KR0185586B1 - 저 분자량 다당류 혼합물, 그의 제조 방법 및 그로 구성된 치료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 헤파린 보다 더 낮은 평균 분자량의 설페이트화 다당류 혼합물, 및 이러한 혼합물을 제조하는 방법을 제공한다.

Description

저 분자량 다당류 혼합물, 그의 제조 방법 및 그로 구성된 치료 조성물

본 발명은 저분자량 다당류 및, 보다 특별하게, 저분자량 헤파린에 관한 것이다.

헤파린은 글리코사미노글리칸족의 생물학적 물질로, 자연 원(源)으로 부터 추출되며, 그들의 항응고성및 항트롬빈성으로 사용된다. 특히, 헤파린은 수술후 정맥혈전증의 치료에 사용된다. 그러나, 헤파린의 자연형태에서, 헤파린은 사용조건을 제한하는 많은 결점을 보인다. 특히, 항응고 활성은 출현을 야기할 수 있으며, 및 pf 4와 같은 혈청인자에 대한 민감성은 비교적 대량의 투여량 사용을 하게 한다.

그러므로, 항트롬빈 효과에 기인한 항응고활성이 없을 때, 특히 항프로트롬비나제 활성에 기인한 항트롬빈활성을 촉진해야만 한다.

이 목적을 위하여, 헤파린을 저 평균 분자량의 분자로 단편을 내는 것이 제한되어 왔었다. 특히, 유럽 특허 EP40,144호는, 헤파린을 구성하는 다당류의 일반 구조를 가지며, 그의 쇄위한 말단에서 에틸렌형 이중 결합을 가지며, 및 중량 평균 분자량이 2,000-10,000달톤인 셀페이트와 다당류의 혼합물을 서술한다. 이러한 혼합물들은 헤파린 에스테르의 해중합 및 비누화에 의해 얻어진다. 이들은 헤파린보다 더 낮은 고 항트롬빈 활성 및 전체항응고 활성을 보이는 것으로 진술된다.

그러나, 헤파린에 직면한 주된 문제 중의 하나는 그들이 매우 불균질한 생성물이라는 것이다. 그러므로, 헤파린의 활성에서 각각의 종의 기여를 평가하고, 해중합 동안의 이들 종의 양태를 밝혀내고 및 최종적으로 최종 생성물내 이들 종의 구조 및 그들 각각의 비율을 조절하는 것은 어렵다. 이러한 이유 때문에, 상기에 언급된 결점들을 전적으로 만족스럽게 해결하는 것은 불가능하다. 특히, 당분야 및 특허EP40,144에 서술된 방법들은 개선된 적용에 대한 필수의 약리학적 특성, 즉 충분하게 긴 플라즈마반감기, 상당히 높은 흡수율, 높은 생적합성 또는 대안적으로 낮은 청소율을 가진 혼합물을 얻을 수는 없게 한다.

그러나, 다른 방법들은 이러한 악영향들을 감소시키는 목적으로 헤파린을 단편으로 만들게 하는 것이 서술되어 있다. (Johnson et al. Thrombos. Haemostas. Stuttg., 1976, 35, 586 i Iane et al. Thrombosis Research 16,651: Iasker et al. us 3,766,167). 이들 방법 각각은, 헤파린 파쇄의 정도가 증가 할 때 바람직한 활성이 촉진되는 것을 나타내는 것으로 보여진다(향트롬빈 활성을 지닌 5탄당에 관련된 유럽특허출원 EP 301,618을 보라).

마찬가지로, 트롬빈 형성에서 헤파린 작용의 메카니즘에 대한 최근 연구는 시험관내에서 헤파린의 평균 분자량이 헤파린의 활성에 미치는 영향을 설명했다(Beguin et al. Throm. Haemost., 61,30,1989)저 분자량 헤파린은 항프로트롬비나제 활성을 가지며, 및 고 분자량의 헤파린은 향트롬빈 활성을 가지는 경향이 있다는 것을 저자는 진술한다.

