CN1186502A - 抑制血栓形成的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供灭活结合于血栓或血块中的纤维蛋白上的凝血酶的组合物和方法,从而血块结合凝血酶催化促进血块进一步增长的能力实质上被消弱或消除。本发明的组合物和方法对于预防心脏旁路循环仪器中和进行肾脏透析的患者体内的血栓形成及治疗罹患或有罹患与血栓有关的心血管并发症危险(如不稳定性心绞痛、急性心肌梗塞(心脏病突发)、脑血管意外(中风)、肺栓塞、深部静脉血栓形成和动脉血栓形成等)的患者特别有用。

Description

抑制血栓形成的组合物和方法

本申请是1995年3月31日提交的序号No.08/412,332的申请的部分继续申请，该申请的教导在此引为参考。

发明领域

本发明总的涉及治疗心血管疾病的组合物和方法。更具体地，本发明涉及通过投与能选择性灭活结合于血块或其它表面上的纤维蛋白的凝血酶但对游离凝血酶即液相凝血酶只有最小限度抑制作用的药剂来改善血栓的形成和发展。本发明还涉及特别激活肝素辅助因子II(HCII)介导的凝血酶抑制的HCII特异性催化剂。本发明的HCII特异性催化剂的活性使其能在灭活游离凝血酶最少的浓度灭活患者体内结合于纤维蛋白的凝血酶，从而减少了出血的危险性。这是本发明的HCII特异性催化剂的惊人的性质，因为其它抗凝剂典型地表现为灭活结合于纤维蛋白的凝血酶比游离凝血酶的能力低(如肝素、硫酸皮肤素和低分子量肝素)或灭活结合于纤维蛋白的凝血酶与游离凝血酶的能力实质上相等(如水蛭素及其衍生物，及活性部位凝血酶抑制剂的抑制剂)。

发明背景

血栓形成是血管内凝血级联反应的病理表现。凝血级联反应是复杂的生物过程，导致由血小板和纤维蛋白组成的血块或血栓的形成。凝血酶结合于血块或血栓的纤维蛋白，具有催化活性，能通过激活周围血中的凝血因子而扩增1000倍以上。血液产生凝血酶的能力对于防止受伤部位的过度出血(止血)是十分重要的。凝血酶在止血中的重要性是因为当血管损伤时它刺激血小板凝聚和纤维蛋白生成。因此，理想的抗凝血酶应是能在不产生因抑制全身循环中凝血酶的产生而致异常出血的浓度下通过灭活结合于纤维蛋白的凝血酶而缓解血块。

可使动脉粥样硬化复杂的血栓形成可导致受累血管局部或全部阻塞，从而导致很多重要的心血管并发症，包括不稳定性心绞痛、急性心肌梗塞(心脏病突发)、脑血管意外(中风)、肺栓塞、深部静脉血栓形成和动脉血栓形成。这样的疾病是世界上(特别是西方社会)伤残和死亡的主要原因。此外，在血管形成术后及溶血栓治疗中或治疗后，凝血酶(特别是表面结合凝血酶)在心脏旁路循环血栓形成上起作用。因此，接受这些手术的患者必须用大剂量肝素进行治疗以防止血栓形成。这些高剂量肝素虽然可以有效地防止凝血，但它们可引起严重的出血并发症。

作为激活凝血级联反应的结果而形成的血块或血栓含有纤维蛋白、血小板和各种其它血液成分。结合于纤维蛋白的凝血酶保持活性，通过纤维蛋白原的连续裂解和血小板及其它凝血因子(如因子V和因子VIII)的激活而引起血块的增长。而且，与易被天然存在的抗凝血酶(如抗凝血酶III(ATIII))灭活的游离凝血酶不同，结合于血块的凝血酶被保护而不被灭活。结果，血块起了活性凝血酶储库的作用，这些凝血酶进一步触发血块生长。此外，凝血酶还引起平滑细胞增殖，因此可能涉及增殖反应，如移植物引起的动脉粥样硬化和血管形成术或动脉切开术(atherectomy)后的再狭窄。

因为凝血酶是血栓形成所必须的，所以使用凝血酶抑制剂治疗血栓形成和血栓形成性并发症早有报告。不少部分有效的抑制剂多年来被人们使用。例如，肝素可被用作抗凝剂和抗凝血酶剂以抑制纤维蛋白形成、血小板凝聚和血栓形成。然而，肝素有很多限制。例如，因其通过激活ATIII而起抗凝剂作用而具有生物物理抑制，且因此而在安全剂量灭活结合于纤维蛋白的凝血酶相对无效，从而使结合于原先存在的血栓中的纤维蛋白上的凝血酶介导的血栓生长得以继续。而且，产生抗血栓效应所需的剂量极不易预测，因此，必须密切监测剂量。低分子量肝素(LMWH)也可用作抗凝剂和抗凝血酶剂以抑制纤维蛋白生成、血小板凝聚和血栓形成。LMWH类通过激活ATIII而起作用，这样，就具有和肝素同样的生物物理限制。然而，LMWH类比肝素产生较可预测的抗凝剂效应。因此，肝素和LMWH都有不易灭活表面结合凝血酶的限制。其结果，(a)需要高浓度以达到抗凝血酶效应，这可导致过度出血，和(b)一旦药剂从循环中清除，表面结合凝血酶可再激活血凝。

用另一系列称作凝血酶直接抑制剂的化合物可达到灭活结合于血块的凝血酶。这样的抑制剂包括水蛭素及其衍生物和凝血酶活性部位抑制剂，如阿加曲班和PPACK(D-苯丙氨酰-L-丙基-L-精氨酰氯甲基酮)。水蛭素是从水蛭唾液腺提取的一种抗凝血酶物质。有关的化合物包括hirulog，这是水蛭素的小分子合成类似物。尽管这些药物可抑制结合于血块的凝血酶，它们具有如下限制。首先，它们并非典型地选择性地抑制结合于血块的凝血酶，而在抑制游离凝血酶所需的同样浓度抑制结合于血块的凝血酶。其次，凝血酶的抑制通常是按化学计量的，因此，除非用很高的浓度，其抑制效应可被在表面结合凝血酶积聚部位(如旁路循环或动脉或静脉血栓形成部位)生成的大量凝血酶所抵消。上述两个限制的结果，必须典型地给予高浓度的凝血酶直接抑制剂(如水蛭素)以与结合于血块的凝血酶产生的游离凝血酶相互作用并抑制它。然而，这样高的抑制剂浓度能引起不希望有的出血。而且，凝血酶直接抑制剂(如水蛭素及其类似物和LMW活性部位凝血酶抑制剂，如阿加曲班)一般是可逆的，因此，当药物从血液中清除后，抑制效应则消失。不幸的是，这种可逆的抑制可导致凝血的反跳激活。

此外，用可逆或不可逆地与凝血酶的活性(如催化的)部位结合的第三类化合物可达到灭活结合于血块的凝血酶。PPACK是不可逆的活性部位抑制剂的一个例子。然而，这样的抑制剂通常对凝血酶缺乏足够的特异性，因而安全性有问题。而且，这样的抑制剂与水蛭素有同样的限制性，它们对结合于血栓的和游离的凝血酶典型地具有同样的活性。这是有问题的，因为证据表明，用活性部位不可逆抑制剂引起的游离凝血酶的总抑制可导致过度出血。

由于上述理由，有必要改善例如用于抑制伴有心血管疾病的血栓形成的组合物和方法。特别是，需要提供能从血管系统内存在的血栓降低或消除结合于纤维蛋白的凝血酶的活性的组合物和方法。相应的结合于血块的凝血酶的消除或减少应当是基本上不可逆的，以便停止给予治疗剂后，血块增生实质上不会恢复。因此，需要用不强烈灭活游离凝血酶的药剂来灭活血块或血栓内的凝血酶的组合物和方法，因为这样的药剂不会对出血的控制(止血)有不利的影响。本发明满足这些及其它需要。

美国专利No.5,240,913和5,196,404描述了用于阻断凝血酶活性部位的水蛭素衍生物，WO92/10575描述了双功能抗血栓形成组合物，它包括糖蛋白IIb/IIIa抑制区域和凝血酶抑制区域。WO90/00178描述了用于抑制血栓形成的糖蛋白IIIa的肽类似物。美国专利No.5,239,058和5,189,019及PCT公布WO93/09803、WO92/04378和WO92/01464描述了因子X和/或Xa的抑制剂。美国专利No.5,223,427和5,023,236和WO92/06711描述了因子VII和/或VIII的抑制剂。WO92/08472描述了血小板抗粘附剂。关于凝血酶的结构与功能的综述，见Stubbsand Bode，Thrombosis Research 69：1-58(1993)。关于肝素的限制性和新抗凝剂作为抗血栓形成剂的潜在优点的综述，见Hirsh，Circ.88：I-C(1993)。

另外，各种改良的肝素组合物，以及其它葡糖氨基聚糖及其衍生物已被开发出来。例如，美国专利No.5,296,471、5,280,016和5,314,876分别描述了肝素的脱硫反应；肝素/肝素硫酸盐的高碘酸盐氧化反应，随后是所得醛基的还原反应；和高分子量N，O-硫酸化heparosans。低分子量肝素片断已被使用了多年(见Boneu，et al.，Thrombosis Research 40：81-89(1985))。近来，开发了各种硫酸皮肤素并研究了它们与肝素辅助因子II的相互作用(见Mascellani，et al.，Thrombosis Research74：605-615(1994)，和Sheehan，et al.，J.Biol.Chem.289：32747-32751(1994))。

发明概述

本发明提供治疗心血管疾病的组合物和方法。本发明特别涉及能选择性灭活结合于血块的凝血酶的药剂。更具体地，一方面，本发明提供能选择性灭活结合于血块中的纤维蛋白或某些其它表面的凝血酶但对游离凝血酶却只有最小抑制活性的肝素辅助因子II特异性(HCII)催化剂。本发明的HCII特异性催化剂的选择性活性使其能在对游离凝血酶产生最少灭活的浓度下灭活患者体内结合于纤维蛋白的凝血酶，从而减少了出血的危险性。较好的是，纤维蛋白或表面结合凝血酶的灭活基本上是不可逆的，结果是在这种HCII特异性催化剂(如激活、催化或引起HCII介导的纤维蛋白结合凝血酶灭活的激活剂)从血液中清除后，血块增生实质上不会再继续。

在一个实施方案中，本发明的药剂是低分子量肝素(LMWH)制剂，它们经修饰成含有低于约5％(较佳为低于约3％)的抗凝血酶III(ATIII)催化活性，或可替换地，未修饰的LMWH或标准肝素，但比硫酸皮肤素具有较高的ATIII激活活性。此外，与标准肝素相比，它们的链长缩短，因此，作为HCII介导的游离凝血酶灭活的催化剂，本发明的药剂比标准肝素或硫酸皮肤素活性低得多。这样，本发明的药剂在凝血酶凝血时间测定中测得对游离凝血酶的活性很弱，不会被预想到是有效的抗血栓形成剂。然而，非常令人惊讶的是，本发明的药剂能有效地催化HCII介导的表面结合凝血酶(如结合于纤维蛋白或结合于血块的凝血酶)的灭活。

表面结合凝血酶典型地通过形成共价、不可逆凝血酶-HCII复合物而被灭活。因此，与典型的抗凝血酶和其它抗凝剂(如硫酸皮肤素、肝素、低分子量肝素(LMWH类)、水蛭素及其它的凝血酶直接抑制剂)形成对照，本发明的HCII特异性催化剂具有选择性、较佳为不可逆性灭活纤维蛋白结合凝血酶的能力，而对液相凝血酶没有较大的抑制效应。并不与某种理论相联系，这种能力由以下的事实来解释，即本发明的药剂产生HCII构象改变，使其在凝血酶固定于一个表面时能与之有效地结合，但当凝血酶游离在液相中时则没有足够的体积以有效地结合凝血酶。

本发明的药剂可用于各种方法，如减轻患者的血栓形成而不引起临床上不安全的全身出血增加。这样的方法一般包括对患者投与能灭活血块结合凝血酶而仅最低限度灭活游离凝血酶的药理学上可接受剂量的药剂。这些药剂以如下特征为佳：在抗因子IIa试验中由约2-5单位/mg肝素辅助因子II介导的特异的抗因子IIa活性，在抗因子Xa试验中约0.2-1.5单位/mg的抗凝血酶III催化剂比活性，及在水介质中约150-1,000mg/ml的溶解度。而且，这些药剂具有的抗凝效应归因于HCII和ATIII介导的机制和不依赖于HCII和ATIII的机制。另外，这些药剂较佳为少于约24个单糖单位的聚阴离子碳水化合物。典型的为分子量介于约3,000至约8,000道尔顿(±1,000道尔顿)的肝素制剂。

本发明包括可用各种技术从肝素制得的肝素制剂。在一个实施方案中，先用化学解聚法降低肝素(如未分级的标准肝素)的分子大小，然后分离和收集分子量在3,000-8,000道尔顿(±1,000道尔顿)的级分。在目前的优选实施方案中，用亚硝酸解聚肝素。然后，将所得的低分子量肝素进行化学修饰以降低其对抗凝血酶III的亲和力。这可以用化学方法完成，或可通过使用抗凝血酶III亲和柱来完成。在目前的优选实施方案中，这是通过氧化反应随后还原反应的化学方法来完成。在这个优选实施方案中，所得的低亲和力、低分子量肝素是具有天然糖(如糖醛酸残基)为非还原末端和2，5-脱水甘露糖醇残基为还原末端、分子量介于约3,000和约8,000道尔顿之间的肝素分子的混合物。在这一实施方案中，相信分子量的降低和ATIII激活活性的降低赋予本发明的药剂以选择性灭活血块结合凝血酶而仅最小限度灭活游离凝血酶的能力。

作为肝素制剂的替换物，本发明的药剂可以是例如对HCII具有亲和力的肝素以外的带负电荷的多糖、带负电荷的聚阴离子、负电性有机分子等。这样的物质会典型地以至少10^-6M(较佳为至少约10^-8或更强的)亲和力结合于HCII，但对凝血酶的亲和力弱，较佳为弱于约10^-6M。

如果需要，可根据用途制备在患者体内抑制血栓形成而实质上不抑制正常凝聚的药物组合物，这些组合物包括：

i)约90-99.9重量％能选择性抑制血块结合凝血酶的药剂，特别是HCII特异性催化剂，它对ATIII有最小的亲和力或基本上没有ATIII结合亲和力，能取代和灭活纤维蛋白结合凝血酶；和

ii)约0.1-约10重量％的ATIII催化剂或ATIH激活剂，如能灭活液相凝血酶的肝素或低分子量肝素(LMWH)。

在目前的优选实施方案中，任意混合的组合物的HCII催化活性或HCII激活活性约为2-5单位/mg，较佳的约为3-4单位/mg。

在另一个实施方案中，本发明提供抑制患者体内血块结合凝血酶和液相凝血酶而不增加全身出血临床不安全性的方法，该方法包括对患者投与药理学上可接受剂量的(i)能灭活血块结合凝血酶的HCII特异性催化剂、对抗凝血酶III(ATIII)具有最小亲和力及在抗因子II试验中约2-5单位/mg对肝素辅助因子II比活性的HCII特异性催化剂；和(ii)能灭活液相凝血酶的ATIII催化即激活剂。适用于本方法的ATIII激活剂包括(但不限于)肝素和低分子量肝素。在此方法中，HCII特异性催化剂和ATIII催化剂即ATIII激活剂可同时或相继地投与患者。当同时投与时，HCII特异性催化剂和ATIII催化剂可作为单一的溶液或化合物或两者挑一地作为两个不同的溶液或化合物投药。

在另一个实施方案中，作为同时、分别或相继使用以抑制患者体内血块结合凝血酶和液相凝血酶而不引起全身出血的临床不安全性增加的合并制剂，本发明提供一种产物，包括(i)能灭活血块结合凝血酶的本发明的药剂；和(ii)能灭活液相凝血酶的ATIII催化剂。适用于该产物的ATIII催化剂包括(但不限于)肝素和低分子量肝素。在此产物中，凝血酶灭活剂和ATIII催化剂可同时给患者投药。当同时给患者投药时，凝血酶灭活剂和ATIII催化剂作为单一的溶液或化合物或两者挑一地作为两个不同的溶液或化合物投药。

本发明的优选的药剂得自肝素。本发明所包括的一类产物包括这样的优选的药剂和作为另一亚类的本发明的肝素制剂，两个亚类的产物都有开环形式的非硫酸化糖醛酸残基和实质上游离的醛基。这一类的典型成员具有约30％其开环形式的糖醛酸残基。另一类这种优选的药剂和肝素制剂包括具有天然糖(如糖醛酸残基)作为非还原的末端和2，5-脱水甘露糖醇残基作为还原末端的产物。一些特别优选的产物属于上述两种类型。

本发明的另一方面在于能选择性灭活血块结合凝血酶的聚阴离子碳水化合物，有利于可得自肝素的游离凝血酶，它具有开环形式的非硫酸化糖醛酸残基，实质上无游离醛基。

本发明还提供能选择性抑制血块结合凝血酶的产物，一种HCII特异性催化剂，它可通过如下步骤得到：

(i)通过亚硝酸解聚反应使未分级的标准肝素解聚；

(ii)用高碘酸钠在水介质中将解聚的肝素于4℃氧化24小时，加入过量乙二醇停止氧化反应，然后用透析管对蒸馏水充分透析，除去500MW的分子；

(iii)加入硼氢化钠将氧化的产物还原，使反应混合物于23℃静置25小时后，用HCl将反应混合物的pH调节为3.0以破坏过剩的硼氢化物，然后加入NaOH将pH快速升至7.0；

