KR960015110B1 - 새로운 헤파린 유도체 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
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Description
본 발명은 여러 다양한 근원의 헤파린을 임의 선택적으로 알칼리금속염과 환원제 존재하에 염기성 매질속에서 처리함으로써 제조되는 출혈성이 낮고 항응고성이 낮으면서 동세 항응혈작용을 가지는 새로운 헤파린 유도체에 관한 것이다.
헤파린게 구조는 염기성 매질속에서 처리함으로써 여러가지 방식으로 수정될 수 있다.
유럽공보 Ep 제0133078호(Mardiguian J.S.)에는 20~80℃의 온도에서 0.1~0.6몰 농도의 유기 또는 무기염기에 의해 헤파린의 벤질에스테르를 처리함으로써, 헤파린을 4~20당류 단위의 올리고당류로 해중합시키는 것에 대해 발표되어있다. 이러한 해중합은 우론산의 4와 5위치에 이중 결합의 생성을 수빈하며 이는 U.V. 스펙트럼에서 230nm에서의 흡수에 의해 검출될 수 있다.
관련문헌(Hirano S. et al., Conn. Tissue Res., 3, 73~79, 1975)에는 80℃ 이상의 온도에서 2~10몰 농도의 수산화나트륨 또는 바륨을 사용하며, 헤파린 및 기타 글리코사미노글리칸을 강한 염기성 매질속에서 해중합시키는 것에 대해 기술되어 있다. 이러한 방법에 따르면 글루코사민 단위의 1위치와 인접한 우론산 단위의 4위치 사이에 글루코시드 결합이 끊어지는 것을 수반하는 강한 해중합반응이 일어나며 더구나 이러한 해중합은 U.V. 스펙트럼에서 225~300nm에서의 흡수에 의해 검출될 수 있는 우론산의 4와 5위치 사이의 이중 결합의 생성을 수반한다.
문헌(Sampson p. and Meyer K., Proc. Nat. Aead. Sci. USA, 68, 2329~2331, 1971)에는 80℃에서 7시간 동안 수소화붕소나트륨 존재하여 1N 수산화나트륨으로 헤파린을 처리함으로써, 3,6-안히드로-글루코사민을 생성시켜 글루코사민 단위의 구조적 수정을 이루는 것에 대해 기술되어 있다.
본 발명의 목적인 헤파린 유동체는 선행기술에 명시된 것과는 완전히 다르다.
즉 실제로 본 헤파린 유도체는 해중합 되지않기 때문에 평균 분자량이 변화되지 않고 유지되며, UV 스펙트럼에서 225~230nm에서의 흡수가 없고13C-NMR에서 이중결합의 공명에 해당하는 피크가 존재하지 않으므로 우론산의 4와 5 위치에 이중 결합이 존재하지 않음을 알 수 있으므로, Mardigaian J.S. 및 Hiran S. et al. 에 의해 제조된 화합물의 화학물리적 특성을 가지지 않는다. 또한 본 발명에 따라 제조된 화합물의13C-NMR 스펙트럼은 글루코사민의 6위치에 있는 탄소원자의 시그널세기와 위치가 변하지 않음을 보여주며, 또한 안히드로유도체의 생성에 있어서 6-황산화 탄소원자의 관여로 인해 3,6-안히드로글로코사민의 생성의 경우에 변화되어야 하는 6-탈황산화탄소원자와, 6-황산화탄소원자 사이의 세기의 비가 변화지 않음을 보여주므로, 본 유도체는 Sampson P. 및 Meyer K. 에 제조된 화합물의 화학물리적 특성을 가지지 않는다.
본 발명은 혈진증의 치료목적으로 사용되는 새로운 헤파린 유도체 및 그 제조방법, 즉 임의 선택적으로 염 및 환원제 존제하에 시판용 또는 적합한 처리에 의해 정제시킨 또는 해중합시킨 여러 근원의 헤파린을 염기성 수성 매질속에서 화학적 수정시킴으로써 상기 헤파린 유도체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
수정된 헤파린 구조를 가지는 새로운 화합물은 출발 화합물과는 다른 화학 물리적 특성(예를 들면 비선광도 및13C-NMR 피크)을 가지며 또한 출혈성과 항응고성이 낮으면서 항응혈 특성은 사실상 변하지 않고 유지되는 보다 우수한 작용 특이성을 보여주는 등의 그 생물학적 특성도 다르다.
