ES2341249T3 - Derivados polisacaridos con alta actividad antitrombotica en plasma. - Google Patents

Abstract

Proceso para la preparación de un sulfato de glucosaminoglucano a partir de un N-acetilheparosano, que comprende las siguientes etapas: a)N-desacetilación y N-sulfatación de un polisacárido N-acetilheparosano aislado de una cepa bacteriana natural o recombinante, en el que dicho polisacárido N-acetilheparosano se aísla de K5 de E. coli; b)epimerización enzimática mediante la enzima glucuronil C5-epimerasa; c)O-sulfatación parcial combinada con O-desulfatación parcial; d)6O-sulfatación parcial; e)N-resulfatación que comprende además una etapa de despolimerización controlada efectuada como alternativa después de la etapa b), c) o d) y en el que dicho proceso se caracteriza por el hecho de que la O-sulfatación parcial en la etapa c) se efectúa durante menos de 10 horas y con una relación molar entre el agente sulfatante y el N-acetilheparosano menor o igual a 5, y por el hecho de que la 6O-sulfatación parcial (etapa d) se efectúa durante un tiempo menor o igual a 2 horas y usando una relación molar entre agente sulfatante y grupos hidroxilo de N-acetilheparosano menor o igual a 2.

Description

Derivados polisacáridos con alta actividad antitrombótica en plasma.

Campo de la invención

El campo de la invención es la preparación de polisacáridos sulfatados con actividad antitrombótica anticoagulante a partir de polisacáridos de origen microbiano.

Técnica anterior

La heparina natural es un polímero que tiene estructura de glucosaminoglucano, con pesos moleculares variables entre 3.000 y 30.000 Da, constituido por la secuencia de unidades disacáridas repetidas constituidas por ácido urónico (L-idurónico o D-glucurónico) y un aminoazúcar (glucosamina) unidas entre sí por enlaces \beta-1,4. El ácido urónico puede estar sulfatado en posición 2 y la glucosamina puede estar N-acetilada o N-sulfatada y 6O-sulfatada. Además, la glucosamina puede contener también un grupo sulfato en posición 3.

Estos sustitutos son esenciales para la creación de la región de unión con alta afinidad a antitrombina (ATIII) y para explicar la actividad anticoagulante y antitrombótica del polímero.

La heparina es el agente anticoagulante y antitrombótico básico para uso terapéutico e, incluso actualmente, se obtiene mediante la extracción de órganos animales. En un intento por sustituir esta fuente de suministro y, por lo tanto satisfacer los requisitos materiales crecientes, eliminando a la vez cualquier contaminación accidental con agentes infecciosos, principalmente virus o priones, se han desarrollado en los últimos años diversos procesos para la preparación de moléculas con estructura similar a heparina así como características parecidas, partiendo de polisacáridos de N-acetilheparosano que tienen origen bacteriano y, por lo tanto, están disponibles sin límite de cantidad.

El polisacárido de N-acetilheparosano aislado de unos pocos K5 de Escherichia coli naturales o recombinantes o disoluciones madre bacterianas de Pasteurella multocida, tiene la misma estructura básica que el precursor de heparina natural constituido por una secuencia repetida de ácido D-glucurónico y N-acetilglucosamina unidas entre sí por enlaces \alpha-1,4. El enlace entre las unidades disacáridos es, por el contrario, \beta-1,4.

El ácido urónico puede estar sulfatado en dos posiciones diferentes y la glucosamina puede estar N-acetilada o N-sulfatada y 6O-sulfatada. Además, la glucosamina puede contener también un grupo sulfato en posición 3.

El polisacárido N-acetilheparosano aislado de K5 de E. coli (Vann W.F., Schmidt M.A., Jann B., Jann K. (1981) en Eur. J. Biochem. 116, 359-364) se ha modificado químicamente como se describe por Lormeau y col. en la patente de EE.UU. nº 5.550.116 y por Casu y col. (Carb. Res. 263-1994-271-284) o química y enzimáticamente en un intento de obtener productos dotados de una actividad biológica comparable a la de heparina extractiva.

Además, los productos semisintéticos deben experimentar un proceso de despolimerización para reducir el peso molecular que hace al producto más adecuado en las diferentes aplicaciones terapéuticas, en particular mejora la biodisponibilidad y reduce el riesgo de hemorragia asociado a su uso y otros efectos secundarios.

Las modificaciones químicas y enzimáticas del polisacárido bacteriano se describen, por ejemplo, en la patente italiana nº IT1230785, en la que el polisacárido K5 se N-desacetila y N-sulfata y experimenta entonces epimerización enzimática en C5 del ácido glucurónico. Estas transferencias están seguidas por otras transferencias de sulfatación enzimática tanto en ácido urónico como el aminoazúcar.

La solicitud de patente WO92/17509 describe un procedimiento para la preparación de productos similares a heparina a partir del polisacárido K5 mediante pasos de N-desacetilación, N-sulfatación y epimerización enzimática en C5, seguidos de O-sulfatación química y opcionalmente N-sulfatación.

La solicitud de patente WO 96/14425 y la patente de EE.UU. nº 5.958.899 describen un procedimiento para la preparación de derivados del polisacárido K5 que tienen un alto contenido de ácido idurónico obtenidos mediante N-desacetilación y N-sulfatación, epimerización enzimática a ácido idurónico de más del 50% del ácido glucurónico usando tampones modificados para obtener una viscosidad crítica, seguido de sulfatación de al menos algunos de los grupos hidroxilo libres del ácido urónico y de los grupos glucosamina.

La solicitud de patente WO97/433117 y la patente US 6.162.797 describen la preparación de derivados de K5 con altas actividades anticoagulantes y antitrombóticas obtenidos mediante N-desacetilación y N-sulfatación, epimerización enzimática del ácido glucurónico y O-supersulfatación y N-resulfatación.

La solicitud de patente WO 98/42754 y la patente US nº 6.197.943 y Naggi A. y col. Carbohydrate Research 336 (2001); 283-290, describen una metodología para la preparación de glucosaminoglucanos sulfatados, incluyendo derivados del polisacárido K5 que tienen alta actividad antitrombótica in vitro, mediante desulfatación solvolítica de precursores supersulfatados y 6O-resulfatación opcional.

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Las solicitudes de patente WO 0172848 y WO 02/50125 describen un procedimiento de preparación de derivado de glucosaminoglucanos a partir del polisacárido K5 que tienen alta actividad anticoagulante y antitrombótica. El proceso comprende los siguientes pasos: a) N-desacetilación, b) N-sulfatación, c) epimerización enzimática del ácido glucurónico a ácido idurónico, d) supersulfatación, e) desulfatación química parcial, f) 6O-resulfatación selectiva opcional. El proceso se caracteriza por el uso de una enzima glucuronil C5-epimerasa en forma truncada, en disolución o inmovilizada.

Además, la solicitud de patente de EE.UU. nº 09/732.026 y Li y col. J. Biol. Chem., vol 276, 213 (2001) 20069-20077 han conducido al descubrimiento de un nuevo gen de ratón para la expresión de la enzima C5-epimerasa que contiene la secuencia adicional en el extremo N-terminal, que permite la producción de formas completas de la enzima que tienen mayor actividad/estabilidad con respecto a la anterior.

Sumario

La presente invención se refiere a un proceso para la preparación de glucosaminoglucanos sulfatados derivados a partir de N-acetilheparosano que comprende las siguientes etapas:

a)

N-desacetilación y N-sulfatación de un polisacárido N-acetilheparosano aislado a partir de una fuente bacteriana natural o recombinante,

b)

epimerización enzimática mediante la enzima glucuronil C5-epimerasa,

c)

O-sulfatación parcial combinada con una O-desulfatación parcial,

d)

6O-sulfatación parcial,

e)

N-resulfatación

que comprende además una etapa de despolimerización controlada intermedia llevada a cabo como alternativa después de la etapa b), c) o d) y en el que dicho proceso se caracteriza por el hecho de que la O-sulfatación parcial en la etapa c) se lleva a cabo usando una relación molar entre agente sulfatante/hidroxilo de N-acetilheparosano menor o igual a 5, más preferiblemente menor de 2,5 o aún más preferiblemente menor de 1,5, y por que la 6O-sulfatación parcial de la etapa d) se lleva a cabo usando una relación molar entre el agente sulfatante/hidroxilo de N-acetilheparosano menor o igual a 2.

Según una realización preferida, la despolimerización intermedia se lleva a cabo después de la etapa de epimerización b).

Tanto la O-sulfatación parcial como la 6O-sulfatación parcial se llevan a cabo con agentes sulfatantes seleccionados entre: trietilamina-SO_{3}, trimetilamina-SO_{3}, piridina-SO_{3} en un disolvente aprótico polar, preferiblemente no donante de grupos formilo, tal como tetrametilensulfona, 2,4-dimetilsulfolano, N,N-dimetilacetamida o N,N-dietilacetamida. Opcionalmente, el proceso comprende una etapa de selección por afinidad en una matriz que porta antitrombina III o sus fragmentos.

La invención hace referencia también a glucosaminoglucanos sulfatados K5OS6OSNS-epi obtenidos según el proceso descrito para uso farmacéutico. Estos productos se caracterizan por un grado de 6O-sulfatación mayor del 40% y comprendido preferiblemente entre 50 y 85%, muy cercano a los valores de la heparina extractiva, y por la presencia, en el extremo reductor, de un residuo de manitol anhidro, preferiblemente sulfatado en las posiciones 1, 3 y 6. Se caracterizan también por un grado de sulfatación del grupo hidroxilo en posición 1 y 6 del manitol anhidro mayor o igual a 20% y, según un aspecto preferido, por la ausencia completa de grupos formilo en el aminoazúcar. Según la invención, los glucosaminoglucanos sulfatados muestran una actividad biológica anti-factor Xa en plasma mayor que la de las heparinas biotecnológicas obtenidas según los procedimientos de la técnica anterior y una relación entre actividad anti-Xa y anti-IIa mayor o igual a 1, distinta de las heparinas extractivas.

Los productos obtenibles según el proceso de la invención:

a)

son capaces de liberar un inhibidor de factor tisular (TFPI) de las células del endotelio vascular al igual que las heparinas extractivas o aún más,

b)

son particularmente resistentes a la degradación por enzimas hidrolíticas tales como heparinasa I,

c)

son capaces de inhibir la liberación de las proteasas trombina y factor Xa,

d)

muestran una baja afinidad por el factor PF4 (factor de plaquetas 4).

Según un aspecto adicional, la invención se refiere a heparinas biotecnológicas (N-acetilheparosano modificado) obtenidas según el proceso de la invención para uso terapéutico y a las composiciones farmacéuticas que comprenden dichos productos como principios activos. Según un aspecto adicional, la invención considera el uso de los productos obtenidos para la preparación de fármacos con actividades antitrombóticas y anticoagulantes similares a heparina, para la preparación de medicamentos profibrinolíticos y antiagregantes y para la preparación de medicamentos para la profilaxis y

\hbox{el tratamiento de trastornos tromboembólicos
causados por la falta congénita  o adquirida de antitrombina
III.}

Un aspecto adicional de la invención hace referencia a la preparación de intermedios O-sulfatados, K5OSNH_{2}-epi y K5OS6OSNH_{2}-epi, que portan el grupo amino del aminoazúcar libre, preferiblemente exento de grupos formilo, en el que dichos intermedios pueden aislarse y usarse para la preparación de derivados de heparosano N-sulfatados y/o N-acetilados.

Descripción de los dibujos

Fig. 1. Espectro de RMN-^{1}H de la región anomérica del polisacárido K5 epimerizado y N-sulfatado como se describe en el ejemplo 1.

Fig. 2. Espectro de RMN-^{1}H del producto obtenido en el ejemplo 1.

Fig. 3. Espectro de RMN-^{1}H del producto obtenido en el ejemplo 2.

Fig. 4. Espectro de RMN-^{13}C del producto obtenido en el ejemplo 3.

Fig. 5. Espectro de RMN-^{13}C del producto obtenido en el ejemplo 4.

Fig. 6. Espectro de RMN-^{13}C del producto obtenido en el ejemplo 5.

Fig. 7. Espectro de RMN-^{13}C del producto obtenido en el ejemplo 6.

Fig. 8. Espectro de RMN-^{13}C del producto obtenido en el ejemplo 7.

Fig. 9. Espectro de RMN-^{13}C del producto obtenido en el ejemplo 8.

Fig. 10. Espectro de RMN-^{13}C del producto obtenido en el ejemplo 9.

Fig. 11. Espectro de RMN-^{13}C del producto obtenido en el ejemplo 10.

Fig. 12. Espectro de RMN-^{13}C del producto obtenido en el ejemplo 11.

Fig. 13. Espectro de RMN-^{13}C del producto obtenido en el ejemplo 12.

Fig. 14. Espectro de RMN-^{13}C del producto obtenido en el ejemplo 13.

Fig. 15. Espectro de RMN-^{13}C del producto obtenido en el ejemplo 14.

Fig. 16. Espectro de RMN-^{13}C del producto obtenido en el ejemplo 15.

Fig. 17. Espectro de RMN-^{13}C del producto obtenido en el ejemplo 16.

Fig. 18. Espectro de RMN-^{1}H del producto obtenido en el ejemplo 18.

