CN1154729C - 新的葡萄球菌激酶衍生物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种产生本发明的衍生物的方法，该方法包括制备包含至少一部分葡萄球菌激酶编码序列的DNA片段(其提供葡萄球菌激酶生物活性)；在所述DNA片段上进行体外定点诱变以便由其它氨基酸的密码子替代一个或多个野生型氨基酸的密码子；在合适的载体中克隆突变的DNA片段；用所述载体转化或者转染合适的宿主细胞；并且在适于表达所述DNA片段的条件下培养所述的宿主细胞。优选的所述DNA片段是质粒pMEX602SakB的453bp EcoRI-HindIII片段，使用质粒pMa/c和修复缺陷大肠杆菌菌株WK6MutS经寡核苷酸定向诱变系统完成体外定点诱变，突变的DNA片段由大肠杆菌菌株WK6表达。本发明也涉及用于治疗动脉血栓形成的包含至少一种按照本发明的葡萄球菌激酶衍生物和合适的赋形剂的药物组合物。
Description
本发明涉及新的葡萄球菌激酶衍生物、其产生方法以及所述衍生物在治疗动脉血栓形成上和制备用于治疗动脉血栓形成之药物组合物上的用途。更具体地说，本发明涉及工程葡萄球菌激酶衍生物在制备用于治疗心肌梗塞之药物组合物上的用途。
心血管疾病的血栓形成并发症是死亡和病废的主要起因，因而，血栓溶解(即，血凝块的药理学分解)可以有利地影响这些威胁生命的疾病(如心肌梗塞，脑血管血栓形成和静脉血栓栓塞)的结果。溶解血栓的药剂是转化血纤维蛋白溶酶原(血液的纤维蛋白分解酶系统的失活酶原)成蛋白酶血纤维蛋白溶酶的血纤维蛋白溶酶原激活剂。血纤维蛋白溶酶溶解血凝块的纤维蛋白，但也可以降解止血系统的正常组分和诱导所谓的″溶解状态″。然而由于组织-型血纤维蛋白溶酶原激活剂、纤维蛋白、血纤维蛋白溶酶(原)和α2-抗血纤维蛋白溶酶(1，2)之间的特异性分子相互作用，生理纤维蛋白溶解作用是纤维蛋白-导向的。
当前，六种溶解血栓的药剂被同意用于临床或者处在患急性心肌梗塞患者的临床研究中。它们包括链球菌激酶，尿激酶，重组组织-型血纤维蛋白溶酶原激活剂(rt-PA)或其衍生物，茴香酰化血纤维蛋白溶酶原链球菌激酶激活剂复合物(APSAC)，重组单链尿激酶-型血纤维蛋白溶酶原激活剂(rscu-PA，重组尿激酶原)和重组葡萄球菌激酶(Sak)(2，3)。用链球菌激酶，rt-PA或APSAC治疗后，在急性心肌梗塞患者中已观察到梗塞程度减弱、心室功能保持和死亡率下降(2)。
目前日常用于治疗的溶解血栓的一种药剂是链球菌激酶，一种Mr45,000的由β-溶血链球菌分泌的蛋白质。然而其施用与广泛的全身纤维蛋白原崩溃有关，其在患有进化急性心肌梗塞的患者中的冠状血栓溶解的效率是有限的，在90分钟内大约百分之九十的冠状动脉再穿通(2)。而且，在大约百分之五的患者中，接触链球菌激酶引起变应性过敏反应，并因此诱导特异性抗体形成，其阻止在几个月或几年之内重复使用该链球菌激酶(4)。
葡萄球菌激酶是一种由金黄色葡萄球菌的某些菌株产生的蛋白质，其在40年以前就显示出具有血纤维蛋白溶酶原性质(5-7)，并且显示出在患有急性心肌梗塞的患者中构成溶血栓剂(8)。葡萄球菌激酶基因已从噬菌体sakφC(9)和sak42D(10)以及从生成溶素的金黄色葡萄球菌菌株的基因组DNA(sakSTAR)(11)克隆，其已在大肠杆菌中在λPR启动子和其自身翻译信号控制下表达，也已在枯草芽孢杆菌或大肠杆菌中在天然启动子和翻译信号控制下表达，分别在周质空间或培养基中积累基因产物(10-13)。
葡萄球菌激酶基因编码163个氨基酸的蛋白质，具有相应于全长成熟葡萄球菌激酶NH2-末端残基的氨基酸28(10，14，15)。这一野生型变体SakSTAR(15)的蛋白质序列在图1中描述。在sakφC、sak42D和sakSTAR基因编码区中仅发现4个核苷酸不同，其中之一构成一种沉默突变(10，14，15)。
几种具有稍微不同的Mr(16,500至18,000SDS-PAGE)和等电点的葡萄球菌激酶的分子形式已被纯化(11-13)。获得了成熟葡萄球菌激酶的较低Mr衍生物，其缺乏6(Sak-Δ6)或10(Sak-Δ10)NH2-末端氨基酸。在与在缓冲液遗传本底中的血纤维蛋白溶酶(原)的相互作用时，成熟葡萄球菌激酶(NH2-末端Ser-Ser-Ser)迅速并定量地转化成Sak-Δ10(NH2-末端Lys-Gly-Asp-)。成熟葡萄球菌激酶和Sak-Δ10显示出具有相同的纤维蛋白分解活性(11，12)。
26位上的氨基酸对葡萄球菌激酶血纤维蛋白溶酶原的激活显示出具有至关紧要的重要性。确实，26位上用精氨酸或缬氨酸取代单一蛋氨酸残基导致丧失功能性活性，而用亮氨酸或半胱氨酸取代对活性具有极小的影响或者没有影响(16)。因为无单个氨基酸交换导致突变体蛋白质溶液结构的明显变化，这种差别行为的机制仍然是高深莫测的。
在血浆遗传本底中，葡萄球菌激酶能够溶解纤维蛋白凝块，而与纤维蛋白原降解无关(17-19)。这一葡萄球菌激酶的纤维蛋白-特异性是结合到血纤维蛋白上的血纤维蛋白溶酶.葡萄球菌激酶复合物的α2抗纤维蛋白溶酶的降低的抑制作用的结果(从血纤维蛋白.葡萄球菌激酶复合物再循环葡萄球菌激酶，接着被α2抗纤维蛋白溶酶抑制，阻止环化血纤维蛋白溶酶原.葡萄球菌激酶由α2抗纤维蛋白溶酶转化成血纤维蛋白.葡萄球菌激酶)(20-22)。在若干实验动物模型中，葡萄球菌激酶对全血或血浆凝块的分解似乎等效于链球菌激酶，但是分解富血小板或回缩的血栓明显更有效(23，24)。
在血栓形成的动物模型中用葡萄球菌激酶所获得的令人鼓舞的结果形成了其以试点规模评价患有急性心肌梗塞的患者的基础(3，25)。在急性心肌梗塞的5个患者中的4个中，10毫克重组葡萄球菌激酶(SakSTAR)在30分钟内静脉内给药，在40分钟之内发现引起血管造影照片所证明的冠状动脉再穿通。血浆纤维蛋白原和α2-抗纤维蛋白溶酶水平不受影响(在40分钟时90-95％基线剩余水平)，没有观察到变应性过敏反应(3)。在患有急性冠状闭塞的5个患者的第二系列中，超过30分钟的静脉内施用10毫克葡萄球菌激酶(SakSTAR)引起在20分钟之内所有患者的再穿通，无相关的纤维蛋白原降解(25)。在24小时的控制血管造影术显示再穿通被持续。
葡萄球菌激酶(SakSTAR)的免疫原性与链球菌激酶的相比在狗(23)和狒狒(24)中进行了研究。总之，这些实验动物的数据表明葡萄球菌激酶与链球菌激酶比较更低的免疫原性。然而，在超过30分钟静脉内输注10毫克葡萄球菌激酶的急性心肌梗塞的前5个患者中，针对葡萄球菌激酶(SakSTAR)的中和抗体滴度基线较低，直到输注后6天，但是在14-35天血浆中抗体的高滴度(12-42μg/毫升血浆的葡萄球菌激酶中和滴度)持续显示出(3)。这些观察结果在5个患者的第二试点试验中得到了充分证实(25)。由此，就免疫原性而言，在人中的初始的观察结果不象在实验动物中的那样令人鼓舞。这样，如同链球菌激酶一样，葡萄球菌激酶的施用限定在单个使用。然而，缺乏针对葡萄球菌激酶和链球菌激酶的抗体的交叉反应性表明这两种物质的施用不是相互排斥的。
链球菌激酶和葡萄球菌激酶的内在的免疫原性明显地阻碍它们不受限制的用途。不仅具有现有高抗体滴度的患者对这些药剂的溶解血栓的作用难控制，而且可以发生变应性副作用和偶然的威胁生命的过敏反应(28)。因为链球菌激酶和葡萄球菌激酶两者都是异源蛋白质，它们的免疫原性可以由蛋白质工程减少不是显然的。确实，没有从链球菌激酶产生活性低分子量片段的成功的尝试被报道。在葡萄球菌激酶中，NH2-末端的17个氨基酸或COOH-末端的2个氨基酸的缺失使该分子失活，此外，所述分子对由位点-特异性诱变的灭活作用十分敏感(25，29)。
然而，我们已令人惊奇地发现，野生型葡萄球菌激酶变体SakSTAR(8，15)包含三个非重叠的免疫显性表位，其中至少两个可以由特异性定点诱变除去，而不灭活该分子。这些工程葡萄球菌激酶变体与用野生型葡萄球菌激酶治疗的患者中激发产生的抗体有较低的反应性，和与野生型葡萄球菌激酶相比明显较低的免疫原性，这一点如在兔和狒狒模型中和在患有外周动脉闭塞患者中所证明的。
因此，本发明涉及与野生型葡萄球菌激酶比较表现出降低的免疫原性的葡萄球菌激酶衍生物。该衍生物实质上具有野生型葡萄球菌激酶或其修饰体的氨基酸序列，但其中除去了至少一个免疫显性表位，而未破坏衍生物的生物活性。在本发明的一个实施方案中，该衍生物实质上具有图1所描述的氨基酸序列，其中一个或多个下划线簇中的一个或多个氨基酸已由其它氨基酸取代，由此改变了相应的表位。优选地是所述氨基酸由丙氨酸替代。通过改变表位降低了所述衍生物与针对三个表位簇I、II和III的一个或多个的单克隆抗体系列(panel)的反应性。这表明用丙氨酸替代野生型氨基酸降低了葡萄球菌激酶的免疫原性。
在一个实施方案中，本发明提供了一种葡萄球菌激酶衍生物，该衍生物与野生型葡萄球菌激酶比较表现出降低的免疫原性，并且实质上具有图1所描述的氨基酸序列，其中一个或多个下划线簇中的一个或多个氨基酸已由丙氨酸取代，由此除去了相应的表位。
在又一个实施方案中，本发明提供了一种葡萄球菌激酶衍生物，该衍生物与野生型葡萄球菌激酶比较表现出降低的免疫原性，并且实质上具有图1所描述的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸已由丙氨酸取代，由此降低了所述衍生物与针对表位簇I或表位簇III或者表位簇I和III的单克隆抗体系列的反应性。
进一步优选地，该衍生物实质上具有图1所描述的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸已由丙氨酸取代，由此降低了所述衍生物与单克隆抗体17G11、26A2、30A2、2B12、3G10、7H11、25E1、40C8、24C4或1A10的反应性。
本发明还提供了产生上述葡萄球菌激酶衍生物的方法，该方法包括以下步骤：a.制备包含至少一部分图1所示葡萄球菌激酶编码序列的DNA片段，其提供葡萄球菌激酶生物活性；b.在所述DNA片段上进行体外定点诱变以便由丙氨酸的密码子替代一个或多个野生型氨基酸的密码子；c.在合适的载体中克隆突变的DNA片段；d.用所述载体转化或者转染合适的宿主细胞；和e.在适于表达所述DNA片段的条件下培养所述的宿主细胞。
