ES2036922B9

ES2036922B9 - Procedimiento de obtención de mezclas de polisacáridos de bajos pesos moleculares

Info

Publication number: ES2036922B9
Application number: ES009101505A
Authority: ES
Inventors: Roger Debrie
Original assignee: Rhone Poulenc Rorer SA; Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1990-06-26
Filing date: 1991-06-25
Publication date: 2012-07-30
Anticipated expiration: 2011-06-25
Also published as: HUT57796A; GR1000763B; GB9113589D0; HU210925B; GB2245898B; DK176524B1; IL98604A; AU643531B2; KR920000792A; DK124391A; BE1006827A3; FR2663639B1; ES2036922B1; GR910100270A; FI913101A0; ATA128191A; LU87957A1; AU7928891A; NO912485D0; KR0185586B1

Abstract

Procedimiento de obtención de mezclas de polisacáridos de bajos pesos moleculares, sulfatados y que presentan la estructura general de los polisacáridos que constituye la heparina. Comprende salificar, en medio acuoso, una heparina por medio de una sal de amonio cuaternario de cadena larga; esterificar la sal así obtenida para formar un éster que tiene un grado de esterificación comprendido entre el 9,5 y el 14%; y despolimerizar dicho éster.#Los polisacáridos resultantes tienen aplicación en la profilaxis y tratamiento de accidentes trombóticos.

Description

La presente invenci´on se reﬁere al campo de los polisac´aridos de bajos pesos moleculares. M´as particularmente la invenci´on se reﬁere al campo de las heparinas de bajo peso molecular.

Las heparinas son substancias biol´ogicas de extracci´on de la familia de los glicosaminoglicanos, utilizadas por sus propiedades anticoagulante y antitromb´otica. Principalmente, se utilizan en el tratamiento de las trombosis venosas post-operatorias. Sin embargo, en su forma nativa, las heparinas presentan un cierto n´umero de inconvenientes que limitan las condiciones de su utilizaci´on. En particular, la actividad anticoagulante puede ocasionar hemorragias, y la sensibilidad a ciertos factores s´ericos, tal pf4, impone la utilizaci´on de dosis relativamente importantes. Por lo tanto es necesario privilegiar la actividad antritromb´otica, atribu´ıda principalmente a la actividad antiprotrombinasa, a expensas de la actividad anticoagulante, atribu´ıda al efecto antitrombina.

Con este ﬁn, se ha propuesto fragmentar las heparinas en mol´eculas de pesos moleculares medios menores. En particular, se conoce en el arte anterior la patente europea EP 40144. Esta patente describe mezclas de polisac´aridos sulfatados que tienen una estructura general de los polisac´aridos constituyentes de la heparina, que poseen el doble enlace etil´enico en una de las extremidades de su cadena, y cuyo peso molecular medio en peso est´a comprendido entre 2000 y 10000 Daltons. Estas mezclas se obtienen por despolimerizaci´on y saponiﬁcaci´on de un ester de heparina. Se ha indicado que presentan una actividad antitromb´otica elevada y una actividad anticoagulante global inferior a la de la heparina.

Sin embargo, uno de los mayores problemas que se encuentran con las heparinas reside en el hecho de que se trata de productos muy heterog´eneos. Por lo tanto es dif´ıcil apreciar la contribuci´on de cada una de las especies en la actividad de la heparina, conocer el comportamiento de estas especies durante la despolimerizaci´on y ﬁnalmente controlar la estructura de estas especies y sus proporciones respectivas en los productos ﬁnales. Por estas razones, los inconvenientes anteriormente mencionados no han podido ser resueltos de manera totalmente satisfactoria. Principalmente, los procedimientos descritos en el arte anterior, y en particular en la patente EP 40144 no permiten obtener mezclas que poseen las propiedades farmacol´ogicas requeridas para una mejor aplicaci´on, a saber una semi-vida plasm´atica suﬁcientemente elevada, una velocidad de absorci´on bastante grande, una fuerte biodisponibilidad y tambi´en una peque˜na “anchura”.

Por lo tanto se han descrito otros procedimientos que permiten fragmentar la heparina, con vistas a disminuir sus efectos indeseables (Johnson et coll. Thrombos. Haemostas. Stuttg., 1.976, 35, 586; Lane et coll. Thrombosis Research 16, 651, Lasker et coll. US. 3.766.167). Cada uno de estos procedimientos parece indicar que la actividad buscada est´a privilegiada cuando el grado de fragmentaci´on de la heparina aumenta (v´ease tambi´en la solicitud de patente europea EP 301618 relativa a pentasac´aridos que poseen una actividad antitromb´otica).

