CN101429228B - 一种从谷胱甘肽发酵液中提取分离谷胱甘肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从谷胱甘肽发酵液中提取分离谷胱甘肽的方法，它包括以下步骤：发酵液离心、热水抽提、磁性纳米材料吸附GSH、解吸附、电渗、减压浓缩及冷冻干燥。该方法利用磁性纳米材料对谷胱甘肽吸附的高度专一性，并结合磁性纳米材料容易被分离的特性，避免了为得到高纯度GSH而除去抽提液中其他杂质的烦琐工序，提取收率达到98％以上，降低能耗80～90％，工作量仅为原来的十分之一，并为后续纯化提供了良好条件。该方法操作简单，减小成本，环境污染小，大大提高GSH提取收率及纯度。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种从谷胱甘肽发酵液中采用磁性纳米材料提取分离高纯度谷胱甘肽的方法，属于谷胱甘肽制备技术领域。
背景技术
谷胱甘肽是一种具有重要生理活性的三肽，即r-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸(glutathione，GSH)。半胱氨酸上的巯基为其活性基团，但巯基容易引起两个分子谷胱甘肽的偶联，谷胱甘肽有两种形式：还原型(GSH)和氧化型(GSSG)，在生理条件下以还原型谷胱甘肽占绝大多数，谷胱甘肽还原酶能催化两型间的互变。谷胱甘肽的相对分子量为307.33，熔点189～193℃，晶体呈无色透明长柱状，等电点为2.83。它易溶于水，可溶于稀醇、液氨。不溶于醇，醚和丙酮。它广泛分布于动物、植物和油料种子中。它在细胞中的功能之一就是抵御各种毒素和致癌剂。有研究表明(孙洪刚，等.谷胱甘肽的代谢和应用.卫生职业教育.2004，10：126-127)：谷胱甘肽在小肠中能被完全吸收，并且某些上皮细胞能利用外源谷胱甘肽去毒，这说明膳食中的谷胱甘肽决定着人体中细胞免受损伤的程度。除作为抗毒剂外，谷胱甘肽还对一些巯基酶有激活作用，可作为保护酶和其它蛋白巯基的抗氧化剂，在生物氧化、氨基酸转运、保护血红蛋白等过程中起一定作用。另外，谷胱甘肽还具有抑制衰老、预防糖尿病、消除疲劳等作用。谷胱甘肽在强化食品风味的同时对人体有保健作用，它的应用前景明显优于其它类型的抗氧化剂和防腐剂。最近研究还发现谷胱甘肽具有抑制艾滋病的作用。因此，研究谷胱甘肽对人类的健康和生活具有重要的意义。
经破壁离心后的酵母谷胱甘肽粗提液浓度很低，而且含有蛋白质、多糖、多肽、氨基酸、色素、盐类等很多杂质，因此高纯度、高收率的谷胱甘肽工业化分离非常困难。目前报道的提取分离发酵液中的谷胱甘肽GSH分离方法有萃 取法、铜盐法、离子交换法、电渗析法、金属亲和层析法、双水相分离等方法。萃取法制备GSH所使用的溶剂可以是水、有机酸溶液和稀醇等，但提取收率低，且造成严重的环境污染。铜盐污染大，影响产品纯度。复旦大学的苑小林等人(苑小林，等.鲜酵母中谷胱甘肽(GSH)分离纯化的初步研究[J].药物生物技术，1998，5(2)：89-91)将对氨基苯汞乙酸连接到聚苯乙烯-二乙烯基苯载体上，形成含有机汞的化学亲和树脂，用于吸附GSH，回收率为83％，但在高浓度盐作用下，汞容易从树脂上断开，影响后续分离和产品纯度。
在国家专利(申请号200610040606.3)“一种从谷胱甘肽发酵液中提取谷胱甘肽的方法”中指出：采用谷胱甘肽发酵液离心得酵母细胞、调节pH、沸水破壁方法，提取细胞中的谷胱甘肽；使用001×7阳离子交换技术去除小分子物质，最终达到从发酵液中浓缩纯化谷胱甘肽的目的，制得分子量为307.33，蛋白质含量为23％、提取收率为80.5％的白色粉末状谷胱甘肽成品。但是，离子交换树脂不能彻底的去除料液中的杂质与色素，尚不能达到结晶浓度，且在解析过程利用盐酸解析，在解析液pH很低，欲进行结晶，必须用碱调节pH，在溶液中产生盐份，在浓缩结晶过程形成干扰，不利于结晶。无法做到药用98％以上的纯度要求。另外在细胞破壁时温度控制95-100℃，温度过高会导致GSH氧化，影响收率。而且在我国部分地区由于海拔高，在常压下无法达到该温度，不便于生产操作。
