FI94534C - Menetelmä uusien hepariinijohdannaisten valmistamiseksi - Google Patents

Description

! 94534

Menetelmä uusien hepariinijohdannaisten valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää uusien hepariini-johdannaisten valmistamiseksi käsittelemällä erilaista al-5 kuperää olevia hepariinejä emäksisessä väliaineessa mahdollisesti alkalimetallisuolojen ja pelkistlmen läsnäollessa. Keksinnön mukaisesti valmistetuilla hepariinijohdannaisilla on verisuonitukoksia estävä vaikutus ja myös pienentyneet verenvuoto- ja hyytymistä estävät vaikutuk-10 set.

On tunnettua, että hepariinin kaltaisia rakenten-telta voidaan muuttaa eri tavoin käsittelemällä niitä emäksisessä väliaineessa.

EP-patenttijulkaisussa 0133078 J. S. Mardiguian 15 depolymeroi hepariiniä oligosakkaridifraktioiksi, jotka sisälsivät 4-20 sakkaridiyksikköä, käsittelemällä hepariinin bentsyyliesteriä orgaanisen tai epäorgaanisen emäksen avulla konsentraation ollessa 0,1 - 0,6 M lämpötilassa 20 °C - 80 eC. Sellaisen depolymeroinnin seurauksena muo-20 dostuu uronihapon asemien 4 ja 5 välille kaksoissidos, joka voidaan havaita UV-absorptiona aallonpituudella 230 nm.

S. Hirano et ai. (Conn. Tissue Res. 3 (1975) 73-79) depolymeroivat hepariiniä ja muita glykosaminoglykaa-25 ne ja voimakkaasti emäksisessä väliaineessa käyttäen nat rium- tai bariumhydroksidin konsentraatioita 2 - 10 M lämpötilassa yli 80 °C. Näin he saavat aikaan voimakkaan depolymeroi tumi sen, jonka seurauksena glukosidisidos glukos-amiiniyksiköiden aseman 1 ja kyseessä olevan uroniyksiköi-30 den aseman 4 välillä purkaantui, ja lisäksi sellaiseen ' ’ depolymeroitumiseen liittyy kaksoissidoksen muodostuminen uronihapon asemien 4 ja 5 välille, mikä voidaan havaita UV-spektrissä aallonpituudella 225 - 230 nm esiintyvänä absorptiona.

35 P. Sampson ja K. Meyer (Proc. Nat. Acad. Sei. USA

68 (1971) 2329-2331) havaitsivat rakenteellisen muutoksen glukosamiiniyksikössä 3,6-anhydroglukosamiinin muodostu- 2 94534 essa käsiteltäessä hepariinia 1 M natriumhydroksidilla natriumboorihydridin läsnäollessa 7 tunnin ajan lämpötilassa 80 °C.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut hepariini-5 johdannaiset eroavat täysin viitejulkaisuissa kuvatuista.

Itse asiassa niillä ei ole J. S. Mardiguianin ja S. Hira-non et ai. havaitsemien yhdisteiden kemiallis-fysikaalisia ominaisuuksia, kuten on osoitettu keskimääräisen molekyy-lipainon avulla, joka jää olleellisesti muuttumattomaksi 10 ja siten osoittaa depolymerointumisen puutteen, ja aallonpituudella 225 - 230 nm esiintyvän UV-absorption puutteena ja kaksoissidoksen resonanssin piikkien puuttumisena 13C-NMR-spektrissä, mikä tarkoittaa kaksoissidoksen puuttumista uronihapon asemien 4 ja 5 väliltä. Niillä ei myöskään 15 ole P. Sampsonin ja K. Meyerin eristämien yhdisteiden kemiallis-fysikaalisia ominaisuuksia, koska keksinnön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden 13C-NMR-spektrin avulla voidaan todeta glukosamiinin asemassa 6 olevan hiiliatomin asema ja intensiteetti muuttumattomiksi ja osoittaa £0 muuttumattomaksi 6-sulfatoidun hiiliatomin ja 6-desulfa-toidun hiiliatomin intensiteettisuhde, joka muuttuisi, jos kyseessä olisi 3,6-anhydroglukosamiinin muodostuminen, jolloin 6-sulfatoitu hiiliatomi ottaisi osaa anhydrojoh-dannaisen muodostumiseen.