(iv)将所得的产物对蒸馏水充分透析；及

(v)冷冻干燥回收产物；并任选地

(vi)将产物通过抗凝血酶III亲和柱，所得的产物具有如下性质：

-分子量为3.000-8,000(±1,000)

-比活性为约2-5抗因子IIa单位/mg

-比活性为约1.5抗凝血酶IIa单位/mg。

还有一个方面，提供了具有天然非还原糖为一个末端基团、2，5-脱水甘露糖醇非还原糖为另一个末端基团的HCII特异性催化剂的制备方法，所述方法包括：

(i)解聚未分级的肝素；

(ii)氧化所得的低分子量肝素；和

(iii)还原经氧化的低分子量肝素；

其中该方法任选地包括再提纯和获得所述HCII特异性催化剂的其它步骤。

本发明的产物和药剂主要是药用的。因此，本发明包括本发明的任何产物和药剂(例如，激活HCII介导的凝血酶的抑制而排除明显的ATIII介导的凝血酶的抑制的药剂)用于制备治疗心血管疾病的药物上的应用。可被使用的本发明的其它产物和药剂包括HCII特异性催化剂、LMWH制剂、聚阴离子碳水化合物和如上可得到的产物及实施例中描述的产物V18(或与V18实质上相似的产物)，以及与上述产物和药剂基本上具有同样特性或抑制或药理学性质的物质。

本发明进一步包括具有开环形式的非硫酸化糖醛酸残基和基本上不含醛基的肝素衍生物用于制备预防或治疗血栓形成的药物上的应用。

除了上面所述的，还提供这样的药物组合物，它们包括结合于HCII使其与凝血酶上的非纤维蛋白结合部位相互作用的药剂或产物。本发明进一步提供包括HCII特异性催化剂和ATIII催化剂(即ATIII激活剂)的药物组合物，及包括选择性灭活表面结合或血块结合凝血酶的药剂和液相凝血酶抑制剂的组合物。可以是混合形式的这样的药物组合物对于治疗各种心血管疾病是有用的。此外，这样的组合物与常规的溶血栓治疗(如给予血纤维蛋白溶酶原组织激活剂(tPA)、链激酶等)及与血管内干涉(如血管成形术、动脉切开术等)结合是有用的。

参考说明书的其余部分和附图，则对本发明本质和优点的进一步理解会变得明显起来。

附图的简要说明

图1阐明肝素与HCII结合、促进HCII和凝血酶之间接近从而在凝血酶和HCII上的Leu-Ser键之间可形成不可逆共价键的可能机制。

图2和图3阐明本发明的HCII特异性催化剂能对表面结合凝血酶具有选择性活性的可能机制。

图4和图5显示用含滤膜板试验比较各种肝素和LA-LMWH HCII特异性催化剂，即V18，抑制和从纤维蛋白取代凝血酶相对能力的一系列实验平均结果。取代和灭活均有剂量反应关系，在4μM时灭括85％，取代60％。对取代的凝血酶和残余灭活纤维蛋白结合凝血酶进行的凝胶分析表明HCII共价结合于凝血酶，表明凝血酶持久地被灭活。

图6A和图6B用“悬挂血块”(hanging clot)试验阐明硫酸皮肤素和本发明的LA-LMWH HCII特异性催化剂，即V18，分别灭活游离和纤维蛋白结合凝血酶的能力。

图7表明V18在葡聚糖凝胶G-50上的洗脱图。

图8表明标记凝血酶从纤维蛋白凝块上的扩散速度。

图9表明在有或无60μg/ml本发明的HCII特异性催化剂之一(即V18)时，0.25μMHCII对提纯的纤维蛋白原中纤维蛋白结合凝血酶的活性的影响。

图10表明用于测量药剂抑制人全血系统凝血的体外再循环回路。

图11表明当同一人血样的等分试样在体外再循环回路中测试时硫酸皮肤素和本发明的LA-LMWH HCII特异性催化剂之一(即V18)的比较效应。

图12表明用LA-LMWH HCII特异性催化剂(即V18)和ATIII催化剂(如肝素)混合的结果。

图13表明未修饰的LMWH 1抗Xa单位/ml和2抗Xa单位/ml对滤膜上的凝块和对凝血酶凝集时间(TCT)的效应。

图14和图15表明在体外再循环回路中，硫酸皮肤素和本发明的LA-LMWHHCII特异性催化剂之一(即V18)在120μg/ml-960μg/ml的浓度范围内对凝血的比较效应。

图16表明水蛭素在10U/ml-20U/ml的浓度范围内对体外再循环回路中凝血的效应。

图17表明肝素或肝素合用V18在旁路模拟模型中的效应。

图18表明本发明的LA-LMWH HCII特异性催化剂之一(即V18)在气囊损伤后对血块重量的影响。

图19表明标准肝素在气囊损伤后对血块重量的影响。

图20表明标准肝素和本发明的LA-LMWH HCII特异性催化剂之一(即V18)在气囊损伤后对血块重量的影响。

图21表明用家兔静脉血栓形成治疗模型测得各种抗凝剂对血块溶解的效应。

图22表明用家兔静脉血栓形成治疗模型测得各种抗凝剂对血块增大的效应。

图23表明V18对正常血浆 ATIII缺乏的血浆(-■-)和HCII缺乏的血浆 中TCT(A)、APTT(B)和因子Xa凝血时间(Xa凝血时间)(C)的效应。

图24表明LMWH对正常血浆

ATIII缺乏的血浆(-■-)和HCII缺乏的血浆

中TCT(A)、APTT(B)和因子Xa凝血时间(Xa凝血时间)(C)的效应。

图25表明硫酸皮肤素对正常血浆 ATIII缺乏的血浆

和HCII缺乏的血浆(-■-)中TCT(A)、APTT(B)和因子Xa凝血时间(Xa凝血时间)(C)的效应。

图26表明级分1对正常血浆

ATIII缺乏的血浆

和HCII缺乏的血浆(-■-)中TCT(A)、APTT(B)和因子Xa凝血时间(Xa凝血时间)(C)的效应。

图27表明级分2对正常血浆

ATIII缺乏的血浆 和HCII缺乏的血浆(-■-)中TCT(A)、APTT(B)和因子Xa凝血时间(Xa凝血时间)(C)的效应。

图28表明级分3对正常血浆

ATIII缺乏的血浆

和HCII缺乏的血浆(-■-)中TCT(A)、APTT(B)和因子Xa凝血时间(Xa凝血时间)(C)的效应。

图29表明肝素(0.1U/ml)对DS和V18引起的凝血酶时间延长的附加效应的比较。

图30表明肝素剂量的增加对加入凝血酶(A)(-■-)、PPACK血块(B) 和血块结合凝血酶(C)

的全血凝血时间的效应。

图31表明硫酸皮肤素剂量的增加对加入凝血酶(A)(-■-)、PPACK血块(B)

和血块结合凝血酶(C)

的全血凝血时间的效应。

图32表明V18剂量的增加对加入凝血酶(A)(-■-)、PPACK血块(B) 和血块结合凝血酶(C) 的全血凝血时间的效应。

图33表明级分1剂量的增加对加入凝血酶(A)(-■-)、PPACK血块(B)

和血块结合凝血酶(C)

的全血凝血时间的效应。

图34表明级分2剂量的增加对加入凝血酶(A)(-■-)、PPACK血块(B) 和血块结合凝血酶(C)

的全血凝血时间的效应。

图35表明级分3剂量的增加对加入凝血酶(A)(-■-)、PPACK血块(B) 和血块结合凝血酶(C) 的全血凝血时间的效应。

图36比较了肝素((A)，上面)级分1((B)，中间)及肝素和10μg/ml级分1合用((C)，下面)对加入凝血酶(A)(-■-)、PPACK血块(B)

和血块结合凝血酶(C)

的全血凝血时间的效应。

图37表明标准肝素和硫酸皮肤素(120μg)合用剂量的增加对加入凝血酶(A)(-■-)、PPACK血块(B)

和血块结合凝血酶(C)

的全血凝血时间的效应。

图38表明硫酸皮肤素和标准肝素(0.5U/ml)合用剂量的增加对加入凝血酶(A)(-■-)、PPACK血块(B)

和血块结合凝血酶(C)

的全血凝血时间的效应。

图39表明V18和标准肝素(SH)(0.5U/ml)合用剂量的增加对加入凝血酶(A)(-■-)、PPACK血块(B)

和血块结合凝血酶(C) 的全血凝血时间的效应。

图40表明肝素对预防旁路循环中的凝血的效应。

图41为比较级分1、2和3与肝素1.5U/ml在旁路循环中的效应。

图42总结了在有或无ATIII存在的缓冲系统中抑制剂的抗Xa活性。

图43表明在有或无ATIII或HCII存在下对各种GAGs测得的含血纤维蛋白原缓冲系统中凝血酶凝血时间的延长。

图44表明在加入了各种凝血酶的血浆系统中标准肝素(A)、LMWH(B)、V18(C)和V18的级分1对灭活Xa、IXa和XIa的相对效应。

图45表明血小板对V18(A)、V18的级分1(B)、LMWH(C)和SH(D)的抗凝活性的效应。

图46表示在血小板富含型血浆(PRP)、血小板贫乏型血浆(PPP)和无血小板血浆(Pit-Free)中用各种GAGS的再钙化时间的结果。

图47表明损伤的装配(impaired assembly)的机制。

图48表明磷脂表面Xa因子的装配。

图49表明损伤的装配的结果。

图50表明损伤的装配的机制。

发明及最佳实施方案的详细说明

本发明提供灭活结合于血栓或血块中纤维蛋白的凝血酶的组合物和方法，从而血块结合凝血酶催化促进血块进一步增长的能力被削弱或消除。本发明的组合物和方法对于预防心脏旁路循环仪器中和肾透析患者体内血栓形成和治疗罹患或有罹患与血栓有关的心血管疾病(如不稳定性心绞痛、急性心肌梗塞(心脏病突发)、脑血管意外(中风)、肺栓塞、深部静脉血栓形成和动脉血栓形成等)的患者上是特别有用的。但是，本发明并不限于这些应用，此处描述的组合物和方法可在需要抑制血块或血栓增长或促进血块或血栓溶解的其它体外或体内情况下找到其用途。例如，本发明的组合物在各种体外研究、试验等中可用作抑制凝血酶引起的凝血的抗凝剂。

本文所用的“蛋白聚糖”包括连接一个或一个以上葡糖胺聚糖链的蛋白质。蛋白聚糖是具有反映蛋白质和葡糖胺聚糖链性质的聚阴离子化合物。

本文所用的“葡糖胺聚糖”包括由重复二糖单位组成的多糖。多糖总是包含氨基糖(如葡糖胺和半乳糖胺)和其它单糖，它们可以是如透明质酸、肝素、硫酸肝素、硫酸软骨素中的糖醛酸(如葡糖醛酸或艾杜糖醛酸)或硫酸皮肤素或如硫酸角质素中的半乳糖。葡糖胺聚糖链可在其重复二糖的任一基团上硫酸化。除了透明质酸外，所有葡糖胺聚糖均共价连接于“核心蛋白”，即作为蛋白聚糖存在。

本文所用的“肝素”(或可互换地称“标准肝素”(SH)或“未修饰的肝素”)包括由构成糖醛酸残基(D-葡糖醛酸或L-艾杜糖醛酸)和D-葡糖胺及残基的重复二糖组成的多糖链的混合物。这些二糖中的很多二糖在糖醛酸残基和/或葡糖胺残基上硫酸化。一般说来，根据肝素的来源及其分离方法，肝素的分子量介于约6,000道尔顿至约20,000道尔顿之间。肝素的重复二糖单位的结构式通常如下：

在上式中，糖醛酸的C₅-C₆上的“高能键-”表明糖醛酸既可以是D-葡糖醛酸(羧基向上)也可以是L-艾杜糖醛酸(羧基向下)。此外，R₁可以是H或SO₃，而R₂可以是H、Ac(乙酰基)或SO₃。

本文所用的“低分子量肝素”(LMWH)包括分子量为约3,000道尔顿至约8,000道尔顿的肝素制剂。

本文所用的“低亲和力肝素”(LAH)(或“低亲和力标准肝素”(LASH)包括以约10^-6M(较佳为低于约10^-5M)的亲和力结合于抗凝血酶III(ATIII)的肝素制剂。

本文所用的“低亲和力低分子量肝素”(LA-LMWH)包括分子量为约3,000道尔顿至约8,000道尔顿并以约10^-6M(较佳为低于约10^-5M)的亲和力结合于抗凝血酶III(ATIII)的肝素制剂。LA-LMWH制剂可以是分子量为约3,000道尔顿至约8,000道尔顿(±1,000道尔顿)的肝素分子的混合物。LA-LMWH分子的混合物此处一般指V18或称作L18。或者，用诸如凝胶排阻色谱法可将肝素分子的混合物分离成它的各种成分。LA-LMWH混合物可用凝胶排阻色谱法任意地分离成三种LA-LMWH级分。级分1平均分子量为约8,000道尔顿，级分2平均分子量为约5,000道尔顿，级分3平均分子量为约3,000道尔顿。

本文所用的“肝素制剂”包括从未分级的标准肝素制得的制剂。在一个优选实施方案中，本发明的HCII特异性催化剂是用如下化学反应从未分级的标准肝素制得的经修饰的肝素，这些化学反应为(1)将未分级的肝素用亚硝酸解聚，得到低分子量肝素(LMWH)；(2)用诸如高碘酸钠将所得的LMWH氧化，打开环状结构未硫酸化的糖醛酸基团；及(3)用诸如硼氢化钠将经氧化的LMWH还原，使解聚和氧化步骤中生成的醛还原成醇。

本文所用的“硫酸类肝素”(HS)包括含类似于肝素中所含的二糖重复单位的葡糖胺聚糖，但它有较多N-乙酰基、较少N-硫酸根和较低程度的O-硫酸根。

本文所用的“硫酸皮肤素”(DS)包括含由N-乙酰基-D-半乳糖胺和D-葡糖醛酸组成的二糖重复单位和由N-乙酰基-D-半乳糖胺和L-艾杜糖醛酸组成的二糖重复单位的不均一的葡糖胺聚糖。糖醛酸以可变的硫酸化程度存在。

本文所用的“水蛭素”包括从水蛭唾液腺提取的抗凝血酶物质。本文所用的“Hirulog”包括水蛭素的小分子合成类似物。

本文所用的“单糖”指含一个醛基或一个酮基的多羟基醇，即简单的糖。单糖包括天然存在的单糖和经化学修饰的单糖。经修饰的单糖包括(但不限于)硫酸化的增加或减少或具有经修饰的羧基、氨基或羟基的单糖。单糖可用如下方法进行化学修饰：N-脱硫(见例如Inoue，Y.，et al.，Carbohydrate Res.46，pp.87-95(1976))；N-再硫化(见例如Lloyd，A.G.，et al.，Biochem.Pharmacol.20，pp.637-648(1971))；N-乙酰化(见例如Danishefsky，I.，et al.，Biophs.90，pp.114-121(1970))；N-琥珀酰化(见例如Nagasawa，K.，et al.，J.Biochem.81，PP.989-993(1977))；N-脱乙酰化(见例如Dimitriev，B.A.，et al.，Carbohydr.Res.40，pp.365-372(1975))；O-脱硫(见例如Jacobson，I.，et al.，J.Biol.Chem.255，pp.5084-5100(1980))；羧基还原；游离羟基或氨基的甲基化，等等。

本文所用的“多糖”指借助糖苷键连接的10个以上单糖的直链或分支聚合物。

本文所用的“聚阴离子”指具有大量负电荷的分子。本文所用的“聚阴离子碳水化合物”包括具有大量负电荷的碳水化合物。

本文所用的“肝素添加剂”包括在给患者投药前与本发明的一个药剂混合的肝素或肝素样混合物。在本优选的实施方案中，肝素添加剂是未分级的肝素或从未分级的肝素中分离出的第三种最低分子量的级分。

本文所用的“连位醇基”包括在邻近的两个碳原子上的两个羟基。更具体地说，本文所用的“连位醇基”是指在本发明的肝素制剂的C2和C3碳原子上的两个羟基。

本文所用的“氧化剂”包括这样一种物质，它(1)容易产生氧气，(2)从一个化合物中除去氢，或(3)吸收负电子。合适的氧化剂包括(但不限于)高碘酸钠，和在本领域技术人员知道的反应条件下的四乙酸铅。

本文所用的“还原剂”包括通过还原其他物质而容易被氧化的物质。合适的还原剂包括(但不限于)硼氢化钠、其它金属氢化物，和在本领域技术熟练人员知道的反应条件下的氢化锂铝。

本文所用的“亲和力”用解离常数(K_d)表示。这样，每次提到亲和力时，是指K_d而非K_a。

本文所用的“全身出血的临床不安全性增加”包括在优选实施方案中使用最高活性浓度的药剂，激活的凝血时间也少于400秒，凝血酶凝血时间少于100秒。

本文所用的“抗因子IIa测定”是HCII催化测定，它是这样进行的：将一定量的人凝血酶加到含有生色的合成凝血酶底物的血浆中。与受试化合物一起培养后，测定405nm处的吸光度以确定剩余凝血酶的量。

