CN113024689A - 一种达肝素钠分子量的控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种达肝素钠分子量的控制方法。本发明通过一次降解、层析纯化、二次降解、还原、脱色及干燥制得达肝素钠成品。本发明通过一次降解的将分子量控制在6900‑7500之间，层析纯化之后再将本应去除的大分子部分进行第二次降解，充分利用了肝素钠原料，使达肝素钠收率明显提高，收率达85%以上。与现有技术相比，本发明方法操作简单易行，对分子量及分子量分布控制准确，所有工序均在常温常压下进行，离子交换工艺易于生产放大，重现性好，具有重要的应用前景。

Description

一种达肝素钠分子量的控制方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种达肝素钠分子量的控制方法。

背景技术

达肝素钠是由猪肠粘膜来源的肝素钠经亚硝酸降解而得到的低分子量肝素的一种，达肝素钠重均分子量为5600-6400，其分子量小于等于3000的比例不大于13%，分子量大于等于8000的比例为15%-25%。达肝素钠的还原端结构为6-O-硫酸-2,5-脱水-D-甘露醇，非还原端结构为2-O-硫酸-α-L-艾杜糖醛酸。按干品计每毫克抗Xa因子的效价为110-210IU/mg，抗IIa的效价为35-100IU/mg，抗Xa/抗IIa的活性比值在1.9-3.2之间。达肝素钠可用于治疗急性深静脉血栓，急性肾功能衰竭或慢性肾功能不全者进行血液透析和血液过滤期间防止在体外循环系统中发生凝血，不稳定型冠状动脉疾病（如不稳定型心绞痛和非Q-波型心肌梗塞），预防与手术有关的血栓形成。

达肝素钠是通过亚硝酸控制降解法生产的，该方法的机理是在低pH值条件下，亚 硝酸与未分级肝素中的N-硫酸葡糖胺反应使之脱去

形成-NH₂，-NH₂与亚硝酸发生重 氮化反应，在放出N₂的同时糖苷键断裂，电子转移，缩环生成2,5-脱氢甘露醛，后者经还原 或脱氢形成甘露糖醇。

由于肝素钠由一系列不同分子量的未分级肝素组成，加入亚硝酸钠后，不同大小分子量的组分同时降解，造成降解后的肝素分子量及分布不符合达肝素钠要求，表现为小分子组分远超出标准，还需要通过进一步纯化，去除部分大分子和小分子后，才能得到符合质量标准的产品。达肝素钠制备工艺的难点为其分子量及分子量分布的控制，分子量及分子量分布是降解和纯化工艺协同控制的结果，需严格优选降解及纯化过程参数，以降低纯化难度及提高产品收率，若降解及纯化工艺选择优化不合适，则需要在纯化过程中去除较多组分，直接结果就是导致产品收率下降。目前达肝素钠制备工艺中采用亚硝酸钠降解后，常用的分子量控制技术有乙醇分级沉淀法、超滤法及层析法。然而上述降解及纯化工艺存在操作复杂，成本高的问题。

因此，如何提供一种操作简便低成本的达肝素钠分子量及分子量分布的控制方法，以满足达肝素钠分子量及分子量分布的控制要求并提高产品收率，成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

鉴于现有技术中的降解及纯化工艺存在的问题，本发明提供了一种达肝素钠分子量的控制方法，其操作简便，生产成本低，能满足达肝素钠分子量及分子量分布的控制要求，充分利用肝素钠原料，提高达肝素钠制备工艺收率。所述方法包括以下步骤：

（1）一次降解：将肝素钠溶解后加入亚硝酸钠进行第一次降解，得第一次降解溶液；

（2）层析纯化：将所述第一次降解溶液进行阴离子交换层析，得到洗脱液I及洗脱液II；

（3）二次降解：在所述洗脱液II中加入亚硝酸钠进行第二次降解，得第二次降解溶液；

（4）还原、脱色及干燥：将所述第二次降解溶液与所述洗脱液I合并后，依次进行还原、脱色及干燥，得达肝素钠成品。

优选的，所述一次降解，具体包括：

将肝素钠加入所述肝素钠9倍重量的纯化水进行溶解，再加入所述肝素钠1倍重量的冰醋酸，然后加入所述肝素钠重量0.4-0.6%的亚硝酸钠进行第一次降解，所述第一次降解完成后调pH至7.0-9.0，得第一次降解溶液；所述第一次降解的温度为20-30℃，所述第一次降解的时间为0.5-1.0h。