在国家专利(申请号200510002408.3)“谷胱甘肽分离纯化方法”中指出：选择含有-S-R基团或-S-S-R’基团的分离介质，将分离谷胱甘肽的介质进行预处理后，填装成层析柱，用pH值1.0-10.0的缓冲液平衡层析柱，调pH值1.0-10.0的谷胱甘肽抽提液上样，用同样的缓冲液冲洗后，用碱或酸洗脱，可得到只含谷胱甘肽的洗脱液。由于介质对谷胱甘肽的高度专一选择吸附，可以有效的将谷胱甘肽分离出来，实现从谷胱甘肽抽提液中一步分离就高度纯化，谷胱甘肽结晶后可以得到纯度为99％的产品。但是，该方法因为利用层析理论进行分离，由于边缘效应的影响，无法进行生产放大。
到目前为止，谷胱甘肽的工业化分离纯化存在收率低、污染严重、浓缩和层析过程成本高等问题。如何提高收率、降低成本、减小对环境污染，是实现工业化生产的重点，本发明方法具有工艺流程简单、高效、节省成本、环境污染小等优点，具有重要的工业应用价值。
发明内容
发明内容 本发明的目的是提供一种从谷胱甘肽发酵液中提取分离谷胱甘肽的方法，利用磁性纳米材料对谷胱甘肽吸附的高度专一性，并结合磁性纳米材料容易被分离的特性，制备高品质、高含量的谷胱甘肽的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种从谷胱甘肽发酵液中提取分离谷胱甘肽的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)发酵液离心：将下罐后的发酵液离心，离心转速为3000～5000rpm，时间为5～10min，得到湿酵母细胞菌体；
(2)热水抽提：以6～10份沸腾去离子水与1份湿酵母细胞菌体的比例，将水和湿酵母细胞菌体混合加入抽提罐后，在沸水浴中进行抽提，同时搅拌抽提液，搅拌转速为300～350rpm，当抽提液温度达到85～95℃时，保温10min～15min后，停止抽提，将抽提液倒出，水浴降温至室温；
(3)磁性纳米材料吸附GSH：按照抽提液中GSH量计算，在抽提液中加入相当于GSH 1～2倍质量的磁性纳米材料，边加边搅拌，使之充分均匀，搅拌转速为100～200rpm，加入磁性纳米材料继续搅拌20min后，用电磁场沉降吸附有GSH的磁性纳米材料，所述的磁性纳米材料是表面包覆有功能基团亚氨基二乙酸的纳米级Fe3O4磁性微粒，可以和谷胱甘肽的巯基发生专一性吸附，从而有效直接的吸附谷胱甘肽；
(4)解吸附：将吸附了GSH的磁性纳米材料在解吸附罐中用0.1～0.6mol/L的酸解析，每克磁性纳米材料中加入20～30mL的解析液，使GSH从磁性纳米材料上脱离，用电磁场沉降磁性纳米材料，得到富含GSH的解析液；
(5)电渗：调解析液的pH值至1～6，对解析液进行电渗处理，收集富含GSH的溶液；
(6)减压浓缩：减压浓缩电渗后的GSH溶液，按照下列条件进行：真空度-0.07～-0.098Mpa，旋转速度40rpm，温度50～60℃，浓缩至GSH浓度250mg/ml以上，得到GSH浓缩液；
(7)冷冻干燥：将谷胱甘肽浓缩液冷冻干燥24～36小时，得到谷胱甘肽成品，成品性状为白色粉末。
上述步骤(1)中所述的发酵液，其发酵水平至少应达到1650mg/L。
上述步骤(4)中解析所用的酸选用硫酸、盐酸、醋酸或硝酸。
本发明提供的上述从谷胱甘肽发酵液中提取分离谷胱甘肽的方法，与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)磁性纳米材料对GSH具有高度专一的选择性吸附，几乎完全把GSH从谷胱甘肽抽提液中吸附到磁性纳米材料上，避免了为得到高纯度GSH而除去抽提液中其他杂质的烦琐工序，提取收率达到98％以上，降低能耗80～90％，工作量为原来的十分之一，并为后续纯化提供了良好条件。