本文所用的“抗因子Xa测定”是ATIII催化的测定，它是这样进行的：将一定量的因子Xa加到含有生色的合成因子Xa底物的血浆中。与受试化合物一起培养后，测定405nm处的吸光度以确定剩余因子Xa的活性。

本文所用的“悬挂血块测定”包括用于测试药剂对液相和血块结合凝血酶活性的抑制作用的一种测定。一般来说，为了测定对液相凝血酶活性的抑制效应，在指出的肝素浓度存在或不存在下，将α-凝血酶(0.2-0.4nM)与柠檬酸化的血浆于37℃一起培养60分钟。培养结束时，测定血纤肽A(FPA)的血浆水平，然后计算每个抑制浓度对FPA生成的抑制百分率。为了测定对血块结合凝血酶活性的抑制效应，在各种肝素浓度存在或不存在下，将洗涤过的纤维蛋白凝块在柠檬酸化血浆中于37℃培养60分钟。培养结束时，测定FPA的血浆水平，然后计算抑制剂的每个浓度对凝块引起的FPA生成的抑制百分率。

本文所用的“含滤膜板试验”(或“基于过滤的试验”)包括用于测试化合物取代和灭活结合于纤维蛋白的凝血酶的能力。该试验用实施例中所述的方案进行。

现已证明，凝血酶上的纤维蛋白结合部位(阴离子结合外部位2)不同于凝血酶上的纤维蛋白原结合部位(阴离子结合外部位1)。即当凝血酶结合于纤维蛋白时，与血块或血栓基质的情况一样，纤维蛋白结合部位会被占领，而当血纤维蛋白原结合部位保持在空间上可用于结合血纤维蛋白原并调整结合的血纤维蛋白原与凝血酶催化部位相互作用，这促进血纤维蛋白原转化为纤维蛋白。酶的活性部位和外部位1也可用于结合和截断其它底物，包括血小板上的因子V、因子VIII和凝血酶受体。

因此，为了从血块或血栓释放凝血酶到周围含水环境中，通常是进入血管环境的血液中，可破坏或干扰凝血酶上的纤维蛋白结合部位和/或纤维蛋白上的凝血酶结合部位。当血块或血栓中的纤维蛋白结合凝血酶受保护，不被肝素和内源性抗蛋白酶灭活时，从血块或血栓中释放的凝血酶对内源性抗蛋白酶和/或适当的药物治疗的灭活作用变得敏感起来。

众所周知，游离凝血酶即液相凝血酶被两种血浆抑制剂，抗凝血酶III(ATIII)和肝素辅助因子II(HCII)不可逆地灭活，而ATIII为主要的抑制剂。在某些种类硫酸化多糖的存在下，这两种抑制剂均显示明显的活性增强。人们发现，ATIII的活性被肝素和低分子量肝素(LMWH)催化，而HCII的活性被高浓度肝素和硫酸皮肤素催化。然而，尽管肝素(而非LMWH)是HCII的强催化剂，治疗浓度的肝素的主要效应是作为ATIII催化剂，因为在这样的浓度，肝素对ATIII的亲和力高于对HCII的亲和力。此外，ATIII的血浆浓度为HCII浓度的2倍多(分别为2.4μM和1μM)，因此只有当以很高浓度给药时，肝素才既催化ATIII又催化HCII。

HCII作为酶的假底物起作用而灭活凝血酶。凝血酶裂解HCII，导致酶-抑制剂共价复合物的生成。在缺乏催化剂时，此复合物的生成是很少的。但是，在硫酸皮肤素或肝素的存在下，HCII介导的凝血酶的抑制增加约2,000倍(见Tollefson，Ann，NY Acad.Sci.714，21-31(1994))。

硫酸皮肤素或肝素对HCII催化作用的模型包括一个两步过程。首先，硫酸化多糖结合于HCII的正电荷区，引起HCII分子的N-末端负电荷片断伸展(图1)。然后此负电性N-末端片断与称作外部位1的凝血酶上的正电荷区相互作用。构象改变的HCII与凝血酶的相互作用增加抑制率约50倍。如果硫酸化多糖链足够长，就出现明显提高HCII介导的凝血酶灭活率的第二步。在此第二步中，硫酸化多糖结合于凝血酶上称作外部位2的正电区。可结合于抑制剂和酶的硫酸化多糖有效地接近HCII和凝血酶，从而增加HCII介导的凝血酶的灭活约2,000倍。

本发明的HCII特异性催化剂的活性部分基于灭活结合于纤维蛋白的凝血酶而不是必须的取代。更具体地，假定的本发明的HCII特异性催化剂的活性模式部分基于下面的观察。首先，因为凝血酶经外部位2结合于纤维蛋白，因此外部位1可用来与构象改变了的HCII相互作用。结果，构象改变的HCII可灭活结合于纤维蛋白的凝血酶而不必取代它。第二，发现某些硫酸化多糖，它们没有足够长的链与HCII和凝血酶同时结合，在溶液中是HCII介导的凝血酶灭活的弱催化剂，但仍能有效地催化HCII灭活纤维蛋白结合凝血酶的作用。因此，本发明的HCII特异性催化剂作为体内血块结合凝血酶选择性抑制剂是有用的，因为它们灭活结合于纤维蛋白的凝血酶而不引起明显的全身抗凝状态。

不限于一个特定的理论，我们认为，这种选择性抑制的出现是由于对HCII介导的灭活游离凝血酶的催化作用即激活作用所需条件不同于HCII介导的灭活纤维蛋白结合凝血酶的激活作用所需的条件。因此，按照本发明，鉴定出灭活纤维蛋白结合凝血酶比灭活游离凝血酶更有效的聚阴离子。这些聚阴离子不能完全催化HCII介导的游离凝血酶的灭活，因为它们链长不够或它们缺乏既与HCII又与凝血酶结合所必须的负电荷。但是，这样的药剂能够灭活纤维蛋白结合凝血酶，因为在理论上，当凝血酶固定在纤维蛋白表面上时，架桥(即同时结合于HCII和凝血酶)不是HCII介导的凝血酶充分灭活的必要条件。取而代之的是，例如硫酸化聚阴离子引起的HCII构象改变足以促进灭活作用。

硫酸化多糖同时结合于HCII和凝血酶的能力是体积依赖性的。含有少于约24个单糖单位的硫酸化多糖典型地长度不足以与凝血酶结合，因此不能显著地增加HCII介导的凝血酶抑制率。但是，这些药剂仍可结合于HCII并引起构象改变，因此可增加凝血酶的抑制率至有节制的程度。而且，当凝血酶在外部位2结合于纤维蛋白而被固定时，不要求多糖结合于凝血酶，因此，血块结合凝血酶可容易地被HCII灭活，假定该抑制剂经低分子量多糖修饰过了的话(图2和3)。这被认为是本发明的HCII特异性催化剂对血块结合凝血酶的选择性的一种机械的解释。

本发明的化合物和方法可提供完全和接近完全的对血块结合凝血酶或血栓结合凝血酶的灭活，从而凝血酶介导的凝血的加强实质上被抑制或阻止。通常，可达到血块或血栓结合凝血酶的至少约60％抑制，较佳为至少约90％抑制，更佳为至少约95％抑制(从本文中看出，“抑制”是指凝血酶活性基本上不可逆地被灭活，因此凝血酶分子不能促进血块或血栓形成或增大；更一般地说，抑制指活性降低)。

一些HCII催化剂试验或HCII激活试验是本领域技术熟练人员所熟知的。这样的HCII激活试验的例子是抗因子IIa试验(见Ofoso，Blood 64：742-747 (1984))。其它的HCII激活试验包括美国专利申请序号No.08/175,211(1993年12月27日提交)。同样，一些ATIII催化剂试验或ATIII激活试验是本领域技术熟练人员所熟知的。这样的ATIII激活试验的例子是抗因子Xa试验(见Teien，et al.，Thromb.Res.8：413-416(1976))。此外，一些抗凝剂试验是本领域技术熟练人员所熟知的，如凝血酶凝血时间、因子Xa凝血时间、部分组织促凝血酶原激酶时间和激活凝血时间。上述试验在诸如Low-Molecular-Weight Heparin in Prphylaxis and Therapyof Thromoembolic Diswases(H.Bounameaux(ed.)；Marcel Dekker，Inc.；New York，New York(1994))中作了一般描述，这些均引入本文，对于各种目的作为参考。

现在仅通过实施例对本发明的产物和药剂作更详细的描述，作为例证举出本发明的HCII特异性催化剂。下面描述关于这种HCII特异性催化剂的优选性质也适用于本发明的其它药剂和产物。

本发明的HCII特异性催化剂以显示一个或一个以上如下特性为宜：

i)在生色抗因子IIa试验中，HCII催化剂比活性或HCII激活比活性为约2-5单位/mg，或更佳为约3-4单位/mg；

ii)在生色抗因子Xa试验中，ATIII催化剂比活性或ATIII激活比活性为约0.2-1.5单位/mg，较佳为约0.5-1.3单位/mg，更佳为约1单位/mg；

iii)在水介质中的溶解度从约150至约1,000mg/ml，较佳为从约200至约750mg/ml，更佳为从约400至约500mg/ml；

iv)在显示体内抗血栓效应的浓度，用凝血酶凝血时间为指标测得血浆中抗凝剂活性为20-80秒(对照组为20秒)，较佳为25-45秒，更佳为30秒；及

v)归因于HCII和ATIII介导的机制和不依赖HCII和ATIII的机制的抗凝剂效应。

本发明的HCII特异性催化剂较佳为葡糖胺聚糖。更特别是，HCII特异性催化剂较佳为约10至约24个单糖单位的聚阴离子碳水化合物，更佳为约14至约20个单糖单位的聚阴离子碳水化合物。典型的HCII特异性催化剂为分子量约3,000-8,000道尔顿(±1,000道尔顿)的肝素制剂。这样，在一个实施方案中，肝素是本发明的HCII特异性催化剂的优选来源。如前所述，肝素是由D-葡聚糖胺和D-葡糖醛酸或L-艾杜糖酸残基组成的高度硫酸化的右旋粘多糖。一般说来，肝素的分子量范围根据其来源和所用的分离方法而为约6,000-20,000道尔顿。在一个优选实施方案中，本发明的HCII特异性催化剂是用如下化学反应从肝素中制得的肝素制剂，这些反应是：(1)解聚未分级肝素得到LMWH；(2)氧化所得的LMWH；和(3)还原经氧化的LMWH。本领域技术熟练人员容易明白的是，这些步骤的顺序可以改变，如可将未分级的肝素氧化、解聚和还原，或者氧化、还原、解聚和还原，但最后一步必须为还原步骤。

然而，除了肝素制剂外，本发明的HCII特异性催化剂还可以是例如对HCII具有亲和力的除肝素外的带负电荷的多糖、带负电荷的聚阴离子、负电性有机分子等。这样的物质典型地会以至少10^-6M的亲和力(较佳为至少约10^-8M或更强)与HCII结合。但对凝血酶的亲和力弱，较佳为弱于约10^-6M。

在一个实施方案中，本发明的HCII特异性催化剂可以具有如下结构式：

在上式中，R₁选自H、D-葡糖氨酸残基、D-葡糖醛酸残基和L-艾杜糖醛酸残基；R₂选自H、D-葡糖氨酸残基、D-葡糖醛酸残基、L-艾杜糖醛酸残基和脱水甘露糖醇；R₃选自H和SO₃ ^-；R₄选自H、SO₃ ^-和CH₃CO^-。上式中，指数“n”独立地被选择，可为从0至约14的值。“n”值的选择是这样的，以使本发明的HCII特异性催化剂具有约3,000道尔顿至约8,000道尔顿(±1,000道尔顿)的分子量范围。

在另一个实施方案中，得自肝素的本发明的HCII催化剂可具有如下结构式：

在上式中，R₁和R₂独立地选自H、D-葡糖氨酸残基、D-葡糖醛酸残基和L-艾杜糖醛酸残基；R₃选自H和SO₃ ^-；R₄选自H、SO₃ ^-和CH₃CO^-。在上述结构中，具有对于ATIII的肝素五糖序列的序列实质上已用ATIII亲和色谱法除去。如上所述，本发明的HCII特异性催化剂具有约3,000道尔顿至约8,000道尔顿(±1,000道尔顿)的分子量范围。

得自肝素制剂的HCII特异性催化剂，即选择性催化HCII介导的纤维蛋白结合凝血酶灭活的催化剂，可用一些不同的方法制备。如上所述，在一个优选实施方案中，本发明的HCII特异性催化剂是用如下化学反应从肝素中制得的肝素制剂，这些反应是：(1)解聚未分级肝素得到LMWH；(2)氧化所得的LMWH，打开未硫酸化糖醛酸的环状结构；和(3)还原经氧化的LMWH，将解聚和氧化步骤中形成的醛还原成醇。在进一步优选的实施方案中，本发明的HCII特异性催化剂是用如下化学反应从肝素中制得的，这些反应是：(1)用亚硝酸解聚未分级肝素，得到LMWH；(2)用高碘酸钠氧化所得的LMWH；和(3)用硼氢化钠还原经氧化的LMWH。在这个优选实施方案中，所得的低亲和力、低分子量肝素是具有天然糖(如糖醛酸残基)为非还原末端、2，5-脱水甘露糖醇残基为还原末端、和分子量范围为约3,000至约8,000道尔顿的肝素分子的混合物。

更特别地，用氧化反应、然后还原反应的化学方法，或者用ATIII亲和色谱法，可从未分级的标准肝素(比活150-160单位/mg抗因子Xa和抗因子IIa)或低分子量肝素制备对ATIII具有低亲和力的肝素。在一个优选实施方案中，用化学方法制备对ATIII具有低亲和力的肝素。按照实施例部分所述的方案，这样的化学修饰涉及用氧化剂然后用还原剂处理肝素制剂中存在的连位醇基。合适的氧化剂包括(但不限于)高碘酸钠，及本领域技术人员知道的某些条件下包括四乙酸铅。合适的还原剂包括(但不限于)硼氢化钠、其它金属氢化物，及本领域技术熟练人员知道的某些条件下包括氢化锂铝。这些反应裂解了在针对ATIII的肝素五糖序列中所见的重要的非硫酸化葡糖醛酸的连位(即C2-C3)键。此键的裂解明显降低肝素对ATIII的亲和力。或者，可用ATIII亲和色谱法选择对ATIII具有很小或没有亲和力的肝素链。用任一种技术制备，所得的低亲和力肝素(LAH)都具有如下特性：

a)基本上缺乏ATIII催化(即ATIII激活)活性(≤1.5抗因子Xa单位/mg)，但保留抗因子IIa活性(约2-5单位/mg)，由于其催化，即激活，HCII的能力。

b)与起始物质相比，LAH或LA-LMWH具有降低的血浆抗凝剂活性(测定为激活的部分组织促凝血酶原激酶时间或凝血酶凝血时间)，但在含生理浓度HCII的缓冲液中，保留其催化凝血酶灭活的能力(见表1)。

表1

凝血酶凝血时间TCT
	(秒)
基线             19.2V18 120μg/mL    26.5V18 240μg/mL    31.5V18 480μg/mL    37.2V18 960μg/mL    43.6DS  120μg/mL    75.9DS  240μg/mL    445DS  480μg/mL    577DS  960μg/mL    841LAH 120μg/mL    556LAH 240μg/mL    717LAH 480μg/mL    1065LAH 960μg/mL    3403水蛭素10U/mL     ＞500水蛭素20U/mL     ＞500

c)在含滤膜板试验中，LAH作为标准肝素，在促进HCII介导的纤维蛋白结合凝血酶的取代(图4)和灭活(图5)上是有效的。标准肝素和LAH均将纤维蛋白结合凝血酶抑制到比LAH取代更大的程度，这与HCII能结合和灭活经外部位2保持结合于纤维蛋白的凝血酶的概念相一致。

d)被标准肝素或LAH取代的大部分凝血酶是与HCII共价复合的，如用SDS-PAGE分析测得的那样(数据没有显示)。

e)基于抑制血浆中血块产生的血纤维蛋白肽A(FPA)产生的程度，LAH与未分级标准肝素在灭活纤维蛋白结合凝血酶上同样有效(图6A和6B)。在悬挂血块试验中，两种药剂都只产生最小限度的凝血酶取代，因为凝血酶经外部位2结合于纤维蛋白，留下外部位1和活性部位自由地与HCII相互作用。

用各种技术，包括用亚硝酸进行解聚、用肝素酶进行酶促降解和进行凝胶过滤，可制备低分子量肝素(LMWH)级分。在一个优选实施方案中，用亚硝酸解聚从未分级的标准肝素制得LMWH。所得的LMWH典型地是分子量范围约为3,000道尔顿-8,000道尔顿(±1,000道尔顿)的肝素分子的混合物。此物质的混合物可直接或用诸如凝胶排阻色谱法分成其各种成分后加以使用。例如，LMWH混合物可用凝胶排阻色谱法任意地分成3个级分。级分1的平均分子量约为8,000道尔顿，级分2的平均分子量约为5,000道尔顿，而级分3的平均分子量约为3,000道尔顿。如本文所述实施例所表示的，这3个级分具有互相不同的和不同于该物质混合物即分子量范围为约3,000道尔顿至约8,000道尔顿的肝素分子混合物的性质。因此，根据使用该物质混合物、级分1、级分2、级分3或这些物质的各种组合，人们可利用其不同的性质。