优选的，所述层析纯化，具体包括：

将所述第一次降解溶液上样至阴离子交换柱，先用0.2-0.5M氯化钠溶液进行冲洗，然后用1.0-1.5M氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液I，再用2.0-2.5M氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液II。

优选的，具体包括：

将所述洗脱液II的pH调至2.0-3.0，然后加入所述肝素钠重量0.05-0.1%的亚硝酸钠进行第二次降解，所述第二次降解完成后调pH至7.0-9.0，得第二次降解溶液；所述第二次降解的温度为20-30℃，所述第二次降解的时间为0.5-1.0h。

本发明提供了一种达肝素钠分子量的控制方法，通过一次降解、层析纯化、二次降解、还原、脱色及干燥制得达肝素钠成品。本发明通过一次降解将分子量控制在6900-7500之间，层析纯化之后再将本应去除的大分子部分进行第二次降解，充分利用了肝素钠原料，使达肝素钠收率明显提高，收率达85%以上。与现有技术相比，本发明方法操作简单易行，对分子量及分子量分布控制准确，所有工序均在常温常压下进行，离子交换工艺易于生产放大，重现性好，具有重要的应用前景。

具体实施方式

达肝素钠制备过程为达到准确控制其分子量及分子量分布的目的，需在工艺中设置纯化步骤，以去除多余的大分子或小分子部分，但大分子或小分子部分去除过多又会影响最终产品收率。为满足达肝素钠分子量及分子量分布的控制要求，以及充分利用肝素钠原料，提高达肝素钠制备工艺收率，本发明提供了一种达肝素钠分子量的控制方法，该方法操作简便、生产成本低，通过两次降解、一次纯化方法获得分子量及分子量分布符合质量标准的达肝素钠，收率达85%以上。下面将结合实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

（1）一次降解

将肝素钠加入所述肝素钠9倍重量的纯化水进行溶解，再加入所述肝素钠1倍重量的冰醋酸，然后加入所述肝素钠重量0.4-0.6%的亚硝酸钠进行第一次降解，于20-30℃降解0.5-1.0h后再加氢氧化钠调pH至7.0-8.0，得第一次降解溶液，检测其分子量为6900-7500，＞8000的比例为34-40%，＜3000的比例为15-20%。

（2）层析纯化

将所述一次降解后的溶液上样至阴离子交换柱，先用0.2-0.5M氯化钠溶液冲洗柱子，以去除部分小分子，然后用1.0-1.5M氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液I，再用2.0-2.5M氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液II。

（3）二次降解

将收集到的所述洗脱液II加盐酸调pH至2.0-3.0，然后加入所述肝素钠重量0.05-0.1%的亚硝酸钠进行第二次降解，于20-30℃降解0.5-1.0h，再加氢氧化钠调pH至7.0-8.0，得第二次降解溶液。

（4）还原、脱色及干燥

将所述第二次降解溶液与洗脱液I合并后，得合并液，检测其分子量为5900-6300，＞8000的比例为20-24%，＜3000的比例为8-12%。合并液经还原，脱色，干燥等步骤，制备成达肝素钠成品。其中，还原剂可为硼氢化钠，脱色剂可为过氧化氢，干燥方法可为真空干燥或冷冻干燥。

下面将结合具体实施场景，用具体实施例进一步对本发明提供的达肝素钠分子量的控制方法进行详细说明。

实施例2

（1）一次降解

取肝素钠1kg，加入纯化水9L搅拌溶解，再加入冰醋酸1L，加入4g亚硝酸钠进行第一次降解，于23℃降解1.0h后加氢氧化钠调pH至7.8，得第一次降解溶液，检测其分子量为7384，＞8000的比例为38.3%，＜3000的比例为15.2%。

（2）层析纯化

将上述第一次降解溶液上样至DEAE阴离子交换柱，阴离子交换柱预先用0.1M氯化钠平衡。上样完后，用0.3M氯化钠溶液冲洗3个柱体积，以去除部分小分子，再用1.1M氯化钠溶液洗脱2个柱体积，收集洗脱液 I，再用2.0M 氯化钠溶液洗脱2个柱体积，收集洗脱液II。

