JP2006526592A - 血管由来の欠損に関連する高コレステロール血症または糖尿病の治療のための、線維芽細胞成長因子をコードするプラスミド - Google Patents

Abstract

【課題】 血管由来の欠損に関連する高コレステロール血症または糖尿病の治療のために、線維芽細胞成長因子をコードするプラスミドを提供する。
【解決手段】 本発明は、心筋または骨格の血管由来の欠損に関連する高コレステロール血症または糖尿病の予防及び治療のための治療薬としての線維芽細胞成長因子をコードするプラスミドの使用に関する。本発明はまた、高コレステロール血症または糖尿病の哺乳類被験対象において心筋または骨格の虚血性組織における側副血行路と細動脈の両方の形成を促進する方法に関する。本発明は更に、処置した筋肉にＶＥＧＦ−Ａ因子発現を誘導せずかつ浮腫を生じさせないで虚血性心筋組織または骨格組織における側副血行路を促進する方法に関する。

Description

本発明は、心筋または骨格の血管由来の欠損に関連する高コレステロール血症または糖尿病の予防及び治療のための治療薬としての線維芽細胞成長因子をコードするプラスミドの使用に関する。本発明はまた、高コレステロール血症または糖尿病の哺乳類被験対象において心筋または骨格の虚血性組織における側副血行路と細動脈の両方の形成を促進する方法に関する。本発明は更に、処置した筋肉にＶＥＧＦ−Ａ因子発現を誘導せずかつ浮腫を生じさせないで虚血性心筋組織または骨格組織における側副血行路を促進する方法に関する。

血管は、３種類の主要な血管、即ち、動脈、毛細管、静脈を含み、心臓から始まり心臓で終わるような閉じた血液運搬系を形成している。心臓が拍動すると、血液は心室から大動脈へ押し出される。大動脈は中型の動脈に枝分かれし、そこからさらに小さな動脈に枝分かれして血液を体の種々の部分へ送る。動脈は、最も小さい分枝である細動脈に辿り着くまで何度も分裂を繰り返す。細動脈は組織に入るとき、組織細胞に近接する毛細管と呼ばれる微小血管に枝分かれする。毛細管は、非常に薄い壁を有する。酸素及び栄養素は毛細管中の血液から離れて組織細胞に入り、二酸化炭素及び他の老廃物は細胞を離れて毛細管内の血液に入る。毛細管は組織を離れる前に併合して細静脈と呼ばれる小さな静脈を形成する。細静脈は併合して連続的により大きな静脈を形成し、血液は最終的には血液を心臓に戻す大静脈に移る。

全ての血管壁は、毛細管を除いて、管腔を取り巻く３つの異なる層から構成されている。血管管腔を裏打ちする最も内側の層は内膜と呼ばれ、主として内皮細胞からなる。中間の層即ち中膜は、主として円形配列された平滑筋細胞からなる。血管壁の最も外側の層即ち外膜は、主として、血管を保護しかつ血管を周囲の構造に固定する弾性線維及びコラーゲン線維からなる。外膜には神経線維が入り込んでおり、より大きな動脈及び静脈においては小さな血管の系が入り込んでいる。

細動脈は最も小さい動脈であり、５０μｍより小さな管腔径を有する。細動脈壁は、中膜に点在する平滑筋線維に囲繞された内膜からなる。細動脈は、動脈から毛細管への血流を調整する。細動脈壁の血管収縮時には、毛細管への血流は制限され、細動脈が働きを担っている組織を瞬間的に迂回させることができる。細動脈壁の血管拡張時には、毛細管への血流は著しく増加する。

対照的に、毛細管は、一連の内皮細胞、単なる内膜のみからなる非常に薄い壁を有する。毛細管は、ほぼ全ての体組織及びほぼ全てに近い体細胞に広がる大規模なネットワークを形成する。毛細管の平均管腔径は、０．０１ｍｍ（１０μｍ）であり、赤血球が通り抜けるのに十分なちょうど良い大きさである。毛細管をこの目的に完全に適合するようにしているのは非常に薄い壁であり、体の細胞との栄養素、酸素及び老廃物の交換がなされる。

側副血行路（collateral blood vessel）は、酸素を器官に供給する重大な役割を果たす。正常な脈管構造における疾患によって酸素の運搬が制限されるときは特にそうである。側副血管は、正常な状態で血流がほとんどまたは全くない既存の血管であることがある。正常な血管の急性閉塞（例えば大動脈の血栓症）は、血管ベッド内で圧力の再分布を生じさせ、それによって側副血管に血流を発生させることができる。側副血行路は冠状動脈及び骨格筋（例えばヒトの足）の循環において特に重要である。心臓においては、心外膜動脈の狭窄または閉塞に起因する虚血性領域への血流供給を側副血管が助けることができる。側副性血流は、梗塞サイズを制限するのに重要なメカニズムであり得る。治療的血管形成において、側副血行路の形成が開始される。

血管形成は、内皮細胞の増殖、基底膜の劣化、周囲基質からの移入、アラインメントと、血管壁を形成しそれによって新たに形成された毛細管ネットワークを生み出すためのチューブ様構造への分化とに関与する複雑なプロセスである。

動脈形成は、側副細動脈の副産物と呼ばれ、毛細管ネットワークに比べてこれらの血管の容量が大きいので血液灌流の回復のための最も効率的なプロセスであると信じられている（Carmeliet et al. , Nat. Med., 2000; 6: 389-395、Van Royen et al., Cardiovasc. Res., 2001; 49: 543-553）。事実上、細動脈は、内膜及び中膜の両方即ち平滑筋細胞の層に支えられている内皮細胞の層が存在するので、成熟した強固で機能性血管であると考えられている。細動脈の形成は、長期の有効な新血管新生のために好ましいタイプである。

血管内皮の機能障害に関連する病理学的状態のうちで、高コレステロール血症は、異常な血管形成、組織灌流の障害された制御、血流の異常な空間分布と、異常な微小血管の機能によって特徴付けられる疾患である。また、血管成長のカイネティクスと得られた血管の性質は、健康な組織とは異なる。これらの変化は、シグナル伝達の減少、Ｌアルギニンの利用可能性の減少、ｅＮＯＳの発現の減少、他の炎症性細胞マクロファージ由来の超酸化物アニオンにより増加したＮＯ不活性化、エンドセリンなど幾つかの血管収縮因子の放出、及び平滑筋血管反応を示すような、障害された血管内皮の結果であることがある。高コレステロール血症の被験対象において、動脈壁中の毛細管密度及び分布は劇的に変化する。究極的には、これらは顕著な失見当識を伴う外膜巨大血管の高密度な網を示す。これはより強いかまたはより弱い血管由来反応を生じさせ得る異なる刺激から生じ得ると信じられている。ヒトにおける高コレステロール血症は、血管内皮の機能障害と、究極的には主要な動脈の進行性狭小化を引き起こす。休息時と負荷時の冠状動脈血流の不均衡が、痛み及び低収縮性につながる密かな筋肉機能不全を引き起こす。通常、供給は休息時には適切であるが、負荷が生じると、需要が高まる一方で動脈閉塞性病変により供給は不可能になる。このヒト病理学を模倣する目的が例えば主要な冠動脈上での狭窄の設定及びこの狭窄により負荷時に生み出される不均衡を明らかにするための負荷試験（stress test）の使用の両方につながる理由はここにある。Ｉ型及びＩＩ型糖尿病患者の血管機能は、障害された内皮依存性弛緩によって特徴付けられることも知られている。糖尿病は、微小血管及び巨大血管の疾患の未熟な発達によって特徴付けられる（Kannel et al., Diabetes Care, 1979,241: 2035-2038）。従って、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）患者、末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）患者、または心臓動脈疾患（ＣＡＤ）患者における高コレステロール血症、糖尿病、高血圧、高脂質血症に起因するそのような重症の内皮機能障害及び異常性を、治療的血管形成を用いることにより救済できるか否かには疑問がある。

側副血行路を促進するために幾つかの血管由来因子、例えばＶＥＧＦ−ＡＦＧＦ及びｂＦＧＦ、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６及びＨＧＦを投与することは、治療的血管形成としても知られているが、虚血性心血管及び末梢虚血の処置に提唱されてきた。しかし、種々の細胞型への強力な多面発現性効果はこれらの化合物の治療的適用可能性を制限することがある。例えば、ＶＥＧＦ−Ａは、最も強力な候補となる血管由来因子の１つであった。しかし、ＶＥＧＦ−Ａは、腫瘍に見られるものに似た、でたらめに蛇行しかつ漏れる血管のみならず、浮腫を生じさせることが分かった（Lee et al., Circulation 2000,102 : 898-901; Springer et al., Mol Cell, 1998,2: 549-559）。

治療的血管形成に対する２つの異なる戦略が存在する。虚血性組織への成長因子の直接運搬を含むタンパク質治療は可能な選択肢である。血管由来遺伝子治療はそれに代わる可能な選択肢であり、側副性発生の向上と、体細胞への核酸の移入による灌流欠損及び関連する虚血の克服を目指すものである（８−１０）。

動物研究は、例えば、組換えヒトＶＥＧＦ、組換えＰＤＧＦ、または組換えｂＦＧＦを含む多くの成長因子の局所血管由来の可能性を実証してきた。しかし、組換えタンパク質の運搬及び高用量の組換えタンパク質の全身性投与が多数の他の負の副作用につながることが示されていた。更に、必要な組換えタンパク質の量も重要である。運搬されるタンパク質が少な過ぎれば、血管形成は達成されないであろう。運搬されるタンパク質が多過ぎれば、でたらめな脈管構造ベッド及び乱雑な血管形成の形成が生じることがある。

血管由来タンパク質を発現することが可能な核酸を裸の型でまたはリポソームまたはウイルス性ベクターによってのいずれかで投与することによる治療的血管形成について調査がされてきた。血管由来コード配列のウイルス性ベクター運搬は、高効率の運搬を可能にするが、ウイルス性ベクターの使用に関連する多数の短所、例えば免疫反応の発生や、統合及び散在の可能性に悩まされている。例えば、１９９９年９月にペンシルバニア大学でジェシー・ゲルシンガー（Jesse Gelsinger）がヒトオルニチンカルバミル転移酵素の補正型を発現したＥｌ及びＥ４欠失組換えアデノウイルスの肝臓内動脈注入後に死亡して以来、アデノウイルス遺伝子治療方法は疑問視されてきた。病理学分析が示すところによれば、公式な死因は、全身投与された組換えアデノウイルスへの全身性炎症性反応により誘導された成人の呼吸困難症候群に伴う多臓器不全であった。ここ最近では、ベクターとしてレトロウイルスを使用したことよって重症複合免疫不全疾患（ＳＣＩＤ）になった小児を治療することを目的とした治験において２つの白血病ケースが報告された。

血管由来のペプチドをコードするＤＮＡを含む裸のＤＮＡとリポソームは共に、ウイルスに比べて輸送の効率が低いという主な欠点があり、治療効果を得るのに必要なタンパク質のレベルに到達するのが難しいことがある。

裸のＤＮＡ戦略に関連して、酸性の線維芽細胞成長因子または線維芽細胞成長因子１型（ＦＧＦ−１）をコードするプラスミドであるＮＶ１ＦＧＦの筋肉内注射を最終段階の末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）の患者に対して行うことが安全性要求に適合することが驚いたことに実証された。カメロータら（Camerota et al., J Vasc. Surg., 2002, 35, 5:930-936）によれば、休息中の痛みまたは組織ネクローシスを伴う５１人の再建不可能な最終段階のＰＡＤ患者は、虚血性大腿及びふくらはぎにＮＶ１ＦＧＦを１回または頻回投与量を増加させながら筋肉内注射されていた。続いて、経皮的な酸素圧、足首及び足指上腕指数、痛み評価、潰瘍治癒などの種々のパラメータを評価した。ＮＶ１ＦＧＦ投与後、上腕指数の有意な増加、痛みの低減、潰瘍サイズの分解、灌流の向上が見られた。

後肢虚血患者におけるＶＥＧＦ遺伝子移入による血管形成の誘導は、ＶＥＧＦ−１６５アイソフォームをコードするＤ裸のプラスミドＤＮＡが、虚血性潰瘍が治癒しておらずかつ／または末梢動脈疾患による休息中の痛みを有する患者の虚血性筋肉に投与されることを示していた。新たに発生した側副血行路及び改善された灌流も毛細管同様に処置後８週間で血管造影的に見ることができた。しかし、処置から５〜６週間後にＶＥＧＦの血清レベルの著しい上昇も観察された（Isner et al., Lancet, 1996; 348: 370-4）。そのような血清ＶＥＧＦレベルの上昇は、乱雑な好ましくない血管形成及び浮腫などの重大な負の副作用を生じさせることがある（２６）。

ビンセントら（Vincent et al., Circulation, 2000; 102 (18):2225-61）は、低酸素症誘導因子１α（ＨＩＦ−１α）転写因子をコードする裸のＤＮＡプラスミドの投与は、ふくらはぎ血圧比、血管由来スコア、局所血流及び毛細管密度の著しい向上と関連していたことを報告している。。しかし、ＨＩＦ−１αは、in vivoで幾つかの標的のみならずＶＥＧＦ経路依存血管形成の増強を示唆する内因性ＥＦＧ遺伝子の発現を活性化することも報告されている。

タニヤマら（Taniyama et al., Gene Therapy, 2001,8: 181-189）は更に、ラット及びウサギの虚血性後肢モデルにおいてヒト肝細胞成長因子（ＨＧＦ）をコードする裸のＤＮＡプラスミドの筋肉内注射を用いた治療的血管形成に関する報告をしている。内皮細胞のマーカとしてのアルカリホスファターゼとして実証された血管造影及び毛細管密度によって、側副血行路の増加を同定した。肝細胞に対する分裂促進因子として最初に同定されたＨＧＦは、メラノサイト、腎尿細管細胞、ケラチノサイト、及びある種の内皮細胞を含むある種の細胞型、及び上皮起源の細胞に対する分裂促進因子であることも分かった（Matsumoto et al. , BBRC, 1991, 176: 45-51）。ＨＧＦは、血管の平滑筋細胞の複製なしに内皮細胞の成長を刺激することも示した（Nakamura et al., Hypertension, 1996; 28: 409-413、Hayashi et al., BBRC, 1996; 220: 539-545）。最後に、ＨＧＦが「散乱因子」即ち上皮及び血管の内皮細胞の解離を促進する活性としても作用し得ることが分かっている（Giordano et al. , PNAS, 1993, 90: 649-653）。従って、ＨＧＦは腫瘍形成に関与すると仮定されてきた。

