CN1832966A - 具有在血浆中高抗血栓活性的多糖衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由乙酰N－肝素样物质制备硫酸化葡糖氨基聚糖的方法，包含：a)将从天然或重组细菌株源，优选大肠杆菌K5(K5 E.coli)中分离出的N－乙酰肝素样物质(N－acetylheparosans)多糖N－去乙酰化和N－硫酸化；b)通过葡糖醛酸基C5－差向异构酶进行酶(glucuronyl C5－epimerase enzyme)差向异构化；c)将部分O－硫酸化后部分O－去硫酸化；d)部分6－O硫酸化；e)N－硫酸化和一个中间受控解聚过程，其特征为两个O－硫酸化(O－硫酸化和6O－硫酸化)都是部分的。本发明进一步涉及根据本方法所得产物显示抗Xa和抗IIa活性比大于或等于1.0；还涉及含有所述产物与合适的药学上可以接受的辅料和/或稀释剂结合的组合物。

Description

具有在血浆中高抗血栓活性的多糖衍生物
技术领域
本发明领域涉及从微生物源制备具有抗凝血和抗血栓活性的硫酸化多糖。
背景技术
天然肝素是一种具有葡糖胺聚糖结构(glycosaminoglycanic structure)的聚合物，其具有3000到30000Da不定的分子量，由重复双糖单元序列构成，此重复双糖单元序列由糖醛酸(左旋艾杜糖醛酸或右旋葡糖醛)和一个氨基糖(葡糖胺)通过β-1-4键相互结合。糖醛酸能在2位被硫酸化，氨基葡糖(glucosamine)能被N-乙酰化或N-硫酸化和6-＝-硫酸化。进一步，氨基葡糖也能在3位包含一个硫酸基。
这些取代基都是建立与抗凝血酶(ATIII)的高亲和性结合区所必需的，也详细解释了这种聚合物的抗凝血和抗血栓活性。
肝素是治疗用途中基本的抗凝血和抗血栓剂，并且，甚至直到现在，肝素是通过从动物器官中提取而得到的。为了替代这种供应源，并且满足对该材料增长的需求，同时消除来自传染介质(主要是病毒或蛋白酶传染性因子)的任何意外污染，在近几年开发了各种方法从细菌源的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)多糖开始，制备有肝素样结构和相似特性的分子，因而，其可以无限量得到。
N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)多糖是从一些天然或重组体的K5大肠杆菌(K5Escherichia Coli)或从出血败血型巴斯德氏菌种(Pasteurella multocida)中分离出的，其具有与天然肝素前体基本相同的结构，由一个重复的右旋葡糖醛酸和N-乙酰基葡糖胺序列构成，右旋葡糖醛酸和N-乙酰基葡糖胺由α1-4键相互键合。相反，此键在双糖单元之间为β-1-4。
糖醛酸可以在两个不同的位置被硫酸化，葡糖胺(glucosamine)可以被N-乙酰化或N-硫酸化和6-O-硫酸化。进一步，葡糖胺也能含有在3位的一个硫酸基。
从K5大肠杆菌(E.Coli K5)(Vann W.F.，Schmidt M.A.，Jann B.，Jann K.在(1981)Eur.J.Biochem 116，359-364)中分离出的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)多糖，被如Lormeau等在美国专利号5,550,116和Casu等(Carb.Res 263-1994-271-284)所述被化学改性，或以化学和酶的方法尝试得到有生物活性的产物，此产物的活性能与提取的肝素相比。
而且，半合成产物必须经受一个解聚过程来减少分子量，以使产物适合不同的治疗应用，特别是此产物提高了生物利用度并减少了因使用和其他副反应伴随的出血风险。
细菌多糖的化学和酶变性在例如意大利专利号IT1230785种被描述，其中K5多糖被N-去乙酰化和N-硫酸化；然后其经历了葡糖醛酸的C5酶的差向异构化。这些转化后进行其它转化，即糖醛酸和氨基糖上的酶硫酸化。
专利申请号WO92/17509描述了从K5多糖通过N-去乙酰化，N-硫酸化和C5酶差向异构化，然后是化学O-硫酸化或任选的N-硫酸化的制备肝素样产物方法。
专利申请号WO 96/14425和美国专利号5,958,899描述了一种制备有高含量艾杜糖醛酸的K5多糖衍生物的方法。其通过N-去乙酰化和N-硫酸化，酶差向异构化到葡糖醛酸中含有超过50％的艾杜糖醛酸，其使用改良的缓冲剂以得到一个关键性的粘度，随后是通过硫酸化糖醛酸和葡糖胺(glucosamine)的游离羟基中的至少一些羟基得到的。
专利申请WO97/433117和美国专利6,162,797描述了制备高抗凝血和抗血栓活性的K5衍生物的方法。其通过将葡糖醛酸N-去乙酰化和N-硫酸化，酶差向异构化，和O-超硫酸化和N-再硫酸化得到。
专利申请WO 98/42754，美国专利6,197,943和Naggi A.等在CarbohydrateResearch 336(2001)283-290描述了制备含高抗血栓体外活性的K5多糖衍生物的硫酸化葡糖氨基聚糖(glycosaminoglycans)的方法，其通过对超硫酸化前体的溶剂分解去硫酸化和任选的6-O再硫酸化获得。
专利申请WO 0172848和WO 02/50125描述了一种从高抗凝血和抗血栓活性的k5多糖衍生物制备葡糖氨基葡聚糖(glycosaminoglycans)衍生物的方法。此方法包括以下步骤：a)N-去乙酰化b)N-硫酸化c)酶差向异构化艾杜糖醛酸中的葡糖醛酸d)超硫酸化e)部分化学去硫酸化f)任选的6-O再硫酸化。此方法的特征为使用截短形式的，溶液中的或固定化的C5葡糖醛酸糖苷差向异构酶。此外，美国专利09/732,026和Li等在J.Biol.Chem，vol 276，213(2001)20069-20077发现了一种用于表达C5差向异构酶的新型小鼠基因，该酶在N-末端含有附加序列，此序列能产生完全形式的酶，它相对于前者有更高的活性/稳定性。
本发明总结
本发明涉及一种从乙酰N-肝素样物质(acetyl N-heparosane)制备硫酸化葡糖氨聚糖(glycosaminoglycans)衍生物的方法，包括以下步骤：
a)将从天然或重组细菌源中分离出的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)多糖N-去乙酰化和N-硫酸化，
b)通过C5-差向异构化酶葡糖醛酸糖基酶(C5-epimerase glucuronil enzyme)进行酶差向异构化，
c)将部分O-硫酸化和部分O-去硫酸化结合
d)部分6-O硫酸化
e)N-再硫酸化
进一步包括一种中间控制的解聚步骤，此步骤可任意在步骤b)，c)或d)之后进行，其中此过程特征为c)步骤中的部分O-硫酸化在进行中使用的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)的硫酸化剂/羟基剂的摩尔比小或于等于5，优选小于2.5，更优选小于1.5；步骤d)的部分6-O硫酸化的进行中使用的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)的硫酸化剂/羟基剂的摩尔比小于等于2。
根据优选的实施例，中间解聚在b)步骤的差向异构化之后进行。
部分O-硫酸化和部分6-O硫酸化用选自以下的硫酸化剂进行：质子惰性的极性溶剂中的三乙胺-SO3，三甲胺-SO3，吡啶-SO3，质子惰性的极性溶剂优选非甲酰基供体，例如四亚甲基砜(tetramethylen-sulfone)，2，4-二甲基硫杂环戊烷(2，4-Dimethylsulfolane)，N，N，-二甲基乙酰胺(N，N，-Dimethylacetamide)或N，N，-二乙基乙酰胺(N，N，-diethylacetamide)。任选地，此方法可以包括一个在携带有抗凝血酶III或其片段的基质上的亲和力选择步骤。。
本发明还涉及根据所述方法得到的医药用途的硫酸化葡糖氨基聚糖(glycosaminoglycans)K5OS6OSNS-epi。此产物的特征为高于40％的6-O硫酸化度，并且优选包含非常接近于提取出的肝素值的50％-85％；在还原端还存在一个失水甘露醇残基，优选硫酸化在1，3和6位。其另一特征为失水甘露醇1和6位上羟基的硫酸化度大于或等于20％，而且根据优选，氨基糖上完全不存在甲酰基。
根据本发明，硫酸化葡糖氨基聚糖(glycosaminoglycans)显示在血浆中抗Xa的生物活性高于背景技术所述方法得到的生物技术肝素，且抗Xa活性和抗IIa活性的比例等于或大于1，近似于提取肝素。
根据本发明方法得到的产物：
a)能够释放血管内皮细胞中的组织因子抑制剂(TFPI)，此功能类似或更好于提取肝素，
b)显著拮抗水解酶如肝素酶I的降解，
c)能够抑制凝血酶和Xa因子蛋白酶的释放，
d)显示与PF4因子(血小板因子4)的低亲和力。
进一步，本发明涉及通过本发明方法得到的用于治疗用途的生物技术肝素(改性的N-乙酰肝素样物质)以涉及及包含此产物作为有效成分的药物组合物。更进一步，本发明涉及将所得用于制备药物的产物的用于制备具有抗凝血和抗血栓类肝素样活性药物，制备前体溶解纤维蛋白(profibrinolytic)和抗聚集药剂，制备预防和治疗先天性或后天性缺乏抗凝血酶III的血栓-栓塞(thrombo-embolytic)疾病的药物。
本发明进一步涉及制备携带氨基糖的氨族的O-硫酸化，K5OSNH2-epi和K5OS6OSNH2-ep中间体，该氨基糖的氨基优选不含甲酰基，所述中间体可被提取和用于制备N-硫酸化和/或N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosan)衍生物。
说明书附图
图1实施例1中所述硫酸化-表面异构化的K5多糖的端基异构体区域的1C-NMR光谱
图2实施例1中得到的产物的1H-NMR光谱
图3实施例2中得到的产物的1H-NMR光谱
图4实施例3中得到的产物的13C-NMR光谱
图5实施例4中得到的产物的13C-NMR光谱
图6实施例5中得到的产物的13C-NMR光谱
图7实施例6中得到的产物的13C-NMR光谱
图8实施例7中得到的产物的13C-NMR光谱
图9实施例8中得到的产物的13C-NMR光谱
图10实施例9中得到的产物的13C-NMR光谱
图11实施例10中得到的产物的13C-NMR光谱
图12实施例11中得到的产物的13C-NMR光谱
图13实施例12中得到的产物的13C-NMR光谱
图14实施例13中得到的产物的13C-NMR光谱
图15实施例14中得到的产物的13C-NMR光谱
图16实施例15中得到的产物的13C-NMR光谱
图17实施例16中得到的产物的13C-NMR光谱
图18实施例18中得到的产物的1H-NMR光谱
具体实施方式
根据主要方面，本发明涉及从N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)制备硫酸化葡糖氨基聚糖(glycosaminoglycans)衍生物的方法，以本发明目的取名为“生物技术肝素”，包括以下步骤：