25 Keksintö koskee menetelmää uusien hepariinijohdan- naisten valmistamiseksi, joiden 13C-NMR-spektrissä on signaalit kohdassa noin 53 ja noin 54 ppm, ominaiskiertokyky vesiliuoksessa on noin +50° - +90°, rikkipitoisuus on noin 8 - 11 % ja sulfaatti/karboksyylisuhde on noin 1,50 -30 2,20. Menetelmälle on tunnusomaista, että hepariiniainek- ** ‘ sen vesiliuosta käsitellään alkali- tai maa-alkalimetalli-emäksellä, jonka konsentraatio on noin 0,04 - 1 N, jolloin läsnä on alkali- tai maa-alkalimetallin suolaa konsentraa-tiona 0 - noin 1 N ja mahdollisesti katalyyttinen määrä 35 pelkistintä, 50 minuutin - 24 tunnin ajan lämpötilassa noin 42 - 60 °C, reaktioseos puhdistetaan mahdollisesti valuttamalla ioninvaihtohartsin läpi tai dialysoimalla ja 3 94534 näin muunnetun rakenteen omaavat yhdisteet saostetaan lisäämällä noin 2 - 4-kertainen tilavuus alkoholia, jossa on 1-3 hiiliatomia, pH:n ollessa noin neutraali.

Uusilla yhdisteillä, joilla on muunnettu hepariini-5 rakenne, on kemiallis-fysikaalisia ominaisuuksia kuten ominaiskiertokyky ja 13C-NMR-piikit, jotka ovat erilaisia kuin lähtöaineilla, ja niillä on lisäksi erilainen biologinen vaikutus, koska niillä on parempi toimintaspesifi-syys ja koska ne pysyvät käytännöllisesti katsoen muuttu-10 mattomina, tukkeumia estävä vaikutus, kun taaas verenvuo-tovaikutus ja hyytyrnisenestoteho ovat alentuneet. Erityisesti niille on tunnusomaista se, että niillä on kaksi uutta signaalia 13C-NMR-spektrissä aallonpituuksilla noin 53 ja 54 ppm ja niiden ominaiskiertokyky on kohonnut ar-15 voon noin +50° - noin +90* lähtöaineena käytettyyn hepa-riiniin nähden, kun käytetään vesiliuosta.

Hepariinirakenteen kemiallinen muuttuminen havaitaan vesiliuoksessa pH-arvoilla, jotka ovat neutraalin liuoksen arvoa suuremmat, emäksen, edullisesti alkali- tai 20 maa-alkalimetallisuolan, ja pelkistimen, edullisesti nat-riumboorihydridin, läsnäollessa.

Reaktio toteutetaan 50 minuutin - 24 tunnin aikana lämpötilassa noin 42 - 60 °C käyttäen emäskonsentraatioi-ta noin 0,04 N - 1 N ja suolakonsentraatioita 0 - noin 1 N 25 mahdollisesti pelkistimen, kuten esimerkiksi natriumboori-hydridin, läsnäollessa.

Menetelmässä käytetään alkali- tai maa-alkalimetal-liemäksiä ja -suoloja, pääasiassa natriumin, kaliumin, kalsiumin, magnesiumin ja bariumin.

30 Natriumin, kaliumin ja bariumin hydroksidit ovat emäksiä, joita voidaan käyttää edullisesti.

Natriumin, kaliumin, bariumin, kalsiumin ja magnesiumin asetaatit ja kloridit ja natriumin, kaliumin ja magnesiumin sulfaatit ovat suoloja, joita voidaan käyttää 35 edullisesti.

Menetelmä hepariinirakenteen muuttamiseksi toteutetaan liuottamalla hepariinimateriaali alkali- tai maa-al- 4 94534 kaliemäksen OH:n suhteen noin 0,04 N - 1 N vesiliuokseen, niin että läsnä on mahdollisesti alkali- tai maa-alkalime-tallisuolaa konsentraationa 1 N tai sen alle ja katalyyttinen määrä pelkistintä, ja termostoimalla liuos läm-5 pötilaan noin 42 - 60 °C aikaväliksi noin 50 minuuttia -24 tuntia.

Reaktion päätyttyä liuos jäähdytetään huoneenlämpö-tilaan, tehdään neutraaliksi ja mahdollisesti puhdistetaan esimerkiksi ioninvaihtohartsin tai dialyysin avulla ja lo-10 puksi muutettu hepariinijohdannainen seostetaan lisäämällä noin 2 - 4-kertainen tilavuus, edullisesti 2,5-kertainen tilavuus alkoholia, joka sisältää 1-3 hiiliatomia, kuten etyylialkoholia.

Tämän menetelmän mukaisesti valmistetuilla muunne-15 tuilla hepariineillä on joitakin tyypillisiä kemiallis-fysikaalisia ominaisuuksia, jotka ovat täysin erilaisia kuin viitejulkaisuista tunnettujen emäskäsittelyjen avulla saadut. Tämä johtuu tässä keksinnössä käytetyistä reaktio-olosuhteista, joissa parametrien arvot, ennen kaikkea e-20 mäskonsentraatio, lämpötila ja mahdollinen suolan mukana olo, poikkeavat merkittävästi edellä käytetyistä.