尽管LA-LMWH，即V18，在从纤维蛋白覆盖的滤膜上取代凝血酶方面不如标准肝素有效(图4)，但它有效地抑制结合凝血酶(图5)。例如，4μM的V18(HCII特异性催化剂，LA-LMWH分子的混合物，分子量范围约为3,000-8,000道尔顿)仅取代60％结合凝血酶，但产生大于85％的结合酶活性抑制作用。但是，V18引起液相凝血酶的较少抑制，因为4μM的V18产生凝血酶凝血时间仅50秒，而4μM的标准肝素产生不可测量的凝血酶凝血时间。

本发明的LA-LMWH具有下列特性：

a)其比活性为约0.2-1.5抗因子Xa单位/mg和约2-5抗因子IIa单位/mg。

b)与未分级标准肝素和LAH相比，LA-LMWH具有降低的血浆中抗凝剂活性(以凝血酶凝血时间测定)，且在含生理浓度HCII的缓冲液中，产生较少催化即激活HCII介导的凝血酶灭活的作用(见上表1)。

c)在含滤膜板试验中，在促进HCII介导的纤维蛋白结合凝血酶的取代上LA-LMWH比标准肝素或LAH效应差，但它能在同样程度上促进激活凝血酶的灭活(图5和6)。

d)基于抑制血浆中血块产生的血纤维蛋白肽A(FPA)产生的能力(图6A和6B)，LA-LMWH在灭活纤维蛋白结合凝血酶上基本上与未分级标准肝素和LAH同样有效。相反，在凝血酶凝血时间试验中，LA-LMWH在灭活游离凝血酶上效应低于肝素和LAH的，约为其1/10。因此，与未分级的标准肝素和LAH相比，LA-LMWH选择性地促进血块结合凝血酶的灭活。

e)本发明的LA-LMWH具有的抗凝剂效应归因于HCII和ATIII两者介导的机制，及独立于HCII和ATIII两者的机制。

因此，本发明的产物和HCII特异性催化剂具有一个或一个以上如下特性。在一个实施方案中，本发明提供用两种方法进行过化学修饰的肝素制剂。首先，用诸如亚硝酸将其化学解聚，从而分子大小降低为原肝素分子大小的约1/3，其分子量范围典型地为约3,000-约8,000道尔顿(±1,000道尔顿)。这种修饰导致其催化肝素辅助因子II(HCII)对游离凝血酶的活性的能力明显损失，而保留其催化HCII对表面结合凝血酶的活性的能力。第二，它们经受氧化和还原反应，这导致它们的抗凝血酶III结合活性丢失约95-99％。更特别是，它们具有弱的ATIII催化活性，或换言之，ATIII激活活性，其证据为抗因子Xa水平为约0.2至约1.5单位/ml，这表示，与未修饰的低分子量肝素相比活性约降低95-99％。因此，本发明所得的HCII特异性催化剂对游离凝血酶具有弱的活性，其证据为在有效地灭活表面结合凝血酶的浓度它们不能延长凝血酶凝血时间大于5倍。这两种性质，即比起其它HCII催化剂，或换言之，HCII激活剂(如硫酸皮肤素)，灭活表面结合凝血酶比灭活游离凝血酶相对较大的能力，及与肝素、硫酸皮肤素和水蛭素相比，一些(尽管明显降低的)ATIII依赖性抗因子Xa活性，与它们在旁路循环中的抗血栓效应有关，这是在以凝血酶凝血时间延长为指标测得的比其它抗凝剂灭活游离凝血酶效应小的浓度下对表面结合凝血酶的测定。此外，十分令人惊奇的是，这些药剂的抗凝剂效应归因于HCII和ATIII两者介导的机制，及独立于HCII和ATIII两者的机制。

作为上述性质的结果，本发明的产物和HCII特异性催化剂即能取代和/或灭活血块结合凝血酶的催化剂可用于预防患者体内的血栓形成和/或阻断血栓增长而不增加全身出血，即不产生全身出血的临床不安全性增加。更特别是，本发明的HCII特异性催化剂可以灭活表面结合凝血酶而只有小的抑制游离凝血酶作用的剂量投与。这样，在另一个实施方案中，本发明提供在患者体内抑制血栓形成(以不产生全身出血的临床不安全性增加为宜)的方法，该方法包括给患者投与药理学上可接受剂量的能灭活血块结合凝血酶的肝素辅助因子II特异性催化剂，该HCII特异性催化剂的特征在于：(i)在抗因子IIa试验中对肝素辅助因子II的肝素辅助因子II比活性为约2-约5单位/mg；(ii)在抗因子Xa试验中对因子Xa的抗凝血酶III(ATIII)比活性为约0.2-约1.5单位/mg；及(iii)在水介质中的溶解度为约150-约1,000mg/ml。

本发明的HCII特异性催化剂(和其它凝血酶灭活剂)单独使用或与灭活游离凝血酶所需的低剂量的肝素或低分子量肝素合用时是有效的。在耐肝素的情况下(即需要很高剂量肝素的疾病)，例如，本发明的HCII特异性催化剂可用作肝素替代剂(heparin-sparing agent)。这样，在另一个实施方案中，本发明提供组合物，较佳的为HCII特异性催化剂和ATIII催化剂即ATIII激活剂的掺合物。这样的掺合物对于抑制患者体内血栓形成是有用的，而基本上不抑制正常凝血作用。因此，本发明的组合物或掺合物对于抑制患者体内血栓形成是有用的，而不引起全身出血的临床上不安全性增加。而且，这样的组合物或掺合物对于预防和治疗静脉或动脉血栓形成和预防体外循环中的凝血是有用的。

本发明的掺合物典型地为约90-99.9重量％的HCII特异性催化剂(更佳为约95-98.5重量％)；和约0.1-10重量％的ATIII特异性催化剂，即ATIII激活剂(更佳为约0.5-约5重量％)。典型地，掺合物的全部HCII催化活性约为2-5/mg，更佳为约2-约4单位/mg。适用于本发明掺合物ATIII催化剂或激活剂包括(但不限于)肝素和LMWH。此外，如果需要，可加入其它药剂以改善该掺合物，包括例如，LMWH(0.1-5重量％)、肝素(0.1-5重量％)、凝血酶直接抑制剂、激活的因子X的直接抑制剂等。

在另一个实施方案中，本发明提供抑制患者体内血块结合凝血酶和液相凝血酶而不导致增加全身出血临床不安全性的方法，该方法包括对患者投与药理学上可接受剂量的(i)能灭活血块结合凝血酶的HCII特异性催化剂，所述HCII特异性催化剂对抗凝血酶III(ATIII)具有最小限度亲和力及在抗因子IIa试验中约2-约5单位/mg对肝素辅助因子II的比活性；和(ii)灭活液相凝血酶的ATIII催化剂。合适的ATIII催化剂，即ATIII激活剂，包括(但不限于)肝素、低分子量肝素、凝血酶直接抑制剂和激活的因子X的直接抑制剂。此外，在该方法中，HCII特异性催化剂和ATIII催化剂，即ATIII激活剂，可同时、分别或相继地投与患者。当同时给患者投药时，HCII特异性催化剂和ATIII催化剂可作为单一的溶液或复方一起给药，或分成两个不同的溶液或复方给药。

本发明的HCII特异性催化剂和掺合物可作为用于治疗上述心血管疾病的药物组合物的组分而掺入。这样的组合物与常规抗血栓治疗合用也是有用的，如给予组织血纤溶酶原激活剂(tPA)、链激酶等，以及给予血管内干涉(如血管成形术、动脉切开术)等。

合适的药物组合物包括在药学上可接受的载体中的治疗有效的剂量的本发明的一种或几种活性产物，如本发明的HCII特异性催化剂。其它合适的药物组合物包括治疗有效的剂量的本发明的活性产物(如HCII特异性催化剂)和ATIII特异性催化剂的掺合物。关于“治疗有效的剂量”或“药理学上可接受的剂量”，是指在治疗如上所述的与血栓有关的心血管疾病时为了灭活血块结合凝血酶和/或抑制血栓增长而存在的足够量的产物或HCII特异性催化剂或诸如HCII特异性催化剂和ATIII特异性催化剂的复方或掺合物。

典型地，活性产物或HCII特异性催化剂以每剂约200mg-2g的浓度(较佳为每剂约500mg-1g的浓度)存在于药物组合物中。根据所用的特定HCII特异性催化剂的活性，每天剂量可变化很大，但通常以约30μg/kg体重/天至约500μg/kg体重/天的浓度存在，较佳的为约50μg/kg体重/天至约200μg/kg体重/天的浓度

关于复合的或掺合的药物组合物，活性产物或HCII特异性催化剂以每剂约3mg/kg-30mg/kg的浓度(较佳为每剂约3mg/kg-10mg/kg的浓度)存在，ATIII催化剂，即ATIII激活剂，以每剂约10U/kg-500U/kg的浓度(较佳为每剂约15U/kg-100U/kg的浓度)存在。根据所用的特定HCII特异性和ATIII特异性催化剂或激活剂的活性，每天剂量可变化很大。典型地，HCII特异性催化剂以约3mg/kg体重/天至约30mg/kg体重/天的浓度(较佳的为约3mg/kg体重/天-10mg/kg体重/天)存在，而ATIII催化剂通常以约10U/kg体重/天-500U/kg体重/天的浓度(较佳为约15U/kg体重/天-100U/kg体重/天的浓度)存在。

药学上可接受的载体可以是适合于对患者给予HCII催化剂或HCII特异性催化剂和ATIII特异性催化剂的掺合物的任何可相容的无毒物质。无菌水、醇、脂类、蜡和惰性固体均可用作载体。药学上可接受的佐剂、缓冲剂、分散剂等也可掺入药物组合物。这样的组合物将适合于口服、鼻内、呼吸道或胃肠外给药，更适合于胃肠外给药，即皮下、血管和静脉注射。还可选择经皮给予本发明提供的物质。

鉴于上面所述的，本领域技术熟练人员可容易地明白，本发明的HCII特异性催化剂或活性产物可有效地用于选择性地抑制血块或纤维蛋白结合凝血酶而不引起全身出血的临床不安全性增加。而且，本发明的HCII特异性催化剂可有效地与其它ATIII催化剂，即激活剂，(如肝素或LMWH)合用以抑制血块结合凝血酶和液相凝血酶而不引起全身出血的临床不安全性增加。这样，本发明的HCII特异性催化剂可单独使用，或与其它ATIII催化剂，即激活剂，合用以治疗很多重要的心血管并发症，包括不稳定性心绞痛、急性心肌梗塞(心脏病突发)、脑血管意外(中风)、肺栓塞、深部静脉血栓形成和动脉血栓形成等。

除了在治疗上面所述的心血管病的药物组合物上有用外，本领域技术熟练人员可容易地认识到本发明的活性产物或HCII特异性催化剂和复方可用作阐明体外血液凝固机制的试剂。

在产生了具有上述所需性质的肝素级分或衍生物后，用本领域技术熟练人员熟知的各种方法就可产生具有类似催化特异性和/或亲和力的其它凝血酶灭活剂或HCII特异性催化剂。例如，Fodor等的美国专利No.5,143,854描述了称作“VLSIPS”的一种技术，其中，在固体基质的选定位置上形成了多种短肽集合。然后将这样的肽筛选其从构象上改变HCII的能力，这种筛选是任意地与肝素级分竞争。用噬菌体显示技术(如见Devlin，WO91/18980)也可产生和筛选这样的短肽库。任意地用其它方法可将这些多肽或其变异体多样化以获得对HCII结合亲和力的改善(如见Ladner的美国专利No.5,223,409，为各种目的将其全部引为参考)。

用常规的固相合成或重组技术(它们都是本领域中充分描述的)可制备HCII激活剂的肽类似物。合适的固相合成技术如Merriefield在J.Am.Chem.Soc.85：2149-2156(1963)中所描述的，基于在一固相基质上将氨基酸顺序加到一个增长的链上。商品化的自动固相合成系统现已可从供应商处(如Applied Biosystems，Inc..Foster City，California)大量获得。此外，重组多肽生产技术在技术和科学文献中广泛地加以描述。例如，见Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook，etal.，Eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)，vols.1-3。

本发明的HCII特异性催化剂的小分子类似物可通过使用药物设计领域的工作人员知晓的技术而获得。这样的方法包括(但不限于)self-consistent field(SEF)分析、构型相互作用(CI)分析和正常模式动力学计算机程序，所有这些都是可以容易地获得的。见Rein，et al.，Computer-Assisted Modeling of Receptor-LigandInteractions，Alan Liss，New York(1989)和Navia and Marcko，″Use of StructuralInformation in Drug Design，″in Current Opinion in Structural Biology，Vol.2，No.2，Pages 202-210，1992。

由这些技术所鉴定的化合物的制剂取决于它们的结构和其它特性，通常可通过可得到的教科书所述的方法用标准的化学合成方法得到，如Furniss，et al.，Vogel′s Textbook of Practical Organic Chemistry.，John Wiley&Sons，New York1992和Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers，Inc.，NewYork 1989.

本发明将通过具体实施例作更详细的描述。下面的实施例是作为例示目的而提供的，并不是为了以任何方式限制本发明。在实施例中，凝血酶灭活剂用从肝素衍生的HCII特异性催化剂作为例子，但本发明并不限于这些药剂。

实施例

A.材料的制备

肝素是从天然来源(通常是猪肠粘膜)分离出来的葡糖胺聚糖(GAG)。本发明的一个方面是制备一种低分子量肝素级分，它基本上无抗凝血酶III激活活性，但保持催化肝素辅助因子II的能力。作为催化肝素辅助因子II能力的结果，此经修饰的GAG能灭活结合于纤维蛋白的凝血酶。

一般说来，低分子量肝素是通过苄基化作用、然后是碱解聚作用、亚硝酸解聚作用、肝素酶催化的解聚作用或过氧化解聚作用，从未级分的标准肝素制得的。在最近的优选实施例中，低分子量肝素是用亚硝酸解聚作用从标准肝素制得的。然后将低分子量肝素修饰，以降低其对抗凝血酶III的亲和力。这可通过化学方法或采用抗凝血酶III亲和柱来完成。在最近的优选实施例中，这可通过先进行氧化反应随后再进行还原反应的化学方法来完成。所得的低亲和力、低分子量肝素典型地是分子量从约3,000-8,000道尔顿的肝素分子的混合物。此范围相当于约10-24个单糖单位。此材料的比活性为约2-5抗凝血酶单位/mg，低于约1.5(开始时，100抗Xa)抗Xa单位/mg。

材料的LA-LMWH可直接使用或用诸如凝胶排阻色谱法分成不同的组分。当用诸如凝胶排阻色谱法分离时，LA-LMWH级分一般得到3个LA-LMWH级分。级分1的平均分子量为约8,000道尔顿，级分2的平均分子量为约5,000道尔顿，级分3的平均分子量为约3,000道尔顿。图7表示用G-50葡聚糖凝胶柱和各种浓度的葡糖醛酸内酯所得的材料的LA-LMWH混合物的洗脱特征。关于材料的LA-LMWH混合物，这3个LA-LMWH级分的每一个的比活性均为约2-5抗凝血酶单位/mg，低于约1.5(开始时，100抗Xa)抗Xa单位/mg。

下面的实施例阐述可用于制备本发明的HCII特异性催化剂的试验方案。如上所提到的，在目前较佳的实施方案中，制备本发明的HCII特异性催化剂的化学反应为：(1)肝素的亚硝酸解聚得到低分子量肝素；(2)低分子量肝素的高碘酸盐氧化打开未硫化糖醛酸基团的环状结构；和(3)亚硝酸和高碘酸盐步骤中所形成的醛的硼氢化物还原(产生醇)。

1.实施例1：V-18，批号#7-1的制备

a.步骤1：LMW-肝素，批号#7的分离

将猪肠的肝素(250g)溶于5升纯水(5％溶液)。加入亚硝酸钠(3.45g)并溶于溶液中，浓度为10mM。溶液温度在18-24℃之间。用约2分钟加入37％HCl30ml，将pH从开始的6.32调节至最终的pH3.00。然后将所得的溶液室温搅拌2小时，使其发生解聚反应。在2小时培养结束时，通过缓慢加入约18ml 50％NaOH溶液使pH上调至6.75。

然后将样品稀释到12.5升体积，用装有10,000分子量截断膜的MilliporePellicon超滤装置(1.5m²)对10倍体积的纯水进行超滤。然后将超滤的滤过液浓缩并用装有3,000分子量截断膜(1.5m²)的Millipore Pellicon超滤装置进行透析。一旦125升滤过液浓缩至约6升，就将其对3倍体积的纯水进行透析。然后将截留物冷冻干燥，得到LMW-肝素，批号#7。得率＝106g(42％)。