本发明特别涉及葡萄球菌激酶衍生物M8，该衍生物具有图1所描述的氨基酸序列，其中在下划线簇8中的氨基酸74位上的赖氨酸、75位上的谷氨酸和77位上的精氨酸已由丙氨酸取代，由此改变了相应的表位；涉及葡萄球菌激酶衍生物M3，该衍生物具有图1所描述的氨基酸序列，其中在下划线簇3中的氨基酸35位上的赖氨酸和38位上的谷氨酸已由丙氨酸取代，由此改变了相应的表位；涉及葡萄球菌激酶衍生物M9，该衍生物具有图1所描述的氨基酸序列，其中在下划线簇9中的氨基酸80位上的谷氨酸和82位上的天冬氨酸已由丙氨酸取代，由此改变了相应的表位；涉及葡萄球菌激酶衍生物M3.8，该衍生物具有图1所描述的氨基酸序列，其中在下划线簇3和8中的氨基酸35位上的赖氨酸、38位上的谷氨酸、74位上的赖氨酸、75位上的谷氨酸和77位上的精氨酸已由丙氨酸取代，由此改变了相应的表位；涉及葡萄球菌激酶衍生物M8.9，该衍生物具有图1所描述的氨基酸序列，其中在下划线簇8和9中的氨基酸74位上的赖氨酸、75位上的谷氨酸、77位上的精氨酸、80位上的谷氨酸和82位上的天冬氨酸已由丙氨酸取代，由此改变了相应的表位。由此M3.8和M8.9是具有两个受破坏的表位的双重突变体。
本发明说明具有较低的免疫原性的葡萄球菌激酶的工程变体可以是链球菌激酶或野生型葡萄球菌激酶的实际的替换性溶血栓剂。
本发明也涉及一种产生本发明的衍生物的方法，该方法通过制备包含至少一部分葡萄球菌激酶编码序列的DNA片段(其提供葡萄球菌激酶生物活性)；在所述DNA片段上进行体外定点诱变以便由其它氨基酸的密码子替代一个或多个野生型氨基酸的密码子；在合适的载体中克隆突变的DNA片段；用所述载体转化或者转染合适的宿主细胞；并且在适于表达所述DNA片段的条件下培养所述的宿主细胞。优选的所述DNA片段是质粒pMEX602SAK的453bp EcoRI-HindIII片段，使用质粒pMa/c和修复缺陷大肠杆菌菌株WK6MutS经寡核苷酸定向诱变系统完成体外定点诱变，突变的DNA片段在大肠杆菌菌株WK6中克隆。
本发明也涉及用于治疗动脉血栓形成的包含至少一种按照本发明的葡萄球菌激酶衍生物和合适的赋形剂的药物组合物。在人类或兽医学实践中用于治疗动脉血栓形成的包含较低免疫原性的葡萄球菌激酶变体作为有效成分的药物组合物可以采用粉末或溶液形式，并且可以用于静脉内或动脉内施用。这种组合物可以通过组合(例如，混合，溶解等)活性成份和中性特征的药学上可接受的赋形剂(例如水或含水溶剂、稳定剂、乳化剂、去垢剂、添加剂)制备，必要时还可以进一步组合进染料。在治疗组合物中的有效成分的浓度可以在0.1％和100％之间广泛地变化，取决于疾病的特征和施药方式。而且，施用的活性成份的剂量可以在每千克体重0,05毫克和1,0毫克之间变化。
此外，本发明涉及葡萄球菌激酶衍生物用于治疗动脉血栓形成(特别是心肌梗塞)上的用途，并且涉及葡萄球菌激酶衍生物在制备用于治疗动脉血栓形成(特别是心肌梗塞)药物上的用途。
在上面和下面，术语″衍生物″，″突变体″和″变体″互换性地使用。
将在以下实施例中详细说明本发明，然而，这些实施例并不限制本发明的范围。基于本发明，对本领域技术人员而言，若干变化与改进是显而易见的。由此，从组合突变体3.8和从组合突变体8.9的随机诱变很可能产生具有较低的免疫原性和可能增加的功能活性的替换性突变体，而在表位中和簇中的替换性诱变将产生具有较低的免疫原性的其它变体。
实施例1
野生型葡萄球菌激酶的表位作图
抗野生型葡萄球菌激酶(SakSTAR变体)产生的一组17个鼠单克隆抗体的表位特异性采用BIAcoreTM仪(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，瑞典)经实时生物特异性相互作用分析(BIA)测定。针对SakSTAR的单克隆抗体基本上用Galfr②和Milstein的方法产生(30)。经皮下注射在完全弗氏佐剂中的10μg SakSTAR，接着在此后2周腹膜内注射在不完全弗氏佐剂中的10μg SakSTAR免疫BALB/c小鼠。在至少间隔6周后，在细胞融合之前4天和2天，用在盐水中的10μg SakSTAR腹膜内强化，分离脾细胞并且按照Fazekas de St.Groth和Scheidegger的方法与P3X63-Ag.8-6.5.3骨髓瘤细胞(从Dr.0.Sch_nherr，Organon，Oss，荷兰获得)融合(31)。在用次黄嘌呤，氨蝶呤，胸苷培养基选择之后，采用涂上一层葡萄球菌激酶的微滴板经单点非竞争微型-ELISA就特异性抗体产生筛选上清液。结合的免疫球蛋白用辣根过氧化物酶(HP)一缀合的兔一抗小鼠IgG检测(32)。阳性克隆用于在降植烷致敏的(pristane-primed)BALB/C小鼠中产生腹水液(33)。通过在蛋白质-琼脂糖凝胶上的亲和色谱纯化来自腹水的单克隆抗体的IgG片段(34)。
这一基于胞质基因共振(SPR)的表面生物特异性相互作用分析使得可以实时直接测量相互作用，而不采用标记(35)。按照制造商推荐的方法，用胺连接试剂盒(Pharmacia Biosensor AB)将葡萄球菌激酶(SakSTAR)固定在Sensor Chip CM5的表面上。这一方法将在配位体中的伯氨基连接到SensorChip的羧甲基化的葡聚糖表面上(36)。从蛋白质溶液完成固定化(以10mM醋酸钠(pH值5.0)中10μg/ml的浓度，6分钟期间的流速为5μl/分钟)。这导致葡萄球菌激酶部分的1,000-1,500 RU(共振单位)(与大约0.07pmole/mm2相应)的共价连接(37)。将第二相互作用组分(分析物：即，单克隆抗体)注射到传感器的溶液中。于20℃使溶液持续流过传感器表面来保持游离分析物的浓度恒定。在缔合阶段在6分钟期间以5μl/分钟的流速注射在10mMHEPES，3.4mM乙二胺四乙酸，0.15MNaCl和0.005％表面活化剂P20，pH值7.2中的至少四种浓度的分析物(范围0-400nM或0-50μM)。然后样品被缓冲液替代，在6至30分钟期间的流速为5μl/分钟。在每个循环之后，传感器芯片的表面通过注射5μl15mM HCl再生。缔合(Kass)和分解(Kdiss)速率常数来源于其它地方详尽描述的传感器方法(sensorgrams)。有关所研究的一组17种单克隆抗体与野生型葡萄球菌激酶的结合的平衡缔合常数(KA)作为Kass和Kdiss的比率被计算出来，范围在0.6和＞25×109M-1之间(平均值1010M-1)(表1)。
在表1中，标有″ID″的栏表明各种葡萄球菌激酶衍生物。代号″17G11″，″26A2″等指结合到所表明的表位簇I，II和III上的单克隆抗体。在″变体″栏中，突变氨基酸和它们的位置以氨基酸单字母码表示。表位簇I被抗体17G11、26A2、30A2、2B12和3G10识别，而表位簇II被抗体29C1、18F12、14H5、28H4、20D6、32B2和7F10识别，表位簇III被抗体7H11、25E1、40C8、2 4C4和1A10识别。
针对不同表位的单克隆抗体相互独立地结合，而针对密切相关表位的单克隆抗体干扰相互的结合。因此，一组单克隆抗体的表位特异性通过试验单克隆抗体对同时结合到抗体上的能力很容易地测定。实时生物特异性相互作用分析(BIA)可以用来测定单克隆抗体对对连接到传感器芯片表面上的葡萄球菌激酶的竞争性结合。如在Application Note 101(PharmaciaBiosensor AB)中所述进行分析。成对方式(Pair-Wise)结合试验将17种单克隆抗体划分成3组，代表抗原上的3个非重叠表位，如图2所示。这些表位的独立性被单克隆抗体26A2、28H4和24C4的加合性结合证实。如表1所示按照其表位特异性排列抗体。
实施例2
葡萄球菌激酶″丙氨酸荷电簇″变体的构建和表位作图
在″丙氨酸荷电簇″(charged-clustet-to-alanine)扫描中，亲水荷电氨基酸簇是靶向。葡萄球菌激酶(SakSTAR)包含45个荷电氨基酸(2个组氨酸，14个谷氨酸，8个天冬氨酸，1个精氨酸，和20个赖氨酸)。在两个或三个氨基酸的簇中，这些荷电残基被突变成丙氨酸，如图1中所总结的。设计了总共21个突变体，其中下划线的荷电氨基酸由丙氨酸替代。被丙氨酸替代的氨基酸在簇中用小的垂直线表示。
突变体通过以下详细描述的定点诱变制备和在大肠杆菌中表达。限制酶从Pharmacia，Uppsala，瑞典或Boehringer曼海姆(曼海姆，德国)购得。T4 DNA连接酶，大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段和碱性磷酸酶从Boehringer曼海姆获得。寡核苷酸-定向诱变系统和pMa/c质粒由corvas(Ghent，比利时)(39)友好提供。表达载体pMEX602SakB由Institut für Molekulare Biotechnologie Jena，德国(25)友好提供。M123K07辅助噬菌体从Promega(Leiden，荷兰)购得。Luria肉汤菌种生长培养基从Life Technologies(Merelbeke，比利时)购得。血纤维蛋白溶酶原如其它地方所述从人类血浆纯化(40)。
用供给者建议的条件进行酶反应。质粒DNA用QIAGEN-纯化方案(由Westburg Leusden，荷兰提供)分离。用磷酸钙方法进行大肠杆菌的转化。用双脱氧链终止反应法和自动激光荧光A.L.F.TM(Pharmacia)进行DNA测序。突变体D5，K6(M20)，直到K86，E88(M10)的定点诱变用pMa/c进行(利用修复缺失大肠杆菌菌株WK6MutS)。在大肠杆菌WK6中完成质粒pMa/c衍生物的增殖，单链DNA的制备和表达(39)。突变体D93，K94(M11)，直到K134，K135，K136(M19)由以上所述的Institut für MolekulareBiotechnologie Jena德国构建(16)。产色底物(S2403)L-焦谷氨酰-L-苯丙氨酰-L-赖氨酸-对-硝基丙氨酸盐酸盐从Chromogenix购得。125I标记的纤维蛋白原从Amersham购得。
包含SakSTAR的完整的编码区的453-碱基对EcoRI-HindIII片段被切割出质粒pMEX602SakB(具有氨苄青霉素抗性)，并克隆进pMc5-8质粒(具有氯霉素抗性)的EcoRI-HindIII位点，产生pMc-STAR。对于体外定点诱变，这一构建体的单链DNA通过pMc-STAR构建体在大肠杆菌中的转化和注射与辅助噬菌体M13K07的过夜培养物制备。在注射之后四小时，细胞通过PEG-沉淀和酚-三氯甲烷抽取从培养基分离。其后，将单链pMc-STAR与单链pMa(EcoRI-HindIII)载体DNA和适当的28至44个碱基的合成寡核苷酸(具有产生或消除限制位点的沉默突变)杂交。用以上描述的DNA聚合酶的Klenow片段进行延伸反应。在大肠杆菌WK6MutS转化和在氨苄青霉素上选择之后，使菌落在硝基纤维素膜上生长，原位变性，并且用各自的放射性标记的突变寡核苷酸(1.5×108cpm用于20-30ng寡核苷酸的T4多核苷酸激酶标记的[γ32P]-ATP)在室温下使DNA杂交过夜。过滤物于42℃用包含0.1％SDS和2×SSC，1×SSC，0.2×SSC，0.1×SSC的溶液洗涤。从10毫升细菌培养物形成阳性克隆提取质粒DNA，并且通过限制性内切酶消化分析。使用A.L.F.TM经全编码序列测序证实所需的突变。