Uusien hepariinijohdannaisten rakenteelliset muutokset on periaatteessa osoitettu 13C-NMR-spektrin resonanssien aseman ja suhteellisen intensiteetin avulla ja 25 myös elektroforeettisen käyttäytymisen perusteella, omina! skiertokyvin arvojen kohoamisena ja rikkipitoisuuden ja sulfaatti/karboksyyli-suhteen pienenemisenä, kun karbok-syylin määrä pysyy muuttumattomana.

Vielä tyypillisemmät muutokset uusien hepariinijoh-30 dannaisten rakenteessa on todettu tutkimalla perinpohjai-** siä muutoksia, joita esiintyy 13C-NMR-spektrissä. Nämä muu- tokset koskevat joitakin erityisiä spektrin vyöhykkeitä, ja niihin kuuluu sekä uusien piikkien ilmestyminen että muiden piikkien muuntuminen. Huomionarvoista on kahden 35 uuden signaalin ilmestyminen arvoille noin 53 ja noin 54 ppm ja iduroni- ja glukosamiiniyksikön hiiliatomia 1 vastaavien piikkien siirtyminen vyöhykkeellä 92 ppm - 5 94534 102 ppm. Uusien yhdisteiden ja lähtöaineina käytettyjen yhdisteiden 13C-NMR-spektrien vertailu tekee mahdolliseksi vahvistaa, että jotkin spektrin osat ovat muuttumattomia ja että sen perusteella jotkin osat hepariinin rakenteesta 5 eivät ole muuttuneet lainkaan. Erityisesti sulfatoidun tai desulfatoidun glukosamiiniyksikön asemaa 6 vastaavat signaalit eivät ole muuttuneet. Lisäksi sulfatoitujen tai asyloitujen glukosamiiniyksiköiden asemaa 2 vastaavat piikit, iduronihapon karboksyyliryhmää vastaavaat piikit ja 10 glukuronihappoyksikköjä, jotka hepariinissa muodostavat keskimäärin 20 % uroniryhmistä, vastaavat piikit ovat muuttumattomia.

Mitä enemmän muuttuneita ovat uusien hepariinijohdannaisten kemiallis-fysikaaliset ominaisuudet, sitä voi-15 makkaammin vaikuttavia ovat reaktio-olosuhteet, kuten voidaan päätellä jäljempänä esitetyistä esimerkeistä. Sen vuoksi reaktion parametrien muuntaminen tekee mahdolliseksi valmistaa yhdisteitä, joiden rakenne on muuttunut enemmän tai vähemmän.

2C Kemiallisen muuttumisen määrä voidaan laskea mää rittämällä suhde summalle, joka saadaan laskemalla yhteen arvoilla noin 53 ppm ja noin 54 ppm esiintyvien piikien integraalit, ja summalle, joka saadaan laskemalla yhteen glukosamiiniyksikön arvoilla noin 62,5 ppm ja noin 69 ppm 25 esiintyvien piikkien integraalit, joista jälkimmäisiä pidetään sopivina referenssiarvoina, koska niiden intensiteetti pysyy vakiona ja koska ne ovat spektrivyöhykkeellä, jossa ei ole muita piikkejä. Samanaikaisesti kun resonanssit arvoilla noin 53 ppm ja noin 54 ppm kohoavat, tapah-30 tuu myös kiertokyvyn kasvu aallonpituudella 589 nm (nat- [ riumin D-viiva), ja sen vuoksi ominaiskiertokyvyn mittaus-» ta voidaan suoraan käyttää hepariinin rakenteessa tapahtuvan kemiallisen muutoksen asteen määrittämiseen. Koska mahdollisia aktiivisia reagensseja ei reaktioväliaineessa 35 käytetä, kiertokyvyn mittausta voidaan suoraan käyttää reaktion kulun tarkasteluun.

6 94534

Sekä 13C-NMR-spektrin piikkien integraalien suhde että ominaiskiertokyvyn kasvu lähtöaineeseen verrattuna on esitetty seuraavassa taulukossa 1.

Taulukko 1 5

Esimerkki Piikkien pinta-ala Muutettujen ja alkuperäis-arvoilla 53 ja 54 ppm ten hepariinien ominais-Piikkien pinta-ala kiertokyvyn ero [a]D20 arvoilla 62,5 ja 69 ppm 10 5 0,15 + 5° 6 0,25 + 7° 7 0,30 + 7° 4 0,45 +10° 1 0,55 +18° 15 2 0,75 +22° 3 1,20 +29° Nämä muunnetut hepariinit ovat lisäksi tunnettuja siitä, että niillä on erilainen elektroforeettinen käyt-20 täytyminen kuin lähtöaineina käytetyillä yhdisteillä, tunnettuja suuremmasta liikkuvuudesta 0,1 M bariumasetaat-tipuskurissa pH-arvolla 5,8 [P. Oreste, G.Torri, J. Chrom.