특히 본 헤파린 유도체는13C-NMR 스펙트럼에서 약 53 및 54ppm에서 2개의 새로운 시그널을 나타내며, 비선광도는 출발물질과 비교하여 수용액중 약 50~90°정도의 증가된 값을 가지는 것을 특징으로 한다.
헤파린 구조의 화학적 수정은 염기, 바람직하게는 알칼리금속 또는 알칼리 토금속의 수산화물 존재하에, 임의 선택적으로 알칼리금속 또는 알칼리토금염, 및 환원제 바람직하게는 수소화붕소 나트륨 존재하에 중성보다 높은 pH의 수성매질속에서 달성된다.
반응은 약 0.01~1N 농도의 염기 및 0~약1N 농도의 염을 사용하여, 임의 선택적으로 환원제 예를 들면 수소화붕소나트륨 존재하에 약 35~70℃의 온도에서 0.5~24시간 동안 수행된다.
알칼리금속 또는 알칼리토금속 염기 및 염으로는 주로 나트륨, 칼륨, 칼슘 마그네슘 및 바륨염기 또는 염이 바람직하다.
수산화나트륨, 칼륨, 바륨, 칼슘 및 마그네슘이 바람직하게 사용될 수 있는 염기이다.
초산나트륨, 칼륨, 바륨, 칼슘, 마그네슘 및 염화나트륨, 칼륨, 바륨, 칼슘 마그네슘 및 황산나트륨, 칼륨, 마그네슘이 바람직하게 사용될 수 있는 염이다.
헤파린 구조의 수정공정은 약 0.01~1N의 알칼리금속 또는 알칼리토금속 염기 존재하에 임의 선택적으로 1N 이하 농도의 알칼리금속 또는 알칼리토금속염 및 촉매 적양의 환원제 존재하에 수용액속에서 헤파린 물질을 용해시킨 다음, 약 35~70℃ 온도에서 약 0.5~24시간 동안 항온시킴으로써 수행된다.
반응이 끝나면 용액을 실온으로 냉각시키고 pH를 중심으로한 다음 필요하다면 예를 들어 이온교환수지 또는 투석에 의해 정제한 후 마지막으로 약2~약 4부피, 바람직하게는 2.5 부피의 C1-C3알콜, 예를 들면 에틸알콜을 첨가시켜 수정된 헤파린 유도체가 침전되게 한다.
이 공정에서 얻어진 수정된 헤파린은 종래에 알려진 알칼리 처리에 의해 얻어지는 헤파린과는 완전히 다른 고유한 화학물리적 특성을 나타낸다.
이것은 조변수(즉 염기농도, 온도 및 염 존재여부)가 종래 사용된 것과는 상당히 다른 본 발명에 사용되는 반응조건 때문이다.
새로운 헤파린 유도체의 구조적 수정은 주로13C-NMR 스펙트럼에서 공명의 위치 및 상대 세기 및 전기영동 특성으로부터, 또한 비선광도값의 증가 및 황함량 및 황산염/카르복실의 비의 감소(카르복실 함량의 불변을 의미함)로부터 알 수 있다.
새로운 헤파린 유도체의 구조의 보다 특성적인 변화는13C-NMR 스펙트럼에서 나타내는 큰 변화를 연구함으로써 확인될 수 있다. 이러한 변화는 스펙트럼의 특정영역으로 나타나며 이에는 새로운 피크의 출현 및 다른 피크의 변형도 포함된다. 특히 중요한 점은 약 53 및 약 54ppm에서 2개의 새로운 시그날이 나타나며, 92와 102ppm 사이의 영역에서 이두론산과 글루코사민 단위의 1탄소 원자에 해당하는 피크의 이동이 나타난다는 점이다. 새로운 화합물과 출발화합물의13C-NMR 스펙트럼을 비교 확인하면, 스펙트럼의 일부영역이 변하지 않으므로 따라서 헤파린 구조의 일부는 전혀 수정되지 않는다는 것을 알 수 있다. 특히 황산화 또는 탈황산화 글루코사민 단위의 6위치에 대한 시그널은 수정되지 않는다. 또한 황산화된 또는 아세틸화된 글루코사민 단위의 2위치에 대한 피크, 이두론산의 카르복실기에 대한 피크, 및 헤파린중 유론산 잔기의 평균 20%를 구성하는 글루쿠론산 단위에 대한 피크도 변하지 않는다.