用高效体积排阻色谱法结合多角激光扫描(HPSEC-MALLS)测定上述LMW-肝素中间体，批号#7(上述)的分子量特性并汇编于表2。

      表2 LMW-肝素中间体和V18产物的HPSEC-MALLS结果

批量：	#7	#7-1	#9	#9-1	#9-2	#20	#20-1
								＞2,000	100	100	99.8	100	100	99.2	100
＞3,000	100	100	80.4	100	100	76.4	77.1
								＞4,000	57.5	61.8	50.1	63.6	63.9	52.1	51.8
＞5,000	35.0	39.9	29.9	36.2	36.4	35.5	34.2
								＞6,000	22.2	25.0	18.2	20.6	20.6	24.4	22.9
＞7,000	14.0	16.3	10.8	12	11.8	16.5	15.8
								＞8,000	9.2	10.5	6.4	6.5	6.5	116.	10.9
＞9,000	5.8	7.1	3.6	3.6	3.6	7.7	7.6
								Mwii	4,989	5,228	4,583	5,022	5,024	4,920	4,876
Mwiii	4,421	4,602	4,031	4,582	4,603	4,067	4.006
								Mw/Mniv	1.129	1.136	1.137	1.096	1.091	1.210	1.217

i在某一分子量之上的重量级分，以百分率表示

ii重均分子量

iii数均分子量

iv多分散性

b.步骤2和3：LMW-肝素，批号#7的氧化和还原

将LMW-肝素，批号#7(100g)溶于1升4-10℃的纯水。将200mM乙酸钠1升(pH5.0)加到溶解的样品中。将200mM高碘酸钠2升加到缓冲后的LMW-肝素溶液中。在缓和的搅拌下将所得的溶液于4-10℃黑暗中培养48小时。

48小时后，加入甘油(70ml)破坏过剩的高碘酸钠。用50％NaOH 10ml将所得反应混合物的pH升至中性，所得溶液稀释至约5.5升。然后用装有3,000MWCO膜的Millipore Pellicon系统将溶液透析(超滤)(如步骤1所述)。收集约7倍体积滤过液后，将经氧化的LMW-肝素中间体溶液浓缩至约3升的体积。

经氧化的中间体的还原按如下步骤进行：向上述3升溶液中加入碳酸氢钠(63g)并混合。得到约0.25M NaHCO₃溶液。将此溶液保持冷却状态(4-10℃)，在搅拌下缓缓加入含有22.8g NaBH₄的溶液(1.2升)(也保持4-10℃)。当NaBH₄溶液加完后，将反应液于4-10℃保持3.5小时。再用6M HCl(约230ml)将反应液的pH调节至4.0，混合约30分钟，再加入50％NaOH将pH提高到6.2。然后用MilliporePellicon系统将该样品对3,000MWCO膜进行超滤(7倍体积)，最后通过0.2μSterivex(Millipore)滤膜进行灭菌过滤。所得溶液冷冻干燥得到V-18，批号#7-1。得率＝76.6g。

用HPSEC-MALLS测定产物的分子量特性，并汇编于上述表2。

2.实施例2：V-18，批号#9-1和9-2的制备

a.步骤1：LMW-肝素，批号#9的分离

将猪肠的肝素(250g)溶于5升纯水(5％溶液)。加入亚硝酸钠(8.62g)并溶于溶液中，浓度为25mM。溶液温度在18-24℃之间。用约2分钟加入37％HCl33ml，将pH从开始的6.32调节至最终的pH3.01。然后将所得的溶液室温搅拌2小时，使其发生解聚反应。在2小时培养结束时，通过缓慢加入50％NaOH溶液使pH上调至6.28。

然后将样品稀释到10升体积，用装有3,000分子量截断膜的Millipore Pellicon超滤装置(1.5m²)对7倍体积的纯水进行超滤。然后将样品浓缩至约3.5升并冷冻干燥，得到LMW-肝素，批号#9。得率＝120.4g(48％)。

用HPSEC-MALLS测定LMW-肝素，批号#9的分子量特性并汇编于上述表2。

b.步骤2和3：V-18，批号#9-1和9-2的氧化和还原

将批号#9 LMW-肝素的两个同样但分开的(50g)样品作如下处理：将LMW-肝素(50g)溶于500ml纯水(4-10℃)。将乙酸钠缓冲液500ml(200mM，pH5.0)分别加到每个同样的样品中。将高碘酸钠(200mM溶液1,000ml)加到每个反应液中。将所得的溶液于冷处黑暗中培养72小时。培养72小时后，加入甘油(40ml)到每个样品中以破坏过剩的高碘酸盐。将每个样品反应液的pH升至约6.5，用装有3,000MWCO膜的Millipore Pellicon系统将溶液对7倍体积纯水进行超滤。

经氧化的LMW-中间体的还原和所有其它步骤按上述实施例1中对于样品7-1所描述的进行。V-18，批号#9-1和9-2的产量分别为37.4g和36.7g。

用HPSEC-MALLS测定V-18，批号#9-1和9-2的分子量特性，并汇编于上述表2。

    3.实施例3：V-18，批号#20-1的制备

a.步骤1：LMW-肝素，批号#20的分离

将猪肠的肝素(500g)溶于10升纯水(5％溶液)。加入亚硝酸钠(9.0g)并溶于溶液中，浓度为12.8mM。溶液温度在18-24℃之间。用约2分钟加入37％HCl59ml，将pH从开始的6.27调节至最终的pH3.00。然后将所得的溶液室温搅拌2小时，使其发生解聚反应。在2小时培养结束后，通过缓慢加入50％NaOH溶液约38ml使pH上调至6.57。

然后将样品稀释到17升体积，用装有8,000分子量截断膜(1.5m²)的MilliporePellicon11超滤装置对10倍体积的纯水进行超滤。将超滤所得的滤过液浓缩并用装有3,000分子量截断膜(1.5m²)的Millipore Pellicon II超滤装置进行透析。一旦170升滤过液浓缩至约8.5升时将样品对7倍体积的纯水进行透析。然后将截留物冷冻干燥，得到LMW-肝素，批号#20。得率＝171.3g(34％)。

用HPSEC-MALLS测定LMW-肝素中间体，批号#20的分子量特性并汇编于上述表2。

b.步骤2和3：V-18，批号#20-1的氧化和还原

将LMW-肝素(批号#20，170g)溶于1700ml纯水(4-10℃)。将乙酸钠缓冲液(1700ml，200mM，pH5.0)加到样品中并混合。将高碘酸钠(200mM溶液3,400ml)加到混合物中以引发反应，将所得的溶液于冷处黑暗中培养72小时。培养72小时后，加入甘油(115ml)以破坏过剩的高碘酸盐。然后将反应液的pH升至约6.5，用装有3,000MWCO膜的Millipore Pellicon II系统将经氧化的LMW-肝素对7倍体积纯水进行超滤。

所得的经氧化的LMW中间体的还原和所有其它步骤按上述实施例中对于样品7-1所描述的进行。V-18，批号#20-1的产量为131g。

用HPSEC-MALLS测定V-18，批号#20-1的分子量特性，并汇编于上述表2。

B.基于过滤的测定法

除了测定各种肝素衍生物催化HCII-介导的液相凝血酶灭活反应的活性外，也对它们取代灭活纤维蛋白与凝血酶的结合进行了研究。在该系统中，在孔上有滤膜覆盖的96孔板的每个孔中加入25μl含有8μM纤维蛋白原、8mM氯化钙和8nM ¹²⁵I标记的凝血酶的缓冲液，形成纤维蛋白血块。在室温下培育30分钟后，获得的血块用150μl缓冲液洗两次，并通过反射性计数来确定结合的凝血酶的数量。各种浓度的肝素的不同衍生物在有HCII或没有HCII的情况下加入。在每种情况下，这些组分加入20μl体积中，培育20分钟然后吸气通过滤膜板。重复该步骤然后用50μl缓冲液洗两次。通过对洗出的缓冲液定量来测定被取代下血块的凝血酶的量，而通过对滤膜定量来测定仍结合在纤维蛋白上的凝血酶的量。通过加入合成凝血酶底物并在反应3分钟间隔后监测荧光信号的变化来测定残余结合的凝血酶的酶活。最后，收集洗下的缓冲液，取下滤膜，滤膜在含SDS的缓冲液中沸腾后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳并通过自动放射照相术来测定凝血酶与HCII复合的程度。

如图4中描述的，1μM HCII(这是HCII生理浓度)只取代少量的凝血酶。SH，LASH，LMWH和分子量为3000道尔顿的肝素级分在没有HCII时不取代凝血酶。然而，当与1μM HCII合用时，这些物质均可取代凝血酶(图4)，其中SH和LASH比LMWH(平均分子量为约5500道尔顿)有更多的取代。然而，所有的药剂均抑制仍结合在纤维蛋白上的凝血酶(图5)，而SH和LASH在高浓度时几乎完全抑制，而LA-LMWH，即V18，产生较小的抑制。对仍结合在滤膜上的物质进行凝胶电泳分析表明大部分的凝血酶与HCII复合，从而解释了其缺少显色活性的原因。这些结果表明仍结合在纤维蛋白上的凝血酶是通过外部位2结合的，留下外部位1和活性部位与HCII相互作用。

C.悬挂血块测定法

悬挂血块测定法用于测定药剂对液相凝血酶和血块结合凝血酶活性的抑制效应。为测定对液相凝血酶活性的抑制效应，在指定浓度的肝素存在或不存在时使α凝血酶(0.2-4.0nM)与含柠檬酸盐血浆在37℃培育60分钟。在培育阶段结束时，测定血纤维蛋白肽A(FPA)的血浆水平，然后在每个抑制剂浓度下计算FPA生成的抑制百分数。为测定对血块结合凝血酶活性的抑制效应，在各种浓度肝素存在或不存在时使洗过的纤维蛋白血块和含柠檬酸盐血浆在37℃培育60分钟。在培育阶段结束时，测定血浆FPA水平，然后计算出每个抑制剂浓度下的血块诱导FPA生成的抑制百分数。每个条代表三个单独的试验的平均值(每个试验作两次)，而条上的线代表SD。

图6A和6B描述了用悬浮血块测定法对硫酸皮肤素(原型HCII激活剂)和本发明的LA-LMWH HCII-特异性催化剂，即V18，灭活游离凝血酶和纤维蛋白结合的凝血酶的相对活性的比较。在5μg/ml时，LA-LMWH比硫酸皮肤素更有选择性(硫酸皮肤素在灭活纤维蛋白结合凝血酶上的效应只有一半，而LMWH在灭活纤维蛋白结合凝血酶和游离凝血酶几乎完全有效应)。在20μg/ml时，LA-LMWH的优点仍是显而易见的，尽管它稍微有些不明显。在高浓度时，两者在灭活纤维蛋白结合凝血酶和游离凝血酶上均有90％的效应。

悬挂血块测定法的另一些结果也表明本发明的LA-LMW HCII激活剂可与灭活的血块或与血栓连接的凝血酶结合。在这些试验中，使含有标记过的凝血酶的250μl血块悬浮在含有150mM氯化钠或2M氯化钠的10ml溶液中。在等渗缓冲液中加入下列中的一个：HCII0.25或0.5μM 100μgLA-LMWH HCII-特异性催化剂，或HCII和LA-LMWHHCII-特异性催化剂的组合。进行下列测定：(1)凝血酶扩散到血块外；(2)通过测定血纤维蛋白肽A在除去血块并加入纤维蛋白原溶液后的生成量来测定血块上的凝血酶的催化活性；和(3)通过使血块增溶和进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和自动放射照相术来测定凝血酶/HCII复合物形成的程度，

图8描述标记过的凝血酶从纤维蛋白血块扩散出的速率。5小时后约40％的凝血酶仍保留在悬浮在150mM NaCl中的血块上。加入单独的HCII或与LA-LMWH HCII-特异性催化剂，即V18，的组合均不影响扩散速率。实际上，HCII和LA-LMWH HCII-特异性催化剂小幅度地减少了扩散速率。相反，当血块悬浮在2M氯化钠中凝血酶的扩散速率有显著增长。

图9通过血块与原始溶液培育五小时并悬浮在纤维蛋白原溶液中后除去血块来测定比较血块结合凝血酶的催化活性。血块在HCII或LA-LMWH HCII-特异性催化剂，即V18，存在或不存在时悬浮在150nM氯化钠中生成约6000nM FPA。相反，由悬浮在150mM含有HCII和LA-LMWH HCII-特异性催化剂的组合的氯化钠中的血块的FPA产生约95％被抑制。悬浮在2M氯化钠中的血块生成约4000nM FPA，这与这些在有或没有HCII的低盐缓冲液中培育的血块发现只有一半的凝血酶是一致的。这些结果表明本发明的LA-LMWH HCII-特异性催化剂，即V18，可在HCII存在时灭活血块结合凝血酶，但如图8所示，其可在不将凝血酶从血块中取代出即可做到。这支持了凝血酶通过外部位2与凝血酶结合，而留下外部位1与HCII相互作用(见美国专利申请号No.08/175,211(1993年12月27日提交)，该理论在这里作引证参照)。

凝胶分析表明从悬浮在含有HCII和LA-LMWH HCII-特异性催化剂，即V18，组合的缓冲液中血块上回收得到的高百分数的凝血酶与HCII复合。相反，在只含有HCII或LA-LMWHHCII-特异性催化剂的缓冲液中的血块上回收得到的主要是未复合的凝血酶。这些结果表明LA-LMWH HCII-特异性催化剂，即V18，通过催化凝血酶和HCII之间的共价复合物来形成对血块结合凝血酶的永久性灭活。

D.体外再循环回路

用一个体外封闭的含有人血的回路来测定各种抗凝血物灭活表面结合的凝血酶的活性，从而来证明灭活纤维蛋白结合凝血酶的选择性活性，用凝血酶凝血时间来测定各种抗凝血物灭活液相凝血酶的活性。本发明的LA-LMWH HCII-特异性催化剂，即V18，与下列抗凝血物进行比较：硫酸皮肤素，低分子量肝素，未分级的肝素和水蛭素。

1.体外封闭回路

图10表示体外封闭回路的流程图。回路包括与40微米输血过滤器(PallSQ40S)相连的Tygon试管(3/16″×1/16″)。系统包括三通阀来进行血取样。与压力记录器(Hewlett-Packard)连接的外科压力转换器与过滤器相连，因此，过滤器的血块形成压力的稳定增长。采用了来自正常的健康献血者的含柠檬酸盐的全血。回路充满了50ml的全血并置于蓄水槽中，维持在37℃的水浴下。将待测定的抗凝血物加入回路中，血块通过重新钙化(0.8ml的1.0M氯化钙)来引发，血用滚动压头泵(Cole-Parmer MFLX调节器与大的F/6滚动压头夹头)以恒定流速再循环通过成血栓表面。在靠近过滤器的回路处插入一个压力计以检测其中的压力变化。当纤维蛋白在过滤器的表面形成以及当凝血酶与血块结合或血栓促进进一步凝血时，其逐渐阻碍了流动。

用该系统可同时测定表面结合凝血酶和液相凝血酶的灭活。更具体的是，表面结合凝血酶的灭活可通过记录回路中的凝血的滞后来定量。该滞后是归因于，尽管是很小程度上，通过抗凝血物对液相凝血酶(其产生是通过血块结合凝血酶来加强的)的灭活效应来实现的。通过记录用重新钙化前从回路取出的血制备的血浆的凝血酶凝血时间来对液相凝血酶的灭活进行定量。

2.结果

下列几点归纳了试验的结果：a)将两种HCII激活剂，即LA-LMWH HCII-特异性催化剂(V18)或硫酸皮肤素中的一种单独加入血中(图11)；b)加入HCII激活剂与低浓度(小于2(重量)％)的未修饰的低分子量肝素(LMWH)的组合(图12)；c)单独使用未修饰的LMWH(图13)；d)单独加入硫酸皮肤素(图14)；e)单独加入LA-LMWH(图15)；和f)单独加水蛭素(图16)。

图14和15描述了在回路中，硫酸皮肤素和本发明的LA-LMWH HCII特异性催化剂，即V18，在120μg/ml-960μg/ml的浓度范围内对凝血的比较效应。如图8所示，LA-LMWH HCII-特异性催化剂，即V18，在回路中对凝血产生了与剂量有关的抑制。更具体地，LA-LMWH剂量为240μg/ml时回路中的凝血在约20分钟内产生，当LA-LMWH剂量为960μg/ml时不发生凝血。相应的凝血酶凝血时间列在上面的表1。下面的表3列出各种浓度的LMWH或LA-LMWH和LMWH或硫酸皮肤素的组合的对比效应。LA-LMWH浓度为240μg/ml时凝血酶凝血时间为26秒，LA-LMWH浓度为960μg/ml时凝血酶凝血时间为43.6秒。相反，如图15所示的，硫酸皮肤素浓度为240μg/ml时回路中的凝血在小于10分钟内发生，尽管相应的凝血酶凝血时间超过了500秒(见表1，上面)。而且，硫酸皮肤素浓度为960μg/ml时回路中的凝血在小于20分钟内发生，尽管相应的凝血酶凝血时间为841秒(见表1，上面)。

            表3

    凝血酶凝血时间(2单位)

加入	TCT(秒)
		对照	21
0.5单位/mL LMWH1.0单位/mL LMWH2.0单位/mL LMWH	203764
		240μg/mL LA-LMWH240μg/mL DS	26＞500
0.5单位/mL LMWH+240μg/mL LA-LMWH0.5单位/mL LMWH+240μg/mL DS	20＞500
		1单位/mL LMWH+240μg/mL LA-LMWH1单位/mL LMWH+240μg/mL DS	38＞500

LMWH       -低分子量肝素

LA-LMWH    -低亲和力低分子量肝素

DS         -硫酸皮肤素

此外，当等分相同的人血样品在模型中测试时，比较LA-LMWH HCII特异性催化剂，即V18，和硫酸皮肤素的相对效应(图11)。从重量角度，LA-LMWHHCII-特异性催化剂比硫酸皮肤素在防止回路血栓形成方面的效果更好。因此，480μg/ml的LA-LMWH HCII-特异性催化剂可完全抑制凝血达90分钟，而增加8倍量的硫酸皮肤素不能完全防止回路中的凝血。相反，硫酸皮肤素对液相凝血酶是更有效的抑制剂(见，上表1)。例如在该试验中，在240μg/ml时，与大于500秒的硫酸皮肤素相比，LA-LMWH HCII-特异性催化剂使凝血酶凝血的实际时间约为26秒(对照为21秒)。