a)将从天然或重组细菌源中分离出的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)多糖N-去乙酰化和N-硫酸化，
b)通过葡糖醛酸基C5-差向异构酶进行酶差向异构化，
c)将部分O-硫酸化和部分O-去硫酸化结合
d)部分6-O选择性硫酸化
e)N-再硫酸化
所述方法进一步包括一种中间控制的解聚步骤，此步骤可选择在步骤b)，c)或d)之后进行，所述方法的特征为O-硫酸化是部分的，所述c)步骤中使用的硫酸化剂和羟基底物(差向异构化的N-乙酰肝素样物质)的摩尔比小于等于5，优选小于等于2.5，更优选小于等于1.5，并且硫酸化时间小于10小时。根据步骤d)的部分6-O硫酸化的进行中使用的硫酸化剂和羟基底物(差向异构化的N-乙酰肝素样物质)的摩尔比小于等于2，优选小于等于1.5，并且硫酸化时间小于2小时，或优选小于等于90分钟，更优选小于等于60分钟，温度在4℃到30℃，优选10℃到25℃。
根据c)步骤的部分O-硫酸化和d)步骤的部分6-O硫酸化是在质子惰性的极性溶剂中用已知的硫酸化剂中进行的，该溶剂优选非甲酰基供体，更优选自：N，N，二烷基乙酰胺(更优选N，N，-二甲基乙酰胺(N，N，-Dimethylacetamide)或N，N，-二乙基乙酰胺(N，N，diethylacetamide))和硫杂环戊烷(sulpholans)(优选四亚甲基砜(tetramethylen-sulfon)或2，4-二甲基硫杂环戊烷(2，4-Dimethylsulfolane))。
非甲酰基供体有机溶剂部分硫酸化条件的组合使用使得产物特征为氨基糖上无甲酰基或其衍生物，而且硫酸基的分布与一种提取肝素相似。
根据本发明的方法，受控解聚作为中间步骤进行，这意味着可选择在步骤b)，c)或d)而不是如技术背景描述的在最终相进行。优选在步骤c)部分O-硫酸化之前或之后在表面差向异构的N-硫酸化肝素样物质多糖(N-sulphate heparosan)上进行。可以通过物理方法包括γ射线处理或通过化学方法包括用亚硝酸或其盐的β-γ处理，或者用过碘酸盐或自由基(a radicals treatment)处理。根据优选的方面，解聚剂为亚硝酸，多糖的用量为1-100mg盐/g多糖。反应温度为4℃到10℃。更优选，受控解聚在硝酸钠参与下进行少于30分钟，通过加入过量摩尔的硼氢化钠终止。
此中间解聚可得到一种低分子量产物，优选分子量小于等于15000Da，更优选3000到90000Da，此低分子量产物在还原端有一个脱水甘露醇残基，这显示除了6位羟基硫酸化，如同提取肝素，1和3位的羟基也硫酸化。
然而，此方法与在过程结束时的进一步解聚可以相容。已经观察到，当解聚在中间相进行时，最终产物有抗凝血和抗血栓活性，并且抗Xa和抗IIa之间的比意想不到地高于相同分子量的产物，此相同分子量产物是在硫酸化/去硫酸化和6O-硫酸化步骤之后的解聚得到的，如表1中数据所示。
根据优选实施例，N-乙酰多糖肝素样物质(N-acetyl polysaccharide heparosan)优选从大肠杆菌K5(E.coli K5)中得到。
此方法可以进一步和任选地包括一个由步骤a)-e)得到的产物富集的最终相，由Hook等在FEBS Lett 1976，66：90-93所述的在抗凝血酶III的亲合色谱构成。
N-去乙酰化和N-硫酸化根据背景技术所述方法进行，其中包含一个碱水解过程，温度为30℃到80℃，优选40℃到60℃，时间为10-30小时，优选15-20小时；随后用硫酸化剂处理12小时，温度20-65℃，硫酸化剂优选碳酸钠中的吡啶三氧化磺(pyridine-sulphotrioxide)。
b)步骤中的差向异构化用天然或重组葡醛酸糖基C5差向异构酶(glucuronil C5epimerase enzyme)进行，酶优选固定形式。
酶优选如WO98/48006专利所述重组体或更优选如美国专利09/732,026所述重组体。酶优选从自昆虫细胞或酵母菌株中表达和纯化，酵母菌株例如SaccharomycesCerevisiae，Pichia methanolica，Hansenula polymorpha，Saccharomyces pombe，Kluyveromices lactis，Kluyveromices lactis，Kluyveromices fragilis.
酶的固定化优选在CNBr琼脂糖凝胶4B树脂(Pharmacia)或聚甲基丙烯酸树脂或聚苯乙烯树脂上进行，环氧化基或二醇基用CNBr激活，在NaHCO3 100-300mM缓冲液或磷酸盐10-50mM缓冲液中进行，pH7.0-8.3，优选pH7.2-7.8，温度4-25℃，时间12-72小时。
根据更优选实施例，差向异构化反应发生在温度不高于35℃，优选15℃到30℃，更优选20℃到25℃。
差向异构化根据已知方法进行，例如专利WO 01/72848所述方法，优选温度不高于35℃，进一步优选15℃到30℃，更优选20℃到25℃。
差向异构化缓冲液优选羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液(优选浓度25mM)，pH值在5,5-8.0之间，更优选pH值6,5-7,0之间。进一步包含N-去乙酰化和N-硫酸化多糖，EDTA 10-30mM，优选15-25mM，CaCI2(或可选择的其他二价阳离子盐，例如Zn2+，Ba2+，Mg2+，Mn2+，)浓度在70-150mM，更优选75-100mM。溶液保持恒温，温度为15℃到30℃(更优选优选20℃到25℃)，优选在流量30-240ml/小时循环，时间为1-24小时。柱优选含有1,2×107到3×1011cpm当量的固定化在惰性恒温载体上的酶。
如前确定的操作条件，特别是预选温度，可稳定差向异构C5酶近千个小时，显著节约制备差向异构化柱所用的时间和试剂。方法中的部分O-硫酸化(步骤c)使用已知的质子惰性极性溶剂中的硫酸化剂，如三乙胺-SO3，三甲胺-SO3，吡啶-SO3，优选溶剂为非甲酰基供体。进行中的硫酸化剂和羟基底物的摩尔比小于等于5或优选小于等于2.5或更优选小于1.5，时间小于等于10小时，优选小于等于8小时，更优选1到6小时，温度20-70℃，优选30-60℃。
部分O-硫酸化之后为部分去硫酸化，用去硫酸化剂如甲醇中的DMSO处理，时间为10到240分钟，温度45-90℃。
每一个步骤也能够根据已知方法包含沉淀作用和/或中间体多糖去盐。
部分6O-硫酸化(步骤d)通过加硫酸化剂和羟基底物得到，两者摩尔比小于等于2或优选小于1.5，时间小于等于2小时，或优选小于等于90分钟，优选温度4℃到30℃，更优选10℃到25℃，反应在质子惰性极性溶液中进行，优选非甲酰基供体。根据可选择实施例的方法，部分6O-硫酸化(步骤d)是在N-再硫酸化之后进行的，而且步骤d)和步骤e)顺序可以倒置。
N-再硫酸化(步骤e)优选在碳酸盐缓冲液中进行，加入已知的硫酸化剂，如三乙胺-SO3，三甲胺-SO3，吡啶-SO3。
总结，本发明的过程显示了以下创新元素：部分O-硫酸化(O-硫酸化和6O-硫酸化)，解聚在中间进行而非最终步骤，此外，部分O-硫酸化和6O-硫酸化反应在质子惰性极性溶液中进行，优选非甲酰基供体溶剂。
根据本发明所述得到的N-乙酰-肝素样物质(N-acetyl-heparosane)衍生物与根据著名的背景技术描述的方法而得的生物技术肝素相比，显示出特有的结构和生物学差异。
从化学观点看本发明的多糖被定义为多糖链混合体，如下通式(I)所示
通式(I)
Figure A20048002230700111
其中n为3-150，R1可以是氢，SO3基或乙酰基，R1不表示其他功能基团，例如甲酰基。R1，R2，R3，R4和R5可以是氢或SO3基，优选R1，R2，R3，R4，R5可以被下述取代：
●R1的85％-97％为SO3基和/或3％-15％为乙酰基和/或0到12％为H+
●R2的15％-60％为SO3-
●R3的SO3-基至少40％，优选50％-85％
●R4和R5上至少20％的葡糖醛酸单元为非硫酸化的
特别地，根据本发明过程的解聚，在其还原端显示一个失水甘露糖醇残基，含有一个或多个硫酸化的羟基。
当解聚在亚硝酸或其衍生物，如亚硝酸钠，存在下发生，随后为硼氢化钠处理，然后得到下述结构(II)的化合物：
通式(II)
Figure A20048002230700121
R1，R2，R3可以是氢或SO3-基，优选
●R1的0到100％为SO3-基
●R2的0到100％为SO3-基
●R1的0到100％为SO3-基
更优选R1和R3的20％到85％为SO3-，R2的15％到60％为SO3-
优选的产物的分子量小于等于15000Da，或更优选1500到15000Da，进一步优选3000到9000Da。
本发明有一个中间解聚的方法制备的低分子量产物，本发明所得产物与背景技术所述产物相比从结构的观点看是有区别的，因为其13C NMR光谱区多重信号的呈现，包含从ppm 79到89，特别是80到86ppm，这远超越了失水甘露糖醇的特征信号(见图10所示实施例9制备样品的高分辨率13C NMR光谱)，这也表明了失水甘露糖醇不同的硫酸化，特别是在1和6位的羟基，。
更特别地，根据本发明所得产物由于失水甘露糖醇1位羟基的硫酸化而不同，如13C NMR光谱ppm 67-68区信号增加和ppm 61-63区信号消失的减少所示。
此区别如比较图11光谱(对应如实施例10所述多糖产物)和图9光谱(如实施例8所述多糖产物)所示。根据Guerrini等在Seminars in Thrombosis and Hermostasis，vol27，5，473-482，2001中所述方法，此区别通过二维核磁共振更加明显。
这些区域的主要特征是通过部分或全部硫酸化失水甘露糖醇可用羟基而得，失水甘露糖醇是在多糖解聚过程中在多糖还原端形成的，这些都发生在硫酸化步骤特别是1和6位羟基的硫酸化之前。
与背景技术所述产物和过程相比(例如试验性实施例6和7与本申请比较)，本发明产物进一步特征为其1H NMR光谱的7-9.5ppm区和13C NMR光谱的51和165ppm信号缺失，这表明具有低分子量和高分子量的所有产物的葡糖胺上不存在与游离氨基，乙酰基或硫酸基团不同的化学基团。
相反，这些信号通常出现在所述N-乙酰肝素样物质硫酸化过程所得产物中，N-乙酰肝素样物质硫酸化是在有机溶剂甲酰基供体中进行，例如N，N-二烷基甲酰胺。
根据本发明所得硫酸化葡糖氨基聚糖显示出一种抗凝血活性，以血浆中抗Xa因子量为标准，其高于根据已知改良方法所得的生物技术肝素。而且，硫酸化葡糖氨基聚糖显示抗Xa和抗IIa的活性比大于或等于1，非常接近提取肝素。
特别地，新产物显示：
a)Xa因子抑制率活性高于50IU/mg，优选高于70IU/mg，在人血浆中测试发现。抗Xa因子活性的测量方法优选入Ten Cate H等在Clin.Chem 3，860-864(1984)或European Pharmacopoeia 1997 3rd edition所述。在血浆存在下本发明的Xa因子抑制率活性意想不到的高于背景技术所得生物技术肝素，接近于高分子量或低分子量的提取肝素检测值。