새로운 헤파린의 화학물리적 특성은 비한정적인 실시예로부터 추론할 수 있는 바와 같이 수정정도가 크면 클수록 그 반응조건은 더욱 제한적이게 되는 결과를 초래한다. 그러므로 반응의 조변수의 수정으로 얻어지는 화합물의 구조를 보다 심하게 또는 덜심하게 수정시킬 수 있다.
화학적 수정의 정도는 약 53 및 54ppm에서의 피크의 적분의 합과 약 62.5 및 약 69ppm에서의 글루코사민 단위의 6위치의 탄소원자의 피크의 적분의 합 사이의 비에 의해 계산될 수 있다. 62.5 및 69ppm은 그 피크세기가 안정하고 또한 다른 피크가 존재하지 않는 스펙트럼 영역에 있기 때문에 임의의 기준으로서 선택하였다. 약 53 및 약 54ppm에서의 공명의 증가와 함께 589nm (D선, 나트륨)에서 선광도의 증가가 있으므로 비선광도의 측정치를 헤파린 구조에 생기는 화학적 수정의 정도를 계산하는데 직접 이용할 수 있다. 광학적활성물질은 반응매질에 사용하지 않으므로 선광도의 측정치를 반응과정의 검토에 직접 이용할 수 있다.
출발물질에 대한13C-NMR 스펙트럼의 피크의 적분의 비 및 비선광도의 증가치는 표 1과 같다.
수정된 헤파린은 pH 5.8에서의 초산나트륨 완충액 0.1M에서 큰 이동도(P. Oreste, G. Torri, J. Chrom, 195, 398, (1980))를 가지는 것을 특징으로 하는 출발화합물과는 다른 전기영동특성을 가지며, 또한 황함량은 약 8~11%이고, 황산염/카르복실비는 약 1.50~2.20이며, 비선광도
은 약 50~90°임을 특징으로 한다.
이에 대해서는 표 2에 나타내었는데 이표의 괄호안의 수치는 해당 출발화합물의 값이다.
본 발명의 목적인 새로운 헤파린 유도체는 출발물질에 비해 낮은 출혈성 및 항응고성을 가지면서 현저한 항응혈작용을 가진다. 이러한 생물학적 작용은 여러가지 전형적인 헤파린 테스트를 통해 평가될 수 있다. 실제로 항 Xa 인자, APTT, 출현시간 및 실험적 혈전증으로부터의 보호에 대한 테스트를 수행하였다. APTT 작용은 종래방법[Larriou M.J. and Weiland G., Rev. Hematol., 12, 199, (1957)]에 의해 측정되었으며 항 Xa 작용은 종래방법[Yin E.T. and Wessler S., Biochem. Biophys Acta, 201, 387, (1970)]에 의해 측정되었다.
시험되는 각 화합물을 절식하는 쥐로부터 취한 혈장내에 용해시킨 후, 각 방법에 필요한 농도로 희석시켰다. 각 화합물에 대한 두가지 작용에 대해 10번 측정하였으며, 해당 테스트에서 매우 큰 변화를 야기시키는 양을 mcg/㎖ 단위로써 계산하였다. 특히 각 제품의 작용성은 각각 APTT 시간을 2배로하는 통도, 항-Xa값을 30% 증가시키는 농도, 즉 meg/㎖ 로써 나타내었다. 두가지 테스트에서 얻어진 값(표 3)은 새로운 화합물이 낮은 항응고성을 가진다는 것을 확인시켜준다.
출혈시간에 대한 테스는 종래방법(Dejana E. Et al., Thromb. Haemost., 48, 108, 1982)에 따라 쥐를 사용하여 수행되었으며, 그 결과로는 100%로 간주되는 해당 출발 헤파린으로 처리한 주에서의 출혈 연장시간에 대한 새로운 헤파린으로 처리한 쥐에서의 출현 연장시간의 퍼센트를 계산하여 나타내었다. 본 발명의 목적인 수정된 헤파린 구조를 가지는 모든 새로운 헤파린 유도체는 해당 출발 헤파린과 비교할 때 출혈시간이 매우 현저하게 감소되는 특성을 가진다.