En el mismo sentido, estudios recientes sobre el mecanismo de acci´on de las heparinas en la formaci´on de la trombina han puesto de maniﬁesto una inﬂuencia del peso molecular medio de las heparinas sobre su actividad in vitro (B´eguin et coll., Thromb. Haemost., 61, 30, 1989). Los autores indican que las heparinas de bajo peso molecular poseen sobre todo una actividad antiprotombinasa y las heparinas de peso molecular m´as elevado, una actividad antitrombina.

Paralelamente, se ha propuesto igualmente fraccionar las heparinas con el ﬁn de extraer mezclas de peso molecular medio homog´eneo. Se conoce en particular la solicitud de patente europea EP 337327, que describe un procedimiento para la preparaci´on de fragmentos de oligosac´aridos derivados de la heparina, que permite obtener mezclas que tienen una dispersi´on molecular reducida. Seg´un este procedimiento, se eliminan previamente las fracciones de peso molecular inferior a 3.000 Daltons, lo que conduce a eliminar el producto ﬁnal de los fragmentos que contienen menos de 10a16sac´aridos, y las especies de peso molecular superior a 7000 Daltons. Seg´un los inventores, este tratamiento, que tiene por objeto homogeneizar la mezcla ﬁnal, permitir´ıa disminuir la actividad anticoagulante, al mismo tiempo que se conservar´ıa la actividad antritromb´otica buscada.

Sin embargo, a despecho de estos trabajos, las mezclas obtenidas presentan siempre un efecto hemorr´agico residual, o una actividad antitromb´otica demasiado debil. Adem´as, nada en el arte anterior permite determinar cuales son las propiedades que deben ser reunidas para obtener una actividad biol´ogica ´optima. Por otra parte la conclusi´on de los autores del art´ıculo precitado es elocuente: “no sabemos cual es la combinaci´on ´

optima de las propiedades de la heparina”. La caracterizaci´on precisa de diferentes preparaciones y la correlaci´on de estas propiedades con observaciones cl´ınicas podr´ıa eventualmente aportar una respuesta”.

Se ha encontrado ahora que es posible obtener heparinas que presentan propiedades ventajosas, principalmente para su utilizaci´on en la proﬁlaxis y el tratamiento de los accidentes tromb´oticos. De manera inesperada, la solicitante ha encontrado en efecto que la presencia en el producto ﬁnal, a la vez de especies de alto y de bajo peso molecular, conﬁere una mejor actividad al producto. Contrariamente a las indicaciones del arte anterior, parece pues preferible conservar en la mezcla ﬁnal especies de peso molecular elevado, as´ı como una cierta heterogeneidad.

El estudio farmacocin´etico de las mezclas de la invenci´on muestra que ´estas reunen propiedades particularmente ventajosas.

En particular, las mezclas de la invenci´on presentan un tiempo de semi-vida superior a los otros productos conocidos, e igualmente a la heparina madura. Por otra parte, con relaci´on a esta ´nalar que la semi-vida de

ultima, es importante se˜las mezclas de la invenci´on es independiente de la dosis inyectada. Esto es interesante puesto que el efecto producido es mucho m´as predecible que en el caso de la heparina.

Adem´as, en el caso del hombre, las mezclas de la invenci´on presentan una excelente biodisponibilidad, medida por la actividad anti Xa. As´ı, desde el 30% aproximadamente para la heparina, es de aproximadamente el 90 % para las mezclas de la invenci´on. Esto es muy ventajoso puesto que permite reducir las dosis inyectadas y mejorar la potencialidad terap´eutica.

Por otra parte, otra propiedades importante de las mezclas de la invenci´on reside en su gran velocidad de absorci´on. Esta caracter´ıstica permite obtener una actividad biol´ogica casi instant´anea, y ofrece por lo tanto una mayor seguridad en el tratamiento, cubriendo r´apidamente al paciente.

Otra caracter´ıstica de las mezclas seg´un la invenci´on es su peque˜na “anchura” comparativamente a los otros productos y alaheparinamadura. Merced a su estructura qu´ımica, a su peso molecular o a su grado de sulfato, estas mezclas presentan en efecto una resistencia particular a la degradaci´on (desulfataci´on, hidr´olisis) y a la eliminaci´on, que aumenta todav´ıa m´as sus capacidades terap´euticas.

Igualmente, las preparaciones de la invenci´on poseen un tiempo de residencia acrecentado con relaci´on alaheparinade partida. Esta propiedad se traduce en una prolongaci´on del tiempo durante el cual el producto permanece activo in vivo, y porlo tanto poruna mejoreﬁcacia terap´eutica.

Adem´as, estas preparaciones presentan tambi´en una sensibilidad reducida a los factores s´edicos, que aumenta su duraci´on de acci´on in vivo y permite utilizarlas a dosis peque˜nas.