Descripción detallada de la invención

Según un aspecto principal, la invención se refiere a un proceso para la preparación de glucosaminoglucanos sulfatados derivados de N-acetilheparosano y denominados con los fines de esta invención "heparinas biotecnológicas", que comprende las siguientes etapas:

a)

N-desacetilación y N-sulfatación de un polisacárido N-acetilheparosano aislado a partir de una fuente bacteriana natural o recombinante,

b)

epimerización enzimática por una enzima glucuronil C5-epimerasa,

c)

O-sulfatación parcial combinada con O-desulfatación parcial,

d)

6O-sulfatación selectiva parcial,

e)

N-resulfatación,

en el que este proceso comprende además una etapa intermedia de despolimerización controlada llevada a cabo como alternativa después de la etapa b) o c) o d), y en el que dicho proceso se caracteriza por el hecho de que las O-sulfataciones son parciales, en el que en la etapa c) se consigue esto usando una relación molar entre el agente sulfatante y los grupos hidroxilo de sustrato (N-acetilheparosano epimerizado) menor o igual a 5, más preferiblemente menor o igual a 2,5 o, aún más preferiblemente, menor o igual a 1,5, y un tiempo de sulfatación menor de 10 horas. Se obtiene una 6O-sulfatación parcial según la etapa d) usando una relación molar entre el agente sulfatante y los grupos hidroxilo del sustrato (N-acetilheparosano epimerizado) menor o igual a 2, o más preferiblemente menor o igual a 1,5, y un tiempo de sulfatación menor de 2 horas o, aún más preferiblemente, menor o igual a 90 minutos, o aún más preferiblemente, menor o igual a 60

\hbox{minutos, a  una
temperatura comprendida entre 4ºC y 30ºC, preferiblemente entre 10ºC
y 25ºC.}

La O-sulfatación parcial según la etapa c) y la 6O-sulfatación parcial según la etapa d) se llevan a cabo con agentes sulfatantes conocidos en un disolvente aprótico polar preferiblemente no donante de grupos formilo, más preferiblemente seleccionado de: N,N-dialquilacetamida (más preferiblemente N,N-dimetilacetamida o N,N-dietilacetamida) y sulfolanos (preferiblemente tetrametilensulfona o 2,4-dimetilsulfolano).

El uso de un disolvente orgánico no donante de grupos formilo combinado con condiciones de sulfatación parcial conduce a productos caracterizados por la falta de grupos formilo o sus derivados en el aminoazúcar y a una distribución de grupos sulfato similar a la de heparinas extractivas.

Según el proceso de la invención, se lleva a cabo una despolimerización controlada como etapa intermedia, lo que significa como alternativa después de cada etapa b), c) o d) y no en la fase final como se describe en la técnica anterior. Se lleva a cabo preferiblemente en el polisacárido heparosano N-sulfatado epimerizado antes o después de la etapa c) de O-sulfatación parcial. Puede llevarse a cabo mediante procedimientos físicos, incluyendo un tratamiento con rayos gamma o mediante procedimientos químicos, incluyendo un tratamiento beta-gamma con ácido nitroso o sus sales, o un tratamiento con sales periódicas o un tratamiento con radicales libres. Según un aspecto preferido, el agente de despolimerización es ácido nitroso y el polisacárido se usa en una cantidad comprendida entre 1 y 100 mg de sal/g de polisacárido. La reacción se efectúa a una temperatura comprendida entre 4 y 10ºC. Más preferiblemente, se lleva a cabo la polimerización controlada durante menos de 30 minutos en presencia de nitrito de sodio y se termina añadiendo un exceso molar de borohidruro de sodio.

La despolimerización intermedia permite obtener un producto de bajo peso molecular, preferiblemente con un peso molecular menor o igual a 15.000 Da, más preferiblemente comprendido entre 3.000 y 9.000 Da, que porta un residuo de anhidromanitol en el extremo reductor que muestra, además de sulfatación de hidroxilo en la posición 6 como en las heparinas extractivas, sulfatación de hidroxilos en las posiciones 1 y 3.

Sin embargo, el proceso es compatible también con una despolimerización adicional llevada a cabo al final del proceso. Se ha observado que, cuando la despolimerización se lleva a cabo en una fase intermedia, los productos finales tienen actividad anticoagulante y antitrombótica y una relación entre anti-Xa y anti-IIa inesperadamente mayor que las encontradas en productos con el mismo peso molecular pero obtenidos después de una despolimerización efectuada después de etapas de sulfatación/desulfatación y 6O-sulfatación, como se demuestra por los datos mostrados en la tabla 1.

Según una realización de proceso preferida, el polisacárido N-acetilheparosano deriva preferiblemente de K5 de E. coli.

El proceso puede comprender adicional y opcionalmente una fase final de enriquecimiento de los productos resultantes de las etapas a)-e) consistente en una cromatografía por afinidad de antitrombina III como se describe en Hook y col. FEBS Lett 1976, 66: 90-93.

La N-desacetilación y N-sulfatación se llevan a cabo según procedimientos de la técnica anterior que comprenden una hidrólisis alcalina efectuada a una temperatura comprendida entre 30 y 80ºC, preferiblemente entre 40 y 60ºC, durante un periodo de tiempo comprendido entre 10 y 30 horas, preferiblemente entre 15 y 20 horas, seguido de tratamiento durante un tiempo de hasta 12 horas a 20-65ºC con un agente sulfatante, preferiblemente piridia-trióxido de azufre en carbonato de potasio.

La epimerización en la etapa b) se lleva a cabo con la enzima glucuronil C5-epimerasa natural o recombinante preferiblemente en forma inmovilizada.

La enzima es preferiblemente la recombinante descrita en el documento WO98/48006 o aún más preferiblemente la descrita en el documento US nº 09/732.026, y se expresa y purifica preferiblemente a partir de células de insecto o de cepas de levadura tales como, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Pichia methanolica, Hansenula polymorpha, Saccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis o Kluyveromyces fragilis.

La inmovilización enzimática se lleva a cabo preferiblemente en resinas CNBr Sepharose 4B (Pharmacia) o resinas polimetacrílicas o poliestirénicas, con grupos epoxídicos o diólicos activados con CNBr, en tampón NaHCO_{3} 100-300 mM o en tampón fosfato 10-50 mM a pH 7,0-8,3, más preferiblemente a pH 7,2-7,8, a una temperatura de 4-25ºC durante 12-72 horas.

Según un aspecto más preferido, la reacción de epimerización ocurre a una temperatura no superior a 35ºC, preferiblemente a una temperatura comprendida entre 15 y 30ºC, más preferiblemente comprendida entre 20 y 25ºC.

Se efectúa la epimerización según procedimientos conocidos tales como los descritos en el documento WO
01/72848, preferiblemente a una temperatura no superior a 35ºC, más preferiblemente entre 15 y 30ºC, o aún más preferiblemente entre 20 y 25ºC.

El tampón de epimerización es preferiblemente una disolución de HEPES (preferiblemente a concentración 25 mM) con un pH comprendido entre 5,5-8,0, más preferiblemente entre pH 6,5-7,0, y comprende además el polisacárido N-desacetilado y N-sulfatado, EDTA 10-30 mM, preferiblemente 15-25 mM, CaCl_{2} (o como alternativa sales de otros cationes divalentes tales como Zn^{2+}, Ba^{2+}, Mg^{2+}, Mn^{2+}) a una concentración comprendida entre 70 y 150 mM, mucho más preferiblemente entre 75-100 mM. Se termostatiza la disolución a una temperatura comprendida entre 15 y 30ºC (preferiblemente 20-25ºC), preferiblemente se recicla a un flujo de 30-240 ml/hora durante un tiempo entre 1 y 24 horas. La columna contiene preferiblemente de 1,2 x 10^{7} a 3 x 10^{11} cpm de equivalentes de la enzima inmovilizada en soporte inerte termostatizado.

Las condiciones operativas anteriores, en particular la temperatura preseleccionada, estabilizan la enzima C5-epimerasa durante miles de horas, permitiendo un notable ahorro de tiempo y de reactivos para la preparación de la columna de epimerización. Se efectúa la O-sulfatación parcial del proceso (etapa c) usando agentes sulfatantes conocidos tales como trietilamina-SO_{3}, trimetilamina-SO_{3}, piridina-SO_{3} en un disolvente aprótico polar, preferiblemente no donante de grupos formilo. Se efectúa usando una relación molar entre el agente sulfatante y los grupos hidroxilo del sustrato menor o igual a 5, o preferiblemente menor o igual a 2,5, o más preferiblemente menor de 1,5, durante un periodo de tiempo menor o igual a 10 horas, más preferiblemente menor o igual a 8 horas, preferiblemente comprendido entre 1 y 6 horas y a una temperatura de 20 a 70ºC, preferiblemente de 30 a 60ºC.

La O-sulfatación parcial es seguida por una desulfatación parcial efectuada mediante tratamiento con un agente de desulfatación tal como DMSO en metanol, durante un periodo de tiempo comprendido entre 10 y 240 minutos a una temperatura comprendida entre 45 y 90ºC.

Cada etapa del proceso puede comprender también precipitaciones y/o desalificaciones de polisacárido intermedias según procedimientos conocidos.

La 6O-sulfatación parcial (etapa d) se obtiene añadiendo un agente sulfatante a una relación molar con los grupos hidroxilo del sustrato menor o igual a 2, o preferiblemente menor de 1,5, durante un periodo de tiempo menor o igual a 2 horas, o preferiblemente menor o igual a 90 minutos, aún más preferiblemente entre 4ºC y 30ºC, preferiblemente 10ºC y 25ºC, en disolución con un disolvente aprótico polar, preferiblemente no donante de grupos formilo. Según una realización alternativa del proceso, la 6O-sulfatación parcial (etapa d) se efectúa después de la N-resulfatación y las etapas d) y e) se efectúan en orden inverso.

La N-resulfatación (etapa e) se efectúa preferiblemente en tampón carbonato añadiendo un agente sulfatante conocido tal como, por ejemplo, trietilamina-SO_{3}, trimetilamina-SO_{3}, piridina-SO_{3}.

En conclusión, el proceso de la invención muestra los siguientes elementos innovadores: O-sulfatación parcial (O-sulfatación y 6O-sulfatación), despolimerización efectuada en una etapa intermedia y no final y, además, una O-sulfatación parcial y 6O-sulfatación efectuadas en un disolvente orgánico aprótico polar preferiblemente no donante de grupos formilo.

Los derivados de N-acetilheparosano obtenidos mediante el proceso de la invención presentan diferencias estructurales y biológicas características con respecto a las heparinas biotecnológicas obtenidas según procesos bien conocidos en la técnica anterior. Desde un punto de vista químico, los polisacáridos de la invención se definen como una mezcla de cadenas polisacáridas representada por la siguiente fórmula general (I)

1

en la que n está en el intervalo de 3 a 150, R1 puede ser un hidrógeno, un grupo SO_{3}^{-} o un grupo acetilo. R1 no presenta otros grupos funcionales tales como grupos formilo. R2, R3, R4 y R5 pueden ser hidrógeno o un grupo SO_{3}^{-}, estando preferiblemente sustituidos R1, R2, R3, R4 y R5 como sigue:

-

R1 de 85 a 97% con grupos SO_{3}^{-} y/o de 3% a 15% con grupos acetilo y/o de 0 a 12% con H^{+},

-

R2 de 15 a 60% con SO_{3}^{-}

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-

R3 con grupos SO_{3}^{-} hasta al menos un 40%, preferiblemente de 50 a 85%

-

al menos un 20% de las unidades de ácido glucurónico no están sulfatadas en las posiciones R4 y R5.

En particular, los polisacáridos despolimerizados según el proceso de la invención muestran en su extremo reductor un residuo de anhidromanitol con uno o más hidroxilos sulfatados.

Esto ocurre cuando se lleva a cabo la despolimerización en presencia de ácido nitroso o sus derivados tales como nitrito de sodio, seguido de tratamiento con borohidruro de sodio, obteniéndose los compuestos según la siguiente estructura (II)

2

en la que R1, R2, R3 pueden ser hidrógeno o un grupo SO_{3}^{-} y preferiblemente en la que:

-

R1 está en el intervalo de 0 a 100% de SO_{3}^{-}

-

R2 de 0 a 100% de SO_{3}^{-}

-

R3 de 0 a 100% de SO_{3}^{-}

Preferiblemente, R1 y R3 comprenden de 20% a 85% de SO_{3}^{-} y R2 de 15 a 60% de SO_{3}^{-}.

Los productos preferidos son aquellos con un peso molecular menor o igual a 15.000 Da, o preferiblemente comprendido entre 1.500 y 15.000 Da, aún más preferiblemente entre 3.000 y 9.000 Da.

Los productos obtenidos según la invención son diferentes desde un punto de vista estructural en comparación con los productos de la técnica anterior debido a la presencia de múltiples señales en la región del espectro de RMN-^{13}C comprendida entre 79 y 89 ppm, en particular de 80 a 86 ppm, que están en exceso con respecto a las señales características de anhidromanitol (véase la figura 10, que muestra el espectro de RMN-^{13}C a alta resolución de la muestra preparada en el ejemplo 9), y que indican la presencia de anhidromanitol sulfatado variadamente, en particular en los hidroxilos en posiciones 1 y 6, en productos de bajo peso molecular preparados según el proceso de la invención con una despolimerización intermedia.

Más particularmente, los productos obtenidos según el proceso de la invención son diferentes debido a la sulfatación de los hidroxilos en posición 1 del anhidromanitol, como se muestra por el aumento de la señal en la región de 67-68 ppm y por la reducción de la desaparición de la señal en la región de 61-63 ppm en el espectro de RMN-^{13}C.