対照的に、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦまたはＦＧＦ−１）をコードするプラスミドの投与はＦＧＦ−１血清レベルを増加させないことが立証され、それによって、そのようなヒトＦＧＦ−１発現プラスミドの使用は、乱雑な血管形成または負の副作用が存在しないので安全性の点で特に有利であることを示した。循環ＦＧＦ−１の不存在は、他の血管由来因子に対し、例えば、循環へのリーク及び遠位の浮腫への誘導が既に説明されているようなＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２に対して有意な安全性の優位性を与える（Baumgartner et al. , Circulation, 1998, 97: 1114-23）
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーは、少なくとも２３の構造的に関連があるタンパク質（ＦＧＦ−１〜２３）からなり、最もよく知られているメンバーは、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−９である。このファミリーのメンバーは、中胚葉及び神経外胚葉由来のほとんどの細胞において後発の有糸分裂誘発を刺激し、血管形成、神経突起の伸展、骨芽細胞成長、神経細胞の生き残り、筋芽細胞分化を含む他の生物学的プロセスに影響する。一般的に、ＦＧＦはヘパリンに対する高い親和性を有する。個々に命名して分ける前には、ヘパリン結合成長因子−１、−２などと呼ばれるＦＧＦもあった。全てではないが多くのＦＧＦは線維芽細胞に対する分裂促進因子である。ＦＧＦファミリーのメンバーは、核配列内で概ね２５〜５５％のアミノ酸配列同一性を有し、この核配列の外側に、Ｃ末端、Ｎ末端、またはその両方のいずれかで著しい伸展を有するＦＧＦもある。この構造的な相同は、既知ＦＧＦをコードする異なる遺伝子が共通の先祖遺伝子に由来している可能性を示唆している。

ＦＧＦファミリーの２３の既知メンバーに加えて、単一遺伝子からＦＧＦの幾つかの分子型が生じて更に複雑さを増している。例えば、ＦＧＦの一次翻訳産物（ＦＧＦ−１）は１５５の残基からなる。しかし、自然の源（例えばウシの脳）に見られるＦＧＦ−１の最も長い型は、１５４残基からなる。ＦＧＦ−１のこの１５４残基型は、１５５残基型のＮＨ２末端メチオニンが欠失し、アセチル化アミノ末端を有している。in vivoまたは精製中のタンパク分解プロセシングは、アミノ末端１５（ｄｅｓ１−１５）または２１（ｄｅｓ１−２１）アミノ酸のいずれかが欠失した、より小さな活性型のＦＧＦ−１を生じさせる。本明細書中では、ＦＧＦ−１は、ＦＧＦ−１の１５４残基型と、ＦＧＦ−１の短い生物学的に活性な型、例えば上記したアミノ末端１５（ｄｅｓ１−１５）または２１（ｄｅｓ１−２１）アミノ酸のいずれかが欠失した型を指すものと定義する。歴史的には、ＦＧＦ−１の１５４残基型はβ−内皮細胞成長因子（β−ＥＣＧＦ）と呼ばれ、ｄｅｓ１−１５型はａＦＧＦまたはＦＧＦ−１と呼ばれ、ｄｅｓ１−２１型はα−ＥＣＧＦと呼ばれていた。この成長因子群に対する専門用語を標準化する前に、目から派生した（eye derived）成長因子及びヘパリン結合成長因子１を含む幾つかの追加の用語も同じタンパク質に適用する。ｂＦＧＦ（ＦＧＦ−２）の類似型についても既に記載されている。ｂＦＧＦの開裂型（cleaved form）に加え、ｂＦＧＦの１５５残基型を生成するＡＴＧ翻訳開始コドンの上流に位置するいくつかの異なるＧＴＧコドンでの翻訳の開始から生じる拡張型（extended form）もついても既に記載されている。ＦＧＦのこれらの代替型は全て、ＦＧＦファミリーを画定する構造的な相同の核領域を含んでいる。種々のＦＧＦ分子の多くは、単離され、種々の心筋虚血動物モデルに投与されてきたが、変動及びしばしば反対の結果を伴っていた。

ＦＧＦ−１に対する血管由来の役割は、in vivo研究に基づいて提唱された（Comerota et al., J. Vasc. Surg., 2002,35, 5: 930-936）。ＦＧＦ−１発現プラスミドの筋肉内注射は、足首上腕指数の増加、痛みの減少、及び経皮酸素の増加に基づく灌流の改善を示した。

出願人は驚くべきことに、他のＦＧＦ因子、ＶＥＧＦ、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６及びＨＧＦを含む他の血管由来因子とは対照的に、ＦＧＦ−１発現プラスミドの筋肉内注射が血管内皮細胞におけるＶＥＧＦを誘導せず、それ故に非常に安全な血管形成治療を構成することを発見した。

ほとんどの治療的血管形成の研究は肢虚血の動物モデルにおいて確認され、正常な健康な動物において実施されていたが、内皮機能が大いに障害された高コレステロール血症または糖尿病環境（setting）において血管形成異常を逆戻り（reverse）させる能力を試験したものもあった。

この点で、既知の治療的血管形成は、大腿の動脈を切除した高コレステロール血症ウサギモデルにおける試験時に説得力があることが立証されなかった。障害された側副血管形成及びＶＥＧＦの投与によって部分的に逆戻しされ得る毛細管密度が観察されたためである（２６）。更に、ロギンら（Roguin A. et al., Cardiovascular Diabetology 2003,2 : 18）がＶＥＧＦ発現プラスミドを用いても糖尿病の虚血性マウスの血流向上と側副化（collateralization）促進ができないことを示したように、治療的血管形成は糖尿病モデルにおける試験時に説得力があることが立証されなかった。

対照的に、本願出願人は驚くべきことに、ヒトＦＧＦ−１を発現するプラスミドが虚血性心筋または骨格筋に筋肉内投与されたときに、側副血管において高コレステロール血症または糖尿病に関連する欠損を効率的に逆戻りさせ、高コレステロール血症または糖尿病の哺乳類被験対象において細動脈などの成熟血管の形成を促進できることがわかった。

更に出願人は、類似の血管由来因子とは対照的に、ＦＧＦ−１発現プラスミドの筋肉内注射は、処置した骨格または心筋において浮腫を生じさせず、従って高コレステロール血症または糖尿病環境など悪化した状態における虚血性筋肉の血管形成異常を救済するのに十分な量で用いることができることを発見した。

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本発明は、高コレステロール血症または糖尿病に関連する心筋または骨格の血管由来の欠損を治療する方法であって、ある種の線維芽細胞成長因子をコードする遺伝子を有するプラスミドを含む医薬品成分を被験対象に内皮機能障害及び血管由来の欠損の逆戻りを促進する量投与する過程を含む方法に関する。

本発明はまた、高コレステロール血症または糖尿病に関連する心筋または骨格の血管由来の疾患または欠損を治療する方法であって、線維芽細胞成長因子をコードする有効量のプラスミドを投与してＶＥＧＦ−Ａ因子発現が誘導されないようにする過程を含む方法に関する。

本発明は更に、線維芽細胞成長因子をコードするプラスミドを骨格筋または心筋においてＶＥＧＦ−Ａ因子発現を誘導せずかつ浮腫を生じさせないで心筋または骨格の血管由来の欠損を逆戻りさせるのに十分な量投与することにより、患者において高コレステロール血症または糖尿病に関連する血管内皮機能障害を治療する方法に関する。

高コレステロール血症または糖尿病環境において虚血性心臓における成熟側副血管または虚血性筋肉における骨格筋組織の形成を刺激及び／または促進する方法であって、線維芽細胞成長因子をコードする有効量のプラスミドを前記被験対象の前記組織に注射してＶＥＧＦ−Ａ因子発現が誘導されずかつ／または浮腫が生成されないようにする過程を含む方法を提供することも本発明の目的である。

本発明の別の目的は、高コレステロール血症または糖尿病の哺乳類被験対象におけるＰＡＤ、ＰＡＯＤまたはＣＡＤなどの虚血性状態を、ＶＥＧＦ因子の発現を誘導することなくかつ浮腫を形成することなく処置する方法を提供することである。

本発明の更に別の目的は、内皮機能が障害された虚血性組織において側副血行路及び細動脈の両方を促進する方法を提供することである。

更なる目的は、高コレステロール血症または糖尿病で誘発される血管形成異常を、そのような処置を必要としている高コレステロール血症または糖尿病哺乳類被験対象においてＶＥＧＦ因子を誘導することなく、逆戻りさせる方法である。

本発明の更に別の目的は、血管形成ＶＥＧＦ非依存性の経路を促進する方法を提供することである。

本発明の更なる目的は、処置した細胞においてＶＥＧＦが上方制御されないことを条件に血管形成を促進する方法を提供することである。

ＦＧＦ発現プラスミドの心筋内または筋肉内注射は、高コレステロール血症または糖尿病に関連する心筋または骨格の血管由来の欠損を逆戻りさせるのに好ましい。本発明の実施に好ましい線維芽細胞成長因子はＦＧＦ−１であり、最も好ましいのはヒト完全長ＦＧＦ−１である。

これ以外の目的、機能及び利点については、図面と共に以下に開示される本発明の好適な実施形態の記載から明らかになるであろう。

本発明は、内皮機能が障害されたか或いは不適当であるような高コレステロール血症または糖尿病環境に関連する心筋または骨格の血管由来の欠損を治療または修復する方法を提供する。

本発明の方法及び成分は、心筋または骨格筋における血管形成の純増を促進するための直接筋肉内投与に続いて、高コレステロール血症または糖尿病に関連する内皮機能障害を逆戻りさせるのに特に有用である。本発明は、生物学的に活性な線維芽細胞成長因子をコードするプラスミド及び薬学的に許容される塩及びその誘導体の使用を含む。

本発明はまた、虚血性心臓または骨格筋組織における成熟側副血管の形成をそのような処置を必要とする哺乳類被験対象において促進する方法であって、前記被験対象の前記組織に線維芽細胞成長因子をコードする有効量のプラスミドを注射して前記被験対象においてＶＥＧＦ−Ａ因子発現が誘導されないようにする過程を含むことを特徴とする方法を提供する。特に、ＦＧＦ発現プラスミドの投与は、虚血性心筋または骨格筋組織においてＶＥＧＦ−Ａ因子の発現を誘導することなく側副血行路及び細動脈の両方の形成を誘導する。本発明に基づくＦＧＦ発現プラスミドは、浮腫などの副作用を引き起こすものではない。

本発明は更に、高コレステロール血症または糖尿病で誘発される血管形成における欠損を、ＶＥＧＦ−Ａ因子発現を誘導しかつ／または浮腫を形成することなく逆戻りさせる方法であって、前記患者の心筋または骨格組織に線維芽細胞成長因子を発現する有効量のプラスミドを注射して側副血行路及び細動脈の両方の形成を促進する過程を含むことを特徴とする方法を提供する。

本発明は更に、高コレステロール血症または糖尿病環境の哺乳類被験対象の虚血性組織において側副血行路及び細動脈の両方を促進することにより血管再生を強化する方法であって、有効量のＦＧＦ発現プラスミドを前記被験対象の前記組織に注射して血管形成異常を逆戻りさせる過程を含むことを特徴とする方法を提供する。前記プラスミドの運搬及び発現は、予想外に、虚血性筋肉全体での血液灌流の著しい向上する結果になる。

「被験対象」なる語には、限定されるものではないが、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、ブタ、ラット、マウス、サル、ヒトなどの哺乳類が含まれる。

「生物学的に活性な配列」なる語は、天然のペプチドまたは生物学的に活性な類似体またはその断片をコードするヌクレオチド配列を意味する。異なる型は、同一生物学的機能のペプチドのための構造遺伝子コード配列が変化する性質に存在する。これらの生物学的に活性な配列の類似体には、１回または複数回のアミノ酸の置換、欠失、付加、または交換を有する天然及び非天然の類似体が含まれる。全てのそのような対立遺伝子の変化の修飾と、１若しくは複数の未変性の生物学的に活性な特性を保持する誘導体を生じさせる類似体とは、本発明の範囲に含まれる。

ＦＧＦをコードするプラスミドは従って所望のＦＧＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。これらの分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそのハイブリッド、またはｍＲＮＡなどのＲＮＡ分子であり得る。プラスミドは、ＦＧＦ−１をコードするヌクレオチド配列を含み、米国特許第４，６８６，１１３号に記載のＦＧＦ−１酸性成長因子の１５４残基型をコードするヌクレオチド配列を含むのが好ましい。

ＤＮＡ分子の遺伝子発現に必要な制御要素には、プロモータ、開始コドン、停止コドン、及びポリアデニル化シグナルを含めることができる。更に、多くの場合遺伝子発現にエンハンサーが必要になる。これらの要素は所望のタンパク質をコードする配列に動作可能に結び付けられ、かつ、制御要素はそれが投与される被験対象の心筋において動作可能であることが必要である。

開始コドン及び停止コドンは、一般的に、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部と考えられている。しかし、遺伝子作成物が投与される被験対象においてこれらの要素が機能的であることが必要である。開始コドン及び終止コドンは、コード配列を有するフレームの中になければならない。

用いられるプロモータ及びポリアデニル化シグナルは、被験対象の心筋細胞内で機能的でなければならない。

本発明を実施するために有用なプロモータの例には、限定されるものではないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）からのプロモータ、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、例えばＨＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）プロモータ、モロニーウイルス、ＡＬＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、例えばＣＭＶ最初期プロモータ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）と、ヒト遺伝子からのプロモータ、例えばヒトαアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン及びヒトメタロチオネインが含まれる。

別の好適な実施形態においては、ＦＧＦ遺伝子の発現は、筋肉特異プロモータによって、例えば米国特許出願公開第２００３／００３９９８４号に記載のマウスまたはヒトのＣＡＲＰ遺伝子の上流配列によって、または国際公開ＷＯ０１／１１０６４に記載の心臓のαアクチンプロモータ配列によって推進される。

本発明を実施するに当たり、特にヒトに対する遺伝的ワクチンの産物において、有用なポリアデニル化シグナルの例としては、限定されるものではないが、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ウシまたはヒトの成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナルがある。特に、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルとして参照されるｐＣＥＰ４プラスミド（Invitrogen, San Diego Calif.）におけるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが用いられる。

ＤＮＡ発現に必要な制御要素に加えて、ＤＮＡ分子には他の要素が含まれることもある。そのような追加要素には、エンハンサーがある。エンハンサーは、限定されるものではないが、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、及びＣＭＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶから得られるウイルス性エンハンサーを含む群から選択することができる。