195 (1980) 398] ja siitä, että niiden rikkipitoisuus on noin 8 % - noin 11 %, sulfaatti/karboksyyli-suhde noin 25 1,50 - 2,20 ja ominaiskiertokyky [a]D20 noin +50° - noin +90°, kuten käy ilmi seuraavasta taulukosta 2, jossa suluissa on esitetty vastaavien lähtöaineina käytettyjen yhdisteiden arvot.

• ► .

»

il IU L Hill Hill I

7 94534

Taulukko 2

Esimerkki % sulfaatteja Sulfaattl/karbok- [a]D20 syylisuhde 5 5 10,31 (11,40) 2,17 (2,27) +50° (+45°) 6 10,69 (11,60) 2,15 (2,32) +54“ (+47“) 7 9,70 (11,00) 1,90 (2,00) +51“ (+44“) 4 9,65 (10,56) 2,03 (2,30) +57“ (+47“) 1 8,95 (10,56) 1,94 (2,20) +57° (+47“) 10 2 8,42 (10,09) 1,64 (2,13) +65“ (+43“) 3 8,12 (10,09) 1,56 (2,13) +72“ (+43°)

Uusilla hepariinijohdannaisilla on selvä tukkeumia estävä vaikutus yhdessä alentuneen hyytymiä estävän vaiku-15 tuksen kanssa lähtöaineena käytettyyn hepariiniin verrattuna. Niiden biologista aktiivisuutta määritettiin käyttäen monia tyypillisiä hepariinin testejä; suoritettiin anti-Xa-tekijätesti, APTT-testi, verenvuotoaikatesti ja kokeelliselta verisuonitukokselta suojaamistesti. APTT-20 aktiivisuus määritettiin M. J. Larrieun ja G. Weilandin julkaisussa Rev. Hematol. 12 (1957) 199 esittämän menetelmän mukaisesti, kun taas anti-Xa-aktiivisuus määritettiin E. T. Yinin ja S. Wesslerin julkaisussa Biochem. Biophys.

Acta 201 (1970) 387 esittämän menetelmän mukaisesti.

25 Jokainen tutkittu yhdiste liuotettiin paastonneiden rottien plasmaan ja sen jälkeen suoritettiin laimennukset menetelmän edellyttämien pitoisuuksien saavuttamiseksi. Suoritettiin kymmenen määritystä kunkin yhdisteen molemmille aktiivisuuksille ja määrä, joka aiheuttaa erittäin 30 merkittävän muutoksen vastaavassa testissä, laskettiin ,· yksiköinä pg/ml. Erityisesti kunkin tuotteen aktiivisuus määritettiin konsentraationa, joka vastaavasti kaksinkertaistaa APTT-ajan ja joka suurentaa anti-Xa-arvoa 30 %, käyttäen yksiköinä pg/ml. Näissä kahdessa testissä saadut β 94534 arvot (ks. taulukko 3) osoittavat, että uudet yhdisteet pienentävät hyytymistä estävää vaikutusta.

Verenvuotoaika määritettiin rottien avulla käyttäen menetelmää, jonka E. Denaja et ai. ovat esittäneet julkai-5 sussa Thromb. Haemost. 48 (1982) 108, ja tulos määritettiin laskemalla prosentuaalinen verenvuotoajan piteneminen rotilla, joille oli annettu uusia hepariinejä, verrattuna verenvuotoajan pitenemiseen rotilla, jotka ovat saaneet vastavaa lähtöaineena käytettyä hepariinia, kun jälkim-10 mäisten arvoksi on merkitty 100 %. Kaikilla muunnetun he-pariinirakenteen omaavilla uusilla johdannaisilla, on u-sein hyvin merkittävä verenvuotoajan lyheneminen verrattuna vastaaviin lähtöaineina käytettyihin hepariineihin.

Tukoksia estävää vaikutusta tutkittiin käyttäen 15 laskimotukostilatestiä, jonka S. Reyers et ai. ovat esittäneet julkaisussa Thromb. Res. 18 (1980) 669-674. Uusilla yhdisteillä aikaan saatu suoja laskettiin prosentteina antamalla arvo 100 tukoksia estävälle vaikutukselle, joka on lähtöaineina käytetyillä hepariineillä.

20 Saadut tulokset osoittavat kahden hepariinisarjan tulosten samanlaisuutta tässä tukoksia estävän vaikutuksen testissä.

Edellä kuvattujen biologisten testien arvot on esitetty seuraavassa taulukossa 3, jossa vastaavien lähtöai-25 neina käytettyjen hepariinien anti-Xa- ja APTT-arvot on esitetty suluissa.