（3）二次降解

将收集的洗脱液II加盐酸调pH至2.8，加入0.9g的亚硝酸钠进行第二次降解，于26℃降解1.0h后加氢氧化钠调pH至7.4，得第二次降解溶液。

（4）还原、脱色及干燥

将上述第二次降解溶液与洗脱液I合并，得合并液。 合并液经还原、脱色及干燥后，制备成达肝素钠成品。得达肝素钠成品0.89Kg，收率为89%。

达肝素钠成品经检测，重均分子量为6256，分子量＞8000的比例为23.6%，分子量＜3000的比例为10.3%，抗Xa因子效价为168 IU/mg，抗Xa/抗IIa活性比值为2.6，符合质量标准要求。

实施例3

（1）一次降解

取肝素钠5kg，加入纯化水45L搅拌溶解，再加入冰醋酸5L，加入30g亚硝酸钠进行第一次降解，于23℃降解0.5h后加氢氧化钠调pH至7.6，得第一次降解溶液，检测其分子量为6972，＞8000的比例为34.3%，＜3000的比例为17.1%。

（2）层析纯化

将上述第一次降解溶液上样至DEAE阴离子交换柱，阴离子交换柱预先用0.1M氯化钠平衡。上样完后，用0.5M氯化钠溶液冲洗3个柱体积，以去除部分小分子，再用1.5M氯化钠溶液洗脱2个柱体积，收集洗脱液 I，再用2.0M 氯化钠溶液洗脱2个柱体积，收集洗脱液II。

（3）二次降解

将收集的洗脱液II加盐酸调pH至2.8，加入2.5g的亚硝酸钠进行第二次降解，于22℃降解0.5h后加氢氧化钠调pH至7.5，得第二次降解溶液。

（4）还原、脱色及干燥

将上述第二次降解溶液与洗脱液I合并，得合并液。 合并液经还原、脱色及干燥后，制备成达肝素钠成品。得达肝素钠成品0.87Kg，收率为87%。

达肝素钠成品经检测，重均分子量为6186，分子量＞8000的比例为22.4%，分子量＜3000的比例为10.8%，抗Xa因子效价为165 IU/mg，抗Xa/抗IIa活性比值为2.4，符合质量标准要求。

以上公开的仅为本发明实施例的具体实施场景，并非是对本发明作其它形式的限制，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范作用，本申请实施例并非局限于此，任何熟悉本领域的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。上述序号仅仅为了描述，不代表实施场景的优劣。如非另行定义，文中所用的所有专业和科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (3)

1.一种达肝素钠分子量的控制方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

一次降解：将肝素钠溶解后加入亚硝酸钠进行第一次降解，得第一次降解溶液；

层析纯化：将所述第一次降解溶液进行阴离子交换层析，得到洗脱液I及洗脱液II；

二次降解：在所述洗脱液II中加入亚硝酸钠进行第二次降解，得第二次降解溶液；

还原、脱色及干燥：将所述第二次降解溶液与所述洗脱液I合并后，依次进行还原、脱色及干燥，得达肝素钠成品；

所述一次降解，具体包括：

将肝素钠加入所述肝素钠9倍重量的纯化水进行溶解，再加入所述肝素钠1倍重量的冰醋酸，然后加入所述肝素钠重量0.4-0.6%的亚硝酸钠进行第一次降解，所述第一次降解完成后调pH至7.0-9.0，得第一次降解溶液；所述第一次降解的温度为20-30℃，所述第一次降解的时间为0.5-1.0h。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述层析纯化，具体包括：

将所述第一次降解溶液上样至阴离子交换柱，先用0.2-0.5M氯化钠溶液进行冲洗，然后用1.0-1.5M氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液I，再用2.0-2.5M氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液II。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二次降解，具体包括：

将所述洗脱液II的pH调至2.0-3.0，然后加入所述肝素钠重量0.05-0.1%的亚硝酸钠进行第二次降解，所述第二次降解完成后调pH至7.0-9.0，得第二次降解溶液；所述第二次降解的温度为20-30℃，所述第二次降解的时间为0.5-1.0h。