Estas propiedades particularmente ventajosas se obtienen controlando, en el curso del procedimiento de preparaci´on, ciertas caracter´ısticas estructurales de las especies en presencia, as´ıcomo su distribuci´on molecular. Las mezclas as´ıobtenidas est´an en una relaci´on favorable entre las fracciones de altos y de bajos pesos moleculares, que les conﬁeren las propiedades antitromb´oticas requeridas, con un efecto hemorr´agico peque˜no.

Estas caracter´ısticas de la invenci´on se expresan a la vez por el porcentaje de cadenas pesadas y de cadenas ligeras y por la relaci´on entre el peso molecular medio en peso de las mezclas y su peso molecular medio en n´umero, que reﬂeja la dispersi´on molecular.

Un objeto de la presente invenci´on reside por lo tanto en mezclas de polisac´aridos sulfatados que presentan la estructura general de los polisac´aridos constituyentes de la heparina, caracterizadas porque tienen un peso molecular medio en peso inferior al de la heparina, que contiene entre 9 y 20% de cadena de peso molecular inferior a 2000 Daltons y entre 5 y 20% de cadenas de peso molecular superior a 8000 Daltons, y en las que la relaci´on en peso molecular medio en n´umero est´a comprendida entre 1,3 y 1,6.

Por otra parte, la solicitante ha comprobado que es posible mejorar todav´ıa m´as las propiedades de las mezclas disminuyendo su grado de impurezas. Principalmente, la mayor parte de las heparinas contienen contaminantes tales como los ´acidos nucl´eicos, los polip´eptidos, o diversos polisac´aridos. Entre ´estos, se pueden citar en particular las condroitinas sulfatos, el heparano o el dermatano sulfato. Cada uno de estos contaminantes, ya sea por su peso molecular muy elevado, por los substituyentes que porta o por su grado de sulfataci´on, es capaz de interferir durante la preparaci´on del producto (en la despolimerizaci´on por ejemplo) para modiﬁcar la distribuci´on molecular ﬁnal, o directamente en la actividad, modiﬁcando las proporciones de cadenas activas principalmente. La solicitante ha puesto a punto ahora un procedimiento que permite eliminar estas impurezas y ha comprobado una mejora de las cualidades de las mezclas que han sufrido este tratamiento. El efecto de este pretratamiento puede medirse utilizando como impureza testigo el dermatano sulfato.

Un objeto m´as particular de la presente invenci´on reside en mezclas de polisac´aridos sulfatados que presentan las caracter´ısticas enunciadas anteriormente, caracterizadas porque contienen menos de 2% de dermatano sulfato.

En un modo preferido, las mezclas de polisac´aridos sulfatados seg´un la invenci´on poseen un peso molecular medio en peso comprendido entre aproximadamente 3500 Daltons y aproximadamente 5500 Daltons.

Siempre preferentemente, las cadenas de polisac´aridos sulfatados que constituyen las mezclas seg´un la invenci´on tienen un ´acido 2-O-sulfo 4 enopiranosur´onico en una de sus extremidades.

Otro aspecto de la invenci´on se reﬁere a un procedimiento para la preparaci´on de mezclas de polisac´aridos sulfatados que tienen un peso molecular medio en peso inferior al de la heparina, que contienen entre 9 y 20% de cadena de peso molecular inferior a 2000 Daltons y entre 5 y 20% de cadenas de peso molecular superior a 8000 Daltons y en las que la relaci´on en peso molecular medio en peso/peso molecular medio en n´umero est´a comprendida entre 1,3 y 1,6. El procedimiento de la invenci´on se caracteriza porque se efect´uan las etapas siguientes:

-: en una primera etapa se saliﬁca el medio acuoso una heparina por medio de una sal de amonio cuaternario de cadena larga,

-: en una segunda etapa, se esteriﬁca la sal as´ı obtenida para formar un ´ester que tiene un grado de esteriﬁcaci´on comprendido entre 9,5 y 14%,y

-: en una tercera etapa, se despolimeriza el ´ester obtenido que tiene un grado de esteriﬁcaci´on comprendido entre 9,5 y 14%.

La solicitante ha comprobado en efecto que se puede controlar el nivel de despolimerizaci´on, y por lo tanto las caracter´ısticas moleculares del producto ﬁnal jugando sobre el grado de esteriﬁcaci´on de la sal de heparina de partida.

Seg´un la invenci´on, por lo tanto es posible obtener directamente y de manera reproducible mezclas de polisac´aridos sulfatados que tienen las caracter´ısticas indicadas anteriormente.

