一种纯化谷胱甘肽的方法
技术领域
本发明涉及化合物的纯化方法,具体涉及谷胱甘肽的纯化方法。
背景技术
谷胱甘肽(GSH)是一种具有重要生理功能的活性三肽,它由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。谷胱甘肽在体内以两种形态存在,即还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,简称GSSG)。通常人们所指的谷胱甘肽是还原型谷胱甘肽。还原型谷胱甘肽很容易被氧化,两分子谷胱甘肽的活泼巯基氧化脱氢后以二硫键相连得到的二聚体,即是氧化型谷胱甘肽。其中只有还原型谷胱甘肽才具有生理活性,而生物体内的氧化型谷胱甘肽需经还原后才能发挥生理功能。
自1888年,法国科学家Rey-pahlade首先在酵母抽提物中发现谷胱甘肽以来,科学家一直在努力研究它在各种生物体内的含量及其相应的生理作用,并逐渐发现它在医药、食品、饲料及其它行业的重要用途。
谷胱甘肽是谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成,化学名为γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸,其结构如下所示:
谷胱甘肽是一种白色晶体,相对分子质量为307.33,熔点是192~195℃(分解),等电点为5.93。比旋光度[α]D20为+17.60°(C=0.05,H2O),易溶于水、稀醇、液氨和二甲基甲酰氨,不溶于乙醚和丙酮。谷胱甘肽固体较为稳定,而水溶液在空气中易被氧化,谷胱甘肽在高水分活度下不易保存,只有将水分活度控制在0.3以下才能长期稳定保存。
谷胱甘肽目前主要用发酵法来生产,范崇东、王森等在2004年《食品与发酵工业》杂志上,报道了“酵母细胞中谷胱甘肽的微波辅助提取”,酵母细胞经过两次微波破碎,谷胱甘肽被释放,从而,获得了含有谷胱甘肽的混合液,但未进一步提纯谷胱甘肽。
日本专利JP58.028.299中,谷胱甘肽抽提液调节PH2.0-3.5,超滤,反渗透浓缩,避免了传统硅藻土过滤除杂的不彻底性,提供了一种提取收率较高的方法。
日本Noguchi Sadao的专利JP52.100.421中,将含有氨基酸杂质的谷胱甘肽混合液,用盐酸或硫酸调PH至3以下,用苯乙烯树脂处理,洗脱后浓缩,二次结晶得到97.5%纯度的谷胱甘肽。
中国专利(申请号200810233834.1)“一种从谷胱甘肽发酵液中提取分离谷胱甘肽的方法”中,提供了一种谷胱甘肽的提取方法:在3000rpm下离心发酵液10-15min,获得酵母细胞沉淀,加入6-10倍的去离子水,在沸水中抽提,使用磁性纳米材料吸附谷胱甘肽,用电场沉降分离后,0.1-0.6mol/l的酸解析,解析液经过电渗处理,再减压浓缩,冷冻干燥,提取收率达到70.3%,纯度98.5%。
中国专利201210111271.5“从含有还原型谷胱甘肽的发酵抽提液中分离纯化还原型谷胱甘肽的方法”中,发酵抽提液用凝胶型强碱树脂纯化,解析后再上含卤素的非极性树脂,解析后,浓缩,加入晶种,低级醇或丙酮,搅拌下结晶,过滤,干燥,重量纯度达到99.73%(折干)。
以上对于谷胱甘肽提纯工艺的探讨,有微波破碎细胞后抽提,沸水抽提,树脂、磁性纳米材料吸附处理后,冻干、结晶干燥得到成品,对结晶的讨论滴加乙醇,加晶种、控制搅拌速度的传统结晶方法,使产品纯度和收率提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种纯化谷胱甘肽的方法。本发明通过大量的结晶工艺实验研究惊奇地发现,在结晶过程中添加十二烷基磺酸盐,能增加溶剂环境对谷胱甘肽粗品中杂质的溶解度,获得高纯度、易分离的晶体,提高产品质量。