Se muestra la diferencia comparando el espectro de la figura 11 (correspondiente al polisacárido producido como se describe en el ejemplo 10) y el mostrado en la figura 9 (polisacárido producido como se describe en el ejemplo 8). Estas diferencias son más evidentes mediante la RMN bidimensional según el procedimiento descrito en Guerrini y col. Seminars in Thrombosis and Hermostasis, vol. 27, 5, 473-482, 2001.

Las características principales de estas regiones derivan de la sulfatación parcial o total de los grupos hidroxilo disponibles del anhidromanitol que se forman en el extremo reductor del polisacárido durante la despolimerización cuando ésta se lleva a cabo antes de la etapa de sulfatación, y en particular por la sulfatación de los hidroxilos en posiciones 1 y 6.

Es una característica adicional de los productos de la invención con respecto a los productos y procedimiento de la técnica anterior (tales como, concretamente, las mostradas en los ejemplos experimentales 6 y 7 comparativos de la presente solicitud) la ausencia de señales a 7-9,5 ppm en el espectro de RMN-^{1}H y a 51 y 65 ppm en el espectro de RMN-^{13}C, que indica la ausencia de grupos químicos diferentes de un grupo amino libre o de un grupo acetilo o del grupo sulfato en la glucosamina en todos los productos derivados con bajo y alto peso molecular.

Por el contrario, estas señales están habitualmente presentes en productos derivados de procesos en los que se efectúa la sulfatación de N-acetilheparosano en disolventes orgánicos donantes de grupos formilo tales como N,N-dialquilformamida.

Los glucosaminoglucanos sulfatados obtenidos según esta invención muestran una actividad anticoagulante, medida como anti-factor Xa en presencia de plasma, mayor que la de heparinas biotecnológicas obtenidas según procedimientos de modificación conocidos. Además, muestran una relación entre actividad anti-Xa y anti-IIa mayor o igual a 1, muy similar a la de heparinas extractivas.

En particular, los nuevos productos muestran:

a)

una actividad inhibidora del factor Xa mayor de 50 UI/mg, más preferiblemente mayor de 70 UI/mg en ensayos llevados a cabo en presencia de plasma humano. La actividad anti-factor Xa se mide preferiblemente como se describe en Ten Cate H y col. Clin. Chem. 3, 860-864 (1984) o en la Farmacopea Europea de 1997, 3ª edición. En presencia de plasma, esta actividad biológica es sorprendentemente mayor que la de heparinas biotecnológicas producidas con procesos de la técnica anterior, y es similar a la medida para heparinas extractivas con alto o bajo peso molecular,

b)

una capacidad de activación de TFPI (inhibidor de la ruta de factor tisular, descrito en Bronze GJ Jr y col. Blood 71, 335-343, 1988) mayor o igual a la de heparinas extractivas,

c)

una relación entre las actividades anti-Xa/anti-IIa mayor o igual a 1 a un peso molecular comparable. Más preferiblemente, la relación es mayor de 1,5,

d)

una resistencia a digestión por heparinasa I mayor o igual a la de heparinas extractivas,

e)

la capacidad de inhibir la liberación de las proteasas trombina y factor Xa,

f)

una baja afinidad por el factor PF4 (factor de plaquetas 4).

La capacidad de activación de TFPI de células de endotelio vascular potencia la actividad antitrombótica y antiinflamatoria de estos productos y extiende y mejora las indicaciones terapéuticas a trombosis venosa profunda en procedimientos quirúrgicos, complicaciones isquémicas de angina inestable e infarto de miocardio y eventos isquémicos.

La capacidad de inhibir la producción de proteasa, combinada con la producción aumentada de TFPI, permite la extensión adicional de las indicaciones terapéuticas de estos productos al tratamiento de sepsis y sus complicaciones tales como coagulación intravascular diseminada (CID) y al tratamiento de enfermedades causadas por la falta congénita o adquirida de antitrombina III.

Se lleva a cabo la determinación de la actividad del factor TFPI después del tratamiento con los productos de la invención, por ejemplo, in vitro o en células HUVEC según el proceso descrito en Gori AM. y col. Thromb. Haemostasis: 81: 589-593 (1999).

Los derivados de N-acetilheparosano obtenidos según la invención (heparinas biotecnológicas) son particularmente resistentes a la degradación con enzimas hidrolíticas tales como heparinasa I. Esta característica, junto con la posibilidad de obtener productos de bajo peso molecular que aumenta por sí misma la biodisponibilidad y reduce el riesgo de hemorragia asociado a su uso y los efectos colaterales con respecto a las heparinas de alto peso molecular, junto con una alta actividad anti-factor Xa y un bajo grado de sulfatación, permite su uso no sólo por la vía de administración parenteral, sino también por la oral.

Como se menciona anteriormente, el producto obtenido con el proceso de la invención muestra la capacidad de inhibir la generación de las proteasas trombina y factor Xa.

La inhibición de la generación de proteasas se lleva a cabo preferiblemente en plasma desprovisto de fibrinógeno. La inhibición de la generación de trombina (factor II) y factor Xa se controla preferiblemente usando un procedimiento amidolítico tanto para el sistema de coagulación intrínseco como extrínseco.

Según ambos procedimientos, en los dos sistemas usados, los productos derivados de la invención muestran una fuerte actividad de inhibición tanto de trombina como de factor Xa, y esta característica mejora el perfil antitrombótico de estos productos. Los productos obtenidos según los procesos de la invención están además dotados de una baja afinidad por el factor PF4 (factor de plaquetas 4) que puede medirse en plasma como la actividad anti-Xa residual después de la adición de una cantidad fija de factor PF4 en la disolución que contiene las heparinas biotecnológicas.

La actividad anti-Xa residual calculada como el porcentaje con respecto a la actividad inicial es mayor que la obtenida con heparinas extractivas o con heparinas extractivas de bajo peso molecular, lo que indica una menor afinidad por PF4.

Esta menor afinidad de unión mejora el perfil clínico de los productos obtenidos según la invención ya que reduce el riesgo de inicio de trombocitopenia inducida por heparina (TIH). Incluso si el peso molecular preferido de los productos obtenibles es menor de 15.000 Da, o está comprendido más preferiblemente entre 3.000 y 9.000 Da, los productos de peso molecular >15.000 Da son obtenibles simplemente cambiando las condiciones de despolimerización, manteniendo todavía sus propiedades biológicas tales como alta actividad anti-Xa, resistencia a heparinasa y liberación del factor TFPI.

En conclusión, las heparinas biotecnológicas producidas según la invención presentan las siguientes características principales:

-

una región comprendida entre 79 y 89 ppm, o más precisamente comprendida entre 80-86 ppm por RMN-^{13}C, caracterizada por la presencia de múltiples señales en exceso con respecto a las señales características del anhidromanitol y un aumento de señal a 67-68 ppm y/o una reducción o incluso desaparición de señal a 61-62 ppm por RMN-^{13}C. Estas señales indican la presencia de anhidromanitol sulfatado variadamente, en particular sulfatado en posiciones 1, 3 y 6 y, aún más particularmente, sulfatado en el hidroxilo en posición 1, como se destaca en la comparación entre los espectros de la figura 11 y de la figura 9;

-

preferiblemente la ausencia de señales a 7-9,5 ppm en un espectro de RMN-^{1}H y la ausencia de señal a 51 y 165 ppm en un espectro de RMN-^{13}C, que indica la ausencia de grupos formilo;

-

una actividad anti-Xa (anticoagulante) en plasma mayor que la de heparinas biotecnológicas preparadas según procedimientos de la técnica anterior;

-

una relación de actividad anti-Xa/anti-IIa mayor o igual a la de heparinas biotecnológicas preparadas según los procedimientos de la técnica anterior, preferiblemente mayor o igual a 1 o mucho más preferiblemente mayor o igual a 1,5;

-

una resistencia a la heparinasa mayor o igual que las heparinas extractivas;

-

la capacidad de inhibir la producción de trombina y factor Xa;

-

baja afinidad por PF4.

Las actividades biológicas de las heparinas biotecnológicas recién producidas son peculiares: en particular, una relación entre actividad anti-Xa y actividad anti-IIa mayor o igual a 1, habitualmente en productos obtenidos según la técnica anterior es menor de 1, indicando una relación óptima entre las actividades antitrombótica y anticoagulante que resulta de los valores de TTPA. Dicha relación es similar a la de heparinas extractivas.

Es una característica óptima también con respecto a las heparinas extractivas, evaluable a partir de los altos valores de HCII, una mejor inhibición directa de la trombina, lo que implica la posibilidad de usar los productos de la invención en trastornos tromboembólicos y/o vasculares debidos a trombina y en la falta adquirida o congénita de antitrombina III.

Según un aspecto adicional, la invención hace referencia al uso de los productos obtenidos según el proceso descrito, solos o formulados en composiciones con excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables, para el tratamiento anticoagulante y antitrombótico o la profilaxis en sustitución de heparinas extractivas y para la preparación de productos farmacéuticos con actividad profibrinolítica y antiagregante.

Es particularmente adecuado el uso de productos de la invención o de composiciones que comprenden dichos productos como ingrediente activo para la profilaxis y el tratamiento de angina inestable, infarto de miocardio, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, eventos isquémicos así como para el tratamiento de sepsis y para la prevención de sus complicaciones tales como coagulación intravascular diseminada (CID).

Según un aspecto adicional, la invención hace referencia al uso de productos de la invención para la preparación de productos farmacéuticos para la profilaxis y el tratamiento de angina inestable, trombosis arterial, aterosclerosis y para el tratamiento de enfermedades tromboembólicas debido a una falta congénita o adquirida de antitrombina III.

Los productos pueden portarse en micelas, moléculas portadoras, etc., y resultan particularmente adecuados para uso oral además de para uso parenteral.

Por lo tanto, representan un aspecto adicional de la invención las composiciones farmacéuticas que contienen como principio activo los derivados polisacáridos de N-acetilheparosano producidos según el proceso de la invención, en formulaciones apropiadas tanto para uso oral como parenteral.

Según un aspecto adicional, la invención hace referencia a la preparación de intermedios O-sulfatados con el grupo amino libre del aminoazúcar y que carecen completamente de grupos formilo y sin ninguna actividad anticoagulante, útiles por ejemplo en la preparación de los productos finales de la invención.

Se prefiere particularmente el intermedio K5-OS,NH_{2},epi obtenido y aislado según el proceso descrito en esta invención, que se define como una mezcla de cadenas polisacáridas representadas por la siguiente fórmula general (III):

3

en la que n está en el intervalo de 3 a 150, R1 puede ser hidrógeno o un grupo acetilo con un grado de acetilación en el intervalo de 3% a 15%.

R1 no porta ningún otro grupo funcional, preferiblemente no porta grupos formilo; R2, R3, R4 y R5 pueden ser hidrógeno o un grupo SO_{3}^{-}, estando preferiblemente comprendido el intervalo de sulfatación entre 30 y 98%.

K5OSNH_{2}-epi, (espectro de RMN-^{1}H mostrado en la figura 16) tiene un peso molecular comprendido preferiblemente entre 1.500 y 15.000 Da o, más preferiblemente, entre 3.000 y 9.000 Da, y se caracteriza por una actividad anticoagulante menor de 10 UI/mg medida mediante la actividad anti-factor Xa con un procedimiento cromogénico (kit de heparina Coatest, Chromogenix).

El K5OSNH_{2}-epi es útil, por ejemplo, en la preparación de los productos de la invención.

El K5-OS6OSNH_{2},epi, obtenido y aislado según esta invención, se define como una mezcla de cadenas polisacáridas representadas por la siguiente fórmula general (IV):

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4

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en la que n está en el intervalo de 30 a 150, R1 puede ser hidrógeno o un grupo acetilo en el que el intervalo de acetilación está comprendido entre 3% y 15%. R1 preferiblemente no porta otros grupos funcionales. Preferiblemente, no porta grupos formilo.

R2, R3, R4 y R5 pueden ser hidrógeno o un grupo SO_{3}^{-} estando preferiblemente sustituidos R2, R3, R4 y R5 como sigue:

-

R2 de 15 a 60% con SO_{3}^{-}

-

R3 más de un 40%, preferiblemente de 50 a 85%, con SO_{3}^{-}

Y al menos un 20% de las unidades de ácido glucurónico no están sulfatadas en las posiciones R4 y R5. El intermedio K5-OS6OSNH_{2}-epi (espectro de RMN-^{13}C mostrado en la figura 15) tiene un peso molecular preferiblemente comprendido entre 1.500 y 15.000 Da, o más preferiblemente de 3.000 a 9.000 Da. El intermedio K5-OS6OSNH_{2}-epi se caracteriza por un grupo amino libre en el aminoazúcar, no sulfatado y preferiblemente exento de grupos formilo. Se caracteriza también por una actividad anticoagulante menor de 10 UI/mg como se encuentra mediante la medida de la actividad anti-factor Xa con un procedimiento cromogénico (kit de heparina Coatest, Chromogenix). El intermedio K5-OS6OSNH_{2}, epi es útil, por ejemplo, en la preparación de derivados N-sulfatados según la invención y no tiene ninguna actividad anticoagulante.