作成物を染色体外に維持しかつ細胞に作成物の複数のコピーを産出するために、遺伝的作成物には哺乳類の複製起源が備わっていることがある。インビトロジェン社（Invitrogen, San Diego, Calif.）から得られるプラスミドｐＣＥＰ４及びｐＲＥＰ４は、エプスタイン・バーウイルス複製起源と、統合なしに高コピーのエピソームの複製を産出する核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含む。他の適切なプラスミドは当業者に公知であり、例えば、レプリケーターｐＭＢ１を伴うプラスミドｐＢＲ３２２、またはレプリケーターＣｏｌＥ１を伴うプラスミドｐＭＫ１６などがある（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1988) 11 : 1.5. 2.）
好適な実施形態において、ＦＧＦをコードするプラスミドは、国際出願ＷＯ９７／１０３４３及びソブリエールら（Soubrier et al., GeneTher. 1999; 6: 1482-1488）に記載されているような複製ｐＣＯＲの条件的な起源を示す。ｐＣＯＲプラスミドは、元の主鎖に挿入されるヒトＦＧＦ−１（ｓｐｈＦＧＦ−１）の分泌型（secreted form）をコードする最適化発現カセットを収容している。得られるプラスミドは、都合のよいことに２．４ｋｂの小さなサイズである。ｓｐｈＦＧＦ−１をコードする配列は、ヒト線維芽細胞インターフェロンからの分泌シグナルペプチド（ｓｐ）をコードする配列と、アミノ酸２１〜１５４（米国特許第４，６８６，１１３号、第５，８４９，５３８号）からのヒトＦＧＦ−１の天然の短縮型（truncated form）との融合である。ｓｐｈＦＧＦ−１の発現は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモータ（ヌクレオチド−５２２から＋７２）によって推進された。適正かつ効率的な転写終了及びそれに続くｓｐｈＦＧＦ−１転写物のポリアデニル化を確実にするために、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０ゲノムからのヌクレオチド２５３８〜２７５９、GenBank locus SV4CG；米国特許第５，１６８，０６２号）からの後発のポリアデニル化シグナルをｓｐｈＦＧＦ−１融合の下流に挿入した。この好適なプラスミドは指定ＮＶ１ＦＧＦであり、抗生物質抵抗遺伝子がない。プラスミドの選択は、独立栄養性レシピエント菌種において抑制転移ＲＮＡ遺伝子に依存している。プラスミドの高いコピー数及び厳しく制限された宿主範囲の維持は、Ｒ６Ｋγ複製起源により得られた。このタンパク質に対する配列コードは、細菌には通常見られないが、被選択宿主菌種のゲノムに人為的に挿入した。従って、プラスミドの潜在的な散在はかなり制限された。

注射可能な物質を心筋の細胞に搬送する任意の方法により、本発明に基づくプラスミドを脊椎動物に投与することができる。本発明に基づくプラスミドは細胞への侵入を促進するように働くことができる運搬手段がないという意味では、例えばポリヌクレオチド配列にはウイルス性配列がなく、特に、遺伝情報を伝達することができるウイルス性粒子がないという意味で、裸のＤＮＡプラスミドとしてプラスミドを投与するのが好ましい。本発明に基づくプラスミドは同様に、リポソームの製剤などのトランスフェクションを促進する任意の物質、リポフェクチン（Lipofectin）（登録商標）などの電荷脂質、またはＣａＰＯ_４などの沈殿剤がないか或いはそれに関してむき出しである。別な方法で、薬学的に許容される液体担体によりプラスミドを動物に搬送することもできる。好適な適用例では、液体担体は水性または部分的に水性であり、無菌で発熱物質を含有しない水を含む。試料のｐＨを適切に調整しかつ緩衝する。或いは、陽性または正に帯電させたリポソームなどのリポソームを用いてプラスミドを注射することができる。

以下の実施例は、プラスミドＮＶ１ＦＧＦが、細動脈などの成熟血管のみならず毛細管血管の形成により持続した血管由来反応を促進するのに十分な濃度で、コードされたＦＧＦ−１タンパク質の徐放を可能にすることをはっきり示している。更に、ＮＶ１ＦＧＦは、処置筋肉において検出不可能な濃度で血管形成を効率的に促進することが実証され、特に効力があることが示された。従って、治療的空白内にある濃度でＮＶ１ＦＧＦを用い、それによって周囲の組織または器官への散在または乱雑な血管形成に起因する負の副作用を回避できる。

更に、安全性及び効力の点でそのような優れた特性に起因して、高コレステロール血症または糖尿病により悪化した状態における治療的血管形成に対してＮＶ１ＦＧＦが特に有用であることが実証された。

高コレステロール血症または糖尿病などの状態が悪化した起源に拘らず、減弱された血液供給により生じた血管形成異常の逆戻りは、従って、本発明によって予期される。

本発明の文脈から読み取れる範囲内で、標的組織は、従って、酸素を含ませた血液が組織に適切に供給されないときに生じる虚血性ダメージを受けているか受ける危険に晒され、高コレステロール血症または糖尿病環境において更に悪化した筋肉組織を含む。実施例中で示しているように、求められる遺伝子治療の安全基準に適合しかつ障害された内皮の機能を更に示す虚血性組織において血管形成を誘導することができるような治療的空白においてプラスミドＮＶ１ＦＧＦの筋肉内注射を効率的に用いることができる。

本発明の一実施形態によれば、ＮＶ１ＦＧＦプラスミドは局所的方法で標的筋肉組織に投与される。本発明の文脈から読み取れる範囲内でＮＶ１ＦＧＦプラスミドを標的組織に投与する任意の適切な手段を用いることができるが、そのような標的筋肉組織への局在注射は、針を用いてＮＶ１ＦＧＦを筋肉に直接注射することにより達成されるのが好ましい。

「注射（する）」なる語は、ＮＶ１ＦＧＦを標的組織に効果的に導入することを意味する。本発明に基づき任意の適切な注射器を使用することができる。

ＮＶ１ＦＧＦプラスミドの投与量の投与は標的組織への単回注射により達成することができるが、ＮＶ１ＦＧＦの複数回注射による投与量の投与が好ましい。複数回注射は、２、３、４、５、またはそれ以上の反復注射であってよく、高コレステロール血症または糖尿病の哺乳類被験対象の虚血性筋肉へ５回以上注射するのが好ましい。複数回注射は、各注射が行われる標的組織の位置によって画定される特異的な幾何学的配置などのパラメータによって扱うことができるので、単回注射よりも利点がある。ＮＶ１ＦＧＦの１回投与量を複数回に分けて注射することにより、制御を良好にし、所与の量を投与する有効性を最大にすることができる。

複数回注射の特異的な幾何学的配置は、各ＮＶ１ＦＧＦが投与される２次元空間のいずれかに画定可能である。複数回注射は虚血性組織内またはその周辺で行うことができ、注射点が２ｃｍまたは３ｃｍ離れるように一定の距離を空けるのが好ましい。

本発明の別の実施形態によれば、複数回注射の各注射は前後の注射から約５〜１０分間以内に行う。

血管形成異常に影響されかつ内皮機能が激しく障害された標的組織にＮＶ１ＦＧＦを投与するとき、側副血行路形成のための源及び末端とその間の領域に適度に近接する領域にＮＶ１ＦＧＦが接触できるようなものである投与が望ましい。

治療対象に効果を与えるための本発明に基づく成分を標的心筋組織に局所的に、筋肉内に、非経口的に、静脈内に、心筋内に、心臓周囲に、心外膜に、または冠内に投与することができる。心筋内投与、心外膜投与、心臓周囲投与、または冠内投与は、針またはカテーテルを用いて行うのが好ましい。

ＮＶ１ＦＧＦの筋肉内注射は、遠位の大腿及び遠位の脚筋肉へ、及び虚血性部位に近い領域または虚血性部位周囲の領域において行うことができるのが好ましい。

また、直接心筋内注射による投与を行うときには、開胸手術に行うか、カテーテルを利用して行うことができる。心臓運搬のためのカテーテルは当分野でよく知られており、そのようなカテーテルには、例えば米国特許第５，０４５，５６５号または第４，６６１，１３３号に記載されている針カテーテルや、米国特許第６，２５４，５７３号及び第６，３０９，３７０号に記載されている位置検出装置付きのものがある。らせん形の針を有する別のカテーテルについては、米国特許第６，３４６，０９９号及び第６，３５８，２４７号に記載されている。

本発明の有利な一側面では、高コレステロール血症または糖尿病環境における血管形成の欠損を逆戻りさせるために、治療効果のある用量のＮＶ１ＦＧＦが投与される。有効量は、高コレステロール血症または糖尿病の被験対象に加えて所与の血管形成異常被験対象の体重及び条件によって変わることになるが、所与の被験対象及び条件に対して適切な用量を決定することは当分野の技能の範囲内であると考えられよう。

この好適な実施形態の側面によれば、血管形成異常の重症状態では、側副血管及び細動脈の両方の持続した形成を促進するために、約１〜２週間またはそれ以上の時間間隔で好適には２〜４回繰り返されるＮＶ１ＦＧＦの筋肉内注射の複数回注射により投与される約８０００μｇ乃至約１６０００μｇのプラスミド用量で処置を行う。それによって、高コレステロール血症または糖尿病の哺乳類被験対象における虚血に起因する血管形成異常を逆戻りさせることができる。

ＮＶ１ＦＧＦは、薬学的に許容される担体とＮＶ１ＦＧＦプラスミドとを含む医薬品成分にて標的虚血性筋肉に投与されるのが望ましい。

本発明の文脈から読み取れる範囲内で任意の適切な薬学的に許容される担体を用いることができ、そのような担体は当分野においてよく知られている。担体の選択は、部分的に、成分が投与される特定の部位及び成分を投与するのに用いられる特定の方法によって決定されることになる。注射に適した製剤には、水性及び非水性溶液と、所期レシピエントの血液と等張の製剤を与える酸化防止剤、緩衝液、静菌薬、溶質を含み得る等張無菌注射液と、懸濁剤、可溶化剤、肥大剤、安定剤、防腐剤を含み得る水性及び非水性無菌懸濁液とが含まれる。製剤は、アンプル及びバイアルなどの１回量または複数回量を封じ込んだ容器に入った状態にもできるし、使用直前に無菌の液体担体、例えば水を加えるだけでよい凍結乾燥（lyophilized）状態で保存することもできる。上記した種類の無菌の粉末、顆粒及び錠剤から即席の注射溶液及び懸濁液を調製することもできる。薬学的に許容される担体は緩衝生理食塩水溶液であるのが好ましい。医薬品成分が塩化ナトリウム溶液（０．９％）を含むのが最も好ましい。

好適な実施形態においては、本発明の成分を低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）と関連付けて投与する。ＬＭＷＨ分子及び調製方法は当分野でよく知られており、とりわけ、米国特許第５，３８９，６１８号、第４，６９２，４３５号、第４，３０３，６５１号、欧州特許第ＥＰ０ ０４０ １４４号、及びネンチ（Nenci GG, Vasc. Med, 2000; 5: 251-258）に記載されている。これらは引用を以って本発明の一部となす。

第２の実施形態では、処置した骨格筋に電気刺激を与える前または後に高コレステロール血症患者または糖尿病患者の骨格筋にＦＧＦ発現プラスミドを注射する。この実施形態に基づき用いられる電気刺激は、米国特許出願公開第２００２／００３１８２７号に記載されており、筋肉収縮に対する閾値以下であるために患者への痛みがなく骨格筋の収縮を生じさせないような電圧及び周波数で適用される。例えば、適用される周波数は約５０Ｈｚ、電圧は約０．１ボルトである。ＦＧＦ発現プラスミドと共に用いられるときには、電気刺激は、血流増加の点で優れた相乗効果を奏する。

第３の実施形態では、ＦＧＦ−１発現プラスミドＢＢは１若しくは複数の血管形成促進因子と組み合わせて運搬される。血管由来因子は例外なく、ＰＤＧＦ−ＡＡ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ニューロピリン（neuropilin）、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、アンジオポエチン（Angiopoietin）１、アンジオポエチン２、１ ５ エリスロポエチン、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ−Ｉ、オステオポンチン、プレイオトロピン（Pleiotropin）、アクチビン、エンドセリン−１、及びその組合せを含むことができる。

ＮＶ１ＦＧＦは、ＰＤＧＦ−ＢＢ発現プラスミドと共に骨格または心筋に注射され、高コレステロール血症または糖尿病環境における側副血行路及び細動脈に優位に形成するのが好ましい。この実施形態は従って、側副血行路及び細動脈を促進する方法であって、ＰＤＧＦ−ＢＢを発現するプラスミド及びＮＶ１ＦＧＦを組織の局在領域に有効量運搬して組織の局在領域内で血管形成を誘導する過程を含む方法に関連する。血管形成促進因子は、組織の局在領域へのＤＮＡの運搬に続いて、因子をコードする単離されたＤＮＡからの発現により運搬される。

本発明は、高コレステロール血症及び糖尿病を更に患う患者におけるＰＡＤ及びＰＡＯＤ、ＣＡＤまたはＣＨＦ症状の治療方法にも関連する。

単一または複数の大きな血管閉塞に起因する後肢における障害された灌流は、ＰＡＤの原因である。初期段階ではこれが歩行時における足の筋肉の不快感を生じさせ、後の段階では潰瘍形成及び壊疽に結び付く（１）。慢性心血管疾患は、内皮機能障害に関与するメカニズムのために、ＰＡＤなどの虚血性状態を既に患っている患者における増悪因子である（２，３）。ＰＡＤの実験的モデルを発展させるための可能な標的として、高コレステロール血症、高血圧、糖尿病などの病態が調査されてきた（４−７）。にもかかわらず、そのような後肢虚血モデルにおいて重大な点は、後肢虚血の臨床的状況を模倣する試みにおいて血管再生処置の有効性を認めるために自発性血管由来反応を否定することである。

高コレステロール血症の遺伝的モデルは、高コレステロール血症または糖尿病状態における血管由来特性の評価に用いられてきた。しかし、そのような遺伝的モデルでは、単一の受容体（ワタナベ遺伝性高脂血症ウサギにおけるＬＤＬ受容体欠損）またはタンパク質（糖タンパク質ＡｐｏＥの欠乏はＡｐｏＥ^−／−マウスにおいてＶＬＤＬ及びＩＤＬレベルの増加を招く）の単一の変化が生じるだけで、実際に病態を再現するわけではない。

対照的に、ＮＶ１ＦＧＦプラスミドは、患者に見られる病理学的状態に大いに匹敵する動物モデルにおいて高コレステロール血症で誘発される欠損を逆戻りさせるのに効力があることが実証された。実際、病状は、コレステロール血症のＰＡＤ患者が直面する状況を模倣するコレステロールに富んだ食餌に起因する全脂質過剰によるものである。

本発明に基づけば、ＮＶ１ＦＧＦは、ＰＡＤ患者においてコレステロールに誘導された血管形成機能障害を、側副血管及び細動脈の両方の成長を促進することによって救済するのに効力があることが実証されている。