La heparina de partida utilizada en el procedimiento seg´un la invenci´on es preferentemente una heparina de cerdo y principalmente mucosa de cerdo. Se ha encontrado en efecto que seg´un el origen de la heparina de partida, la actividad de las mezclas obtenidas pod´ıa variar de manera substancial. Principalmente, cuando la heparina de partida es de origen bovino, se obtienen mezclas que tienen una actividad anticoagulante superior ala obtenidaapartir de laheparinade mucosa intestinal de cerdo.

Adem´as, en una variante particularmente ventajosa, el procedimiento de la invenci´on comprende tambi´en una etapa previa de precipitaci´on de la heparina de partida por medio de un alcohol. Este pretratamiento permite disminuir el grado de impurezas de tipo condroitina sulfato o heparano sulfato.

Un alcohol que da buenos resultados es, por ejemplo, el metanol.

El grado de pureza de la heparina s´odica puede determinarse a continuaci´on por cromatograf´ıa l´ıquida de exclusi´on est´erica.

Esta etapa preliminar permite principalmente preparar una heparina que tiene un grado de dermatano sulfato inferior al 2%.

M´as precisamente, el saliﬁcado de la heparina se realiza de la manera siguiente.

La sal de la heparina puede obtenerse por acci´on de un exceso de sal correspondiente sobre una heparina s´odica, en medio acuoso, a una temperatura pr´oximaa20◦C. De una manera ventajosa, la sal de amonio cuaternario utilizada es preferentemente una sal de bencetonio tal como principalmente el cloruro de bencetonio, que puede hacerse reaccionar sobre la heparina s´odica.

En lo que se reﬁere a la segunda etapa, se preﬁere realizar la esteriﬁcaci´on en las condiciones siguientes.

El ´ester parcial de la heparina en forma de sal cuyo grado de esteriﬁcaci´on est´a comprendido entre 9,5 y 14%, puede obtenerse por esteriﬁcaci´on de la sal de amonio cuaternario de cadena larga de la heparina en un disolvente org´anico clorado en presencia de un derivado del cloro. Adem´as, la eﬁcacia de la reacci´on queda aumentada controlando las proporciones de dos diferentes reactivos y la temperatura y el tiempo de reacci´on.

De una manera ventajosa, el ´ester parcial de la heparina es un ´ester arom´atico.

Tambi´en preferentemente, el derivado del cloro es el cloruro de bencilo, y el disolvente clorado se elige entre el cloroformo o el cloruro de metileno.

Para obtener un grado de esteriﬁcaci´on comprendido entre 9,5 y 14%, puede ser particularmente ventajoso utilizar, por una parte en peso de sal de heparina, aproximadamente 1 parte en volumen de derivado del cloro en el seno de 3 a 5 partes en volumen de disolvente org´anico clorado, y efectuar la reacci´on durante un periodo de 15 a 48 horas, a una temperatura comprendida entre 25y 45◦C y preferentemente entre 30 y 40◦C.

En un modo preferido de realizaci´on,el´ester parcial de la heparina est´a en forma de una sal de sodio.

Los ´esteres as´ı formados pueden recuperarse por precipitaci´on por medio de un alcohol tal como principalmente el metanol, en presencia de acetato de sodio. Preferentemente, se utilizan entre 1 y 1,2 vol´umenes de alcohol por volumen de medio reaccional. El grado de esteriﬁcaci´on del ´ester puede controlarse a continuaci´on por cromatograf´ıa en fase l´ıquida de alta resoluci´on. En particular, en el caso del ´ester benc´ılico, se puede medir la cantidad de alcohol benc´ılico obtenido por saponiﬁcaci´on del ´ester a 0◦C.

La ´

ultima etapa del procedimiento de la invenci´on se conduce ventajosamente de la manera siguiente.

Preferentemente, la despolimerizaci´on se realiza tratando el ´ester con una base fuerte en soluci´on acuosa. M´as precisamente, se puede utilizar el carbonato s´odico.

Ventajosamente, la relaci´on en peso base/´ester est´a comprendida entre 0,05 y 0,2, y preferentemente entre 0,08 y 0,15.

La temperatura del medio se ajusta a un valor comprendido entre 50 y 70◦C, y preferentemente entre 55 y 65◦C, y la relaci´on se efect´ua durante un periodo que va de 30 minutos a 3 horas, y preferentemente, de 1 a 2 horas.

Adem´as, es preferible operar en un medio en el que la relaci´on en peso agua/´ester est´ecomprendida entre 15 y 30.

Una manera particularmente ventajosa de realizar la despolimerizaci´on consiste en mezclar:

-: una parte en peso de un ´ester arom´atico de la heparina tal como se obtiene de la segunda etapa en forma de sal, cuyo grado de esteriﬁcaci´on est´a comprendido entre 9,5 y 14%,

-: entre 0,08 y 0,15 partes en peso de carbonato s´odico, y

-: entre 20 y 30 partes en peso de agua,

a continuaci´on mantener durante 1a2horas la temperatura entre 55 y 65◦C.