En una realización particularmente preferida, el proceso para la producción de bioheparinas a partir de polisacáridos bacterianos tales como N-acetilheparosano (polisacárido K5 de E. coli) comprende las siguientes etapas:

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Preparación y purificación de polisacáridos de N-acetilheparosano

El material de partida es preferiblementen el polisacárido N-acetilheparosano representado por una cadena de unidades disacáridas [-4)-GicA \alpha1-4 GlcNAc-(1-]_{n} constituida por monómeros de ácido D-glucurónico y N-acetilglucosamina ligados por enlaces \beta-1,4. El polisacárido puede obtenerse, por ejemplo, a partir de una cepa de K5 natural de Escherichia coli (cepa Bi 83337/41 serotipo O10:K5:H4) (en este caso, el polisacárido es el polisacárido K5) o de bacteria Pasteurella multocida de tipo D, o de sus derivados o mutantes o cepas recombinantes de Escherichia coli obtenidas, por ejemplo, como se describe en Finke A, y col. Journal of Bacteriology, 173 (13): 4088-4094, 1991, o en Drake CR, Roberts IS, Jann B, Jann K y Boulnois GJ. FEMS Microbiol. Lett. 54 (1-3): 227-230, 1990.

La cepa de Escherichia coli útil para la producción del polisacárido K5 puede obtenerse también a partir de colecciones públicas de microorganismos tales como la ATCC (American Type Culture Collection-EE.UU.) nº ATCC 23506.

La disolución madre de Pasteurella multocida de tipo D puede obtenerse de la colección ATCC (ATCC nº
12948).

El polisacárido N-acetilheparosano se obtiene mediante fermentación microbiana y extracción del caldo de cultivo. Se efectúa la purificación mediante técnicas conocidas, como las descritas, por ejemplo, en la patente WO 01/02597 en que se usa el siguiente caldo de cultivo: harina de soja descremada 2 g/l, K_{2}HPO_{4} 9,7 g/l, KH_{2}PO_{4} 2 g/l, MgCl_{2} 0,11 g/l, citrato de sodio 0,5 g/l, sulfato de amonio 1 g/l, glucosa (esterilizada aparte) 2 g/l, agua hasta 1.000 ml, pH 7,3.

Se inocula preferiblemente un precultivo con una suspensión celular de E. coli Bi 8337/41 (O1O:K5:H4) derivada de un cultivo en pendiente mantenido en agar de soja tríptico. Se incuba a 37ºC durante 24 horas con agitación. En una etapa posterior, se inocula un fermentador que contiene el medio citado al 0,1% con el precultivo anteriormente mencionado y se lleva a cabo una fermentación durante 18 horas a 37ºC. Durante la fermentación, se controlan pH, oxígeno, glucosa residual, polisacárido K5 producido y crecimiento bacteriano.

Al final de la fermentación, la temperatura se lleva a 80ºC durante 10 minutos. Se separan las células del medio mediante centrifugación a 10.000 rpm y se filtra el sobrenadante a través de membranas de filtración con un corte de 1.000-10.000 Da para reducir el volumen a aproximadamente 1/5. Se precipita entonces el polisacárido K5 añadiendo 4 volúmenes de acetona y se recupera mediante centrifugación.

Se lleva a cabo la desproteinización del sedimento preferiblemente usando una proteasa de tipo II de Aspergillus orizae en un tampón que comprende NaCl 0,1 M y EDTA 0,15 M a pH 8 que contiene SDS al 0,5% a 37ºC durante 90 minutos.

Se ultrafiltra la disolución con membranas con un corte de 10.000 Da y se precipita entonces el polisacárido con acetona. La pureza del polisacárido es habitualmente superior al 80% y se mide mediante al menos uno de los siguientes procedimientos analíticos: cálculo de ácidos urónicos (procedimiento de carbazol), RMN de protón, de ^{13}C, UV y/o contenido de proteína.

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a) N-desacetilación y N-sulfatación del polisacárido N-acetilheparosano de fuente microbiana

Se solubiliza una cantidad preferiblemente comprendida entre 5 y 10 g de polisacárido K5 purificado en 200-2000 ml de hidróxido de sodio 2 N y se deja reaccionar a 40-80ºC hasta que se completa la desacetilación (concretamente, 15-30 horas). Se conduce la disolución a neutralidad.

Se mantiene la disolución que contiene el polisacárido K5 desacetilado a 20-65ºC y se añaden 10-40 g de carbonato de sodio en una sola etapa, así como 10-40 g de un agente sulfatante seleccionado entre reactivos tales como aductos de piridina-trióxido de azufre, trimetilamina-trióxido de azufre, etc.

Se añade el agente sulfatante durante un tiempo de hasta 12 horas. Al final de la reacción, si es necesario, se lleva la disolución a temperatura ambiente y a un pH comprendido entre 7,5 y 8.

Se purifica el producto de sales mediante técnicas conocidas tales como, por ejemplo, mediante diafiltración con membranas en espiral de 1.000 Da (cartucho Millipore a escala preparativa). Se reduce en volumen el producto retenido hasta obtener una concentración de polisacárido del 10%. Puede desecarse una disolución concentrada, si es necesario, con procedimientos conocidos.

Se mide la relación de N-sulfato/N-acetilo con RMN-^{13}C.

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b) Epimerización enzimática por glucuronil C5-epimerasa

Se lleva a cabo la etapa de epimerización de C5, que implica la epimerización de una parte del ácido glucurónico a ácido idurónico, con la enzima glucuronil C5-epimerasa (llamada C5-epimerasa) natural o recombinante en disolución o preferiblemente en forma inmovilizada.

Para esta etapa, se usa enzima C5-epimerasa como se describe en el documento WO 98/48006. Preferiblemente, la enzima recombinante modificada como se describe en el documento US nº 09/732.026 y en Li y col. J. Biol. Chem., vol. 276, 23, (2001) 20069-20077), y contiene una secuencia adicional en su extremo N-terminal.

Se expresa y purifica preferiblemente la enzima recombinante a partir de células de insecto o células de levadura, preferiblemente pertenecientes al género Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Hansenula polymorpha, Saccharomyces pombe, Kluyveromices lactis o Kluyveromices fragilis.

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b.1) Inmovilización de la C5-epimerasa sobre resinas

La enzima recombinante puede inmovilizarse sobre diferentes matrices inertes tales como resinas, membranas o perlas de vidrio derivatizadas con grupos funcionales mediante técnicas conocidas tales como bromuro de cianógeno, glutaraldehído, carbodiimida, o dejando reaccionar la enzima con una resina de intercambio iónico o dejándola absorberse en membranas.

Según una realización preferida, se inmoviliza la enzima sobre resinas comerciales tales como CNBr Sepharose 4B (Pharmacia) o sobre resinas poliestirénicas o polimetacrílicas (Resindion Mitsubishi) con grupos epoxídicos o diólicos activados con CNBr.

Se prefiere particularmente según la invención la inmovilización enzimática sobre resina polimetacrílica con grupos diólicos activados con CNBr en tampón NaHCO_{3} 100-300 mM a pH 7,0-8,3, preferiblemente pH 7,2-7,8, a una temperatura de 4-25ºC durante 12-72 horas.

Según la invención, la reacción de unión de la enzima a la matriz inerte se lleva a cabo en presencia del sustrato K5 N-desacetilado y N-sulfatado para evitar que dicha unión implique al sitio activo enzimático con pérdida de actividad.

La medida de la actividad enzimática inmovilizada se lleva a cabo dejando recircular, a través de una columna que contiene la enzima inmovilizada, la cantidad de K5 N-desacetilado y N-sulfatado teóricamente convertible en cpm de enzima inmovilizada, disuelta en tampón HEPES 25 mM, KCI 0,1 M, Triton X100 al 0,01% y EDTA 0,15 M a 7,4 pH a 37ºC durante 24 horas con un flujo de 0,5 ml/minuto. Después de purificación mediante un procedimiento cromatográfico DEAE y desalado en Sephadex G-10, se liofiliza en producto y se analiza el contenido de ácido idurónico mediante la técnica de RMN de protón según el documento WO 96/14425.

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b.2) Epimerización con enzima inmovilizada

La reacción de epimerización de C5 puede efectuarse, por ejemplo, como se describe en el documento WO 96/14425 en tampón de reacción a pH 7,4 que comprende preferiblemente HEPES 0,04 M o Tris 0,05 M, KCI 0,4 M, EDTA 0,06 M y Triton X-100 y uno o más aditivos, en particular glicerol o polivinilpirrolidona.

La reacción puede efectuarse como se describe en el documento WO 01/72848, en el que se usa una disolución que contiene HEPES 25 mM, CaCl_{2} 50 mM a pH 7,4, a una temperatura de 30-40ºC.

Se prefieren particularmente las condiciones de reacción de temperatura y tampón que permitan que la actividad de glucuronil C5-epimerasa sea de larga duración y estable incluso después de inmovilización sobre una columna. Se permiten circular 20-1.000 ml de una disolución acuosa que comprende 0,001-10 g de K5 N-desacetilado y N-sulfatado y EDTA 10-30 mM, preferiblemente 15-25 mM, HEPES 25 mM, CaCl_{2} a una concentración de 70 a 150 mM (preferiblemente 75-100 mM) a pH 5,5-8,0, preferiblemente pH 6,5-7,0 y termostatizado a una temperatura comprendida entre 15 y 30ºC (preferiblemente 20-25ºC), a un flujo de 30-240 ml/hora durante un tiempo comprendido entre 1 y 24 horas en una columna que contiene de 1,2 x 10^{7} a 3 x 10^{11} equivalentes de la enzima inmovilizada en un medio inerte termostatizado a una temperatura comprendida entre 15 y 30ºC, preferiblemente de 20 a 25ºC.

Las condiciones de temperatura y tampón anteriores aumentan la estabilidad de la enzima sobre la columna durante un periodo de trabajo superior a 3.000 horas y, por lo tanto, hacen particularmente ventajoso el proceso. Al final de la reacción, se purifica la muestra pasando a través de una resina DEAE o un cartucho Sartobind DEAE y se precipita mediante la adición de NaCl 2 M y, finalmente, se desala en resina G10 Sephadex (Pharmacia) o se purifica mediante precipitación con 2 volúmenes de etanol y pasando por resina IR 120H+ para obtener la sal de sodio.

El producto obtenido en dichas condiciones preferidas tiene una relación de epimerización medida por la técnica de RMN de protón, como se describe en el documento WO 96/14425, de al menos un 50% (tasa de ácido idurónico sobre los ácidos urónicos totales).

Despolimerización controlada

El producto obtenido en la etapa b) o c) o d) experimenta una despolimerización controlada con técnicas conocidas tales como desaminación con ácido nitroso como se describe en el documento WO 82/03627, o mediante apertura oxidativa con peryodato de sodio (documento EP 287477), o mediante tratamiento con radicales libres (documento EP 121067) o mediante eliminación beta (documento EP40144), o mediante tratamiento con rayos gamma (documento US 4.987.222), obteniéndose fracciones de peso molecular comprendidas preferiblemente entre 1.500 y 15.000 Da, o aún más preferiblemente, comprendidas entre 3.000 y 9.000 Da.

Según un aspecto preferido de la invención, se lleva a cabo la despolimerización controlada antes de las etapas de sulfatación.

En particular, el producto resultante de las etapas anteriores se pone bajo despolimerización controlada con ácido nitroso o nitrito de sodio. En este caso, la cantidad de sal usada comprende de 1 a 100 mg por cada gramo de polisacárido, seguido de reducción por borohidruro en exceso.

Según una segunda realización preferida, se disuelve la muestra en 50-250 ml de agua a 4ºC y se acidifica con ácido clorhídrico 1 N. Se añade entonces una cantidad de nitrito de sodio comprendida entre 5 y 500 mg y se continúa la reacción durante menos de 60 minutos, preferiblemente menos de 30 minutos.

Después de la destrucción del borohidruro de sodio en exceso, se recupera el producto mediante precipitación con 3 volúmenes de etanol y se deseca en una estufa a vacío.

Cuando se lleva a cabo la despolimerización al final del proceso, puede efectuarse como se describe, por ejemplo, en el documento WO 01/72848.

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c) O-Sulfatación parcial combinada con O-desulfatación parcial

Se resuspende el producto derivado de las etapas anteriores en agua a una concentración del 10%. Se enfría la disolución a 10ºC y se pasa a través de una resina de intercambio catiónico IR-120 H+ manteniendo la temperatura a 10ºC. Después de pasar la disolución a través de la resina, se lava con agua desionizada hasta que el pH del eluido sea mayor de 6. Se conduce la disolución ácida a neutralidad añadiendo una amina terciaria o una sal de amonio cuaternario tal como una disolución acuosa de hidróxido de tetrabutilamonio al 15%, obteniendo la sal de amonio relevante. La disolución puede concentrarse a un volumen mínimo y liofilizarse.

Se suspende el producto obtenido en 10-1.000 ml de un disolvente orgánico consistente, preferiblemente, en sulfolano o 2,4-dimetilsulfolano. Como alternativa, el disolvente puede ser N,N-dimetilformamida (DMF) o dimetilsulfóxido (DMSO) o N,N-dimetilacetamida. Se añade este disolvente orgánico con un agente sulfatante tal como aducto de piridina-SO_{3} en forma sólida o en disolución con los mismos disolventes anteriormente usados.

Se mantiene la relación molar entre el agente sulfatante y el sustrato polisacárido (K5 N-sulfatado epimerizado), que se entiende como la relación entre el agente sulfatante y los moles de hidroxilo del dímero polisacárido, menor o igual a 5 o, más preferiblemente, menor de 2,5 o, aún más preferiblemente, menor de 1,5.

