CN1649626A - 可与触珠蛋白受体配体结合相互作用的分子的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供可与触珠蛋白受体配体结合相互作用的分子在制备预防和治疗葡萄球菌感染的药物中的用途。

Description

可与触珠蛋白受体配体结合相互作用的分子的用途

发明领域

本发明涉及预防和治疗葡萄球菌感染的药物的制备。

发明背景

葡萄球菌感染是全世界医院中一个日益严重的威胁。金黄色葡萄球菌(S.aureus)是最常见的医院感染来源之一。它引起多种不同的感染，如无症状的鼻腔携带、中度到重度皮肤和创伤感染、腹膜炎、骨髓炎、肺炎、尿道感染。当该细菌存在于血液中并且在全身移动时，最严重的情况是菌血症和脓毒症。葡萄球菌的外观和致病能力与抗生素的广泛使用有关，抗生素已经诱发并且在继续诱发多药耐药性。由于这个原因，针对葡萄球菌感染的医学治疗不能只依赖抗生素。这些疾病的治疗需要策略上的改变，旨在预防感染或者干扰促进疾病的细菌机制(综述见Cossley编著，1997)。

因此，本发明的一个目的在于为了对抗葡萄球菌感染提供替代治疗方法。

本发明提供可与触珠蛋白受体配体结合相互作用的分子在制备预防和治疗葡萄球菌感染的药物中的用途，从而解决了这一问题。

发明内容

触珠蛋白受体，以前被称为LPXT-Gp5，没有与之有关的任何功能(特别是受体功能)，使用来自不同金黄色葡萄球菌感染患者的人血清，通过细菌表面展示和蛋白质组学，被鉴定为一种重要的抗原(WO02/059148 A，Etz等人，2002，Vytvytska，2002)。它属于金黄色葡萄球菌中的一类细胞表面蛋白质，与宿主组织、宿主细胞和分子的直接相互作用有关(Patti等人，1994；Schneewind等人，1995)。本发明提供了与该蛋白质的生物学功能有关的新用途，该蛋白质作为触珠蛋白受体，介导金黄色葡萄球菌的铁摄取，影响吞噬细胞的杀伤。

金黄色葡萄球菌和其它病原体的最限制生长的因素之一是铁限制。本发明第一次使预防和治疗金黄色葡萄球菌感染的药物制备针对金黄色葡萄球菌的铁摄取途径。铁作为大量酶的辅因子是细菌的一种必需的、限制生长的养分。铁过载产生毒性，主要是因为不受控制的氧化还原循环、酶抑制、可与所有类型的生物分子强烈反应的羟自由基的形成，DNA损伤产生最有害的后果。因此，铁饥饿与铁中毒之间的精细平衡至关重要。众所周知，铁在几种感染的易感性和后果中起作用。低于和高于临界水平的铁浓度可减弱身体的抗微生物防御。在医学领域众所周知，补铁(特别是静脉内)能够加重不明显的慢性疾病，众所周知的例子是结核。这一现象在几种动物模型中再现(Lounis等人，2001)。

在体内，(在宿主中生长的)病原体细菌面临铁限制，因为在真核生物中不含或者只含少量(10^-12-15M)的游离铁，因为事实上在需氧条件和生理pH下，Fe离子是不可溶的且有毒的。铁被小无机物(如柠檬酸盐)复合或与蛋白质结合。细胞外致病菌必须从Fe结合的血浆(胞外)蛋白质(如转铁蛋白、乳铁蛋白、游离(血浆)血红蛋白和血红素结合蛋白)中提取铁。细胞内铁构成血红素和非血红素铁结合蛋白，最丰富的是血红蛋白(红细胞中)、肌红蛋白(肌肉中)和细胞色素C(所有细胞中)。过量的铁在细胞内被一种特化的贮存蛋白——铁蛋白螯合。

由于细菌高度依赖于外部铁来源，专门的离子获取系统是宿主中致病菌存活和生长的必要条件。大量细菌蛋白质与微生物铁摄取和转运有关，在不同细菌种使用的摄取系统中发现相当多的变化。细菌使用两种主要的机制从宿主的铁结合蛋白中提取铁。在革兰氏阴性和革兰氏阳性菌中鉴定了几种表面受体，它们直接结合宿主的铁结合蛋白，使它们紧密靠近细菌表面，在表面上铁或血红素从这些蛋白质上脱落。该方法之后由专门的或通用的转运蛋白穿过膜特异性转运(Braun，2001综述)。获得铁的另外一种机制是产生并分泌低分子量分子，即对Fe³⁺和血红素有极高亲和力的所谓的铁载体。这种极高的亲和力(10^-12M)使这些分子能够从蛋白质结合的铁中清除铁。装载铁和血红素的铁载体通过特异性受体被摄取，铁在细胞内被利用。不同的细菌偏爱一种或者另外一种、甚至使用两种方法，并且表达几种不同的受体，用于结合宿主的铁结合蛋白，或者输入低分子量铁螯合化合物，如血红素、柠檬酸盐或铁载体。例如，致病的奈瑟氏球菌(脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoe)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)或酿脓链球菌(S.pyogenes))不含用于产生和摄取铁载体成分的酶和受体，只依赖于通过捕获宿主的铁结合蛋白清除铁。同源转铁蛋白结合的(TbpA，B)和乳铁蛋白结合的(LbpA，B)蛋白质已经在奈瑟氏球菌和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)中鉴定(Cornelissen等人，1992；Pettersson等人，1994；Bonnah等人，1995；Biswas和Sparling，1995；Gray-Owen等人，1995；Schryvers，1988)。另外，奈瑟氏球菌也含有与血红蛋白结合的受体(HmbR)和触珠蛋白-血红蛋白复合物(HpuA，B)(Lewis等人，1997；Kahler等人，2001；Stojiljkovic等人，1996)。在流感嗜血菌中也发现了血红蛋白-触珠蛋白受体(Jin等人，1996；Ren等人，1998)。这些铁结合蛋白的表达模式和配体特异性已经表征。已经确定，它们是在低铁培养基中生长所必需的，因为敲除株的生长受到限制，但不是完全缺陷，这是由于流感嗜血菌或奈瑟氏球菌表达的血红素采集系统的多余性质。在流感嗜血菌或脑膜炎奈瑟氏球菌感染的恢复期患者的血清中，循环抗体的存在是体内表达的指示。

本发明证实，重组LPXTGp5能够在亲和纯化中使用，用来结合并纯化来自人血浆的血清触珠蛋白。作为商品获得的触珠蛋白也显示能够结合LPXTGp5蛋白，其作为重组蛋白，或者直接分离自细菌细胞。因此，本发明清楚地表明，LPXTG5作为一种触珠蛋白受体起作用，用于使触珠蛋白与金黄色葡萄球菌表面结合，从而使该细菌能够摄取铁。

最丰富的Fe结合蛋白是血红蛋白(Hb)，它主要在细胞内(红细胞)。然而，由于红细胞的生理更新(t_1/2＝180天)，血清中总是含有少量(～10μg/ml)的游离血红蛋白。在溶血过程中，大量Hb释放到血浆中。血浆(游离)Hb立即通过极高亲和力的结合(Ka＞10^-15M)与触珠蛋白(Hp)复合，后者是一种丰富的(0.5-2mg/ml)血浆糖蛋白。大量溶血能够耗尽血清触珠蛋白，因此低Hp浓度对于溶血具有诊断价值。触珠蛋白与血红蛋白结合的主要作用之一是，仅仅通过将蛋白质复合物的大小提高到滤过限度以上(＞70kDa)，阻止Hb(64-kDa)被肾小球滤过到尿中。Hp-Hb复合物的形成防止发展两种危险的疾病。直接危险是肾小球中高浓度的Hb，这阻塞滤过液的流动，阻止排尿，导致急性肾衰竭。慢性危险是体内失铁，导致铁缺乏，主要是贫血。为了防止肾脏损伤和失铁，肝脏的RES(网状内皮系统)从循环中提出Hp-Hb复合物。RES细胞含有对于触珠蛋白与Hb结合特异的高亲和力受体。

众所周知，与铁代谢有关的血浆蛋白，如触珠蛋白、血红素结合蛋白和乳铁蛋白，具有免疫功能，有助于正常的感染抗性。

触珠蛋白是一种急性期蛋白质，具有推测的抗炎症活性。促炎细胞因子IL-6和IL-1可以增强它的肝表达(Baumann等人，1990)。另外，TNF-α似乎迅速提高感染或损伤部位的Hp水平，导致急性炎症反应的调节(Berkova等人，1999)。最近已经证实，触珠蛋白也能够被肺上皮细胞表达，可能有助于局部微生物抗性(Yang等人，2000)。而且，触珠蛋白与吞噬细胞功能的调节有关。人吞噬细胞(多形核粒细胞以及单核细胞，但不是嗜酸粒细胞)在特定颗粒内含有触珠蛋白。这些触珠蛋白贮存反映了从胞外环境中特异摄取触珠蛋白。而且，如同其它颗粒部分一样，触珠蛋白在吞噬过程中被胞吐(Wagner等人，1996)。在体外测定中，显示Hp抑制吞噬作用和粒细胞对细菌的胞内杀伤(Rossbacher等人，1999)。推测的功能是吞噬过程中氧化爆发(oxidative burst)的下调，从而防止吞噬细胞的氧化损伤。最近已经描述了巨噬细胞上的一种新型Hp-Hb受体(CD163)(Kristiansen等人，2001)。CD163/Hb清除受体负责肝脏从循环中摄取Hb-Hp复合物。另外，已经证明中性粒细胞表面整联蛋白CD11b/CD18结合Hp(El Ghmati等人，1996)。这些数据提示，触珠蛋白在宿主抗感染和炎症的防御中具有重要的生物功能，作为免疫系统受体-配体激活的一种天然拮抗剂。

令人感兴趣的是，有一些报道称Hp对细菌(例如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes))的生长甚至具有直接的抑制作用(Delanghe等人，1998b)。一种触珠蛋白同源物，触珠蛋白相关蛋白(HRP)，被鉴定为一种锥虫裂解复合物的主要成分，负责T.cruci的直接杀伤(Smith等人，1995)。

人群中存在触珠蛋白基因多态性，这是由于编码Hp一条链的复制基因部分引起的。抗氧化蛋白质触珠蛋白已知有三个表型：Hp 1-1、Hp2-1和Hp 2-2。这些不同的表型与不同疾病(如细菌和病毒感染(例如AIDS)、糖尿病、心脏病等)的易感性有关(Delanghe等人，1998a；Hochberg等人，2002；Van Vlierberghe等人，2001)。主要解释为不同的分子大小(单体对寡聚体形成)，因此不同的组织穿透和局部抗氧化活性。Hp能够抵抗Hb诱导的Fenton反应引起的氧化损伤。

