CN1850854A - 一种从谷胱甘肽发酵液中提取谷胱甘肽的方法 - Google Patents
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Abstract
一种从谷胱甘肽发酵液中提取谷胱甘肽的方法，属于谷胱甘肽制备技术领域，涉及从谷胱甘肽发酵液中制备低蛋白质含量的谷胱甘肽成品。本发明采用谷胱甘肽发酵液离心得酵母细胞、调节pH值、沸水破壁方法，提取细胞中的谷胱甘肽，同时使蛋白质等大分子物质变性沉淀；使用阳离子交换技术去除小分子和有色物质，最终达到从发酵液中浓缩纯化谷胱甘肽的目的，制得分子量为307.33、蛋白质含量为23％、提取收率为80.5％的白色粉末状谷胱甘肽成品。本发明方法具有操作简便、工艺流程简单、高效、费用低廉、成品纯度较高、环境污染小、易于工业化等优点，不仅可以在实验室中方便实施，而且极易在工业生产中运用。
Description
技术领域
本发明涉及一种从谷胱甘肽发酵液中提取谷胱甘肽的方法，涉及从谷胱甘肽发酵液中制备低蛋白质含量、高品质的谷胱甘肽，属于谷胱甘肽制备技术领域。
背景技术
谷胱甘肽，即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸(glutathione，GSH)，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的一种同时具有γ-谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物。谷胱甘肽有两种形式：还原型GSH和氧化型GSSG，只有GSH才具有活性，而生物体内的GSSG需还原后才能发挥其重要的生理功能。还原型谷胱甘肽固体较为稳定，但其水溶液在空气中极易被氧化成氧化型谷胱甘肽GSSG。GSH在自然界中广泛分布于动物、植物和微生物细胞内。GSH在生物体内有着多种重要的生理功能，特别是对于维持生物体内适宜的氧化还原环境起着至关重要的作用。GSH还具有独特的生理功能，被称为长寿因子和抗衰老因子。由于GSH在强化食品风味的同时对人体有保健作用，它的应用前景显然要优于其它类型的防腐剂或抗氧化剂。随着GSH的生理生化功能和性质被不断研究发现，GSH作为一种多功能的生物活性添加剂在食品加工业中的应用将会愈来愈广，GSH的需求量正日益增大。
发酵法生产谷胱甘肽的方法不断得到改进，已经成为目前国内外生产谷胱甘肽最普遍的方法。但要从发酵液中获得纯度很高的GSH，一直成为国内外研究的热点。到目前为止报道的分离提纯GSH的方法有铜盐法、离子交换、亲和层析、双水相分离等。铜盐法是一种比较传统的方法，有一定实用价值，目前仍然被一些GSH生产工艺所应用，但需要大量的H2S，污染较大，工艺复杂，所以随着各项新的分离纯化技术的出现，必将逐渐被淘汰。由于氨基酸和多肽类物质为具有弱碱性和弱酸性官能团的两性化合物，因此采用阴阳离子交换树脂吸附、解吸的方法来使得氨基酸和肽类化合物和其他物质快速有效的分离。该方法经济效益较高，可望完全代替铜盐法。亲和层析方法是一种有效的分离纯化GSH的方法。一般而言含汞树脂对酸碱比较敏感，稳定性比较差，在工业应用上有一定的限制。双水相分离具有分相时间短、易于连续操作、目标产物分配系数大、投资费用少、大多形成双水相的高聚物可回收利用等特点，被广泛用于生物化学、细胞生物学、生物化工等领域产品的分离和提取。ATPE技术主要用于分离生物有机大分子(蛋白质、核酸、菌等)，但实现工业化生产仍有困难。