Se mantiene la disolución a una temperatura comprendida entre 20 y 70ºC, preferiblemente comprendida entre 30 y 60ºC, durante un periodo de tiempo menor o igual a 10 horas, más preferiblemente menor o igual a 8 horas, o aún más preferiblemente menor o igual a 6 horas. Al final de la reacción, se enfría eventualmente la reacción a temperatura ambiente y se añade acetona saturada con cloruro de sodio hasta la precipitación completa del polisacárido.

Se separa el precipitado del disolvente mediante filtración, se solubiliza con la cantidad mínima de agua desionizada y se añade cloruro de sodio hasta obtener una disolución 0,2 M. Se lleva la disolución a pH 7,5-8 mediante la adición de hidróxido de sodio 2 N. Se añade entonces acetona para completar la precipitación. Se separa el precipitado del disolvente mediante filtración. Se solubiliza el sólido obtenido con 10-100 ml de agua desionizada y se purifica de las sales residuales mediante ultrafiltración.

Se liofiliza una alícuota para el análisis estructural del producto parcialmente O-sulfatado mediante RMN-^{13}C y RMN-^{1}H.

Se pasa la disolución que contiene el producto parcialmente sulfatado a través de una resina de intercambio catiónico IR-120+ o equivalente.

Se lava la resina con agua desionizada hasta que el pH del eluido sea mayor de 6 y se añade entonces piridina. Se concentra la disolución a un volumen mínimo y se liofiliza. Se trata el producto con 20-200 ml de una disolución de DMSO/metanol (9/1 V/V) y se mantiene la disolución a 45-90ºC durante 10-420 minutos. Al final, se añaden a la disolución 10-200 ml de agua desionizada y se trata con acetona saturada con cloruro de sodio para completar la precipitación.

Se purifica el sólido obtenido mediante diafiltración según técnicas conocidas y se liofiliza una alícuota para análisis estructural por RMN-^{13}C.

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d) 6O-sulfatación parcial

Se 6O-sulfata entonces el producto de la etapa previa. Se mide el contenido de grupos sulfato en posición 6O mediante técnicas conocidas tales como, por ejemplo, RMN, según las condiciones descritas en Guerrini y col. Seminars in Thrombosis and Hemostasis, vol 27, 5, 473-482, 2001.

Se resuspende el producto obtenido en agua a una concentración comprendida entre 5 y 10% y se mantiene a temperatura ambiente. Se pasa entonces la disolución a través de una resina de intercambio catiónico IR-120 H+ o equivalente. Después del flujo de disolución, se lava la resina con agua desionizada y se conduce a neutralidad con una amina terciaria o una sal de amonio cuaternario tal como, por ejemplo, hidróxido de tetrabutilamonio en disolución acuosa, obteniéndose la sal de amonio relevante. Se concentra la disolución a un volumen mínimo y se
liofiliza.

Se suspende el producto obtenido en 10-1.000 ml de un disolvente orgánico consistente en N,N-dimetilformamida, preferiblemente en sulfolano o en 2,4-dimetilsulfolano o en N,N-dimetilacetamida, y se añade un agente de sulfatación tal como un aducto de piridina-SO_{3} en forma sólida o en disolución con el mismo disolvente.

Se lleva la suspensión a una temperatura comprendida entre 4ºC y 30ºC, preferiblemente de 10 a 25ºC, se trata con una cantidad de agente sulfatante tal como aducto de piridina-SO_{3} usando menos de 2 equivalentes en comparación con los grupos hidroxilo para sulfatar, o incluso más preferiblemente con menos de 1,5 equivalentes, durante 10-90 minutos y se trata con acetona saturada con cloruro de sodio en una cantidad tal que se complete la precipitación. Se purifica entonces el sólido obtenido mediante diafiltración según procedimientos bien conocidos en la técnica. Se liofiliza una alícuota para análisis estructural por RMN-^{13}C.

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e) N-Resulfatación

La disolución de la etapa d), que contiene el polisacárido 6O-sulfatado, se lleva a 20-65ºC y se añaden 10-100 g de carbonato de sodio en una sola adición y 10-100 g de agente de sulfatación seleccionado entre los reactivos disponibles tales como, preferiblemente, piridina-trióxido de azufre. La adición del agente sulfatante se lleva a cabo durante un tiempo variable de hasta 12 horas. Al final de la reacción, si es necesario, se lleva la disolución a temperatura ambiente y a un pH comprendido entre 7,5 y 8, preferiblemente con hidróxido de sodio 2 M.

Se purifica el producto de sales mediante técnicas conocidas tales como, por ejemplo, diafiltración usando una membrana en espiral de 1.000 Da (concretamente, cartucho Millipore a escala preparativa). Se completa el proceso cuando la conductividad del perneado es menor de 1000 \muS, preferiblemente menor de 100 \muS. Se reduce en volumen el producto obtenido hasta obtener una concentración de polisacárido del 10% por filtración. Se liofiliza una alícuota de la disolución concentrada para análisis estructural por RMN-^{13}C.

La 6O-sulfatación selectiva y N-resulfatación llevadas a cabo como se describe en esta etapa con productos derivados de la etapa e) pueden efectuarse en orden diferente, por ejemplo la N-resulfatación primero y después la 6O-sulfatación, como se describe en el documento WO 98/42754, sin modificar las actividades biológicas del producto final.

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Enriquecimiento de secuencias de unión a antitrombina III (opcional)

El producto obtenido como se describe en la etapa previa puede purificarse opcionalmente además mediante cromatografía, por ejemplo, en una columna cromatográfica de intercambio aniónico tal como, por ejemplo, en columnas DEAE como se describe en Lam L.H. y col. Bioch. And Biophysical Research Communication vol. 69, 2, pág. 570-577, 1976. Como alternativa a esta purificación o además de ésta, el producto puede someterse a una cromatografía por afinidad adicional en columnas que portan la secuencia de antitrombina humana total o parcial como se describe, por ejemplo, en Hook y col. FEBS Lett. 1976, 66: 90-93 o en la patente de EE.UU. 4.692.435 o secuencias peptídicas que tienen una alta afinidad por heparina como se describen en Liu S y col. Proc. Natl. Acad Sci USA 1980, 77: 6551-6555.

Este tratamiento permite la separación, mediante posterior elución con una disolución salina de NaCl, de al menos una fracción capaz de unirse a la fase sólida.

En la práctica, se cargan 10-50 mg de producto derivado de la etapa de N-resulfatación en una columna de afinidad en que se inmovilizan 50-100 mg de antitrombina III humana (Kedrion SpA, Lucca, Italia) en tampón Tris-HCl 10 mM a 7,4 pH y NaCl 0-0,15 M a 4ºC. Se lava entonces la columna con al menos 3 volúmenes de tampón Tris-HCl 10 mM a pH 7,4.

Las moléculas unidas con mayor afinidad a la columna se eluyen con Tris HCl 10 mM, pH 7,4, que contiene NaCl de 0,5 a 3 M.

Se diafiltra entonces el material eluido preferiblemente por membranas en espiral de 1.000 Da de corte para eliminar sales, y se concentra por liofilización.

Puede analizarse una alícuota mediante el procedimiento de carbazol, HPLC, RMN y ensayo cromogénico para medir la actividad anti-Xa.

El material obtenido muestra una mayor actividad anti-Xa, enriquecida de 1,5 a 3 veces, que la actividad del material de partida.

Se obtiene el mismo aumento de actividad anti-Xa tratando del mismo modo heparinas extractivas. Esta es una señal adicional de la similitud de las heparinas biotecnológicas obtenidas según esta invención con las heparinas extractivas en la unión a antitrombina III.

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Parte experimental

Ejemplo 1

Producción de heparina biotecnológica según el proceso de la invención

Se han seguido las siguientes etapas:

a)

preparación del polisacárido N-acetilheparosano partiendo de K5 de Escherichia coli,

b)

N-desacetilación/N-sulfatación,

c)

epimerización,

d)

despolimerización,

e)

O-sulfatación parcial/O-desulfatación parcial

f)

6O-sulfatación parcial

g)

N-resulfatación

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a) Preparación de polisacárido

Se obtuvo el polisacárido N-acetilheparosano mediante fermentación de una disolución madre de E. coli Bi 8337/41, serotipo O10:k5:H4 (ATCC 23506) y posterior extracción del caldo de cultivo y purificación según la descripción de la patente WO 01/02597 usando el siguiente caldo de cultivo: harina de soja descremada 2 g/l, K_{2}HPO_{4} 9,7 g/l, K_{2}HPO_{4} 2 g/l, MgCl_{2} 0,11 g/l, citrato de sodio 0,5 g/l, sulfato de amonio 1 g/l, glucosa (esterilizada aparte) 2 g/l, agua hasta 1000 ml, pH 7,3.

Se inoculó el cultivo con una suspensión celular derivada de un cultivo en pendiente mantenido en agar de soja tríptico a 37ºC durante 24 horas con agitación. Se inoculó en un fermentador de tipo F5 (Industrie Meccaniche di Bagnolo SpA) que contenía el mismo medio anteriormente mencionado un inóculo al 0,1% con el cultivo de matraz Erlenmeyer anteriormente mencionado, y se efectuó la fermentación a una temperatura de 37ºC durante 18 horas. Durante la fermentación, se midieron el pH, oxígeno, glucosa residual, polisacárido K5 producido y crecimiento bacteriano. Al final de la fermentación, se llevó la temperatura a 80ºC durante 10 minutos. Se separaron las células del medio mediante centrifugación a 10.000 rpm, se filtró el sobrenadante del medio mediante centrifugación a 10.000 rpm y se filtró el sobrenadante usando membranas de filtro de 10.000 Da de corte para reducir el volumen a 1/5. Se precipitó el polisacárido K5 añadiendo 4 volúmenes de acetona y, finalmente, se recuperó mediante centrifuga-
ción.

Se efectuó la desproteinización del sólido mediante proteasa de tipo II de Aspergillus oryzae en tampón de NaCl 0,1 M y EDTA 0,15 M a pH 8 que contenía 0,5% de SDS, a 37ºC durante 90 minutos.

Se ultrafiltró la disolución obtenida con membranas que tenían un corte nominal de 10.000 Da y se precipitó el polisacárido con acetona. Se midió la pureza del polisacárido mediante la determinación de ácidos urónicos (procedimiento de carbazol), RMN-^{1}H, RMN-^{13}C, UV y contenido de proteína.

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b) N-desacetilación/N-sulfatación

Se solubilizaron 10 g del producto obtenido en la etapa a) en 200 ml de hidróxido de sodio 2 N y se dejaron a 50ºC durante 18 horas. Se llevó la disolución a pH neutro con ácido clorhídrico 6 N. Se obtuvo un polisacárido N-desacetilado.

Se mantuvo la disolución de polisacárido N-desacetilado a 40ºC y se añadieron 10 g de carbonato de sodio en una sola adición y 10 g de aducto de piridina-trióxido de azufre en 10 minutos. Se purificó de sales el producto obtenido constituido por polisacárido K5 N-desacetilado y N-sulfatado mediante diafiltración usando una membrana en espiral de 1.000 Da (cartucho Millipore a escala preparativa). Se completó el proceso de purificación cuando la conductividad del permeado era inferior a 100 \muS.

Se llevó el producto a una concentración de polisacárido del 10% usando el mismo procedimiento de diafiltración y se liofilizó entonces.

La relación de N-sulfato/N-acetilo del producto obtenido era de 9,5/0,5 medida mediante RMN-^{13}C.

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c) Epimerización c-1) Inmovilización de C5-epimerasa sobre resina

Se disolvieron 5 mg de glucuronil C5-epimerasa recombinante obtenida según el documento US nº 09/732.026 y Li y col. J. Biol. Chem., vol 276, 23, (2001) 20069-20077 en 200 ml de tampón Hepes 0,25 M, pH 7,4 que contenía KCI 0,1 M, Triton X-100 al 0,1% y EDTA 15 mM, y se añadieron a la disolución 100 mg de K5 N-desacetilado y N-sulfatado obtenido según la descripción de la etapa b). Se diafiltró la disolución por una membrana de 30.000 Da a 4ºC hasta que desapareció el K5 N-desacetilado y N-sulfatado en el diafiltrado. Se cambió el tampón de la disolución retenida por la membrana por diafiltración, se sustituyó por NaHCO_{3} 200 mM a 7 pH y, después de concentración a 50 ml, se añadieron 50 ml de resina activada CNBr Sepharose 4B, que se dejó reaccionar durante una noche a 4ºC.

Al final de la reacción, se midió la cantidad de enzima residual en el sobrenadante con el procedimiento Quantigold (Diversified Biotec) después de decantación. La enzima estaba ausente en el sobrenadante, demostrado que con el procedimiento descrito la enzima se inmovilizaba al 100%. Para ocupar los sitios de resina dejados disponibles, se lavó la resina con tampón Tris-HCl 100 mM a pH 8.

Para la medida de la actividad enzimática inmovilizada, se cargó una cantidad de enzima inmovilizada teóricamente correspondiente a 1,2 x 10^{7} cpm en una columna. En la columna así preparada, se trató 1 mg de K5 N-desacetilado y N-sulfatado obtenido según la etapa b) y se disolvió en tampón HEPES 25 mM, KCI 0,1 M, EDTA 0,015 M, Triton X-100 al 0,01% a pH 7,4, dejando recircular a través de dicha columna a 37ºC durante una noche con un flujo de 0,5 ml/minuto.

Después de purificación por el procedimiento de cromatografía DEAE y desalificación en Sephadex G10, se liofilizó la muestra y se analizó el contenido de ácido idurónico mediante la técnica de RMN de protón según la descripción de la patente WO 96/14425.

