CN101519459A - 一种超低分子肝素钠(钙)的生产工艺 - Google Patents

一种超低分子肝素钠(钙)的生产工艺 Download PDF

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Abstract

本发明针对肝素在临床上出血副作用较严重，临床应用受到限制的情况，向人们公开了一种超低分子肝素钠(钙)的生产工艺；本发明工艺步骤包括：取肝素钠溶液，加入亚硝酸钠溶液，进行裂解；碱调裂解液，再用阴离子交换柱吸附杂质；洗涤，得到超低分子肝素钙；用超滤膜过滤，再用乙醇得沉淀物；经脱盐、脱水后，再沉淀，经冷冻干燥后制得成品超低分子肝素钠(钙)；本发明工艺方法所生产的产品具有在低水平抗凝作用时有更好更安全的抗血栓作用，可广泛用于防治深部静脉血栓、肺栓塞、播散性血管内凝血等疾病。

Description

一种超低分子肝素钠(钙)的生产工艺
技术领域
本发明涉及一种超低分子肝素(ultra low molecular weightheparin、ultra LMWH)的生产方法，具体地说涉及一种超低分子肝素钠和超低分子肝素钙的生产工艺，属于生物制药领域。
发明背景
肝素是一种黏多糖类物质，广泛存在于肠黏膜和肺等动物器官和组织中，经去脂肪和去蛋白等工艺处理后成为药用肝素钠。它具有抗凝血、调血脂等功能，已经广泛应用于心血管疾病防治领域，然而肝素在临床上出血副作用较严重，临床应用受到限制。低分子肝素(lowmolecular weight heparin，LMWH)是20世纪80年代开发出来的抗凝药，它是由普通肝素(亦称未分级肝素，un fractionatedheparin，UFH)裂解而得。由于LMWH较UFH在低水平抗凝作用时能产生良好而持久的抗血栓作用，副作用较小，可用于防治深部静脉血栓、肺栓塞、播散性血管内凝血等疾病，因此低分子肝素成为心血管药物的研究热点。
发明内容
本发明的目的是，针对肝素在临床上出血副作用较严重，临床应用受到限制的情况，提出了在低水平抗凝作用时有更好更安全的抗血栓作用的肝素衍生品，一种超低分子肝素钠(钙)的生产工艺。
本发明的技术方案是这样实现的：一种超低分子肝素钠(钙)的生产工艺，实现该工艺方法的主要特征包括下列步骤：
(1)取肝素钠用水溶解后制成4-8％(w/v)的溶液，分批多次加入亚硝酸钠溶液，在0℃～10℃条件下裂解5～24小时，裂解过程中监控亚硝酸钠的浓度，添加亚硝酸钠使其浓度一直维持在0.08％(w/v)以下，并控制亚硝酸钠总加入量0.2％～1.5％(w/v)。
(2)用氢氧化钠或氢氧化钙或氨水等碱调(1)裂解液使pH值至7.5～9.0，加入1％-8％(w/v)的氯化钠，然后通过强碱性阴离子交换柱吸附，去除杂质。强碱性阴离子交换柱可以是D201、D202、717、703、7170等强碱性阴离子交换树脂填充柱。
(3)通过1％—10％氯化钠(钙)溶液洗涤，1％～10％氯化钠(钙)溶液用量为(2)裂解液的20％(v/v)，然后用10％～30％氯化钠(钙)溶液洗脱得到洗脱液为超低分子肝素钠(钙)溶液，10％～30％氯化钠(钙)溶液用量为(2)裂解液的1～1.5倍。此步使用氯化钙可以完成转钙，得到超低分子肝素钙。
(4)将(3)洗脱液通过5000D的超滤膜，去除绝大部分分子量大于6000D的超低分子肝素钠(钙)，得超滤液；然后用超滤液的1.5～3倍乙醇沉淀，去除绝大部分分子量小于1500D的超低分子肝素钠(钙)，得沉淀物。
(5)将(4)沉淀物经过脱盐、脱水后，室温至80℃条件下真空干燥得到超低分子肝素钠(钙)粗品。
(6)将(5)超低分子肝素钠(钙)粗品溶解后再次沉淀，重复(5)后得到超低分子肝素钠(钙)。
(7)注射用水溶解(6)超低分子肝素钠(钙)，经活性炭脱色，粗滤，0.22u精滤后的溶液冷冻干燥后制得成品超低分子肝素钠(钙)。
本发明的理论依据是：
肝素催化ATIII抑制FIIa时需同时结合两者，故肝素分子链应长于18个糖单位，而催化ATIII抑制FXa和FIIa时，只需结合ATIII，因此短的肝素链即可发挥作用，LMWH就是基于该理论被开发出来的。LMWH较UFH在低水平抗凝作用时能产生良好而持久的抗血栓作用，临床安全性较好。也基于该理论和LMWH的研究思路，我们研究开发这一种超低分子肝素，以求得到在低水平抗凝作用时有更好更安全的抗血栓作用的肝素衍生品。
本发明的效果作用是：
1、通过严格控制亚硝酸钠的浓度和总量，选择合适超滤膜的超滤技术和沉淀技术，得到分子量分布80％在1500～5000D、重均分子量2300～2900D、抗Xa因子效价在100～145IU/mg，抗IIa因子效价小于15IU/mg的超低分子肝素，比普通低分子肝素更具安全性和有效性；
2、通过在上述纯化时选用不同的洗涤剂和洗脱剂氯化钠或氯化钙可相应得到超低分子肝素钠或超低分子肝素钙；
3、本发明工艺方法所生产的产品，其特征是超低分子肝素钠(钙)重均分子量2300～2900D，分子量在1500～5000D的比例达到80％；抗Xa因子效价在100～145IU/mg，抗IIa因子效价小于15IU/mg。
具体实施方式
实施例一：100g未分级肝素(抗IIa因子效价143IU/mg，硫酸皮肤素含量0.7％)，溶解在2000ml注射用水中，冷却到3℃，用醋酸溶液把PH调到3.0，加150ml 1％(v/v)亚硝酸钠溶液，用醋酸溶液调PH到2.7，裂解经过6小时候后，加入150ml 1％(v/v)亚硝酸钠溶液，裂解经过12小时候后，加入100ml1％(v/v)亚硝酸钠溶液，裂解经过18小时候后，用氢氧化钠调以上裂解液pH值至7.5终止裂解。
裂解液中加入2％的氯化钠，溶解后，溶液通过阴离子交换柱，循环吸附2小时。4000ml 2％的氯化钠溶液洗涤交换柱，用1000ml 20％的氯化钠溶液洗脱得到超低分子肝素钠的溶液。溶液通过5000D的超滤膜后，用2.0倍乙醇沉淀，沉淀物分别用85％乙醇洗涤两次脱盐，再用无水乙醇洗涤两次脱水后，真空干燥得到超低分子肝素钠粗品69.34g。
取以上粗品50g溶解在600ml注射用水中，用2.0倍乙醇沉淀，沉淀物分别用85％乙醇洗涤两次脱盐，再用无水乙醇洗涤两次脱水后，真空干燥得到44.28g产品，用450ml注射用水溶解，经活性炭脱色和两次精密过滤后，冷冻干燥后制得成品超低分子肝素钠43.18g。产品质量指标见下表。
实施例二：100g未分级肝素(抗IIa因子效价143IU/mg，硫酸皮肤素含量0.7％)，溶解于2000ml注射用水，冷却到5℃，用醋酸溶液调PH到3.0，加入160ml1％(v/v)亚硝酸钠溶液，用醋酸溶液把PH调到2.5，裂解经过7小时候后，加入160ml 1％(v/v)亚硝酸钠溶液，裂解经过14小时候后，加入120ml 1％(v/v)亚硝酸钠溶液，裂解经过20小时候后，用氢氧化钠调以上裂解液pH值至8.0终止裂解。
裂解液中加入2％的氯化钠，溶解后，溶液通过阴离子交换柱，循环吸附2小时。6000ml 1.8％的氯化钙溶液洗涤交换柱，用1000ml 24％的氯化钙溶液洗脱得到超低分子肝素钙的溶液。溶液通过5000D的超滤膜后，用2.0倍乙醇沉淀，沉淀物分别用85％乙醇洗涤两次脱盐，再用无水乙醇洗涤两次脱水后，真空干燥得到超低分子肝素钙粗品71.35g。
取以上粗品50g溶解在600ml注射用水中，用2.0倍乙醇沉淀，沉淀物分别用85％乙醇洗涤两次脱盐，再用无水乙醇洗涤两次脱水后，真空干燥得到43.23g产品，用450ml注射用水溶解，经活性炭脱色和两次精密过滤后，冷冻干燥后制得成品超低分子肝素钙41.97g。产品质量指标见下表。
 