本発明の更に別の目的は、内皮機能が障害された虚血性組織において側副血行路及び細動脈の両方を促進する方法を提供することである。

以下の実施例に示すように、ＮＶ１ＦＧＦは、組織への血液の搬送及び輸送が必要な大腿後部の虚血負傷筋肉においてコンダクタンスが大きい成熟血管（１５０μｍ以上の側副血管）及び抵抗が小さい動脈（５０μｍ以下の細動脈）の形成を効率的に誘導することができる。そのような成熟血管の誘導は、有害な血管形成異常が高コレステロール血症または糖尿病で誘発されるような最も重症のケースで特に効率的な処置を表す。

側副及び細動脈の両方の成長は、治療的血管形成において特に興味深い。実際、側副は動脈ネットワーク間に橋を形成する血管であり、細動脈は、組織へのまとまったフローを与える経壁細胞（周細胞または平滑筋細胞）により固定された内皮細胞の層を形成する成熟血管である。毛細管ネットワークは、従って、フローの分布を確実にするためにその存在に依存している（Carmeliet et al., Nat. Med., 2000; 6: 389-395; Van Royen et al., Cardiovasc. Res., 2001; 49: 543-553）
本発明の更なる目的は、処置した細胞においてＶＥＧＦが上方制御されないことを条件に血管形成を促進する方法を提供することである。

以下に示す例は、ＮＶ１ＦＧＦの注射の筋肉内投与は注射された筋肉において局所的なマウスＶＥＧＦ−Ａ誘導を誘発せず、注射されたマウスの循環血液においてマウスＶＥＧＦ−Ａ分泌を誘発しないことを実証している。これは、ＶＥＧＦ非依存性の経路においてＶＥＧＦ−Ａ因子を誘導することなく側副血行路及び細動脈を促進するための新たな方法に関連する本発明の重要な側面である。事実、ＶＥＧＦ−Ａが乱雑で好ましくない血管形成、浮腫、及び造腫瘍性の可能性など深刻な負の副作用を引き起こすことはよく知られている。

本明細書において、種々の出版物、特許及び特許出願を参照している。本発明が属する最先端分野をより十分に説明するため、これらの出版物、特許及び特許出願の教示及び開示をそのまま引用することを以って本明細書の一部となす。

また、本明細書において例示的な実施形態に開示されている発明の原理は、当業者により多様に実施され得ることが理解及び期待されるであろう。そのような改変、変更、置換は、本特許出願の範囲内に含まれるものとする。

実施例
実施例１：動物及び食餌
実験には１１〜１２週齢のシリアンゴールデンハムスター（ｎ＝５０）（CERJ, Le Genest St Isle, France）を用いた。動物は、研究実験計画を開始する少なくとも７日前に標準条件に慣れさせた。全ての動物は、実験の全期間を通じて自由に水へアクセスできた。全ての動物手順はアベンティス・ファーマ社（Aventis Pharma）の動物使用委員会に承認されたものであり、国立衛生研究所（ＮＩＨ）が出版したガイドライン（NIH publication No. 85-23, revised 1985）に基づき手順を実施した。

実験１では、ハムスター（ｎ＝３７）を無作為に３つの群に分けた（図１）。低コレステロール（ＬＣ）群のハムスター（ｎ＝１３）に適宜標準固形試料（ref. A04-C, UAR, Epinay-sur-Orge, France）を与えた。高コレステロール（ＨＣ）群の処置後２１日（ＨＣ／２１）及び２８日 （ＨＣ／２８）の両群のハムスター（ＨＣ／２１：ｎ＝１２；ＨＣ／２８：ｎ＝１２）には、３％コレステロール及び１５％ココアバターを補充した標準固形試料（ref. 1414C, UAR, Epinay-sur-Orge, France）からできたコレステロールを高めた食餌を毎日動物１匹につき２０ｇ与えた。実験２では、ハムスター（ｎ＝１３）を無作為に２つの群に振り分けた（図１）。生理食塩水群（ｎ＝５）とＮＶ１ＦＧＦ群（ｎ＝８）のハムスターには、実験１に記載したコレステロールを高めた食餌を与えた。

実施例２：後肢虚血の誘導
ＬＣまたはＨＣの食後３５日目に、以下の手術手順に従って動物を後肢虚血にした。他の動物種に関連して記載した手順に従って（１９，２０）、Ｎ_２Ｏ（０．８ｌ．ｍｉｎ^−１）、Ｏ_２（０．４ｌ．ｍｉｎ^−１）及びイソフルオラン（isofluorane）（２％）のガス麻酔下で後肢虚血を誘導した。無菌手術条件下で、鼠径靭帯から膝蓋骨の近位にある点まで右後肢の大腿内側部で縦方向の切開を行った。この切開を通じて、手術ループを用いて、大腿の動脈をばらばらにし、その主要な分枝を凝固させた。伏在枝と膝窩枝の二股に分かれる遠位の点への外腸骨動脈の分枝として大腿の動脈をその近位の起源から完全に切除した（２０）。４．０シルクワイヤにより１つの層で切開を閉じた。

実施例３：後肢骨格筋における遺伝子移入
実験２では、虚血の誘導から１４日後に、生理食塩水（ｎ＝５）またはＮＶ１ＦＧＦをコードするプラスミド（１８０μｇのＤＮＡ、ｎ＝８）を３回の５０μＬの注射により、それと知らずに即ち盲検的に与えた。注射は、虚血性肢の頭部脛骨筋（Tibialis cranialis）、内転筋群筋肉、大腿４頭筋のそれぞれに行った。

実施例４：血清中の全コレステロール及びトリグリセリドレベルの測定
手術日から−３５日目、−７日目、及び＋２１日目または＋２８日目に、Ｎ_２Ｏ（０．８ｌ．ｍｉｎ^−１）、Ｏ_２（０．４ｌ．ｍｉｎ^−１）及びイソフルオラン（２％）のガス麻酔下で、眼窩後穿刺によって、ＨＣ／２１群、ＨＣ／２８群、生理食塩水群、及びＮＶ１ＦＧＦ群のハムスターから血液を得た。血清中の全コレステロールレベル及びトリグリセリドレベルは、市販のキット（Olympus Diagnostica GmbH, Hamburg, Germany）を用いて酵素学的に決定した。

実施例５：血管造影による側副血管形成の定量化
虚血の誘導後２１日目（ＨＣ／２１群）または２８日目（ＬＣ、ＨＣ／２８、生理食塩水群、及びＮＶ１ＦＧＦ）に以下の血管造影手順を実施した。

腹大動脈に挿入されたカテーテルを介して〜３００μｌの造影剤（水に溶かした０．５ｇ．ｍｌ^−１の硫酸バリウム溶液）を注射した直後、ハムスターをペントバルビタールナトリウムの過剰投与により屠殺した。ハムスターを背側臥位で放射線写真装置（モデルＭＸ−２０、Faxitron X-ray Corp., Wheeling, IL, USA）に載置し、両肢から脈管構造の死後写真を集めてデジタル化した（software Specimen, DALSAMedOptics, Tucson, AZ, USA）。この放射線写真システムは、直径１５０μｍ以上の血管の可視化を可能にする。処置に盲検的な研究者が上記した専用のソフトウェアを用いて写真をオフラインで分析した（２２）
簡単に言えば、虚血性肢及び非虚血性肢の両方に対して、大腿後部側における側副血管の範囲を、分析した面積のパーセンテージとして決定した。血管造影スコアを虚血性／非虚血性比のパーセンテージとして計算した。この方法の妥当性をチェックするために、後肢虚血になっていない６匹の別々の年齢適合ハムスターにおいて血管造影スコアを評価した。予想通り、右肢／左肢比のパーセンテージとして計算された血管造影スコアは１．０４±０．１８であり、両肢における類似の血管新生を反映していた。

実施例６：免疫組織化学による細動脈形成の定量化及び高コレステロール血症のハムスターの大腿動脈の切除により後肢虚血に誘導された 典型的な筋肉病
虚血誘導後２１日目（ＨＣ／２１群）または２８日目（ＬＣ群、ＨＣ／２８群、生理食塩水群、ＮＶ１ＦＧＦ群）に、虚血性後肢からの骨格筋を回収し、ＰＢＳ３．７％ホルマリン溶液中に固定した。非虚血性後肢からの筋肉を同様に試料採取し、対照筋肉として用いた。異なる筋肉（大腿薄筋、半膜様筋、内転筋群、半腱様筋、大腿二頭筋）からなる２つの横断スライスを各大腿の後部分から処理した。スライスを脱水してパラフィンに包埋し、免疫組織化学のために５μｍ厚の切片を準備した。平滑筋α−アクチン（ＳＭＡ；clone1A4, ２００倍希釈, Dako, Carpinteria, CA, USA）に向けられたマウスのモノクローナル抗体は、成熟血管において恒常的に発現されるので、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）に対するマーカとして用いた。市販のキット（Envision（登録商標）＋システム／西洋わさびペルオキシターゼ, Dako, Carpinteria, CA, USA）を用いてアビジン−ビオチン−ペルオキシターゼ方法によりＳＭＡ抗体を検出した。内転筋群筋肉及び大腿薄筋の両方で、ＳＭＡ陽性（ＳＭＡ＋）血管をサイズ（外径）によってランク付けし、直径５０μｍ以下の細動脈を計数した。

これらの筋肉は、我々の後肢虚血ハムスターモデルにおいて組織病理学的病変へ、逆には大腿後部側から得た他の筋肉（半腱様筋、半膜様筋、大腿二頭筋）への感受性に対して選択されたものである。

大腿の動脈の切除によって誘導される典型的な病変を図２に示す。虚血誘導後２８日目に大腿の後部分からの筋肉即ち大腿薄筋及び内転筋群を回収し、ＨＥＳ染色が観察された後に筋肉の５μｍ厚切片を回収した。図２Ｂ及び図２Ｃはそれぞれ、虚血性筋肉における軽度ネクローシス（破線）及び中心核形成（centronucleation）（矢印）を示す。図２Ａは、対照としての病変を有しない非虚血性反対側筋肉の倍率１００倍断面を示す。内転筋群筋肉及び大腿薄筋の総面積を決定し、筋肉量に対する虚血への影響を調査した。全筋肉面積に対するＳＭＡ＋細動脈の数を決定した。両パラメータに対し、その後、虚血性／非虚血性値の比を計算した。処置に盲検的な研究者が全ての手順を実行した。

実施例７：虚血性筋肉におけるＮＶ１ＦＧＦ遺伝子移入後のＦＧＦ−１の発現
実験２では、生理食塩水注射またはＮＶ１ＦＧＦ遺伝子移入から１４日後（即ち虚血の誘導から２８日後）、非虚血性及び虚血性肢から得た大腿の後部分からの筋肉（大腿薄筋及び内転筋群）を以下のように処理した。ＦＧＦ−１発現を検出するために用いられる古典的なストレプトアビジン−ビオチンアッセイを用いてＦＧＦ−１免疫組織化学を行った。一次ポリクロナール抗ＦＧＦ−１ウサギ抗体（reference AB-32-NA, ３０倍希釈, R & D Systems, Abingdon, UK）によるインキュベーションの後、ビオチン化ロバ抗ウサギ免疫グロブリン（２００倍希釈、Amersham, Buckinghamshire, UK）によるインキュベーションを行った。ストレプトアビジンに結合したペルオキシダーゼを加えた後、色素生産性ジアミノベンジジン基質を用いて免疫複合体を局在化させた。５μｍ厚の切片をヘマトキシリンにより対比染色し、脱水して、永久封入剤により封入した。顕微鏡（Axioplan 2, Zeiss, Hallbergmoos, Germany）下で免疫反応性線維を同定した（褐色染色）。

統計分析
結果を平均値ＳＤとして表す。統計学的な有意性はＰ＜０．０５で想定した。

実験１では、ＨＣ／２１及びＨＣ／２８群における血清脂質レベルを種々の時点でＡＮＯＶＡにより比較し、任意の２つの値の比較のためにチューキー・クレーマー（Tukey-Kramer）事後テストを行った。ＬＣ、ＨＣ／２１及びＨＣ／２８群において計算した血管造影スコアをＡＮＯＶＡにより比較し、チューキー・クレーマー事後テストを行った。ＨＣ／２１群及びＨＣ／２８群において、非虚血性及び虚血性の筋肉面積値及びＳＭＡ陽性細動脈の数と対応する比を不対ｔ検定によって比較した。

実験２では、生理食塩水及びＮＶ１ＦＧＦ群おける血清脂質レベルを種々の時点でＡＮＯＶＡにより比較し、任意の２つの値の比較のためにチューキー・クレーマー事後テストを行った。生理食塩水及びＮＶ１ＦＧＦ群において、血管造影スコア、非虚血性及び虚血性の筋肉面積値及びＳＭＡ陽性細動脈の数と対応する比を不対ｔ検定によって比較した。

実施例８：低コレステロール及びコレステロールに富んだ食餌における血清脂質の測定
実験１及び実験２における、コレステロールに富んだ食餌を与える前（−３５日目）及び食餌変更後の種々の時点（−７日目及び＋２１日目または＋２８日目）での血清脂質レベルをそれぞれ表１、表２にまとめた。コレステロールに富んだ食餌は、全コレステロールレベル及びトリグリセリド血清レベルの両方で時間依存増加をもたらした。

実施例９：後肢虚血後の側副性発生及び細動脈密度に対するコレステロールに富んだ 食餌の効果（実験１）
図３に示すように、後肢虚血から２８日後の側副形成はＬＣ群において高く（図３Ａ）、血管造影スコアは０．９３±０．４５になった（図３Ｄ）。

逆に、両ＨＣ群において側副の形成は後肢虚血後２１日目または２８日目に格段に障害され、血管造影スコアはそれぞれ０．３５±０．３８、０．３７±０．２１に減少した（図３Ｂ及び図３Ｃを参照）。血管造影スコアの減少は、両ＨＣ群においてＬＣ群に比較して顕著であった（Ｐ＜０．０１）。にもかかわらず、血管造影スコアは、図３Ｄに示すようにＨＣ／２１とＨＣ／２８群で異なっていなかった（Ｐ＞０．０５）。

図４Ａ乃至図４Ｄは、虚血の誘導後２１日目または２８日目に回収された非虚血性及び虚血性筋肉（内転筋群及び大腿薄筋）からの平滑筋α−アクチン（ＳＭＡ）免疫組織化学により標識された成熟血管の倍率１００倍の代表的な断面と、筋肉面積及び５０μｍ以下のＳＭＡ陽性細動脈の定量化を示す。

