CN101076599A

CN101076599A - 细菌中生物学活性蛋白质的表面表达

Info

Publication number: CN101076599A
Application number: CNA2004800081643A
Authority: CN
Inventors: 张家华; 刘晓文; J·A·莱维克; 徐强
Original assignee: Osel Inc
Current assignee: Osel Inc
Priority date: 2003-01-29
Filing date: 2004-01-28
Publication date: 2007-11-21
Also published as: EP1590443A4; WO2005012491A3; WO2005012491A2; EP1590443A2; JP2007503845A; US7754467B2; US20050003510A1

Abstract

本发明提供了将异源多肽靶向定位到细菌细胞壁上的方法和组合物。

Description

细菌中生物学活性蛋白质的表面表达

相关申请的交叉引用

本申请要求2003年1月29日提交的美国临时专利申请No.60/433,619的优先权，该申请全部包含在参考文献中。

联邦资助研发的发明权的声明

本发明受到政府支持，在国立健康研究所授权的基金No.2R44 AI46203-02)资助下完成。政府对本发明享有一定权利。

技术领域

与革兰氏阳性细菌的肽葡聚糖共价连接的蛋白质的表面表达涉及独特的分类信号和分选酶依赖机理(Mazmanian等著，Science 285：760-763(1999))。研究最充分的系统之一是化脓性链球菌的编码M6结构蛋白的emm6基因(Fischetti等著，1990，Mol.Microbiol.4：1603-1605(1990))。M6蛋白有一特征性细胞壁分类信号(Leu-Pro-X-Thr-Gly(LPXTG)基序)，其后是一段疏水性氨基酸的延伸段，最后是一段作为细胞表面保留信号的含有带电荷的残基序列(KRKEEN)。这些细胞壁分类基序也在其它革兰氏阳性菌：包括葡萄球菌、肠球菌、李斯特菌和乳杆菌(Navarre和Schneewind，Microbiol.Biol.Rev.63：174-229(1999))中鉴定到，但在寄居于人类阴道中的乳杆菌中未鉴定出。

所有人类的粘膜天然都由细菌寄居(Tannock.Clin.Rev.AllergyImmunol.22：231-53(2002))。近来的科学证据已证实这些细菌与附近的细胞和组织相互作用可调节天然的生物学过程。逐渐明确的是这种粘膜微生物群基本上与多种影响人类细胞和组织的疾病有关。

一般来说，阴道和胃肠道中的乳杆菌和相关细菌的微生物群对健康是有益的(Redondo-Lopez等著，Eev.Infect.Dis.12：856-72(1990)；Tannock.Clin.Rev.Allergy Immunol.22：231-53(2002))。将乳杆菌的天然菌株当作“前生命”来维持在这些部位中的健康的微生物群和预防感染已有多年。这些“健康细菌”能与病原生物(例如细菌、病毒和真菌)竞争，从而抑制病原体相关疾病的发生和发展。然而，由于健康微生物群可受到机会性感染相关的天然颠覆(turnover)和破坏(disruption)，这种微生物群是一种脆弱和动态的内环境。因此，维持甚至改善该微生物群的完整性和天然性质的方法，并将其作为预防或治疗疾病的工具是生物医学领域梦寐以求的。

粘膜微生物群阻挡了很多影响粘膜表面的局部疾病。例如，HIV和其它性传播病原体必须绕过阴道粘膜。此外，包括溃疡性结肠炎和Crohn病等的炎症性大肠疾病从病因学上讲可能是受到破坏的菌群与宿主细胞和组织之间发生不适当相互作用所致。调整粘膜菌群中细菌性质的方法可能有助于预防或治疗这些疾病和影响粘膜表面的相关病症。将生物学活性蛋白质靶向定位到这些细菌和其它生物的细胞壁上可以帮助治疗这些疾病。

本发明阐述了这些和其它的问题。

发明概述

本发明提供了含有一表达盒的乳杆菌属细菌，该表达盒含有一通过操作性连接于一段多聚核苷酸上的启动子。该段多聚核苷酸编码一信号序列和生物学活性多肽，其中所述的生物活性多肽与异源性羧基末端细胞壁靶向区域相连，而异源性羧基末端细胞壁靶向区域含有按以下顺序排列的序列：细胞壁相关序列、LPQ(S/A/T)(G/A)和疏水序列。

在一些实施例中，该细胞壁相关序列含有至少50个氨基酸。在一些实施例中，细胞壁相关序列含有至少200个氨基酸。在一些具体实施例中，异源性羧基末端细胞壁靶向区域在该区域的羧基末端还含有带电荷的序列。

在一些具体实施例中，乳杆菌属细菌是寄居在阴道的菌株。在一些具体实施例中，该细菌选自下组：简氏乳杆菌(L.jiensenii)、加氏乳杆菌(L.gassei)、干酪乳杆菌(L.casei)和卷曲乳杆菌(L.crispatus)。