• « · · «·*.* !*«· l*i rn-m . i 9 94534

Taulukko 3

Anti-Xa-aktii- APTT-aktiivi- Vuotoaika; Antitrom-visuus; Yhdis- suus; Yhdis- % pidenty- bootti- 5 teen teen määrä, nen hepa- nen suo-

Esim. määrä, joka joka kaksin- riiniläh- jaus-% lisää anti-Xa- kertaistaa töaineen heparii- arvoa APTT-ajan suhteen nilähtö- 30 % (yg/ml) (pg/ml) aineeseen 10 verrattuna 1 30,2 (20,6) 4,2 (1,7) 22 100 2 33,7 (18,6) 8,9 (1,9) 83 117 3 43,5 (18,6) 16,3 (1,9) 11 53 15 4 18,1 (20,6) 4,8 (1,7) 60 75 5 21,0 (16,5) 11,5 (10,8) 9 113 6 44,0 (40,6) 8,8 (8,5) 30 113 7 19,6 (18,2) 2,6 (2,0) 30 88 : 20 Edellä havainnolistettujen farmakologisten ominai suuksien kannalta näitä uusia hepariinijohdannaisia voidaan käyttää hoidettaessa verisuonitukossairauksia. Edulliset antotavat ovat parenteraalinen ja ihonalainen antotapa steriilinä vesiliuoksena, joka mahdollisesti sisäl-25 tää myös joitakin suoloja liuoksen saattamiseksi isotoni-* seksi ja joitakin säilöntäaineita.

Annostelualue riippuu käytetyistä farmaseuttisista koostumuksista ja potilaan tilasta; edullisesti heparii-nijohdannaista annetaan määrä, joka vastaa 5000 - 20000 30 yksikköä anti-Xa-tekijää (U.A. Xa), kerran tai useammin päivässä.

Lähtöaineina voidaan käyttää eri alkuperää olevia hepariinimateriaaleja. Esimerkiksi kaupallisia hepariineja ja hepariineja, joita on saatu puhdistamalla kaupallisia 35 hepariineja, sekä pienen molekyylipainon omaavia hepariineja, joita saadaan depolymeroimalla alalla tunnettuja menetelmiä käyttäen, käytettiin nyt kuvattujen muunnettujen hepariinien valmistamiseksi. Seuraavassa esitetään 10 94534 tässä keksinnössä lähtöaineina käytettyjä hepariinimate-riaaleja.

Natriumhepariini ALFA 87-78 25 g kaupallista natriumhepariinia liuotetaan 2000 5 ml:an vettä ja kaadetaan noin 30 min:n aikana liuokseen, joka sisältää 111,2 g kalsiumasetaatti-monohydraattia 2000 ml:ssa vettä, 57 ml etikkahappoa ja 600 ml etyylialkoholia, niin että lämpötila pysyy arvossa noin 8 - 10 °C. Saatu suspensio suodatetaan 15 tunnin kuluttua lämpötilas-10 sa 5 "C ja suodos lisätään 1000 ml:an etyylialkoholia ja 3 tunnin kuluttua lämpötilassa 5 °C saatu saostuma suodatetaan. Sen jälkeen saostuma liuotetaan 200 ml:an vettä, liuoksen pH säädetään arvoon 7,0 1 M natriumhydroksidin avulla ja käsitellään sen jälkeen 100 ml:11a natriummuo-15 dossa olevaa hartsia Dowex 50W X8 ja 70 ml:11a vettä 20 min:n ajan. Liuos ja hartsi siirretään kromatografointi-pylvääseen (halk. 1,6 cm, h = 10 cm), joka sisältää 80 ml samaa hartsia. Kun liuos on valunut massan läpi ja massaa on eluoitu tislatulla vedellä, kunnes liuoksen kokonaisti-*20 lavuus on 400 ml, mainittu liuos lisätään 12 g:an natrium-asetaatti-trihydraattia ja 1000 ml:an etyylialkoholia. Saostuma suodatetaan ja kuivataan alennetussa paineessa, jolloin saadaan 19,2 g puhdistettua natriumhepariinia ALFA 87-78, jolla on seuraavat kemiallis-fysikaaliset ominai-.25 suudet: S = 10,09 %, sulfaatti/karboksyyli-suhde = 2,13, [a]D20 = +43° (C - 1 % vedessä) 13C-NMR-spektri (ppm): 177,3; 104,7; 102,0; 99,4; 80,0; 78,6; 72,3; 71,9; 69,0; 62,5; 60,6.

30 Natriumhepariini ALFA 87-81 l. Tuotetta saatiin käyttäen samaa puhdistusmenetelmää kuin tuotteelle ALFA 87-78 ja käyttäen lähtöaineena 50 g kaupallista hepariinia.

Saatiin 36,5 g puhdistettua hepariinia, jolla oli 35 seuraavat fysikaalis-kemialliset ominaisuudet: 11 94534 S = 10,56 %; sulfaatti/karboksyyli-suhde * 2,20 [α]30 = +47° (C - 1 % vedessä) 13C-NMR-spektri (ppm): 177,3; 104,7; 102,0; 99,5; 80,1; 78,6; 72,4; 72,0; 69,1; 62,7; 60,7.