b)其TFPI(组织因子通道抑制剂，Bronze GJ Jr等在Blood 71，335-343，1988中述)的激活能力高于等于提取肝素的TFPI，
c)其在相应分子量中抗Xa和抗IIa之间的活性比大于等于1。优选大于1.5，
d)其对肝素酶I消化的抵抗力大于等于提取肝素，
e)能够抑制凝血酶和Xa因子蛋白酶释放，
f)与PF4因子(血小板因子4)的低亲和力
来自血管内皮细胞的TFPI的激活能力增强了本产品抗血栓和抗炎活性，并且扩充和改善了外科手术操作中深部静脉血栓形成，不稳定心绞痛的局部缺血并发症，心肌梗塞和局部缺血事件的治疗学指征。
与增加的TFPI产生组合，抑制蛋白酶产生的能力使得进一步扩大这些产物的治疗学指征，用于治疗败血症及其并发症，例如弥散性血管内凝血(CID)和治疗因先天或后天缺乏抗凝血酶III引起的疾病。
用本发明产物治疗后，TFPI因子活性的体外测定方法如Gory AM.等在Thromb.Haemostasis：81：589-593(1999)所述进行。
根据本发明所得N-乙酰肝素样衍生物(生物技术肝素)，尤其抵抗在水解酶，例如肝素酶I参与下的分解。此特征同得到低分子量产物可能性还有高抗Xa因子活性和低硫酸化度一起，使得他们的用途不仅限于肠道外也适合口腔给药。低分子量产物与高分子量肝素用途和副作用相比，本身就能提高生物利用度，降低出血风险。
如前所述，根据本发明所得产物显示抑制凝血酶蛋白酶的产生和Xa因子的能力。
抑制凝血酶蛋白酶的产生优选在纤维蛋白素原缺失的血浆中进行。对凝血酶(因子II)和Xa因子增殖的抑制优选用一个内源和外源性凝血系统的酰胺分解法监测。
根据两种在两个系统中的方法，本发明所得产品显示很强的抑制凝血酶和Xa因子的活性，而且这一特征改进了这些产品的抗凝血指征。
根据本发明所得产物，进一步拥有与PF4因子(血小板因子4)的低亲和力，这个可以通过在含有生物技术肝素的溶液中加入附加固定量的PF4因子后，检测血浆中残留抗Xa活性而得。
此残留抗Xa活性是通过其与起始活性的百分比计算而来的，此百分比高于提取肝素或显示与PF4因子的低亲和力的低分子量的提取肝素。
此低亲和力改善了本发明产物的临床指征，其降低了肝素(HIT)诱发的血小板减少的发病风险。即使所得产物优选分子量低于15000Da，或更优选3000到9000Da，分子量大于15000Da的产物可通过改变解聚条件简单得到，还是能保持它们的生物学性质，比如抗Xa的高活性，肝素酶抵抗性和TFPI因子释放。
总结根据本发明所得生物技术肝素具有下述主要特征：
●其13C NMR光谱的79到89ppm区域，或更优选80到86ppm区域的特征信号超过失水甘露糖醇特征信号，而且在67-68ppm区的信号增加和/或61-62ppm区信号减弱甚至消失。这些信号表明存在不同硫酸化失水甘露糖醇，特别是1，3和6位，甚至更特别的是1位的羟基硫酸化，正如图11和图9光谱图比较所示。
●优选1H NMR光谱7-9.5ppm区信号缺失，13C NMR光谱51-165ppm区信号缺失，显示不存在甲酰基。
●血浆中抗Xa因子(抗凝血剂)活性高于根据背景技术方法所制备的生物技术肝素中的。
●抗Xa因子活性/抗IIa体活性比大于等于根据背景技术方法所制备的生物技术肝素中的，优选大于等于1或更优选大于等于1.5。
●对肝素酶的抵抗性大于等于提取肝素；
●能够抑制凝血酶和Xa因子产物
●与PF4的低亲和力
以新方法制备的生物技术肝素的生物活性很特殊：特别地，抗Xa因子活性和抗IIa因子活性之间的比大于或等于1，通常根据背景技术方法所制备的生物技术肝素的这个比小于1，这指示了因APTT值引起的抗凝血和抗血栓活性的最适比率。此比值近似于一种提取肝素。
一项与提取肝素相比的最佳特征是一个较好的凝血酶直接抑制，可通过高HCII值评价。这个特征暗示可使用本发明产品于因凝血酶和先天或后天缺乏抗凝血酶III引发的血栓-栓塞(thrombo-embolytic)和/或血管病症。
根据本发明所述产物的另一方面，涉及本发明的使用，其单独或与适合药学上可接受的辅料或稀释剂配比成的组合物，用于抗凝血剂和抗血栓治疗或预防用于取代提取肝素和制备具有前体纤维蛋白原(profibrinolytic)和抗聚集活性的药物。
本发明产物或含有以其为有效成分的组合物特别适用于预防和治疗不稳定心绞痛，心肌梗塞，深部静脉血栓形成，肺栓赛，局部缺血事件并能治疗败血症及预防其并发症，例如弥散性血管内凝血(CID)。
根据本发明所述产物的另一方面，涉及本发明产物的使用，其可用于制备预防和治疗不稳定心绞痛，动脉血栓形成，动脉粥样硬化药物并可用于治疗因先天或后天缺乏抗凝血酶III引发血栓栓塞性疾病的药物。
本产品可通过微粒、载体分子等载带，其效果特别适用于除肠道外给药的口腔给药。
因此，另一方面，其显示以本发明方法得到的N-乙酰-肝素样物质的多糖衍生物为有效成分的药物组合物，其适合口腔和肠道外使用制剂。
根据本发明另一方面，涉及制备O-硫酸化中间产物，其具有氨基糖的游离氨基，完全没有甲酰基，并且无任何抗凝血活性，例如，在本发明最终产物制备中有用。
特别优选根据本发明方法所述得到和分离出来的中间体K5-OS，NH2，epi，其被定义为多糖链混合物，如下通式(III)所示：
通式(III)
Figure A20048002230700151
n为3到150，R1可以是氢或一个乙酰化度3％到15％的乙酰基。
R1不携带任何其他功能基团，优选不携带甲酰基；R2，R3，R4和R5可以是氢或SO3-基，其硫酸化范围优选30％到98％。
K5OSNH2-epi(如图16的1H NMR光谱所示)的分子量优选1500到15000Da，更优选3000到9000Da，其特征为其抗凝血活性低于10IU/mg，这是通过产色法(CoatestHeparin kit，Chromogenix)测量抗Xa因子活性而得。
K5OSNH2-epi是有用的，例如，在制备本发明产物时。
K5OSNH2-epi可通过本发明方法所述得到和分离出来，其被定义为多糖链混合物，如下通式(IV)所示：
通式(IV)
n为3到150，R1可以是氢或一个乙酰度3％到15％的乙酰基。R1携带任何其他功能基团，优选不携带甲酰基；R2，R3，R4和R5可以是氢或SO3-基，优选如下取代：
●R2为15-60％的SO3-
●R3高于40％，优选50-85％的SO3-
至少20％的葡糖醛酸单元没有在R4和R5位被硫酸化。
K5-OS6OSNH2-epi中间体(如图1513C NMR光谱图所示)的分子量优选1500到15000Da，更优选3000到9000Da。K5-OS6OSNH2-epi中间体特征为氨基糖上有一个游离氨基，非硫酸化的，优选没有甲酰基。其另一特征为其抗凝血活性低于10IU/mg，这是通过产色法(Coatest Heparin kit，Chromogenix)测量抗Xa因子活性而得。K5-OS6OSNH2-epi中间体是有用的，例如，在根据本发明方法制备本N-硫酸化衍生物，其无任何抗凝血活性。
在一个特别优选的实施例中，从细菌多糖，例如N-乙酰肝素样物质(E.coli的K5多糖)制备生物肝素产品的方法包括如下步骤：
制备和纯化N-乙酰肝素样物质多糖
起始材料优选N-乙酰肝素样物质多糖，其表达为二糖单元链[-4]-GicAα1-4GlcNAc-(1-)n，由一个D-葡糖醛酸和一个N-乙酰葡糖胺单体通过β1-4键结合。多糖能够从例如天然Escherichia coli K5菌株(菌株Bi 83337/41血清型O10:K5:H4)(在本例中多糖为K5多糖)或从Pasteurella multocida菌D型，或从其衍生物或变形体得到，或者从Escherichia coli重组菌株得到例如Finke A等在ournal of Bacteriology，173(13)：4088-4094，1991，或Drake CR，Roberts IS，Jann B，Jann K and Boulnois GJ.FEMSMicrobiol Lett.54(1-3)：227-230，1990.所述。用于生产K5多糖产物的Escherichia coli菌株也可以从微生物的公开收集得到，例如ATCC(美国标准菌种收集-USA)n°ATCC23506.。Multocida pasteurella D-型菌种可从ATCC得到(ATCC No.12946)。
N-乙酰肝素样物质多糖可通过细菌发酵和从液体培养基提取得到。纯化是通过已知技术进行，例如专利WO 01/02597描述的以下培养基：脱脂豆粉2g/l，K2HPO4 9.7gr/l，KH2PO42 gr/l，MgCl2 0.11gr/l，枸橼酸钠0.5gr/l，硫酸铵1gr/l，葡萄糖(已灭菌拆分)2gr/l，水q.bat 1000ml，pH7.3。
前培养优选从Tripic大豆琼脂的斜面保留的E.coli Bi 8337/41(O1O:K5:H4)细胞混悬液灌输得到。在37℃下搅拌24小时培养。在随后步骤中，一个含有前述介质的发酵罐接种前述0.1％的前培养，在37℃下培养18小时。发酵过程中，PH，氧，残留葡萄糖，引长的K5多糖和细菌生长受监控。
发酵结束时，温度升高到80℃，持续10分钟。细胞在10.000rpm与介质离心分离，上清液通过1000-10.000Da截取的滤过膜滤过以减少到大约1/5的体积。加入4体积丙酮后，K5多糖沉淀，并被离心分离还原。
片状沉淀物去蛋白作用优选用来自Aspergillus Orizae缓冲液的II型蛋白酶，缓冲液为NaCl 0,1M和EDTA 0,15M，pH8缓冲液，含有0,5％SDS，在37℃下持续90分钟。
溶液用10000Da截取量膜超滤，多糖用丙酮沉淀。多糖纯度通常高于80％，其可以通过至少一种以下方法检测：计算糖醛酸(咔唑法)质子和13C-NMR，UV和/或蛋白质含量。
a)来自微生物源的N-乙酰肝素样物质多糖的N-去乙酰化和N-硫酸化。
优选5-10g的纯化K5多糖溶解在200-2000ml 2N氢氧化钠中，在40-80℃反应直至去乙酰化完成(例如15-30小时)。溶液被中和。含有去乙酰K5多糖的溶液保温于20-65℃，一次加入10-40g碳酸钠和10-40g硫酸化剂，硫酸化剂选自吡啶-三氧化硫加合物，三甲胺三氧化硫等。
硫酸化剂的加入时间为最多12小时。在反应结束时，如必要，将溶液置于室温，pH7.5-8。
产物从盐中的纯化是通过已知技术，例如用1.000Da的螺旋膜(prepscale cartridge-Millipore)透析过滤。留下的产物浓缩至10％浓度多糖。浓溶液，如必要，可用已知方法干燥。
N-硫酸化/N-乙酰化比是通过碳13NMR测定的。
b)用C5葡糖醛酸基差向异构酶的酶差向异构化
C-5差向异构化步骤，涉及艾杜糖醛酸中部分葡糖醛酸的差向异构化是用C5葡糖醛酸基差向异构酶(C5差向异构酶)进行的，C5差向异构酶是天然的或重组的，在溶液或优选以固定形式的。
在此步骤中，使用如WO 98/48006所叙述的重组C5差向异构酶。优选，美国专利09/732,026和Li等在J.Biol.Chem，vol 276，23，(2001)20069-20077)所修饰的重组酶，其在N-末端含有一个附加序列。