由于Hp的众所周知的抗氧化活性，金黄色葡萄球菌的触珠蛋白包被可导致吞噬体内细菌氧化损伤减少。此外，与金黄色葡萄球菌表面结合的Hp也可以使其逃脱杀伤，这是通过调节进入专业吞噬细胞的途径(通过触珠蛋白受体)，在细胞质而不是在吞噬细胞颗粒内产生游离细菌。

根据本发明，提供了与触珠蛋白受体介导的配体结合相互作用的分子，其反过来将导致细菌，特别是金黄色葡萄球菌的铁饥饿。如本发明所用的“相互作用”涉及导致阻碍病原体中的这种触珠蛋白受体与配体结合的任何相互作用。优选地，通过破坏这种机制进行相互作用，即完全灭活或阻断这种途径。然而，该途径功能性的显著降低(例如通过竞争性反应)通常也足以对抗由含有触珠蛋白受体的病原体引起的疾病。

本发明表明，LPXTGp5基因的预测的开放阅读框(金黄色葡萄球菌N315株中的SA1552，根据Kuroda等人，2001的描述)(SEQ ID No 1)编码一种长895个氨基酸的蛋白质，它在N端有一个典型的信号肽序列，在C端有典型的革兰氏阳性锚定基序，包含LPXTG基序、疏水性跨膜区和带正电的尾(SEQ ID.No 2)。

应当指出，在本发明中，“触珠蛋白受体”是LPXTGp5基因(SEQ ID.No 1)编码的LPXTGp5蛋白(SEQ ID.No 2)，也被称为“HarA”，它代表触珠蛋白受体A，具有针对人血浆触珠蛋白和触珠蛋白-血红蛋白复合物的特异性配体结合活性。

根据本发明的一个优选实施方案，可与配体的触珠蛋白受体结合相互作用的分子选自触珠蛋白受体抗体、与根据SEQ ID NO 2的肽(触珠蛋白受体)结合的触珠蛋白模拟位(mimotope)，或其片段。

“触珠蛋白受体抗体”包括任何一种抗体或抗体片段或衍生物，其显示对根据本发明的触珠蛋白受体的结合亲和力。它们可以是多克隆或单克隆抗体、单链抗体或含有抗体分子的可变结合域的其它片段。

抑制与触珠蛋白(Hp)结合的一个有效方法是通过抗LPXTGp5的特异性抗体。除了中和其作为HpR的功能以外，相同的抗体能够支持调理吞噬，因为Hp结合区必须是表面暴露的。在动物模型中使用的保护性疫苗有几个例子，它们包含细菌铁摄取受体蛋白(Webb和Cripps，1999)。Webb和Cripps证明，在大鼠模型中，用重组转移结合蛋白(TbpB)免疫可通过刺激保护性应答(抗体产生)加速从肺中清除无法分型的流感嗜血菌。

而且，抗LPXTGp5抗体能够用于发展有效抑制剂和拮抗剂，如模拟位。这些拮抗剂优选地是肽或无机(或有机)小分子。此外，HpR的鉴定也能够产生小药物抑制剂，是抗细菌化学治疗或化学预防的一部分。

根据本发明的一个优选实施方案，触珠蛋白受体抗体或触珠蛋白模拟位可结合选自SEQ ID NO 4(D1)和SEQ ID NO 6(D2)或其片段的多肽。

在本发明的过程中，已经鉴定了两个高度同源的结构域(D1和D2)，它们位于LPXTGp5蛋白的胞外部分。这两个分离的结构域都能够结合从人血浆中纯化的触珠蛋白。

根据一个方面，本发明也提供了编码触珠蛋白结合分子(即一种触珠蛋白受体)的基因。因此本发明也涉及这些含有根据SEQ.ID.NO.1的序列的基因。编码根据SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5的D1或D2结构域的核酸和编码触珠蛋白结合多肽的片段也是根据本发明的核酸分子。

根据本发明的核酸序列可以是例如RNA或DNA；它们也可以与适当的启动子、增强子、标记等序列共存于例如一种载体中，如质粒或病毒载体，使多肽或mRNA在靶细胞、组织或体液中表达。根据SEQ.ID.NO.7的Fur盒是根据本发明使用的一种优选的调节元件。本发明也包括编码触珠蛋白受体或其触珠蛋白结合片段的核酸序列，分别可与SEQ.ID.Nos1、3、5、7严格杂交的核酸(或其互补序列)。可能的严格杂交条件是例如6×SSC(例如Sambrook等人1989，《分子克隆：实验室方法》所定义的)。

根据另一方面，本发明提供了分离的多肽，包括选自下列的多肽：SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 6及其触珠蛋白结合片段，以及同源结构域。“同源结构域”包括所有触珠蛋白结合域，根据SIM(Expasy)程序(例如可以利用PSIPRED预测排比程序进行二级结构测定(例如用于结构域限定；也用于同源性))计算，它们与SEQ ID NOs 4或6有至少40％、优选地至少70％、特别是至少90％的序列同源性。

只在结构域和相邻区之间存在显著同源性：

	LPXTGp5D1	LPXTGp5D2
			LPXTGp5D2	142aa54.9％	142aa100％
LPXTGp6D	147aa45.6％	194aa67.5％
			LPXTGp7	45aa31.1％	86aa24.4％

根据本发明的再一方面，提供一种合成偶联物，其含有一种根据SEQ ID NO 4的肽，该肽通过非天然存在的接头与根据SEQ ID NO 6的肽连接。原则上不干扰Hp结合的所有偶联物都可用于本发明，例如GST(谷胱甘肽-S-转移酶、His-tag、FLAG-尾等)。

根据本发明的一个优选实施方案，非天然存在的接头是多肽。

根据本发明的另一方面，本发明包括反义技术的使用。因此，病原体中触珠蛋白受体的表达被可结合触珠蛋白受体mRNA或其调节元件的反义核酸分子阻断或大大抑制。用来与触珠蛋白受体配体结合相互作用的分子因此是一种结合触珠蛋白受体基因或结合调节元件的反义核酸，用于表达触珠蛋白受体基因，特别是根据SEQ ID NO 7的Fur盒。

根据本发明的另一方面，提供了一种在严格条件下可与选自SEQID NO 7的核酸序列杂交的核酸。

严格杂交条件在本领域公知(见上)。如果核酸序列已知，能够计算最佳杂交条件。例如，能够根据将要杂交的核酸的GC含量确定杂交条件(Sambrook等人1989，《分子克隆：实验室方法》)。

在原核生物中，铁代谢主要在基因转录水平上调节。在进化过程中，已经发展了高度调节的、复杂的、繁琐的摄取系统，大量基因(在有些情况下＞40种)的表达由优势胞内浓度的Fe通过与调节蛋白复合直接控制。在几乎所有细菌中表征最好的、最保守的是Fur阻抑蛋白(铁摄取调节蛋白)。Fur直接感知细胞内铁浓度的改变，是一种铁结合蛋白。在足够或高浓度下，铁与Fur结合。铁的结合使得该蛋白质能够结合被称为fur盒的某些DNA序列，抑制靶基因的转录。在铁限制条件下，Fe²⁺易于从Fur-Fe复合物上解离，使Fur调节的基因转录(Escolar等人，1999)。重要的是，毒力因子的表达与铁饥饿联系在一起(例如，志贺毒素、大肠菌素、溶血素)，提示低铁浓度是体内“战场上的”致病菌的一个总体信号。这在目的上可能是合理的，因为细胞毒素、溶血素导致铁结合蛋白(如血红蛋白和肌红蛋白)释放，它们是细菌生长的极佳的铁源。

通常对于革兰氏阳性菌，特别是葡萄球菌，对它们的铁转运和调节所知相对较少。金黄色葡萄球菌基因组编码三个铁摄取调节基因(Fur)同源物：Fur、PerR和Zur。发现PerR控制编码氧化应激抗性蛋白过氧化氢酶(KatA)、烷基氢过氧化物还原酶(AhpCF)、细菌铁蛋白共迁移蛋白(Bcp)和硫氧还蛋白还原酶(TrxB)的基因转录。此外，PerR也调节编码铁贮存蛋白-铁蛋白和铁蛋白样Dps同源物MrgA的基因的转录(Horsburgh等人，2001综述)。而且，已经证明金黄色葡萄球菌能够利用几种氧肟酸盐铁载体在铁限制条件下生长(Sebulsky等人，2000)。曾经提出sir(铁载体调节)操纵子构成金黄色葡萄球菌中的铁载体转运系统。它含有受体和细胞质膜结合的交通ATPase，该酶与铁(III)-氧肟酸盐复合物的具体转运有关(Sebulsky等人，2001)。然而，关于通过与宿主铁结合蛋白直接结合获得铁所知甚少。表面GAPDH是一种42-kDa的金黄色葡萄球菌蛋白质，可能是转铁蛋白受体(Modun和Williams，1999)。最近，一种LPXTG蛋白已经被鉴定为金黄色葡萄球菌的转铁蛋白受体(Taylor和Heinrichs，2002)。本发明表明，LPXTGp5上游的核苷酸序列对应于位于起始ATG密码子上游-53和-35bps之间的共有fur结合盒。本发明表明，LPXTGp5一方面在fur缺失突变的金黄色葡萄球菌株中组成型表达，另一方面，在fur基因完整的野生型金黄色葡萄球菌株中，这种表达是铁调节的。

根据另一方面，本发明提供一种方法，用于分离可与触珠蛋白受体配体结合相互作用的分子，其特征在于下列步骤：

-在固体表面上提供触珠蛋白受体多肽或其触珠蛋白结合片段，

-使标记的触珠蛋白与这种固定的触珠蛋白受体多肽或其触珠蛋白结合片段结合，形成固定的触珠蛋白受体多肽或其触珠蛋白结合片段与标记的触珠蛋白的复合物，

-使这种复合物接触含有候选分子的库(pool)，

-确定该库中替代复合物中所述标记触珠蛋白的分子，和

-分离替代该复合物中的标记触珠蛋白的所述分子。

利用这种方法，能够分离与触珠蛋白竞争触珠蛋白受体之触珠蛋白结合位点的分子。

根据本发明的一种相当的方法，用于分离可与触珠蛋白受体配体结合相互作用的分子，其特征在于下列步骤：

-提供固定于固体表面上的触珠蛋白，

-使标记的触珠蛋白受体多肽或其触珠蛋白结合片段与这种固定的触珠蛋白结合，形成固定的触珠蛋白与标记的触珠蛋白受体多肽或其触珠蛋白结合片段的复合物，

-使该复合物接触含有候选分子的库，

-确定该库中替代该复合物中所述标记触珠蛋白受体多肽或其触珠蛋白结合片段，并与固定的触珠蛋白结合的分子，

-分离该库中与固定触珠蛋白结合的所述分子。

利用该方法，能够分离触珠蛋白受体模拟位。

根据本发明的另一种相当的方法，用于分离可与触珠蛋白受体配体结合相互作用的分子，其特征在于下列步骤：

-提供候选分子库，

-从该库中提取并分离可与固定的触珠蛋白受体或其触珠蛋白结合片段结合的分子，

-从该库中提取并分离可与固定的触珠蛋白结合的分子，

-使其余的候选分子库接触在触珠蛋白与触珠蛋白受体或其触珠蛋白结合片段之间形成的固定复合物，

-分离与该固定复合物结合的所述分子。

利用该方法，能够分离特异性结合触珠蛋白/触珠蛋白受体复合物而不结合(未复合的)单种成分的分子。因为复合物只在病原体细胞表面上体内存在，因此能够将这些复合物特异性分子与适当的对抗病原体的分子(例如特定抗生素)组合，以实现病原体的定点控制。