5 Kaupallinen natriumheparlini

Kyseessä on hepariini, jolla on seuraavat kemiallis- fysikaaliset ominaisuudet: S « 11,0 %; sulfaatti/karboksyyli-suhde * 2 [a]30 - +44* (C - 1 % vedessä) 10 13C-NMR-spektri (ppm): 177,4; 104,6; 101,9; 99,8; 79,9; 78,6; 72,2; 71,8; 69,0; 62,6; 60,6.

Pienen molekyylipainon omaava natriumheparlini LMW ALFA 86-02

Pienen molekyylipainon omaava natriumheparlini LMW 15 ALFA 86-02 valmistettiin depolymeroimalla vetyperoksidilla kupari(II)-ionien läsnä ollessa käyttäen menetelmää, joka on esitetty kansainvälisessä patenttijulkaisussa W0 86/ 06729.

Tuotteella on seuraavat kemiallis-fysikaaliset omi-20 naisuudet: keskimääräinen molekyylipaino: 4200 daltonia S = 11,40 %; sulfaatti/karboksyyli-suhde = 2,27 20 [a]£ = +45° (C » 1 % vedessä) 13C-NMR-spektri (ppm): 177,4; 104,5; 101,9; 99,8; 25 79,9; 78,6; 72,2; 71,9; 69,1; 62,7; 60,7.

Pienen molekyylipainon omaava natriumheparlini LMW ALFA 87-198

Pienen molekyylipainon omaava natriumheparlini LMW ALFA 87-198 valmistettiin depolymeroimalla LMW 86-02:n 30 valmistamiseksi esitetyn menetelmän mukaisesti.

.* Tuotteella on seuraavat kemiallis-fysikaaliset omi naisuudet: S = 11,60 %; sulfaatti/karboksyyli-suhde = 2,32 [a]p® = +47° (C = 1 % vedessä) 35 13C-NMR-spektri (ppm): 177,7; 104,8; 102,0; 99,6; 12 94534 80,2; 78,6; 72,4; 71,9; 69,2; 62,7; 60,6.

Ominaiskiertokyvyn [a]D20 arvojen määritykset suoritettiin 1-prosenttisessa vesiliuoksessa.

Sulfaatti/karboksyyli-suhteen määritys suoritettiin 5 potentiometrisesti.

Rikin määrä prosentteina määritettiin sekä potentiometrisesti että Schoenigerin menetelmää käyttäen.

13C-NMR-spektrit määritettiin taajuudella 75,47 MHz spektrometrillä Varian CFT-75 käyttäen liuottimena D20:ta 10 ja sisäisenä vertailuaineena 3-trimetyylisilyylipropaani- sulfonaattia.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

Esimerkki 1 1.8 g hepariinia ALFA 87-81 lisätään 45 mitan vesi-15 liuosta, joka sisältää 0,4 g natriumhydroksidia (0,225 N), 2,3 g natriumasetaattia (0,625 N) ja 10 mg natriumboori-hydridiä. Saatua liuosta pidetään 3,5 tunnin ajan lämpötilassa 60 °C, sen jälkeen se jäähdytetään huoneen lämpöti-.. laan, tehdään neutraaliksi jääetikalla ja sekoitetaan 2,5- *20 kertaiseen tilavuuteen etanolia. Saostuma suodatetaan, pestään suodattimena käyttäen etanolin ja veden seosta (6:1) ja kuivataan. Saadaan 1,7 g tuotetta, jolla on 13C-NMR-spektri, jossa on karakteristiset viivat seuraavilla δ-arvoilla (ppm): 177,3; 104.3; 101,9; 99,4; 98,4; 97,2; 25 96,8; 79,7; 79,1; 78,5; 72,1; 71,8; 71,2; 68,8; 62,4; 60,6; 60,3; 54,1; 53,1.

Esimerkki 2 1.8 g hepariinia ALFA 87-78 lisätään 45 ml:an vesi-liuosta, joka sisältää 0,4 g natriumhydroksidia (0,225 N), 3C 2,3 g natriumasetaattia (0,625 N) ja 10 mg natriumboori-hydridiä. Saatua liuosta pidetään 15 tunnin ajan lämpötilassa 60 °C, sen jälkeen se tehdään neutraaliksi etikkaha-polla ja sitten se valutetaan kolonnin (halk. 1,2 cm, h = 8 cm) läpi, joka sisältää anionihartsin Dowex 1x2 klori- 13 94534 dimuotoa. Läpi mennyt liuos ja pesuliuokset kootaan yhteen ja lisätään 2,5-kertainen tilavuus etanolia. Saostuma suodatetaan, pestään suodattimena käyttäen etanolin ja veden seosta (6:1) ja kuivataan. Saadaan 1,65 g tuotetta, jolla 5 on 13C-NMR-spektri, jossa on karakteristiset viivat seu-raavilla δ-arvoilla (ppm): 177,4; 104,6; 101,8; 98,6; 97,2; 96,8; 79,1; 78,9; 72,2; 71,5; 71,2; 68,8; 62,5; 60,3; 54,1; 53,1.