동시에, 또한 좀 더 균질한 평균 분자량의 혼합물들을 추출하기 위해서 헤파린을 분별하는 것이 제안되었다. 감소된 분자 분산을 갖는 혼합물을 얻을 수 있게 하며, 헤파린으로 부터 유래된 소당류 단편을 제조하는 방법을 서술한 유럽 특허출원EP337,327은 특히 공지 되었다. 이 방법에 따라서, 3,000 달톤이하 분자량의 분액의 선행의 제거를 수행하여, 최종 생성물로 부터 10-16당류 이하를 함유한 단편의 제거를 유도한다. 7,000달톤이상 분자량의 종으로 수행한다. 발명가에 의하면, 최종 혼합물의 균질화의 목적을 가진 본 처리는 바람직한 항트롬빈 활성을 보존하는 반면 항응고 활성의 감소를 허용하는 것으로 간주된다.

그러나, 본 절차에도 불구하고, 얻어진 혼합물은 여전히 잔유출혈효과 또는 매우 낮은 항트롬빈 활성을 보인다. 게다가, 당 분야에서 어느 것도 최적의 생물학적 활성을 얻기 위해서 성질들이 조합되는 것을 결정하는 것은 가능하지 않다. 더우기, 상기 언급된 공보의 저자의 결론은 자명하다 : 우리는 헤파린 성질의 어떤 조합이 최적인지는 알 수가 없다. 다른 제제의 정확한 특성표시 및 일상적인 관찰을 한 이러한 성질들의 상관관계는 가능하게는 답을 제공할 수 있다

특히 급성 혈전증 경우의 예방 및 치료에 유용한 유리한 성질을 나타내는 헤파린을 얻는 것은 가능한 것으로 밝혀졌다. 뜻밖에도, 출원인은 최종 생성물내 고 및 저 분자량 모두의 종의 존재가 생성물에 더 우수한 활성을 준다는 것을 밝혔다.

선행기술의 지시와는 반대로, 최종 생성물 종 내에 어느정도의 이성(異性)뿐만 아니라 고 분자량의 종을 보유하는 것이 바람직하다는 것으로 나타난다.

본 발명의 혼합물의 약물역학적 연구는 그들이 유리한 성질의 조합을 가지는 것으로 나타났다. 특히, 본 발명의 혼합물은 공지된 다른 생성물보다 더 긴 반감기를 가지며, 그리고 또한 속성 헤파린보다 더 긴 반감기를 갖는다.

더우기, 후자에 관련하여, 본 발명의 혼합물의 반감기는 주사된 투여량에 무관한것을 강조하는 것이 중요하다. 이것은 생성된 효과가 헤파린의 경우보다 훨씬 더 예언가능하기 때문에 유리하다. 더우기, 사람에 있어서, 본 발명의 혼합물은 항-Xa활성에 의해 측정된, 탁월한 생적합성을 보인다. 이 활성은 헤파린의 경우에 거의 30%이지만, 본 발명의 혼합물의 경우에는 거의 90%이다. 이것은 주사된 투여량을 감소되게 하고 및 치료 역가를 개선되게 하기 때문에 매우 유용하다.

게다가, 본 발명의 혼합물의 다른 중요한 성질은 그들의 고흡수율에 있다. 이러한 특징은 사실상 순간의 생물학적 활성을 얻게 하며, 및 환자를 재빠르게 보호해야 하는 치료에서 더 큰 안전을 제공하게 한다.

본 발명에 따르는 혼합물의 또 다른 특징은 다른 생성물 및 숙성 헤파린과 비교된 낮은 청소율이다. 그들의 화학구조, 그들의 분자량 또는 그들의 설페이트 함량의 결과로서, 이 혼합물들은, 치료 능력을 더욱 증가시키는, 분해(탈설페이트화, 가수분해)및 제거에 특별한 내성을 보여준다.

본 발명의 제제는 부가적으로 헤파린 출발재료와 비교하여 증가된 체류 시간을 가진다. 이 성질은 생성물의 생체내 활성인 체로 머무르는 동안의 시간의 연장 및 그래서 더 우수한 치료 효능에 반영된다.