在本发明的一个优选实施方案中，该触珠蛋白结合片段选自SEQID No.4、SEQ ID No.6及其片段，或这些片段的组合。

如本发明的实施例所述，能够建立一种基于ELISA的体外测定和一种基于FACS的体外测定，用于测定LPXTGp5或其片段(例如D1和D2)与触珠蛋白的竞争性结合。这类测定系统在筛查、分离可相互作用或破坏LPXTGp5和触珠蛋白相互作用的分子中特别有用。

在本发明的一个优选实施方案中，该触珠蛋白受体是金黄色葡萄球菌触珠蛋白受体。

在本发明的另外一个优选实施方案中，该触珠蛋白是一种哺乳动物，特别是人触珠蛋白。

本发明通过下列实施例和附图更详细地描述，但是并不限于此。

                  附图说明

图1显示LPXTGp5蛋白的结构，以及LPXTGp5与含有同源结构域的其它葡萄球菌蛋白质之间的二级结构的比较。

图2通过凝胶电泳、蛋白质染色和免疫印迹法显示重组LPXTGp5。

图3-4显示在不同金黄色葡萄球菌感染患者和健康供体的血清中，测定的抗rLPXTGp5、D1和D2的IgG水平。

图5显示人血浆蛋白质与重组LPXTGp5的结合。

图6显示触珠蛋白与体外培养的金黄色葡萄球菌细胞表达的原始LPXTGp5的结合。

图7显示金黄色葡萄球菌的依赖生长条件的LPXTGp5表达。

图8显示fur盒序列的排比，以及铁和Fur调节的LPXTGp5表达。

图9显示在基于ELISA的测定中，rLPXTGp5结构域对触珠蛋白的结合。

图10显示在基于FACS的测定中，触珠蛋白与活金黄色葡萄球菌细胞的结合。

图11显示在D1结构域存在下，触珠蛋白与金黄色葡萄球菌结合的抑制。

图12显示触珠蛋白与金黄色葡萄球菌8325-4和LXTGp5KO的结合。

图13显示Hp-Hb复合物引起的金黄色葡萄球菌生长的增强。

图14显示触珠蛋白受体结合触珠蛋白-血红蛋白复合物。

                  实施例

方法与实验程序

菌株和培养条件

金黄色葡萄球菌野生株8325-4(Novick，1967)、临床分离株COL(Shafer和Iandolo，1979)和限制缺陷株RN4220(Kreiswirth等人，1983)来自我们实验室的菌株库。金黄色葡萄球菌fur突变体(Horsburgh等人，2001)由Simon Foster(Sheffield University，UK)惠赠。金黄色葡萄球菌株在BHI(脑心浸液)培养液或RPMI 1640组织培养基(含有25mMHepes缓冲液和L-谷氨酰胺，Gibco BRL)中培养，作为铁含量较少的贫乏培养基。向RPMI培养基中加入FeCl₃至终浓度为25μM实现补铁。可作为商品获得的大肠杆菌BL21株和ElectroMAX DH10B(Invitrogen)分别用于重组蛋白质表达和克隆目的，在Luria-Bertani培养液(LB)中生长。当含有抗生素时，以下列浓度加入：对于大肠杆菌氨苄青霉素，100μg ml^-1；红霉素，300μg ml^-1；对于金黄色葡萄球菌红霉素，5μg ml^-1；林可霉素，25μg mol^-1；四环素，5μg ml^-1。除非另外说明，所有细菌培养都在37℃和150转/分振摇下进行。

细菌裂解物制备

在蛋白酶抑制剂(Complete∑，不含EDTA的片剂，Roche)存在下，通过在37℃下溶葡萄球菌素消化(100μg ml^-1，在PBS中)30分钟，制备总细菌裂解物。除了酶消化之外，也利用微型超声破碎仪(BandelinSonopuls，HD 2200，德国)超声处理，破坏细胞。离心后，回收可溶性级分，用Bredford法(Bio-Rad蛋白质测定法)测定蛋白质浓度。

重组HarA的表达

利用掺入BsaI位点的基因特异性寡核苷酸HARA1和HARA2，由金黄色葡萄球菌COL基因组DNA扩增编码HarA的cDNA(表1)。将限制性内切酶消化的PCR产物克隆到BsaI酶切的pASK-IBA4载体中，位于编码Strep-tag II(IBA，Gottingen)的序列的下游。获得的基因缺乏位于sortase酶切位点(LPKT，G)下游的对应于信号肽和C端部分的序列(QAQA，AENT)。通过StrepTactin亲和层析(根据厂商说明)，从无水四环素诱导的BL21大肠杆菌的细菌提取物中纯化重组蛋白。除了全长蛋白质之外，扩增对应于预测的D1和D2结构域的DNA序列也产生HarA的两种截短形式。分别使用寡核苷酸引物MOL1031和MOL1032或MOL1033和MOL1034，产生聚合酶链反应产物(表1)，然后用BamHI-SalI消化，以插入BamHI-SalI消化的pGEX-4T-3(AmershamBiosciences)中。通过超声处理(缓冲液：50mM Tris-HCl pH8.0，100mMNacl，1mM EDTA)从IPTG诱导的BL21大肠杆菌细胞中提取GST融合蛋白，在谷胱甘肽Sepharose 4B亲和柱(Amersham Biosciences)上从可溶性细菌级分中纯化。通过凝血酶消化(50U ml^-1，室温下3小时)或使用10mM谷胱甘肽，洗脱重组蛋白。

表1.引物列表

名称核苷酸序列

限制酶切位点以下划线标出

人血浆蛋白质的亲和纯化

首先，通过与Ultralink固定的蛋白质G珠(PIERCE)结合，使人血浆耗尽IgG。简言之，将用PBS(pH7.4)1∶2稀释的1ml血浆分两次加到蛋白G Sepharose柱上，收集流过液。IgG耗尽的血浆(～60mg总蛋白质)与固定于StrepTactin琼脂糖(IBA，Gottingen)上的20ug StrepII-标记的重组蛋白温育。用PBS充分洗珠后，用100μl等电聚焦样品缓冲液(IEF：10M尿素，4％CHAPS，0.5％SDS，100mM DTT)洗脱蛋白质。

使用纯化触珠蛋白的金黄色葡萄球菌蛋白质的亲和纯化

通过200μg生物素化的触珠蛋白(Hp∶生物素=1∶10)与40μl链霉抗生物素蛋白凝胶Ultralink Plus(PIERCE)结合，制备触珠蛋白亲和柱。从在RPMI中培养到稳定期的金黄色葡萄球菌8325-4细胞中提取总蛋白质，将2mg加到Hp柱上。充分洗涤后，结合的蛋白质用100μl IEF缓冲液洗脱，40μl洗脱物通过SDS-PAGE随后通过免疫印迹法分析。

二维凝胶电泳

高分辨率二维凝胶电泳如别处所述进行(Hochstrasser等人，1988)，其使用mini-Protean电泳系统(Bio-Rad)。为了分析IgG耗尽的血浆，用IEF样品缓冲液稀释1μl样品，可达10μl。样品缓冲液中的洗脱级分直接加到凝胶上。一维等电聚焦在2625V-h下在1mm×10cm管式凝胶中分步进行(10min，500V，3.5h，750V)，其中使用4％丙烯酰胺(Gerbu，Gaiberg，德国)/0.1％PDA，0.035％Nonidet P-40和2％两性电解质(pH3.5-10∶pH4-8∶pH5-7＝1∶1∶2；Merck，Darmstadt，德国)，用脱气的20mM NaOH作为阴极电解质，6mM H₃PO₄作为阳极电解液。管式凝胶置于1.0mm 12％SDS-PAGE平板凝胶之上。用3％SDS，70mM Tris碱，0.001％溴酚蓝平衡3分钟后，使用0.1％SDS，25mMTris碱和200mM甘氨酸作为电极缓冲液，在15℃下进行第二维电泳。凝胶用考马斯蓝染色。在该系统中可以检测的蛋白质的范围是：10-220-kDa，pI3.5-7.5。

抗HarA抗体的产生

从经ELISA确定含有高水平抗rHarA抗体的健康供体的血浆中分离人抗HarA IgG。50ml血浆用ImmunoPure IgG结合缓冲液(PIERCE)1∶2稀释，加到UltraLink固定的蛋白G珠(PIERCE)上。与该柱结合的IgG用ImmunoPure IgG洗脱缓冲液(PIERCE)洗脱，用1M Tris-HClpH8.0中和。合并洗脱级分，在4℃下对PBS透析过夜。150mg IgG与40mg生物素标记的HarA温育，后者固定于50μl UltraLink Plus固定的链霉抗生物素蛋白凝胶(PIERCE)上。在充分洗涤后，用ImmunoPure IgG洗脱缓冲液洗脱级分。这种纯化产生～20μg IgG，使用rHarA和几种无关金黄色葡萄球菌重组蛋白，通过ELISA和免疫印迹法检测其特异性，作为阴性对照。用代表全长HarA或含有单结构域D1和D2的截短形式的重组蛋白免疫兔，产生超免疫的多克隆免疫血清。在采血前，新西兰白兔以3周的间隔免疫三次，每只兔每次注射250μg蛋白质。有效的免疫和特异性抗体的存在使用各自的重组蛋白通过ELISA和免疫印迹法证实。

免疫印迹

利用mini-Protean电泳系统(Bio-Rad)通过一维和二维SDS-PAGE分离蛋白质，并利用半干转移系统(Bio-Rad)将其转移到硝酸纤维素膜(ECL，Amersham Biosciences)上，通过丽春红S染色显示。用5％牛奶封闭过夜后，加入100ng ml^-1浓度的纯化的人抗HarA IgG或1∶10000稀释的兔免疫前或免疫血清，HarA蛋白的特异性检测使用HRP标记的山羊抗人IgG(Southern Biotech)或HRP标记的山羊抗兔IgG(Amersham Biosciences)。用ECL检测系统(Amersham Biosciences)检测信号。