(2)加入0.1～0.6mol/L的酸进行解析，GSH和少量含-SH的物质能够完全从磁性纳米材料上被解析，调节溶液pH值为1～6后电渗处理，得到富含GSH的溶液。整个过程容易集成控制，避开了层析法带来的放大效应、操作复杂、生产周期长、投资大等不利于工业化的因素。该法操作简单，缩短工时，减少人力、物力消耗，节约能源，环境污染小，大大提高GSH提取收率及纯度。
具体实施方式
实施例1：
取发酵水平为1650mg/L的发酵液5L，用转速为3000rpm的离心机离心10min，得到湿酵母细胞1500g。湿酵母细胞中GSH含量为5.50g/kg。将1500g湿酵母细胞加入9L沸水中，同时搅拌抽提液，搅拌转速为300rpm。当抽提液温度达到95℃时，保温15分钟后，停止抽提。将抽提液流水冷却，降温至室温。抽提液中加入磁性纳米材料8.25g，边加边搅拌，使之充分混匀，搅拌转速为100rpm。磁性纳米材料完全加入后继续搅拌20分钟，用电磁场沉降吸附了GSH的磁性纳米材料。弃去上清液，解析罐中加入0.1M的盐酸溶液165ml解析，使GSH从磁性纳米材料上脱离，用电磁场沉降磁性纳米材料，得到富含GSH的解析液。用等量去离子水洗磁性纳米材料，洗液与解析液合并为电渗处理液。调电渗处理液pH值1.0后，进行电渗处理，收集富含GSH的溶液。减压浓缩电渗后的GSH溶液，真空度-0.098MPa，温度50℃，得到纯的谷胱甘肽浓缩液。将谷胱甘肽浓缩液冷冻干燥24小时，得到纯谷胱甘肽5.80g。提取收率为70.3％，得到纯度大于98.5％的白色疏松粉末。
实施例2：
取发酵水平为1650mg/L的发酵液5L，用转速为5000rpm的离心机离心5min，得到湿酵母细胞1500g。湿酵母细胞中GSH含量为5.50g/kg。将1500g湿酵母细胞加入15L沸水中，同时搅拌抽提液，搅拌转速为350rpm。当抽提液温度达到85℃时，保温10分钟后，停止抽提。将抽提液流水冷却，降温至室温。抽提液中加入磁性纳米材料16.5g，边加边搅拌，使之充分混匀，搅拌转速为200rpm。磁性纳米材料完全加入后继续搅拌20分钟，用电磁场沉降吸附了GSH的磁性纳米材料。弃去上清液，解析罐中加入0.6M的硝酸溶液495ml解析，使GSH从磁性纳米材料上脱离，用电磁场沉降磁性纳米材料，得到富含GSH的解析液。用等量去离子水洗磁性纳米材料，洗液与解析液合并为电渗处理液。调电渗处理 液pH值6.0后，进行电渗处理，收集富含GSH的溶液。减压浓缩电渗后的GSH溶液，真空度-0.08MPa，温度60℃，得到纯的谷胱甘肽浓缩液。将谷胱甘肽浓缩液冷冻干燥36小时，得到纯谷胱甘肽5.92g。提取收率为71.8％，得到纯度大于98％的白色疏松粉末。
实施例3：
取发酵水平为1650mg/L的发酵液5L，用转速为4500rpm的离心机离心8min，得到湿酵母细胞1500g。湿酵母细胞中GSH含量为5.50g/kg。将1500g湿酵母细胞加入10L沸水中，同时搅拌抽提液，搅拌转速为320rpm。当抽提液温度达到90℃时，保温13分钟后，停止抽提。将抽提液流水冷却，降温至室温。抽提液中加入磁性纳米材料10g，边加边搅拌，使之充分混匀，搅拌转速为180rpm。磁性纳米材料完全加入后继续搅拌20分钟，用电磁场沉降吸附了GSH的磁性纳米材料。弃去上清液，解析罐中加入0.3M的硫酸溶液250ml解析，使GSH从磁性纳米材料上脱离，用电磁场沉降磁性纳米材料，得到富含GSH的解析液。用等量去离子水洗磁性纳米材料，洗液与解析液合并为电渗处理液。调电渗处理液pH值5.0后，进行电渗处理，收集富含GSH的溶液。减压浓缩电渗后的GSH溶液，真空度-0.07MPa，温度55℃，得到纯的谷胱甘肽浓缩液。将谷胱甘肽浓缩液冷冻干燥30小时，得到纯谷胱甘肽5.84g。提取收率为70.8％，得到纯度大于98％的白色疏松粉末。
对比实施例1：
取发酵水平为1650mg/L的发酵液5L，用转速为2000rpm的离心机离心3min，其他条件依照实施例1，结果由于离心转速太低，时间短，没能使酵母细胞充分沉降而导致收率降低，最终仅得到谷胱甘肽4.63g，收率为56.1％。