게다가, 본 발명의 제제는 또한, 생체내 활성의 시간을 증가시키고 및 저 투여량으로 그들을 사용하게 하는, 혈청인자에 대한 감소된 민감성을 나타낸다.

특히, 이러한 유리한 성질들은, 제조 공정 중에, 분자 분포 뿐만 아니라, 존재하는 종의 특정 구조적 특징을 조절함으로써 얻어진다. 이로써, 얻어진 혼합물들은, 단지 약간의 출혈효과를 가진 필수의 항트롬빈 성질을 부여하는, 고 분자량 분액 대 저분자량 분액의 바람직한 비를 가진다.

본 발명의 이러한 특징은, 분자 분산을 반영하는 혼합물의 중량 평균 분자량 대 수평균 분자량의 비에 의해 및 중쇄 및 경쇄의 %에 의해 표현된다.

본 발명은, 헤파린을 구성하며, 헤라핀보다 낮은 중량 평균 분자량을 가지며, 및 2,000달톤이하 분자량의 쇄 9-20% 및 8,000달톤 이상 분자량의 쇄 5-20%를 함유하며, 및 중량 평균 분자량/수 평균 분자량의 비가 1.3-1.6인 다당류의 일반 구조식을 갖는 설페이트화 다당류의 혼합물을 제공한다.

더우기, 출원인은 불순물의 함량을 감소시킴으로써 혼합물의 성질을 개선시키는 것이 가능하다는 것을 밝혔다. 특히, 다수의 헤파린은 핵산, 폴리펩티드 또는 다른 11다당류와 같은 오염물을 함유한다. 후자중에서, 콘드로이린 셀페이트 및 헤파 또는 더마탄 설페이트가 특히 언급될 수 있다. 매우 높은 분자량의 결과로서 및 수반한 또는 설페이트화 정도의 결과로서 이러한 오염물 각각은 생성물의 제조동안 (예를들어, 해중합 동안)의 간섭 및 특히 활성인 쇄의 비율을 개질함에 의해 최종 분자 분포, 또는 활성에 직접 개질을 할 수 있다. 출원인은 이러한 불순물을 제거하는 방법을 개발하였고, 및 이 전처리를 거치는 혼합물의 질에서의 개선을 알게 되었다. 이 전처리의 효과는 조절불순물과 같은 더마탄 설페이트를 사용하여 측정될 수 있다. 상기에 언급된 특징을 가지는 본 발명의 설페이트 다당류의 혼합물은 바람직하게 더마탄 설페이트의 2%이하와 동등한 다당류 불순물을 함유한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따르는 설페이트 다당류의 혼합물은 거의 3,500-5,500달톤의 중량 평균 분자량을 가진다. 더욱 더 바람직하게, 본 발명에 따르는 혼합물을 구성하는 설페이트 다당류의 쇄는 그들의 한 말단에서 2-0-설포-4-에노피라노수론 산을 가진다.

본 발명의 또 다른 관점은, 헤파린보다 낮은 중량 평균 분자량을 가지며, 2,000달톤이하 분자량의 쇄 9-20%및 8,000달톤 이상 분자량의 쇄의 5-20%를 함유하며, 및 중량 평균 분자량/수평균 분자량의 비가 1.3-1.6인 설페이트 다당류의 혼합물을 제조하는 방법이며, 하기의 단계들로 구성된다 :

- 첫 번째 단계로, 수성 매질내에서 헤파린을 그의 장쇄 4차암모늄 염으로 전환시키고, - 두번째 단계로, 결과 얻어진 염을 에스테르화하여 9.5-14%의 에스테르화 정도를 갖는 에스터르를 형서하고, 및 -세번째 단계로, 얻어진 에스테르를 해중합하여 9.5-14%의 에스테르화 정도를 갖게 한다.