然后，将突变的HindIII-EcoRI片段连接回包含pTaq启动子的pMEX602SakB表达载体(39)。在用这一载体转化的大肠杆菌WK6细胞中，突变蛋白质被胞内产生，并且为可溶性形式。用阳离子交换和疏水相互作用色谱从超声处理过的细菌提取物纯化所述突变体(25)。
获得SakSTAR突变体，产率范围在10和80毫克/升之间，代表起始物质15至88％回收。纯化过的物质在非还原10-15％梯度凝胶上的电泳(未示出)显示时为纯的。NH2-末端氨基酸分析确证成熟葡萄球菌激酶的丝氨酸-丝氨酸-丝氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸序列。这些葡萄球菌激酶突变体更详尽的生物化学特征已经在其它地方报道(41)。
根据Bradford(42)的方法测定蛋白质浓度。用产色底物试验测定SakSTAR溶液的纤维蛋白溶解活性，该试验是在微滴板上用80μl SakSTAR溶液和100μl谷氨酸-血纤维蛋白溶酶原溶液(终浓度0.5mM)的混合物进行。在37℃培养30分钟后，产生的血纤维蛋白溶酶经添加30μl S2403(终浓度1μM)和测量405毫微米的吸收度而定量。活性以home单位(HU)表达(与in-house标准(lot STAN5)比较，其被指定为由氨基酸组合测定时每毫克蛋白质100,000 HU的活性)(11)。用10-15％梯度凝胶由Phast SystemTM(Pharmacia，Uppsala，瑞典)进行SDS-PAGE，并经考马斯亮蓝染色。通过在1％SDS和1％二硫赤藓糖醇存在下于100℃加热3分钟完成样品的还原。
如以下的详细描述进行突变体M3.8和M8.9的构建，产生和纯化。用于构建的寡核苷酸，5′-ATAGCAATGCATTTCCTGCACTATCAAC-3′(M3)，5′-CTAATTCAACTACTGCAAACGCTGCATATGCTGTCGCATC-3′(M8)，和5′-TTTGCGCTTGGCGCCAATGCAACTACTCTAAACTCTTTATAT-3′(M9)由PharmaciaBiotech常规合成。
为构建突变体M3.8，单链pMc-STAR和pMa5-8的EcoRI-HindIII片段用于制备间隙-双螺旋DNA分子，将该分子与28个碱基合成寡核苷酸M3(包含NsiI限制位点)杂交。用所描述的DNA聚合酶的Klenow片段和连接酶进行延伸反应。在大肠杆菌WK6MutS转化和在氨苄青霉素上选择之后，使81个菌落在硝基纤维素膜上生长，原位变性，并且用放射性标记的M3寡核苷酸(1.5×108cpm用于20-30ng寡核苷酸的T4多核苷酸激酶标记的[γ32P]-ATP)在室温下使DNA杂交过夜。过滤物于42℃用包含0.1％SDS和2×SSC，1×SSC，0.2×SSC，0.1×SSC的溶液洗涤，从150毫升细菌培养物制备16个阳性中的1个选择的克隆的DNA，并且通过用NsiI和PvuI经限制性内切酶消化分析。使用A.L.F.TM经全编码序列测序证实M3突变(pMa-STAR3)。然后通过如上所述在大肠杆菌中pMa-STAR3的转化制备单链DNA。如上所述将单链pMa-STAR3与pMc(EcoRI-HindIII)和与包含NdeI限制位点的40个碱基的合成寡核苷酸杂交。在大肠杆菌WK6MutS转化和在氯霉素上选择之后，使100个菌落在硝基纤维素膜上生长，并与标记的M8寡核苷酸杂交。培养阳性克隆(7个中的2个)，通过限制性内切酶(Nsil-HindIII和NdeI)消化分析，产生一阳性克隆。然后将双重突变体M3.8连接回pMEX602SakB表达载体。12个小量制备的DNA中，6个具有正确的限制模式。这些克隆中的一个(pMEXSakSTAR.M38)被测序，并用于在IPTG诱导tac启动子前后纵排的两个Shine-Dalgarno序列的控制下制备突变体。
100μl用重组质粒pMEXSakSTAR.M38转化的大肠杆菌WK6细胞悬液包含100μg/ml氨苄青霉素的100ml LB培养基(Gibco/BRL)中培养。于37℃在200rpm振荡下培养混合物一夜，形成在600毫微米下约5个吸收单位的细胞密度。将20ml等分试样转移进包含体积为2升(在5升蒙诺德培养瓶中)的包含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中。在添加200μM IPTG诱导M3.8表达(其允许进行4小时)之前，将混合物在37℃振荡培养3小时。通过在4,000rpm下离心20分钟使细胞成为离心沉淀，重悬于1/10体积的0.01M磷酸缓冲液(pH值6.5)中，在0℃经声处理破碎细胞，通过在20,000rpm下离心30分钟除去细胞碎片，将上清液在-20℃下贮存直至使用。
将从20至30升细菌培养物收集的澄清的细胞溶解物(2升体积)调节pH至5.9，通过0.22μm Sartorius滤器过滤灭菌，并用于5×25cmSP-琼脂糖凝胶柱，于4℃以12毫升/分钟的流速层流用0.5M NaOH和用已灭菌的0.01M磷酸缓冲液预处理。柱用2至3升缓冲液洗涤，于4℃以10毫升/分钟的流速用500毫升以上的0到1M和250毫升以上的1M到2M盐梯度洗脱。收集包含SDS凝胶电泳定位的组分的M3.8(大约200ml)，4℃对15升已灭菌0.01M磷酸缓冲液(pH8.0)透析。将透析物质在4,000rpm下离心30分钟，再次经过滤灭菌，并用于Q-琼脂糖凝胶快流2.5×12cm柱，于4℃以3毫升/分钟的流速用0.5M NaOH和用已灭菌的0.01M磷酸缓冲液(pH8.0)预处理。柱用约600毫升0.01M磷酸缓冲液(pH8.0)以8毫升/分钟的流速洗涤，以4毫升/分钟的流速用30毫升以上的0到0.17M和100毫升以上的0.17到0.2M盐梯度洗脱。收集包含SDS凝胶电泳定位的组分的M3.8，将蛋白质浓度调整到1毫克/毫升，经通过0.22μm微孔滤膜的过滤使物质灭菌。M3.8的三种制剂产生80±25毫克的具有45,000±5,200 HU/毫克比活性(specific activity)的纯的蛋白质(平均值±标准差)。
为构建突变体M8.9，单链pMc-STAR和pMa5-8的EcoRI-HindIII片段用于制备间隙-双螺旋DNA分子，将该分子与42个碱基合成寡核苷酸M9(包含NarI限制位点)杂交。用所描述的DNA聚合酶的Klenow片段和连接酶进行延伸反应。在大肠杆菌WK6MutS转化和在氨苄青霉素上选择之后，使菌落在硝基纤维素膜上生长，原位变性，并且用放射性标记的M9寡核苷酸(1.5×108cpm用于20-30ng寡核苷酸的T4多核苷酸激酶标记的[γ32P]-ATP)在室温下使DNA杂交过夜。过滤物于42℃用包含0.1％SDS和2×SSC，1×SSC，0.2×SSC，0.1×SSC的溶液洗涤。制备4个阳性中的2个选择的克隆的DNA，使用A.L.F.TM经核苷酸序列分析确定其中1个(pMA-STAR9)的特征。将pMa-STAR9的EeoRI-HindIII插入物连接回pMEX602SakB表达载体。经核苷酸序列分析确定一个克隆(pMEXSakSTAR.M9)的特征，接着用于构建突变体M8.9。
为构建M8.9，经聚合酶链反应(PCR)将突变8引入进M9。采用5U酶和1μg下列各引物在100μl总体积中进行PCR：
寡核苷酸II＝5′-CAGGAAACAGAATTCAGGAG-3′
寡核苷酸III＝5′-TATATAATATTCGACATAGTATTCAATTTTT-3′
寡核苷酸IV＝ 5′-TATCCCGGGCATTAGATGCGACAGCATATGCAGCGTTTGCAGTA-3′和
寡核苷酸V＝5′-CAAAACAGCCAAGCTTCATTCATTCAGC-3′。dATP，dCTP，dGTP和dTTP的浓度为200μM。于94℃变性1分钟，于55℃退火2分钟，于72℃延伸1.5分钟。30个循环后，将样品在72℃温育10分钟，冷却至4℃。在第一PCR反应中，用寡核苷酸IV和V作为引物扩增2毫微克pMEXSakSTAR.M9。用SmaI和HindIII消化PCR扩增子，在于1.5％琼脂糖凝胶中电泳之后用Prep-A-gene试剂盒(Bio-Rad实验室，Hercules CA，美国)纯化。用快速DNA连接试剂盒(Boehringer Mannheim)将所形成的片段克隆进pUC18(Pharmacia BioTech，Uppsala，瑞典)的SmaI-HindIII位点。在大肠杆菌WK6细胞中转化之后，制备12个菌落的DNA，当用EcoRI和HindIII消化时，所有12个产生大约230个碱基对的片段。这些DNA的一个(pUC18-M89Δ)用于克隆第二PCR产物(参见下述)。用寡核苷酸II和III作为引物在2毫微克pMEXSakSTAR.M9上进行第二PCR反应。用SspI和EcoRI消化PCR反应产物，并如上所述进一步纯化。将所形成的片段连接进pUC18-M89Δ的SmaI-ERI位点。在大肠杆菌WK6细胞中转化后，选择6个克隆供DNA制备。当用EcoRI和HindIII消化时，6个中的5个产生大约453个碱基对的片段。将这一编码整个突变体M8.9的片段克隆进表达载体pMEX602SakB的EcoRI-HindIII位点。在大肠杆菌WK6细胞中转化之后，经EcoRI和HindIII消化分析6个菌落的DNA，所有都产生大约453碱基对的片段。这些DNA的一个进一步经核苷酸序列分析确定特征。
用100μl由重组质粒pMEXSakSTAR.M89转化的大肠杆菌WK6细胞的悬液接种100ml包含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(GIBCO/BRL)。于37℃以140rpm振荡培养培养物一夜，至600毫微米的大约5个吸收单位的细胞密度。4mi等分试样用于接种2升包含150μl/ml氨苄青霉素的“Terrific Broth”培养物(在SL缓冲的培养瓶中)。于30℃在140rpm下培养培养物大约20小时，形成大约4.109细胞/ml的细胞密度。通过在4,000rpm下离心20分钟使细胞成为离心沉淀，重悬于1/5体积的0.01M磷酸缓冲液(pH值6.5)中，在0℃经声处理破碎细胞。然后将pH调至5.8，通过在20,000rpm下离心30分钟除去细胞碎片。将上清液在-20℃下贮存直至进一步加工。