重组酶优选从昆虫细胞或酵母细胞表达和纯化，优选Saccharomyces Cerevisiae，Pichia Pastoris，Pichia methanolica，Hansenula polymorpha，Saccharomyces pombe，Kluyveromices lactis，Kluyveromices fragilis。
b.1)树脂上的C5差向异构酶的固定化。
重组酶可以在不同的惰性基质上固定化，例如通过已知技术用功能基团衍生化的树脂、膜或玻璃珠，已知技术例如溴化氰，戊二醛(glutharaldeyde)，碳二亚胺或通过让酶与离子交换树脂反应或让其吸附在膜上。
根据优选的实现，酶被固定于商业用树脂例如CNBr琼脂糖4B(Pharmacia)带有环氧或二醇-CNBr活化基团的聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸树脂(Resindion Mitsubishi)。
更优选根据本发明，酶固定在带有用CNBr激活的二醇的聚甲基丙烯酸树脂上，激活反应在NaHCO3 100-300mM的缓冲液中，其pH7.0-8.3，优选pH7.2-7.8，温度4-25℃，进行时间12-72小时。
根据本发明，酶与惰性基质的结合反应在K5 N-去乙酰化N-硫酸化底物的存在下进行，避免了涉及酶活性部位失活的结合。
检测固定化酶活性是通过让其再循环通过含有固定化酶的柱而进行，将理论上可转化为固定化酶cpm的N-去乙酰化N-硫酸化的K5的量溶解在HEPES 25mM，KCl 0,1M，Triton X1000,01％，EDTA 0,15M缓冲液中，pH7.4，温度37℃，时间24小时，流量0,5ml/分钟。在通过DEAE色析法纯化和Sephadex G-10脱盐后，产物冷冻干燥并根据专利WO 96/14425的质子NMR技术分析艾杜糖醛酸含量。
b.2)用固定化酶的差向异构化。
C5差向异构化反应可如WO 96/14425所述的缓冲液中进行，缓冲液pH7.4，优选含有HEPES 0.04或Tris 0.05M，KCl 0.4M，EDTA 0.06M和triton X-100还有一种或多种添加剂，例如，优选丙三醇或聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)。
本反应可如专利WO 01/72848所述进行，其所述可用溶液含有HEPES 25mM，CaCl250mM，pH7,4，温度30-40℃。
更优选的温度和缓冲液反应条件允许葡萄糖醛酸基C5差向异构酶(glucoronyl C5epimerase)甚至在柱上固定后还能长效和稳定。
20-1000ml水溶液含有0,001-10g N-去乙酰化N-硫酸化K5，EDTA 10-30mM，优选15-25mM，HEPES 25mM，CaCl2浓度70到150mM(优选75-100mM)，pH5,5-8,0，优选pH6,5-7,0，恒温保持在15℃到30℃(优选20-25℃)，允许在30-240ml/小时流量在柱中循环1到24小时，柱包含1,2×107到3×1011当量的在一个恒温惰性基质上固定化的酶，恒温温度15℃到30℃，优选20到25℃。
上述温度和缓冲液条件增加了酶在柱上稳定的有效时间长于3000小时，因此，使方法显著有益。在反应结束时，样品通过DEAE树脂或Sartobind DEAE药筒纯化，加2M的NaCl沉淀，最后在G10 Sephadex树脂(Pharmacia)上除去盐分，或通过2体积的乙醇沉淀纯化，再通过IR 120H+树脂得到钠盐。
在所述优选条件下得到的产物，其的差向异构化率至少达到50％(总体糖醛酸的艾杜糖醛酸比率)，这是通过如专利WO 96/14425所述质子NMR技术检测的。
受控解聚
受控解聚通过步骤b)或c)或d)的得到的产物经历用已知技术的受控解聚，已知技术如专利WO 82/03627所述用亚硝酸去胺化，或用高碘酸钠(sodium periodate)氧化开环(an oxidative opening)(EP 287477)，或通过自由基处理(EP 121067)或通过β-消去(EP40144)，或γ-射线处理(US 4,987,222)，以得到分子量级数优选为1500到15000Da，或更优选为3000到9000Da。
根据本发明优选方面，受控解聚在硫酸化步骤前进行。
特别地，来自前一步骤的产物用亚硝酸或亚硝酸钠进行受控解聚。在此例中所用盐的量为每克多糖用1到100mg盐，随后为用过量硼氢化物还原。
根据第二个优选实施例，样品在4℃时溶解于50-250ml水中，加入1N盐酸酸化。加入的亚硝酸钠的量5到500mg，反应持续时间少于60优选少于30’。
在去除了过量氢硼化钠(sodium borohydride)后，产物用3体积乙醇沉淀回收和真空干燥箱干燥。
当解聚在过程结束时进行时，可以如WO 01/72848专利所述进行。
c)部分O-硫酸化结合部分O-去硫酸化。
从上述步骤得到的产物在水中再-混悬，浓度为10％。溶液在10℃冷却并通过IR-120H+的阳离子交换树脂，同时保持温度10℃。溶液通过树脂后，用去离子水水洗涤树脂，直到洗出液pH高于6。酸溶液加叔胺(ertiary ammine)或季铵(quaternaryammonium)盐例如含有15％四丁铵氢氧化物的水溶液中和，相关的铵盐。溶液可被浓缩成最小容量并低压冻干。
得到产物混悬于10-1000ml有机溶剂中，优选硫杂环戊烷(sulfolane)或2，4-二甲基硫杂环戊烷(2，4-dimethylsulfolane)。或者，有机溶剂可为二甲基甲酰胺(dimethylformamide)(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)，或N，N-二甲基乙酰胺(N，N，-dimethylacetamide)。此有机溶剂与硫酸化剂一起加入，例如固体的或在前述相同溶剂的溶液中的吡啶-SO3加合物(pyridine adduct-SO3)。
为了达到硫酸化剂多糖二聚物的羟基的摩尔比，硫酸化剂和多糖底物(差向异构化的N-硫酸化K5)的摩尔比维持在小于或等于5，或更优选小于2.5，或进一步优选小于1.5。
溶液保持在温度20到70℃，优选30到60℃，时间小于等于10小时，优选小于等于8小时，更优选小于或等于6小时。反应结束时，溶液逐步降到室温，并加氯化钠饱和的丙酮，直至多糖完全沉淀。
沉淀过滤分离，用最小量的去离子水溶解，加氯化钠直至得到0.2M的溶液。溶液用2N氢氧化钠调至pH7,5-8。加入丙酮至完全沉淀。沉淀从溶剂中过滤分离。所得固体用10-100ml去离子水溶解，用超滤法除去剩余的盐而纯化。
低压冻干一部分用于13C-NMR和1H-NMR结构分析的O-硫酸化产物。
含有部分硫酸化产物的溶液通过IR-120+的阳离子交换树脂或等同物。树脂用去离子水水洗，直到洗出液pH高于6，再加吡啶。溶液浓缩到最小量再低压冻干。产物用20-200ml的DMSO/甲醇(9/1 V/V)处理，并将溶液保温于45-90℃，10-420分钟。最后在溶液中加入10-200ml去离子水，并加氯化钠饱和的丙酮，直至完全沉淀。
用已知技术超滤纯化所得固体，低压冻干一部分用于13C-NMR结构分析。
d)部分6-O硫酸化
前述步骤产物进行6-O硫酸化。在6O位的硫酸基含量用已知技术如根据Guerrini等在Seminars in Thrombosis and Hemostasis，vol 27，5，473-482，2001所述的条件，如NMR测定。
所得产物在室温下重新混悬于水中，浓度为5-10％。溶液通过IR-120+的阳离子交换树脂或等同物。在溶液流出后，树脂用去离子水水洗，加叔胺或季铵盐例如四丁铵氢氧化物水溶液中和，得到相关铵盐。溶液可被浓缩成最小容量并低压冻干。
得到产物混悬于10-1000ml有机溶剂如二甲基甲酰胺(dimethylformamide)中，优选硫杂环戊烷(sulfolane)或2，4-二甲基硫杂环戊烷(2，4-dimetilsulfolane)或二甲基乙酰胺并加入硫酸化剂，例如固体的或在前述相同溶剂中的吡啶-SO3加合物(-SO3pyridine adduct)。
使混悬液达到到4℃到30℃，优选10到25℃，用一定量硫酸化剂处理10-90分钟，如SO3吡啶加合物(-SO3 pyridine adduct)，用量小于2当量，以将要硫酸化的羟基为基准，或优选小于1.5当量，然后用氯化钠饱和的丙酮处理，用量为直至沉淀完全。用已知技术透析过滤纯化所得固体，低压冻干一部分用于13C-NMR结构分析。
e)N-再硫酸化
使来自步骤d)，含有6O硫酸化多糖溶液达到到20-65℃然后一次加入10-100g碳酸钠，再加入10-100g硫酸化剂，选自可得到的试剂，例如，优选吡啶-三氧化硫(pyridine-sulfotrioxide)。加入硫酸化剂的时间可变，一直到12小时。反应结束时，如果必要，溶液降至室温，调节pH为7.5到8，优选用2M氢氧化钠。
产物通过已知技术从盐中纯化，例如，用1000Da螺旋膜(例如Prepscale cartridge-Millipore)透析过滤。当渗透导电性低于1000μS，优选低于100μS时，过程结束。所得产物通过过滤缩量至多糖浓度10％。低压冻干一部分用于13C-NMR结构分析。
6-O选择性硫酸化和N-再硫酸化如本步骤所述进行，来自步骤e)产物可以用不同顺序进行，例如专利WO 98/42754所述，先N-再硫酸化再6-O硫酸化，而不改变最终产物的生物活性。
富集抗凝血酶III的结合序列(任选的)
从前述步骤所得产物可任选地用色谱进一步纯化，例如阴离子交换色谱柱，如Lam L.H.等在Bioch.And Biophysical Research Communication vol 69，2，pag.570-577，1976所述DEAE柱。，替代这一步纯化或除此步纯化之外，产物进一步进行柱亲和色谱，该柱具有所述完全的或部分的人抗凝血酶序列，例如Hook等在FEBS Lett 1976，66：90-93或在美国专利4,692,435或如Liu S等在Proc.Natl.Acad Sci USA 1980，77：6551-6555所述或对肝素有高亲和力的肽序列。此处理通过后来的用NaCl盐溶液洗脱来实现能结合到固相的至少一部分的分离。
实际上，10-50mg从N-再硫酸化步骤而得的产物被装载在亲和层析柱上，柱上固定化了50-100mg人抗凝血酶III(Kedrion SpA，Lucca，Italia)于缓冲液Tris-HCl10mM，pH7.4和0-0.15M NaCl，温度4℃。
被附着在高亲和性柱上的分子用至少3体积的Tris HCl 10mM，pH7.4，含有0.5到3M NaCl缓冲液洗脱。
被洗脱物质然后优选用1000Da截取量的螺旋膜透析过滤除盐，并用低压冻干法浓缩。
一部分用咔唑法，HPLC，NMR和产色法来检测抗Xa活性。