출원인은, 해중합의 수준, 및 그로부터의 최종 생성물의 분자분포는 헤파린 염 출발 물질의 에스테르화 정도를 변화시킴으로써 조절될 수 있다는 것을 밝혔다. 이 방법에 의해서, 상기 언급된 특징을 설페이트 다당류의 직접적인 또는 재생가능한 혼합물을 얻을 수 있는 것이 가능하다.

본 발명의 방법에 사용된 헤파린 출발물질은 바람직하게 돼지의 헤파린 이며, 특히 돼지 점막의 헤파린이다. 얻어진 혼합물의 활성은 헤파린 출발 물질의 유래에 따라 실질적으로 다를 수 있다는 것이 밝혀졌다. 특히, 헤파린 출발 물질이 소에서 유래할 때, 돼지 장의 점막 헤파린으로부터 얻은 것보다 바람직 하지 않게 큰 항응고 활성을 갖는 혼합물이 얻어진다.

더군다나, 특히 유리한 변형에서, 부가로, 본 발명의 방법은 알콜을 사용한 헤파린 출발 물질의 침강의 선행단계가 포함된다. 이 전 처리는 콘드로이린 설페이트 또는 헤파란 설페이트형의 불순물의 함량을 감소될 수 있게 한다. 우수한 결과를 주는 알콜은, 예컨대, 메탄올이다. 그리고 나서, 헤파린 나트륨의 순도는 입체 배제 액체 크로마토그래피에 의해 결정될 수 있다.

특히, 이 예비적인 단계는 2%이하의 더마탄 설페이트 함량과 동등한 불순물의 함량을 가지는 헤파린을 제조하는 것을 가능하게 한다. 더욱 특별하게, 헤파린의 염화는 하기 방법으로 수행된다. 헤파린염은, 수성 매질내20℃범위의 온도에서, 헤파린 나트륨에 상응하는 4차 암모늄 염의 과량의 작용에 의해 얻어진다. 이롭게도, 사용된4차 암모늄 염은, 특히 헤파린 나트륨과 반응할 수 있는 염화벤제토늄과 같은 벤제토늄 염이다.

두번째 단계에서, 하기의 조건에서 에스테르화를 수행하는 것이 바람직하다. 9.5-14%의 에스테르화 정도인, 염 형태 내 헤파린의 부분적 에스테르는, 염소화 유기 용매내, 에스테르화하는 알콜에 상응하는 염화물의 존재하에, 헤파린의 장쇄 4차 암모늄 염의 에스테르화에 의해 얻어질 수 있다. 게다가, 반응의 효율은 다양한 반응물 및 반응 온도 및 시간이 비율을 조절함에 의해 증가된다.

이롭게도, 헤파린의 부분적 에스테르는 방향족 에스테르이며, 바람직 하게 염화물은 염화벤질이며, 및 염소화용매는 클로로포름 또는 염화메틸렌이다.

9.5-14%의 에스테르화 정도를 얻기 위해서는, 염소화 유기용매의 3-5부피부내 헤파린 염의 1중량부에 대해 염화물의 대략 1부 피부를 사용하며, 25-45℃, 바람직하게는 30-40℃의 온도에서 15-48시간의 기간 동안 반응을 수행하도록 하는 것이 특히 이로울 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 헤파린의 부분적 에스테르는 나트륨 염의 형태이다.

이로써 형성된 에스테르는, 초산 나트륨의 존재하에, 특히 메탄올과 같은 알콜을 사용한 침강에 의해 회수될 수 있다. 바람직하게, 1-1.2부피의 알콜이 반응 매질의 부피당 사용된다. 그리고나서 에스테르의 에스테르화 정도는 고성능 액체 크로마로그래피에 의해 점검될 수 있다.

특히, 벤질에스테르의 경우에 있어서, 0℃에서 에스테르의 비누화에 의해 얻어진 벤질 알콜의 양은 측정될 수 있다.

본 발명의 공정의 최종단계는 하기 방법에서 이롭게 수행된다.

바람직하게, 수성용액 내에서 에스테르를 강염기로 처리함으로써 중합해중합을 수행한다. 더욱 특별하게, 수산화나트륨이 사용될 수 있다. 이롭게도 염기/에스테르의 중량비는 0.05-0.2, 및 바람직하게 0.08-0.15이다.