将收集的澄清的细胞溶解物(1800ml体积)调节pH至5.8，用于2.5×20cmSP-琼脂糖凝胶柱，于4℃以2毫升/分钟的流速用0.5M NaOH和新鲜的0.01M磷酸盐、2.5MNaCl缓冲液(pH值7.5)预处理。柱用500μl缓冲液洗涤，以6毫升/分钟的流速用200毫升以上的0到1M盐梯度洗脱。
收集的M8.9组分(用SDS凝胶电泳鉴别)用固体氯化钠调节至2.5M，并在苯基-琼脂糖凝胶的2.5×20cm柱上进行疏水相互作用色谱，于4℃以2毫升/分钟的流速用0.5M NaOH和新鲜的0.01M磷酸盐、2.5MNaCl缓冲液(pH值7.5)预处理。柱用约500μl缓冲液洗涤，用0.01M磷酸盐缓冲液(pH值6.5)洗脱。收集包含SDS凝胶电泳定位的组分的M8.9，对2升0.01M磷酸缓冲液(pH9.0)透析。将透析物质在4,000rpm下离心30分钟，再次经过滤灭菌，并用于Q-琼脂糖凝胶快流1.6×5cm柱，于4℃以2毫升/分钟的流速用0.5M NaOH和用新鲜的0.01M磷酸缓冲液(pH9.0)预处理。柱用约150毫升0.01M磷酸缓冲液(pH9.0)洗涤，以4毫升/分钟的流速用100毫升以上的0到1M氯化钠盐梯度洗脱。收集包含SDS凝胶电泳定位的组分的M8.9，将蛋白质浓度调整到1毫克/毫升，经通过0.22μM微孔滤膜的过滤使物质灭菌。M8.9的三种制剂产生73±17毫克具有51000±3500HU/mg的比活性的纯的蛋白质。
用产色底物试验测定的不同SakSTAR突变体的纤维蛋白溶解活性总结在表1中。
如图1中所说明的设计的21个突变体中，E99，E100(M13)和E99，E100，E102(M14)不能以纯化的形式获得，而K11，D13，D14(M1)；E46，K50(M4)和E65，D69(M7)是失活的。表1中总结的16个突变体和野生型SakSTAR一起被详细研究。这些突变体中，D5，K6(M20)；K8，K10(M21)；D33，K35(M2)；K57，E58，K59(M5)；E61，E65(M6)；K86，E88(M10)；D93，K94(M11)；K96，K97，K98(M12)；E108，K109(M15)；D115，E118，H119(M16)；H119，K121(M17)；K130(M18)和E134，K135，K136(M19)与单克隆抗体组反应是与SakSTAR类似的方式。然而K35，E38(M3)和E80，D82(M9)仅与抗体簇7H11，25E1，40C8反应，而K74，E75，R77(M8)仅与簇26A2，30A2，2B12和3G10反应。表位消除的加合性出现在突变体K35，E38/K74，E75，R77(M3.8)和K74，E75，R77/E80，D82(M8.9)中，其组合了与两种亲本分子的单克隆抗体的降低的反应性。
实施例3
用野生型和″丙氨酸荷电簇″葡萄球菌激酶变体吸收患者中经SakSTAR治疗激发的抗体
为了获得诱导的抗体(其是在患有急性心肌梗塞的患者中用SakSTAR治疗后激发产生的)的表位特异性的有关信息，在经生物特异性相互作用分析测定对SakSTAR的残余结合之前，用两倍摩尔过量(超过葡萄球菌激酶中和活性)的单独的和组合的″丙氨酸荷电簇″突变体吸收16个患者的血浆样品。按如下测定这些样品中的葡萄球菌激酶中和活性。将野生型或突变SakSTAR的增加的浓度(包含0.2至1000μg/ml的50μl体积)添加到300μl含枸橼酸盐的人类血浆和50μl缓冲液或试验血浆的混合物中，紧接着添加100μl包含凝血酶(50NIH单位/ml)和CaCl2(25mM)的混合物。测定血浆凝块溶解时间，并对SakSTAR部分的浓度作图。从这一曲线确定在20分钟产生完全的凝块溶解的血纤维蛋白溶酶原激活剂的浓度。以试验血浆和缓冲液值间的不同测定中和活性滴度，并以每毫升试验血浆微克表示。
结果总结在表2中。野生型SakSTAR从所有样品吸收90％以上的结合抗体，由突变体K35，E38(M3)在4个患者中、突变体K74，E75，R77(M8)在12个患者中、E80，D82(M9)在5个患者中观察到不完全吸收。组合突变体K35，E38/K74，E75，R77(M3.8)和K74，E75，R77/E80，D82(M8.9)在13个患者中除去不到90％的抗体(16个患者各自有68％和65％的中位值)，如所预料的，组合突变体的母体分子(M8和M3或M9)的混合物一致地吸收超过90％的抗体。
实施例4
在用野生型葡萄球菌激酶(SakSTAR)、突变体K35，E3.8(M3)；K74，E75，R77(M8)；E80，D82(M9)、组合突变体K35，E38/K74，E75，R77(M3.8)和K74，E75，R77/E80，D82(M8.9)免疫的兔中，葡萄球菌激酶的“丙氨酸荷电簇”变体的免疫原性
在分配给SakSTAR的4或8只兔的组中和分配给变体的8只兔的组中皮下免疫接种后，研究了SakSTAR相对各SakSTAR变体，M3，M8，M9，M3.8和M8.9的比较免疫原性。在第0周静脉内输注400μg/kg SakSTAR和200至1,000μg/kg突变体进行免疫(为确定基线凝块溶解能力)后，在第二周皮下注射400μg在弗氏完全佐剂中的相同的药剂，在第三和五周皮下注射400μg在弗氏不完全佐剂中的相同的药剂。免疫原性在第六周经测定血浆中的葡萄球菌激酶中和活性和残余溶解血栓潜能(如下详细说明的)定量。
简言之，在血浆中葡萄球菌激酶中和活性按以下所述测定：将野生型或突变SakSTAR的增加的浓度(包含0.2至1000μg/ml的50μl体积)添加到300μl含枸橼酸盐的人类血浆和50μl缓冲液或兔血浆的混合物中，紧接着添加100μl包含凝血酶(50NIH单位/ml)和CaCl2(25mM)的混合物。测定血浆凝块溶解时间，并对SakSTAR或变体的浓度作图。从这一曲线确定在20分钟产生完全的凝块溶解的血纤维蛋白溶酶原激活剂的浓度。以兔血浆和缓冲液值间的不同测定中和活性滴度，并以微克/毫升兔血浆表示。
用0.3毫升125I血纤维蛋白标记的血小板-缺乏的兔血浆凝块(插入到体外动静脉环中)研究溶解血栓性质。由此，用4个French导管(Portex White，Portex，Hythe，UK)插入露置的股动脉，经由两个皮下组织的注射器与插管的耳静脉连接。用蠕动泵保持体外环血流在10ml/分钟。将125I血纤维蛋白标记的血浆凝块引入到插入环中的两个注射器中。通过将0.3ml血小板-缺乏的兔血浆与痕量(大约1.5μCi)125I标记的人类纤维蛋白原溶液(Amersham Buckinghamshire，英国)和0.07ml牛凝血酶(15NIH单位/ml)和0.5M CaCl2的混合物混合，接着在37℃温育30分钟制备血浆凝块。在开始灌输之前的三十分钟，以静脉内大丸剂施用7.5毫克/千克ridogrel(一种组合的血栓烷合酶抑制剂和前列腺素内过氧化物(endoperoxide)受体拮抗剂)(43)以阻止在体外的环中血小板沉淀。动物用肝素(300单位/千克，接着在整个实验中连续输注200单位/千克/小时)抗凝，并随机分配为输注400μg/千克SakSTAR(4或8只兔)或200至1000μg/千克SakSTAR变体(8只兔)。在第6周，分配给SakSTAR变体的兔的一半再一次用相同的SakSTAR变体处理，另一半用野生型SakSTAR处理，而以SakSTAR免疫的兔用SakSTAR变体处理(如果这个对照组由4只兔组成)或者随机用野生型SakSTAR或SakSTAR变体处理(如果这个对照组包含8只兔)。在1小时内以10％大丸剂和90％输注静脉内给予溶解血栓的药剂。凝块溶解的时间进程持续由外部γ计数器监测，采用配置在体外环上的两块3x0.5英寸碘化钠/铊晶体(Bicron Newbury OH)。闪烁晶体与一个专门的Canberra-S100系统(Canberra-Packard Meriden，CT)连接，如其它地方所述(44)分析数据。在实验末，也从注射器回收剩余凝块，以测定其放射性同位素含量。按美国生理学会和血栓形成和血郁滞国际委员会的指导原则(45)进行动物实验。
表3A中比较了SakSTAR和各单一突变体(M3，M8和M9)的免疫原性。结果以平均值±SD表示。
在突变体M3随机化处理的8只兔中，针对M3和针对SakSTAR的基线中和活性是0.0±0.0μg/ml。静脉内输注200μg/千克M3诱导76±23％凝块溶解。然后，这8只兔在第二周用悬浮在500μl完全弗氏佐剂中的M3免疫，在第三和五周用悬浮在500μl不完全弗氏佐剂中的M3免疫。在第6周，血浆中和活性增加至11±6.7μg/ml(针对SakSTAR)和11±7.2μg/ml(针对M3)。在第6周，在这些兔中随机选择的4只中输注400μg SakSTAR产生18±27％的凝块溶解，而在4只其它兔中输注200μg/千克M3诱导16±17％凝块溶解。在4只分配给SakSTAR的兔中，基线中和活性是0.2±0.2μg/ml(针对0.0 SakSTAR)和0.0±0.0μg/ml(针对M3)。静脉内输注400μg/千克SakSTAP产生89±8.6％基线溶解。然后，这4只兔用400μg悬浮在完全弗氏佐剂(在第2周)或不完全弗氏佐剂(在第3和5周)的SakSTAR免疫。在第6周，血浆中和活性增加至35±23μg/ml(针对SakSTAR)和19±13μg/ml(针对M3)。在第6周在这4只兔中静脉内输注200μg/千克SakSTAR.M3诱导9.3±8.2％溶解。
在分配给突变体M8的8只兔中，血浆中的基线中和活性是1.4±0.2μg/ml(针对SakSTAR)和0.6±0.5μg/ml(针对M8)。静脉内输注1000μg/千克M8产生41±13％溶解。然后这些兔用400μg悬浮在完全弗氏佐剂(在第2周)或不完全弗氏佐剂(在第3和5周)的M8免疫。在第6周，血浆中和活性增加至3.8±1.8μg/ml(针对SakSTAR)和5.9±2.7μg/ml(针对M8)。在这4只兔中输注400μg/kg SakSTAR产生49±28％凝块溶解，而在4只其它兔中输注1000μg/kg M8产生24±11％凝块溶解。在分配给SakSTAR组的8只兔中，血浆中的基线中和活性是0.9±0.6μg/ml(针对SakSTAR)和0.6±0.3μg/ml(针对M8)。静脉内输注400μg/千克SakSTAR产生68±18％溶解。然后这些兔用400μg悬浮在完全弗氏佐剂(在第2周)或不完全弗氏佐剂(在第3和5周)的SakSTAR免疫。在第6周，血浆中和活性增加至59±47μg/ml(针对SakSTAR)和22±16μg/ml(针对M8)。而400μg/千克SakSTAR的残余溶解血栓潜能降低至7.5±2.4％，1,000μg/千克M8残余溶解血栓潜能降低至4.1±4.8％。