所得物质显示很强的抗Xa活性，其强于浓缩1.5到3倍的起始物质的强度。
同样抗Xa活性的增加是通过用同样方法处理提取肝素得到的。这是另一个根据本发明所得生物技术肝素与提取肝素在结合抗凝血III方面相似的信号。
具体实施方式
实施例1根据本发明的生物技术肝素的生产
如下步骤：
a)从Escherichia coli K5开始制备N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)多糖
b)N-去乙酰化N-硫酸化
c)差向异构化
d)解聚
e)部分O-硫酸化/部分O-去硫酸化
f)部分6-O硫酸化
g)N-再硫酸化
a)多糖制备
N-乙酰肝素样物质多糖是通过发酵E.coli Bi 8337/41菌株，血清型O10:k5:H4(ATCC 23506)，然后的提取是根据专利WO 01/02597所述的液体培养基和纯化，其使用：脱脂豆粉2gr/l，K2HPO4 9.7gr/l，K2HPO4，2gr/l MgCl2 0.11gr/l，柠檬酸钠0.5gr/l，硫酸铵1gr/l，葡萄糖(已灭菌)2gr/l，水q.b为1000ml，pH7.3。
培养物用细胞混悬液接种，此细胞混悬液来自于37℃下搅拌24小时的谷光苷肽大豆琼脂斜面培养基提取。发酵罐中的接种物，含有上述介质的F5型(industrieMeccaniche di Bagnolo SpA)，接种于0.1％上述beuta培养基，发酵在37℃进行18小时。在发酵期间，检测pH，氧，残留葡萄糖，产出的K5多糖和细菌生长。发酵结束时，温度升至80℃，持续10分钟。用10.000rpm离心分离细胞和介质，上清夜用10.000Da截取量的滤过膜过滤，缩小体积至1/5。加4提及的丙酮沉淀K5多糖，最后离心分离回收。
所得固体的去蛋白化是用II型蛋白酶，其来自Aspergillus Orizae(曲霉菌)的NaCl 0,1M和EDTA 0,15M缓冲液，pH8，含有0，5％SDS，37℃，90分钟。
所得溶液用公称截留(nominal cut-off)10.000Da的膜超滤，多糖用丙酮沉淀。多糖纯度用糖醛酸测定法(咔唑法)，质子和碳13NMR，UV和蛋白质含量检测。
b)N-去乙酰化N-硫酸化
10gr来自a)步骤的产物溶解于200ml 2N氢氧化钠，在50℃保持18小时。溶液用6N盐酸中和pH值。得到一种N-去乙酰多糖。
N-去乙酰多糖在40℃一次加入10g碳酸钠，然后在10分钟内加10g吡啶-三氧化硫加合物(pyridine-sulphotrioxide adduct)。产物由N-去乙酰化N-硫酸化K5多糖构成，用截留1.0000Da的螺旋膜(prepscale cartridge-Millipore).透析过滤纯化除盐。当渗透导电性低于100μS时，纯化结束。
产物用同样透析过滤法浓缩到多糖浓度10％，然后低压冻干。
所的产物的N-去乙酰化N-硫酸化比率用碳13NMR检测为9,5/0,5。
c)差向异构化
c-1)树脂上的C5差向异构酶固定化
将根据美国专利09/732,026和Li等在J.Biol.Chem.，vol 276，23，(2001)20069-20077的5mg重组体葡糖醛酸基C-5差向异构酶溶解于200ml Hepes 0,25M缓冲液，pH7.4，含有KCl 0,1M，Triton X-100 0,1％和EDTA 15mM缓冲液，加入100mg根据b)步骤得到的N-去乙酰化N-硫酸化K5多糖。溶液在4℃用30.000D的膜透析过滤，直至N-去乙酰化N-硫酸化K5多糖在超滤中消失。对于滤过膜上固定的溶液，缓冲液被透析过滤改变，用NaHCO3 200mM，pH为7时取代，浓缩至50ml后加入50mlCNBr Sepharose 4B活化树脂，其在4℃过夜反应。
在反应结束时，上清液中残余酶的量是在其析出后用Quantigold法(DiversifiedBiotec)检测的。上清液中没有酶，证明根据上述方法，酶被100％固定。为了占用可用的树脂区，树脂用tampon Tris-HCl 100mM，pH8洗脱。
为了检测固定酶的活性，将理论上相应为1,2×107cpm的一定量的酶装载在柱上。在如此准备的柱上，1mg根据b)步骤而得的N-去乙酰化N-硫酸化K5被处理并溶解于缓冲液HEPES 25mM，KCl 0,1M，EDTA 0,015M，Triton X-1000,01％，pH7.4。使其在37℃以0.5ml/分钟流量再循环过夜。
用DEAE层析法纯化后，用Sephadex G10脱盐，样品低压冻干，并根据专利WO96/14425所述用质子NMR分析艾杜糖醛酸含量。
c-2)用固定化酶差向异构化
将10gN-去乙酰化N-硫酸化K5多糖溶解在600ml EDTA 15mM缓冲液中，HEPES25mM，pH7.0，含CaCL2 75mM。使所得溶液通过含有固定化酶的50ml的树脂柱再循环。
此操作在28℃以of 200ml/h流量，循环24小时。
所得产物用超滤纯化，用乙醇沉淀。
沉淀重新溶解于水中，浓度10％。
所得产物显示差向异构化百分比，用1H-NMR检测，如艾杜糖醛酸百分比在糖醛酸中为55％(如图1所示)。
d)受控解聚
从c-2)所得样品经受了如专利WO 82/03627所述的用硝酸受控解聚。特别地，5g样品溶于250ml水中，并用4℃恒温水浴。用1N冷却到4℃的盐酸将pH调节至2.0，然后加入200mg亚硝酸钠。如必须，用1N氯化物将pH调至2，然后缓慢搅拌15分钟。用NaOH 1N将溶液中和，冷却到4℃。
我们将250mg氢硼化钠溶解于13ml去离子水中，让其反应4小时。溶液用1N盐酸调至pH5.0后使其反应10分钟以除去多余的氢硼化钠(sodium borohydride)，然后产物用3体积乙醇沉淀还原，再在真空炉中干燥。所得产物显示约6000Da的分子量。
e)部分O-硫酸化/部分O-去硫酸化
通过以上步骤所得的产物重复混悬于水溶液中，浓度为10％。溶液被冷却到10℃，并在10℃使其流入阳离子交换树脂IR-120+。溶液流出，树脂用去离子水水洗，直到洗脱物pH高于6。酸溶液用叔胺或季铵盐中和，例如15％四丁基氢氧化铵水溶液，所得结果为铵盐。溶液然后浓缩到最小量，低压冻干。
所得溶液混悬于100ml of N，N-二甲基乙酰胺(N，N，dimethylacetamide)(DMA)，然后加吡啶-SO3。
硫酸化剂和差向异构化K5N-硫酸化底物(如羟基摩尔数)的摩尔比为1.25，硫酸化剂照此比加入。溶液在50℃保持360分钟。反应结束时，溶液被冷却到室温，加氯化纳饱和的丙酮直至完全沉淀。
沉淀通过过滤与溶剂分离，溶于最小量的去离子水，然后加氯化纳直至得到0.2M溶液。溶液加2N氢氧化钠调节到pH7,5，加入丙酮沉淀。沉淀通过过滤与溶剂分离，所得沉淀加入100ml去离子水溶解，再用超滤纯化，除去残余盐。
低压冻干一部分用于13C-NMR.结构分析部分O-硫酸化产物。
使含有部分O-硫酸化产物的溶液流过阳离子交换树脂IR-120+或等同物。树脂用去离子水水洗，直到洗脱物pH高于6。酸溶液用吡啶中和。溶液然后浓缩到最小量，低压冻干。所得产物用100ml DMSO/甲醇(9/1V/V)溶液处理，所得溶液在65℃保存240分钟。
最后，溶液中加入200ml去离子水，加氯化纳饱和的丙酮直至完全沉淀。所得固体根据已知技术用透析过滤纯化，低压冻干一部分用于13C-NMR.结构分析。
f)部分6-O硫酸化
从e)步骤所得产物重复混悬于水溶液中，浓度为10％。溶液被冷却到室温。使其流过阳离子交换树脂IR-120+。溶液流出后，树脂用去离子水水洗，用四丁基氢氧化铵水溶液中和，得到铵盐。溶液然后浓缩到最小量，低压冻干。
所得产物混悬于100ml DMF，然后再加入在DMA中的硫酸化剂吡啶-SO3溶液。溶液降到10℃，用一定量作为硫酸化剂的吡啶-SO3加合物处理，用量为1.25当量的硫酸化剂，作用于羟基60分钟。
溶液加氯化纳饱和的丙酮直至完全沉淀，所得固体根据已知技术用透析过滤纯化，低压冻干一部分用于13C-NMR.结构分析。
g)N-再硫酸化
产物溶于水，降至40℃，单独加入10gr碳酸钠和10分钟内加入10gr吡啶-三氧化硫。
反应结束时，如必须，溶液降至室温，然后，如必须，用NaOH调节pH低于8.0。
产物用以已知方法纯化，如用1000Da截取量的螺旋膜(prep scale cartridge-Millipore)透析过滤。当渗透导电性低于1000μS，优选低于100μS时，反应结束。固定产物用同样过滤方法得到的多糖减量至得到浓度10％多糖。
1H-NMR光谱如图2所示。
所得最终产物在人血浆中的抗Xa活性测得140IU/mg(见表2)，抗Xa活性和抗IIa活性比为2.5。
实施例2用DMF来O-硫酸化
重复实施例1过程，所不同的是c)和f)步骤中O-硫酸化和部分6O-硫酸化是用二甲基甲酰胺(DMF)作为有机溶剂的。所得最终产物在人血浆中的抗Xa活性测得85.9IU/mg(见表2)，NMR光谱如图3所示。
实施例3在50mg亚硝酸钠/gr底物参与下的受控解聚
重复实施例1过程，所不同的是受控解聚在50mg亚硝酸钠/每g多糖参与下进行，以获得大约4200Da分子量。
所得最终产物在人血浆中的抗Xa活性测得60.1IU/mg(见表2)，13C-NMR光谱如图4所示。
实施例4分子量为大约8000Da的生物技术肝素产物(用20mg/g亚硝酸钠/底物受控解聚)
重复实施例1过程，所不同的是d)步骤中受控解聚在20mg亚硝酸钠/每g多糖参与下进行，以获得大约8000Da分子量。
所得最终产物在人血浆中的抗Xa活性测得150IU/mg(见表2)，13C-NMR光谱如图5所示。
实施例5分子量为大约20000Da的生物技术肝素产物
实施例5根据以下步骤进行：
a)从Escherichia coli K5开始制备N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)多糖
b)N-去乙酰化N-硫酸化
c)差向异构化
d)部分O-硫酸化/部分O-去硫酸化
e)部分O-硫酸化/部分N-再硫酸化
步骤a)到c)相应于其如实施例1中各自步骤，然而其没有解聚(步骤d)，步骤d)相应于实施例1中的步骤e)，步骤e)相应于实施例1中的步骤f)和g)。
所得最终产物为大约20.000Da分子量，且易受解聚影响。其在人血浆中的抗Xa活性测得135IU/mg(见表2)，13C-NMR光谱如图6所示。
实施例6分子量为大约15000Da的生物技术肝素产物(用5mg/g亚硝酸钠/底物受控解聚)
在与步骤d)相同温度和时间条件下重复实施例1过程，但受控解聚在5mg亚硝酸钠/每g多糖参与下进行，以获得大约15000Da分子量。
所得最终产物在人血浆中的抗Xa活性测得180IU/mg(见表2)，13C-NMR光谱如图7所示。
实施例7根据已知技术制备生物技术肝素产物
在此例中，O-超硫酸化和6O-硫酸化过程的条件如专利WO 01/72848和WO02/50125所用。简要地，在50℃下用二甲基甲酰胺(dimethylformamide)进行超硫酸化18个小时，在65℃下O-去硫酸化进行150分钟，在0℃下用二甲基甲酰胺(dimethylformamide)进行6O-硫酸化90分钟。