利用抗HarA抗体的细胞表面染色

在含有或不含作为铁源的25μM FeCl₃的情况下，在RPMI培养基中培养到对数晚期的5×10⁶金黄色葡萄球菌细胞(OD₆₀₀为0.8-1.0；在RPMI中的最大OD₆₀₀～1.6)用多克隆兔抗HarA抗血清染色。在加入1∶500稀释的兔超免疫血清之前，与10μg样品^-1的人IgG Fc片段(Jackson ImmunoResearch)温育，阻止抗体的非特异性结合。用PBS洗涤后，加入第二种试剂——FITC标记的抗兔IgG/Fab特异性片段(Jackson ImmunoResearch)。所有步骤都在冰上进行，每步30分钟。最后，用PBS洗涤细胞，用2％PFA固定，用FACScan(Becton Dickinson)定量荧光。

触珠蛋白结合测定

基于ELISA的体外测定以两个不同的设置进行。首先，我们使用从合并的人血浆(SIGMA和FLUKA)中纯化的触珠蛋白作为包被试剂，它在包被缓冲液(0.1M碳酸钠，pH9.3)中浓度为10μg ml^-1，并且以2.5-12pmoles(2-10μg ml^-1)的量使用GST-D1和GST-D2作为结合配偶体。用1∶5000稀释的生物素标记的山羊抗GST mAbs(Abcam，UK)和1∶10000稀释的链霉抗生物素蛋白-HRP(Roche)检测Hp与D1或Hp与D2之间的相互作用。其次，rHarA、D1和D2结构域蛋白以10μg ml^-1的浓度在包被缓冲液中包被，加入含量为0.08-4.0pmoles的配体触珠蛋白、触珠蛋白-血红蛋白复合物或血红蛋白。在室温下以1∶1摩尔比轻轻混合触珠蛋白与血红蛋白(Sigma)45分钟，制备触珠蛋白-血红蛋白复合物。复合物的形成通过非变性PAGE凝胶的CBB染色显示。使用1∶2000稀释的抗人触珠蛋白(SIGMA)和抗人血红蛋白(Abcam，UK)单克隆抗体，和HRP标记的抗小鼠IgG作为第二种试剂，检测配体蛋白质的结合。根据用自动ELISA读板器(Wallace Victor 1420)读取的OD_405nm，测定底物(ABTS)向有色产物的转化，由此定量抗原-抗体复合物。以10∶1的生物素与触珠蛋白比，用纯化的生物素标记的触珠蛋白(EZ-连接磺基-NHS-LC生物素，PIERCE)进行基于FACS的测定，在室温下30分钟。在用Nanosep 10K离心装置(Pall，Life Sciences，USA)除去游离生物素后，使用链霉抗生物素蛋白-HRP作为检测试剂，通过免疫印迹证实触珠蛋白的标记。在存在或不存在作为铁源的25μM FeCl₃的情况下，金黄色葡萄球菌细胞在RPMI培养基中培养，直到对数晚期(OD₆₀₀＝0.8-1.0)。向5×10⁶细胞中加入生物素化的触珠蛋白(5-30μg)，在室温下温育30分钟。用PBS洗涤后，加入1∶100稀释的链霉抗生物素蛋白-FITC(DAKO)，然后用2％PFA固定细胞。通过用FACScan(Becton Dickinson)测定荧光强度定量触珠蛋白的表面结合。

依赖铁的生长

生长研究使用铁耗尽的RPMI培养基。RPMI的铁消耗通过与Chelex100(Sigma)成批温育实现。简言之，向1L培养基中加入10gChelex100，在室温下搅拌4小时。然后向培养基中补充二价离子至10μM CaCl₂和100μM MgSO₄。从BHI平板上接种金黄色葡萄球菌8325-4和harA突变细胞，在RPMI完全培养基中温育过夜。收集细胞，洗涤，重悬浮于铁耗尽的RPMI培养基中，达到OD₆₀₀＝0.05。在铁饥饿3小时后，收集细胞，用补充不同铁源的铁耗尽RPMI稀释为OD₆₀₀＝0.02。使用下列铁源：浓度为25mM的三氯化铁，0.5mM Hb和1μM和0.5μM浓度的Hp-Hb(2∶1)复合物。通过用Hitachi U-2001分光光度计测量600nm的光密度监测细菌的生长。

harA插入灭活突变体的构建

使用以前(Chakraborty等人，1992)描述的pAUL-A载体(SimonFoster惠赠)构建用于插入灭活harA的质粒。使用分别添加SalI/KpnI和KpnI/EcoRI限制酶切位点的基因特异性引物MOL1313、MOL1314和MOL1315、MOL1316(表1)，PCR产生harA开放阅读框的5′和3′侧翼区。将1kb片段克隆到SalI-EcoRI消化的pAUL-A载体中，产生质粒pAUL-AD。使用掺入KpnI限制酶切位点的引物MOL1317和MOL1318(表1)，由pDG1513(Guerout-Fleury等人，1995；Simon Foster惠赠)扩增四环素抗性盒。然后将KpnI消化的含有1.5kb四环素抗性盒(Tc)的PCR片段克隆到pAUL-AD内。通过电穿孔法用50微克获得的pAD02质粒转化金黄色葡萄球菌RN4220限制缺陷转化受体。在质粒复制的许可温度(30℃)下鉴定红霉素抗性转化子。通过将温度转变为42℃筛选单交换Campbell型染色体插入，并在四环素上筛选。pAD02质粒向染色体DNA内的整合通过PCR分析证实。四环素抗性标记向金黄色葡萄球菌8325-4染色体内的整合通过用噬菌体11转导实现。根据红霉素和林可霉素抗性的丢失进一步选择转导的菌落，通过使用基因特异性引物的PCR，以及利用Southern印迹法，检查harA基因的缺乏。

结果

实施例1.LPXTGp5是在不同金黄色葡萄球菌感染过程中在体内表达的高度免疫原性的新细胞壁蛋白质

1/A.LPXTGp5作为抗原的鉴定

特异性抗细菌抗体是相应抗原体内表达的分子证据。抗原特异性血清抗体的鉴定广泛用于对某些病原体(特别是不可培养的病原体)的血清诊断。

通过细菌表面展示以及使用不同金黄色葡萄球菌感染患者的人血清进行的蛋白质组学，LPXTGp5被鉴定为一种重要的抗原(参见WO02/059148 A，Etz等人，2002，Vytvytska等人，2002)。通过表面展示鉴定了该蛋白质的5个不同的B细胞表位区，全部位于N端。根据这些数据，LPXTGp5在人金黄色葡萄球菌感染期间表达，在许多患者中用多个表位产生广泛的免疫原性。生物信息学分析鉴定了一种不知道功能的新型蛋白质。

1/B.LPXTGp5基因和蛋白质

根据TIGR注释(SA1781，InterCell ORF01361；Kuroda等人，2001)(SEQ.ID.No 1)，LPXTGp5基因的预测的开放阅读框位于金黄色葡萄球菌COL株的1824064与1821380 bps之间。预测的ORF编码一种长895个氨基酸的蛋白质，其在N端含有一个典型的信号肽序列，在C端含有典型的革兰氏阳性锚定基序，含有LPXTG基序、疏水跨膜区和带正电的尾(SEQ.ID.No 2)。一级氨基酸序列和预测的二级结构分析都提示，结构域的所有β折叠结构中存在两个同源结构域(D1和D2)，它们被螺旋或卷曲区分开(图1)。这两个结构域含有～145个氨基酸残基，显示52％的同一性和71％的相似性。

令人感兴趣的是，序列同源性搜索在其它三种金黄色葡萄球菌蛋白质中鉴定了类似的单结构域，我们称之为LPXT-Gp6、LPXTGp7和p7。显然，这三种蛋白质是金黄色葡萄球菌染色体上直接相邻的基因。LPXTGp7和p7似乎被转录为一种mRNA。而且，p7基因之后是三个预测的膜蛋白，它们显示与蛋白质的铁ABC转运家族同源。包括p5在内的所有四种蛋白质在5种金黄色葡萄球菌株之间高度保守，其基因组信息是可以获得的。令人感兴趣的是，发现使用人血清，所有四种蛋白质都是免疫原性的(参见，例如WO 02/059148 A)。类似于LPXTGp5，p6和p7/p7样含有fur盒序列，在最近的公开文本中，证实这些蛋白质是铁调节的(Mazmanian等人，2002)。预测的同源结构域的结构非常相似(PhD)，尽管其具有～40％的适中的氨基酸同一性。另外，在其它革兰氏阳性菌中也存在含有同源结构域的蛋白质，它们全部属于梭菌属(Clostridium)。单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocyotgenes)含有一种蛋白质，称为p64，它含有三个这样的结构域。蛋白质组学分析提示，p64的表达是铁调节的(Borezee等人，2000)。Bacillus halodurans基因组含有一个预测的含有该结构域的开放阅读框。

1/C.产生重组蛋白

由金黄色葡萄球菌COL株基因组DNA扩增编码LPXTGp5的cDNA，其中分别使用基因特异性寡核苷酸5′-CGTAGCTGGAGCCACCGCAGTTC-3和5′-AAAATGCTACCAAAAACTTGA-3′。将限制性内切酶消化的PCR产物克隆到pASK-IBA4载体的BamHI-SalI位点内，位于编码Strep-tagII的序列下游(IBA，Gottingen)。获得的基因缺乏位于sortase酶切位点(LPXTG)下游的对应于信号肽和C末端的序列。通过Streptactin亲和层析(根据厂商说明)，从氨苄青霉素诱导的BL21大肠杆菌的细菌提取物中纯化重组蛋白。尽管该895aa蛋白质的预测分子量是101-kDa，但是重组全长LPXTGp5作为一种～130-kDa蛋白质迁移。细菌细胞壁蛋白质的迁移速度通常慢于其实际大小。

除了全长蛋白质之外，也产生LPXTGp5的两种不同截短形式，方法是扩增对应于预测的D1和D2结构域的DNA序列，并插入BamHI-SalI消化的pGEX4T-3内。通过溶菌酶消化(缓冲液：50mM TrispH8.0，100mM NaCl，1mM EDTA)，从IPTG诱导的DH10B大肠杆菌细胞中提取GST-融合蛋白，利用谷胱甘肽亲和柱从可溶性细菌级分中纯化。通过凝血酶消化，或者使用10mM谷胱甘肽，洗脱重组蛋白。因此，可以获得长145aa的D1和D2重组截短形式，其含或不含GST尾。