50-70℃, 및 바람직하게 55-65℃의 값으로 매질의 온도를 조정하고, 및 30분-3시간, 및 바람직하게 1-2시간 범위의 기간 동안 반응을 수행한다. 게다가, 물/에스테르의 중량비가 15-30인 매질내에서 반응시키는 것이 바람직하다.

해중합을 수행하는 특별히 이로운 방법은 하기를 혼합하는 것으로 구성된다. :

--염 형태이고 9.5-14%의 에스테르화 정도를 가지는 두번째 단계에서 얻어진 바와 같은 헤파린의 방향족 에스테르의 1중량부

--수산화 나트륨의 0.08-0.15 중량부, 및

-- 물의 20-30중량부,

및 55-65℃에서 1-2시간동안 온도를 유지시킨다.

그리고 나서 생성물은 묽은 무기산, 바람직하게 염산으로 반응 매질을 중화시키고, 메탄올과 같은 알콜의 존재하에 침강시켜 회수될 수 있다.

이 방법에서, 하기를 함유하며, 3,500-5,000달톤의 중량 평균 분자량 및 1.3-1.6의 중량 평균 분자량/수평균 분자량을 가지는 설페이트 다당류의 혼합물을 직접적으로 또는 재생가능하게 얻는 것이 가능하다.

--2,000달톤 이하 분자량의 쇄 9-20%, 및

--8,000달톤 이상 분자량의 쇄 5-20%, 본 발명의 혼합물은 항트롬빈재로서 이롭게 사용될 수 있다. 특히, 장기적 위험 상황을 포함하는, 위험 상황에서 정맥 혈전증의 예방에 적용가능하다. 특히, 이러한 혼합물들은, 고정된 투여량으로 정형외과 수술에서의 급성 혈전증의 위험을 최초로 감소시키는 것을 가능케 한다. 임의 치료 부재하 70% 및 헤파린 존재하 거의 25%인 이 위험은 본 발명의 혼합물의 경우 약 10%정도 또는 그 이하이다.

유사하게 인공신장의 관으로 주사될 때, 이러한 혼합물들은 그 내에서 전개되기 쉬운 혈전증을 감소시킬 수 있다. 후자의 적용은 수술장비에서 혈전증의 예방으로 확대될 수 있다.

본 발명의 혼합물의 또 다른 이로운 치료용도는 급성 동맥혈전중, 특히 심근 경색증의 경우에서의 예방에 있다.

더우기, 본 발명에 따르는 혼합물의 특별히 이로운 적용은 외과 환자의 정맥 혈전증의 예방을 위한 수술 후 규정수이법을 사용할 가능성에 있다. 수술하는 동안 출혈의 위험 및, 수술후 규정식이법의 형태로 예방에 의해 발생되는 마취의 유형 및 투여량의 문제를 피하는 것을 가능하게 하기 때문에 본 적용은 매우 이롭다.

이러한 집합적 성질은 본 발명 제조의 치료 역가를 증명한다. 하기의 실시예들은 본발명을 설명한다.

분석기술

생성물의 분자량 및 분자량 분포를 예를 들어, 굴절계 검출기와 연결된 TSK G 2000SW 또는 TSK G 3000 SW (30×0.75㎝)및 Lichrosorb 100Diol 10u (2×0.75㎝)명칭하에 시판중인 일련의 두 개의 칼럼을 가진 고압 액체 크로마로그래피에 의해 결정된다. 사용된 용매는 0.3 M포스페이트 완충 pH7 이며, 및 흐름속도는 0.7ml/분이다.

Barrow Cliffe et al., Thromb. res., 12, 27-36(1977-78) 또는 D.A.Lane et al.,Thromb. res., 12, 257-271(1977-78)에 의해 서술된 기술에 따라 아가로스 -폴리아크릴아미드(IBF)에 대한 배제크로마토그래피에 의해 에녹사파린(PHARMUKA)의 분별에 의해 제조된 표준으로 시스템을 검량한다. GPC6 소프트웨어(Perkin Elmer)를 사용해서 결과를 계산한다.