図４Ｅ乃至図４Ｆに示されるように、虚血から２１日後（Ｐ＜０．０１）に非虚血性肢に比べて虚血性肢における内転筋群及び大腿薄筋の面積が減少した。統計学的な有意性（Ｐ＝０．０５３８）には到達しなかったが、後肢虚血から２８日後に同じ傾向が見られた。更に、虚血後２１日目と２８日目の両方で、非虚血性肢に比べて虚血性肢における５０μｍ以下の細動脈の数が有意に減少した（ｐ＜０．０１）。細動脈密度計算の中間ステップにおける有意性のこれらの統計学的レベルに拘らず、食餌変更の開始から２１日後と２８日後で密度自体は異なっていなかった。筋肉面積と、ＳＭＡ＋細動脈と、虚血性／非虚血性肢の比で表される細動脈密度は、２１日目と２８日目で異なっていなかった。

これらの結果は、後肢虚血から２１日後と２８日後に高コレステロール血症が側副血管、血管造影により定量化される巨大及び微小血管レベルの両方での慢性血管由来疾患、及び組織学的方法により同じ程度まで定量化される５０μｍ以下の細動脈発生の阻害を誘導することをはっきり示している（図２Ｂ及び図２Ｃ）。

更に、我々のモデルに適用された脂質過剰が上昇し、内皮機能障害及び後肢虚血後の血管形成反応における欠損をはっきり生じさせるので、この研究に用いた高コレステロール血症のハムスターは特に重症のモデルを与える。更に、コレステロールに富んだ食餌の開始から４週間後にハムスターから回収した動脈の組織病理学的分析を行ったところ、泡沫細胞の存在が明らかになった。更に、後肢虚血からの回復期間中に持続する全コレステロール及びトリグリセリドレベルの連続的な増加があり、それにより、モデルを載置することは内皮機能障害及び血管形成異常の重症度において最悪のシナリオである。

実施例１０：高コレステロール血症のハムスターにおける筋肉内投与から１４日後（即ち後肢虚血後２８日）の側副性発生及び細動脈密度に対するＮＶ１ＦＧＦ遺伝子移入の効果（実験２）
図５Ｂに示すように、後肢虚血の誘導から１４日後の筋肉内のＮＶ１ＦＧＦ遺伝子移入は、生理食塩水で処置したハムスター（図５Ａ）に比べ、虚血性肢における側副形成を大いに促進した。また、ＮＶ１ＦＧＦ遺伝子移入後の血管造影スコア（０．７５±０．４７）は、生理食塩水で処置したハムスターのもの（０．２２±０．０５）より実際に有意に高かった（ｐ＜０．０１）。

図６Ａ及び図６Ｂは、生理食塩水及びＮＶ１ＦＧＦで処置したハムスターの虚血性筋肉からの平滑筋α−アクチン（ＳＭＡ）免疫組織化学により標識された成熟血管を示す代表的な断面（１００倍に拡大）であり、筋肉面積及び５０μｍ以下のＳＭＡ陽性細動脈について定量化した。

生理食塩水群及びＮＶ１ＦＧＦ群の両群において、虚血性肢における（それぞれＰ＝０．２４０４、Ｐ＝０．０８４６）内転筋群及び大腿薄筋の面積減少が観察された。図６Ｃ及び図６Ｄに示すように、虚血性／非虚血性肢の比で表される筋肉面積は、生理食塩水群及びＮＶ１ＦＧＦ群（Ｐ＝０．４５８４）において類似していた。生理食塩水で処置した動物において、非虚血性肢に比べて虚血性肢において５０μｍ以下の細動脈の数は有意に減少した（Ｐ＝０．０３３３）。ＮＶ１ＦＧＦ群においては、差は有意ではなかった（Ｐ＝０．１３４７）。虚血性／非虚血性肢の比を計算することにより、生理食塩水（Ｐ＝０．０１８７）と比べてＮＶ１ＦＧＦで処置した筋肉において統計学的に高い値が明らかになった。にもかかわらず、どの処置群（生理食塩水、ＮＶ１ＦＧＦに対してそれぞれＰ＝０．９３２０、Ｐ＝０．１５８６）の非虚血性肢及び虚血性肢からの筋肉においても、細動脈密度は異なっていなかった。虚血性／非虚血性肢の比で表される細動脈密度は、生理食塩水群とＮＶ１ＦＧＦ群とで異なっていなかった（Ｐ＝０．２７２４）。

実施例１１：ＮＶ１ＦＧＦ遺伝子移入後の虚血性筋肉におけるＦＧＦ−１の発現
ＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２など他の血管由来因子を含む遺伝子治療とは対照的に、発明者は、ＦＧＦ−１の発現がＮＶ１ＦＧＦで処置した動物の虚血性筋肉に有利に制限されることを証明した。

また、非虚血性（反対側）の注射されていない肢（図７Ａ）及び生理食塩水（図７Ｂ）またはＮＶ１ＦＧＦ（図７Ｃ）を注射した虚血性肢から得た大腿の後部分からの筋肉（大腿薄筋及び内転筋群）における抗ＦＧＦ−１ポリクロナール抗体での免疫組織化学的染色の代表的な写真（１００倍に拡大）が示すように、生理食塩水で処置した動物の虚血性筋肉においても生理食塩水及びＮＶ１ＦＧＦで処置した動物の非虚血性（反対側）筋肉においてもＦＧＦ−１の発現は驚いたことに検出できなかった。これは、成熟血管の形成による持続した血管由来反応をもたらすのに十分な治療的空白内で、しかし散在性及び乱雑な血管形成または負の副作用を許容しない濃度で、コードされたＦＧＦ−１タンパク質の徐放を可能にするプラスミドＮＶ１ＦＧＦの優れた特性をはっきりと示している。ＮＶ１ＦＧＦは従って、処置筋肉において検出不可能な濃度で血管形成を効率的に促進することができ、従って、治療的空白及び悪化した内皮機能障害によって特徴付けられる条件に含まれるＮＶ１ＦＧＦの濃度の使用を可能にするので、特に効力があることが証明された。安全性及び効力の点でそのような優れた特徴に起因して、ＮＶ１ＦＧＦは、高コレステロール血症または糖尿病により引き起こされた悪化した状態における血管形成治療として用いられ得るので有利である。

これらの結果は、ＮＶ１ＦＧＦ遺伝子治療が側副血管及び細動脈の増加によって障害されたものを救済することができることをはっきり示している。事実上、１５０μｍ以上の側副血管の成長が血管造影的に証明され、５０μｍ以下の細動脈の成長が、大腿二頭筋、内転筋群、大腿薄筋、半膜様筋、及び半腱様筋を含む大腿後部における免疫組織化学によって証明された。期せずして本件出願人は、血管造影スコアによって際立たせたように（図５Ｃ）、ＮＶ１ＦＧＦ遺伝子移入から１４日後、側副血管の形成がこの領域へ著しく刺激されることを実証した。

大腿の動脈切除後にその領域に虚血が生じると主張するために組織酸素付加のin situ測定を行ってはいないが、中心核形成、ジストロフィー、ネクローシス、炎症など組織学的病変の存在は明らかになった（図２）。より正確には、これらの病変は内転筋群筋肉及び大腿薄筋に限定され、大腿二頭筋、半膜様筋、及び半腱様筋には病変の傾向はなかった。従って、５０μｍ以下の細動脈の定量化は、専ら、内転筋管のすぐ上の内転筋群筋肉及び大腿薄筋において行った。図６Ｄに示されるように、ＮＶ１ＦＧＦ遺伝子移入が虚血性肢のこれらの筋肉への細動脈の絶対数を増加させた。

従って、これらのデータは、組織への血液の搬送及び輸送が必要な大腿後部の虚血負傷筋肉においてコンダクタンスが大きい成熟血管（１５０μｍ以上の側副血管）及び抵抗が小さい動脈（５０μｍ以下の細動脈）の形成を誘導するためのＮＶ１ＦＧＦの能力を疑いなく実証している。

実施例１２：ＮＶ１ＦＧＦで処置した筋肉におけるＶＥＧＦ−Ａ誘導の不存在
この実験の目的は、マウスにおけるラットＦＧＦ−１をコードする裸のＤＮＡの筋肉内（ＩＭ）投与に続くＶＥＧＦ−Ａ誘導をin vivoで評価することであった。マウスＶＥＧＦ−Ａ（ｍＶＥＧＦ−Ａ）循環レベルと局所遺伝子発現の両方を調査した。循環レベルをＥＬＩＳＡによってＩＭ投与後３日及び７日間測定し、７日目まで２つのアッセイ、即ち、タンパク質に対する免疫組織化学（ＩＨＣ）と、リアルタイム転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）によるｍＲＮＡの検出とを用いて局所ｍＶＥＧＦ−Ａ遺伝子発現を調査した。

この研究には、４０匹のメスのマウスを用いた。群１乃至３（１群につきｎ＝８）にはそれぞれpCOR-CMV.rat-spFGF-1、pCOR-CMV.Empty（ＦＧＦ−１遺伝子なし）またはＮａＣｌ０．９％を右左両方の頭部脛骨筋にＩＭ投与した。pCOR-CMV.rat-spFGF-1は、ヒトＦＧＦ−１が対応するラット由来のコード配列に置換されたＮＶ１ＦＧＦプラスミドに対応する。注射された筋肉を投薬後７日目に回収し、ｍＶＥＧＦ−Ａ及びＦＧＦ−１免疫組織化学（右筋肉）またはｍＶＥＧＦ−ＡリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（左筋肉）のために処理した。群１乃至３において、新たに調製した血清サンプルにおいてｍＶＥＧＦ−ＡのＥＬＩＳＡ検出を行うために、投与後３日目（Ｄ３）及び７日目（Ｄ７）に血液を収集した。

図８に示すように、pCOR-CMV.Empty I（図８Ｂ）にもＮａＣｌ を注射した筋肉（図８Ｃ）にもＦＧＦ−１陽性筋線維は検出されなかった。pCOR-CMV.sp-ratFGF-1を注射した筋肉（図８Ｅ）に対して、筋線維／切片を発現する２５ＦＧＦ−１の平均値を確立した。

免疫組織化学を用いて、両対照筋肉群（ＮａＣｌ及びpCOR-CMV.Empty）に類似かつ淡いｍＶＥＧＦ−Ａ標識が観察された。これはｍＶＥＧＦ−Ａの内因性発現を示している。筋線維内に局在させた免疫染色はモザイクパターンを示したが、これは他よりも強く標識された線維があったためである。pCOR-CMV.rat-spFGF-1を注射した筋肉において、pCOR-CMV.EmptyまたはＮａＣｌを注射した筋肉に比べて投与後Ｄ７によるｍＶＥＧＦ−Ａ免疫標識の増加は見られなかった（図８Ｄ）。同じ免疫染色のモザイクパターンは見られた。

リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて、pCOR-CMV.Empty及びＮａＣｌで処置した筋肉において類似レベルのｍＶＥＧＦ−ＡｍＲＮＡ発現が証明された（全ＲＮＡの２ｎｇ当たり６．８４×１０^３及び４．３１×１０^３のｃＤＮＡコピー）。これは内因性ｍＶＥＧＦ−Ａ発現を示している。pCOR-CMV.sp-ratFGF-1を注射した筋肉において、pCOR-CMV.EmptyまたはＮａＣｌを注射した筋肉に比べて投薬後７日目（Ｄ７）までにｍＶＥＧＦ−ＡｍＲＮＡレベルの増加は見られなかった（全ＲＮＡの２ｎｇ当たり６．５１×１０^３ｃＤＮＡコピー）。

これらの結果は、pCOR-CMV.rat-spFGF-1を筋肉内投与しても注射された筋肉に局所ｍＶＥＧＦ−Ａ誘導をもたらさず、注射されたマウスの循環血液中にｍＶＥＧＦ−Ａ分泌をもたらさなかったことをはっきりと示している。

実施例１３：高コレステロール血症のワタナベウサギ冠動脈疾患動物モデル
可能性のある処置としての遺伝子治療産物の確認は、その生物学的活性に部分的に依存している。それを評価するために、被選択動物モデルは、解剖学的構造及び機能に関する限り模倣するヒト疾患にできるだけ近いものであるべきである。

解剖学的関連性は、用いる種に基づいた。冠状動脈ネットワークに関する限り、ヒトの心臓にできるだけ近いものであるべきである。更に、種々の技術ステップが容易になるので種は大きければ大きいほどよい。他方、費用、取扱い設備、動物状態偶然性、動物設備適応性などの因子も考慮した。この研究で見つけられた最も良い妥協案はウサギである。ウサギは、取扱い及び固定が容易な程度に小さく、特定の動脈の良好なスポッティング、正確な冠動脈造影、種々の解剖学的及び機能的事項のヒト様比較が可能な程度に大きい。

実際、機能的関連性はここでは動物の能力に基づいたが、これはヒト側の対応部（counterpart）即ち高コレステロール血症に関連する血管由来欠損にできるだけ近い病態を作り出すためである。

ヒトにおける高コレステロール血症は、血管内皮機能障害と、究極的には主要な冠動脈の進行性狭小化を引き起こす。休息時と負荷時の冠状動脈血流の不均衡が、痛み及び低収縮性につながる密かな心筋機能不全を引き起こす。通常、供給は休息時には適切であるが、負荷が生じると、需要が高まる一方で冠状動脈の閉塞性病変により供給は不可能になる。このヒト病理学を模倣する目的が主要な冠動脈上での狭窄の設定及びこの狭窄により負荷時に生み出される不均衡を明らかにするための負荷試験の使用の両方につながる理由はここにある。

従って、ＬＤＬ受容体欠損であるがゆえに冠状動脈のアテロームにつながるような自発性アテローム性動脈硬化症を発現するワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ（ＷＨＨＲ）を用いて、開胸手術中に虚血を評価し、虚血性状態に対するＮＶ１ＦＧＦの心筋内注射の効果を評価した。

全ての実験の扱いは、動物管理委員会に承認され、ＮＩＨの実験動物の管理と使用に関するガイドラインに適合した実験計画に基づいた。

体重３０００〜３５００ｇの１歳齢のＷＨＨウサギをコバンス社（Covance, PO Box 7200, Denver, PA, 17517, USA）から入手した。

使用前少なくとも８日間は、良好な動物管理慣習に基づき全ての動物を動物小屋に保持した。この期間を通じて、１匹ずつ檻に入れ、エサ（112C type from UAR）及び適切にろ過された飲料水に自由にアクセスできるようにした。動物小屋は、大気温度２０〜２４□、湿度３５〜７５％にセットし、１２時間の明暗サイクル（午前６時に点灯）を維持した。

ワタナベウサギは、野生型動物に比べてコレステロールレベルが７〜１０倍高く、トリグリセリドレベルが正常より４〜５倍高かった。

屠殺後、そのうちの４匹をオイルレッドＯ染色した。オイルレッドＯは、大動脈、冠状動脈の口及び僧帽弁における脂質プラークの存在を証明する。

更に、これらのうちの１つを組織学的分析に送った。回旋冠動脈のＨＥＳ染色切片の顕微鏡検査は、２匹の研究用ウサギの一方（ウサギ番号CAD98R2、図９Ｂを参照）において管腔の約１５％をカバーしているアテローム斑を同定した。