El producto puede recuperarse a continuaci´on por neutralizaci´on del medio reaccional por medio de un ´acido mineral dilu´ıdo, y preferentemente de ´´on en presencia de

acido clorhıdrico, y precipitaci´un alcohol, tal como metanol.

De esta manera, es posible obtener directamente y de forma reproducible una mezcla de polisac´aridos sulfatados que contiene:

-: entre 9 y 20 % de cadenas de peso molecular inferior a 2000 Daltons,

-: entre 5 y 20 % de cadena de peso molecular superior a 8000 Daltons,

y que tiene un peso molecular medio comprendido entre 3500 y 5500 Daltons y una relaci´on peso molecular medio en peso/peso molecular medio en n´umero comprendida entre 1,3 y 1,6.

Las mezclas de la presente invenci´on pueden utilizarse de manera ventajosa como agentes antitromb´oticos.

En particular, son aplicables para la prevenci´on de trombosis venosas en las situaciones de riesgo.

Esto es v´alido igualmente en las situaciones de riesgo prolongado. En particular, estas mezclas permiten por primera vez disminuir, a dosis ﬁjas, los riesgos de accidentes tromb´oticos en la cirug´ıa ortop´edica. Este riesgo es del 70% en ausencia de cualquier tratamiento y aproximadamente el 25% en presencia de heparina, se sit´ua en los alrededores del 10% con las mezclas de la invenci´on, incluso menos.

Igualmente, inyectada en las tubuladuras de un ri˜n´on artiﬁcial, estas mezclas pueden reducir las trombosis susceptibles de desarrollarse en las mismas. Esta ´on puede extenderse

ultima aplicaci´ala prevenci´on de las trombosis en el material quir´urgico.

Otra utilizaci´on terap´eutica ventajosa de las mezclas de la invenci´on reside en la prevenci´on de los accidentes tromb´oticos arteriales, y principalmente en el caso de infarto de miocardio.

Por otra parte, una aplicaci´on particularmente interesante de las mezclas seg´un la presente invenci´on reside en la posibilidad de utilizar, para la prevenci´on de las trombosis venosas en el caso de las enfermedades quir´urgicas, en r´egimen post-operatorio. Esta aplicaci´on es completamente ventajosa puesto que permite evitar los riesgos de hemorragia durante la operaci´on, y los problemas de tipo y de dosis de anestesia, que se ocasionan por una prevenci´on en r´egimen pre-operatorio.

El conjunto de estas propiedades demuestra las potencialidades terap´euticas de las preparaciones de la invenci´on.

Los ejemplos siguientes, que no tienen ning´un caracter limitativo, ilustran la presente invenci´on. Tecnicas de dosiﬁcado.

Los pesos moleculares y las distribuciones de peso molecular de los productos se determinan por cromatograf´ıa l´ıquida a elevada presi´on con dos columnas en serie, por ejemplo las comercializadas bajo la designaci´on TSK G 3000SW (30x0,75 cm) y Lichrosorb 100 Diol 10u (25x0,75 cm), o TSK G 2000SW, acopladas con un detector refractom´etrico. El disolvente utilizado es un tamp´on fosfato 0,3M pH 7, y el caudal es de 0,7 ml/minuto. El sistema est´a calibrado con patrones preparados por fraccionamiento de la enoxaparina (PHARMUKA) por cromatograf´ıa de exclusi´on sobre agarosa-poliacrilamida (IBF), seg´un la t´ecnica descrita por BarrowCliﬀe et Coll., Thromb. res., 12, 27-36 (1977-78) o D.A. Lane et Coll., Thromb. res, 12, 2257-271 (197778). Los resultados est´an calculados por medio del dispositivo l´ogico GPC6 (Perkin Elmer).

En los ejemplos que siguen, la actividad anticoagulante global de las mezclas se mide por turbidimetr´ıa utilizando el primer calibre internacional de heparina de bajo peso molecular. La actividad anti factor Xa (antitromb´otico) se mide por el m´etodo amidol´ıtico sobre un substrato crom´ogeno descrito por Teien et Coll., Thromb.res., 10, 399410 (1977), utilizando el primer calibre internacional de heparina de bajo peso molecular. Ejemplo 1.

Este ejemplo ilustra la etapa previa de tratamiento de la heparina s´odica, que permite reducir el grado de impurezas de tipo condroitina sulfato y heparano sulfato.