在分配给突变体M9的8只兔中，血浆中的基线中和活性是0.2±0.05μg/ml(针对SakSTAR)和0.03±0.05μg/ml(针对M9)。静脉内输注400μg/千克M9产生72±11％溶解。然后这些兔用400μg悬浮在完全弗氏佐剂(在第2周)或不完全弗氏佐剂(在第3和5周)的M9免疫。在第6周，血浆中和活性增加至8.0±4.6μg/ml(针对SakSTAR)和3.5±2.6μg/ml(针对M9)。在第6周，在这4只兔中输注400μg/kg SakSTAR产生53±11％凝块溶解，而在4只其它兔中输注400μg/kg M9产生40±7.8％凝块溶解。在分配给SakSTAR的4只对照兔中，血浆中的基线中和活性是0.1±0.05μg/ml(针对SakSTAR)和0.05±0.06μg/ml(针对M9)。静脉内输注400μg/千克SakSTAR产生78±13％溶解。然后这些兔用400μg悬浮在完全弗氏佐剂(在第2周)或不完全弗氏佐剂(在第3和5周)的SakSTAR免疫。在第6周，血浆中和活性增加至16±5.0μg/ml(针对SakSTAR)和12±9.1μgg/ml(针对M9)。而M9溶解血栓潜能降低至24±33％。
表3B中比较了SakSTAR相对于双重突变体M3.8和M8.9的免疫原性。在分配给M3.8组的8只兔中，血浆中的基线中和活性是0.6±0.3μg/ml(针对SakSTAR)和3.5±2.0μg/ml(针对M3.8)。静脉内输注1000μg/千克M3.8产生53±13％溶解。然后这些兔用400μg悬浮在完全弗氏佐剂(在第2周)或不完全弗氏佐剂(在第3和5周)的M3.8免疫。在第6周，血浆中和活性增加至1.7±0.7μg/ml(针对SakSTAR)和6.1±3.0μg/ml(针对M3.8)。在这4只兔中输注400μg/kg SakSTAR产生77±18％凝块溶解，而在4只其它兔中输注1000μg/kg M3.8产生59±25％凝块溶解。在分配给SakSTAR组的8只兔中，血浆中的基线中和活性是0.6±0.4μg/ml(针对SakSTAR)和2.0±2.0μg/ml(针对M3.8)。静脉内输注400μg/千克SakSTAR产生80±10％溶解。然后这些兔用400μg悬浮在完全弗氏佐剂(在第2周)或不完全弗氏佐剂(在第3和5周)的SakSTAR皮下免疫。在第6周，血浆中和活性增加至20±15μg/ml(针对SakSTAR)和21±22μg/ml(针对M3.8)。而400μg/千克SakSTAR的残余溶解血栓潜能降低至8.5±5.7％，1,000μg/千克M3.8残余溶解血栓潜能降低至30±29％。
在分配给M8.9组的8只兔中，血浆中的基线中和活性是0.3±0.2μg/ml(针对SakSTAR)和1.6±0.5μg/ml(针对M8.9)。静脉内输注800μg/千克M8.9产生39±13％基线凝块溶解。然后这些兔用400μg悬浮在完全弗氏佐剂(在第2周)或不完全弗氏佐剂(在第3和5周)的M8.9免疫。在第6周，血浆中和活性仅增加至2.5±1.5μg/ml(针对SakSTAR)和4.9±1.3μg/ml(针对M8.9)。在第6周，在这4只兔中输注400μg/kg SakSTAR产生51±35％凝块溶解，而在4只其它兔中输注800μg/kg M8.9产生39±12％凝块溶解。在分配给SakSTAR的4只对照兔中，预处理中和活性是0.2±0.1μg/ml(针对SakSTAR)和0.7±0.3μg/ml(针对M8.9)。静脉内输注400μg/千克SakSTAR产生67±19％凝块溶解。然后这些兔用400μg悬浮在完全弗氏佐剂(在第2周)或不完全弗氏佐剂(在第3和5周)的SakSTAR免疫。在第6周，血浆中和活性增加至20±15μg/ml(针对SakSTAR)和18±15μg/ml(针对M8.9)。而M8.9残余溶解血栓潜能仅降低至31±30％。
这些结果说明，在SakSTAR和选择的突变体的这一直接比较研究中，尤其是双重突变体(M3.8和M8.9)引起较SakSTAR明显低的抗体相关中和活性和对溶解的抗性。
实施例5
在狒狒中SakSTAR和M3.8的比较的免疫原性
在狒狒中研究了有关中和抗体诱导和重复施用对血栓溶解不应性的SakSTAR和M3.8的比较的免疫原性。
按美国生理学会和血栓形成和血郁滞国际委员会的指导原则(45)进行动物实验。在麻醉和插管的狒狒中，经一个外部聚乙烯环将插入导管的胫骨到臂动脉与外周血管连接产生体外动静脉回路。插入针对和保持持续监测通过体外环的血流的蠕动泵，在所述环中两个适应性皮下组织注射器各包含一新鲜的0.3ml125I纤维蛋白-标记的狒狒血浆凝块。在SakSTAR或变体M3.8的输注期间的凝块溶解的时间进程经注射器上的外部γ计数器连续监测。另外，通过将实验结束时整个血液放射性的总量(乘以因子3校正血管外分布)加回收的血栓中的放射性与血栓中原始存在的比较测定同位素回收余量。
在各血栓溶解实验之前，经ridogrel的静脉内大丸剂给狒狒用药3毫克/千克，以预防在体外系统中的血小板沉积。在整个血栓溶解实验中，静脉内施用肝素300IU千克/大丸剂，接着输注200IU/kg.h。
雄性狒狒(Papio hamadryas)在基线上(0周)随机分配来用50μg/千克SakSTAR(1组)或变体M3.8(2组)处理，10％大丸剂静脉内输注1小时，基线溶解血栓的潜能通过监测放射性从凝块消失2小时评价。然后，用悬浮在完全弗氏佐剂中(在第二周)和不完全弗氏佐剂中(第三和第五周)的SakSTAR(1组)或变体M3.8(2组)免疫狒狒。在第六周，溶解血栓的功效经4小时期间体外血栓溶解模型定量：随机选择1组的6只狒狒中3只(在基线时处理，接着用SakSTAR免疫)和2组的6只狒狒中的3只(在基线时处理，接着用M3.8免疫)首先给予50μg/千克SakSTAR，在1小时中静脉内输注10％大丸剂，在开始SakSTAR-输注2小时之后，以同样的用药方式施用M3.8(分别为组1A和2A)。其它的6只狒狒接受相同的治疗，但是以相反的秩序：首先使用M3.8，然后使用SakSTAR(以前以SakSTAR和M3.8免疫的狒狒分别为组1B和2B)。在18周，溶解血栓的功效通过监测3小时期间放射性从纤维蛋白凝块的消失评价三次：以SakSTAR免疫的6只狒狒中的3只给予250μg/千克SakSTAR，在2.5分钟中静脉内输注大丸剂(组1A)，而以SakSTAR免疫的另外3只狒狒给予相同量的M3.8(组1B)。以M3.8免疫的6只狒狒中的3只给予250μg/千克SakSTAR(组2A)，另外3只狒狒给予相同量的M3.8(组2B)。
在基线和测定激活的部分的组织促凝血酶原激酶时间(aPTT)、纤维蛋白原、α2-抗血纤维蛋白溶酶(在各实验的开始和结束时)和SakSTAR以及M3.8中和活性(在溶解血栓的输注之前)的几个时间点用含枸橼酸盐的试管收集血液样品(最终浓度0.01M)。因此，将增加量的SakSTAR或M3.8(包含0.2到1000μl/ml的50μl体积)添加到300μl含枸橼酸盐的人类血浆和50μl缓冲液或者试验的狒狒血浆混合物中，其后立即添加100μl凝血酶(50NIH U/毫升)和CaCl2(25mM)的混合物。测定血浆凝块溶解时间，并对SakSTAR或M3.8的浓度作图。从这条曲线确定在20分钟后产生完全的凝块溶解的血纤维蛋白溶酶原激活剂的浓度。中和活性定义为试验血浆和缓冲液值之间的差，并且以μg/毫升血浆表示。
系统的纤维蛋白原不降解，α2-抗血纤维蛋白溶酶也不损耗，反映出两种药剂总的纤维蛋白-特异性。
从6周起，1组的SakSTAR-中和活性明显高于2组的M3.8-中和活性。1组产生中和活性更迅速，抗SakSTAR比抗M3.8明显地更强，而在2组中M3.8中和活性不超过SakSTAR中和活性(表4)。从8周起，1组比2组更明显地产生抗SakSTAR和抗M3.8的中和活性(表4)。
在基线时，在1小时中静脉内输注50μg/千克SakSTAR，在6只狒狒中在2小时中诱导77±2.9凝块溶解(1组)，50μg/千克M3.8在其它6只狒狒中在2小时中诱导88±3.6凝块溶解(2组)(平均值±SEM，P＝0.2)。在6周，在2小时中50μg/千克SakSTAR的溶解功效(静脉内输注1小时)下降至9.2±1.0％(在3只用SakSTAR免疫的狒狒中(1A组)和下降至8.5±3.2％(在3只用M3.8免疫的狒狒中(2A组))，在2小时中50μg/千克静脉内M3.8的溶解功效下降至10±6.9％(在3只用SakSTAR免疫的狒狒中(1B组))和下降至11±7.4％(在3只用M3.8免疫的狒狒中(2B组；p＜0.001，相对于所有组的相应基线溶解；p＝NS，在各组之间))。在开始首次溶解血栓的输注之后2小时，静脉内输注50μg/千克其它药剂1小时，产生可比较的剩余溶解功效：组1A和2A中的M3.8在两小时中分别为7.7±1.5％和11±5.7％凝块溶解，组1B和2B中的SakSTAR在两小时中分别为13±2.7％和12±2.1％凝块溶解。
在18周，静脉内大丸剂注射250μg/千克SakSTAR，在3小时中在以SakSTAR免疫的3只狒狒(1A组)中生产39±5.3％凝块溶解，而250μg/kgM3.8在以M3.8免疫的3只狒狒(2B组)中的剩余溶解血栓的潜能明显提高：在3小时中68±4.5％凝块溶解(p＜0.005)。250μg/千克SakSTAR在3小时中在以M3.8免疫的3只狒狒(2A组)中产生58±9.5％凝块溶解(p＝0.1，对1A组)，而250μg/千克M3.8在3小时中在以SakSTAR免疫的3只狒狒(1B组)中产生39±3.6％凝块溶解(p＝0.0005，对2B组)。与在18周使用的药剂无关，收集物分析显示39±3.0％(对用SakSTAR免疫的1组)对63±5.2％(对用M3.8免疫的2组)的在3小时中的残余溶解(p＜0.0005)。
在整个研究期间中的溶解血栓的效能与相应的中和活性反相关(Spearman r＝-0.83；p＜0.0001)。
这样，突变体M3.8是有可比较活性的和纤维蛋白-特异性的，但是在狒狒中较野生型SakSTAR有明显较低的抗原性，如在血浆中较少诱导中和活性和免疫后较快恢复溶解血栓潜能所证明的。这些结果，在远系繁殖灵长类中获得的结果证实和扩展了在兔中观察的结果。
实施例6
在患有外周动脉闭塞患者中M3.8和M8.9相对于SakSTAR的比较的溶解血栓的效能和免疫原性