Esimerkki 3 10 1,8 g hepariinia ALFA 98-78 lisätään 120 ml:an ve siliuosta, joka sisältää 4,8 g (1 N) natriumhydroksidia. Liuosta pidetään 3,5 tunnin ajan lämpötilassa 60 °C, tehdään neutraaliksi etikkahapolla ja seosta dialysoidaan yön ajan virtaavalla vedellä ja 6 tunnin ajan tislatulla ve-15 dellä. Sen jälkeen liuokseen sekoitetaan 3,5 g natriumase-taattia, tehdään neutraaliksi etikkahapolla ja sekoitetaan 2,5-kertaiseen tilavuuteen etanolia. Saostuma suodatetaan, pestään käyttäen etanolin ja veden seosta (6:1) ja kuivataan. Saadaan 1,7 g tuotetta, jolla on 13C-NMR-spektri, ‘20 jossa on karakteristiset viivat seuraavilla 6-arvoilla (ppm): 177,4; 104,6; 101,7; 98,6; 98,4; 97,2; 96,8; 79,7; 79,1; 78,6; 73,5; 72,5; 72,3; 72,1; 71,5; 68,8; 62,6; 60,4; 60,2; 54,0; 53,1.

Esimerkki 4 , 25 4 g hepariinia ALFA 87-81 lisätään 120 ml:an vesi- liuosta, joka sisältää 4,8 g natriumhydroksidia (IN), 6,2 g natriumasetaattia (0,625 N) ja 25 mg natriumboorihydri-diä. Reaktioseosta pidetään 3,5 tunnin ajan lämpötilassa 60 °C, sen jälkeen se tehdään neutraaliksi etikkahapolla, 30 dialysoidaan 24 tunnin ajan virtaavalla vedellä ja valute-: taan kolonnin (halk. 1,6 cm, h - 15 cm) läpi, joka sisäl tää anionihartsin Dowex 1x4 kloridimuotoa. Läpi mennyt liuos ja pesuliuokset sekoitetaan 4 g:n kanssa natriumasetaattia ja 2,5-kertaisen tilavuuden kanssa etanolia. Saos-35 tuma suodatetaan ja pestään suodattimena käyttäen etano- 1Λ 94534 14

Iin ja veden seosta (6:1) ja kuivataan. Saadaan 3,55 g tuotetta, jolla on 13C-NMR-spektri, jossa on karakteristiset viivat seuraavilla 6-arvoilla (ppm): 177,4; 104,5; 101,8; 99,4; .98,7; 97,1; 79,5; 78,6; 73,5; 71,8; 68,8; 5 62,4; 60,3; 54,0; 53,1.

Esimerkki 5 1,8 g hepariinia LMW ALFA 86-02 lisätään 50 ml:an vesiliuosta, joka sisältää 0,08 g natriumhydroksidia (0,04 N), 2,6 g natriumasetaattia (0,625 N) ja 10 mg nat-10 riumboorihydridiä. Saatua liuosta pidetään 210 minuutin ajan lämpötilassa 60 "C, sen jälkeen se jäähdytetään huoneenlämpötilaan ja valutetaan ensin kolonnin (halk. 1,2 cm, h = 10 cm) läpi, joka sisältää anionihartsin Dowex 1 x 4 OH-muotoa ja sen jälkeen kolonnin läpi, joka sisältää 15 kationihartsin Dowex 50 WX8 H1-muotoa (halk. 1,2 cm, h = 10 cm). Läpi mennyt liuos ja pesuliuokset neutraloidaan käyttäen natriumhydroksidin 2 N vesiliuosta ja sen jälkeen sekoitetaan 4 g:n kanssa natriumasetaattia ja 2,5-kertai-sen tilavuuden kanssa etanolia. Saatu saostuma pestään ‘20 käyttäen etanolin ja veden seosta (6:1) ja kuivataan. Saadaan 1,4 g tuotetta, jolla on 13C-NMR-spektri, jossa on karakteristiset viivat seuraavilla δ-arvoilla (ppm): 177,4; 104,6; 101,9; 98,6; 98,4; 97,2; 96,8; 79,9; 78,6; 72,3; 71,9; 68,8; 62,6; 60,3; 54,1; 53,1.