하기의 실시예에서, 혼합물의 전체 항응고 활성은 저 분자량 헤파린의 Primary International Standard 를 사용한 혼탁도 측정에 의해 측정한다. Teien et al., Thromb. res., 10, 399-410(1977)에 의해 서술된, 저 분자량 헤파린의 Primary Inteznalional standard 를 사용하여 색소 유전자 지지체에 대한 아미드 분해 방법에 의해 항-인자 Xa(항트롬빈)활성을 측정했다.

[실시예 1]

본 실시예는 콘드로이린 설페이트 및 헤파란 설페이트형의 불순물의 함량을 감소시키는 헤파린 나트륨을 처리하는 선행단계를 설명한다.

염화나트륨(3g)을 함유한 물(100ml)내에 용해된 통상의 헤파린(나트륨 염) (10g)에 메탄올(80ml)를 가한다. 침강된 헤파린을 여과하고, 헹구고 그리고 나서 건조한다. 260nm로 조정된 UV검출계에 연결된 TSK 2000 SW (60×0.75㎝)및 TSK 3000 SW (60×0.75㎝)의 명칭하에 시판중인, 일련의 두 개의 컬럼을 가진 입체 배제 액체크로마토그래피에 의해, 그로부터 얻어진 헤파린 나트륨의 순도를 측정한다. 사용된 이동상은 1ml.분^-1의 흐름속도에서 0.5m수성나트륨 설페이트 용액이다. 더마탄 설페이트(2%)를 함유한 비교 헤파린의 UV흡수와 시험 샘플을 비교한다.

상기 기술된 조건하에서, 얻어진 헤파린은, 더마탄 설페이트의 2%이하와 동등한 양으로 콘드로이틴 설페이트 및 헤파란 설페이트 형의 불순물을 함유한다.

[실시예2]

본 실시예는 헤파린의 4차 암모늄 염의 제조를 설명한다.

물 (100ml)내, 실시예 1에 따라 얻어진 정제된 헤파린나트륨(10g)의 용액에 물(125ml)내 염화벤제토늄(25g)의 용액을 가한다. 그리고 나서 실온에서 침강된생성물을 여과하고 물로 세척하고 그리고 건조한다.

동일한 방법에서 또한 실시예 1의 정제처리를 하지 않은 헤파린의 벤제토늄염을 제조한다.

[실시예 3]

본 실시예는 본 발명에 따른 혼합물의 제조 및 성질을 설명한다.

1. 에스테르화

염화메틸렌(75ml)내, 실시예 1의 방법에 따라 처리된 헤파린으로부터 실시예 2에서 서술된 것과 같이 얻어진 벤제토늄 헤파리 네이트(15g)의 용액에 염와벤질(15ml)을 가한다. 용액을 25시간 동안 유지되게 35℃의 온도로 가열한다. 그리고 나서 메탄올 내 초산 나트륨의 10%용액(90ml)를 가하고, 그리고 침강된 생성물을 여과하고 메탄올 내에서 세척하고 건조한다. 나트륨염의 형태로 헤파린 벤질에 스테르(6.5g)를 그에 의해 얻으며, 상기 서술된 바와 같이 정해진 에스테르화 정도는 13.3%이다.

2. 해중합

상기 서술된 바와같이 얻어진 헤파린 벤질 에스테르 나트륨 염(10g)을 물(250ml)내에 용해한다. 62℃로 가열된 이용액에 수산화나트륨 (0.9g)을 가한다. 62℃에서 1시간 30분 동안 온도를 유지한다. 그리고 나서 반응 혼합물을 약 20℃로 냉각하고, 묽은 염산을 가함에 의해 중화한다. 그리고 나서 반응매질내 염화 나트륨의 농도를 10%로 조정한다. 마침내 메탄올(750ml)내에 생성물을 침강시키고, 여과하고, 건조한다. 하기 구조 특징을 가지는 헤파린을 그에 의해 얻었다. :