在患有血管造影术所证明的外周动脉或旁路移植物动脉闭塞的患者中，在闭塞的血栓邻近端以2毫克大丸剂动脉内施用SakSTAR(n＝8)，RM3.8(n＝4)和M8.9(n＝4)，接着输注1毫克/小时。在征得同意并且方案由Leuven大学人类研究委员会批准之后研究这些患者。除了允许在48小时内用重组葡萄球菌激酶部分再处理外，所包含的和排除的标准实质上如以前描述的(46)。如以前的描述(46)用肝素、阿司匹林和口服抗凝剂联合抗血栓形成治疗。
在动脉内输注野生型或变体SakSTAR之前、输注期间至少每4小时和输注结束时系列评价所堵塞的外周动脉或旁路移植的开放状态。输注结束时的靶脉管的血管造影术开放状态构成主要研究点(endpoint)。当获得足够的脉管开放时、当并发症需要其停止时或当两个连续的血管造影照片不能显示凝块溶解时，终止施用溶解血栓的药剂。再穿通被定义为足够恢复活跃顺行性流过以前堵塞的区段的凝块溶解。当研究者判断血栓充分地溶解时或预期不会有进一步的血栓溶解时，允许使用补充性血管内方法，例如经皮的透照血管成形术(PTA)。
在SakSTAR，M3.8或M8.9输注之前、输注期间和输注之后监测血压和心搏率。在血管造影术方法之前、完成时和其后6小时收集血液样品。测量包括外周血细胞计数，凝血酶原时间(PT)，aPTT，纤维蛋白原，α2-抗血纤维蛋白溶酶，血纤维蛋白溶酶原和生物化学肝和肾机能试验。在住院和出院期间抽取的血液样品上系列测定SakSTAR-中和，M3.8-中和及M8.9中和活性和抗SakSTAR，抗M3.8和抗M8.9IgG和IgM。临床跟踪集中于血栓形成的复发和副作用，例如变应性过敏反应和大出血(即需要输血或外科控制，大于10％的血细胞比容下降，或颅内出血)
具有血管造影术证明PA0(具有1至120天估计的期限和8至50cm的长度)的4至8个患者(41至73岁)组用M3.8，M8.9或SakSTAR治疗。给予野生型SakSTAR的一个患者(wAL)在2毫克大丸剂施用之后5分钟之内出现过敏样反应。立即终止输注，在血浆膨胀剂(expanders)输注期间的20分钟之内血压恢复正常。在计算表5至7中平均值±SEM时不包括这一患者。给予M8.9的一个患者(LAN)在30小时后出现再闭塞，其用6.5毫克变体治疗。在2-3周之后，这一患者表现出7.8μg/毫升M8.9中和活性和270μg/毫升特异性抗M8.9IgG。
单独的患者的有关基线特征在表5中显示。大多数PAO在股腘水平上。所有的是由于原位血栓形成。包括2个移植物和2个髂的移植片固定模闭塞。9个患者出现无能力的跛行，2个具有慢性局部缺血的静息疼痛，4个具有亚急性的局部缺血，1个具有急性局部缺血。
表6总结了单个的治疗结果。在3.5至11小时期间的5.5至13毫克的剂量的动脉内输注在13个患者中诱导完全再穿通，1个患者中部分再穿通和1个患者中无改善。在12个患者中进行补充性血管内方法(主要是PTA)，在1个患者中在血栓溶解后立即进行补充性外科治疗。血栓形成在血管造影术完成后的复发出现在4个患者中：第一个患者在30小时后以6.5毫克M8.9成功地消退，第二个患者进行主动脉双髂旁路移植，第三个患者在用40毫克rt-PA处理后20小时成功地再穿通，在第四个患者中透照抽吸血栓。除了一个患者在右四头肌肌肉之内出现血肿外，未出现出血并发症或限制在血管造影术穿刺位点上的中等血肿形成。其它与血管内操作有关的并发症包括远侧栓塞(embolization)和动脉切开，其在一患者中需要溶解血栓的输注早一些时间停止。表面股动脉闭塞被证明阻碍在6.0小时中输注的8.0毫克SakSTAR，随后其被PTA成功地处理(表6)。
循环的纤维蛋白原，血纤维蛋白溶酶原和α2-抗血纤维蛋白溶酶水平在SakSTAR部分的输注期间仍然不变(表7)，反映出这些药剂在所采用的剂量时的绝对纤维蛋白特异性。如估价D-二聚体水平所证明的，出现实质上的体内纤维蛋白消化。动脉内肝素疗法延长aPTT(表7)。
抗体相关SakSTAR-、M3.8-和M8.9-中和活性和抗SakSTAR-、M3.8-和M8.9-特异性IgG在基线时和在输注后的第一周时低(表8)。从第二周起，在用M3.8和M8.9处理的患者中中和活性水平分别增加至每毫升血浆所中和的2.9μg和3.3μg SakSTAR变体的中位值，其明显低于在用SakSTAR处理的患者中每毫升所中和的9.1μg野生型SakSTAR的中位值(p＝0.03，突变体对野生型，经Mann-Whitney等级总数试验)。SakSTAR-特异性IgG增加至分别用M3.8和M8.9处理的患者中的每毫升血浆51和31μgg的中位值，其明显低于用SakSTAR处理的患者中的240μg/ml的中位值(p＝0.01，突变体对野生型，经Mann-Whitney等级总数试验)。
这样，在患有外周动脉闭塞的患者中给予5.5至13毫克的化合物M3.8和M8.9比SakSTAR诱导明显少的中和抗体和特异性抗葡萄球菌激酶IgG。这些变体提供经蛋白质工程降低针对重组葡萄球菌激酶体液反应时切实可行的这一观点的证据。
附图说明
图1野生型葡萄球菌激酶，SakSTAR的蛋白质序列。编号从成熟全长葡萄球菌激酶的NH2-末端氨基酸开始。标明了所研究的″丙氨酸荷电簇″变体。
图2一组抗SakSTAR产生的17种鼠单克隆抗体的表位特异性的示意性图解。
表1.鼠单克隆抗体结合葡萄球菌激酶野生型和“丙氨酸荷电簇”突变体的平衡缔合常数(KA×109M-1)
| ID | 变体 | 比活性(×103/mg) | 表位簇I | 表位簇II | 表位族III |
| 17G11 26A2 30A2 2B12 3G10 | 29C1 18F12 14H5 28H4 20D6 32B2 7F10 | 7H11 25E1 40C8 24C4 1A10 | |||
| M20M21M2M3M5M6M8M9M10M11M12M15M16M17M18M19M3.8M8.9 | SakSTARD5，K6K8，K10D33，K35K35，E38K57，E58，K59E61，E65K74，E75，R77E80，D82K86，E88D93，K94K96，K97，K98E108，K109D115，E118，IH119H119，K121K130E134，K135，K136K35，F38/K74，R77K74，E75，R77/E80，D82 | 1301502412597948011013073974717032130110744551 | 6.4 17 7.4 19 351.3 21 12 9.2 9.71.8 16 5.1 29 152.1 19 14 14 1918 11 5.7 ＞14 9.54.0 8.7 6.0 7.3 279.5 ＞10 8.8 21 29＞23 0.2 0.22 0.41 0.2415 13 10 21 287.2 1.4 3.7 6 4.68.2 19 13 30 242.8 41 23 37 901.6 5.1 7.2 19 5.12.5 32 3.4 21 8.78.0 24 11 26 2913 12 - 15 1422 21 6.7 25 250.71 0.05 0.09 0.09 0.071.9 0.034 0.03 0.08 0.04 | ＞9.2 ＞18 ＞25 ＞18 2.9 ＞14 1.111 12 23 17 0.4 10 0.48.1 22 16 26 1.5 18 1.08.7 15 24 32 0.60 10 5.38.1 6 10 8.5 0.018 ＞9.2 ＞7.67.1 16 14 6.7 1.2 5.6 0.52＞4.5 ＞11 ＞16 6.6 2.6 ＞7.2 4.6＞12 ＞20 ＞25 ＞21 4.7 ＞16 1.718 4.7 ＞25 ＞20 3.5 ＞20 1.95.9 5.7 4.9 7.7 8.2 15 4.422 18 11 ＞10 22 9 0.888.6 ＞16 9.1 19 1.2 16 0.4120 28 1.5 21 3.1 21 1.29.3 13 9.9 23 1.6 9.3 1.218 25 14 29 3.1 12 0.5210 6.5 - 4.8 - 0.5 0.19＞6.5 ＞18 ＞25 ＞15 4 ＞12 1.78.5 5.8 6.2 6.7 0.02 6.8 0.043.7 1.9 2.0 2.6 0.17 3.0 0.3 | 0.6 11 1.6 6.3 2.01.3 3.9 0.8 4.5 3.80.93 11 1.1 18 0.75- 5.1 3.8 5.1 3.00.02 0.05 0.15 6.1 2.60.36 1.7 0.42 1.0 1.10.51 4.6 2 5.9 1.50.33 15 1.2 ＞6.6 3.10.03 0.07 0.05 ＜0.01 1.20.09 5.4 0.8 1.9 0.131.4 11 2.4 7 2.10.58 17 1.2 13 0.300.43 6.9 1.4 10 1.91.0 24 2.1 9 1.81.2 11 2.9 20 1.2- 0.19 0.44 3.6 0.410.2 11 0.94 6 -0.06 0.04 0.05 1.9 0.080.003 0.09 0.15 0.01 0.01 |
表2：葡萄球菌激酶野生型和“丙氨酸荷电簇”变体对由在患有急性心肌梗塞的患者中
用野生型葡萄球菌激酶(Sak STAR)治疗所激发的抗体的吸收
| ID | 滴度(μg/ml) | 吸收的抗体的百分数 |
| SakSTAR M3 M8 M9 M3+M8 M9+M8 M3.8 M8.9 | ||
| COELBANCFLUSVERSDEBEVERMVERBGODTFLUYVBROVBORDEDOPELGASSEVOLCSWIN | 26111275114518471.53347358575960 | + + 63 + + + 68 62+ 68 59 64 + + 50 56+ + 49 + + + 38 42+ + + + + + + ++ + 47 84 + + 53 67+ 89 64 88 + + 65 54+ + + + + + + 85+ 75 23 56 20 22+ 85 75 85 64 62+ + + + 87 ++ + 64 + 64 61+ + 78 + 75 73+ + 75 + 68 67+ + 83 + 80 78+ + + + + ++ + 69 + 69 60 |
| 表位丧失平均值±SD中位值 | 37±2634 | 0 III I III 0 0 I+III I+III95±1 90±8 71±20 83±12 68±21 67±2095 96 72 93 68 65 |
≥90％的吸收表示为+。
表位簇如表1所限定的。