实施例一 实施例二
品名 超低分子肝素钠 超低分子肝素钙
重均分子量 2735 2695
分子量>6000 2.75％ 2.58％
分子量2000-5000 83.4％ 84.9％
抗Xa因子效价(IU/mg) 104 118
抗IIa因子效价(IU/mg) 9.5 8.3
抗Xa效价/抗IIa效价 11.0 14.2
钙含量 10.34％

Claims (5)

1、一种超低分子肝素钠(钙)的制备方法，其特征是：包括下列步骤：
A、分多次添加亚硝酸钠在低温条件下长时间裂解，得到裂解液。
B、用氢氧化钠调以上裂解液pH值至7.5～9.0，加入1％～8％的氯化钠，然后通过阴离子交换柱吸附。
C、通过1％～10％的氯化钠(钙)溶液洗涤后，用10％～30％的氯化钠(钙)溶液洗脱得到超低分子肝素钠(钙)的溶液。
D、上述溶液通过5000D的超滤膜后，用1.5～3倍乙醇得沉淀物。
E、上沉淀物经过脱盐、脱水后真空干燥得到超低分子肝素钠(钙)粗品。
F、以上超低分子肝素钠(钙)粗品溶解后再次沉淀，重复(5)后得到超低分子肝素钠(钙)。
G、注射用水把以上超低分子肝素钠(钙)溶解，经活性炭脱色和两次过滤后的溶液冷冻干燥后制得成品超低分子肝素钠(钙)。
2、根据权利要求1所述超低分子肝素钠(钙)的制备方法，其特征是：步骤A所述分多次添加亚硝酸钠，所述亚硝酸钠浓度一直维持在0.08％以下，总亚硝酸钠加入量0.15％～1.5％，温度在0℃～10℃，反应时间在5～24小时。
3、根据权利要求1所述超低分子肝素钠(钙)的制备方法，其特征是：步骤B所述使用阴离子交换的方法去除杂质，阴离子交换的方法还可以完成转钙，所述阴离子交换柱所填充为强碱性阴离子树脂。
4、根据权利要求1所述超低分子肝素钠(钙)的制备方法，其特征是：步骤D所述用超滤的方法去除硫酸皮肤素和较大分子肝素。
5、根据权利要求1所述超低分子肝素钠(钙)的制备方法，其特征是：所述本制备方法制得的超低分子肝素钠(钙)的产品为重均分子量2300～2900D，分子量在1500～5000D的比例达到80％；抗Xa因子效价在100～145IU/mg，抗IIa因子效价小于15IU/mg。
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