所得最终产物为大约20.000Da分子量，其在人血浆中的抗Xa活性测得45IU/mg(见表2)，13C-NMR光谱如图8所示。
实施例8根据背景技术制备生物技术肝素产物
此例用如WO 01/72848和WO 02/50125O所述相同的超硫酸化和6O-去硫酸化，简要地，在50℃下进行超硫酸化18个小时，在65℃下O-去硫酸化进行150分钟，在0℃下用二甲基甲酰胺(dimethylformamide)进行6O-硫酸化90分钟。
而且，在4℃，40mg/g亚硝酸钠/底物参与下，解聚步骤如专利WO 01/72848和WO 02/50125所述在硫酸化步骤结束时进行15分钟。
所得最终产物为大约6.000Da分子量，其在人血浆中的抗Xa活性测得31.5IU/mg(见表2)，13C-NMR光谱如图9所示。
实施例9制备生物技术肝素产物：解聚和硫酸化条件的控制
重复实施例1过程，所不同的是：
受控解聚(实施例1中步骤d)是用40mg亚硝酸钠/每g差向异构化的K5NS，在实施例1同样的时间和温度下进行的。所得分子量为大约6500Da。
在实施例1中的部分硫酸化(步骤d)用硫酸化剂和N-硫酸化差向异构化的K5底物的摩尔比为5，进行180分钟，同时O-去硫酸化进行60分钟。
所得最终产物在人血浆中的抗Xa活性测得89IU/mg(见表2)，13C-NMR光谱如图10所示。
实施例10制备生物技术肝素产物：解聚和硫酸化条件的控制
重复实施例1过程，K5-N多糖的中间解聚(步骤d)是在如实施例9所述相同的时间和温度条件下进行的，不同的是使用40mg亚硝酸钠/每g差向异构化的K5NS，得分子量为大约6500Da。部分硫酸化相应于实施例1的步骤e)，使用硫酸化剂和N-硫酸化差向异构化的K5底物的摩尔比为0.6，培养8小时，同时O-去硫酸化进行30分钟。
所得最终产物在人血浆中的抗Xa活性测得101IU/mg(见表2)。
根据本实施例所得最终产物的13C-NMR光谱如图11所示。
实施例11通过在亲和层析柱上的选择分离对抗凝血酶III有高亲和性的多糖部分
根据实施例1制备多糖。在步骤g)N-再硫酸化后，产物通过如下亲和层析柱：20mg来自实施例1g)步骤的产物被装入CNBr琼脂糖凝胶4B树脂柱(Pharmacia)，根据已知技术，上有前述固定的100mg人抗凝血酶III(Kedrion SpA，Lucca，Italia)，在缓冲液Tris-HCI 10mM pH为7.4和0-0.15M NaCl中，4℃。在层析60分钟后，用至少3体积Tris-HCI 10mM pH7.4缓冲液水洗层析柱。
加含有2M NaCl的Tris HCI 10mM pH7.4的梯度洗脱液洗脱有高亲和力吸附在层析柱上的分子。
所得被洗脱物质用1000Da截取量的螺旋膜透析过滤除盐，低压冻干浓缩。
所得最终产物分子量为大约8500Da，在人血浆中的抗Xa活性测得300IU/mg(见表2)，13C-NMR光谱如图12所示。
实施例12低分子量为大约6000Da的生物技术肝素的生产
重复实施例5，但是N-再硫酸化步骤的产物在实施例1步骤d)所述同样的条件下解聚。所得最终产物分子量为大约6.000Da，在人血浆中的抗Xa活性测得65IU/mg(见表2)，13C-NMR光谱如图13所示。
实施例13生物技术肝素产物：控制硫酸化条件
重复实施例1，不同的是实施例1的步骤e)的部分硫酸化中，使用的硫酸化剂和N-硫酸化差向异构化的K5底物的摩尔比为5，在50℃下进行8小时。
所得产物在人血浆中的抗Xa活性测得75IU/mg(见表2)，13C-NMR光谱如图14所示。
实施例14制备K5-OS6OSNH2，epi中间体(生物技术肝素的非再硫酸化中间体)
重复实施例1，但没有最后的再硫酸化步骤。
所得最终产物分子量为大约6.000Da，在人血浆中的抗Xa活性测得5IU/mg(见表2)，13C-NMR光谱如图15所示。
实施例15制备K5-OS6OSNH2，epi中间体(在去硫酸化和60-硫酸化和N-再硫酸化步骤之前的生物技术肝素中间体)
重复实施例1，不同的是实施例1步骤e)的部分O-硫酸化条件中，使用的硫酸化剂和N-硫酸化差向异构化的K5底物的羟基化摩尔比为5，在50℃下进行8小时，无后来的去硫酸化和6O-硫酸化和N-再硫酸化。
所得K5-OS6OSNH2，epi产物分子量为大约6.000Da，羟基硫酸化为95％，在人血浆中的抗Xa活性测得8IU/mg(见表2)，质子1H-NMR光谱如图16所示。
实施例16分子量为大约6.000Da的生物技术肝素产物
根据以下步骤进行实施例1
a)起始于Escherichia coli K5制备N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)多糖
b)N-去乙酰化/N-硫酸化
c)差向异构化
d)部分O-硫酸化/部分O-去硫酸化
e)受控解聚
f)部分O-硫酸化/部分N-再硫酸化
步骤a)到c)相应于其如实施例1中各自步骤，步骤d)和e)的顺序与实施例1种相比可以倒置。所得最终产物分子量为大约6.000Da，在人血浆中的抗Xa活性测得95IU/mg(见表2)，带正电之有机离子NMR光谱如图17所示。
实施例17根据本发明所得产物的生物活性的确定
检测抗Xa活性：根据产色法(Coatest Heparin kit，Chromogenix)评价抗Xa活性。检测在正常人血浆中进行，使用显色底物S2222(Chromogenix)，Xa牛因子(Chromogenix)和人抗凝血III(Chromogenix)作为试剂。反应在37℃用凝血测试剂(coagulometre)ACL 9000(International Laboratory)进行和在405nm下读数。结果如表2所示。根据已知技术(如专利WO 01/72848and WO 02/50125所述程序制得特殊产物)所得结果总结如表1所示，提取肝素文献的数据已被报道(Fareed J等在Exp Opin.Invest.Drugs，1997，6：705-733)。
抗体IIa活性：抗体IIa活性检测根据以下记录在正常人血浆中进行：
30μl 0.5U/ml人抗凝血III(Chromogenix)与30μl待测不同浓度样品溶液混合，再在5.3nKat/ml(Chromogenix)下与60μl牛凝血酶混合。
溶液在37℃下培养70秒，加显色底物S-2238(Chromogenix)。反应用凝血测试剂(coagulometre)ACL 9000(International Laboratory)进检测，在405nm下每秒读数，记录90秒。所得结果为已知产物(主要产物的过程如WO 01/72848和WO02/50125所述)已经在表1中被总结。
与肝素酶拮抗性：与肝素酶I拮抗性是通过评价低和高分子量样品，在缓冲液最终浓度0.02％的Tris HCI 20mM，50mM NaCI，4mM CaCI2和0.01％BSA，pH为7.5中，20单位肝素酶I(Sigma，CAS number 52227-76-6)加入100μl含样品的溶液，反应在25℃下培养。反应有规则的间隔10分钟，1小时，2小时，20小时，通过加入HCI 50mM结束。
每份样品通过235nm的分光光度计测定和GPC-HPLC测定分子量来分析。所得结果如表3所示，可以观察到当被用于研究的高分子量(HMW)和低分子量(Fraxiparina，Sanofi)的提取肝素如分子量减少所示，在最后退化；而根据本发明所得的生物技术肝素比较稳定(用肝素酶I处理20小时后分子量仍稳定)。
TFPI活性：根据Gori AM.等在Thromb.Haemostasis 1999：81：589-93所述方法，以TFPI因子为基础的活性测定是在体外HUVEC细胞上做的，其是与一种商品非分离肝素比较的(表4)。
蛋白酶增殖抑制：蛋白酶增殖抑制测定是根据Fareed等在Path.Haem.Thromb.2002；32(3)：56-65所报道的在纤维蛋白原的衰竭血浆中进行的。在检测中，在样品中加入各种稀释液后，血浆是通过加用于激活内源性凝血系统的PT(thromboplastine C)或加入用于激活内源性凝血系统的APTT(Dade Actin)而激活的。用ACL 9000血凝度测量器(International Laboratory)监测凝血酶(因子II)和Xa因子抑制率。用50μg/ml的样品稀释液所得值如表5所示。
与PF4因子亲和性：与PF4因子(血小板因子4)亲和性的测定是在血浆中评价的，通过在含有根据本发明所得生物技术肝素的溶液中加入固定量的PF4因子后，测定残留抗Xa活性的到。
加入含有抗Xa0.8IU/ml的100μg血浆，得到一个PF4的最终浓度10μg/ml。以Coatest heparin kit(肝素试剂包膜)(chromogenix)的ACL 9000血凝度测量器(International Laboratory)监测残留抗Xa因子活性。残留抗Xa因子活性是通过其与起始活性的百分比测定的(表6)。
测量活化部分凝血激酶时间(APTT)：APTT的测定是通过使用ACL 9000血凝度测量器(International Laboratory)进行的。反应是在37℃时在适当稀释的样品中加一定量的脑磷脂(kit APTT International Laboratory cod 8468710)，然后在加入氯化钙后血块形成，在660nm时读数。
APTT值如表2中所示，与低分子量肝素85/600的第一个国际标准相比的百分比活性。
肝素辅因子II(HCLII)活性的测定：肝素辅因子II(HCLII)活性的测定是制备反应混合物含有20μl HCII(Stago)0.085PEU/ml，80μl不同浓度的待测样品溶液，50μl凝血酶，0.18U/ml(Boehringer)在0.02M氨基丁三醇-缓冲液，pH7.4，＝.15M NaCl和0,1％的PEG 6000。溶液在37℃培养60秒，然后加入50μl的1mM色谱酶(Spectrozyme)显色底物(American Diagnostic)。用自动的ACL 9000血凝度测量器(International Laboratory)在405nm波长条件下每隔1秒监测反应180秒。
HCLII值如表2中所示，与低分子量肝素85/600的第一个国际标准相比的百分比活性。
表1和2是生物技术肝素的生物活性数据，生物技术肝素是根据本发明所得，或根据特征为无需使用甲酰基的或提取肝素的供体或非供体或溶剂例如N，N，-二甲基酰胺的O-超硫酸化方法和最终解聚步骤。特别地，根据本发明所得产品检测在人血浆中的抗Xa活性高于等分子量的背景技术肝素。
实际上，根据本发明所得产品的的生物活性即抗Xa活性与分子量的比更高。此增值看似乎是因为本方法的结合特色：
●O-硫酸化(O-硫酸化和6O-硫酸化)是在缓和条件下进行的(见实施例5和7比较)；
●在O-硫酸化和6O-硫酸化步骤中使用非甲酰基供体极性溶剂(见实施例1和2比较)；