-중량 평균 분자량:

3,900달톤

-분자분포 :

·2,000달톤이하 분자량의 쇄 20%

·8,000달톤 이상 분자량의 쇄 5.5%

·분산 : d=1.39

·항-Xa 활성 : 106 IU

·항응고 활성 : 22. 6 IU

[실시예 4]

유사한 방법으로, 9.5-14%의 에스테르화 정도를 가진 에스페르로 출발하여, 하기 구조 특징을 갖는 해중합된 헤파린의 용액을 제조했다. :

a) - 중량 평균 분자량 : 4.425 달톤

-분자분포 :

·2,000달톤 이하 분자량의 쇄 12.4%

·8,000달톤 이상 분자량의 쇄 9.3%

-분산 : d=1.37

-항-Xa 활성 : 102IU

-항응고 활성 : 33IU

b)- 중량 평균 분자량 : 4,579달톤

- 분자분포 :

·2,000달톤 이하 분자량의 쇄 11.2%

·8,000달톤 이상 분자량의 쇄 10.4%

-분산 : d=1.37

-항 -Xa 활성 : 104IU

-항응고 활성 : 37IU

c) - 중량 평균 분자량 : 4, 446달톤

- 분자 분포 :

·2, 000달톤 이하 분자량의 쇄 12.6%

·8,000달톤 이상 분자량의 쇄 9.5%

- 분산 : d = 1.38

-항-Xa 활성 : 100IU

- 항응고 활성 : 32IU

[실시예 5]

본 실시예는 본 발명내 구성되지 않은 혼합물의 제조를 설명한다.

1. 에스테르화

염화메틸렌(60ml)내 실시예 1의 방법에 의해 처리된 헤파린으로부터 실시예 2에 서술된 것과 같이 얻어진 벤제토늄 헤파리네이트 (15g)의 용액에 염화벤질(12ml)를 가한다. 이 용액을 30시간동안 유지되게 28℃의 온도가 가열한다. 그리고 나서 메탄을 내초산나트륨의 10%용액(90ml)를 가하고, 혼합물을 여과하고 및 생성물을 메탄올로 세척하고 건조한다. 나트륨염의 형태로 헤파린 벤질에스테르(6.3g)를 그에 의해 얻는다. 0℃에서 에스테르의 비누화로 유리된 벤질 알콜의 양의, 고성능 액체 크로마토 그래피에서의 측정에 의해 결정된, 이 생성물의 에스테르화 정도는 9.2%이다.

2. 해중합

물(200ml)내에 나트륨 염의 형태로 상기에서 얻은 헤파린 벤질에스테르(10g)를 용해한다. 58℃로 가열된 이 용액에, 수산화 나트륨(1.1g)을 가한다. 58℃에서 1시간동안 온도를 유지한다.

그리고 나서 반응 혼합물을 약 20℃로 냉각하고 묽은 염산을 가해 중화한다. 그리고 나서 반응 매질내 염화나트륨의 농도를 10%로 조정한다. 마침내 생성물을 메탄올(600ml)내에 침강시키고, 여과하고 건조한다. 하기 구조 특징을 갖는 헤파린을 그에 의해 얻는다 :

- 평균 분자량 : 5,425달톤

- 분자분포

·2,000달톤 이하 분자량의 쇄 9.6%

·8,000달톤 이상 분자량의 쇄 19.5%

- 분산 : d=1.44

-항-Xa활성 : 122IU

-항응고성 활성 : 68.6IU

고 항응고 활성으로 증명된 이러한 결과는 서술된 특징을 가지며 본 발명에 따라 제조된 혼합물의 우수성을 증명한다.

[실시예 6]

본 실시예는, 혈장내 그들의 반감기에 의해 표현되는, 본 발명의 혼합물의 생체내 안정성의 증가를 설명한다.

21-30세의 지원자에게 첫 번째 약물 역학조사를 수행했다.

20-80mg/ml사이에 변하는 투여량의 피하주사를 실시했다.