本发明所述谷胱甘肽粗品,是由谷胱甘肽发酵液经提取、纯化所得。上述谷胱甘肽粗品的制备方法为本领域公知的成熟技术方案,本发明不做特殊限定。
具体而言,本发明提供了一种纯化谷胱甘肽的方法,所述方法包括以下步骤:将谷胱甘肽粗品溶解在水中,加热条件下滴加十二烷基磺酸盐的低级醇溶液,降温结晶,分离结晶后洗涤、干燥,即得。
其中,所述十二烷基磺酸盐选自十二烷基磺酸铵、十二烷基磺酸钠、十二烷基磺酸钾、十二烷基磺酸锂中的一种或多种;优选为十二烷基磺酸铵。
所述低级醇或酮选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮中的一种或多种;优选为乙醇。
作为本发明的优选方案,所述十二烷基磺酸盐的低级醇或酮溶液浓度为0.4~8g/100ml,优选为0.8~4g/100ml,更优选为2.5~3.5g/100ml。
为了提高所述杂质的去除效果,且避免对最终产品的收率造成不利影响,本发明优选所述谷胱甘肽粗品与十二烷基磺酸盐的重量比为1:0.04~0.4,优选为1:0.12~0.35,更优选为1:0.15~0.21。
在溶解谷胱甘肽粗品时,每1g谷胱甘肽粗品用1.1~15ml水溶解,优选用1.5~10ml水溶解,更优选用3~5ml水溶解。
为了提高结晶效果,确保所得产物具有良好的收率以及纯度,本发明对加热温度以及降温终点温度进行优选。具体而言,所述加热条件为60~75℃水浴加热;所述降温具体为:缓慢降温至3~20℃。
作为本发明的一种优选实施方案,所述方法包括以下步骤:将谷胱甘肽粗品以1g/3~5ml溶于水,在60~65℃热水浴条件下,每1g所述谷胱甘肽粗品滴加6~7ml浓度为2.5~3.5g/100ml的十二烷基磺酸铵/钠乙醇溶液,静置,缓慢冷却至10℃,抽滤收集晶体,用乙醇洗涤晶体,真空干燥,即得。
其中,所述十二烷基磺酸铵/钠乙醇溶液是指十二烷基磺酸铵、十二烷基磺酸钠或十二烷基磺酸铵与十二烷基磺酸钠混合物的乙醇溶液。当采用十二烷基磺酸铵与十二烷基磺酸钠混合物时,二者优选以等质量混合。
本发明提供的方法创造性地提出利用十二烷基磺酸盐的低级醇或酮溶液改变杂质的溶解性,从而提高谷胱甘肽的收率和产品质量。该方法工艺简单,操作简便,所得产物收率高,纯度可达97.5%以上,具有很强的推广和实用价值。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
以下各实施例中,谷胱甘肽粗品的获得方法为:取谷胱甘肽发酵液,陶瓷膜过滤,碱性树脂吸附,解吸,浓缩,乙醇结晶,分离,干燥得粗品。经常规HPLC法检测,所述粗品中谷胱甘肽的含量为85.72%。
实施例1
取10g谷胱甘肽粗品,40ml水溶解,热水浴60℃,20min滴加乙醇60ml,静置结晶;逐步冷却至10℃,抽滤,用75%乙醇40ml洗涤,真空干燥,得成品7.71g;经常规HPLC法检测,纯度为95.69%。
实施例2
取10g谷胱甘肽粗品,40ml水溶解,热水浴65℃,20min滴加乙醇70ml,静置结晶;逐步冷却至10℃,抽滤,用75%乙醇40ml洗涤,真空干燥,得成品7.95g;经常规HPLC法检测,纯度为94.97%。
实施例3
取10g谷胱甘肽粗品,40ml水溶解,热水浴60℃,20min滴加含有1.8g(3%)十二烷基磺酸铵的乙醇溶液60ml,静置结晶;逐步冷却至10℃,抽滤,用75%乙醇40ml洗涤,真空干燥,得成品7.54g;经常规HPLC法检测,纯度为98.93%。
实施例4
取10g谷胱甘肽粗品,40ml水溶解,热水浴60℃,20min滴加含有2.1g十二烷基磺酸铵的乙醇溶液70ml,静置结晶;逐步冷却至10℃,抽滤,用75%乙醇40ml洗涤,真空干燥,得成品8.31g;经常规HPLC法检测,纯度为98.73%。
实施例5