1/D.LPXTGp5在人类中具有广泛免疫原性

在一系列免疫印迹和ELISA实验中，测定来自不同金黄色葡萄球菌感染患者以及健康个体的人血清是否含有抗LPXTGp5抗体(图2)。在不同血清之间，抗LPXTGp5 IgG(图3)与IgA(数据未显示)的水平存在差异，金黄色葡萄球菌创伤感染患者显示最高水平。使用D1和D2蛋白的ELISA证明，这些结构域也具有高度免疫原性(图4)。

实施例2.血清触珠蛋白作为LPXTGp5的结合配体的鉴定

2/A.用重组LPXTGp5对人血浆蛋白质的亲和纯化

为了鉴定LPXTG-p5的结合配偶体和功能，将StrepII-标记的重组蛋白固定到Streptactin琼脂糖(IBA)上，加IgG耗尽的人血浆。血浆样品的选择取决于通过ELISA获得的抗rLPXTGp5的低IgG和IgA滴度，以避免不希望的免疫作用。与LPXTGp5柱结合的人血浆蛋白质的洗脱级分，以及只有Streptactin的对照柱的级分，进行2D-PAGE分析。2D凝胶的考马斯蓝染色显示一组蛋白质斑点，其具有40-到45-kDa和pI 4.5-5.5的特征(图5A)。对照柱的洗脱物(图5B)以及单独的rLPXTGp5凝胶(图5C)中没有这些斑点。未分级的血浆样品的分离显示同一组斑点(图5D)，有助于相应蛋白质的鉴定。根据2D凝胶中蛋白质斑点的特征，借助于可从瑞士-2DPAGE数据库(http：//us.expasy.org/ch2d/)中获得的蛋白质组学信息，纯化的40-45-kDa蛋白质被鉴定为人血浆/血清糖蛋白——触珠蛋白的亚基。特有的“珠位于带上”的外观是由于在前述Asn残基的4个可能的糖基化位点处N连接的糖基化。为了证实这一发现，来自LPXTGp5亲和柱的洗脱级分用抗人触珠蛋白抗体进行2D免疫印迹分析，并且用纯化的人血清触珠蛋白作为阳性对照。2D凝胶相同区域中信号特有的5个斑点外观再次证实。

为了提供确切的证据，购买可以作为商品获得的从合并人血浆中纯化的触珠蛋白(cat# 51325，Fluka)，检测它与LPXTGp5亲和柱结合的能力。类似于使用血浆的实验，纯化的Hp通过与LPXTGp5相互作用保留在柱上，因为对照Streptactin琼脂糖的洗脱物不含触珠蛋白。也进行逆转实验，其中使用通过生物素标记固定于链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠上的纯化的触珠蛋白，以及由在耗尽铁(含有Chelex 100)的RPMI培养基中生长到对数期的金黄色葡萄球菌8325-4spa株制备的总裂解液。来自触珠蛋白偶联珠的洗脱物的免疫印迹分析进一步证实，直接从细菌细胞中分离的天然LPXTGp5实际上是这种胞外宿主糖蛋白的结合配偶体(图6)。

2/B.与LPXTGp5的D1和D2结构域结合的配体的定位

在大肠杆菌中产生重组LPXTGp5总是产生降解产物(图2)，这可能是由于蛋白质大小较大，以及这种革兰氏阳性细胞壁蛋白在革兰氏阴性大肠杆菌中表达的部分不相容性。为了鉴定识别触珠蛋白所必需的蛋白质部分，如上所述产生GST标记的缺失突变LPXTGp5蛋白。同源结构域是配体结合的有吸引力的候选者。使用通过D1和D2蛋白免疫产生的超免疫兔血清显示了这两个结构域的细胞表面位置，证实它们可用于细胞外配体结合。用重组结构域蛋白质和纯化的触珠蛋白或IgG耗尽的血浆重复亲和层析。GST-D1和GST-D2蛋白固定于谷胱甘肽Sepharose柱上，人血浆或纯化的触珠蛋白作为配体来源，类似于全长LPXTGp5使用的。洗脱物的2D分析鉴定触珠蛋白为结构域的结合配偶体。尽管该实验的设置不适于亲和测定，但是似乎GST-D1比GST-D2更好地结合。

实施例3.LPXTGp5/SAHpR表达的调节

3/A.在应激培养基中的优先表达

用抗LPXTGp5抗体对由金黄色葡萄球菌8325-4 spa-(蛋白A缺陷株)制备的细菌提取物进行免疫印迹分析，显示一条约130-kDa分子量的蛋白带(图7)。重要的是，纯化的人IgG和兔免疫血清显示相同的带。尽管这种895aa蛋白质的预测分子量为101-kDa，但是细菌细胞壁蛋白质通常比其实际大小更慢地迁移。支持这一观点，重组全长LPXTGp5实际上类似于天然形式作为一种～130-kDa的蛋白质迁移(图2)。

令人感兴趣的是，由在成分已知的、贫乏、低铁培养基(RPMI 1640)中培养的细菌制备的提取物含有LPXTGp5，而在丰富培养基，如脑心浸液(BHI)中培养的细菌的提取物不含(图7)。而且，蛋白质的表达只在细胞生长的对数后期和稳定期观察到，而在对数早期观察不到。众所周知，离子浓度类似于人血浆的成分已知的、贫乏培养基比丰富培养基使病原体表达更多的体内相关的蛋白质，通常用于细菌的实验室生长。

3/B.铁和Fur对表达的调节

LPXTGp5 ORF上游的核苷酸序列对应于位于起始ATG密码子上游-53与-35bps之间的共有fur结合盒(图8A)。该DNA基序的存在高度预示了依赖铁的表达抑制，如同革兰氏阴性和革兰氏阳性菌中的几种基因所显示的一样(Escolar等人，1999)。

基因中存在fur盒序列引起了比较LPXTGp5蛋白在低和高铁浓度培养基中培养的细菌中表达的兴趣。由在补充RPMI培养基中培养的8325-4野生型金黄色葡萄球菌株制备的细菌裂解物进行免疫印迹分析，显示铁将表达抑制到不可检测的水平(图8B，左图)。在一种金黄色葡萄球菌株中没有这种调节，其中fur基因通过插入诱变灭活。Fur是一种依赖铁浓度的转录抑制蛋白，因此在不存在时，预期靶基因解除抑制，从而上调。实际上，LPXTGp5在fur缺失突变金黄色葡萄球菌株(具有8325-4背景)中在每个生长阶段组成型表达(图8B，右图)。根据这些结果，明确了LPXTGp5的表达处于Fur介导的铁调节之下。

相反，agr和sar是与大量葡萄球菌毒力蛋白的调节有关的关键基因座(Arvidson和Tegmark，2001)，它们似乎不调节LPXTGp5的表达，根据单敲除株(agr-，sar-)的提取物的结果，相对于用野生型株获得的结果，显示类似的130-kDa带的染色强度(数据未显示)。

实施例4.筛选和发展LPXTGp5-触珠蛋白相互作用抑制剂的试验

4/A.使用重组LPXTGp5蛋白的基于ELISA的体外测定

发展了一种基于ELISA的测定，其使用触珠蛋白作为包被试剂(10μg/ml，在包被缓冲液中)，GST-D1和GST-D2作为结合配偶体。Hp-D1与-D2的相互作用用生物素标记的抗GST mAbs(cat# ab6648，Abcam)和链霉抗生物素蛋白-HRPO(cat# 1089153，Roche)检测。含量升高的D1和D2导致更高的OD读数，直到在大约250pmol时达到饱和水平。相同摩尔含量(根据实际分子量校正)的GST相对于背景不产生可检测的信号(图9)。这些结果进一步支持LPXTGp5内Hp结合的定位。这也提供了一种筛选LPXTGp5与Hp相互作用抑制剂的容易、可能的高通量测定。

4/B.使用活金黄色葡萄球菌细胞的基于FACS的体外测定

纯化的触珠蛋白用生物素标记(10∶1生物素与触珠蛋白比)，并以逐渐升高的浓度加入活的野生型和fur突变金黄色葡萄球菌细胞中，该细胞在含或不含作为铁源的25μM FeCl₃的RPMI培养基中培养。利用链霉抗生物素蛋白-FITC(cat# F0422，DAKO)作为第二试剂检测触珠蛋白的结合，通过FACS定量分析。在允许LPXTGp5表达的条件下培养的金黄色葡萄球菌的表面染色证实了触珠蛋白的显著结合(图10A)。使用在富含铁的培养基中培养的金黄色葡萄球菌，无法检测到触珠蛋白的结合(图10B)，这与使用抗LPXTGp5抗体的免疫印迹上信号的缺乏相一致。重要的是，无论环境中的铁浓度如何均过量表达LPXTGp5的fur突变体显示最明显的触珠蛋白结合(图10C，D)。为了检验配体与LPX-TGp5结合的特异性，也在重组GST-D1结构域的存在下添加触珠蛋白。提高GST-D1的摩尔过量可以以浓度依赖的方式降低用触珠蛋白实现的表面染色。9倍过量的GST-D1已经使触珠蛋白的结合几乎降低到背景水平，而相同摩尔过量的GST不显著影响结合(图11)。该竞争实验强烈提示，存在一种葡萄球菌触珠蛋白受体，触珠蛋白结合功能不是多余的。因此，破坏剂，无论是抗体、模拟位还是中断触珠蛋白-LPXTGp5相互作用的小药物，都可能对Hp-金黄色葡萄球菌的相互作用有害。

实施例5.金黄色葡萄球菌对来自Hp-Hb复合物的铁的应用

在人体内生长的金黄色葡萄球菌不得不从体内，即从宿主的铁结合蛋白中“窃取”铁。最丰富的含铁蛋白质是血红蛋白(Hb)。由于细胞外血红蛋白立即被触珠蛋白复合，实际上是Hp-Hb复合物，它是血浆中的铁源之一。检测在铁耗尽的RPMI培养基中生长的金黄色葡萄球菌8325-4株在体外利用来自Hp-Hb复合物的铁的能力。只加入触珠蛋白和只加入血红蛋白作为阴性对照，FeCl₃作为生长增加的阳性对照。金黄色葡萄球菌的生长在复合物存在下受到刺激，提示铁的获取通过Hp-Hb复合物(图12)。