25 Esimerkki 6 10 g hepariinia LMW ALFA 87-198 lisätään 300 ml:an vesiliuosta, joka sisältää 2,7 g natriumhydroksidia (0,225 N), 15 g natriumasetaattia (0,625 N) ja 60 mg nat-riumboorihydridiä. Saatua liuosta pidetään 50 minuutin 30 ajan lämpötilassa 60 °C, jäähdytetään huoneenlämpötilaan, *. laimennetaan 500 ml:ksi tislatulla vedellä ja valutetaan ensin kolonnin (halk. 2 cm, h = 15 cm) läpi, joka sisältää anionihartsin Dowex 1x2 0H-muotoa, ja sen jälkeen kolonnin läpi, joka sisältää kationihartsin Dowex 50 WX8 35 H1-muotoa (halk. 2 cm, h = 15 cm). Läpi mennyt liuos ja I ift-i- Kili I ! 4 #1 is 94534 pesuliuokset neutraloidaan käyttäen 4 M natriumhydroksidin vesiliuosta ja sen jälkeen sekoitetaan 20 g:n kanssa nat-* riumasetaattia ja 2,5-kertaisen tilavuuden kanssa etano lia. Saatu saostuma pestään käyttäen etanolin ja veden 5 seosta (6:1) ja kuivataan. Saadaan 9,1 g tuotetta, jolla on 13C-NMR-spektri, jossa on karakteristiset viivat seu-raavilla δ-arvoilla (ppm): 177,4; 104,6; 101,9; 99,8; 98,6; 98,4; 97,2; 96,8; 79,6; 78,6; 72,2; 71,8; 68,9; 62,5; 60,3; 54,1; 53,1.

10 Esimerkki 7 15 g kaupallista hepariinia lisätään 600 ml: an vesiliuosta, joka sisältää 5,4 g natriumhydroksidia (0,225 N), 30 g natriumasetaattia (0,625 N) ja 120 mg natriumboo-rihydridiä. Liuosta pidetään 4 tunnin ajan lämpötilassa 15 42 °C, jäähdytetään huoneenlämpötilaan ja tehdään neut raaliksi etikkahapolla. Liuosta dialysoidaan yön ajan vir-taavalla vedellä ja sen jälkeen valutetaan kolonnin (halk.

2,8 cm, h s 15 cm) läpi, joka sisältää anionihartsin Dowex 1x2 kloridimuotoa. Läpi mennyt liuos ja pesuliuokset se-20 koitetaan 10 g:n kanssa natriumasetaattia, pH säädetään arvoon 7 käyttäen natriumhydroksidin 2 N vesiliuosta ja sekoitetaan 2,5-kertaisen tilavuuden kanssa etanolia.

Saatu saostuma pestään käyttäen etanolin ja veden seosta (6:1) ja kuivataan. Saadaan 13,9 g tuotetta, jolla on “οι 25 NMR-spektri, jossa on karakteristiset viivat seuraavilla δ-arvoilla (ppm): 177,3; 104,6; 101,9; 99,8; 98,6; 98,4; 97,2; 96,8; 79,9; 78,6; 72,2; 71,8; 69,0; 62,5; 60,3; 54,1; 53,1.

Esimerkki 8 30 Parenteraaliseen käyttöön tarkoitettu lääke sisäl- : tää: - esimerkin 1 mukaisesti muunnettua hepariinia 10 000 U.A.Xa - F.U. natriumkloridia F.U. 5 mg 35 - B.P. bentsyylialkoholia 8 mg - kahdesti tislattua steriiliä vettä 1 ml

Claims (6)

16 94534

1. Menetelmä uusien hepariinijohdannaisten valmistamiseksi, joiden 13C-NMR-spektrissä on signaalit kohdassa 5 noin 53 ja noin 54 ppm, ominaiskiertokyky vesiliuoksessa on noin +50® - +90°, rikkipitoisuus on noin 8 - 11 % ja sulfaatti/karboksyylisuhde on noin 1,50 - 2,20, tunnettu siitä, että hepariiniaineksen vesiliuosta käsitellään alkali- tai maa-alkalimetalliemäksellä, jonka kon- 10 sentraatio on noin 0,04 - 1 N, jolloin läsnä on alkali-tai maa-alkalimetallin suolaa konsentraationa 0 - noin 1 N ja mahdollisesti katalyyttinen määrä pelkistintä, 50 minuutin - 24 tunnin ajan lämpötilassa noin 42 - 60 °C, reaktioseos puhdistetaan mahdollisesti valuttamalla ionin- 15 vaihtohartsin läpi tai dialysoimalla ja näin muunnetun rakenteen omaavat yhdisteet saostetaan lisäämällä noin 2 -4-kertainen tilavuus alkoholia, jossa on 1 - 3 hiiliatomia, pH:n ollessa noin neutraali. .. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- "20 n e t t u siitä, että emäs on natrium-, kalium- tai ba-riumhydroksidi.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suola on natrium-, kalium-, barium-, kalsium- tai magnesiumkloridi tai -asetaatti tai 2. natrium-, kalium- tai magnesiumsulfaatti.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pelkistin on natriumboorihydridi.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdisteet saostetaan lisäämällä 30 noin 2,5-kertainen tilavuus etyylialkoholia. i

91 IN t I ! Hft i 17 94534