图13描述了未修饰的LMWH的1抗Xa单位/ml和2抗Xa单位/ml对滤膜上的血凝和对凝血酶凝血时间的效应。在这些浓度下，LMWH在防止支路栓塞方面的效应最小，尽管凝血酶凝血时间分别延长至37秒和64秒(见表3，下面)。

图12描述HCII特异性催化剂，即V18，和有效的ATIII催化剂(如肝素)混合使用的结果。在肝素浓度为0.5抗因子Xa单位/ml的LMWH(其使凝血酶凝血时间达20秒)，未修饰的LMWH在防止滤膜上的血uxth上是无效的，但当用相同量的LMWH与240μg/ml的LA-LMWH HCII-特异性催化剂，即V18，合用时，混合物可高效抑制滤膜上的血凝。LMWH和硫酸皮肤素的混合物也同样非常有效。然而，LMWH/硫酸皮肤素组合的相应的凝血酶凝血时间大于500秒，而LMWH/LA-LMWH HCII-特异性催化剂混合物的相应的凝血酶凝血时间只有20秒(见表3)。

这些结果清楚地显示与硫酸皮肤素相比，本发明的LA-LMWH HCII-特异性催化剂，即V18，对纤维蛋白结合的凝血酶有选择性活性。因此，它比硫酸皮肤素在防止滤膜凝血方面更有效，但由于对液相凝血酶的抑制活性较少而较少地延长了凝血酶的凝血时间。

与LA-LMWH HCII-特异性催化剂相反，水蛭素在将凝血酶凝血时间延长至大于500秒时的浓度下，在将凝血酶凝血时间延长至小于500秒时的浓度下(见图16和表1)，及当LA-LMWH HCII-特异性催化剂和LMWH的组合用于将凝血酶凝血时间延长至小于30秒时(见图13和表1)防止回路栓塞方面的效果较差。

图17描述肝素或肝素合用V18在侧支模拟模型中的效应。此外，表4提出了ACT和侧支滤膜上的纤维蛋白原沉积率之间的关系。在表4中，对只用肝素和用肝素与V18组合进行比较。

表4

ACT和侧支滤膜上的纤维蛋白原沉积率之间的关系：

只用肝素和用肝素与V18组合之间的比较

              ACT(s)      纤维蛋白原沉积率(％)肝素(2.0U/mL)      651               36肝素(1.5U/mL)      452               84肝素(1.5U/mL)和    453                5V18(2.0mg/mL)

E.防止静脉血栓形成的动物疾病模型

实验例1

1.外科过程

研究在体重为三至四公斤的雄性新西兰白兔上进行。左右颈静脉通过颈部的腹侧切开。鉴定每个颈静脉的2厘米的部分，对支脉进行结扎。在收集用于凝血研究的静脉血样品后，动物随机地接受静脉注射低亲和力标准肝素、低亲和力低分子量肝素或生理盐水的药团。经处理4分钟后，再次收集血样品进行凝血研究。将4号法国气囊导管伸入右颈静脉，气囊被膨胀，在2厘米颈静脉切片上的内皮被膨胀的气囊15次经过所破坏。通过将两个相隔2厘米的止血带绕在充满血的切片上诱导2厘米切片内的停滞。该过程一结束，立即将组织促凝血酶原激酶的药团(7mg/kg)静脉注射入左颈静脉，并通过将两个相隔2厘米的止血带绕在充满血的切片上诱导该静脉内的停滞。在静脉闭塞15分钟后，取血样品进行凝血研究，然后移植静脉切片并对其中含有的血块称重。

2.结果

在模拟预防高度危险状态家兔模型中研究本发明的LA-LMWH HCII-特异性催化剂，V18。建立了一个剂量响应关系。在8mg/kg(约100μg/ml，其比防止侧支回路中的血栓形成所需的量低约5倍)时可完全抑制血栓形成(见图18)。为测试本发明的LA-LMWH HCII-特异性催化剂，即V18，与ATIII催化剂合用的增效作用，对浓度为10U/kg(该浓度对血栓形成无影响(见图19))的肝素和浓度为2mg/kg和4mg/kg的LA-LMWH HCII-特异性催化剂，即V18，的组合进行研究。当用2mg/kg(该剂量单独使用时事实上没有效果)LA-LMWH HCII-特异性催化剂时有大于60％的血栓形成被抑制，当用4mg/kg(该剂量单独使用时可产生小于40％的抑制)LA-LMWH HCII-特异性催化剂时可100％抑制血栓形成(见图20)。当单独使用8mg/kg的LA-LMWH时或当其与10U/kg肝素合用时，凝血酶凝血时间不增加，这说明以最小的抑制作用对游离凝血酶已见效。

从SH(比活，160抗Xa和抗IIa单位/mg)和LMWH(比活，100抗Xa单位/mg)分别用如在Casu，B.，等人描述的“用高碘酸氧化的非抗凝血剂肝素保持抗脂血活性”(″Retention of antilipemic activity by periodate-oxidized non-anticoagulantheparins″，Arzneim-Forsch/Drug Res.36：637-42(1986))中所描述的高碘酸氧化和后续还原方法制备SH和对ATIII低亲和力的LMWH(分别为LASH和LA-LMWH)。对低亲和力衍生物的抗凝血活性与起始材料和硫酸皮肤素(DS)进行比较。如表5所述，当按等当量重量进行比较时，LASH和LA-LMWH，即V18，基本上无抗Xa活性，这表明它们不再增强抗凝血酶III介导灭活因子Xa。此外，这些低亲和力衍生物对凝血酶凝血时间(TCT)的效果比母体化合物要低。因此，通过减少它们催化ATIII的能力，它们的抗凝血活性减少。

       表5

 GAG(浓度)             抗Xa

                        U/ml

SH(0.5U/ml)             0.3

SH(2.0U/m1)             1.3

SH(10.0U/ml)            6.0

LASH(3μg/ml)          0.07

LASH(11μg/ml)         0.06

LASH(50μg/ml)         0.06

LMWH(0.5U/ml)           0.6

LMWH(2.0U/ml)           2.8

LMWH(10.0U/ml)         11.0

LA LMWH(5μg/ml)(V18)  0.04

LA LMWH(20μg/ml)(V18) 0.05

LA LMWH(100μg/ml)(V18)0.06

DS(1μg/ml)            0.05

DS(10μg/ml)           0.06

DS(100μg/ml)          0.05

当对不同分子量的肝素级分活性进行比较时，9000道尔顿级分的活性接近于SH的，而5000道尔顿的级分的活性接近LMWH的。相反，3000道尔顿的级分的活性更低(图5和6)。这些结果再一次符合20或更多的单糖单元的肝素链，(这与8000道尔顿或更高的分子量相当)含有HCII的最大激活的概念。

实施例II

1.麻醉

特定的无病原体，新西兰雄性白兔用肌肉间注射开他敏(50mg/kg)和xylazine(2mg/kg)进行麻醉。一旦麻醉后，腹颈区域就剃光毛并用醇和碘溶液作准备。将22号导管(Becton-Dickinson，Sandy，UT)插入左中央心耳动脉和边缘心耳静脉中以分别收集血样品和静脉间注射液体和抗凝血剂。一旦这些步骤进行后，就将家兔移到手术室。在藉着面罩暴露在isoflurane(1至4％)，氧气(1分钟)和一氧化二氮(1分钟)混合物下后，将2号Fr内皮管插入家兔并维持相同混合物的吸入麻醉剂直至操作结束。

2.血块产生

通过腹颈部皮肤切口暴露右外颈和面部静脉。面部静脉片段用两个4-0号丝缝线相隔0.5厘米封闭。所有的颈静脉侧支路结扎长度为2厘米。在将3号FrFogarty血栓切除导管通过封闭的面部静脉片段插入颈静脉后，气囊被膨胀，2cm的颈静脉片段的内皮被导管的15次通过损伤。将两个40号丝缝线每隔1.5厘米绕在损伤的静脉外。将Fogarty导管除去，并用#60聚乙烯管来代替通过分离的颈静脉切片中。排空受损静脉的血，片段用缝线封闭。静脉片段用稀释在0.5ml生理盐水500U牛凝血酶冲洗5分钟，静脉片段应全部被封闭，从而防止凝血酶的系统流出。然后抽出凝血酶溶液，片段用生理盐水冲洗。

将约1ml的动脉血快速抽入1ml注射器中，并与约1μCi的¹²⁵I标记的血纤维蛋白原混合。将0.2ml混合物注射入封闭的颈静脉片段中。然后除去导管，结扎面部静脉，使血栓生长30分钟。同时，在试管中37℃下使两个等分的0.2ml的相同血样品凝血30分钟。由于试验性的研究证明，体外形成的血栓在重量和放射性上与在原地颈静脉中形成的血栓相同，体外血块的平均重量和放射性用来作为原地的血块质量和放射性的一个指标。

在凝血酶注射入颈静脉片段20分钟后，对动物给下列一种药(a)肝素，70U/kg IV药团和280U/kg s.c.96h X2，(b)硫酸皮肤素，2mg/kg IV药团和8mg/kgs.c.q6h X2，(c)V-18，2mg/kg IV药团和8mg/kg s.c.q6h X2，(d)同样剂量的肝素和硫酸皮肤素的组合，或(e)同样剂量的肝素和V18的组合。对照动物在相同间隔给相同体积的生理盐水。血栓生长30分钟后，除去止血带，将两个4-0丝缝线通过颈静脉管壁置于血栓内防止其移动。然后将封闭止血带除去，使颈静脉片段内的血流还原。颈部切口用0.5ml青霉素冲洗，使皮肤通过常规方式封闭。使家兔在100％氧气下恢复呼吸。当它们重新有窒息反射时，取出气管内的管并将动物移至手术后的特别病室。

3.终点

血栓形成24小时后，使动物安乐死，打开颈静脉片段，称量残余的血块并计算其放射性。通过与在体外形成的血块的重量和放射性进行比较，计算血块重量(血块增加量)和放射性(血块溶解量)的变化百分比(见图21和22)。

F.V18的凝血曲线和其级分与低分子量肝素和硫酸皮肤素在正常的和ATm-和HCII缺失血浆中的比较

进行凝血研究以描述V18和三个V18级分的抗凝血曲线的特性，它们是通过凝胶排阻色谱而分离产生的级分1(平均分子量8000)，级分2(平均分子量5000)和级分3(平均分子量3000)。此外，由于V18是一个修饰的LMWH，具有硫酸皮肤素(DS)的一些特点，将V18的抗凝血曲线与这两种硫酸化多糖者作比较。这些比较是用凝血酶凝血时间(TCT)测定法，激活部分组织促凝血酶原激酶时间测定法(APTT)，和因子Xa凝血时间(Xa时间)测定法。这三种测定法在正常血浆，ATIII-缺乏型血浆和HCII-缺乏型血浆中进行。

图23描述V18对正常血浆，ATIII缺乏型血浆和HCII缺乏型血浆中的APTT(A)、TCT(B)和因子Xa凝血时间(Xa凝血时间)(C)的效应。从图23A可明显看出，APTT时间随剂量增加而增加与ATIII和HCII有关，因为在正常血浆，ATIII缺失型血浆和HCII缺失型血浆中可观察到同样的与剂量有关的时间延长。图23B说明TCT在高达约120μg/ml的浓度下有最小的时间延长，此后，TCT在正常血浆和ATIII缺失型血浆中均迅速增加，而在HCII缺失型血浆中只有较小增加。这些结果表明V18对游离的凝血酶有较低活性，该活性很大程度上与HCII有关。图23C说明Xa凝血时间随剂量增加而延长是与HCII和ATIII都有关的。这些结果表明V18除了对血块结合的凝血酶有活性外，还对液相凝血酶有与HCII有关的微弱的活性，还有与ATIII有关的抗Xa活性。

为作比较，图24和25描述LMWH(图24)和DS(图25)的抗凝血曲线。与V18相反，LMWH对TCT(图24A)，APTT(图24B)和Xa时间(图24C)的抑制效应主要与ATIII有关，而HCII对TCT和Xa时间的延长的影响较少。此外，与V18相反，DS对TCT(图25A)，APTT(图25B)和Xa时间(图25C)的抑制效应完全与HCII有关。

图26，27和28说明V18的用凝胶排阻色谱通过体积来分离的三个级分的抗凝血曲线。级分1平均分子量为8000，级分2平均分子量为5000和级分3平均分子量为3000。级分1对TCT的抑制效应主要与HCII有关(图26A)，对APTT(图26B)是与HCII和ATIII都有关，对Xa时间(图26C)主要与ATIII都有关。级分2对TCT的抑制效应与HCII有关(图27A)，对APTT(图27B)是与HCII和ATIII有关，对Xa时间(图27C)主要与ATIII有关。与级分1相反，级分2对液相凝血酶的效应更低，在APTT和Xa时间测定法中的效果较差。级分3在TCT测定中活性最小(图28A)，在APTT(图28B)和Xa时间(图28C)测定中有微弱活性。

表6是APTT和TCT倍增所需的不同葡糖胺聚糖(GAGS)的浓度的归纳。

表6

	倍增APTT和TCT的剂量μg/ml		比率
				APTT	TCT
		×2				×2
V18			60	100	0.6
	级分1	20				15	1.3
级分2			50	120	2.4
	级分3	100				480	4.8
DS			20	15	1.3

根据重量，DS比V18更有效，DS与级分1的效果相同。V18的级分的效应随分子量的降低而丧失。图29说明肝素(0.1U/ml)对DS和V18引起的凝血酶时间延长的附加效应的比较。

G.测试游离和血块结合凝血酶的抑制性的改进全血凝血时间(WBCT)测定法

用改进的全血凝血时间测定法进行研究以比较GAGS对液相凝血酶和血块结合凝血酶的效应。血块通过绕聚苯乙烯钩将250μl氯化钙加入10ml血小板贫乏型血浆中(最终浓度0.025M)来制备。使血块在37℃下增生1小时。然后将其取出，并与钩连在一起，冲洗四次共30分钟。将血块与10μM PPACK培育30分钟来制备有PPACK-灭活血块结合凝血酶的对照血块。全血凝血时间是通过将正常献血者的950μl人血加入到50μl的抗凝血剂(或缓冲液对照)来进行测定的。将与聚苯乙烯钩相连的血块(血块结合凝血酶)或PPACK血块(灭活血块结合凝血酶)，或有足够浓度使基本凝血时间降低至用血块结合凝血酶(游离凝血酶)获得的游离凝血酶加入血试管中在37℃培育，并用试管摇动法来记录凝血时间。

图30描述肝素剂量的增加对加入凝血酶(A)、PPACK血块(B)和血块结合凝血酶(C)的全血凝血时间的效应。游离凝血酶，PPACK血块和血块结合凝血酶的IC50分别为0.3单位/ml，0.6单位/ml和0.9单位/ml。因此，该全血系统对于游离凝血酶(A)对血块结合凝血酶(C)的效应的相对灵敏度比率约为3，全血系统对于PPACK灭活血块(B)对血块结合凝血酶(C)的效应的相对灵敏度比率约为1.5。

图31描述硫酸皮肤素剂量的增加对加入凝血酶(A)、PPACK血块(B)和血块结合凝血酶(C)的全血凝血时间的效应。游离凝血酶的IC50为480μg/ml，而PPACK血块者和血块结合凝血酶者为大于1440μg/ml。因此，该全血系统对游离凝血酶(A)和血块结合凝血酶(C)的效应的相对灵敏度比率大于3.0，全血系统对于PPACK灭活血块(B)对血块结合凝血酶(C)的效应的相对灵敏度比率大于3.0。

图32描述V18剂量的增加对加入凝血酶(A)、PPACK血块(B)和血块结合凝血酶(C)的全血凝血时间的效应。游离凝血酶，PPACK血块和血块结合凝血酶的IC50分别为90μg/ml，180μg/ml和250μg/ml。因此，该全血系统对游离凝血酶(A)对血块结合凝血酶(C)的效应的相对灵敏度比率约为3，全血系统对于PPACK灭活血块(B)对血块结合凝血酶(C)的效应的相对灵敏度比率约为1.5。

图33，34和35分别描述V18的级分1，2和3的剂量增加对加入凝血酶(A)、PPACK血块(B)和血块结合凝血酶(C)的全血凝血时间的效应。对于级分1，游离凝血酶，PPACK血块和血块结合凝血酶的IC50分别为22μg/ml，25μg/ml和37μg/ml。因此，该全血系统对于游离凝血酶(A)对血块结合凝血酶(C)的效应的相对灵敏度比率约为1.7，全血系统对于PPACK灭活血块(B)对血块结合凝血酶(C)的效应的相对灵敏度比率约为1.6。

对于级分2，游离凝血酶，PPACK血块和血块结合凝血酶的IC50分别为90μg/ml，240μg/ml和250μg/ml。因此，该全血系统对于游离凝血酶(A)对血块结合凝血酶(C)的效应的相对灵敏度比率约为2.7，全血系统对于PPACK灭活血块(B)对血块结合凝血酶(C)的效应的相对灵敏度比率约为1.0。