Se agregan a 10 g de heparina comercial (sal de sodio) en soluci´on en 100 ml de agua, que contienen 3 g de cloruro de sodio, 80 ml de metanol. Tras precipitaci´on, el producto obtenido se ﬁltra, se enjuaga y a continuaci´on se seca. El grado de pureza de la heparina s´odica as´ı obtenida se mide por cromatograf´ıa l´ıquida de exclusi´on est´erica, con dos columnas en serie, las comercializadas bajo la designaci´on TSK 2000SW (60 x 0,75 cm) y TSK 3000SW (60 x 0,75 cm), acopladas con un detector UV regulado a 206 nm. La fase m´ovil utilizada es una soluci´on acuosa de sulfato de sodio 0,5M que circula a un caudal de 1m1.mn−1 . El ensayo se compara con una heparina testigo quecontiene2% dedermatano sulfato.

En las condiciones indicadas anteriormente, la heparina obtenida contiene menos de 2% de dermatano sulfato. Ejemplo 2.

Este ejemplo ilustra la preparaci´on de la sal de amonio cuaternario de la heparina.

Se agrega a una soluci´on de 10 g de heparina de sodio seg´un el ejemplo 1, que contiene menos del 2% de dermatano sulfato, en 100 ml de agua, una soluci´on de 25 g de cloruro de bencetonio en 125 ml de agua. El producto obtenido a temperatura ambiente, se ﬁltra a continuaci´on, se lava con agua y a continuaci´on se seca.

De manera id´entica, se prepara la sal de bencetonio de una heparina que no ha sido sometida al tratamiento del ejemplo 1. Ejemplo 3.

Este ejemplo ilustra la preparaci´on y las propiedades de las mezclas seg´un la invenci´on.

1. Esteriﬁcaci´on.

Se agregan a una soluci´on de 15 g de heparina de bencetonio, previamente tratado seg´un el procedimiento del ejemplo 1, en 75 cm de cloruro de metileno, 15 ml de cloruro de bencilo. La soluci´on se calienta a una temperatura de 35◦C, que se mantiene durante 25 horas. Se agregan entonces 90 ml de una soluci´on al 10% de acetato de sodio en metanol, se ﬁltra y se lava con metanol y se seca. Se obtienen as´ı6,5 g de ´eter benc´ılico de heparina en forma de sal de sodio, cuyo grado de esteriﬁcaci´on, determinado como se ha indicado anteriormente, es del 13,3%.

2. Despolimerizaci´on.

Se disuelven 10 g del ´ester benc´ılico de heparina obtenido anteriormente en forma de sal de sodio en 250 ml de agua. A esta soluci´on calentada a 62◦C se agregan 0,9 g de carbonato s´odico. La temperatura se mantiene durante 1 hora y 30 minutos a 62◦C. La mezcla reaccional se refrigera a continuaci´on hacia 20◦C y se neutraliza por adici´on de ´acido clorh´ıdrico dilu´ıdo. Se ajusta entonces la concentraci´on del medio reaccional al 10% en cloruro de sodio. El producto se precipita ﬁnalmente en 750 ml de metanol, se ﬁltra y se seca. Se obtiene as´ı una heparina que presenta las caracter´ısticas estructurales siguientes:

-: peso molecular medio en peso: 3900 Daltons

-: distribuci´on molecular:

. 20% de cadenas de peso molecular inferior a 2000 Daltons

. 5,5 % de cadenas de peso molecular superior a 8000 Daltons

-: dispersi´on: d = 1,39

-: actividad anti Xa: 106 UI

-: actividad anticoagulante: 22,6 UI.

Ejemplo 4.

Se preparan de una manera similar, partiendo de ´esteres que tienen un grado de esteriﬁcaci´on comprendido entre 9,5 y 14%, soluciones de heparina despolimerizada que tienen las caracter´ısticas estructurales siguientes:

a) -peso molecular medio en peso: 4425 Daltons -distribuci´on molecular: . 12,4 % de cadenas de peso molecular inferior a 2000 Daltons . 9,3 % de cadenas de peso molecular superior a 8000 Daltons -dispersi´on: d = 1,37 -actividad anti Xa: 102 UI -actividad anticoagulante: 33 UI.

b) -Peso molecular medio en peso: 4579 Daltons -distribuci´on molecular: . 11,2 % de cadenas de peso molecular inferior a 2000 Daltons . 10,4 % de cadenas de peso molecular superior a 8000 Daltons -dispersi´on: d = 1,37 -actividad anti Xa: 104 UI -actividad anticoagulante: 37 UI.

c) -Peso molecular medio en peso: 4446 Daltons -distribuci´on molecular: . 12,6 % de cadenas de peso molecular inferior a 2000 Daltons . 9,5 % de cadenas de peso molecular superior a 8000 Daltons -dispersi´on: d = 1,38 -actividad anti Xa: 100 UI -actividad anticoagulante: 32 UI.

Ejemplo 5.