表3A SakSTAR，M3，M8和M9在兔中的免疫原性
A.SakSTAR对M3
免疫剂 中和活性(μg/ml) 凝块溶解(百分比)
SakSTAR M3 SakSTAR(400μg/kg) M3(200μg/kg)
基线 6周 P 基线 6周 P 基线 6周 P 基线 6周 P
SakSTAR 0.2±0.2(4) 35±23(4) 0.06 0.0±0.0(4) 19±13(4) 0.06 89±8.6(4) - - - 9.3±8.2(4) -
M3 0.0±0.0(8) 11±6.7(8) 0.003 0.0±0.0(8) 11±7.2(8) 0.004 - 18±27(4) - 76±23(8) 16±17(4) ＜0.0005
P 0.02 0.02 1 0.2 - - - 0.05
B.SakSTAR对M8
免疫剂 中和活性(μg/ml) 凝块溶解(百分比)
SakSTAR M8 SakSTAR M8(1,000μg/kg)
基线 6周 P 基线 6周 P 基线 6周 P 基线 6周 P
SakSTAR 0.9±0.6(8) 59±47(8) 0.01 0.6±0.3(4) 22±16(4) 0.01 68±18(8) 7.5±2.4(4) 0.001 - 4.1±1.8(4) -
M8 1.4±0.2(8) 3.8±1.8(8) 0.01 0.6±0.5(8) 5.9±2.7(8) 0.005 - 49±28(4) - 41±13(8) 24±11(4) 0.03
P 0.04 0.005 - 1.0 0.01 - 0.001 - ＜0.0005 -
C.SakSTAR对M9
免疫剂 中和活性(μg/ml) 凝块溶解(百分比)
SakSTAR M9 SakSTAR M9(400μg/kg)
基线 6周 P 基线 6周 P 基线 6周 P 基线 6周 P
SakSTAR 0.1±0.05(4) 16±5.0(4) 0.008 0.05±0.06(4) 12±9.1(4) 0.08 78±13(4) - - 24±33(4) -
M9 0.2±0.05(8) 8.0±4.6(8) 0.004 0.03±0.05(8) 3.5±2.6(8) 0.07 - 53±11(4) - 72±11(8) 40±7.8(4) ＜0.005
P 0.09 0.03 - 0.6 0.04 - - - 0.2
结果代表括号中给出的实验次数的平均值±SD。
显著性水平适当地由配对或非配对值的Student′s t-试验或由Mann-whitney等级总数试验确定。
表3B SakSTAR，M3.8和M8.9在兔中的免疫原性
A.SakSTAR对M3.8
免疫剂 中和活性(μg/ml) 凝块溶解(百分比)
SakSTAR M3.8 SakSTAR M3.8(1,000μg/kg)
基线 6周 P 基线 6周 P 基线 6周 P 基线 6周 P
SakSTAR 0.6±0.4(8) 20±15(8) 0.008 2.0±2.0(4) 21±22(4) 0.17 80±10(8) 8.5±5.7(4) ＜0.0005 - 30±29(4) -
M3.8 0.6±0.3(8) 1.7±0.7(8) 0.001 3.5±2.0(8) 6.1±3.0(8) 0.001 - 77±18(4) - 53±13(8) 59±25(4) 0.7
P 1.0 0.004 - 0.1 0.3 - - ＜0.0005 - - 0.05 -
B.SakSTAR对M8.9
免疫剂 中和活性(μg/ml) 凝块溶解(百分比)
SakSTAR M8.9 SakSTAR M8.9(8 00μg/kg)
基线 6周 P 基线 6周 P 基线 6周 P 基线 6周 P
SakSTAR 0.2±0.1(4) 20±15(4) 0.05 0.7±0.3(4) 18±15(4) 0.07 67±19(4) - - 31±30(4) -
M8.9 0.3±0.2(8) 2.5±1.5(8) 0.03 1.6±0.5(8) 4.9±1.3(8) 0.002 - 51±35(4) - 39±13(6) 39±12(4) 0.9
P 0.4 0.03 - 0.02 0.09 - - - 0.6 -
结果代表插号中给出的实验次数的平均值±SD.
差异的统计学显著性适当地由配对或非配对值的Student′s t-试验或由Mann-Whitney等级总数试验确定。
表4：SakSTAR-和M3.8-中和活性(以μg/ml表示)随时间的进程。
0 2 3 5 6 8 10 12 14 16 18 20
用药方式 i.v. s.c. s.c. s.c. i.v. i.v.
1组：用SakSTAR免疫(n＝6)
SakSTAR- 0.3±0.02 1.3±0.7 2.6±1.6 15±7.6 53±11 100±23 54±10 38±5.6 26±2.8 18±2.5 14±19 66±7.6
中和活性
M3.8-中和 0.0±0.0 0.3±0.3 0.0±0.0 0.8±0.2 30±5.0 50±11 33±5.1 22±4.7 15±2.4 14±2.2 9.2±2.2 51±7.4
活性
p - 0.1 - 0.06 0.04 0.009 0.01 0.007 0.004 0.2 ＜0.0005 0.02
2组：用M3.8免疫(n＝6)
SakSTAR- 0.3±0.0 7.5±3.8 7.4±3.9 14±4.3 20±17 25±4.5 20±2.7 11±2.2 9.8±2.3 6.6±1.5 4.9±1.2 40±4.7
中和活性
M3.8-中和 0.0±0.0 6.7±3.3 4.5±2.4 8.8±3.2 19±6.0 22±7.1 9.0±1.2 7.3±0.5 6.2±2.2 4.8±0.7 2.8±1.7 34±5.9
活性
p - 0.3 0.1 0.06 0.6 0.3 0.003 0.2 0.008 0.6 0.05 0.03
数据代表6只狒狒的平均值±SEM。配对Student′t-试验用于计算p-值。详细的免疫方案参见表I.
i.v.，静脉内；s.c.，皮下。
表5：用M3.8、M8.9或SakSTAR处理的患有外周动脉闭塞的患者的特征
化合物 性别 年龄 临床表现 相关病史 吸烟否 闭塞部位 估计的闭塞 估计的Icn闭
患者Id. (岁) 期(天) 塞(天)
A.M3.8
STO M 63 跛行 - + 右中SFA 40 10
VLA F 70 跛行 高血压；颈动脉病 + 左中SFA 25 10
HOO M 56 跛行 肾移植 - 右SFA 7 20
MER M 52 局部缺血性安静疼痛 主动脉双股移植； + 右SFA 9 45
足前段切断手术
平均值±SEM 60±4 20±8 21±8
B.M8.9
HEC M 41 跛行 两侧髂动脉移植片固定模 + 右CIA(移植 16 15
片固定模)
OTT M 51 亚急性局部缺血 左国 国移植 + 左PA移植物 3 15
LAN M 55 跛行 心肌梗塞；普通髂动脉斯滕特 + 右CIA(移植 14 15
固定 片固定模)
BRO M 73 亚急性局部缺血 高脂血症；高血压；CAD； - 右中SFA 1 15
中度肾衰竭
平均值±SEM 55±7 8.5±3.8 15±0
C.SakSTAR
KNA M 41 急性局部缺血 右股 国移植(创伤后) - 右股腘移植 1 50
DRI M 69 局部缺血性安静疼痛 腹部主动脉瘤 + 右中SFA 60 12
GOD M 67 跛行 可疑的CAD + 右PA ≥120 8
WAL* M (67) 跛行 高血压；CAD + 右中SFA (21) (10)
SMO M 62 亚急性局部缺血 左股国移植 - 右PA 3 10
右PA动脉瘤
VEL F 74 跛行 高脂血症 - 左SFA 90 8
POT M 61 亚急性局部缺血 前列腺癌 - 左SFA 7 18
STA F 69 跛行 高血压，高脂血症 右SFA 40 7
平均值±SEM 63±4 46±18 16±5.8
SFA：表皮下股动脉；CIA：普通髂动脉；PA：腘动脉；CAD：冠状动脉病。
*计算平均值±SEM时未包括。
表6：在用M3.8、M8.9或SakSTAR治疗的患有外周动脉闭塞的患者中的处理和结果
化合物 患者1d. 经血栓溶 溶解血栓剂的 溶解血栓输注的总 附加治疗 血管造影法的并发症
解再穿通 总剂量(mg) 持续时间(小时)
A.M3.8
STO 完全 9.0 7.0 PTA 颤抖(不发烧)
VLA 完全 10 8.0 PTA 在PTA之后远侧栓塞；在持续SakSTAR.M38灌输期
间消散；呕吐
HOO 部分 6.5 4.5 PTA 动脉切开；瞬时轻度发热
MER 完全 9.5 7.5 股胫移植 无
平均值±SEM 8.8±0.3 6.8±0.8
B.M8.9
HEC 完全 10 8.0 PTA+斯滕特固定 在用主动脉-双髂移植治疗8天后再闭塞
OTT 完全 10 8.0 无 无
LAN 完全 11 8.5 PTA+斯滕特固定 在用吸引术治疗的PTA后远侧栓塞；在以6.5毫克
SakSTAR、M8.9(超过4.5小时)和PTA再治疗30
小时后再闭塞
BRO 完全 10 8.0 血小板吸引术+ 给予30毫克rt-PA超过20小时(*)
斯滕特固定
平均值±SEM 10±0.3 8.0±0.2
C.SakSTAR
KNA 完全 12 10 移植的PTA； 右大腿血肿
栓吸引术(腓骨
动脉)
DRI 完全 7.5 5.5 PTA；动脉 由于从腹腔主动脉动脉瘤到远侧左下腿动脉(胆甾
动脉瘤切除术 醇)栓塞(4天)，对110毫克rt-PA不反应，
(9天) 对侧脚急性局部缺血
GOD 无 8.0 6.0 PTA 静脉穿刺位点血肿
WAL** (2.0) - 在大丸剂施用后5分钟过敏性休克，接着在5分钟
后和在血压正常之后，出现左中间脑部动脉区瞬时
局部缺血
SMO 完全 7.5 6.0 斯滕特固定 在6周后移植片固定模再闭塞
VEL 完全 5.5 3.5 PTA 无
POT 完全 13 11 - 急性再闭塞(第1天)成功透照血栓吸引术
STA 完全 8.0 6.0 PTA 在静脉穿刺位点血肿
平均值±SEM 8.8±1.0 6.9±1.0
PTA：经皮透照血管形成术；*由于SakSTAR，M8.9的有限的可获得性，治疗用rt-PA继续。**在计算平均值±SEM时未包括。
表7：在患有外周动脉闭塞的患者中施用M3.8、M8.9或SakSTAR之前和之后的凝结参数
化合物患者 血纤维蛋白原(g/l) 血纤维蛋白溶酶原(％) α2-纤维蛋白溶酶(％) D-二聚体(ng/ml) aPTT(s)
Id.