实施例6：一种LPXTGp5插入灭活突变体的构建

为了研究LPXTGp5的作用，制备了一种插入灭活的LPXTG-p5突变体。使用在引物上分别添加SalI、KpnI、KpnI和EcoRI限制酶切位点的基因特异性引物，通过PCR扩增LPXTGp5开放阅读框的1kb 5′和3′侧翼区，构建一种用于破坏LPXTGp5的质粒。PCR产物用SalI-KpnI和KpnI-EcoRI酶切，克隆到用SalI-EcoRI酶切的pAUL-A载体中，在大肠杆菌DH10B中产生质粒pAUL-AD。使用掺入KpnI限制位点的MOL1317和MOL1318引物，由pDG1513扩增1.5kb四环素抗性盒。含有四环素抗性盒的KpnI片段去磷酸化，克隆到去磷酸化的pAUL-AD的KpnI位点内，在大肠杆菌DH10B中产生pAD02。通过电穿孔用pAD02的质粒DNA(50μg)转化金黄色葡萄球菌RN4220，在质粒复制的许可温度(30℃)下鉴定红霉素抗性转化子。通过将温度转变为42℃选择单交换Campbell-型染色体插入，而在四环素上筛选。使用LPXTGp5内部引物通过PCR证实克隆02中灭活的和完整拷贝的LPXTGp5的存在。02的噬菌体裂解物由Φ11原种制备，转导金黄色葡萄球菌8325-4，在四环素平板上筛选。检测所有回收的转导子的红霉素和林可霉素敏感性。使用LPXTGp5内部引物通过PCR证实，并且用四环素和LPXTGp5 N端片段作为探针通过Southern印迹分析证实LPXTGp5∷Tc标记向这些转导子47之一的金黄色葡萄球菌染色体内的成功整合。Southern印迹法按照标准程序进行，按照厂商说明用PCRIDG探针合成试剂盒(Roche)制备的DNA探针发出信号。简言之，在转移后，膜在高严格条件下预杂交和杂交(DIG Easy Hyb溶液，42℃)。用低严格缓冲液(2×SSC+0.1％SDS)洗涤两次，用高严格缓冲液(0.5×SSC+0.1％SDS)洗涤两次。这些杂交条件可以检测与根据试剂盒所带厂商手册的探针＞80％同源性的基因。Southern印迹分析证实野生型株中存在LPXTGp5基因，而在敲除株中不存在。在这些条件下，探针也检测一条在两个菌株中都存在的对应于LPXTGp6的带。

实施例7：HarA偏好结合触珠蛋白-血红蛋白复合物

触珠蛋白的主要生理作用是复合血浆中的细胞外血红蛋白。假定该相互作用有极高的亲和力，触珠蛋白捕获释放的血红蛋白几乎是同时发生。为了解决当HarA与血红蛋白结合时是否能够识别触珠蛋白为一种配体的问题，我们使用rHarA以及HarA-D1和HarA-D2结构域蛋白进行了体外结合研究。在这些测定中，通过包被ELISA板固定蛋白质，然后加入含量逐渐提高的触珠蛋白、触珠蛋白-血红蛋白复合物和血红蛋白，用抗触珠蛋白或抗血红蛋白单克隆抗体检测信号。触珠蛋白与血红蛋白之间有效复合物的形成通过非变性凝胶分析证实(图14A)。通过比较相同摩尔含量的不同配体产生的信号强度，我们检测到触珠蛋白-血红蛋白复合物的结合显著高于触珠蛋白。在低配体浓度下较高水平的结合暗示较高的亲和相互作用，使用全长HarA以及结构域蛋白质是明显的(图14B和C，上图)。重要的是，增强的复合物的结合不是HarA结构域与血红蛋白高亲和力相互作用的结果，尽管我们也能够证明Hb的直接结合(图14C，下图)。当我们使用配体蛋白包被并且使用GST标记结构域蛋白检测时，在结合测定中获得非常相同的结果(数据未显示)。这些数据提示，触珠蛋白和血红蛋白都能够被HarA结构域识别为结合配偶体，其亲和力低于Hp-Hb复合物。然而，假定血浆中游离血红蛋白的浓度极低，生理相关的相互作用似乎介于HarA与触珠蛋白-血红蛋白复合物之间，以及与丰富的触珠蛋白之间。

图例

图1(A)LPXTGp5是一种典型的革兰氏阳性细胞壁蛋白质，在N端含有信号肽(SP)，在C端含有胞外域和LPXTG细胞分类信号，之后是一个疏水距膜域(TM)和带正电的尾(++)。在该蛋白质的细胞外部分内鉴定了两个高度同源的结构域(D1、D2)。(B)显示了LPXTGp5/SA1552/结构域与其它金黄色葡萄球菌蛋白质LPXTGp6/SA0976/和LPXTGp7/SA0977/之间二级结构的相似性。

图2(A)重组LPXTGp5的考马斯蓝染色的10％SDS-PAGE凝胶。第1道——分子量标准，第2道——BSA(2mg/mL)，第3道——BSA(1mg/mL)，第4道——LPXTGp5。(B)重组LPXTGp5与分离的抗LPXTGp5抗体的免疫印迹。(C)用ELISA测定的人血清抗LPXTGp5抗体滴度(上图)与rLPXTGp5的免疫印迹信号(下图)相比较。

图3利用标准ELISA测定的健康供体(实心灰色圆形)和金黄色葡萄球菌感染患者(血液感染——空心菱形，创伤感染——实心正方形，其它感染——实心三角形)的抗LPXTGp5 IgG滴度。

图4利用标准ELISA测定的健康非携带者(灰色实心圆形)、鼻携带者(黑色实心圆形)和金黄色葡萄球菌感染患者(血液感染——空心菱形，创伤感染——实心正方形，其它感染——实心三角形)的抗D1(A)和抗D2(B)IgG抗体滴度。

图5考马斯蓝染色的2D电泳凝胶。IgG耗尽的人血浆与20μg重组LPXTGp5蛋白结合。特异性结合配偶体用100μl样品缓冲液-9M尿素，4％CHAPS，100mM DTT，0.5％SDS洗脱。与LPXTGp5结合的血浆蛋白质偶联：Stretpactin琼脂糖(A)、单独的Streptactin琼脂糖(B)、纯化的StrepII标记的rLPXTGp5(C)，IgG耗尽的人血浆(D)。

图6将在RPMI中生长至对数期的8325-4 spa-细胞的金黄色葡萄球菌裂解物加到通过将生物素标记的触珠蛋白固定到链霉抗生物素蛋白基质上制成的亲和柱上。裂解蛋白质与链霉抗生物素蛋白珠的非特异性结合被认为是背景(第4道)。使用人抗LPXTGp5抗体的免疫印迹显示，从Hp-链霉抗生物素蛋白柱上洗脱的天然LPXTGp5(第3道)是触珠蛋白的一种结合配偶体。用重组LPXTGp5(第1道)和金黄色葡萄球菌8325-4spa-裂解物(第2道)作为免疫印迹的阳性对照。

图7金黄色葡萄球菌野生型(8325-4)株在RPMI 1640或脑心浸液(BHI)培养基中培养，生长到所述的OD_600nm。通过溶葡萄球菌素消化和超声处理制备总细菌裂解物。20μg总蛋白质加样到7.5％聚丙酰胺凝胶上。利用半干系统将电泳分离的蛋白质转移到Hybond ECL膜上。该膜用亲和纯化的人抗LPXTGp5 IgG探针杂交，用ECL检测系统检测信号。

图8(A)已知的Fur盒核苷酸序列与推断的位于LPXTGp5基因上游的Fur盒的比较。(B)在不同培养基(RPMI、RPMI+FeCl₃)上培养后，从野生型8325-4(wt)和fur突变(fur-)株分离的金黄色葡萄球菌总裂解物的免疫印迹分析。将10μg总蛋白质加样到7.5％聚丙烯酰胺凝胶上。利用半干系统将电泳分离的蛋白质转移到ECL膜上。该膜用亲和纯化的抗LPXTGp5 IgG探针杂交，用ECL检测系统检测信号。

图9在基于ELISA的测定中进行触珠蛋白与GST-D1和GST-D2的结合。Polysorb ELISA板用触珠蛋白包被，然后加入浓度逐渐增加的GST-D1、GST-D2和单独的GST作为阴性对照。用生物素标记的抗GST mAb和链霉抗生物素蛋白-HRPO检测特异性信号。

图10利用基于FACS的测定法检测触珠蛋白与金黄色葡萄球菌细胞的结合。生物素标记的Hp(30μg、12.5μg、5μg)与在RPMI(A，C)或补充25μM FeCl₃的RPMI(B，D)中培养的5×10⁶金黄色葡萄球菌野生型8325-4株(A，B)或fur-(C，D)在室温下温育30分钟。洗涤后，加入链霉抗生物素蛋白-FITC，在室温下30分钟，然后用2％Pfa固定细胞，用FACScan分析样品。对照细胞的荧光强度(灰色)与结合30μg Hp(1)、12.5μg Hp(2)和5μg Hp(3)的细胞的荧光相比较。

图11利用基于FACS的测定法检测触珠蛋白与金黄色葡萄球菌细胞的结合。12.5μg单独的生物素标记的Hp(1)或与9倍摩尔过量的D1-GST(2)或与GST(2)的复合物与在RPMI中生长的5×10⁶金黄色葡萄球菌细胞(野生型8325-4株)在室温下温育30分钟。洗涤后加入链霉抗生物素蛋白-FITC，在室温下30分钟，然后用2％Pfa固定细胞，用FACScan分析样品。

图12利用基于FACS的测定比较触珠蛋白与金黄色葡萄球菌8325-4野生型株(wt)、LPXTGp5敲除株(LPXTGp5 KO)的结合。生物素标记的Hp(20μg，，5μg)或与在RPMI(A，C，D)或在补充25μM FeCl₃的RPMI(B)中生长的5×10⁶金黄色葡萄球菌细胞(野生型8325-4株)(A，B)、LPXTGp5 KO(C)或fur-(D)在室温下温育30分钟。洗涤后加入链霉抗生物素蛋白-FITC，在室温下30分钟，然后用2％Pfa固定细胞，用FACScan分析样品。对照细胞的荧光强度(灰色)与结合20μg Hp(1)和5μg Hp(2)的细胞的荧光相比较。

图13在含有不同铁源的培养基中的生长率。金黄色葡萄球菌野生型8325-4细胞在耗尽铁的RPMI培养基(空心圆形)或重新补充25mMFeCl₃的培养基(实心圆形)中培养，含有1mM Hp(空心三角形，虚线)，含有0.5mM Hb(实心三角形，虚线)，含有Hp∶Hb复合物(空心三角形，实线)。在指定的时间点，测量细菌培养物的OD_600nm。