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c-2) Epimerización con enzima inmovilizada

Se disolvieron 10 g de polisacárido K5 N-desacetilado y N-sulfatado en 600 ml de EDTA 15 mM, tampón HEPES 25 mM, pH 7,0, que contenía CaCl_{2} 75 mM. Se dejó recircular la disolución obtenida a través de una columna de 50 ml cargada con una resina que contenía la enzima inmovilizada.

Se efectuó esta operación a 28ºC con un flujo de 200 ml/h durante 24 horas.

Se purificó el producto obtenido mediante ultrafiltración y se precipitó con etanol. Se resolubilizó el precipitado en agua a una concentración del 10%.

El producto obtenido muestra un porcentaje de epimerización, medido con RMN-^{1}H, como porcentaje de ácido idurónico de los ácidos urónicos totales, del 55% (como se muestra en la figura 1).

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d) Despolimerización controlada

La muestra obtenida en la etapa c-2) experimentó una degradación controlada con ácido nitroso como se describe en la patente WO 82/03627. En particular, se disolvieron 5 g de la muestra en 250 ml de agua y se llevaron a 4ºC con baño termostatizado. Se llevó el pH a pH 2,0 con ácido clorhídrico 1 N enfriado a 4ºC y, después de ello, se añadieron 200 mg de nitrito de sodio. Cuando fue necesario, se llevó el pH a 2 con ácido clorhídrico 1 N y se mantuvo con agitación lenta durante 15 minutos. Se neutralizó la disolución con NaOH 1 N enfriado a 4ºC.

Se añadieron 250 mg de borohidruro de sodio disuelto en 13 ml de agua desionizada, dejando reaccionar durante 4 horas. Se llevó la disolución a pH 5,0 con ácido clorhídrico 1 N y se dejó durante 10 minutos para destruir el exceso de borohidruro de sodio y, después de ello, se neutralizó con NaOH 1 N. Se recuperó el producto mediante precipitación con 3 volúmenes de etanol y, entonces, se desecó en una estufa a vacío. El producto obtenido muestra un peso molecular de aproximadamente 6.000 Da.

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e) O-sulfatación parcial/O-desulfatación parcial

Se resuspendió el producto resultante de la etapa previa a una concentración del 10% en disolución acuosa. Se enfrió la disolución a 10ºC y se dejó fluir a una temperatura de 10ºC a través de una resina de intercambio catiónico IR-120+. Después del flujo de esta disolución, se lavó la resina con agua desionizada, hasta que el pH del eluido era mayor de 6. Se condujo entonces la disolución ácida a neutralidad usando una amina terciaria o una sal de amonio cuaternario, tal como por ejemplo hidróxido de tetrabutilamonio en disolución acuosa al 15%, obteniendo como resultado la sal de amonio. Se concentró entonces la disolución a un volumen mínimo y se liofilizó.

Se resuspendió la disolución resultante en 100 ml de N,N-dimetilacetamida (DMA) y se añadió piridina-SO_{3}. Se añadió entonces una cantidad de agente sulfatante a una relación molar entre el agente sulfatante y el sustrato K5 N-sulfatado epimerizado (como moles de hidroxilo) de 1,25.

Se mantuvo la disolución a 50ºC durante 360 minutos. Al final de la reacción, se enfrió la disolución a temperatura ambiente y se añadió acetona saturada con cloruro de sodio hasta precipitación completa.

Se separó el precipitado del disolvente mediante filtración, se solubilizó con una cantidad mínima de agua desionizada y se añadió cloruro de sodio hasta obtener una disolución 0,2 M. Se llevó la disolución a pH 7,5 mediante la adición de hidróxido de sodio 2 N y se añadió acetona para permitir la precipitación. Se separó entonces la disolución precipitada del disolvente mediante filtración. Se solubilizó la disolución sólida así obtenida mediante la adición de 100 ml de agua desionizada y se purificó de sales residuales mediante ultrafiltración.

Se liofilizó una alícuota para el análisis estructural del producto parcialmente O-sulfatado mediante RMN-^{13}C.

Se dejó fluir la disolución que contenía el producto parcialmente sulfatado a través de una resina de intercambio catiónico IR-120 H+ o equivalente. Después del flujo de esta disolución, se lavó la resina con agua desionizada hasta que el pH del permeado fue mayor de 6. Se condujo la disolución ácida a neutralidad añadiendo piridina. Se concentró la disolución a un volumen mínimo y se liofilizó. Se manejó el producto obtenido con 100 ml de disolución de DMSO/metanol (9/1 V/V) y se mantuvo la disolución obtenida a 65ºC durante 240 minutos.

Finalmente, se añadieron a la disolución 200 ml de agua desionizada y se manejó entonces con acetona saturada con cloruro de sodio en tal cantidad que se completara la precipitación. Se purificó el sólido obtenido mediante diafiltración según técnicas conocidas y se liofilizó una alícuota para análisis estructural por RMN-^{13}C.

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f) 6O-Sulfatación parcial

Se resuspendió el producto obtenido en la etapa e) en una disolución acuosa a una concentración del 10% y se mantuvo a temperatura ambiente. Se pasó la disolución a través de una resina de intercambio catiónico IR-120 H+. Se lavó entonces la resina con agua desionizada y se condujo a neutralidad mediante hidróxido de tetrabutilamonio en disolución acuosa, obteniéndose la sal de amonio. Se concentró entonces la disolución en un volumen mínimo y se liofilizó.

Se suspendió entonces el producto obtenido en 100 ml de DMF y se añadió entonces el agente sulfatante piridina-SO_{3} añadido en una disolución de DMA. Se llevó la disolución a 10ºC y se trató con una cantidad de aducto de piridina-SO_{3} como agente sulfatante de 1,25 equivalentes de agente sulfatante con respecto al hidroxilo durante 60 minutos.

Se trató la disolución con acetona saturada con cloruro de sodio en una cantidad que completara la precipitación. Se purificó el sólido obtenido mediante diafiltración según un procedimiento conocido. Se liofilizó una alícuota para análisis estructural por RMN-^{13}C.

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g) N-Resulfatación

Se solubilizó el producto en agua, se llevó a una temperatura de 40ºC y se añadieron en una adición simple 10 g de carbonato de sodio y 10 g de piridina-trióxido de azufre durante un tiempo de 10 minutos.

Al final de la reacción, si era necesario, se condujo la disolución a temperatura ambiente y entonces, si era necesario, a un pH menor de 8,0 con NaOH.

Se purificó entonces el producto de sales mediante técnicas conocidas tales como, por ejemplo, mediante diafiltración con una membrana en espiral de 1.000 Da de corte (cartucho Millipore a escala preparativa). El proceso terminaba a una conductividad de permeado menor de 1000 \muS, preferiblemente menor de 100 \muS. Se redujo en volumen el producto retenido hasta que se obtuvo una concentración del 10% de polisacárido conseguida mediante el mismo proceso de filtración.

Se muestra el espectro de RMN-^{1}H en la figura 2.

La actividad anti-Xa de los productos obtenidos medida en plasma humano era de 140 UI/mg (véase la tabla 2) y la relación entre la actividad anti-Xa y la actividad anti-II era de 2,5.

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Ejemplo 2

O-Sulfatación con DMF

Se repitió el ejemplo nº 1 con la variación de que en la etapa c) y f) se llevaron a cabo la O-sulfatación parcial y 6O-sulfatación parcial usando N,N-dimetilformamida (DMF) como disolvente orgánico. El producto obtenido mostraba una actividad anti-Xa en plasma de 85,9 UI/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro de RMN en la figura 3.

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Ejemplo 3

Despolimerización controlada en presencia de 50 mg/g de sustrato nitrito de sodio

Se repitió el ejemplo nº 1 con la diferencia de que se efectuó la despolimerización controlada con 50 mg de nitrito de sodio por g de polisacárido para obtener un peso molecular de aproximadamente 4200 Da.

El producto obtenido mostraba una actividad anti-Xa en plasma de 60,1 UI/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro de RMN-^{13}C en la figura 4.

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Ejemplo 4

Producción de heparinas biotecnológicas que tienen un peso molecular de aproximadamente 8.000 Da (despolimerización controlada con 20 mg/g de sustrato nitrito de sodio)

Se repitió el ejemplo nº 1 con la diferencia de que en la etapa d) se llevó a cabo la despolimerización controlada con 20 mg de nitrito de sodio por g de polisacárido para obtener un peso molecular de aproximadamente 8.000 Da.

El producto obtenido mostraba una actividad anti-Xa en plasma de 150 UI/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro de RMN-^{13}C en la figura 5.

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Ejemplo 5

Producción de heparinas biotecnológicas que tienen un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da

Se efectuó el ejemplo nº 5 según las siguientes etapas:

a)

preparación del polisacárido N-acetilheparosano partiendo de K5 de Escherichia coli;

b)

N-desacetilación/N-sulfatación;

c)

epimerización;

d)

O-sulfatación parcial/O-desulfatación parcial;

e)

O-sulfatación parcial/N-resulfatación parcial.

Las etapas a)-c) corresponden a sus respectivas etapas del ejemplo 1 y, cuando falta la despolimerización (etapa d), la etapa d) corresponde a la etapa e) del ejemplo 1 y la etapa e) corresponde a las etapas f) y g) del ejemplo 1.

El producto final obtenido tenía un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da, y es susceptible de despolimerización. La actividad anti-Xa en plasma era de 135 UI/mg (véase la tabla 2).

Se muestra el espectro de RMN-^{13}C en la figura 6.

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Ejemplo 6

Producción de heparinas biotecnológicas que tienen pesos moleculares de aproximadamente 15.000 Da (despolimerización controlada con 5 mg/g de sustrato nitrito de sodio)

Se repitió el ejemplo 1 en las mismas condiciones de temperatura y tiempo usadas en la etapa d), pero se llevó a cabo la despolimerización controlada con nitrito de sodio con 5 mg de nitrito de sodio por g de polisacárido para obtener un peso molecular de aproximadamente 15.000 Da.

El producto obtenido mostraba una actividad anti-Xa en plasma de 180 UI/mg (véase la tabla 2); Se muestra el espectro de RMN-^{13}C en la figura 7.

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Ejemplo 7

Proceso de preparación de heparina biotecnológica según técnicas conocidas

En este ejemplo, se usaron las condiciones de proceso de O-supersulfatación y 6O-sulfatación descritas en los documentos WO 01/72848 y WO 02/50125. Brevemente, efectuar la supersulfatación con N,N-dimetilformamida a 50ºC durante 18 horas, la O-desulfatación a 65ºC durante 150 minutos y la 6O-sulfatación con N,N-dimetilformamida a 0ºC durante 90 minutos.

El producto final mostraba un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da y una actividad anti-Xa en plasma de 45 UI/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro de RMN-^{13}C en la figura 8.

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Ejemplo 8

Producción de heparinas biotecnológicas según técnicas de la técnica anterior

Se efectuó este ejemplo usando las mismas condiciones de supersulfatación y 6O-desulfatación descritas en los documentos WO 01/72848 y WO 02/50125: brevemente: se efectuó la supersulfatación en N,N-dimetilformamida a 50ºC durante 18 horas, la O-desulfatación a 65ºC durante 150 minutos y la 6O-sulfatación en N,N-dimetilformamida a 0ºC durante 90 minutos.

Además, se efectuó una etapa de despolimerización al final del proceso de sulfatación como se describe en los documentos WO 01/72848 y WO 02/50125 en presencia de 40 mg/g de sustrato nitrito de sodio a 4ºC durante 15 minutos.

El producto final obtenido tiene un peso molecular de aproximadamente 6.000 Da y una actividad anti-Xa en plasma de 31,5 UI/mg. Se muestra el espectro de RMN-^{13}C en la figura 9.

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Ejemplo 9

Producción de heparinas biotecnológicas: control de las condiciones de despolimerización y sulfatación

Se repitió el ejemplo 1 con las siguientes variaciones:

Se efectuó la despolimerización controlada (etapa d) del ejemplo 1) con 40 mg de nitrito de sodio por g de K5NS epimerizado en las mismas condiciones de tiempo y temperatura que el ejemplo 1. El peso molecular obtenido era de aproximadamente 6.500 Da. Se efectuó la sulfatación parcial (etapa e) del ejemplo 1 con una relación molar de 5 entre el agente de sulfatación y el sustrato K5 N-sulfatado epimerizado y durante un periodo de 180 minutos, mientras que la O-desulfatación se realizó durante 60 minutos.

El producto obtenido mostraba una actividad anti-Xa en plasma de 89 UI/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro de RMN-^{13}C en la figura 10.

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Ejemplo 10

Producción de heparinas biotecnológicas: control de las condiciones de despolimerización y sulfatación

Se repitió el ejemplo 1 y se efectuó la despolimerización intermedia (etapa d) del polisacárido K5 N-sulfatado epimerizado en las mismas condiciones de tiempo y temperatura descritas en el ejemplo 9, pero usando 40 mg de nitrito de sodio por m g de K5NS epimerizado para obtener un peso molecular de aproximadamente 6.500 Da. Se llevó a cabo la sulfatación parcial correspondiente a la etapa e) del ejemplo 1 usando una relación molar de 0,6 entre el agente sulfatante y el sustrato K5 N-sulfatado epimerizado en un tiempo de incubación de 8 horas. Se llevó a cabo la O-desulfatación durante 30 minutos.