일정한 시간 간격을 두고, 샘플을 채집(4.5ml)하여 약 4℃에 보관한다. 그리고 나서 2,300g에서 15분동안 샘플을 원심분리하여 소판-결핍혈장을 분리하여 분석전에 냉동시켰다. 그리고 나서 항-Xa 활성을 측정하여 혼합물의 반감기를 결정한다. 얻어진 결과는 하기와 같다. :

- 실시예3 및 4에서 얻은 혼합물

·40mg투여량 : 75%의 경우, 반감기가 4시간보다 더 길며, 대략 45%의 경우시간 보다 훨씬 더 길다.

·60mg투여량 : 75%의 경우, 반감기가 3.7시간 보다 더 길다.

-동일한 투여량 조건하에서, 정맥내 주사한 무상(無傷) 헤파린은 약 0.6시간의 반감기를 가진다.

- 유럽 특허 EP40,144 에 서술된 방법에 따라 생성물을 제조할 때 반감기는 17%의 경우에서의시간보다 더 길다.

20명의 환자에게 유사한 조건하에서 수행한 두번째 조사는 본 발명에 따르는 혼합물에 대한 하기의 결과를 준다.

·40mg 투여량 : 80%의 경우, 반감기는 4시간보다 더 길며, 약 40%의 경우시간보다 더 길다.

·20mg 투여량 : 60%의 경우, 반감기는 3.9시간보다 더 길다.

Claims (10)

1. 헤파린을 구성하고, 헤파린보다 더 낮은 중량 평균 분자량을 가지며 2,000달톤 이하 분자량의 쇄 9-20% 및 8,000달톤 이상 분자량의 쇄5-20%를 함유하며, 중량 평균 분자량/수평균 분자량 비가 1.3-1.6인 다당류의 일반 구조를 가지는 설페이트화 다당류의 혼합물.
2. 제1항에 있어서, 2%이하와 동량의 불순물 더마탄 설페이트를 함유한 혼합물.
3. 제1항에 있어서, 대략 3,500-대략 5,000달톤의 중량평균 분자량을 가지는 혼합물.
4. 제1항에 있어서, 설페이트화 다당류의 쇄가 그의 하나의 말단에 2-O-설포-4- 에노피라노수론산을 가지는 혼합물.
5. 하기 단계로 구성되는, 헤파린을 구성하고, 헤파린보다 더 낮은 중량 평균분자량을 가지며 2,000 달톤 이하 분자량의 쇄 9-20% 및 8,000달톤이상 분자량의 쇄 5-20%를 함유하며, 중량 평균 분자량/수 평균 분자량비가 1.3-1.6인 다당류의 일반 구조를 가지는, 설페이트화 다당류의 혼합물을 제조하는 방법 :

   - 첫 번째 단계로, 수성 매질 내에서 헤파린을 그의 장쇄 4차 암모늄염으로 전환시키고,

   - 두번째 단계로, 결과 얻어진 염을 에스테르화하여 9.5-14%의 에스테르화 정도를 가진에스테르를 형성하며, 및

   - 세번째 단계로, 9.5- 14%의 에스테르화 정도를 가진 얻어진 에스테르를 해중합 한다.
6. 제5항에 있어서, 두번째 단계를, 에스테르화한 알콜에 상응하는 염화물과 함께 염소화 유기 용매내에서 실시하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 염소화 유기용매 3-5부피부내 25-45℃의 온도에서, 헤파린 염 1 중량부와 염화물 대략 1 부피부를 혼합시킴에 의해 에스테르화를 실시하는 방법.
8. 제5항에 있어서, 에스테르를 수용액내 강 염기로 처리함으로써 해중합을 수행하는 방법.
9. 제 5항에 있어서, 헤파린 출발 원료를, 알콜로 수성 용액으로부터 침강시켜 정제하는 방법.
10. 제1항, 2항, 3항 또는 4항에 청구된 바의 설페이트화 다당류의 혼합물로 구성된 혈전증의 예방 또는 치료를 위한 치료 조성물.