图14 HarA结合触珠蛋白-血红蛋白复合物。A.通过触珠蛋白(Hp)和血红蛋白(Hb)以1∶1的摩尔比温育，形成触珠蛋白-血红蛋白复合物(Hp-Hb)，用CBB染色的非变性PAGE凝胶显示。B.在基于ELISA的测定中，将纯化的触珠蛋白(●)和血红蛋白(■)的结合与触珠蛋白-血红蛋白复合物的结合(▲)相比较，其中使用重组HarA作为包被试剂，抗触珠蛋白mAb作为检测试剂。C.GST-D1(填充的符号)和GST-D2(空心符号)蛋白质包被ELISA板，以逐渐升高的含量添加Hp、Hb和Hp-Hb复合物(如B所示)。用单克隆抗触珠蛋白(上图)或抗血红蛋白抗体(下图)检测信号。

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序列表

<110>Intercell AG

<120>治疗葡萄球菌感染的药物

<130>R 41506

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2685

<212>DNA

<213>金黄色葡萄球菌

<400>1

atgaacaaac atcacccaaa attaaggtct ttctattcta ttagaaaatc aactctaggc     60

gttgcatcgg tcattgtcag tacactattt ttaattactt ctcaacatca agcacaagca    120

gcagaaaata caaatacttc agataaaatc tcggaaaatc aaaataataa tgcaactaca    180

actcagccac ctaaggatac aaatcaaaca caacctgcta cgcaaccagc aaacactgcg    240

aaaaactatc ctgcagcgga tgaatcactt aaagatgcaa ttaaagatcc tgcattagaa    300

aataaagaac atgatatagg tccaagagaa caagtcaatt tccagttatt agataaaaac    360

aatgaaacgc agtactatca ctttttcagc atcaaagatc cagcagatgt gtattacact    420

aaaaagaaag cagaagttga attagacatc aatactgctt caacatggaa gaagtttgaa    480

gtctatgaaa acaatcaaaa attgccagtg agacttgtat catatagtcc tgtaccagaa    540

gaccatgcct atattcgatt cccagtttca gatggcacac aagaattgaa aattgtttct    600

tcgactcaaa ttgatgatgg agaagaaaca aattatgatt atactaaatt agtatttgct    660

aaacctattt ataacgatcc ttcacttgta aaatcagata caaatgatgc agtagtaacg    720

aatgatcaat caagttcagt cgcaagtaat caaacaaaca cgaatacatc taatcaaaat    780

acatcaacga tcaacaatgc taataatcaa ccgcaggcaa cgaccaatat gagtcaacct    840

gcacaaccaa aatcgtcaac gaatgcagat caagcgtcaa gccaaccagc tcatgaaaca    900

aattctaatg gtaatactaa cgataaaacg aatgagtcaa gtaatcagtc ggatgttaat    960

caacagtatc caccagcaga tgaatcacta caagatgcaa ttaaaaaccc ggctatcatc   1020

gataaagaac atacagctga taattggcga ccaattgatt ttcaaatgaa aaatgataaa   1080

ggtgaaagac agttctatca ttatgctagt actgttgaac cagcaactgt catttttaca   1140

aaaacaggac caataattga attaggttta aagacagctt caacatggaa gaaatttgaa   1200

gtttatgaag gtgacaaaaa gttaccagtc gaattagtat catatgattc tgataaagat   1260

tatgcctata ttcgtttccc agtatctaat ggtacgagag aagttaaaat tgtgtcatct   1320

attgaatatg gtgagaacat ccatgaagac tatgattata cgctaatggt ctttgcacag   1380

cctattacta ataacccaga cgactatgtg gatgaagaaa catacaattt acaaaaatta   1440

ttagctccgt atcacaaagc taaaacgtta gaaagacaag tttatgaatt agaaaaatta   1500

caagagaaat tgccagaaaa atataaggcg gaatataaaa agaaattaga tcaaactaga   1560

gtagagttag ctgatcaagt taaatcagca gtgacggaat ttgaaaatgt tacacctaca   1620

aatgatcaat taacagattt acaagaagcg cattttgttg tttttgaaag tgaagaaaat   1680

agtgagtcag ttatggacgg ctttgttgaa catccattct atacagcaac tttaaatggt   1740

caaaaatatg tagtgatgaa aacaaaggat gacagttact ggaaagattt aattgtagaa   1800

ggtaaacgtg tcactactgt ttctaaagat cctaaaaata attctagaac gctgattttc   1860

ccatatatac ctgacaaagc agtttacaat gcgattgtta aagtcgttgt ggcaaacatt   1920

ggttatgaag gtcaatatca tgtcagaatt ataaatcagg atatcaatac aaaagatgat   1980

gatacatcac aaaataacac gagtgaaccg ctaaatgtac aaacaggaca agaaggtaag   2040

gttgctgata cagatgtagc tgaaaatagc agcactgcaa caaatcctaa agatgcgtct   2100

gataaagcag atgtgataga accagagtct gacgtggtta aagatgctga taataatatt   2160

gataaagatg tgcaacatga tgttgatcat ttatccgata tgtcggataa taatcacttc   2220

gataaatatg atttaaaaga aatggatact caaattgcca aagatactga tagaaatgtg   2280

gataaagatg ccgataatag cgttggtatg tcatctaatg tcgatactga taaagactct   2340

aataaaaata aagacaaagt catacagctg aatcatattg ccgataaaaa taatcatact   2400

ggaaaagcag caaagcttga cgtagtgaaa caaaattata ataatacaga caaagttact   2460

gacaaaaaaa caactgaaca tctgccgagt gatattcata aaactgtaga taaaacagtg   2520

aaaacaaaag aaaaagccgg cacaccatcg aaagaaaaca aacttagtca atctaaaatg   2580

ctaccaaaaa ctggagaaac aacttcaagc caatcatggt ggggcttata tgcgttatta   2640

ggtatgttag ctttattcat tcctaaattc agaaaagaat ctaaa                   2685

<210>2

<211>895

<212>PRT

<213>金黄色葡萄球菌

<400>2

Met Asn Lys His His Pro Lys Leu Arg Ser Phe Tyr Ser Ile Arg Lys

1               5                   10                  15

Ser Thr Leu Gly Val Ala Ser Val Ile Val Ser Thr Leu Phe Leu Ile

            20                  25                  30

Thr Ser Gln His Gln Ala Gln Ala Ala Glu Asn Thr Asn Thr Ser Asp

        35                  40                  45

Lys Ile Ser Glu Asn Gln Asn Asn Asn Ala Thr Thr Thr Gln Pro Pro

    50                  55                  60

Lys Asp Thr Asn Gln Thr Gln Pro Ala Thr Gln Pro Ala Asn Thr Ala

65                  70                  75                  80

Lys Asn Tyr Rro Ala Ala Asp Glu Ser Leu Lys Asp Ala Ile Lys Asp

                85                  90                  95

Pro Ala Leu Glu Asn Lys Glu His Asp Ile Gly Pro Arg Glu Gln Val

            100                 105                 110

Asn Phe Gln Leu Leu Asp Lys Asn Asn Glu Thr Gln Tyr Tyr His Phe

        115                 120                 125

Phe Ser Ile Lys Asp Pro Ala Asp Val Tyr Tyr Thr Lys Lys Lys Ala

    130                 135                 140

Glu Val Glu Leu Asp Ile Asn Thr Ala Ser Thr Trp Lys Lys Phe Glu

145                 150                 155                 160

Val Tyr Glu Asn Asn Gln Lys Leu Pro Val Arg Leu Val Ser Tyr Ser

                165                 170                 175

Pro Val Pro Glu Asp His Ala Tyr Ile Arg Phe Pro Val Ser Asp Gly

            180                 185                 190

Thr Gln Glu Leu Lys Ile Val Ser Ser Thr Gln Ile Asp Asp Gly Glu

        195                 200                 205

Glu Thr Asn Tyr Asp Tyr Thr Lys Leu Val Phe Ala Lys Pro Ile Tyr

    210                 215                 220

Asn Asp Pro Ser Leu Val Lys Ser Asp Thr Asn Asp Ala Val Val Thr

225                 230                 235                 240

Asn Asp Gln Ser Ser Ser Val Ala Ser Asn Gln Thr Asn Thr Asn Thr

                245                 250                 255

Ser Asn Gln Asn Thr Ser Thr Ile Asn Asn Ala Asn Asn Gln Pro Gln

            260                 265                 270

Ala Thr Thr Asn Met Ser Gln Pro Ala Gln Pro Lys Ser Ser Thr Asn

        275                 280                 285

Ala Asp Gln Ala Ser Ser Gln Pro Ala His Glu Thr Asn Ser Asn Gly

    290                 295                 300

Asn Thr Asn Asp Lys Thr Asn Glu Ser Ser Asn Gln Ser Asp Val Asn

305                 310                 315                 320

Gln Gln Tyr Pro Pro Ala Asp Glu Ser Leu Gln Asp Ala Ile Lys Asn

                325                 330                 335

Pro Ala Ile Ile Asp Lys Glu His Thr Ala Asp Asn Trp Arg Pro Ile

            340                 345                 350

Asp Phe Gln Met Lys Asn Asp Lys Gly Glu Arg Gln Phe Tyr His Tyr

        355                 360                 365

Ala Ser Thr Val Glu Pro Ala Thr Val Ile Phe Thr Lys Thr Gly Pro

    370                 375                 380

Ile Ile Glu Leu Gly Leu Lys Thr Ala Ser Thr Trp Lys Lys Phe Glu

385                 390                 395                 400

Val Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Val Glu Leu Val Ser Tyr Asp

                405                 410                 415

Ser Asp Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Pro Val Ser Asn Gly Thr

            420                 425                 430

Arg Glu Val Lys Ile Val Ser Ser Ile Glu Tyr Gly Glu Asn Ile His

        435                 440                 445

Glu Asp Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Val Phe Ala Gln Pro Ile Thr Asn

    450                 455                 460

Asn Pro Asp Asp Tyr Val Asp Glu Glu Thr Tyr Asn Leu Gln Lys Leu

465                 470                 475                 480

Leu Ala Pro Tyr His Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu

                485                 490                 495

Leu Glu Lys Leu Gln Glu Lys Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Ala Glu Tyr

            500                 505                 510

Lys Lys Lys Leu Asp Gln Thr Arg Val Glu Leu Ala Asp Gln Val Lys

        515                 520                 525

Ser Ala Val Thr Glu Phe Glu Asn Val Thr Pro Thr Asn Asp Gln Leu

    530                 535                 540

Thr Asp Leu Gln Glu Ala His Phe Val Val Phe Glu Ser Glu Glu Asn

545                 550                 555                 560

Ser Glu Ser Val Met Asp Gly Phe Val Glu His Pro Phe Tyr Thr Ala

                565                 570                 575

Thr Leu Asn Gly Gln Lys Tyr Val Val Met Lys Thr Lys Asp Asp Ser

            580                 585                 590

Tyr Trp Lys Asp Leu Ile Val Glu Gly Lys Arg Val Thr Thr Val Ser

        595                 600                 605

Lys Asp Pro Lys Asn Asn Ser Arg Thr Leu Ile Phe Pro Tyr Ile Pro

    610                 615                 620

Asp Lys Ala Val Tyr Asn Ala Ile Val Lys Val Val Val Ala Asn Ile

625                 630                 635                 640

Gly Tyr Glu Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Ile Asn Gln Asp Ile Asn