●中间解聚过程是在O-硫酸化或6O-硫酸化步骤之前进行的，与在过程结束时进行解聚相比(见实施例1和12比较)；
生物活性，即血浆中抗Xa活性与所得产物分子量的比显著增高。当O-硫酸化(O-硫酸化和6O-硫酸化)与用于O-硫酸化的非甲酰基供体极性质子惰性溶剂部分共同使用和如实施例1和6的6O-硫酸化配对解聚在中间相进行时，抗Xa和抗IIa活性的比较高增加。
然而，本过程也与如实施例13所述更强的O-硫酸化和6O-硫酸化结合相一致。
而且，本发明过程也与如实施例12所述的最终解聚相一致。
与根据已知方法所得生物技术肝素相比，本发明产物的一个改良附加参数，即抗Xa和抗IIa活性比表明抗血栓和抗凝血特性的关系，作为APTT值得结果，与提取肝素值相似。
根据本发明所得产物的这个比大于等于1，根据背景技术方法所得产物的这个比小于1。
另一个通过高HCII值显示的特征为与提取肝素相比，其直接抑制凝血酶能力强于提取肝素。
实施例18分子量为大约6.000Da的生物技术肝素产物
根据以下步骤进行实施例1
a)起始于Escherichia coli K5制备N-乙酰肝素样物质多糖
b)N-去乙酰化N-硫酸化
c)差向异构化
d)部分O-硫酸化/部分O-去硫酸化
e)N-再硫酸化
f)受控解聚
g)部分6-O硫酸化
步骤a)到c)的条件相应于其如实施例1中各自步骤，然而步骤d)-g)与实施例1种相同步骤相比，顺序是可以倒置的。
所得最终产物分子量为大约6.000Da，在人血浆中的抗Xa活性测得92IU/mg(见表2)，质子NMR光谱如图18所示。
表1生物活性数据比较表
  产物   O-硫酸化和解聚   分子量范围(Da)   人血浆中抗Xa活性   人血浆中抗Iia活性   抗Xa/分子量(KDa)比   抗Xa/抗IIa比
  未分级的提取肝素(UFH)   -   11000-15000   160-200*   160-200*   13-14   1.0
  提取肝素LMW   -   3900-6700   80-150*   25-60*   15-25   1.8-4.0
  产物Ex.n°7，WO 01/72848，   -超硫酸化   20000-30000   30-80   70-80   1.5-3   0.5-0.8
  产物Ex.n°8，WO01/72848，   -超硫酸化-最终解聚   4000-8000   15-50   40-70   3-6   0.5-0.8
  产物Ex.n°6   -部分O-硫酸化-部分6O-硫酸化-中间解聚   9000-15000   150-190   100-150   10-12   1.0-1.5
  产物Ex.n°1   -部分O-硫酸化-部分6O-硫酸化-中间解聚   3000-9000   50-150   30-100   16-25   ≥1.5
  产物Ex.n°11   -部分O-硫酸化-部分6O-硫酸化-中间解聚-亲和层析柱   4000-9000   100-350   50-100   25-40   ≥1.5
(*)发表在：Fareed等在Exp.Opin.Invest.Drugs(1997)6：705-733，Eriksson B.等在Tromb.Haemost.(1995)73：398
表2总结表：根据本发明产物的实施例和生物活性
  Ex.n°   图号   分子量(Da)HPLC   O-硫酸化   去硫酸化   人血浆中抗Xa活性(IU/mg)   抗Xa/抗IIa比   aPTT   HCII   备注
  1   1,2   6000   r.m＝1.256hrs，50℃   240min65℃   140   2.5   93   n.d   见实施例1
  2   3   6000   r.m＝1.256hrs，50℃   240min65℃   85,9   1.5   84   364   如实施例1在DMF参与下
  3   4   4200   r.m＝1.256hrs，50℃   240min65℃   60,1   3.0   58   254   如实施例1解聚至4200Da
  4   5   8000   r.m＝1.256hrs，50℃   240min65℃   150   2.0   98   n.d   如实施例1解聚至8000Da
  5   6   20000   r.m＝1.256hrs，50℃   240min65℃   135   1.0   n.d   725   如实施例1无解聚
  6   7   15000   r.m＝1.256hrs，50℃   240min65℃   180   1.2   n.a   n.a   如实施例1解聚至15000Da
  7   8   20000   Supersolf18hrs，50℃   150min65℃   45   0.6   n.d   n.d   如专利WO 01/72848所述超硫酸化和6O-硫酸化，无解聚
  8   9   6000   Supersolf18hrs，50℃   150min65℃   31,5   0.8   n.d   n.d   如专利WO 01/72848超硫酸化和6O-硫酸化，有最终解聚
  9   10   6500   r.m＝53hrs，50℃   60min65℃   89   2.5   73.9   395   如实施例1，但步骤e)不同
  10   11   6500   r.m＝0.68hrs，50℃   30min65℃   101   2.5   n.d   423   如实施例1，但步骤e)不同
  11   12   8500   r.m＝1.256hrs，50℃   240min65℃   300   1.8   94.2   n.d   如实施例1，有亲和层析柱
  12   13   6000   r.m＝1.256hrs，50℃   240min65℃   65   1.0   n.d   n.d   如实施例1，有最终解聚
  13   14   6000   r.m＝58hrs，50℃   240min65℃   75   1,2   n.d   n.d   如实施例1，但步骤e)不同
  14   15   6000   r.m＝1.256hrs，50℃   240min65℃   5   n.d   n.d   n.d   如实施例1，但无N-再硫酸化
  15   16   6000   r.m＝58hrs，50℃   240min65℃   8   n.d   n.d   n.d   如实施例13，但无去硫酸化/6O-硫酸化/N-再硫酸化
  16   17   6000   r.m＝1.256hrs，50℃   240min65℃   95   2.5   n.d   n.d   如实施例1，步骤d)和e)可以颠倒
  18   18   6000   r.m＝1.256hrs，50℃   240min65℃   92   2.5   n.d   n.d   如实施例1，步骤d)-g)可以颠倒
n.d.＝未测定
r.m.＝硫酸化剂与底物的摩尔比
表3：生物技术肝素和提取肝素的肝素酶水解比较试验
  样品   时间：0   时间：10“   时间：1小时   时间：2小时   时间：20小时
  提取肝素高分子量(13600Da)   12788Da   8930Da   4191Da   5007Da   4082Da
  提取肝素低分子量(Fraxiparina)   5718Da   4602Da   nd   4187Da   3417Da
  生物技术肝素分子量＝8500Da(Ex.n°10)   8546Da   7636Da   7932Da   8453Da   7868Da
  生物技术肝素分子量＝10000Da(Ex.n°10+解聚至10000Da)   10087Da   9979Da   10978Da   9993Da   10479Da
表4：体外HUVEC细胞的TFPI因子释放测定
  样品   释放于基质中的TFPI(ng/ml)
  对照(仅培养基)未分级的提取肝素(Vister，Pfizer)(1IUaXa/ml)生物技术肝素6000Da(ex.n°1)(1IUaXa/ml)生物技术肝素8500Da(ex.n°10)(1IUaXa/ml)   0,5-0,82,4-2,62,5-3,73.0-4,7
表5：蛋白酶产生抑制测定(凝血酶和Xa因子)。
  样品   ％产品Xa因子抑制率   ％产品凝血酶抑制率
  内在   外在   内在   外在
  低分子量提取肝素生物技术肝素6000Da(ex.n°1)   5080   9090   065   080
表6：与PF4因子亲和性测定
  样品   在PF4参与下％残留Xa活性
  未分级的提取肝素(UFH)低分子量提取肝素(LMWH)生物技术肝素4200Da(ex.n°3)生物技术肝素8500Da(ex.n°10)   45659070

Claims (61)

1.从乙酰N-肝素样物质(acetyl N-heparosan)制备葡糖氨基聚糖-硫酸盐(glycosaminoglicans-sulfates)，的方法，包括以下步骤：
a)将从天然或重组细菌株中分离出的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)多糖N-去乙酰化和N-硫酸化；
b)通过葡糖醛酸基C5-差向异构酶(glucuronil C5-epimerase enzyme)进行酶差向异构化；
c)将部分O-硫酸化和部分O-去硫酸化结合；
d)部分6-O硫酸化；
e)N-再硫酸化
进一步包括一个受控的解聚步骤，此步骤可任意在步骤b)，c)或d)之后进行，其中所述方法的特征为c)步骤中的部分O-硫酸化进行的时间少于10小时，使用的硫酸化剂和N-乙酰肝素样物质之间的摩尔比小于或等于5，；步骤d)的部分6-O硫酸化的进行的时间等于或少于2小时，使用的硫酸化剂和N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)的羟基之间的摩尔比小于或等于2。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于d)和e)步骤以倒置的顺序进行。
3.根据权利要求1-2的方法，其特征在于中间解聚是在b)步骤的差向异构化后进行的。
4.根据权利要求1-2的方法，其特征在于根据步骤c)的O-硫酸化以硫酸化剂和N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)之间的摩尔比小于2.5进行。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于所述的摩尔比小于或等于1.5。
6.根据权利要求4-5的方法，其特征在于部分O-硫酸化(步骤d)进行的时间小于或等于6小时。