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El producto obtenido mostraba una actividad anti-Xa en plasma de 101 UI/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro de RMN-^{13}C obtenido según este ejemplo en la figura 11.

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Ejemplo 11

Separación de fracciones de polisacárido que tienen una gran afinidad por antitrombina III mediante selección en columna de afinidad

Se preparó un polisacárido según el ejemplo 1. Después de la etapa g) de N-resulfatación, se dejó pasar el producto a través de una columna afinidad como sigue:

Se cargaron 20 mg del producto obtenido en la etapa g) del ejemplo 1 en una columna de resina CNBr Sepharose 4B (Pharmacia), sobre la que se habían inmovilizado previamente según técnicas conocidas 100 mg de antitrombina III humana (Kedrion SpA, Lucca, Italia), en tampón Tris-HCl 10 mM a pH 7,4 y NaCl 0-0,15 M a 4ºC. Después de un periodo de 60 minutos de unión, se lavó la columna con al menos 3 volúmenes de tampón Tris-HCl 10 mM pH 7,4.

Se eluyeron las moléculas unidas con mayor afinidad a la columna añadiendo un gradiente de Tris HCl 10 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 2 M.

Se diafiltró el material eluido por una membrana en espiral de 1.000 Da de corte para eliminar las sales y se concentró por liofilización.

El producto final mostraba un peso molecular de 8.500 Da y una actividad anti-Xa en plasma de 300 UI/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro de RMN-^{13}C en la figura 12.

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Ejemplo 12

Producción de heparinas biotecnológicas que tienen un bajo peso molecular de aproximadamente 6.000 Da

Se repitió el ejemplo 5 pero, después de la etapa de N-resulfatación, se despolimerizó el producto en las mismas condiciones que se describen en la etapa d) del ejemplo 1.

El producto final obtenido tenía un peso molecular de aproximadamente 6.000 Da y una actividad anti-Xa en plasma de 65 UI/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro de RMN-^{13}C en la figura 13.

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Ejemplo 13

Producción de heparinas biotecnológicas: control de las condiciones de sulfatación

Se repitió el ejemplo 1 variando la O-sulfatación (etapa e) del ejemplo 1, que se llevó a cabo con una relación molar de 5 entre el agente sulfatante y el sustrato K5 sulfatado epimerizado durante 8 horas a 50ºC.

El producto obtenido mostraba una actividad anti-Xa en plasma de 75 UI/mg. Se muestra el espectro de RMN-^{13}C en la figura 14.

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Ejemplo 14

Preparación de K5-OS6OSNH_{2},epi (intermedio no resulfatado de heparina biotecnológica)

Se repitió el ejemplo 1 sin la última etapa de resulfatación.

El producto final tenía un peso molecular de aproximadamente 6.000 Da y una actividad anti-Xa de 5 UI/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro de RMN-^{13}C en la figura 15.

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Ejemplo 15

Preparación del intermedio K5-OS,NH_{2},epi (intermedio de heparina biotecnológica antes de las etapas de desulfatación, 6O-sulfatación y N-resulfatación)

Se repitió el ejemplo 1 variando las condiciones de O-sulfatación parcial (etapa e) del ejemplo 1, ya que se llevó a cabo con una relación molar de 5 entre el agente sulfatante y los hidroxilos del sustrato K5 N-sulfatado epimerizado durante 8 horas a 50ºC y sin las etapas posteriores de desulfatación, 6O-sulfatación parcial y N-resulfatación.

El producto K5-OSNH_{2}-epi obtenido tenía un peso molecular de aproximadamente 6.000 Da, una sulfatación de 95% de los hidroxilos y una actividad anti-Xa de 8 UI/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro de RMN-^{1}H de protón en la figura 16.

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Ejemplo 16

Producción de heparinas biotecnológicas con peso molecular de aproximadamente 6.000 Da

Se llevó a cabo el ejemplo 1 con las siguientes etapas:

a)

preparación del polisacárido N-acetilheparosano a partir de K5 de Escherichia coli,

b)

N-desacetilación/N-sulfatación,

c)

epimerización,

d)

O-sulfatación parcial/O-desulfatación parcial,

e)

despolimerización controlada,

f)

6O-sulfatación parcial/N-resulfatación parcial,

en las que las condiciones de las etapas a)-c) corresponden a las descritas en las etapas respectivas del ejemplo 1 y en las que las etapas d) y e) están en orden invertido con respecto a las mismas etapas del ejemplo 1.

El producto final obtenido tenía un peso molecular de aproximadamente 6.000 Da y una actividad anti-Xa en plasma de 95 UI/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro de RMN-^{13}C en la figura 17.

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Ejemplo 17

Determinación de la actividad biológica de los productos obtenidos según la invención

Medida de la actividad anti-factor Xa: se estimó la actividad anti-factor Xa según un procedimiento cromogénico (kit de heparina Coatest, Chromogenix). Se efectuó la medida en plasma humano normal, usando como reactivos el sustrato cromogénico S2222 (Chromogenix), factor bovino Xa (Chromogenix) y antitrombina III humana (Chromogenix). Se efectuó la reacción a 37ºC en un coagulómetro ACL 9000 (International Laboratory) y se realizó la lectura a 405 nm. Se muestran los resultados en la tabla 2. Se han resumido en la tabla 1 los resultados obtenidos según técnicas conocidas (particularmente los productos de los procedimientos preparados como se describe en los documentos WO 01/72848 y WO 02/50125), en que se han reseñado los datos de la bibliografía para heparina extractiva (Fareed J y col. Exp. Opin. Invest. Drugs, 1997, 6: 705-733).

Actividad anti-factor IIa: Se estimó la actividad anti-factor IIa en plasma humano normal según el siguiente protocolo:

Se mezclaron 30 \mul de antitrombina III humana a 0,5 U/ml (Chromogenix) con 30 \mul de una disolución de la muestra a investigar a diferentes concentraciones y con 60 \mul de trombina bovina a 5,3 ncat/ml (Chromogenix).

Se incubó la disolución durante 70 segundos a 37ºC y se añadieron entonces 60 \mul del sustrato cromogénico S-2238 (Chromogenix). Se registró la reacción durante 90 segundos con una lectura cada segundo a 405 nm usando un coagulómetro ACL 9000 (International Laboratory). Se han resumido en la tabla 1 los resultados obtenidos con productos conocidos (principalmente productos del proceso descrito en los documentos WO 01/72848 y WO 02/50125).

Resistencia a la heparinasa: Se estimó la resistencia a la heparinasa I preparando muestras de alto y bajo peso molecular en tampón Tris HCl 20 mM, NaCl 50 mM, CaCl_{2} 4 mM y 0,01% de BSA a pH 7,5 a una concentración final de 0,02%.

Se añadieron 20 unidades de heparinasa I (Sigma, nº CAS 52227-76-6) a una disolución de 100 \mul que contenía la muestra y se incubó la reacción a 25ºC. Se detuvo entonces la reacción mediante la adición de HCl 50 mM a intervalos regulares cada 10 min, 1 hora, 2 horas y 20 horas.

Se analizó cada muestra mediante determinación espectrofotométrica a 235 nm y por GPC-HPLC para determinar el peso molecular. Se muestran en la tabla 3 los resultados obtenidos, en los que puede observarse que, aunque las heparinas extractivas usadas en el estudio tanto de alto (HMW) como de bajo peso molecular (fraxiparina, Sanofi) se han degradado a largo plazo como se muestra por la reducción del peso molecular, las heparinas biotecnológicas obtenidas según esta invención son estables (el peso molecular es estable incluso después de 20 horas de tratamiento con heparinasa I).

Actividad TFPI: Se realizó la determinación in vitro de la actividad basada en el factor TFPI en células HUVEC según el procedimiento descrito en Gori AM. y col. Thromb. Haemostasis 1999: 81: 589-93 y se realizó la comparación con una heparina comercial no separada (tabla 4).

Inhibición de la generación de proteasas: Se efectuó la determinación de la inhibición de proteasas en plasma desprovisto de fibrinógeno según el procedimiento reseñado en Fareed y col. Path. Haem. Thromb. 2002; 32 (3): 56-65.

Después de añadir diversas diluciones de las muestras bajo examen, se activó el plasma añadiendo TP (tromboplastina C) para la activación del sistema de coagulación intrínseco o TTPA (Dade Actin) para la activación del sistema de coagulación intrínseco.

Se controló la inhibición de trombina (factor II) y de factor Xa usando un coagulómetro ACL 9000 (International Laboratory). Se muestran en la tabla 5 los valores obtenidos con una dilución de muestra de 50 \mug/ml.

Afinidad con el factor PF4: Se evaluó la determinación de la afinidad por el factor PF4 (factor de plaquetas 4) en plasma determinando la actividad anti-Xa residual después de la adición de una cantidad fija de factor PF4 a la disolución que contiene las heparinas biotecnológicas obtenidas según la invención.

Se añadieron 100 \mug de plasma que contenía 0,8 UI anti-Xa/ml, obteniendo una concentración final de PF4 de 10 \mug/ml. Se midió la actividad anti-Xa residual de la muestra usando un kit de heparina Coatest (Chromogenix) mediante el coagulómetro ACL 9000 (International Laboratory). Se midió la actividad anti-Xa residual como porcentaje de la actividad inicial (tabla 6).

Medida del tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA): Se efectuó la determinación del TTPA mediante un ensayo de coagulación usando un coagulómetro ACL 9000 (International Laboratory). Se llevó a cabo la reacción a 37ºC añadiendo una cantidad de cefalina (kit APTT International Laboratory cod. 8468710) a la muestra debidamente diluida y siguiendo la formación de coágulo después de la adición de cloruro de calcio y lectura del resultado a 660 nm.

Se reseñan los valores de TTPA en la tabla 2 como porcentaje de la actividad con respecto al primer patrón internacional de heparina de bajo peso molecular 85/600.

Determinación de la actividad de cofactor II de heparina (HCII): se llevó a cabo la determinación de HCII preparando una mezcla de reacción que contenía 20 \mul de HCII (Stago) a 0,085 UEP/ml, 80 \mul de disolución de la muestra bajo examen a diferentes concentraciones, 50 \mul de trombina a 0,18 U/ml (Boehringer) en tampón tris 0,02 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M y 0,1% de PEG 6000. Se incubó la disolución durante 60 segundos a 37ºC, se añadieron entonces 50 \mul de sustrato cromogénico Spectrozyme 1 mM (American Diagnostic). Se controló la reacción durante 180 segundos a intervalos de 1 segundo a 405 nm de longitud de onda en un coagulómetro automático ACL 9000 (Instrumentation Laboratory).

Se reseñan los valores de HCII en la tabla 2 como porcentaje de actividad con respecto al primer patrón internacional de heparina de bajo peso molecular 85/600.

En la tabla 1 y 2, se encuentran los datos de actividad biológica de heparinas biotecnológicas producidas según la invención, o según procedimientos caracterizados por O-supersulfatación independientemente del uso de disolventes donantes o no donantes de grupos formilo tales como N,N-dimetilformamida y por una etapa de despolimerización final, o de heparinas extractivas. Los datos muestran en particular que la actividad anti-Xa medida en plasma humano es mayor para los productos obtenidos según este proceso que para los productos de la técnica anterior a un peso molecular comparable.

De hecho, en los productos obtenidos según la invención, la relación entre actividad biológica expresada como actividad anti-factor X y peso molecular es mayor. Dicho aumento parece ser debido a las peculiaridades combinadas del proceso:

-

O-sulfataciones (O-sulfatación y 6O-sulfatación) efectuadas en condiciones suaves (véanse los ejemplos 5 y 7 para comparación);

-

uso de un disolvente aprótico polar no donante de grupos formilo durante las etapas de O-sulfatación y 6O-sulfatación (véanse los ejemplos 1 y 2 para comparación);

-

etapa de despolimerización intermedia, que se efectúa antes de las etapas de O-sulfatación o 6O-sulfatación, comparada con la despolimerización llevada a cabo al final del proceso (véanse los ejemplos 1 y 12 para comparación).

Se obtiene un aumento mayor de la relación entre la actividad biológica, considerada como actividad anti-Xa, en plasma y el peso molecular del producto obtenido, así como de la relación entre la actividad anti-Xa, cuando las O-sulfataciones (O-sulfatación y 6O-sulfatación) son parciales, junto con el uso de un disolvente aprótico polar no donante de grupos formilo para O-sulfatación y 6O-sulfatación acoplados a despolimerización efectuada en una fase intermedia como en el ejemplo 1 y el ejemplo 6.

Sin embargo, el proceso es compatible también con una O-sulfatación mayor combinada con una 6O-sulfatación parcial, como se describe en el ejemplo 13.

Además, el proceso de la invención es también compatible con una despolimerización final como se describe en el ejemplo 12.

Es un parámetro adicional mejorado en los productos de la invención, en comparación con las heparinas biotecnológicas obtenidas según el procedimiento conocido, la relación entre actividad anti-Xa y actividad anti-IIa, que indica una relación entre las características antitrombóticas y anticoagulantes, resultando también valores de TTPA que son similares al valor de heparinas extractivas.

En los productos obtenidos según la invención, dicha relación es mayor o igual a 1, mientras que es menor a 1 en productos obtenidos según procesos de la técnica anterior. Otra característica mostrada por los altos valores de HCII es una mayor capacidad de inhibir directamente la trombina, en comparación con heparinas extractivas.

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Ejemplo 18

Producción de heparinas biotecnológicas con peso molecular de aproximadamente 6.000 Da.