近年来我国离子交换树脂工业发展迅速，国产离子交换树脂的价格相对于进口树脂价格大大降低，使得离子交换法在生化物质的分离方面的研究不断深入。离子交换法能够将带电情况不同的物质进行分离，广泛应用于天然活性成分的研究中。对于离子交换法，国内外对阳离子交换树脂的研究比较多，但大多GSH的回收率很低，只达到32.9％-57.6％，采用高选择性的含汞树脂分离效果回收率也只达到54.3％，同时获得的产品纯度普遍较低。
以往的GSH提取方法普遍存在着成本高、提取率不高、质量低劣和品质不稳定、环境污染严重等缺点，难以适应工业化生产和实际应用的需要。考虑到国内外对高品质的谷胱甘肽食品添加剂需求的不断增长，因此，如何在工业规模上实现高品质的GSH提取，具有重要的工业应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种从谷胱甘肽发酵液中提取谷胱甘肽的方法，是利用谷胱甘肽发酵液制备高品质、高含量的谷胱甘肽的方法，制备的谷胱甘肽以富含谷胱甘肽的食品添加剂的形式作为产品。
本发明的技术方案：将谷胱甘肽发酵液经离心得到酵母细胞液、调节pH值、沸水破壁、阳离子交换、真空浓缩、冷冻干燥、成品包装而制得。
具体操作步骤如下：
1、离心得酵母细胞液：将发酵液离心，转速为3000rpm，时间为10-15min，得到湿酵母细胞沉淀。
2、调节pH值：用2mol/1H2SO4将酵母细胞液的pH值调节为1-2。
3、沸水破壁：以湿酵母细胞质量计，按照物料比为10-12ml/g计算蒸馏水体积用量，先将大部分蒸馏水加热至沸腾，将调好pH值的酵母细胞液倒进沸水中，迅速搅拌，用剩下少量的蒸馏水冲洗烧杯，一并倒入。当温度再次加热至95-100℃，开始计时，12min后，立刻放置冰浴中冷却至4℃。
4、阳离子交换：将型号为001×7阳离子交换树脂装柱，柱体积为φ2.6cm×30cm，将含菌体的酵母细胞液直接上柱，其上样时pH值为2-3，流速为1ml/min，留出未吸附的酵母细胞液循环上样直至饱和；用3-4倍柱体积的以盐酸调pH值为3的蒸馏水洗树脂柱，将菌体和细胞沉淀等杂质洗去，再用3-4倍柱体积的1.5％HCl洗脱，其洗脱速度为0.5ml/min，洗脱液浓缩到5-6倍，收集富含谷胱甘肽的浓缩液。
5、真空浓缩：将谷胱甘肽浓缩液再次真空浓缩，按照下列条件进行：真空度0.9MPa，旋转速度130rpm，温度55-60℃，浓缩至8-10倍，得谷胱甘肽超浓缩液。
6、冷冻干燥：将谷胱甘肽超浓缩液进行冷冻干燥于-84℃下干燥28h，得到白色粉末状谷胱甘肽成品。
本发明的有益效果：本发明从谷胱甘肽发酵液中提取GSH的过程分为提取和浓缩两个阶段，提取为将发酵液离心得到酵母细胞沉淀煮沸破壁提取GSH，再经过离子交换技术等进一步浓缩得到GSH。采用离心得酵母细胞、调节pH值、沸水破壁方法，提取细胞中的谷胱甘肽，同时使蛋白质等大分子物质变性沉淀，使用阳离子交换技术去除小分子和有色物质，最终达到从发酵液中浓缩纯化谷胱甘肽的操作工序，不仅可以在实验室中方便实施，而且极易在工业生产中运用。采用沸水破壁前调节pH值，不仅有利于GSH的稳定，而且可以使大分子蛋白质变性沉淀，除去大部分蛋白质。将带菌体的酵母液直接上柱，生产成本较低，适合工业化生产。使用适合于工业化规模的离子交换技术可有效的去除小分子和有色物质，尤其是离子交换技术适合大规模的工业化生产。该法操作简单、高效、费用低廉、成品纯度较高、环境污染小、易于工业化。制得GSH产品的分子量为307.33、蛋白质含量为23％、提取收率为80.5％的谷胱甘肽成品。