ワタナベ遺伝性高脂血症ウサギは、２つの興味深い性質を有していた。１つはウサギの心臓サイズが複数回の心筋内注射に十分適合していたことであり、１つはウサギの冠状動脈ネットワークの所々にアテローム斑があったことである。麻酔下でのドブタミン負荷試験を行うと顕著な虚血パターンが見られる一方で、（正常なＥＣＧ及び正常な収縮性により評価される）冠状動脈血流が休息中に正常である理由は、後者の性質により説明される。

つまり、両分析、例えば心電図検査及び心臓エコー検査は、負荷時に、例えばＳＴの低下または減動（hypokinesis）などそのヒト側の対応部との比較が可能な徴候を証明する。

実施例１４：手術
直接注射によって遺伝子治療産物を心筋に届けるために手術を用いる。無菌条件下で手術手順を行った。ケタミン（７０ｍｇ／Ｋｇ）とキシラジン（７ｍｇ／Ｋｇ）の混合物を麻酔下で動物に筋肉内注射した（１ｍｌ／Ｋｇ）。気管内挿管を容易にするために剃毛後に動物の咽頭にリドカイン５％スプレーにより蒸気を与え、実験を通じて以下の条件で人工呼吸器（Siemens, Servo Ventilator 900D）により麻酔を維持した。

ガス注入量：１，４Ｌ／分
ガス抜き頻度：４０／分
ハロタン：０．４〜０．６％
酸素：３０〜３５％
５％のグルコースが動物の中を連続的に潅流するように、辺縁耳静脈のカニューレ挿入を行った。手術行為を通じて安定したリズムを確実にするためにＥＣＧによるモニタリングを用いた。第四肋間腔で左開胸を行った。心膜を開いた後、心臓をプラスミド注射のために曝した。

自作の針により、即ち短い斜端針ＢＤ（２６Ｇ^３／８）が固定されたステリフレックス（Steriflex）Ｇ１９カテーテル（ref: 167.10）に接続された２５０μｌのハミルトン注射器により、左心室自由壁上の１３の異なる位置に注射を行った。１つの位置につき１ｍｇ／ｍｌのプラスミド溶液を２５μｌ注射した。各注射位置を図１Ａに示す。

注射後、ドレインチューブを胸腔に配置し、２本のMersurtures（登録商標）（１．０）縫合糸で肋骨を隣り合わせに置いた。動物が覚醒するまでハロタンを止め、酸素を維持した。胸部を閉じる間中、ドレナージを２００〜４００ｍｂａｒ付近に設定した。筋肉の２つの層をバイクリル（登録商標）（４．０）縫合糸により閉じた。その後、Suturamide（２／０）縫合糸により皮膚を縫合した。ドレインチューブを引き抜く直前に胸部全体で肺が十分に膨らむように、最後の縫合が終わった時点でかつドレインチューブの除去前に、人工呼吸器の助けを借りて肺における終末呼気陽圧（ＰＥＥＰ）を増加させた。

傷にベータダインゲルを塗布し、包帯を巻回した。動物が覚醒したとき、人工呼吸器を停止させた。

実施例１５：手術後の処置
動物が覚醒したらすぐに、以下の化合物を注射した。

手術中及び手術後に冠動脈の潜在的な血栓症を避けるための凝集阻止及び血液凝固阻止：
０．３７５ｍｌのベタルジン（Vetalgine）（手術の１日前及びその後５日間）：筋肉内注射
０．１ｍｌのヘパリン（手術の翌日から４日間）：皮下注射
感染予防のためのスペクトルの大きな抗生物質：
０．２ｍｌのバイトリル（Baytril）２％（５日間）：皮下注射
動物がつらい手術行為に耐えるように強力な鎮痛薬：
０．５ｍｌのモルヒネ（２日間）：皮下注射
実施例１６：心電図検査
心電図検査をヒト側の対応部になるべく近づけて設定した。４つの電極を四肢にセットし、６つ（Ｖ１からＶ６）を前胸部にセットした。古典的な十二誘導ＥＣＧを心電計（HP Pagewriter II 4565A）に記録した。ＥＣＧの使用により、（１）手術中の心臓リズム、（２）ドブタミン負荷試験中の心臓リズム、（３）心筋梗塞の検出、及び（４）虚血の徴候の検出をモニターすることが可能になった。

４．１ 手術中の心臓リズムのモニタリング
全身麻酔を伴う開胸手術は、潜在的に、ＥＣＧモニタリングにより検出可能な種々の手術毎の問題につながることがある。徐脈はアトロピン注射によって処置し、不整脈はリドカイン０．５％注射（０．５〜１ｍｌ）によって処置し、心臓の停止はイソプレナリンを含む高エネルギー心肺蘇生によって処置した。

４．２ ドブタミン負荷試験の心臓リズムのモニタリング
ドブタミンの主な薬理学的効果がその変力作用であったとしても、この産物は変時性のようでもあり、よって、心臓リズムの増加が負荷試験をモニターする最も簡単な方法であるように見えた。

４．３ 心筋梗塞の検出
最も重要な部分ではそれぞれがｐ波、ｑ波、ｒ波、ｓ波の連続したものであるような一連の拍動として心臓の電気活性を記録した。ｐ波を試験活性の証拠として用い、ｑｒ波を合成したものを心室活性の証拠として用い、ｔ波を再分極のマーカとして用いた。

ヒトにおける心筋梗塞の最も古典的なＥＣＧサインは、深くかつ大きなｑ波である。一連の診査用ウサギの分析はほとんどのウサギにおいて冠動脈を機械的に閉じたときにそのようなｑ波の存在を示すので、ウサギの並列実験は可能であった。

４．４ 虚血の徴候の検出
この密かな現象は、休息中に通常見られるものではなかった。負荷試験中、種々の変化が表れた。ウサギの心臓が同一の機械的／科学的負荷を与えたときに同一の電気的パターンを示すと仮定した。事実、ヒトにおける実際の虚血は、ＳＴセグメントの上昇またはＴ波の低下または／及び反転をもたらす（図１０）。２つの主要なサインは、ヒトの負荷試験中、図１０に示したようなＳＴセグメントの低下と負の深いＴ波である。そのウサギ側の対応部の例を図１１に示す。

虚血サインのスコアリング方法を図１２に示した。図１２に示されるような各誘導に対する０ポイント（正常なＥＣＧ）から３ポイント（著しい虚血）までのスコアが与えられ、記録された。誘導における有意な偏差の存在は、偏差が見られる誘導の数として重要であった。従って、先ず全スコアの合計を記録し、次に特定のＥＣＧに見られた最も高いスコアのみを保持し、虚血性動物の包括のために用いた。唯一の除外基準は、経壁ネクローシスを示すｑ波（１マスより大きく、３マスより深い）の存在であった。

休息中の典型的な標準十二誘導ＥＣＧを図１３Ａに示した。同一の動物は、最大負荷で（図１３Ｂを参照）Ｉ、ＩＩ、ａＶＦ、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４誘導において有意な下向き勾配の低下と、ＩＩＩ、Ｖ５及びＶ６誘導において有意でない低下を示した。この特定のＥＣＧは、非常に強い虚血を示した。

結論的には、ＥＣＧは、除外基準（即ちネクローシス）または包含基準（ドブタミンに対する虚血性反応）のいずれかを検出するための、最初に行うのに最も良い方法であった。

実施例１７：心臓エコー検査
アキュソン・セコイア２５６（Acuson Sequoia 256）及び線形８Ｌ５ ８ＭＨｚプローブを用いて心筋収縮性を評価した。小型ウサギの胸部域がこの特定の分析においてこの表在プローブを用いるに耐えるものだったからである。

各動物に対して、手術前に１回、その後負荷試験前と負荷試験中に毎週、心臓エコー検査を実施した。各ケースでは、長軸及び短軸の両軸において、できるだけ多くのセグメントで次々に心臓の全体的な速度論的挙動を検査した。その後、長軸において最大径をスポッティングし、左心室の正常な挙動を確実にするために装置をＭモードに切り替えた。

負荷試験の各ステップにおいて類似の２Ｄ分析を行った。検出された異常性を記録して更に評価した。位置は下記（図１４）の命名法を用いて書き留め、欠損のタイプの格付けは、正常なものに対しては１、減動（hypokinesy）に対しては２、無動（akinesy）に対しては３、運動障害（dyskinesy）に対しては４とした。欠損の存在が疑わしいときは、Ｍモードを用いて肥大割合を格付けした。その後、全てのセグメントが正常な肥大割合（３０％以上）を有すれば１、減動（１若しくは複数のセグメント３０％以下）を有すれば２、無動（少なくとも１つのセグメントに肥大なし）を有すれば３、運動障害（１つのセグメントが負の肥大割合、即ち収縮期中に心筋が拡大）を有すれば４として配列をスコア化した。

最も高い欠損スコアのみを最終分析のために保持した。

実施例１８：ドブタミン負荷試験
この試験は、負荷状態への心臓の反応を模倣するためにその変力性及び変時性特性によりドブタミンを用いた。虚血は、通常は負荷中に生じる密かな現象であるので、心臓エコー検査により証明されるようなＥＣＧ上の電気サイン及び心筋収縮性に対するその結果を検出してそれを明かした。試験の技術的ステップは以下の通りである。

麻酔：イソフルランは休息中の心拍数を高くするイソフルランを処分した。アトロピンの付加は心室転位症の出現をもたらすので、ハロタンを処分した。従って、心拍数増加のカイネティクスが良好なキシラジン−ケタミンを選択した。

アトロピン：０．５ｍｇ／Ｋｇのアトロピン硝酸メチルを予備的ステップとして耳カテーテルに注射した。ある程度の心拍数増加をもたらす硫酸アトロピンを処分した。

用量のスケールアップ：初回投与は２μｇ／Ｋｇ／分であった。３分毎に用量を５、１０、２０、３０、及び４０μｇ／Ｋｇ／分に増加させた。最大心臓に達していなければ、最終用量は８０μｇ／Ｋｇ／分のにした。

ステップ毎にＥＣＧ及び心臓エコー検査を記録した。麻酔下のウサギの心拍数は、休息中２０３±２２（ｎ＝６１試験）、４０μｇ／Ｋｇ／分で２８０±３１（ｎ＝５９）、８０μｇ／Ｋｇ／分で２９９±１９（ｎ＝２９）であった。心拍数が４０μｇ／ｋｇ／分で３００ｂｐｍ以下のときにのみ４０から８０に上げる決定をした。

結論的には、この試験を用いて、化学的負荷中の心筋の挙動が分かるようにし、従って、心臓の虚血性切片を明らかにした。

実施例１９：アテローム斑、耐性及びＦＧＦ−１発現の組織学的分析検出
実験の最後に、アテローム斑が存在するかどうか２匹のウサギの回旋冠動脈を検査した。心臓を取り除き、回旋冠動脈の上部を含む左心室のサンプルを解剖して更なる分析のためにＰＢＳ緩衝３．７％ホルマリンに浸漬した。各サンプルをパラフィンに包埋した。各３００μｍから５μｍ切片を作成し、顕微鏡検査のためにヘマトキシリン−エロシン−サフラン（Hematoxilin-Eosin-Saffron：ＨＥＳ）で染色した。

２匹の他のウサギを用いて、左心室壁にＦＧＦ−１をコードするプラスミドを注射することの効率及び安全性を評価した。後者を３日目に安楽死させ、心臓を取り除いて洗浄し、前壁を観察してホルマリンに１時間保持した。その後、それを５つのサンプルに分け、それぞれを３．７％ＰＢＳ緩衝ホルマリン中に一晩固定してからパラフィンに包埋した。

各心臓に対し、肉眼的病変を示すか或いは注射部位を含むと推定された５つのサンプルを収集し、３．７％ＰＢＳ緩衝ホルマリン中に一晩固定してからパラフィンに包埋した。

スライド試料には標準化された手順を用いた。各ブロックから２つの５μｍの連続切片を作成した。一方の切片を組織病理学的検査のためにヘマトキシリン−エロシン−サフラン（ＨＥＳ）で染色し、他方の切片をＦＧＦ−１免疫組織化学（ＩＨＣ）のために処理した。針及びベクター注射に関連する組織学的変化の存在により、注射部位をＨＥＳ染色切片上で同定した。古典的なストレプトアビジン−ビオチンアッセイを用いてＩＨＣ手順を行った。一次ポリクロナール抗ＦＧＦ−１ウサギ抗体（R&D Systems; ＃AB-32-NA, ３０倍希釈）によるインキュベーションの後、ビオチン化ロバ抗ウサギ免疫グロブリン（Amersham, ２００倍希釈）によるインキュベーションを行った。ストレプトアビジンに結合したペルオキシダーゼを加えた後、色素生産性ジアミノベンジジン基質を用いて免疫複合体を局在化させた。切片をによりヘマトキシリン対比染色し、脱水して永久封入剤により封入した。この方法により、免疫反応性線維は褐色に、核は青色に見えた。ウサギ筋肉におけるＦＧＦ−１ＩＨＣアッセイの以前の確認は、ウサギ組織サンプルに抗ウサギ二次抗体を用いたときでさえも、筋線維におけるＦＧＦ−１導入遺伝子検出能力を実証した。陰性対照（一次抗体を省略するが二次抗体を用いる）を用いて特定の免疫反応性に対する非特異的染色（主として細胞外の）を区別した。更に、アッセイ中のＦＧＦ−１ＩＨＣの動作制御は以前に高レベルのＦＧＦ−１発現を示したラット筋肉からの陽性切片（スライドP1056GNR2、研究PAD31.2001）を用いて行った。免疫反応性線維を同定して顕微鏡（Zeiss, Axioplan 2）下で計数した。所与の免疫反応性細胞数は、各注射部位の周辺に見られた免疫反応性心筋線維の数であった。

実施例２０：高コレステロール血症環境における治療的血管形成の実証
１歳齢のオスのワタナベウサギを全部で１６匹用いて、高コレステロール血症に関連する心筋虚血の逆戻りに対するＮＶ１ＦＧＦの有効性を評価した。更に、２匹のニュージーランドウサギに同一の手術手順を施し、３日目に発現分析のために屠殺した。

２０．１／ＦＧＦ−１発現評価及び組織病理学的パターン
２匹の健康なニュージーランドウサギを手術手順及びＮＶ１ＦＧＦの注射後３日目に屠殺した。各心臓から分析した５つのサンプル内に５及び７つの注射部位を局在化したので、ベクター注射に関連する組織病理学的変化の評価を成功裏に達成した。２つの注射間の距離に対応する６〜１０ｍｍだけ離れた、最大３つの異なる注射部位を証明するサンプルがあった。心筋病変は、ほぼ線形で、活性慢性炎症反応を伴うネクローシス及び変性にあった（図１５Ａを参照）。心膜下で限定された心膜炎を示唆するリンパ球の拡散浸潤を示すサンプルもあった。個々の結果を表３に示す。