取10g谷胱甘肽粗品,40ml水溶解,热水浴60℃,20min滴加含有0.48g十二烷基磺酸铵的乙醇溶液60ml,静置结晶;逐步冷却至10℃,抽滤,用75%乙醇40ml洗涤,真空干燥,得成品7.63g;经常规HPLC法检测,纯度为95.74%。
实施例6
取10g谷胱甘肽粗品,40ml水溶解,热水浴60℃,20min滴加含有3.0g十二烷基磺酸铵的乙醇溶液60ml,静置结晶;逐步冷却至10℃,抽滤,用75%乙醇40ml洗涤,真空干燥,得成品6.64g;经常规HPLC法检测,纯度为97.78%。
实施例7
取10g谷胱甘肽粗品,15ml水溶解,热水浴60℃,20min滴加含有1.5g十二烷基磺酸铵的甲醇溶液50ml,静置结晶;逐步冷却至10℃,抽滤,用75%乙醇40ml洗涤,真空干燥,得成品7.82g;经常规HPLC法检测,纯度为95.75%。
实施例8
取10g谷胱甘肽粗品,15ml水溶解,热水浴60℃,20min滴加甲醇50ml,静置结晶;逐步冷却至10℃,抽滤,用75%乙醇40ml洗涤,真空干燥,得成品7.93g;经常规HPLC法检测,纯度为93.14%。
实施例9
取10g谷胱甘肽粗品,40ml水溶解,热水浴60℃,20min滴加含有1.8g十二烷基磺酸钠的乙醇溶液60ml,静置结晶;逐步冷却至10℃,抽滤,用75%乙醇40ml洗涤,真空干燥,得成品8.14g;经常规HPLC法检测,纯度为97.01%。
实施例10
取10g谷胱甘肽粗品,70ml水溶解,热水浴60℃,20min滴加乙醇140ml,静置结晶;逐步冷却至10℃,抽滤,用75%乙醇40ml洗涤,真空干燥,得成品6.47g;经常规HPLC法检测,纯度为95.85%。
实施例11
取10g谷胱甘肽粗品,40ml水溶解,热水浴60℃,20min滴加含有1.8g十二烷基苯磺酸钠的乙醇溶液60ml,静置结晶;逐步冷却至10℃,抽滤,用75%乙醇40ml洗涤,真空干燥,得成品7.03g;经常规HPLC法检测,纯度为94.30%。
实施例12
取10g谷胱甘肽粗品,40ml水溶解,热水浴60℃,20min滴加含有1.8g十二烷基苯磺酸铵的乙醇溶液60ml,静置结晶;逐步冷却至10℃,抽滤,用75%乙醇40ml洗涤,真空干燥,得成品7.24g;经常规HPLC法检测,纯度为94.57%。
实施例13
取10g谷胱甘肽粗品,40ml水溶解,热水浴60℃,20min滴加含有0.9g十二烷基磺酸钠和0.9g十二烷基磺酸铵的乙醇溶液60ml,静置结晶;逐步冷却至10℃,抽滤,用75%乙醇40ml洗涤,真空干燥,得成品7.93g;经常规HPLC法检测,纯度为98.39%。
实施例14
取10g谷胱甘肽粗品,100ml水溶解,热水浴75℃,20min滴加含有6.0g十二烷基磺酸铵的异丙醇溶液200ml,静置结晶;逐步冷却至20℃,抽滤,用75%乙醇40ml洗涤,真空干燥,得成品5.96g;经常规HPLC法检测,纯度为96.90%。
实施例15
取10g谷胱甘肽粗品,100ml水溶解,热水浴75℃,20min滴加异丙醇200ml,静置结晶;逐步冷却至20℃,抽滤,用75%乙醇40ml洗涤,真空干燥,得成品6.02g;经常规HPLC法检测,纯度为95.77%。
实施例16
取10g谷胱甘肽粗品,40ml水溶解,热水浴60℃,20min滴加含有2.1g十二烷基硫酸铵的乙醇溶液70ml,静置结晶;逐步冷却至10℃,抽滤,用75%乙醇40ml洗涤,真空干燥,得成品4.98g;经常规HPLC法检测,纯度为93.04%。
将以上各实施例中主要参数进行汇总,如表1所示。
表1:纯化谷胱甘肽的参数
由表1数据可以看出,谷胱甘肽粗品结晶过程中,加入适量的十二烷基磺酸盐对结晶收率和产品质量有明显提高作用。
虽然,上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。