对于级分3，游离凝血酶，PPACK血块和血块结合凝血酶的IC50分别为150μg/ml，320μg/ml和600μg/ml。因此，该全血系统对于游离凝血酶(A)对血块结合凝血酶(C)的效应的相对灵敏度比率约为4.0，全血系统对于PPACK灭活血块(B)对血块结合凝血酶(C)的效应的相对灵敏度比率约为1.9。

图36比较了肝素(图36A，上面)，级分1(图36B，中间)及肝素和10μg/ml级分1组合(图36C，下面)对WBCT的效应。肝素和级分1的结果在上面已有描述，在图36中提出是为了与肝素和级分1的组合进行比较。组合(图36C，下面)对于游离凝血酶的IC50为0.3单位/ml(即与肝素的值相同(图36A，上面))。同样，PPACK血块的IC50与肝素的值一样，即为约0.55单位/ml。相反，血块结合凝血酶的IC50与PPACK血块的一样，即为约0.55单位/ml。因此，与肝素相反，该全血系统对于游离凝血酶(A)对血块结合凝血酶(C)的效应的相对灵敏度比率约为2.0，全血系统对于PPACK灭活血块(B)对血块结合凝血酶(A)的效应的相对灵敏度比率约为1.0。

图37描述肝素和硫酸皮肤素组合对WBCT的效应。与V18相反，120μg/ml的DS在PPACK血块或血块结合凝血酶存在时并不影响凝血时间。然而，当增加浓度的DS加入到0.5单位/ml的肝素中(图38)时，可以计算出相对的IC50值的比率。该全血系统对于游离凝血酶(A)对血块结合凝血酶(C)的效应的相对灵敏度比率约为5.0，全血系统对于PPACK灭活血块(B)对血块结合凝血酶(C)的效应的相对灵敏度比率约为2.0。因此，该全血系统对于游离凝血酶(C)对血块结合凝血酶(C)的效应的相对灵敏度比率约为1.1，全血系统对于PPACK灭活血块(B)对血块结合凝血酶(C)的效应的相对灵敏度比率约为1.0。

图39描述V18和肝素组合对加入凝血酶(A)、PPACK血块(B)和血块结合凝血酶(C)的WBCT的效应。游离凝血酶，PPACK血块和血块结合凝血酶的IC50分别为50μg/ml，45μg/ml和45μg/ml。因此，该全血系统对于游离凝血酶(A)对血块结合凝血酶(C)的效应的相对灵敏度比率约为3，全血系统对于PPACK灭活血块(B)对血块结合凝血酶(C)的效应的相对灵敏度比率约为1.0。

不同的GAGS对于加入游离凝血酶、PPACK血块和血块结合凝血酶的WBCT的效应以及相对IC50的比率列在表7中。

                 表7

           在血块存在和不存在时延长

        全血凝血时间(IC50)所需的GAGS的浓度

	重量μg/ml		比率有血块/无血块
				无血块	有血块
	V18	90				150	1.5
级分1			45	45	～1.0
	级分2	90				360	3.5
级分3			160	600	4.0
	SH	2				6	3.0
LMWH			4	13	3.0
	DS	480				＞1400	＞3.0

而且，表8中对V18和肝素对纤维蛋白结合的凝血酶的协同作用作了归纳。

表8

V18和肝素对全血中纤维蛋白

结合凝血酶的协同作用

凝血时间V18μg/ml0                             660                           14120                          20240                          75肝素0.5U/ml                  30肝素0.5U/ml+V18 60μg/ml    150

H.用侧支循环的预防凝血研究

图40描述肝素对预防侧支循环中的凝血的效应。消耗84％的纤维蛋白原，肝素浓度为1.5单位/ml时发生凝血。尽管当肝素浓度为2.0单位/ml时，仍有36％的纤维蛋白原消耗，但是凝血被部分抑制。V18单独使用时浓度为960μg/ml可预防循环中凝血，在与1.5单位/ml的肝素合用时，浓度为约120至240μg/ml可预防凝血。级分1浓度在约120μg/ml时可预防循环中的凝血。

图41描述级分1、2和3从葡聚糖凝胶G50柱上洗脱的图样。此外，图42还比较了级分1、2和3与肝素1.5U/ml合用的效应。级分1在约60μg/ml的浓度下可预防循环中的凝血，而级分2在约60μg/ml的浓度下只是部分有效，而级分3则无效。该试验证明，三个级分中，级分1对于侧支循环最有效，而级分3效果最低。表9和表10中列出了GAGS单独使用或与1.5单位/ml的肝素合用时的最小有效浓度。

表9

循环中组合的效果(分钟浓度)

1.5U/ml     SH    +    120μg/ml    L18
	1.5U/ml     SH    +    60μg/ml    级分1

表10侧支循环中的最小有效剂量

重量μg/ml
	SH        12LMWH      80V18      960级分1    240DS    ＞3840

在表11中列出了延长APTT和TCT以预防在血块存在时全血的凝血和预防侧支凝血所需的GAGS的相对应的浓度。

表11

延长凝血时间所需的GAGS的浓度

	TCT×3	APTT×3	侧支	凝血酶	PPACK/血块	血块
							SH U/ml	0.15	0.4	2.0	0.3	0.55	0.8
LMWH U/ml	0.25	0.7	＞8.0	0.4	0.9	1.2
							DSμg/ml	15	150	＞3000	15	＞1440	＞1440
V18μg/ml	160	120	960	70	150	200
							级分1μg/ml	10	40	120	15	35	35
级分2μg/ml	150	110		65	150	150
							级分3μg/ml	＞600	240		120	250	500

TCT的IC50及预防循环中的凝血所需的剂量和相应的比率列在表12中。

                        表12

               TCT的IC50和侧支的有效剂量的比较

	IC 50μg/ml	侧支μg/ml
					单独使用	比率	和肝素1.5U/ml合用
		DSV18级分1SHLMWH	40260450.62.5	＞38409602401480				＞1003.75.32332	12060

I.二级速率常数的测定

在表13中归纳了浓度在6，60和300μg/ml时，ATIII介导催化因子Xa和凝血酶抑制，和HCII介导的凝血酶抑制的二级速率常数(K₂)的增长倍数。

表13

K₂的增长倍数

GAG	浓度μg/ml	ATIIIXa                     IIa		HCIIIIa
					SHLMWHV18DS	660300660300660300[？？]660300	7502165307526248515571968260--	5772545188357213190100616121022	4674657626389830060060012011612120

K₂在GAGS的治疗浓度的增长倍数为列在表14中。

               表14

      GAGS的K₂的增长倍数

	ATIIIXa                          IIa		HCIIIIa
				SHLMWHDSV18SS-LMWH	750262-68583	577357361250	462621006001200

在治疗浓度下(即约6μg/ml)，肝素(SH)和LMWH通过激活ATIII产生抗凝血效应，而HCII的催化效果较弱。相反，在治疗浓度(约60至300μg/ml)下，V18通过激活ATIII和HCII产生抗凝血效应。而且，在治疗浓度下(约300μg/ml)，DS通过激活HCII而产生抗凝血效应。有兴趣地发现在两个由纤维蛋白结合的凝血酶(即血浆血块和侧支循环的全血凝血时间)介导的凝血测定方法中，要预防较小的凝血，需要的DS的浓度比V18高的多，然而，V18对HCII介导的凝血酶抑制的速率差不多要小50倍。各种GAGS对凝血酶(IIa)，因子Xa和ATIII的结合亲和力列在表15中。

表15

对与丝氨酸蛋白酶和它们的抑制剂结合的GAG的本质的测定

	Kd nM
					GAG	IIa	HCII	ATIII	Xa
StHp	116.6		24.7
					V18	1048.9		27311
DS	2601.4		--
					LMWH	940.4		208.5

J.测定V18是否有与HCII或ATIII无的抗凝血活性的试验

进行试验测定V18对凝血是否有与ATIII或HCII无关的效应。这些试验设计成用来测定：1)V18对因子Xa的抑制是否与ATIII无关；2)V18是否能破坏纤维蛋白的聚合；3)V18是否不依赖于ATIII灭活IXa或XIa；和4)V18是否在富含血小板系统中和在血小板贫乏系统中一样有效。

1.因子Xa的ATIII不依赖型抑制

在一个缓冲液系统中，在有ATIII和无ATIII的存在下测定V18的抗因子Xa的活性。在没有ATIII时V18不灭活因子Xa(图43)。

2.纤维蛋白聚合的抑制

为测定V18是否干扰纤维蛋白聚合，在有或没有ATIII或HCII时测定含有纤维蛋白原的缓冲液系统中凝血酶凝血时间的延长。对肝素(SH)和DS进行试验以作比较。在没有ATIII或HCII时，这些GAG不延长凝血酶凝血时间。V18的效应与DS的一样与HCII有关。根据重量，DS比V18的效率要高20倍。与V18和DS相反，需要HCII而不需要ATIII来抑制与凝血酶凝结构血纤维蛋白原)肝素可通过两个辅助因子反应，但是ATIII是更为有效的辅助因子(图44)。

3.IXa和XIa的灭活

这些试验进行用来测定V18或V18的级分1是否依据与ATIII或HCII无关的机制通过灭活IXa或XIa来延长APTT。在血浆系统中研究肝素，LMWH，V18和V18的级分1灭活Xa，IXa和XIa的相对效应，每个系统中均加入凝血酶(图44)。每个加入的凝血酶的浓度使得凝血时间在40至50秒之间。肝素(图44A)对IXa凝血时间延长比Xa凝血时间长，而相对地对XIa凝血时间的效应较低。相反，其它所有的GAG，包括V18和V18的级分1，对IXa和Xa凝血时间有相同的效应。这些结果表明V18(图44C)和V18的级分1(图44D)对IXa或XIa没有效应，独立于ATIII或HCII。

K.血小板对V18及其级分1的抗凝血活性的影响

在有肝素，V18，LMWH和V18的级分1的存在时，在富含血小板，血小板贫乏和不含血小板的血浆中对因子Xa凝血时间进行研究。在所有情况下，富含血小板血浆中所有的凝血时间均较短，这表明因子Xa通过这些GAG(包括V18和级分1(图45))灭活而被保护。然而，V18的抗凝血效应显示比肝素或LMWH对血小板更有抗性。这些GAG重新钙化的时间在富含血小板血浆中比在血小板贫乏血浆中更短，这表示在tenase复合物中的因子IXa被这些GAGS灭活而被保护(图46)。

1.V18有与HCII或ATIII无关的抗凝血效应

尽管V18在体外用标准生色因子Xa测定法测定时有最小的抗因子Xa活性，当在HCII缺失型血浆中其却有满意的抗凝血活性。这归纳在表16中，表16描述V18和肝素对重新钙化凝血时间(在含柠檬酸盐的血小板缺失血浆中加入钙和磷脂[脑磷脂]进行凝血)的效应。在正常血浆中，V18浓度为500μg/ml时使重新钙化时间增加9.6倍。该浓度的V18的加入使重新钙化时间在ATIII缺失型血浆中提高了3.6倍(“HCII效应”)，在HCII缺失型血浆中提高了4.1倍(“ATIII效应”)。此外，V18使HCII和ATIII均缺失的血浆(双重缺失型血浆)的重新钙化时间提高了2.9倍。相反，肝素使重新钙化时间延长的效应事实上完全有赖于ATIII。因此，在正常血浆中，用肝素只使重新钙化时间提高9.5倍，在ATIII缺失型血浆中为1.2倍(“HCII效应”)，在HCII缺失型血浆中为6.0倍(“ATIII效应”)，在HCII和ATIII均缺失的血浆中为1.3倍。这些结果表明V18的抗凝血效应通过HCII和ATIII介导机制和与ATIII和HCII无关的机制起作用。相反，肝素的几乎所有的抗凝血效应是由ATIII介导的。

为不局限于一个特别的理论，认为两种互相关联的机制是造成V18的活性与HCII无关的原因。两者与V18干扰血小板表面的因子Xa合成有关。血小板表面凝血的发生是许多表面上的凝血因子的共同作用的结果。因此因子IXa与因子VIIIa复合形成粘合复合物，其激活因子X形成Xa，然后因子Xa在血小板表面与因子Va形成一个将凝血酶原转变为凝血酶的复合物(“凝血酶原酶复合物”)。因子Va是血小板表面上因子Xa的受体。因子V激活成因子Va是由凝血酶表面介导的。在血栓中，它包括在纤维蛋白网状物中血小板凝聚物，因子V的激活由与纤维蛋白结合的非常靠近血小板的凝血酶介导(图47)。当凝血酶与血小板表面的因子Va结合时，因子Xa通过其天然的抑制剂，ATIII，来灭活而被保护(图48)。因此，防止因子Xa结合到血小板表面可显著提高ATIII激活因子Xa的速率(图49)。

V18通过两种不同的但相互关联的机制来干扰因子Xa结合到血小板表面上(图50)。第一，V18通过HCII介导机制灭活纤维蛋白结合的凝血酶，破坏因子V激活成因子Va，因此减少了血小板表面的因子Xa受体的密度。第二，如所示的，V18与因子Xa与磷脂表面(“血小板”表面)的结合进行竞争。这两种机制均抑制因子Xa结合到血小板表面上，因此使得因子Xa易受到甚至是相当弱的ATIII催化剂如V18的灭活(图49)。

V18干扰合成是新颖的。步骤并不是仅仅目标Xa，而且还如图49所示目标其它凝血酶。另外一些发现是试图用无活性的蛋白质类似物来与Xa和IXa的结合进行竞争。然而，上述的V18的抗血栓形成机制是独特的，因为其通过一步独特步骤，以干扰血小板表面(表面使未保护的因子Xa被ATIII灭活)的因子Xa的合成，来选择性地使HCII激活剂和纤维蛋白结合的凝血酶结合。通过使HCII介导的纤维蛋白结合的凝血酶的灭活和ATIII介导的凝血酶再生抑制(通过因子Xa的灭活)的结合，V18可通过抑制两个关键的途径来调节血栓形成(图50)。

                表16

正常   ATIII      HCII        双重血浆 缺失型血浆 缺失型血浆 缺失型血浆时间用分钟表示对照1/5脑磷脂  3.3    2.3        2.3          2.3
	比    率V18 200μg/ml  2.8    1.8        2.0          1.51/5脑磷脂V18 300μg/ml  4.6    2.3        2.8          2.31/5脑磷脂V18 500μg/ml  9.6    3.6        4.1          2.91/5脑磷脂
肝素0.5U/ml    9.5    1.2          6          1.31/5脑磷脂

M.在模拟心肺的侧支循环中比较V18(分子量3000至8000)和SPL(分子量1000至3000)

该实施例比较了V18和SPL(一种类似V18的材料，分子量为1000至3000道尔顿)在模拟侧支循环中的活性。如下面的表17中，与V18相反，SPL基本上无活性。

1.制备SPL，一种类似V18的分子量为1000至3000道尔顿的材料

将2克SPL(1000至3000道尔顿)的产品溶解在50毫升蒸馏水中。加入等体积的0.2M偏高碘酸纳(新制备)。溶液保持在4℃下混合24小时。加入5.0ml的乙二醇，溶液置于透析管(MWCO500)内，并对蒸馏水透析24小时(换几次)。将溶液放回烧杯中，并在维持恒定搅拌下加入800mg硼氢化钾。溶液在室温下暗处放置2.5小时。用1N HCl调节pH至3.0，然后用1N NaOH迅速调节至pH7.4。溶液再一次如前所述透析，并冻干得最后的产品。

2.在模拟心肺侧支循环中比较V18和SPL

在如上所述的模拟心肺侧支循环中比较V18和SPL。获得的结果表明，与V18相反，SPL基本上无活性(见表17，下面)。这是因为分子量小于3000道尔顿的肝素分子从V18中除去。通过从V18除去这些分子，V18的效果本质上有所增加。

               表17

处理μg/mL	A.C.T.秒	循环失败时间(分钟)	血纤维蛋白原的消耗
				V18 480	372	＞90	9
V18 240	284	＞90	9
				SPL(1000-3000)480	193	17	89

N.在模拟心肺侧支循环中比较水蛭素和V18与肝素的组合的效率和安全性

该实施例在如上所述的模拟心肺侧支循环中比较水蛭素和V18与肝素的组合的效率和安全性。获得的结果明显地表明与水蛭素相反，V18在无出血问题的浓度下有非常良好的APTT时间(见表18)。

表18

处理    ACT(秒)    处理失败时间(分钟)    纤维蛋白的沉积率％
	水蛭素      340            30                     ＞90水蛭素      480            60                     ＞90水蛭素      610            75                     ＞90水蛭素      ＞1500         ＞90                   9V18       358            ＞90                   8V18和肝素    370            ＞90                   6肝素        360            35                     91生理盐水      180            10                     ＞90

O.V18+desmin对液相凝血酶和血块结合凝血酶的比较效应

该实施例是用如上所述的悬挂血块测定法比较V18和desmin(即低分子量的硫酸皮肤素)对于液相凝血酶及血块结合凝血酶的效应。下面表19的结果明确地表明desmin比V18的选择性差，此外它的效率也差，只有V18的四分之一。

表19

液相凝血酶	血块结合凝血酶
		TCT(IC50)	人侧支循环(IC50)
V18μg/mL    90	210
		Desminμg/mL    15	750
比率V18          6∶1Desmin	1∶3.5