Este ejemplo ilustra la preparaci´on de una mezcla que no entra en las caracter´ısticas de la invenci´on.

1. Esteriﬁcaci´on.

Se agregan a una soluci´on de 15 g de heparinato de bencetonio previamente tratada seg´un el procedimiento del ejemplo 1, en 60 ml de cloruro de metileno, 12 ml de cloruro de bencilo. La soluci´on se calienta a una temperatura de 28◦C, que se mantiene durante 30 horas. Se agregan entonces 90 ml de una soluci´on al 10% de acetato de sodio en metanol, se ﬁltra, se lava con metanol y se seca. Se obtienen as´ı 6,3gde ´ester benc´ılico de heparina en forma de sal de sodio. El grado de esteriﬁcaci´on de este producto determinado por medida, en cromatograf´ıa l´ıquida de alta resoluci´on, de la cantidad de alcohol benc´ılico liberada por saponiﬁcaci´on del ´ester a 0◦C, es del 9,2%.

2. Despolimerizaci´on.

Se disuelven 10 g del ´ester benc´ılico de heparina obtenido anteriormente en forma de sal de sodio, en 200 ml de agua. A esta soluci´on, calentada a58◦C, se agregan 1,1 g de carbonato s´odico. La temperatura se mantiene durante 1 hora a 58◦C. La mezcla reaccional se refrigera a continuaci´on hacia 20◦C y se neutraliza por adici´on de acido ´clorh´ıdrico dilu´ıdo Se ajusta entonces la concentraci´on del medio reaccional al 10% en cloruro de sodio. El producto se precipita ﬁnalmente en 600 ml de metanol, se ﬁltra y se seca. Se obtienen as´ı una heparina que presenta las caracter´ısticas estructurales siguientes:

-: peso molecular medio: 5425 Daltons

-: distribuci´on molecular:

. 9,6 % de cadenas de peso molecular inferior a 2000 Daltons

. 19,5 % de cadenas de peso molecular superior a 8000 Daltons.

-: dispersi´on: d = 1,44

-: actividad anti Xa: 122 UI

-: actividad anticoagulante: 68,6 UI.

Estos resultados, que hacen aparecer una actividad anticoagulante elevada, demuestran la superioridad de las mezclas preparadas seg´un la invenci´on, y que poseen las caracter´ısticas enunciadas. Ejemplo 6.

Este ejemplo ilustra la ganancia de estabilidad in vivo de las mezclas de la invenci´on, expresada por su semi-vida plasm´atica.

Un primer estudio farmacocin´eticose harealizado sobre voluntarios que tienen entre 21 y 30 a˜nos. Se han practicado inyecciones subcut´aneas de dosis que varian entre 20 y 80 mg/ml. En el transcurso del tiempo, se han tomado muestras (4,5 ml) y se han almacenado aproximadamente a4◦C. Las muestras se han centrifugado entonces durante 15 minutos a 23000 g y el plasma pobre en plaquetas se ha separado, y se ha coagulado antes del an´alisis. La semi-vida de las mezclas se determina a continuaci´on por medida de la actividad anti ka. Los resultados obtenidos son los siguientes:

-: Con las mezclas obtenidas en los ejemplos 3 y4:

. dosis de 40 mg: en 75 % de los casos la semi vida es superior a 4 horas, y es incluso superior a 4 horas y media en aproximadamente.el 45 % de los casos.

. dosis de 6O mg: en e1 75 % de los casos, la semi vida es superior a 3,7 horas.

-: en las condiciones de dosiﬁcado id´enticas, la heparina intacta, inyectada por v´ıa intravenosa posee una semi-vida de 0,6 horas aproximadamente.

-: Cuando el producto se prepara seg´un el procedimiento descrito en la patente europea 40144, la semi-vida es superior a 4 horas y media en el 17 % de los casos.

Un segundo estudio realizado en condiciones similares sobre 20 pacientes ha dado los resultados siguientes para las mezclas seg´un la presente invenci´on:

. dosis de 40 mg: en el 80% de los casos, la semi vida es superior a 4 horas, y es superior a 4 horas y media en el 40% aproximadamente de los casos.

. dosis de 20 mg: en el 6O% de los casos, la semi vida es superior a 3,9 horas.

Descrita suﬁcientemente la naturaleza del invento, asi como la manera de realizarlo en la pr´actica, debe hacerse constar que las disposiciones anteriormente indicadas son susceptibles de modiﬁcaciones de detalle en cuanto no alteren su principio fundamental.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una mezcla de polisacáridos sulfatados que poseen la estructura general de los polisacáridos de los que se compone la heparina, teniendo dichos polisacáridos un peso molecular medio ponderal menor que el de la heparina y conteniendo entre 9 y 20% de cadenas de peso molecular inferior a 2.000 daltons y entre 5 y 20% de cadenas de peso molecular superior a 8.000 daltons, y en la que la relación de peso molecular medio ponderal/peso molecular medio en número está comprendida entre 1,3 y 1,6.
2.