항응혈 작용은 문헌(Reyers S. et al. Thromb. Res. 18, 1669-74, 1980)에 기술되어 있는 울혈 정맥 혈전중 테스트에 의해 평가되었다. 새로운 화합물에 의해 이루어지는 보호는, 출발 헤파린에 의해 이루어지는 항응혈 보호를 100으로 취하여 이에 대한 퍼센트로서 계산하였다. 얻어진 결과는 항응혈 작용에 대한 이 테스트에 있어서 두 계열의 헤파린이 사실상 동일하다는 것을 보여준다.
상술한 생물 학적 테스트의 값은 표 3에 기록되어 있다. 여기서 해당 출발 헤파린의 항-Xa 값 및 APTT값은 괄호안에 기록되어 있다.
위에 나타난 약리학적 특성으로 볼 때, 이러한 새로운 헤파린 유도체는 혈전증의 치료에 효과적이다. 바람직한 투여방법은 약간의 염(용액을 등장액으로 유지시키기 위한 목적)과 약간의 방부제를 함유하는 멸균 수용액 형태로 비경구투여 및 피하투여하는 투여량은 사용되는 약제조성물 및 환자의 상태에 의존한다. 본 발명에 따르는 헤파린 유도체의 바람직한 투여방법은 항-Xa 인자(U.A. Xa) 5000~20,000 단위에 해당하는 양의 헤파린。도체를 1일 1회 또는 수회 투여하는 것이다.
출발물질로는 서로 다른 근원의 헤파린 물질을 사용할 수 있다. 예를 들면 시판용 헤파린 및 시판용 헤파린을 처리하여 정제시킨 헤파린, 또한 당해 분야에 알려진 방법에 따라 해중합시켜 얻어지는 저분자량의 헤파린을, 본 발명의 목적인 수정된 헤파린을 제조하는데 사용하였다. 이후에 본 발명에 사용되는 출발 헤파린의 제조방법을 설명한다.
[헤파린 나트륨 ALFA 87-78]
시판용 헤파린 나트륨 25g을 2000㎖의 물속에 용해시키고 이것을 2000㎖의 물, 57㎖의 초산 및 600㎖의 에틸알콜중에 111.2g의 초산칼슘 일수화물을 함유하는 용액에 30분간 따라 부으면서 온도는 약 8~10℃로 유지시킨다. 이렇게 생성된 현탁액을 5℃에서 15분 지난 다음 여과시킨 후, 1000㎖의 에틸알콜을 가하고 5℃에서 3시간 지난 다음 생성된 침전물을 여과시킨다. 그 다음 이 침전물을 200㎖의 물에 용해시킨 후 이 용액의 pH를 1N 수산화나트륨을 사용하여 7.0으로 조절한 다음 100㎖의 Dowex 50W X8 (나트륨형태) 수지와 70㎖의 물(20분간)로 처리한다. 용액과 수지를 동일한 수지 80㎖가 들어있는 크로마토그래픽컬럼(ø=1.6cm, h=10cm)속에 옮겨넣는다.
이 용액을 삼출시키고 용액의 총 부피가 400㎖가 될 때까지 증류수로 용출시킨 다음 상기 용액에 12g의 초산나트륨 삼수화물과 1000㎖의 에틸알콜을 가한다. 이 침전물을 여과하여 진공하에 건조시켜서 ALFA 87-78이라 불리는 정제된 헤타린 나트륨 19.2g을 얻었다. 그 화합물리적 특성은 다음과 같다.
S=10.09%
황산염/카르복실비=2.13
13C-NMR 스펙트럼(ppm) : 177.3; 104.7; 102.0; 99.4; 80.0; 78.6; 72.3; 71.9; 69.0; 62.5; 60.6
[헤파린나트륨 ALFA 87-81]
이 화합물은 동일한 시판용 헤파린 50g을 출발물질로하여 ALFA 87-78에 대해 수행한 것과 동일한 방법에 의해 제조되었다.
정제된 헤파린 36.3g을 얻었으며 그 화학물리적 특성은 다음과 같다.
S=10.56%
황산염/카르복실비=2.20
13C-NMR 스펙트럼(ppm) : 177.3; 104.7; 102.0; 99.5; 80.1; 78.6; 72.4; 72.0; 69.1; 62.7; 60.7
[시판용 헤파린 나트륨]
이 화합물은 다음과 같은 화학물리적 특성을 가진다.