ＮＶ１ＦＧＦの心筋内注射から３日後、注射部位を示す全てのサンプルにおいてＦＧＦ−１免疫反応性筋線維を検出した。発現は、組織学的病変の周辺に限ると、注射部位当たり３乃至３６の陽性心筋線維であった（図１５Ｂを参照）。個々の結果を表３に示す。

結論的には、健康なウサギの心筋内にＮＶ１ＦＧＦを直接注射してから３日後、筋線維変性及びそれに続く炎症反応が見られた。そのような初期時点で、病変の重症度及びタイプは、導入遺伝子をコードしない裸のＤＮＡプラスミドを注射した後にブタの心筋で観察されたものと類似していたので、組織学的ダメージはＮＶ１ＦＧＦに非特異と考えられた。

注射部位を示す全てのサンプルにＦＧＦ−１発現が見られたとき、ＮＶ１ＦＧＦの心筋内注射に対してウサギの心臓における導入遺伝子発現の効率を確立した。注射部位当たりの免疫反応性筋線維の数を考慮すると、ウサギにおける１注射部位がラットの心臓における単回注射に等しいと仮定すれば、発現のレベルは同量のＮＶ１ＦＧＦの心筋内注射後にラットの心臓で観察されたものと類似していた。

２０．２／注射されたワタナベウサギの心電図パターン
この研究には１６匹のウサギを用いた。それぞれの動物に対し、手術前及びその後４週間毎週、負荷試験を行った。観察された最も高いスコアを両群に対してプロットした（空の（empty）プラスミドを注射した動物は青色、ＮＶ１ＦＧＦを注射した動物はピンク色）。７日目になるとすぐにＮＶ１ＦＧＦ群のほとんどの動物はより低いスコアを獲得し、処置下で虚血が消失する傾向にあることが示された。他方、空の処置群のほとんどの動物は、深く虚血性のままであった（最大虚血性スコアは３）。

図１６に示した結果は、空のプラスミド（個々の結果は青色の小さな丸、平均は青色の柱）またはＮＶ１ＦＧＦプラスミド（個々の結果は赤色の小さな丸、平均はピンク色の柱）で処置したウサギに対する負荷試験中に最大ＥＣＧスコアの進展を示した。ＮＶ１ＦＧＦプラスミドの処置は、虚血性サイズの意図した効果を生ずる有意な減少をはっきり示した。

７日目から開始し、統計分析（不対ｔ検定）は両群間で有意な差を示した（*に対してｐ＜０．０５、**に対してｐ＜０．０１）。これは、負荷時に虚血性心電図パターンの回帰にＦＧＦ−１が存在する効果を示している。

２０．３／注射されたワタナベウサギの心エコーパターン
第１のステップは、定性評価（分類正常、減動、無動）と定量分析（部分壁肥大）との対応の正確さを確認することである。３０のセグメントを分析したところ、１６が正常、１４が異常であることが分かった。その後、その部分壁肥大を計算し、対応を図１７に示した。

図から分かるように、２つの組の重複は非常に狭く、視覚的評価がかなり妥当であることを示している。異常なセグメントには、１つの運動障害のセグメント（肥大割合は良好だが動きが異常）及び３つの無動セグメントが含まれ、そのうち１つは収縮期により薄くすらなるものであった。続いて、我々が正常及び減動／無動として認定したのは妥当であり、従って、心筋の動態の二次的な、より広範な評価が可能になると考えられた。

第２のステップは、各負荷試験における心エコーの評価にＥＣＧの結果を相関させることであった。結果を図１８にプロットした。回帰曲線を赤色で示した。これは、異常なＥＣＧが異常なエコーと凡そ相関することを示している。２つの影付き領域は主な２組のデータ、即ち、normokinesisエコー及び正常な／僅かに虚血性のＥＣＧと、異常なエコー（hypokinesis及びakinesis）及び非常に虚血性のＥＣＧ（スコア３）を表す。

虚血性ＥＣＧが正常なエコーに対応する６つの点は、あらゆる試験に対して良いクリップを得ることの技術的困難さであり、エコーの欠損が見当たらなかったことを恐らく示している。他方、エコー欠損を伴う僅かに虚血性のＥＣＧを示したのは３つの試験のみであった。異常なエコーと相関する正常なＥＣＧはなく、ＥＣＧに対する良好な感受性が示された。

第３のステップでは、４つの処置動物の２つの群における心臓エコー検査の進展が続いた。スコアの格付けは、１（正常）、２（減動）または３（無動）とした。この組の動物には運動障害セグメントが見られなかった。表４に生データをプロットした。この表から分かるように、基線値は異なっていた（平均値２．２５対１．５）。従って、各基線値を用いて組全体を１００％に基準化した。次に、各動物に対する以下の点をこの基線のパーセンテージとして表した。最終的な図形を図１９に示した。

ＮＶ１ＦＧＦで処置した動物のスコアは空のプラスミドで処置した動物のスコアより有意に低かった（不対ｔ検定による分析）。空のプラスミドで処置した動物のスコアが増大している一方で、心筋収縮性へのＦＧＦ−１の存在の効果を示している。

最終屠殺ステップとして含まれる他の技術分析についてはここでは詳述していないので、２８日目のこれらの動物に対するエコー記録は入手できなかったことに留意されたい。

図１９に示した結果は、心筋に複数回ＮＶ１ＦＧＦを注射した処置動物がＥＣＧ及び心臓エコー検査の両方で負荷時に虚血パターンの回帰に至る一方で、空のプラスミド注射ではそうはならないことをはっきりと示した。これらの結果は、ＮＶ１ＦＧＦ効果が高コレステロール血症環境において心臓を負荷状態に適合させるのに役立つこともはっきりと示した。

実施例２１：ＮＶ１ＦＧＦで処置した心筋における細動脈の誘導の実証
２１．１／動物
この研究には成体オス小型ブタ（３０ｋｇ）を用いた。全部で３４匹の動物（ｎ＝８各処置群及び対照群において期待される最後、全部で４群）を用いた。動物を標準条件下で小屋に入れ、普通の食餌を与えた。全ての手順及び実験計画はデューク大学（Duke University）の動物管理委員会に承認されたものである。動物達は、米国医学研究学会（the National Society for Medical Research）がまとめた「Principles of Laboratory Animal Care」及び米国実験動物資源協会（the Institute of Laboratory Animal Resources）が作成し国立衛生研究所が出版した「実験動物の管理と使用に関する指針（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）」（NIH publication No. 85-23, revised 1985）に従って人道的な世話を受けた。

動物に麻酔及び経口気管内挿管を行った。手順を通じて連続的な心電図及び脈拍−酸素測定モニタリングを用い、安定した心臓リズム及び酸化を確実にした。無菌状態で、第四肋間腔から左前外側の開胸を実施した。心膜を縦方向に単離し、左心耳を引っ込めて左回旋（ＬＣｘ）動脈の暴露を可能にした。血管の周囲に水圧オクルダー及び２ｍｍの超音波フロープローブ（Transonic Systems, Inc., Ithaca, NY）を自由に載置できるように近位のＬＣｘを解剖した。ＬＣｘを通る下流フローを記録するために、フロープローブをオクルダーから遠位に載置した。その後、別々の穿刺による切開によりオクルダー及びフロープローブを体外に出した。２０フレンチ胸腔チューブを配置し、層の傷を閉じた。手順の終わりに胸腔チューブを除去した。術後３日目にオクルダーを膨らませ、移植されたフロープローブを用いて評価される基線の約１０％までＬＣｘ中の安静時血流を減少させた。生理学的評価の前に同程度の血管閉塞を確実にするために週に３回実施された血流記録と共に動物を低フロー状態に２週間保持した。

２１．２／ポジトロン放出断層撮影、ドブタミン負荷心臓エコー検査及び有色ミクロスフェア
低フロー状態で３２±１１日後、心臓の血流、代謝性及び機能性状態を特徴付け、ＬＣｘ分布における虚血性の生存可能な心筋の存在を記録するために、動物のポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）及びドブタミン負荷心臓エコー検査（ＤＳＥ）を行った。これらの同じ領域において正常なまたは増加したグルコースの利用（共に非虚血性中隔と比較して）を伴うＬＣｘにより供給される左心室の横壁及び後下壁においてフロー不足に気づいたら、冬眠心筋を示すものとしてＰＥＴスキャンを翻訳した。ＤＳＥを用いて、休息中に低収縮性が重篤である心筋領域における低用量ドブタミンによる収縮期性壁肥大の改善として左心室の横壁及び後下壁における生存能力を画定した。収縮期性壁運動が負荷により悪化したら、生存可能なセグメントは虚血性であると考えた（二相反応）。

ＰＥＴ及びＤＳＥにより虚血性心筋の存在を確認した後、開胸アプローチを用いて、ＮＶ１ＦＧＦなどのＦＧＦ発現プラスミドを直接心筋内注射することにより投薬を行った（ＬＣｘ閉塞後５２±１６日）。左心室自由壁に分布した１０部位（１００μｇ／１００μｌ／プラスミドベクター注射部位）にベクターを投与した。対照群に対し、１００μｌの生理食塩水を１０回注射した。処置に盲検的な操作者及び研究者が処置を実施した。全ての有効性パラメータを盲検法で割り当て、研究の最後にコードをオープンにした。

２１．３／実験計画

処置から１０９±１３日後、組織学分析及び灌流アッセイのために心臓を切除した。図２０に示すようにサンプル試料には標準化された手順を用いた。より正確には、心臓を３つの短軸スライスに切断した（先端、中間、基底セグメント）。これらの各セグメントを、６つ（中間及び基底セグメント）または４つの定方位セクター（先端セグメント）にさらに分け、１つの心臓当たり全部で１６のセクターを与えた。各セクターをその後３つの経壁サンプルに分けた。１つのサンプルをミクロスフェア灌流分析のために保存し、別のサンプルを液体窒素で冷却したイソペンタン中で急速冷凍（snap frozen）させ、３つ目のサンプルを３．７％ホルマリン中に固定した。右心室から得られたサンプルを対照として回収した。

２１．４／組織学的分析
スライド試料には標準化された手順を用いた。ホルマリン固定された各サンプルをパラフィンワックスに包埋し、各ブロックから３つの５μｍの連続切片を作成した。一方の切片を組織病理学的検査による壊死後線維症の評価のためにヘマトキシリン−エロシン−サフラン（ＨＥＳ）で染色し、連続切片を抗α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）抗体により染色して動脈及び細動脈を同定した。α−ＳＭＡは実際に、成熟血管における内皮細胞内で関連する周細胞及び平滑筋細胞の両方において発現された（Benjamin et al., Development, 125,1591-1598. 1998）。この抗体により染色できる大静脈もあるが、それは形態学的基準上で容易に同定されることに留意されたい。

２１．４．１／α−ＳＭＡ染色
全てのブタからの全てのセクターをα−ＳＭＡ免疫組織化学により処理した。ダコ社のエンビジョン（EnVision）（登録商標）＋／ＨＲＰ（西洋わさびペルオキシターゼ）検出システム（Dako, Sabattini et al. , J. Clin Pathol, 51: 506-511, 1998）を用いて手順を行った。抗α−ＳＭＡモノクローナル抗体（Dako, clone1A4, １００倍希釈）により切片をインキュベートした。第２のステップは、ＨＲＰ標識ポリマーに共役したヤギ抗ウサギ抗体によるインキュベーションにある。色素生産性ジアミノベンジジン基質を用いて免疫複合体を局在化させた。切片をヘマトキシリンにより対比染色し、脱水して、永久封入剤により封入した。この方法により、免疫反応性細胞は褐色に、核は青色に見えた。

２１．４．２／形態計測分析
治療計画に盲検的な１人の観察者が測定を行った。各セクターに対し、瘢痕領域（壊死後線維症）を決定するために先ずＨＥＳ染色切片を分析した。以下のスケールを用いて低倍率（２５倍）でサンプル中の線維症量をスコア化した。
+：最小（線維症にされるサンプル表面の５％以下）
++：軽度（サンプル表面の５〜１５％以下）
+++：顕著（サンプル表面の１５〜２５％以下）
++++：高度（サンプル表面の２５％以上）
連続α−ＳＭＡ染色切片で血管密度の評価を行った。ｉ）瘢痕の中心（３視野）、ｉｉ）瘢痕の境界（３視野）、ｉｉｉ）瘢痕から遠位にある即ち生存可能な心筋（３視野）に位置する９つの高倍率の顕微鏡視野（各々０．３７ｍｍ^２）においてα−ＳＭＡ染色血管の数を計数した。各視野に対して、３つの血管カテゴリーが記録された。小さな単層血管と、直径１００μｍ以下の多層血管と、直径１００μｍ以上の細動脈及び動脈である（図２を参照）。α−ＳＭＡ染色をした大静脈をその形態学的機能に基づいて分析から除外した。α−ＳＭＡ微細線維を含む筋線維芽細胞の多数を形態計測分析から除外したことに留意されたい。

その後、注射されることになっている５つのセクター（ＢＡ、ＢＡＬ、ＭＡ、ＭＡＬ及びＡＡセクター）からデータをプールすることにより、各ゾーン（瘢痕、境界ゾーン、生存可能な心筋）に対して血管密度（即ちｍｍ^２当たりの各血管カテゴリーの数）を計算した。追加の対照として供するために、非注射ゾーン（ＢＩＬ、ＢＩ、ＢＩＳ、ＢＡＳ、ＭＩＬ、ＭＩ、ＭＩＳ、ＭＡＳ、Ａｌ、ＡＩ、ＡＳセクター）における血管密度も計算した。

２１．４．３／導入遺伝子発現
ＮＶ１ＦＧＦで処置したブタから得られたＢＡ、ＢＡＬ、ＭＡ、ＭＡＬ、ＡＡセクターをＦＧＦ−１免疫組織化学のために処理した。古典的なストレプトアビジン−ビオチンアッセイを用いてＦＧＦ−１発現を評価した。一次ポリクロナール抗ＦＧＦ−１ウサギ抗体（R&D Systems; ＃AB-32-NA, ３０倍希釈）によるインキュベーションの後、ビオチン化ロバ抗ウサギ免疫グロブリン（Amersham, ２００倍希釈）によるインキュベーションを行った。ストレプトアビジンに結合したペルオキシダーゼを加えた後、色素生産性ジアミノベンジジン基質を用いて免疫複合体を局在化させた。切片をヘマトキシリンにより対比染色し、脱水して、永久封入剤により封入した。この方法により、免疫反応性線維は褐色に、核は青色に見えた。高レベルのpCOR-CMV.ratFGF-1プラスミド遺伝子移入を示したラット筋肉からの陽性切片を用いることによって、アッセイを通じてＦＧＦ−１ＩＨＣの動作を制御した。