具体实施方式
实施例1
发酵得到的谷胱甘肽发酵液，成份分析结果：菌体75g/L；GSH含量3.95g/L。将上述2L发酵液于3000rpm下离心15min，弃去上清液，得到420g湿菌体。在上述湿菌体中加水稀释至5L。将稀释后的菌体用2mol/L硫酸调节pH至1-2范围内。加热煮沸12min后置于冰水浴中冷却至4℃。将冷却后的菌体混合液直接上001×7阳离子交换树脂柱，柱体积为φ2.6cm×30cm，将含菌体的酵母细胞液直接上柱，柱吸附洗脱，此时GSH回收率为89.1％，蛋白质去除率为78％，洗脱液浓缩5倍。将上述经吸附柱浓缩后的谷胱甘肽浓缩液再次进行真空浓缩，按照下列条件进行：真空度0.9MPa，旋转速度130rpm，温度55-60℃，浓缩至8倍。将谷胱甘肽超浓缩液进行冷冻干燥，于-84℃下干燥28h后得到白色粉末状谷胱甘肽成品。此时谷胱甘肽的纯含量为6.36g，提取收率为80.5％。谷胱甘肽呈白色粉末状物质，具有良好的感官品质。
对比实施例1
改变沸水破壁前用硫酸所调pH值，将pH调节为3，其它操作同实施例1。结果：谷胱甘肽的纯含量为2.46g，提取收率为31.1％。
对比实施例2
改变煮沸时间。将煮沸时间改为2h，其他操作同实施例1。结果：谷胱甘肽的纯含量为2.46g，提取收率为62.5％。
对比实施例3
改变所用的洗脱剂，将1.5％的HCl改为采用1.5％NaCl为洗脱剂。其他操作同实施例1。结果：浓缩倍数仅为6倍，谷胱甘肽的纯含量为5.7g，提取收率为72.4％，蛋白质去除率40.6％。
Claims (1)
1、一种从谷胱甘肽发酵液中提取谷胱甘肽的方法，其特征是将谷胱甘肽发酵液经离心得到酵母细胞液、调节pH值、沸水破壁、阳离子交换、真空浓缩、冷冻干燥、成品包装而制得成品谷胱甘肽；
离心得酵母细胞液：将发酵液离心，转速为3000rpm，时间为10-15min，得到湿酵母细胞沉淀；
调节pH值：用2mol/l H2SO4将酵母细胞液的pH值调节为1-2；
沸水破壁：以湿酵母细胞质量计，按照物料比为10-12ml/g计算蒸馏水体积用量，先将大部分蒸馏水加热至沸腾，将调好pH值的酵母细胞液倒进沸水中，迅速搅拌，用剩下少量的蒸馏水冲洗烧杯，一并倒入，当温度再次加热至95-100℃，开始计时，12min后，立刻放置冰浴中冷却至4℃；
阳离子交换：将型号为001×7阳离子交换树脂装柱，柱体积为φ2.6cm×30cm，将含菌体的酵母细胞液直接上柱，其上样时pH值为2-3，流速为1ml/min，留出未吸附的酵母细胞液循环上样直至饱和；用3-4倍柱体积的以盐酸调pH值为3的蒸馏水洗树脂柱，将菌体和细胞沉淀等杂质洗去，再用3-4倍柱体积的1.5％HCl洗脱，其洗脱速度为0.5ml/min，洗脱液浓缩到5-6倍，收集富含谷胱甘肽的浓缩液；
真空浓缩：将谷胱甘肽浓缩液再次真空浓缩，按照下列条件进行：真空度0.9MPa，旋转速度130r/min，温度55-60℃，浓缩至8-10倍，得谷胱甘肽超浓缩液；
冷冻干燥：将谷胱甘肽超浓缩液进行冷冻干燥，-84℃下干燥28h，即得白色粉末状谷胱甘肽成品。
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