对比实施例2：
改变抽提液温度达到82℃，保温8min，其它操作同实施例1，结果由于抽 提温度低，保温时间短，使细胞破壁不彻底，仅得到谷胱甘肽4.81g，提取收率为58.3％。
对比实施例3：
依照实施例1得到抽提液后，在抽提液中加入磁性纳米材料6g，其它操作同实施例1，结果由于加入的磁性纳米材料太少，没能将抽提液中的谷胱甘肽完全吸附，导致收率降低，仅得到谷胱甘肽4.35g，收率为52.7％。
对比实施例4：
改变解析罐中加入的解析液为0.06M的硝酸溶液，其它操作同实施例1，结果由于解析酸浓度过低，解析不彻底，仅得到谷胱甘肽4.98g，提取收率为60.3％，纯度为89.5％。
对比实施例5：
依照实施例1，待电磁场沉降吸附了GSH的磁性纳米材料，弃去上清液，在解析罐中加入0.1M的盐酸溶液120ml解析，使GSH从磁性纳米材料上脱离，用电磁场沉降磁性纳米材料，得到富含GSH的解析液。用等量去离子水洗磁性纳米材料，洗液与解析液合并为电渗处理液。调电渗处理液pH值7.0后，进行电渗处理，其他依照实施例1。结果由于解析液用量太少(小于20ml/g磁材料)，使得谷胱甘肽没有完全被解析下来，以及电渗pH值过高，导致谷胱甘肽收率降低，纯度降低。最终仅得到谷胱甘肽3.86g，纯度88.5％，收率46.8％。
对比实施例6：
依照实施例1，电渗后得到富含谷胱甘肽的溶液。减压浓缩电渗后的谷胱甘肽溶液，真空度-0.06MPa，温度70℃，结果由于真空度过低，浓度过高，再浓缩过程中谷胱甘肽被氧化，仅得到谷胱甘肽4.36g，纯度95.3％的白色疏松粉末，提取收率为52.8％。
Claims (3)
1.一种从谷胱甘肽发酵液中提取分离谷胱甘肽的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)发酵液离心：将下罐后的发酵液离心，离心转速为3000～5000rpm，时间为5～10min，得到湿酵母细胞菌体；
(2)热水抽提：以6～10份沸腾去离子水与1份湿酵母细胞菌体的比例，将水和湿酵母细胞菌体混合加入抽提罐后，在沸水浴中进行抽提，同时搅拌抽提液，搅拌转速为300～350rpm，当抽提液温度达到85～95℃时，保温10min～15min后，停止抽提，将抽提液倒出，水浴降温至室温；
(3)磁性纳米材料吸附GSH：按照抽提液中GSH量计算，在抽提液中加入相当于GSH 1～2倍质量的磁性纳米材料，边加边搅拌，使之充分均匀，搅拌转速为100～200rpm，加入磁性纳米材料继续搅拌20min后，用电磁场沉降吸附有GSH的磁性纳米材料，所述的磁性纳米材料，是表面包覆有功能基团亚氨基二乙酸的纳米级Fe3O4磁性微粒；
(4)解吸附：将吸附了GSH的磁性纳米材料在解吸附罐中用0.1～0.6mol/L的酸解析，每克磁性纳米材料中加入20～30mL的解析液，使GSH从磁性纳米材料上脱离，用电磁场沉降磁性纳米材料，得到富含GSH的解析液；
(5)电渗：调解析液的pH值至1～6，对解析液进行电渗处理，收集富含GSH的溶液；
(6)减压浓缩：减压浓缩电渗后的GSH溶液，按照下列条件进行：真空度-0.07～-0.098Mpa，旋转速度40rpm，温度50～60℃，浓缩至GSH浓度250mg/ml以上，得到GSH浓缩液；
(7)冷冻干燥：将谷胱甘肽浓缩液冷冻干燥24～36小时，得到谷胱甘肽成品，成品性状为白色粉末。
2.根据权利要求1所述的从谷胱甘肽发酵液中提取分离谷胱甘肽的方法，其特征在于该方法步骤(1)中所述的发酵液，其发酵水平至少应达到1650mg/L。
3.根据权利要求1所述的从谷胱甘肽发酵液中提取分离谷胱甘肽的方法，其特征在于该方法步骤(4)中解析所用的酸，选用硫酸、盐酸、醋酸或硝酸。
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