前 后 前 后 前 后 前 峰 前 后
A.M3.8
STO 3.9 4.0 89 81 87 89 ＜300 6,500 35 49
VLA 4.0 5.0 100 110 97 110 1,200 2,000 36 ＞180
HOO 8.0 8.0 96 92 100 110 420 3,000 33 81
MER
4.5
5.4
120
120
110
110
880
4,300
40
72
平均值±SEM 5.1±1.0 5.6±0.9 100±7.0 100±9.0 99±5.0 100±5.0 700±210 4,000±970 36±1.0 96±29
p+ 0.2 0.5 0.2 0.06 0.1
B.M8.9
HEC 4.2 4.6 94 91 97 93 880 4,600 30 51
OTT 3.1 3.6 82 82 89 90 290 1,200 32 62
LAN 3.5 4.6 96 98 99 100 ＜100 1,800 29 75
BRO
3.8
4.0
75
73
97
92
310
2,100
62
65
平均值±SEM 3.7±0.2 4.2±0.2 87+5.0 86±5.0 96±2.0 94±2 400±170 2,400±750 38±8.0 63±5.0
p+ 0.2 0.10 0.6 0.04 0.04
C.SakSTAR
KNA 2.0 2.1 91 90 87 80 ＜100 9,700 39 53
DRI 3.4 3.8 88 85 88 100 470 23,000 30 48
GOD 3.6 4.0 92 96 93 93 ＜100 4,600 37 46
WAL* (3.8) (3.7) (100) (84) (100) (93) (＜100) (5,900) (34) (32)
SMO 4.5 4.2 100 94 100 93 ＜100 ＞12,500 33 99
VEL 2.0 2.4 91 76 96 88 650 2,100 29 110
POT 3.2 2.8 91 55 100 81 ＜100 4,700 33 55
STA
2.5
3.1
110
120
110
120
＜100
4,500
27
44
平均值±SEM 3.0±0.3 3.2±0.3 95±2.9 88±7.5 964±3.0 94±5.1 230±87 8,700±2,700 33±1.6 65±10
n+ 0.3 0.3 0.5 0.02 0.02
p由配对Student′s t-试验获得.
计算平均值时不考虑“＜”和“＞”。
*计算平均值±SEM时未包括。
表8：用M3.8、M8.9或SakSTAR治疗的患者血浆中的中和活性和特异性IgG(95.12.14)
中和活性治疗 治疗日 中和活性(μg/ml) 特异性IgG抗体(μg/ml)
基线 1周 2周 3周 4周 基线 1周 2周 3周 4周
A.抗SakSTAR
A.1.M3.8
STO 95.04.24 0.0 - 8.0 5.0 7.0 4.2 - 46 40 35
VLA 95.05.04 0.1 0.1 0.3 0.0 0.0 0.6 3.1 5.6 3.1 1.9
HOO 95.05.18 0.8 0.8 0.0 0.5 1.0 3.2 8.3 9.2 11 7.1
MER 95.05.26 0.0 0.0 2.3 4.0 3.0 2.1 1,8 33 67 21
A.2.M8.9
HEC 95.05.29 0.0 0.0 2.3 4.5 - 1.9 5.6 29 31 -
OTT 95.05.29 0.0 0.3 3.0 4.5 4.0 3.8 36 79 41 48
LAN(*) 95.06.01 0.0 0.0 10 7.5 9.2 11 14 200 99 120
BRO 95.07.03 0.0 - 0.5 0.5 0.3 4.0 - 5.6 4.4 2.0
A.3.SakSTAR
KNA 95.07.17 0.0 0.25 12 16 15 7.5 6.7 130 100 96
DRI 95.07.19 0.0 0.25 80 100 100 3.1 6.4 2,100 2,400 1,700
GOD 95.07.26 0.25 1.3 46 27 25 4.4 15 270 200 230
WAL(**) 95.07.26 0.25 0.2 6.0 4.5 6.5 7.3 18 120 150 190
SMR 95.08.17 0.0 0.0 0.0 0.0 0.5 2.3 2.2 33 33 47
VEL 95.08.31 0.0 0.0 11 12 10 5.0 0.8 210 250 250
POT 95.10.12 0.0 0.0 4.0 4.3 4.3 2.9 33 310 380 480
STA 95.11.13 0.0 0.0 7.1 7.1 11 3.3 11 270 280
B.抗M3.8
B.1.M3.8
STO 0.0 - 4.0 5.0 2.5 1.3 - 150 130 100
VLA 0.0 0.0 0.5 0.0 0.5 0.7 3.1 6.3 7.5 4.8
HOO 0.0 0.5 0.0 2.5 2.0 3.0 3.3 13 25 14
MER 0.0 0.3 3.3 6.0 1.0 1.0 3.0 67 100 63
B.2.M8.9
HEC 0.0 0.0 3.0 6.0 - 1.5 2.8 39 42 -
OTT 0.0 2.5 4.0 5.0 2.0 2.7 52 170 110 210
表8：用M3.8、M8.9或SakSTAR治疗的患者血浆中的中和活性和特异性IgG(95.12.14)
LAN(*) 0.0 0.0 8.0 9.0 10 12 23 220 210 300
BRO 0.0 - 5.0 6.0 1.0 5.2 - 2.3 3.3 3.5
B.3.SakSTAR
KNA 0.0 0.0 12 11 12 8.3 7.5 200 75 110
DRI 0.0 0.0 55 47 40 3.1 5.9 1,700 1,800 1,300
GOD 0.5 0.5 35 27 22 9.3 47 500 400 480
WAL(**) 0.5 0.5 2.0 1.0 5.0 4.3 8.3 80 96 130
SMR 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 3.5 3.1 6.7 2.0 3.0
VEL 0.0 0.0 5.0 6.0 3.0 4.0 1.2 27 63 63
POT 0.0 0.5 2.5 2.0 2.0 4.2 26 96 130 140
STA 0.0 0.0 4.0 3.0 3.0 6.6 16 210 150
C.M8.9
C.1.M3.8
STO 0.5 - 3.5 3.5 2.0 13 1.2 88 58 71
VLA 0.0 0.5 0.5 0.0 1.0 2.3 1.8 4.6 9.2 7.1
HOO 1.0 0.5 0.5 2.0 2.0 7.5 7.7 13 15 12
MER 0.0 0.5 0.8 2.4 3.0 4.2 2.5 55 58 65
C.2.M8.9
HEC 0.0 0.0 2.0 5.0 - 1.6 2.3 27 50 -
OTT 0.0 0.5 0.5 6.0 3.0 5.8 63 92 79 110
LAN(*) 0.0 0.0 6.5 9.0 7.5 11 44 320 220 310
BRU 0.0 - 1.0 1.0 0.0 4.0 - 6.25 5.8 5.8
C.3.SakSTAR
KNA 0.0 2.0 16 12 7 5.8 9.6 38 63 63
DRI 0.0 1.0 100 60 45 3.1 9.8 960 1,500 1,300
GOD 1.0 0.5 34 22 22 8.4 38 790 400 460
WAL(**) 1.0 0.0 4.5 2.0 3.5 1.1 7.8 10 18 25
SMR 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 6.7 6.3 7.1 1.6 2.0
VEL 0.0 0.0 1.8 2.0 5.0 3.0 3.0 15 17 40
POT 0.0 0.0 3.3 2.0 1.8 2.7 5.8 75 100 29
STA 0.0 0.0 5.0 4.0 4.0 7.1 12 200 250
(*)30小时后再治疗.(**)大丸剂后中断治疗.
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Claims (17)
1.葡萄球菌激酶衍生物，该衍生物与野生型葡萄球菌激酶比较表现出降低的免疫原性，并且实质上具有图1所描述的氨基酸序列，其中一个或多个下划线簇中的一个或多个氨基酸已由丙氨酸取代，由此除去了相应的表位。
2.葡萄球菌激酶衍生物，该衍生物与野生型葡萄球菌激酶比较表现出降低的免疫原性，并且实质上具有图1所描述的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸已由丙氨酸取代，由此降低了所述衍生物与针对表位簇I的单克隆抗体系列的反应性。
3.如权利要求2所要求的葡萄球菌激酶衍生物，其中所述单克隆抗体系列包括抗体17G11、30A2和3G10。
4.葡萄球菌激酶衍生物，该衍生物与野生型葡萄球菌激酶比较表现出降低的免疫原性，并且实质上具有图1所描述的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸已由丙氨酸取代，由此降低了所述衍生物与针对表位簇III的单克隆抗体系列的反应性。
5.如权利要求4所要求的葡萄球菌激酶衍生物，其中所述单克隆抗体系列包括抗体7H11、24C4和1A10。
6.葡萄球菌激酶衍生物，该衍生物与野生型葡萄球菌激酶比较表现出降低的免疫原性，并且实质上具有图1所描述的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸已由丙氨酸取代，由此降低了所述衍生物与针对表位簇I和III的单克隆抗体系列的反应性。
7.葡萄球菌激酶衍生物M8，该衍生物实质上具有图1所描述的氨基酸序列，其中在下划线簇8中的氨基酸74位上的赖氨酸、75位上的谷氨酸和77位上的精氨酸已由丙氨酸取代，由此改变了相应的表位。
8.葡萄球菌激酶衍生物M3，该衍生物实质上具有图1所描述的氨基酸序列，其中在下划线簇3中的氨基酸35位上的赖氨酸和38位上的谷氨酸已由丙氨酸取代，由此改变了相应的表位。
9.葡萄球菌激酶衍生物M9，该衍生物实质上具有图1所描述的氨基酸序列，其中在下划线簇9中的氨基酸80位上的谷氨酸和82位上的天冬氨酸已由丙氨酸取代，由此改变了相应的表位。
10.葡萄球菌激酶衍生物M3.8，该衍生物实质上具有图1所描述的氨基酸序列，其中在下划线簇3和8中的氨基酸35位上的赖氨酸、38位上的谷氨酸、74位上的赖氨酸、75位上的谷氨酸和77位上的精氨酸已由丙氨酸取代，由此改变了相应的表位。
11.葡萄球菌激酶衍生物M8.9，该衍生物实质上具有图1所描述的氨基酸序列，其中在下划线簇8和9中的氨基酸74位上的赖氨酸、75位上的谷氨酸、77位上的精氨酸、80位上的谷氨酸和82位上的天冬氨酸已由丙氨酸取代，由此改变了相应的表位。
12.一种产生如权利要求1所要求的葡萄球菌激酶衍生物的方法，该方法包括以下步骤：
a.制备包含至少一部分图1所示葡萄球菌激酶编码序列的DNA片段，其提供葡萄球菌激酶生物活性；
b.在所述DNA片段上进行体外定点诱变以便由丙氨酸的密码子替代一个或多个野生型氨基酸的密码子；
c.在合适的载体中克隆突变的DNA片段；
d.用所述载体转化或者转染合适的宿主细胞；和
e.在适于表达所述DNA片段的条件下培养所述的宿主细胞。
13.如权利要求12所要求的方法，其中所说的DNA片段是质粒pMEX602SAK的453 bp EcoRI-HindIII片段，使用质粒pMa/c和修复缺陷大肠杆菌菌株WK6MutS经寡核苷酸定向诱变系统完成所述的体外定点诱变，所述突变的DNA片段在大肠杆菌菌株WK6中表达。
14.一种药物组合物，该组合物包含至少一种如权利要求1所要求的葡萄球菌激酶衍生物以及合适的赋形剂。
15.如权利要求14所要求的药物组合物，其用于治疗动脉血栓形成。
16.如权利要求1-11之任一要求的葡萄球菌激酶衍生物，其用于治疗动脉血栓形成。
17.如权利要求1-11之任一要求的葡萄球菌激酶衍生物在制备用于治疗动脉血栓形成之药物组合物上的用途。
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