                645                 650                 655

Thr Lys Asp Asp Asp Thr Ser Gln Asn Asn Thr Ser Glu Pro Leu Asn

            660                 665                 670

Val Gln Thr Gly Gln Glu Gly Lys Val Ala Asp Thr Asp Val Ala Glu

        675                 680                 685

Asn Ser Ser Thr Ala Thr Asn Pro Lys Asp Ala Ser Asp Lys Ala Asp

    690                 695                 700

Val Ile Glu Pro Glu Ser Asp Val Val Lys Asp Ala Asp Asn Asn Ile

705                 710                 715                 720

Asp Lys Asp Val Gln His Asp Val Asp His Leu Ser Asp Met Ser Asp

                725                 730                 735

Asn Asn His Phe Asp Lys Tyr Asp Leu Lys Glu Met Asp Thr Gln Ile

            740                 745                 750

Ala Lys Asp Thr Asp Arg Asn Val Asp Lys Asp Ala Asp Asn Ser Val

        755                 760                 765

Gly Met Ser Ser Asn Val Asp Thr Asp Lys Asp Ser Asn Lys Asn Lys

    770                 775                 780

Asp Lys Val Ile Gln Leu Asn His Ile Ala Asp Lys Asn Asn His Thr

785                 790                 795                 800

Gly Lys Ala Ala Lys Leu Asp Val Val Lys Gln Asn Tyr Asn Asn Thr

                805                 810                 815

Asp Lys Val Thr Asp Lys Lys Thr Thr Glu His Leu Pro Ser Asp Ile

            820                 825                 830

His Lys Thr Val Asp Lys Thr Val Lys Thr Lys Glu Lys Ala Gly Thr

        835                 840                 845

Pro Ser Lys Glu Asn Lys Leu Ser Gln Ser Lys Met Leu Pro Lys Thr

    850                 855                 860

Gly Glu Thr Thr Ser Ser Gln Ser Trp Trp Gly Leu Tyr Ala Leu Leu

865                 870                 875                 880

Gly Met Leu Ala Leu Phe Ile Pro Lys Phe Arg Lys Glu Ser Lys

                885                 890                 895

<210>3

<211>431

<212>DNA

<213>金黄色葡萄球菌

<400>3

gcggatgaat cacttaaaga tgcaattaaa gatcctgcat tagaaaataa agaacatgat     60

ataggtccaa gagaacaagt caatttccag ttattagata aaaacaatga aacgcagtac    120

tatcactttt tcagcatcaa agatccagca gatgtgtatt acactaaaaa gaaagcagaa    180

gttgaattag acatcaatac tgcttcaaca tggaagaagt ttgaagtcta tgaaaacaat    240

caaaaattgc cagtgagact tgtatcatat agtcctgtac cagaagacca tgcctatatt    300

cgattcccag tttcagatgg cacacaagaa ttgaaaattg tttcttcgac tcaaattgat    360

gatggagaag aaacaaatta tgattatact aaattagtat ttgctaaacc tatttataac    420

gatccttcac t                                                         431

<210>4

<211>144

<212>PRT

<213>金黄色葡萄球菌

<400>4

Ala Asp Glu Ser Leu Lys Asp Ala Ile Lys Asp Pro Ala Leu Glu Asn

1               5                   10                  15

Lys Glu His Asp Ile Gly Pro Arg Glu Gln Val Asn Phe Gln Leu Leu

            20                  25                  30

Asp Lys Asn Asn Glu Thr Gln Tyr Tyr His Phe Phe Ser Ile Lys Asp

        35                  40                  45

Pro Ala Asp Val Tyr Tyr Thr Lys Lys Lys Ala Glu Val Glu Leu Asp

    50                  55                  60

Ile Asn Thr Ala Ser Thr Trp Lys Lys Phe Glu Val Tyr Glu Asn Asn

65                  70                  75                  80

Gln Lys Leu pro Val Arg Leu Val Ser Tyr Ser Pro Val Pro Glu Asp

                85                  90                  95

His Ala Tyr Ile Arg Phe Pro Val Ser Asp Gly Thr Gln Glu Leu Lys

            100                 105                 110

Ile Val Ser Ser Thr Gln Ile Asp Asp Gly Glu Glu Thr Asn Tyr Asp

        115                 120                 125

Tyr Thr Lys Leu Val Phe Ala Lys Pro Ile Tyr Asn Asp Pro Ser Leu

    130                 135                 140

<210>5

<211>429

<212>DNA

<213>金黄色葡萄球菌

<400>5

gcagatgaat cactacaaga tgcaattaaa aacccggcta tcatcgataa agaacataca     60

gctgataatt ggcgaccaat tgattttcaa atgaaaaatg ataaaggtga aagacagttc    120

tatcattatg ctagtactgt tgaaccagca actgtcattt ttacaaaaac aggaccaata    180

attgaattag gtttaaagac agcttcaaca tggaagaaat ttgaagttta tgaaggtgac    240

aaaaagttac cagtcgaatt agtatcatat gattctgata aagattatgc ctatattcgt    300

ttcccagtat ctaatggtac gagagaagtt aaaattgtgt catctattga atatggtgag    360

aacatccatg aagactatga ttatacgcta atggtctttg cacagcctat tactaataac    420

ccagacgac                                                            429

<210>6

<211>143

<212>PRT

<213>金黄色葡萄球菌

<400>6

Ala Asp Glu Ser Leu Gln Asp Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Ile Asp

1               5                   10                  15

Lys Glu His Thr Ala Asp Asn Trp Arg Pro Ile Asp Phe Gln Met Lys

            20                  25                  30

Asn Asp Lys Gly Glu Arg Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser Thr Val Glu

        35                  40                  45

Pro Ala Thr Val Ile Phe Thr Lys Thr Gly Pro Ile Ile Glu Leu Gly

    50                  55                  60

Leu Lys Thr Ala Ser Thr Trp Lys Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly Asp

65                  70                  75                  80

Iys Lys Leu Pro Val Glu Leu Val Ser Tyr Asp Ser Asp Lys Asp Tyr

                85                  90                  95

Ala Tyr Ile Arg Phe Pro Val Ser Asn Gly Thr Arg Glu Val Lys Ile

            100                 105                 110

Val Ser Ser Ile Glu Tyr Gly Glu Asn Ile His Glu Asp Tyr Asp Tyr

        115                 120                 125

Thr Leu Met Val Phe Ala Gln Pro Ile Thr Asn Asn Pro Asp Asp

    130                 135                 140

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>金黄色葡萄球菌

<400>7

gatattgata attattatc                                                  19

Claims (17)

1.与触珠蛋白受体或配体结合相互作用的分子在制备预防和治疗葡萄球菌感染的药物中的用途。

2.根据权利要求1的用途，其特征在于所述分子破坏触珠蛋白受体配体结合。

3.根据权利要求1或2的用途，其特征在于所述分子选自：触珠蛋白受体抗体，与根据SEQ ID No.2的肽结合的触珠蛋白模拟位，其它的触珠蛋白受体，或其片段。

4.根据权利要求3的用途，其特征在于触珠蛋白受体抗体或触珠蛋白模拟位结合于一种选自SEQ ID No.4或SEQ ID No.6或其片段的肽。

5.根据权利要求1或2的用途，其特征在于所述分子是一种反义核酸，它结合触珠蛋白受体基因或触珠蛋白受体基因表达的调节元件，特别是根据SEQ ID No.7的Fur盒。

6.根据权利要求5的用途，其特征在于所述分子是一种抑制化合物，它结合根据SEQ ID No.7的Fur盒。

7.一种核酸分子，它在严格条件下可与具有根据SEQ ID No.7的序列的核酸分子杂交。

8.分离的多核苷酸，其含有选自SEQ ID No.3和SEQ ID No.5的核酸序列。

9.分离的多肽，其含有选自SEQ ID No.4和SEQ ID No.6的多肽序列。

10.合成偶联物，其含有根据SEQ ID No.4的肽，该肽通过非天然存在的接头与根据SEQ ID No.6的肽连接。

11.根据权利要求10的合成偶联物，其特征在于所述非天然存在的接头是多肽。

12.分离与触珠蛋白受体配体结合相互作用的分子的方法，其特征在于下列步骤：

-在固体表面上提供触珠蛋白受体多肽或其触珠蛋白结合片段，

-使标记的触珠蛋白结合于该固定的触珠蛋白受体多肽或其触珠蛋白结合片段，形成固定的触珠蛋白受体多肽或其触珠蛋白结合片段与标记的触珠蛋白的复合物，

-使这种复合物接触含有候选分子的库，

-确定该库中替代该复合物中的标记触珠蛋白的分子，和

-分离替代该复合物中所述标记触珠蛋白的所述分子。

13.分离与触珠蛋白受体配体结合相互作用的分子的方法，其特征在于下列步骤：

-提供固定于固体表面上的触珠蛋白，

-使标记的触珠蛋白受体多肽或其触珠蛋白结合片段与所述固定的触珠蛋白结合，形成固定的触珠蛋白与标记的触珠蛋白受体多肽或其触珠蛋白结合片段的复合物，

-使该复合物接触含有候选分子的库，

-确定该库中替代该复合物中的标记触珠蛋白受体多肽或其触珠蛋白结合片段，并与固定的触珠蛋白结合的分子，

-分离该库中与固定的触珠蛋白结合的所述分子。

14.分离与触珠蛋白受体配体结合相互作用的分子的方法，其特征在于下列步骤：

-提供候选分子库，

-从该库中提取并分离与固定的触珠蛋白受体或其触珠蛋白结合片段结合的分子，

-从该库中提取并分离与固定的触珠蛋白结合的分子，

-使其余的候选分子库接触触珠蛋白与触珠蛋白受体或其触珠蛋白结合片段形成的固定的复合物，

-分离与所述固定的复合物结合的分子。

15.根据权利要求12-14中任何一项的方法，其特征在于所述触珠蛋白结合片段选自SEQ ID No.4、SEQ ID No.6及其片段，或这些片段的组合。

16.根据权利要求12-15中任何一项的方法，其特征在于所述触珠蛋白受体是金黄色葡萄球菌触珠蛋白受体。

17.根据权利要求12-16中任何一项的方法，其特征在于所述触珠蛋白是人触珠蛋白。

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