La mezcla de acuerdo con la reivindicación 1, que contiene impurezas equivalentes a menos de 2% de dermatán sulfato.
3.

La mezcla de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que posee un peso molecular medio ponderal comprendido entre aproximadamente 3.500 daltons y aproximadamente 5.500 daltons.
4.

La mezcla de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que las cadenas de polisacáridos sulfatados tienen un ácido 2-Osulfo-4-enopiranosurónico en uno de sus extremos.
5.

Un proceso para preparar una mezcla de polisacáridos sulfatados de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende las siguientes etapas:

-

en una primera etapa, convertir heparina en un medio acuoso en una sal de amonio cuaternaria de cadena larga de la misma,

-

en una segunda etapa, esterificar la sal obtenida para formar un éster que tiene un grado de esterificación comprendido entre 9,5% y 14%, y

-

en una tercera etapa, despolimerizar el éster obtenido que tiene un grado de esterificación comprendido entre 9,5 y 14%.
6.

El proceso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la segunda etapa se realiza en un disolvente orgánico clorado con un cloruro correspondiente al alcohol de esterificación.
7.

El proceso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el cloruro es cloruro de benzoílo y el disolvente es cloroformo o cloruro de metileno.
8.

El proceso de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en el que la esterificación se realiza mezclando

1 parte en peso de la sal de heparina con aproximadamente 1 parte en volumen de un cloruro en 3 a 5 partes en volumen del disolvente orgánico clorado a una temperatura comprendida entre 25 y 45°C.
9.

El proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la temperatura está comprendida entre 30 y 40°C.
10.

El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que la despolimerización se realiza por tratamiento del éster con una base fuerte en solución acuosa.
11.

El proceso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la relación de pesos de base/éster está comprendida entre 0,05 y 0,2.
12.

El proceso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la relación de pesos está comprendida entre 0,08 y 0,15.
13.

El proceso de acuerdo con la reivindicación 10, 11 ó 12, en el que la relación de pesos de agua/éster está comprendida entre 15 y 30.
14.

El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que la temperatura del medio se ajusta a un valor comprendido entre 50 y 70°C, y la reacción se realiza durante un periodo que varía de 30 minutos a 3 horas.
15.

El proceso de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la temperatura del medio está comprendida entre 55°C y 65°C y la reacción se realiza durante 1 a 2 horas.
16.

El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 15, en el que el material de partida de heparina se ha purificado por precipitación en una solución acuosa con un alcohol.
17.

El proceso de acuerdo con la reivindicación 5, sustancialmente como se describe en los ejemplos anteriores 1 a 4.
18.

Una mezcla de polisacáridos sulfatados obtenidos por el proceso de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 17.
19.

El uso de una mezcla de polisacáridos sulfatados de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 18 para la preparación de una composición terapéutica.

OFICINA ESPA˜

NOLA DE PATENTES Y MARCAS

ESPA˜NA

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

k

51 Int. Cl.5: C08B 37/10 // A61K 31/725

k

11 ES 2 036922 21kN.◦ solicitud: 9101505 22kFecha de presentaci´on de la solicitud: 25.06.91 32kFecha de prioridad: 26.06.90

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categor´ıa

Documentos citados Reivindicaciones afectadas

X

FR-A-2548672 (PHARMUKA LABORATOIRES) *P´ag. 4, l´ın. 12-33; p´ag. 5, l´ın. 1-20 * 1,5,6,8

X

ES-A-8206555 (PHARMINDUSTRIE) *P´ag. 11-15, ejemplo 3 * 1,5,6,8

A

ES-A-2006891 (BIOIBERICA, S.A.) 1

A

THROMBOSIS AND HAEMOSTASIS, vol. 61, n◦ 1, p´ag. 30-34, 1989 Stuttgart, Alemania; S. BEGUIN et al.: ”The mode of action of low molecular weight heparin preparation (PK10169) and two of its major components on thrombin generation in plasma”.

Categor´ıa de los documentos citados X: Y: A: de particular relevancia de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categor´ıa reﬂeja el estado de la t´ecnica O: P: E: referido a divulgaci´on no escrita publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaci´on de la solicitud documento anterior, pero publicado despu´es de la fecha de presentaci´on de la solicitud

El presente informe ha sido realizado × para todas las reivindicaciones para las reivindicaciones n◦:

Fecha de realizaci´on del informe 29.05.92

Examinador I. Seri˜n´aRam´ırez P´agina 1/1