S=11.0%
황산염/카르복실비=2
13C-NMR 스펙트럼(ppm) : 177.4; 104.6; 101.9; 99.8; 79.9; 78.6; 72.2; 71.8; 69.0; 62.6; 60.6
[저분자량 헤파린나트륨 LMW ALFA 86-02]
저분자량 헤파린나트륨 LMW ALFA 86-01은 국제특허공보 WO 86/06729에 기술되어 있는 방법에 따라 구리이온 존재하에 과산화수소로 해중합시켜 제조하였다.
이 화합물은 다음과 같은 화학물리적 특성을 가진다.
평균분자량 : 4200 달톤
S=11.4%
황산염/카르복실비=2.27
13C-NMR 스펙트럼(ppm) : 177.4; 104.6; 101.9; 99.8; 79.9; 78.6; 72.2; 71.9; 69.1; 62.7; 60.7
[저분자량 헤파린나트륨 LMW ALFA 86-198]
저분자량 헤파린나트륨 LMW ALFA 86-198은 LMW 86-02에 사용된 방법에 따라 해중합시킴으로써 제조하였다.
이 화합물은 다음과 같은 화학물리적 특성을 가진다.
S=11.60%
황산염/카르복실비=2.32
13C-NMR 스펙트럼(ppm) : 177.7; 104.8; 102.0; 99.6; 80.2; 78.6; 72.4; 71.9; 69.2; 62.7; 60.6
비선광도
의 측정은 1% 농도의 수성매질 속에서 수행되었다. 황산염/카르복실비의 측정은 전위차 측정법에 의해 수행되었다.
황함량의 측정은 전위차 측정법과 쇠니기(Schoeniger)법에 의해 수행되었다.
13C-NMR 스펙트럼은 용매로서 D2O, 기준내 표준물질로서 3-트리메틸실릴프로판술폰산나트륨을 사용하여 바리안(Varian) CFT-75 분광공도개를 이용하여 75.47MHZ에서 수행하였다.
다음의 실시예는 본 발명을 설명하고자 하는 것이며 제한하고자 하는 것은 아니다.
[실시예 1]
헤파린 ALFA 87-81 1.8g을, 수산화나트륨(0.225N) 0.4g 초산나트륨(0.625N) 2.3g 및 수소화붕소나트륨 10mg을 함유하는 수용액 49㎖에 가한다. 이 용액을 60℃에서 3.5시간 동안 항온시킨 다음 실온에서 냉각시킨 후 빙초산으로 중성으로 조절한 후 2.5부피의 에탄올을 가한다. 이 침전물을 여과하여 6 : 1 에탄올/물 혼합물로 세척한 다음 건조시킨다. 이렇게하여 생성물 1.7g을 얻었다. 이 생성물은 스펙트럼에서 다음과 같은 δ(ppm으로 표현)에서 특성 시그널을 나타낸다. δ : 177.3; 104.3; 101.9; 99.4; 98.4; 97.2; 96.8; 79.7; 79.1; 78.5; 72.1; 71.8; 71.2; 68.8; 62.4; 60.6; 60.3; 54.1; 53.1
[실시예 2]
헤파린 ALFA 87-78 1.8g을, 수산화나트륨(0.225N) 0.4g 초산나트륨(0.625N) 2.3g 및 수소화붕소나트륨 10mg을 함유하는 수용액 45㎖에 가한다. 이 용액을 60℃에서 15시간 동안 항온시킨 다음 냉각시킨 후 빙초산으로 중성으로 조절한 후 Dowex 1×2(염화물형태)을 이온수지가 들어 있는 컬럼(ø=1.2cm, h=8cm)을 통해 삼출시킨다. 삼출액과 세액을 함께 모은 다음 2.5부피의 에탄올을 가한다. 이 침전물을 여과하여 6 : 1 에탄올/물 혼합물로 세척한 다음 건조시킨다. 이렇게하여 생성물 1.65g을 얻었다. 이 생성물은13C-NMR 스펙트럼에서 다음과 같은 δ(ppm으로 표현)에서 특성 시그널을 나타낸다. δ : 177.3; 104.6; 101.8; 98.6; 97.2; 96.8; 79.6; 79.1; 78.9; 72.2; 71.5; 71.2; 68.8; 62.5; 60.3; 54.1; 53.1
[실시예 3]