7.根据权利要求1-6的方法，其特征在于部分O-硫酸化(步骤d)使用硫酸化剂和N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)的羟基之间的摩尔比小于或等于1.5进行。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于进行部分O-硫酸化(方法的(步骤d))的时间小于或等于60分钟。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于进行硫酸化的时间小于或等于30分钟。
10.根据权利要求1-2的方法，其特征在于步骤a)中的N-乙酰肝素样物质多糖是从大肠杆菌K5(E.coli K5)中分离出来的。
11.根据权利要求1-10的方法，其特征在于包含一个在结合抗凝血酶III或其片段的基质上的进一步的亲和性选择步骤f)。
12.根据权利要求1-11的方法，其特征在于根据步骤c)的部分硫酸化和步骤d)的部分6O-硫酸化中使用的硫酸化剂选自质子惰性溶剂中的三乙胺-SO3，三甲胺-SO3，吡啶-SO3。
13.根据权利要求12的方法，其特征在于所述质子惰性极性溶剂为非甲酰基供体(non-donor)。
14.根据权利要求12的方法，其特征在于所述质子惰性极性溶剂选自：四甲基砜(tetramethylensolfone)，2，4-二甲基硫杂环戊烷(2.4-Dimethylsulfolane)，N，N，-二甲基乙酰胺(N，N-dimethylacetamide)或N，N，-二乙基乙酰胺(N，N，-diethylacetamide)。
15.根据权利要求1-14的方法，其特征在于部分O-硫酸化(步骤d)进行的温度为4℃到30℃。
16.根据权利要求1-14的方法，其特征在于所述的温度为10℃到25℃。
17.根据权利要求1-16的方法，其特征在于部分中间受控解聚是通过化学或物理方法进行的。
18.根据权利要求17的方法，其特征在于所述物理方法进行为γ-射线处理，所述化学方法包括：用亚硝酸或其盐处理，或用β-消去或用过碘酸或自由基处理(afree radicals treatment)。
19.根据权利要求18的方法，其特征在于所述解聚的进行是用亚硝酸或其盐处理的。
20.根据权利要求19的方法，其特征在于亚硝酸或其盐与多糖的比为1-100mg盐每克多糖，且反应温度为4到10℃。
21.根据权利要求20的方法，其特征在于所述受控解聚的进行时间小于30分钟，且在亚硝酸或其盐存在下进行。
22.根据权利要求21的方法，其特征在于所述亚硝酸盐为硝酸钠。
23.根据权利要求17-22的方法，其特征在于解聚是通过加入过量摩尔的硼氢化物结束的。
24.从乙酰N-肝素样物质制备硫酸化葡糖氨基聚糖(glycosaminoglycans)的方法，包括以下步骤：
a)将从天然或重组细菌株中分离出的乙酰N-肝素样物质(acetyl N-heparosan)多糖N-去乙酰化和N-硫酸化；
b)通过葡糖醛酸基C5-差向异构酶进行酶差向异构化(glucuronyl C5epimerase)；
c)将部分O-硫酸化和部分O-去硫酸化结合；
d)部分6-O硫酸化；
进一步包括一种中间受控解聚步骤，此步骤可任意在步骤b)，c)或d)之后进行，其中所述方法的特征为c)步骤中的部分O-硫酸化进行的时间等于或少于10小时，使用的硫酸化剂和N-乙酰肝素样物质之间的摩尔比小于或等于5，部分6-O硫酸化(步骤d)进行的时间小于或等于2小时，使用的硫酸化剂与乙酰N-肝素样物质的摩尔比小于或等于2；步骤c)和步骤d)的O-硫酸化使用的硫酸化剂选自质子惰性溶剂中的三乙胺-SO3，三甲胺-SO3，吡啶-SO3。
25.根据权利要求1-24的方法，其特征在于C5-差向异构化反应(步骤c)是在低于35℃温度下进行，所述提取的或重组的C5-差向异构酶(glucuronyl C5-epimerase)被固定化在一种固定相上。
26.根据权利要求25的方法，其特征在于所述重组C5-差向异构酶是一种在昆虫或酵母细胞中表达的小鼠酶。
27.根据权利要求25的方法，其特征在于所述温度为15℃到30℃。
28.根据权利要求27的方法，其特征在于所述温度为20℃到25℃。
29.根据权利要求25的方法，其特征在于所述固定相为用CNBr激活的有环氧或二醇基团的聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸树脂；C5-差向异构酶的固定化是在含有100-300mM NaHCO3的缓冲液或10到50mM的磷酸盐缓冲液，其pH7.0-8.3，温度4-25℃进行，时间为12-72小时。
30.根据权利要求25-29的方法，其特征在于C5-差向异构化反应(步骤c)是在含有：10到30mM EDTA，70到150mM CaCI2和pH5,5到8,0的HEPES缓冲液中进行的。
31.改性的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)是根据权利要求1-30的方法得到的。
32.根据权利要求31的改性的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)，其分子量小于或等于15000Da.
33.根据权利要求32的改性的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)，其特征在于其的分子量小于等于3000到9000Da.
34.根据权利要求13的方法所得的改性的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)，其特征在于在分子中不存在甲酰基。
35.根据权利要求31-34的改性的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)，其特征在于在其还原端携带有一个硫酸化2，5失水甘露糖醇残基。
36.根据权利要求35的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)，其特征在于失水甘露糖醇的1，3和6位的羟基被部分硫酸化。
37.根据权利要求36的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)，其特征在于失水甘露糖醇的1位和6位的羟基被部分硫酸化。
38.根据权利要求37的K5OS6OSNS-epiN-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)，其特征在于位于1位羟基的硫酸化度为20％到85％。
39.根据权利要求37的K5OS6OSNS-epiN-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)，其特征在于葡糖胺(glucosamine)的6位羟基的硫酸化度高于40％。
40.根据权利要求39的K5OS6OSNS-epiN-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)，其特征在于所述的硫酸化度为50％-85％。
41.根据权利要求36N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)，其特征在于葡糖胺的3位羟基的硫酸化度低于60％。
42.根据权利要求24的方法得到K5OS6OSNH2，epi。
43.根据权利要求24的方法的步骤a)-c)得到K5OS6OSNH2，epi。
44.根据权利要求31-41的改性的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)，其特征在于测得的在血浆存在下的抗Xa活性大于或等于50IU/mg。
45.根据权利要求44的改性的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)，其特征在于Xa因子和IIa因子抑制率活性之间的比大于或等于1.0。
46.根据权利要求44的改性的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)，其特征在于其的TFPI激活作用活性大于或等于提取肝素的活性。
47.根据权利要求44的改性的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)，其特征在于其对肝素酶I的抵抗性大于提取肝素的抵抗性。
48.根据权利要求44的改性的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)，其特征在于其抑制凝血酶和Xa因子蛋白酶的产生。
49.根据权利要求44的改性的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)，其特征在于其对PF4因子的亲和性低于提取肝素。
50.根据权利要求44的改性的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)，其特征在于其HCII活性大于提取肝素。
51.根据权利要求44-50的改性的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)，其特征在于其13C NMR光谱与失水甘露糖醇信号相比，在从79到89ppm的信号区表现多重信号，在51和165ppm不存在信号，且其1H-NMR光谱在ppm 7-9,5区没有信号。
52.根据权利要求51的K5 OS 6OS N-epi，其1H-NMR光谱如图2所示。
53.根据权利要求51的K5 OS 6OS N-epi，其13C NMR光谱如图7所示。
54.根据权利要求31-41和44-53的改性的N-乙酰肝素样物质(N-acetylheparosans)是用于药理学上的用途。
55.根据权利要求54的产物用途，其用于制备具有肝素样抗血栓和抗凝血活性的药剂。
56.根据权利要求54的产物用途，其用于制备具有前体溶解纤维蛋白(profibrinolytic)和抗聚集活性的医药制剂。
57.根据权利要求54的产物用途，其用于制备预防和治疗不稳定心绞痛，心肌梗塞，深部静脉血栓形成，肺栓塞和局部缺血事件的药物。
58.根据权利要求55-56的产物用途，其用于制备治疗败血症及其并发症，例如弥散性血管内凝血(CID)的药物。
59.根据权利要求56的产物用途，其用于制备预防和治疗不稳定心绞痛，心肌梗塞，静脉和动脉血栓，肺栓塞和局部缺血事件和动脉粥样硬化的药物。
60.根据权利要求54-55的产物用途，其用于制备预防和治疗因先天或后天缺乏抗凝血酶III引起的血栓栓塞(thromboembolytic)事件的药物。
61.含有以权利要求31-41和44-53中任一项产物作为有效成分与合适的辅料和/或稀释剂结合的药物组合物。
62.根据权利要求61的药物组合物，其组成适于口服给药。
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