应当理解上述的描述只用于描述而不具有限制性。许多例子对于该领域技术熟练人员在读上述描述时是明了的。因此，本发明的范围并不参照上述描述来确定，而是参照附加的权利要求，根据这些权利要求的等同的范围来确定。所有公开的文章和参考文献，包括专利申请和专利公开，均在这里引证参照。

Claims (66)

1.灭活血块结合凝血酶的肝素辅助因子II特异性(HCII特异性)催化剂，其特征在于：

(i)在抗因子IIa试验中对肝素辅助因子II的肝素辅助因子II比活为约2-5单位/mg；

(ii)在抗因子Xa试验中对因子Xa的抗凝血酶III(ATIII)比活为约0.2-1.5单位/mg；及

(iii)在水介质中的溶解度为约150-1,000mg/ml。

2.如权利要求1所述的药剂，具有以下一个或两个特征：

(i)其抗凝血酶III亲和力低于未分级肝素的活性的约3％；

(ii)它是约10-24个单糖单位的聚阴离子碳水化合物。

3.如权利要求1或2所述的药剂，它是分子量在约3,000至8,000道尔顿之间的肝素制剂。

4.如权利要求3所述的药剂，其中肝素制剂：

(i)基本上由从未分级肝素分离出来的最低的第三分子量级分组成；或

(ii)用化学方法降低分子量范围在约3,000-8,000道尔顿之间而从未分级肝素制得。

5.如权利要求3或4所述的药剂，其中肝素制剂；

(i)平均分子量为约8,000道尔顿；

(ii)平均分子量为约5,000道尔顿；或

(iii)平均分子量为约3,000道尔顿。

6.如权利要求3-5之一所述的药剂，其中肝素制剂用化学方法降低分子量范围至约3,000-8,000道尔顿之间而从未分级肝素制得，并通过用氧化剂处理肝素制剂中存在的连位醇基，然后用还原剂处理而降低其抗凝血酶活性，可任选地，其中氧化剂选自高碘酸钠、二甲亚砜、酸酐、四乙酸铅和抗坏血酸，还原剂选自硼氢化钠、氢化锂铝、金属氢化物和肼。

7.如权利要求3-6之一所述的药剂，其中肝素制剂基本上由对ATIII无亲和力的物质组成，所述物质用固定ATIII、保留流出液的固相亲和提纯法制成。

8.如权利要求1所述的药剂，具有如下结构式(a)：

其中：

R₁选自H、D-葡糖胺酸残基、D-葡糖醛酸残基和L-艾杜糖醛酸残基；

R₂选自H、D-葡糖胺酸残基、D-葡糖醛酸残基、L-艾杜糖醛酸残基和脱水甘露糖醇；

R₃选自H和SO₃ ^-；

R₄选自H、SO₃ ^-和CH₃CO^-

指数“n”独立地被选择，可为从0至约14的值；

HCII特异性催化剂具有约3,000道尔顿至约8,000道尔顿的分子量；或

具有如下结构式(b)：

其中：

R₁和R₂独立地选自H、D-葡糖胺酸残基、D-葡糖醛酸残基和L-艾杜糖醛酸残基；

R₃选自H和SO₃ ^-；

R₄选自H、SO₃ ^-和CH₃CO^-；

HCII特异性催化剂具有约3,000道尔顿至约8,000道尔顿的分子量。

9.如权利要求1-8之一所述的药剂，其特征在于具有如下一个或两个特征：(i)在抗因子IIa活性上有至少约3-4单位/mg的肝素辅助因子II比活；(ii)在抗因子Xa试验中有约1单位/mg的ATIII比活。

10.如权利要求1-9之一所述的药剂，其中：

(i)该药剂与肝素添加剂合用，或

(ii)该药剂与肝素添加剂合用，HCII特异性催化剂与肝素添加剂的重量比大于约2∶1，其中任选地，肝素添加剂是未分级肝素或从未分级肝素分离出来的最低的第三分子量级分。

11.抑制患者血栓形成的药物组合物，该组合物包括：

(i)约90-99.9重量％的灭活纤维蛋白结合凝血酶的HCII特异性催化剂，该HCII特异性催化剂对抗凝血酶III(ATIII)仅有最低限度的亲和力；

(ii)约0.1-10重量％的灭活液相凝血酶的ATIII催化剂，

其中所述组合物的HCII催化活性约为2-5单位/mg。

12.如权利要求11所述的组合物，其中HCII特异性催化剂为

(i)约10-24个单糖单位的聚阴离子碳水化合物；或

(ii)聚阴离子碳水化合物为约10-24个单糖单位，是分子量在3,000-8,000道尔顿之间的肝素制剂。

13.如权利要求12所述的组合物，其中肝素制剂由权利要求4、5、6、7、8或9中一个或一个以上权利要求所述的具体特征进一步限定。

14.如权利要求12或13所述的组合物，其中ATIII催化剂是未分级的肝素，或是从未分级的肝素分离出来的最低第三分子量级分。

15.一种产物，包括：

(i)灭活血块结合凝血酶的药剂，该药剂对抗凝血酶III(ATIII)具有最低限度的亲和力及在抗因子IIa试验中对肝素辅助因子II的肝素辅助因子II比活约为2-5单位/mg；和

(ii)ATIII催化剂，它作为一种同时、分别或相继使用以抑制患者体内血块结合凝血酶和液相凝血酶而灭活液相凝血酶的制剂。

16.如权利要求所述的15所述的产物，其中凝血酶灭活剂为

(i)如权利要求1至8中一个或一个以上权利要求所定义的HCII特异性催化剂，或

(ii)如权利要求12(i)或(ii)所述的具体特征所定义的聚阴离子碳水化合物，及外加或任选地，在抗因子IIa试验中具有肝素辅助因子II比活至少约为3-4单位/mg。

17.如权利要求15或16所述的产物，其中ATIII催化剂是未分级的肝素，或是从未分级的肝素分离出来的最低第三分子量级分。

18.低分子量肝素制剂，其特征在于：

(i)分子量在约3,000-8,000道尔顿之间(±1，000道尔顿)；

(ii)在抗因子IIa试验中对肝素辅助因子II的肝素辅助因子II比活为约2-5单位/mg；

(iii)在抗因子Xa试验中对因子Xa的抗凝血酶III(ATIII)的比活为约0.2-1.5单位/mg；

(iv)在水介质中的溶解度为约150-1,000mg/ml；和

(v)以糖醛酸残基或其它天然的非还原糖为一个末端基团，2，5-脱水甘露糖醇非还原糖为另一个末端基团。

19.能选择性灭活血块结合凝血酶而非游离凝血酶的聚阴离子碳水化合物，它可得自肝素，具有开环形式的非硫酸化糖醛酸残基，和基本上无醛基。

20.如权利要求19所述的碳水化合物，它具有天然的非还原糖为一个末端基团，2，5-脱水甘露糖醇非还原糖为另一个末端基团，和/或其中约30％糖醛酸残基是开环形式的。

21.如权利要求18所述的制剂或如权利要求19或20所述的碳水化合物，其特征还在于权利要求1的一个、两个或三个特征，和/或权利要求2至9中一个或一个以上权利要求所述的具体特征。

22.能选择性抑制血块结合凝血酶的产物，它可通过如下步骤得到：

(i)用亚硝酸使未分级的肝素解聚；

(ii)分离和收集分子量为3,000-8,000(±1,000)道尔顿的解聚的级分以提供低分子量级分；

(iii)用高碘酸盐裂解低分子量级分；

(iv)用硼氢化钠将裂解的级分还原；其中任选地用抗凝血酶III亲和柱降低解聚的肝素的亲和力，低分子量级分的比活约为2-5抗凝血酶单位/mg，并低于约1.5抗因子Xa单位/mg。

23.可通过如下步骤得到的产物：

(i)用亚硝酸解聚法使未分级的标准肝素解聚；

(ii)用高碘酸钠在水介质中将解聚的肝素于4℃氧化24小时，加入过量的乙二醇停止氧化反应，然后用透析管对蒸馏水充分透析，除去500MW的分子；

(iii)加入硼氢化钠将氧化的产物还原，使反应混合物于23℃静置25小时后，用HCl将反应混合物的pH调节至3.0以破坏过剩的硼氢化物，然后加入NaOH将pH快速升至7.0；

(iv)将所得的产物对蒸馏水充分透析；及

(v)冷冻于燥以回收产物；并任选地

(vi)将产物通过抗凝血酶III亲和柱，所得的产物具有如下性质：

-分子量为3.000-8,000(±1,000)道尔顿

-抗因子IIa的比活性为约2-5单位/mg

-抗凝血酶IIa的比活性为约1.5单位/mg。

24.如权利要求1-10之一所述的催化剂、如权利要求18或21所述的制剂、如权利要求19-21之一所述的碳水化合物或如权利要求22或23所述的产物用作药物。

25.包含如权利要求1-10之一所述的催化剂、如权利要求18或21所述的制剂、如权利要求19-21之一所述的碳水化合物或如权利要求22或23所述的产物，并任选地包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的药品，该药品还进一步任选地包含与所述活性药剂同时、分别或相继给予的液相凝血酶抑制剂。

26.制备具有天然的非还原糖为一个末端基团、2，5-脱水甘露糖醇非还原糖为另一个末端基团的HCII特异性催化剂的方法，所述方法包括：

(i)将未分级的肝素解聚；

(ii)将所得的低分子量肝素氧化；和

(iii)将经氧化的低分子量肝素还原；

其中所述方法任选地包括外加的提纯或其它步骤以得到所述HCII特异性催化剂。

27.如权利要求26所述的方法，其中未分级的肝素用亚硝酸解聚和/或经氧化的低分子量肝素用硼氢化钠还原。

28.如权利要求1-10之一所述的催化剂、如权利要求18或21所述的制剂、如权利要求19-21之一所述的碳水化合物或如权利要求22或23所述的产物或可用权利要求26或27所述的方法制得的HCII特异性催化剂在制备治疗心血管疾病的药物上的用途，该用途任选地还进一步包括用液相凝血酶抑制剂来制备药物。

29.具有开环形式的非硫酸化糖醛酸残基且实质上无醛基的肝素衍生物在制备用于预防和治疗血栓形成药物上的用途。

30.抑制患者体内血栓形成而不增加全身出血的临床不安全性的方法，所述方法包括给患者投与药理学上可接受剂量的灭活血块结合凝血酶的肝素辅助因子II特异性(HCII特异性)催化剂，所述HCII催化剂的特征在于：

(i)在抗因子IIa试验中对肝素辅助因子II的肝素辅助因子II比活为约2-5单位/mg；

(ii)在抗因子Xa试验中对因子Xa的抗凝血酶III(ATIII)催化剂比活为约0.2-1.5单位/mg；及

(iii)在水介质中的溶解度为约150-1,000mg/ml。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述HCII特异性催化剂具有抗凝血酶III的亲和力低于未分级肝素的抗凝血酶III活性的约3％。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述HCII特异性催化剂的抗凝效应归因于HCII和ATIII两者介导的机制，及独立于HCII和ATIII两者的机制。

33.如权利要求31所述的方法，其中所述HCII特异性催化剂是约10-24个单糖单位的聚阴离子碳水化合物。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述聚阴离子碳水化合物是分子量在3,000-8,000道尔顿之间的肝素制剂。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述肝素制剂基本上由从未分级肝素分离出来的最低的第三分子量级分组成。

36.如权利要求34所述的方法，其中所述肝素制剂系用化学方法降低分子量范围至约3,000-8,000道尔顿之间而从未分级肝素制得的。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述肝素制剂平均分子量为约8,000道尔顿。

38.如权利要求36所述的方法，其中所述肝素制剂平均分子量为约5,000道尔顿。

39.如权利要求36所述的方法，其中所述肝素制剂平均分子量为约3,000道尔顿。

40.如权利要求36所述的方法，其中所述肝素制剂的抗凝血酶III的亲和力降低到未分级肝素的抗凝血酶III活性的约3％以下。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述抗凝血酶III亲和力的降低包括用氧化剂处理所述肝素制剂中存在的连位醇基，然后用还原剂处理。

42.如权利要求41所述的方法，其中氧化剂选自高碘酸钠、二甲亚砜、酸酐、四乙酸铅和抗坏血酸，所述还原剂选自硼氢化钠、氢化锂铝、金属氢化物和肼。

43.如权利要求34所述的方法，其中所述肝素制剂基本上由对ATIII无亲和力的物质组成，所述物质用固定ATIII、保留流出液的固相亲和提纯法制成。

44.如权利要求30所述的方法，其中所述HCII特异性催化剂具有如下结构式：

其中：

R₁选自H、D-葡糖胺酸残基、D-葡糖醛酸残基和L-艾杜糖醛酸残基；

R₂选自H、D-葡糖胺酸残基、D-葡糖醛酸残基、L-艾杜糖醛酸残基和脱水甘露糖醇；

R₃选自H和SO₃ ^-；

R₄选自H、SO₃ ^-和CH₃CO^-

指数“n”独立地被选择，可为0至约14的值；

HCII特异性催化剂具有约3,000道尔顿至约8,000道尔顿的分子量；或

45.如权利要求30所述的方法，其中所述HCII特异性催化剂具有如下结构式：

其中：

R₁和R₂独立地选自H、D-葡糖胺酸残基、D-葡糖醛酸残基和L-艾杜糖醛酸残基；

R₃选自H和SO₃ ^-；

R₄选自H、SO₃ ^-和CH₃CO^-；

HCII特异性催化剂具有约3,000道尔顿至约8,000道尔顿的分子量。

46.如权利要求30所述的方法，其中所述HCII特异性催化剂具有在抗因子IIa试验中至少约3-4单位/mg的肝素辅助因子II比活。

47.如权利要求30所述的方法，其中所述HCII特异性催化剂具有在抗Xa试验中约1.0单位/mg的ATIII比活。

48.如权利要求30所述的方法，其中所述HCII特异性催化剂在给患者投药前与肝素添加剂混合。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述HCII特异性催化剂与所述肝素添加剂的重量比大于约2∶1。

50.如权利要求48所述的方法，其中所述肝素添加剂是未分级肝素。

51.如权利要求48所述的方法，其中所述肝素添加剂是从未分级肝素分离出来的最低的第三分子量级分。

52.抑制患者血栓形成的药物组合物，该组合物包括：

(i)约90-99.9重量％的灭活纤维蛋白结合凝血酶的HCII特异性催化剂，所述HCII特异性催化剂对抗凝血酶III(ATIII)仅有最低限度的亲和力；

(ii)约0.1-10重量％的灭活液相凝血酶的ATIII催化剂，

其中所述组合物的HCII催化活性约为2-5单位/mg。

53.如权利要求52所述的组合物，其中所述HCII特异性催化剂是约10-24个单糖单位的聚阴离子碳水化合物。

54.如权利要求53所述的组合物，其中所述聚阴离子碳水化合物是分子量在3,000-8,000道尔顿之间的肝素制剂。

55.如权利要求52所述的组合物，其中所述ATIII催化剂是未分级的肝素。

56.如权利要求52所述的组合物，其中所述ATIII催化剂是从未分级的肝素分离出来的最低第三分子量级分。

57.抑制患者体内血块结合凝血酶和液相凝血酶而不增加全身出血临床不安全性的方法，所述方法包括对患者投与药理学上可接受剂量的(i)能灭活血块结合凝血酶的HCII特异性催化剂，所述HCII特异性催化剂对抗凝血酶III(ATIII)具有最小限度亲和力及在抗因子IIa试验中对肝素辅助因子II的比活为约2-5单位/mg；和(ii)灭活液相凝血酶的ATIII催化剂。

58.如权利要求57所述的方法，其中所述HCII特异性催化剂和所述ATIII催化剂同时给患者投药。

59.如权利要求57所述的方法，其中所述HCII特异性催化剂的抗凝效应归因于HCII和ATIII两者介导的机制，及独立于HCII和ATIII两者的机制。

60.如权利要求57所述的方法，其中所述HCII特异性催化剂是约10-24个单糖单位的聚阴离子碳水化合物。

61.如权利要求57所述的方法，其中所述聚阴离子碳水化合物是分子量在约3,000-8,000道尔顿之间的肝素制剂。

62.如权利要求57所述的方法，其中所述HCII特异性催化剂具有如下结构式：

其中：

R₁选自H、D-葡糖胺酸残基、D-葡糖醛酸残基和L-艾杜糖醛酸残基；

R₂选自H、D-葡糖胺酸残基、D-葡糖醛酸残基、L-艾杜糖醛酸残基和脱水甘露糖醇；

R₃选自H和SO₃ ^-；

R₄选自H、SO₃ ^-和CH₃CO^-

指数“n”独立地被选择，可为从0至约14的值；

HCII特异性催化剂具有约3,000道尔顿至约8,000道尔顿的分子量。

63.如权利要求57所述的方法，其中所述HCII特异性催化剂具有如下结构式：

其中：

R₁和R₂独立地选自H、D-葡糖胺酸残基、D-葡糖醛酸残基和L-艾杜糖醛酸残基；

R₃选自H和SO₃ ^-；

R₄选自H、SO₃ ^-和CH₃CO^-；

HCII特异性催化剂具有约3,000道尔顿至约8,000道尔顿的分子量。

64.如权利要求57所述的方法，其中所述HCII特异性催化剂具有在抗因子IIa活性上至少有约3-4单位/mg的肝素辅助因子II比活。

65.如权利要求57所述的方法，其中所述AT III催化剂是未分级肝素。

66.如权利要求57所述的方法，其中所述AT III催化剂是从未分级肝素中分离出来的最低第三分子量级分。

Images