헤파린 ALFA 87-78 1.8g을, 수산화나트륨(1N) 4.8g을 함유하는 수용액 120㎖에 가한다. 이 용액을 60℃에서 3.5시간 동안 항온시킨 다음 초산으로 중성으로 조절한 후 흐르는 물을 사용하여 하루 밤, 증류수를 사용하여 6시간 투석시킨다. 그 다음 이 용액에 3.5g의 초산나트륨을 가하고 초산을 사용하여 중성으로 조절한 후 2.5부피의 에탄올을 가한다. 이 침전물을 여과하여 6 : 1 에탄올/물 혼합물로 세척한 다음 건조시킨다. 이렇게하여 생성물 1.7g을 얻었다. 이 생성물은13C-NMR 스펙트럼에서 다음과 같은 δ(ppm으로 표현)에서 특성피크를 나타낸다. δ : 177.4; 104.6; 101.7; 98.6; 98.4; 97.2; 96.8; 79.7; 79.1; 78.6; 73.5; 72.5; 72.3; 72.1; 71.5; 68.8; 62.6; 60.4; 60.2; 54.0; 53.1
[실시예 4]
헤파린 ALFA 87-81 4g을, 수산화나트륨(1N) 4.8g, 초산나트륨(0.625N) 6.2g 및 수소화붕소나트륨 25mg을 함유하는 수용액 120㎖에 가한다. 이 반응혼합물을 60℃에서 3.5시간 동안 항온시킨 후 초산으로 중성으로 조절한 후 흐르는 물을 사용하여 24시간 동안 투석시키고 난 다음 Dowex 1×4(염화물형태) 음이온수지가 들어 있는 컬럼(ø1.6cm, h=15cm)에 삼출시킨 다음 이 삼출액과 세액에 4g의 초산나트륨과 2.5부피의 에탄올을 가한다. 이 침전물을 여과하여 6 : 1 에탄올/물 혼합물로 세척한 다음 건조시킨다. 이렇게하여 생성물 3.55g을 얻었다. 이 생성물은13C-NMR 스펙트럼에서 다음과 같은 δ(ppm으로 표현)에서 특성 시그널을 나타낸다. δ : 177.4; 104.5; 101.8; 99.4; 98.7; 97.1; 79.5; 78.6; 73.5; 71.8; 68.8; 62.4; 60.3; 54.0; 53.1
[실시예 5]
헤파린 LMW ALFA 87-01 1.8g을 수산화나트륨(0.04N) 0.08g, 초산나트륨(0.625N) 2.6g 및 수소화붕소나트륨 10mg을 함유하는 수용액 50㎖에 가한다. 이 반응혼합물을 60℃에서 210분간 항온시킨 후 실온으로 냉각시키고 우선 음이온 수지인 Dowex 1×4(OH--형태)이 들어 있는 컬럼(ø1.2cm, h=10cm)에서, 그 다음 양이온 수지인 Dowex 50W×8(H+형태)이 들어 있는 컬럼(ø=1.2cm, h=10cm)에서 삼출시킨다. 이 삼출액과 세액을 2N의 수산화나트륨 수용액으로 중화시킨 다음 4g의 초산나트륨과 2.5부피의 에탄올을 가진다. 이렇게 하여 생선된 침전물을 6 : 1 에탄올/물 혼합물로 세척한 후 건조시킨다. 이렇게하여 생성물 1.4g을 얻었다. 이 생성물을13C-NMR 스펙트럼에서 다음과 같은 δ(ppm으로 표현)에서 특성 시그널을 나타낸다. δ : 177.4; 104.6; 101.9; 99.8; 98.6; 98.4; 97.2; 96.8; 79.8; 78.6; 72.2; 71.8; 68.9; 62.5; 60.3; 54.1; 53.1
[실시예 6]
헤파린 LMW ALFA 86-198 10g을 수산화나트륨(0.225N) 2.7g, 초산나트륨(0.625N) 15g 및 수소화붕소나트륨 60mg을 함유하는 수용액 300㎖에 가한다. 이 용액을 60℃에서 50분간 항온시킨 후 실온으로 냉각시키고 증류수를 사용하여 500㎖로 희석시킨 다음 우선 음이온 수지인 Dowex 1×2(OH-형태)이 들어 있는 컬럼(ø=2cm, h=15cm)에서, 그 다음 양이온 수지인 Dowex 50W×8(H+형태)이 들어 있는 컬럼에서 삼출시킨다. 이 삼출액과 세액을 4N의 수산화나트륨 수용액으로 중화시킨 다음 20g의 초산나트륨과 2.5부피의 에탄올을 가한다. 이렇게하여 생성된 침전물을 6 : 1 에탄올/물 혼합물로 세척한 후 건조시킨다. 이렇게하여 생성물 9.1g을 얻었다. 이 생성물을13C-NMR 스펙트럼에서 다음과 같은 δ(ppm으로 표현)에서 특성 시그널을 나타낸다. δ : 177.4; 104.6; 101.9; 99.8; 98.6; 98.4; 97.2; 96.8; 79.8; 78.6; 72.2; 71.8; 68.9; 62.5; 60.3; 54.1; 53.1