Se llevó a cabo el ejemplo 1 según las siguientes etapas:

a)

preparación del polisacárido N-acetilheparosano partiendo de K5 de Escherichia coli,

b)

N-desacetilación/N-sulfatación,

c)

epimerización,

d)

O-sulfatación parcial/O-desulfatación parcial,

e)

N-resulfatación,

f)

despolimerización controlada,

g)

6O-sulfatación parcial

en las que las condiciones de las etapas a)-c) corresponden con las descritas en las etapas respectivas del ejemplo 1, menos las etapas d)-g) que están en orden invertido con respecto a las mismas etapas del ejemplo 1.

El producto final obtenido tenía un peso molecular de aproximadamente 6.000 Da, y una actividad anti-Xa en plasma de 92 UI/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro de RMN de protón en la figura 18.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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5

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\cr \cr
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6

7

TABLA 3 Ensayo comparativo de la hidrólisis por heparinasa de heparinas biotecnológicas y extractivas

8

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TABLA 4 Ensayo de liberación de factor TFPI de células HUVEC in vitro

9

TABLA 5 Ensayo de inhibición de la generación de proteasa (trombina y factor Xa)

10

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TABLA 6 Ensayo de afinidad por el factor PF4

11

Claims (59)

1. Proceso para la preparación de un sulfato de glucosaminoglucano a partir de un N-acetilheparosano, que comprende las siguientes etapas:

a)

N-desacetilación y N-sulfatación de un polisacárido N-acetilheparosano aislado de una cepa bacteriana natural o recombinante, en el que dicho polisacárido N-acetilheparosano se aísla de K5 de E. coli;

b)

epimerización enzimática mediante la enzima glucuronil C5-epimerasa;

c)

O-sulfatación parcial combinada con O-desulfatación parcial;

d)

6O-sulfatación parcial;

e)

N-resulfatación

que comprende además una etapa de despolimerización controlada efectuada como alternativa después de la etapa b), c) o d) y

en el que dicho proceso se caracteriza por el hecho de que la O-sulfatación parcial en la etapa c) se efectúa durante menos de 10 horas y con una relación molar entre el agente sulfatante y el N-acetilheparosano menor o igual a 5, y por el hecho de que la 6O-sulfatación parcial (etapa d) se efectúa durante un tiempo menor o igual a 2 horas y usando una relación molar entre agente sulfatante y grupos hidroxilo de N-acetilheparosano menor o igual a 2.

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2. El proceso según la reivindicación 1, en el que las etapas d) y e) se efectúan en orden inverso.

3. Proceso según las reivindicaciones 1-2, en el que la despolimerización intermedia se lleva a cabo después de la etapa b) de epimerización.

4. Proceso según las reivindicaciones 1-2, en el que la O-sulfatación según la etapa c) se lleva a cabo con una relación molar entre el agente sulfatante y el N-acetilheparosano menor de 2,5.

5. Proceso según la reivindicación 4, en el que dicha relación molar es menor o igual a 1,5.

6. Proceso según las reivindicaciones 4-5, en el que se efectúa la O-sulfatación parcial (etapa d) durante un tiempo menor o igual a 6 horas.

7. Proceso según la reivindicaciones 1-6, en el que la O-sulfatación parcial (etapa d) se lleva a cabo usando una relación molar entre el agente sulfatante y los grupos hidroxilo de N-acetilheparosano menor o igual a 1,5.

8. Proceso según la reivindicación 7, en el que la 6O-sulfatación parcial ((etapa d) del proceso) se efectúa durante un tiempo menor o igual a 60 minutos.

9. Proceso según la reivindicación 8, en el que la sulfatación se lleva a cabo durante un tiempo menor o igual a 30 minutos.

10. Proceso según las reivindicaciones 1-9, caracterizado por el hecho de que comprende una etapa de selección por afinidad f) adicional sobre matrices de unión a antitrombina III o fragmentos de la misma.

11. Proceso según las reivindicaciones 1-10, en el que la sulfatación parcial según la etapa c) y la 6O-sulfatación parcial según la etapa d) se llevan a cabo usando un agente sulfatante seleccionado del grupo consistente en: trietilamina-SO_{3}, trimetilamina-SO_{3}, piridina-SO_{3} en un disolvente aprótico.

12. Proceso según la reivindicación 11, en el que dicho disolvente aprótico polar no es donante de grupos formilo.

13. Proceso según la reivindicación 11, en el que dicho disolvente aprótico polar se elige entre: tetrametilensulfona, 2,4-dimetilsulfolano, N,N-dimetilacetamida o N,N-dietilacetamida.

14. Proceso según las reivindicaciones 1-13, en el que la 6O-sulfatación parcial (etapa d) se efectúa a una temperatura comprendida entre 4 y 30ºC.

15. Proceso según la reivindicación 14, en el que dicha temperatura está comprendida entre 10ºC y 25ºC.

16. Proceso según las reivindicaciones 1-15, en el que la despolimerización controlada intermedia se efectúa mediante procedimientos químicos o físicos.

17. Proceso según la reivindicación 16, en el que dichos procedimientos físicos comprenden un tratamiento con rayos gamma y en el que dichos procedimientos químicos comprenden: un tratamiento con ácido nitroso o sales del mismo, o una eliminación beta o un ácido periódico o un tratamiento con radicales libres.

18. Proceso según la reivindicación 17, en el que se efectúa la despolimerización mediante tratamiento con ácido nitroso o sales de mismo.

19. Proceso según la reivindicación 18, en el que la relación entre el ácido nitroso o sales del mismo y el polisacárido está comprendida entre 1 y 100 mg de sal por g de polisacárido, y la reacción se efectúa a una temperatura comprendida entre 4 y 10ºC.

20. Proceso según la reivindicación 19, en el que la despolimerización controlada se efectúa durante un tiempo menor de 30 minutos y en presencia de ácido nitroso o sales del mismo.

21. Proceso según la reivindicación 20, en el que la sal de ácido nitroso es nitrito de sodio.

22. Proceso según las reivindicaciones 16-21, en el que se termina la despolimerización mediante la adición de un exceso molar de borohidruro.

23. Proceso para la preparación de glucosaminoglucanos sulfatados derivados de N-acetilheparosano que comprende las siguientes etapas:

a)

N-desacetilación y N-sulfatación de un polisacárido N-acetileheparosano aislado a partir de una cepa bacteriana natural o recombinante de E. coli K5,

b)

epimerización enzimática por glucuronil C5-epimerasa,

c)

O-sulfatación parcial combinada con O-desulfatación parcial,

d)

6O-sulfatación parcial,

que comprende además una etapa intermedia de despolimerización controlada efectuada como alternativa después de la etapa b), c) o d)

en el que dicho proceso se caracteriza por el hecho de que la O-sulfatación parcial de la etapa c) se lleva a cabo durante un tiempo menor o igual a 10 horas y usando una relación molar entre agente sulfatante y N-acetilheparosano menor o igual a 5, y por que la 6O-sulfatación parcial (etapa d) se efectúa durante un tiempo menor o igual a 2 horas y con una relación molar entre el agente sulfatante y el N-acetilheparosano menor o igual a 2, y porque las O-sulfataciones de las etapas c) y d) se efectúan con un agente sulfatante seleccionado entre: trietilamina-SO_{3}, trimetilamina-SO_{3} y piridina-SO_{3} en un disolvente aprótico.

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24. Proceso según las reivindicaciones 1-23, caracterizado por que la reacción de C5-epimerización (etapa c) se lleva a cabo a una temperatura menor de 35ºC y en el que la glucuronil C5-epimerasa extractiva o recombinante se inmoviliza en la fase estacionaria.

25. Proceso según la reivindicación 24, en el que dicha C5-epimerasa recombinante es una enzima de ratón expresada en células de insecto o levadura.

26. Proceso según la reivindicación 25, en el que dicha temperatura está comprendida entre 15 y 30ºC.

27. Proceso según la reivindicación 26, en el que dicha temperatura está comprendida entre 20 y 25ºC.

28. Proceso según la reivindicación 24, en el que la fase estacionaria es una resina poliestirénica o polimetacrílica con grupos epoxídicos o diólicos activados con CNBr y por que la inmovilización de C5-epimerasa se lleva a cabo en un tampón que comprende NaHCO_{3} a una concentración de 100 a 300 mM o en tampón fosfato a una concentración de 10 a 50 mM a un pH de 7,0 a 8,3 a una temperatura comprendida entre 4 y 25ºC durante un tiempo comprendido entre 12 y 72 horas.

29. Proceso según las reivindicaciones 24-28, en el que la epimerización de la etapa c) se lleva a cabo en tampón HEPES que comprende: EDTA de 10 a 30 mM, CaCl_{2} de 70 a 150 mM y con un pH de 5,5 a 8,0.

30. N-acetilheparosano modificado obtenible por el proceso según las reivindicaciones 1-29.

31. N-acetilheparosano modificado según la reivindicación 30 con un peso molecular menor o igual a 15.000 Da.

32. N-acetilheparosano modificado según la reivindicación 31 con un peso molecular comprendido entre 3.000 y 9.000 Da.

33. N-acetilheparosano modificado obtenible mediante el proceso según la reivindicación 12, caracterizado por la ausencia de grupos formilo en la molécula.

34. N-acetilheparosano modificado según las reivindicaciones 30-33, caracterizado por el hecho de que porta en el extremo reductor un residuo de 2,5-anhidromanitol sulfatado.

35. N-acetilheparosano según la reivindicación 34, en el que los grupos hidroxilo en posiciones 1, 3 y 6 del anhidromanitol están parcialmente sulfatados.

36. N-acetilheparosano según la reivindicación 35, en el que el anhidromanitol está parcialmente sulfatado en los hidroxilos en posiciones 1 y 6.

37. N-acetilheparosano K5 OS 6OS NS-epi según la reivindicación 36, en el que el grado de sulfatación de los grupos hidroxilo en posición 1 está comprendido entre 20 y 85%.

38. N-acetilheparosano K5 OS 6OS NS-epi según la reivindicación 36, en el que el grado de sulfatación de los grupos hidroxilo en posición 6 de la glucosamina es mayor de un 40%.

39. N-acetilheparosano K5 OS 6OS NS-epi según la reivindicación 38, en el que dicho grado de sulfatación está comprendido entre 50 y 85%.

40. N-acetilheparosano según la reivindicación 35, en el que el grado de sulfatación de los grupos hidroxilo en posición 3 de la glucosamina es menor de un 60%.

41. K5 OS 6OS NH_{2},epi obtenible mediante el proceso según la reivindicación 23.

42. K5 OS NH2-epi obtenible mediante el proceso según la reivindicación 23, etapas a)-c).

43. N-acetilheparosano modificado según las reivindicaciones 30-40, caracterizado por una actividad anti-factor Xa medida en presencia de plasma mayor o igual a 50 UI/mg.

44. N-acetilheparosano modificado según la reivindicación 43, caracterizado por una relación entre las actividades de inhibición del factor Xa y el factor IIa mayor o igual a 1,0.

45. N-acetilheparosano modificado según la reivindicación 43, caracterizado por una actividad de activación de TFPI mayor o igual en comparación con heparinas extractivas.

46. N-acetilheparosano modificado según la reivindicación 43, caracterizado por que tiene una resistencia a heparinasa I mayor que las heparinas extractivas.

47. N-acetilheparosano modificado según la reivindicación 43, caracterizado por que inhibe la generación de las proteasas trombina y factor Xa.

48. N-acetilheparosano modificado según la reivindicación 43, caracterizado porque tiene una menor afinidad por el factor PF4 en comparación con heparinas extractivas.

49. N-acetilheparosano modificado según la reivindicación 43, caracterizado por una actividad HCII mayor que las heparinas extractivas.

50. N-acetilheparosano modificado según las reivindicaciones 43-49, caracterizado por la presencia de múltiples señales en un espectro de RMN-^{13}C en exceso en comparación con las señales de anhidromanitol en la región comprendida entre 79 y 89 ppm, por la ausencia de señales a 51 a 165 ppm y por la ausencia de señales en la región de 7-9,5 ppm del espectro de RMN-^{1}H.

51. N-acetilheparosano modificado según las reivindicaciones 30-40 y 43-50 para uso farmacéutico.

52. Uso del producto según la reivindicación 51 para la preparación de un medicamento con actividad antitrombótica y anticoagulante similar a heparina.

53. Uso del producto según la reivindicación 51 para la preparación de un medicamento con actividad profibrinolítica y antiagregante.

54. El uso según la reivindicación 52 para la preparación de un medicamento para la profilaxis y el tratamiento de angina inestable, infarto de miocardio, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar y eventos isquémicos.

55. Uso según las reivindicaciones 52-53 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de sepsis y de sus complicaciones tales como coagulación intravascular diseminada (CID).

56. Uso según la reivindicación 53 para la preparación de un medicamento para la profilaxis y el tratamiento de angina inestable, infarto de miocardio agudo, trombosis venosa y arterial, embolia pulmonar, eventos isquémicos o arteriosclerosis.

57. Uso según las reivindicaciones 51-52 para la preparación de un medicamento para la profilaxis y el tratamiento de eventos tromboembólicos debidos a una falta congénita o adquirida de antitrombina III.

58. Composición farmacéutica que comprende como principio activo cualquiera de los productos según las reivindicaciones 30-40 y 43-50 en combinación con excipientes y/o diluyentes adecuados.

59. Composición farmacéutica según la reivindicación 58 en una composición adecuada para administración oral.