２１．４．４／統計分析
脈管構造における定量的な変化は、生理食塩水群とプラスミド処置群の間で異なるゾーン（瘢痕、境界、生存可能な心筋）において明らかにされた。血管の各カテゴリーに対して算術平均及び標準偏差（Ｓｄ）を計算した。一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ、SigmaStat（登録商標）、Jandel Scientific）を用いて群間データを比較した。有意な差が見られたときには、ダネットの方法を用いて対照群に対する複数回の比較を行った。全ての差は、ｐ≦０．０５のレベルで有意であると考えられた。

２１．５／血管密度の評価
処置動物における注射ゾーンと対照動物におけるＮＶ１ＦＧＦ及びＮａＣｌ注射ゾーンの間で平均値の比較を行った（図２１）。

生存可能な心筋における血管の各クラス（小、中、大）に対して別々に分析を行った。処置群が何であれ、直径１００μｍ以下の多数の動脈構造が線維性瘢痕に見られた。形態学的基準のみに基づけば、これらの血管は未変性の心筋血管と区別がつかなかった。これらの大部分は小さく、単層の平滑筋細胞を示していた。

生理食塩水を注射した領域に比べて、心臓へのＮＶ１ＦＧＦの投与は、注射ゾーン内に位置する心筋の生存可能な部分において、小さな単層（unilayered）血管（ｐ＝０．０１７）密度の２２％及び２０％の増加を誘導した。この効果は、より大きな血管には示されなかった。

これらの結果は、各々のｓｐＦＧＦ−１導入遺伝子をコードするｐＣＯＲプラスミドの直接心筋内注射が、虚血性のブタの心臓において、単層動脈即ち平滑筋細胞の単層を有する細動脈の密度の著しい増加を誘導することをはっきり示した。これらの結果はまた、ＮＶ１ＦＧＦの直接心筋内注射後の長く持続するＦＧＦ−１発現を実証した。実際、心筋線維には、注射部位の周囲に常に位置し、投薬から１０４乃至１３２日後に検出可能量のＦＧＦ−１を発現したものもあった。この長く持続する発現は、動脈形成のため及び誘導された新たな血管を維持するために必要な前駆体細胞の補充及び分裂の利益になるであろう。回収時点では、これらの血管は動脈形成の初期 段階におけるものであると信じられている。

実験の計画の概略である。 （Ａ）乃至（Ｃ）からなり、ＨＥＳ染色後のハムスターの筋肉（大腿薄筋及び内転筋群）の代表的な断面（倍率１００倍）を表す。（Ａ）は非虚血性（contralateral）筋肉の断面、（Ｂ）及び（Ｃ）は虚血性筋肉の断面である。（Ｂ）中の破線は軽度ネクローシスの存在を示す。（Ｃ）中の矢印は中心核形成を指し示す。 （Ａ）乃至（Ｄ）からなり、ＬＣ（Ａ）、ＨＣ／２１（Ｂ）、ＨＣ／２８（Ｃ）のハムスターからの非虚血性（左）及び虚血性（右）後肢の両方において記録された代表的な血管造影図を示す。（Ｄ）は、後肢虚血後に側副形成の定量化により得られた対応する血管造影スコアを示す。 （Ａ）乃至（Ｆ）からなり、虚血の誘導後２１日目（Ａ及びＢ）または２８日目（Ｃ及びＤ）に回収された非虚血性（Ａ及びＣ）または虚血性（Ｂ及びＤ）の筋肉（内転筋群及び大腿薄筋）からの平滑筋α−アクチン（ＳＭＡ）免疫組織化学により標識された成熟血管の代表的な断面（倍率１００倍）を示す。（Ｅ）及び（Ｆ）は、筋肉面積及び５０μｍ以下のＳＭＡ陽性細動脈の定量化を示すグラフを示す。空の棒：非虚血性後肢、陰影を付けた棒：虚血性後肢、ＮＳ：有意ではない、**ｐ＜０．０１対任意の群 （Ａ）乃至（Ｃ）からなり、（Ａ）及び（Ｂ）は、生理食塩水（Ａ）またはＮＶ１ＦＧＦ（Ｂ）で処置したハムスターからの非虚血性及び虚血性後肢の両方の代表的な血管造影図を示す。（Ｃ）は、後肢虚血後に見られる血管造影スコアによる側副形成の定量化を示す。 （Ａ）乃至（Ｄ）からなり、（Ａ）及び（Ｂ）は、生理食塩水（Ａ）またはＮＶ１ＦＧＦ（Ｂ）で処置したハムスターの虚血性筋肉（内転筋群及び大腿薄筋）からの平滑筋α−アクチン（ＳＭＡ）免疫化学により標識された成熟血管を示す代表的な断面（倍率１００倍）を示す。（Ｃ）及び（Ｄ）は、筋肉面積及び５０μｍ以下のＳＭＡ陽性細動脈の定量化を示すグラフを示す。空の棒：非虚血性後肢、陰影を付けた棒：虚血性後肢、ＮＳ：有意ではない、*：ｐ＜０．０１、**ｐ＜０．０１生理食塩水対ＮＶ１ＦＧＦ 非虚血性（反対側）の注射されていない肢（Ａ）及び生理食塩水（Ｂ）またはＮＶ１ＦＧＦ（Ｃ）を注射した虚血性肢から得た大腿の後部分からの筋肉（大腿薄筋及び内転筋群）における抗ＦＧＦ−１ポリクロナール抗体による免疫化学染色の代表的な写真（倍率１００倍）である。矢印は、免疫複合体の褐色染色により同定される免疫反応性線維を示している。 （Ａ）乃至（Ｅ）からなり、（Ａ）乃至（Ｃ）は、マウスＶＥＧＦに対する抗体により染色された頭部脛骨筋からの組織学的切片である。（Ａ）は、筋線維ポジティビティのモザイク様の、ＮａＣｌを注射した筋肉切片。（Ｂ）は、類似の側面を有するpCOR-CMV.Emptyを注射した筋肉切片。（Ｃ）は、ｍＶＥＧＦ−ＡペプチドによるｍＶＥＧＦ−Ａに対する抗体の吸着後のＮａＣｌを注射した筋肉切片。（Ｄ）及び（Ｅ）は、ｍＶＥＧＦ−Ａ（Ｄ）またはＦＧＦ−１（Ｅ）に対する抗体により染色されたpCOR-CMV.rat-spFGF-1を注射した頭部脛骨筋の組織学的に連続した切片である。 （Ａ）及び（Ｂ）からなり、（Ａ）は、高コレステロール血症のウサギの心臓における１３の注射位置を示すテンプレートを示す。（Ｂ）は、高コレステロール血症のワタナベウサギからの左回旋冠動脈のＨＥＳ染色切片の倍率１００倍顕微鏡写真である。Ａは外膜、Ｍは中膜、矢印の頭は内膜、矢印はアテローム斑に対応する。 ヒトにおける負荷試験中のＳＴセグメント変化の命名法に基づくヒトにおける休息中のＥＣＧを示す（Braunwald et al. Heart Disease, 5^th ed. p159より）。図１０の左にはヒトにおける休息中のＥＣＧ、右には上から下へと、このセグメントの勾配に依存した、即ち上り勾配、水平、及び下り勾配の、ＳＴセグメントの連続的に重大になっている変化を示す。１番下に示す上昇が最も重大である。 （Ａ）及び（Ｂ）からなり、（Ａ）はドブタミン負荷試験中のウサギにおけるＥＣＧを示す。（Ｂ）はＩ誘導の拡大図を示す。大きな垂直ピークによるＱＲＳ合成の直後にＳＴの低下、水平がはっきり分かる。 最高ドブタミン用量でのＥＣＧの格付けを示す。 （Ａ）及び（Ｂ）からなり、（Ａ）は休息中のウサギにおける典型的な十二誘導ＥＣＧを示す。（Ｂ）は同じウサギにおける最大負荷時の強い虚血を示す。 ２Ｄ心臓エコー検査の命名法の概略である。 ＮＶ１ＦＧＦの注射から３日後の健康なウサギの心臓における心筋顕微鏡的病変及び関連するＦＧＦ−１発現を示す。ＨＥＳ染色は、活性慢性炎症反応（Ａ）及び関連するＦＧＦ−１発現（矢印の頭、Ｂ）を有する心筋の変性及びネクローシスを示している。背景（*）は、内因性ＩｇＧとの二次抗体共役（抗ウサギ）に関連する。倍率１００倍。 空のプラスミド（灰色の柱）またはＮＶ１ＦＧＦプラスミド（陰影を付けた柱）で処置したウサギに対する負荷試験中の最大ＥＣＧスコアの進展を示す。 １６の正常なセグメント（灰色）及び１４の異常なセグメント（黒色）の定量化を示す。正常／異常の認定は、視覚的評価であった。 ＥＣＧ最大スコア対エコー最大スコアのプロットを示す。回帰曲線を黒色で示す。２つの主要なゾーン（異常なＥＣＧ及び異常なエコー、正常なＥＣＧ及び正常なエコー）を灰色で影付けしている。 処置後の経時的な心エコーのスコアの進展を示す。ＮＶ１ＦＧＦで処置した動物には陰影を付けて示し、空のプラスミドで処置した動物は灰色で示している。*は群間の有意な差（ｐ＜０．０５）を示す。 ３つの短軸スライス、例えば、先端、中間及び基底セグメントに基づき心臓の種々のセクターを組織学的に分析するための心臓切片サンプルを準備するために用いられる標準化手順を示す。 瘢痕から遠位の生存可能な心筋における瘢痕における血管密度の定量分析を示す。

Claims (20)

1. 高コレステロール血症患者または糖尿病患者において高コレステロール血症または糖尿病に関連する心筋または骨格の血管由来の疾患または欠損を治療する方法であって、線維芽細胞成長因子をコードするプラスミドを前記患者に有効量投与し、心筋または骨格筋内でＶＥＧＦ−Ａ因子発現が誘導されないようにする過程を含むことを特徴とする方法。
2. 高コレステロール血症患者または糖尿病患者において高コレステロール血症または糖尿病に関連する血管内皮機能障害を治療する方法であって、線維芽細胞成長因子をコードするプラスミドを前記患者の骨格筋または心筋に心筋または骨格の血管由来の欠損を逆戻りさせるのに十分な量投与し、前記筋肉内でＶＥＧＦ−Ａ因子発現が誘導されないようにする過程を含むことを特徴とする方法。
3. 高コレステロール血症患者または糖尿病患者において高コレステロール血症または糖尿病に関連する心筋または骨格の血管由来の疾患を治療する方法であって、線維芽細胞成長因子をコードするプラスミドを前記患者に前記患者の心筋または骨格筋における血管形成の促進に十分な量投与し、前記筋肉内でＶＥＧＦ−Ａ因子発現が誘導されないようにする過程を含むことを特徴とする方法。
4. 高コレステロール血症患者または糖尿病患者において高コレステロール血症または糖尿病に関連する心筋または骨格の血管由来の疾患を治療する方法であって、線維芽細胞成長因子をコードするプラスミドを前記患者の心筋または骨格筋における成熟側副血行路及び細動脈の形成の促進に十分な量投与する過程を含むことを特徴とする方法。
5. 虚血性心臓または骨格筋組織における成熟側副血管の形成をそのような処置を必要とする哺乳類被験対象において促進する方法であって、線維芽細胞成長因子をコードする有効量のプラスミドを前記被験対象の前記組織に注射して前記被験対象においてＶＥＧＦ−Ａ因子発現が誘導されないようにする過程を含むことを特徴とする方法。
6. 側副血行路及び細動脈の両方の形成をそのような処置を必要とする哺乳類被験対象の虚血性心筋または骨格筋組織において促進する方法であって、線維芽細胞成長因子をコードする有効量のプラスミドを前記被験対象の前記組織に注射する過程を含むことを特徴とする方法。
7. 前記被験対象の心筋または骨格筋において前記ＶＥＧＦ−Ａ因子発現が誘導されないことを特徴とする請求項６に記載の方法。
8. 高コレステロール血症または糖尿病患者において高コレステロール血症または糖尿病で誘発される血管形成における欠損を、ＶＥＧＦ−Ａ因子の発現を誘導することなく逆戻りさせる方法であって、線維芽細胞成長因子を発現する有効量のプラスミドを前記患者の心筋または骨格組織に注射して側副血行路及び細動脈の両方の形成を促進する過程を含むことを特徴とする方法。
9. 高コレステロール血症患者または糖尿病患者の心筋または骨格筋においてコンダクタンスが大きい成熟血管（１５０μｍ以上の側副血管）及び抵抗が小さい動脈（５０μｍ以下の細動脈）の形成を促進する方法であって、線維芽細胞成長因子を発現する有効量のプラスミドを前記筋肉に注射する過程を含むことを特徴とする方法。
10. 前記ＶＥＧＦ−Ａ因子誘導が誘導されないことを特徴とする請求項９に記載の方法。
11. 前記プラスミドの注射が、大腿及びふくらはぎの後部分及び／または前部分に位置する骨格筋において円形に実施されることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１つに記載の方法。
12. 前記プラスミドが、複数回注射により前記筋肉の虚血性部位の周囲に投与されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. 前記プラスミドが、冠内注射、心筋内注射、経胸腔的注射、心臓周囲注射、または心外膜注射により前記患者の心筋に投与されることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１つに記載の方法。
14. 前記心筋への投与が、複数回注射により前記心筋の虚血性部位の周囲に、または単回注射により行われることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
15. 前記注射が、カテーテルを用いて行われることを特徴とする請求項１３または１４のいずれかに記載の方法。
16. 前記カテーテルが、針カテーテルであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
17. 前記線維芽細胞成長因子が、ＦＧＦ−１または酸性線維芽細胞成長因子であることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか１つに記載の方法。
18. 前記プラスミドが、制御配列と、ＦＧＦ−１遺伝子の上流のシグナルペプチドをコードする配列と、ＦＧＦ−１遺伝子の下流の終結シグナル及びポリアデニル化シグナルとを更に含むことを特徴とする請求項１乃至１８のいずれか１つに記載の方法。
19. 前記制御配列がＣＭＶプロモータであり、シグナルペプチド配列がインターフェロンのペプチド配列から派生し、ポリアデニル化シグナルがＳＶ４０のペプチド配列から派生し、ＦＧＦ−１をコードするプラスミドが指定ＮＶ１ＦＧＦであることを特徴とする請求項１乃至１９のいずれか１つに記載の方法。
20. 前記プラスミドが、低分子量のヘパリンと共に投与されることを特徴とする請求項１乃至１７のいずれか１つに記載の方法。
    
    
    

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