[실시예 7]
시판용 헤파린나트륨 15g을, 수산화나트륨(0.225N) 5.4g, 초산나트륨(0.625N) 30g 및 수소화붕소나트륨 120mg을 함유하는 수용액 600㎖에 가한다. 이 용액을 42℃에서 4시간 동안 항온시킨 후 실온으로 냉각시키고 초산으로 중화시킨다. 이 용액을 흐르는 물을 사용하여 하룻밤 동안 투석시킨 다음 음이온 수지인 Dowex 1×2(염화물형태)의 컬럼(ø=2.8cm, h=15cm)에서 삼출시킨다. 이 삼출액과 세액에 초산나트륨 10g을 가한 다음 2N 수산화나트륨 수용액으로 pH를 7로 조절한 후 2.5부피의 에탄올을 가한다. 이렇게하여 생성물 13.9g을 얻었다. 이 생성물은13C-NMR 스펙트럼에서 다음과 같은 δ(ppm으로 표현)에서 특성 시그널을 나타낸다. δ : 177.3; 104.6; 101.9; 99.8; 98.6; 98.4; 97.2; 96.8; 79.9; 78.6; 72.2; 71.8; 69.0; 62.5; 60.3; 54.1; 53.1
[실시예 8]
비경구투여용 약병이나에는 다음 성분들이 함유된다.
-실시예 1에 따라서 수정된 헤파린……………10.000 U.A. Xa
-F.U. 염화나트륨 F.U. ……………5mg
-B.P 벤질알콜……………8mg
-2회 증류시킨 멸균수……………1㎖
Claims (6)
13C-NMR 스펙트럼에서 시그널이 약 53 및 약 54ppm에서 나타나고, 비선광도가 수용액중에서 약 50~90°이며, 황함량이 약 8%~약 11%이며 황산염/카르복실비가 약 1.50~2.20인 것을 특징으로 하는 새로운 헤파린 유도체.
13C-NMR 스펙트럼에서 시그널이 약 53 및 약 54ppm에서 나타나고, 비선광도가 수용액중에서 약 50~90°이며, 황함량이 약 8~11%이며 황산염/카르복실 비가 약 1.50~2.20인 것을 특징으로 하는 새로운 헤파린 유도체의 제조방법으로서, 약 35~70℃의 온도에서 0.5~24시간 동안 0-약 1N 농도의 알칼리금속 또는 알칼리 토금속염 존재하에 또한 (필요시) 촉 대적양의 환원제 존재하에, 약 0.01N~1N 농도의 알칼리금속 또는 알칼리 토금속염기로 헤파린계 물질의 수용액을 처리한 다음, (필요시) 이온 교환수지를 통한 삼출에 의해 또는 투석에 의해 이 반응혼합물을 정제한 후, 여기에 pH가 거의 중성인 상태에서 약 2~4부피의 C1-C3알콜을 가하여 수정된 구조를 가지는 화합물을 침전시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 새로운 헤파린 유도체의 제조방법.
제2항에 있어서, 염기는 수산화나트륨, 칼륨 및 바륨중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제2항에 있어서, 염은 염화나트륨, 칼륨, 바륨, 칼슘, 마그네슘; 초산나트륨, 칼륨, 바륨, 칼슘, 및 마그네슘; 및 황산나트륨, 칼륨, 마그네슘 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제2항에 있어서, 환원제는 수소화붕소나트륨인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제2항에 있어서, 수정된 구조를 가지는 화합물은 약 2.5부피의 에틸 알콜을 가함으로써 침전되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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