在一些具体实施例中，该细胞壁靶向区域含有氨基酸序列LPQSG。在一些具体实施例中，该细胞壁靶向区域含有氨基酸序列LPQAG。在一些具体实施例中，该细胞壁靶向区域含有氨基酸序列LPQTG。在一些具体实施例中，细胞壁靶向区域含有氨基酸序列LPQTA。在一些具体实施例中，该细胞壁靶向区域含有SEQ NO：7。在一些具体实施例中，该细胞壁靶向区域含有SEQ NO：8。

在一些具体实施例中，该生物活性多肽表达在细菌的细胞壁上。在一些具体实施例中，该生物活性多肽在10到600个氨基酸残基之间。在一些具体实施例中，当该生物活性蛋白质与病原体接触时可与病原体结合。

在一些具体实施例中，病原体是细菌病原体。在一些具体实施例中，病原体是真菌病原体。在一些具体实施例中，病原体是病毒病原体。

在一些具体实施例中，病毒病原体是人免疫缺陷病毒(HIV)。在一些具体实施例中，该生物活性蛋白质是CD4或CD4的HIV结合片段。在一些具体实施例中，该生物活性蛋白质是2D-CD4。在一些具体实施例中，该生物活性蛋白质是蓝病毒素-N(cyanovirin-N)(CV-N)或CV-N的病毒结合片段。在一些具体实施例中，病毒病原体是单纯疱疹病毒。在一些具体实施例中，该生物活性蛋白质是单纯疱疹病毒进入介质C(HveC)或HveC的病毒结合片段。

在一些具体实施例中，该生物活性多肽可从乳杆菌属细菌中释放出来。在一些具体实施例中，该生物活性多肽锚定在乳杆菌属细菌的细胞壁上。

本发明也提供在乳杆菌属细菌的细胞壁上表达生物学活性多肽的方法。在一些具体实施例中，该方法包括提供含有一表达盒的乳杆菌属细菌，该表达盒含有一通过操作性连接于多聚核苷酸的启动子。该多聚核苷酸编码一信号序列和生物活性多肽，其中生物活性多肽与一异源性羧基末端细胞壁靶向区域相连，而此异源性羧基末端细胞壁靶向区域含有按以下顺序排列的序列：细胞壁相关序列、LPQ(S/A/T)(G/A)和疏水序列；并且在诱导该多肽表达的条件下培养该细菌，从而在乳杆菌属细菌的细胞壁上表达该生物活性多肽。

在一些具体实施例中，所述细胞壁相关序列含有至少50个氨基酸。在一些具体实施例中，所述细胞壁相关序列含有至少200个氨基酸。

在一些具体实施例中，所述异源性羧基末端细胞壁靶向区域可在该区域的羧基末端还含有带电荷的序列。在一些具体实施例中，所提供的步骤包括将表达盒转运进所述细菌。

在一些具体实施例中，该细胞壁靶向区域含有氨基酸序列LPQSG。在一些具体实施例中，该细胞壁靶向区域含有氨基酸序列LPQAG。在一些具体实施例中，该细胞壁靶向区域含有氨基酸序列LPQTG。在一些具体实施例中，该细胞壁靶向区域含有氨基酸序列LPQTA。在一些具体实施例中，该细胞壁靶向区域含有SEQ NO：7。在一些具体实施例中，细胞壁靶向区域含有SEQ NO：8。

在一些具体实施例中，该细胞壁靶向区域含有至少200个氨基酸。

在一些具体实施例中，该细菌是寄居在阴道的菌株。在一些具体实施例中，所述细菌选自：简氏乳杆菌、加氏乳杆菌、干酪乳杆菌和卷曲乳杆菌。在一些具体实施例中，该生物活性蛋白质在10到600个氨基酸之间。在一些具体实施例中，当该生物学活性蛋白质与病原体接触时可与病原体结合。

在一些具体实施例中，病毒病原体是人免疫缺陷病毒(HIV)。在一些具体实施例中，该生物活性蛋白质是CD4或CD4的HIV结合片段。在一些具体实施例中，该生物活性蛋白质是2D-CD4。在一些具体实施例中，该生物活性蛋白质是蓝病毒素-N(CV-N)或CV-N的病毒结合片段。在一些具体实施例中，病毒病原体是单纯疱疹病毒。在一些具体实施例中，生物学活性蛋白质是单纯疱疹病毒进入介质C(HveC)或HveC的病毒结合片段。

本发明也给出了在哺乳动物粘膜表面提供生物学活性蛋白质的方法。在一些具体实施例中，该方法包括使粘膜表面与重组改变的乳杆菌属细菌相接触，该细菌经重组转变可表达连接于生物活性多肽的信号序列；而该生物活性多肽连接于异源性羧基末端细胞壁靶向区域，而该异源性羧基末端细胞壁靶向区域含有按以下顺序排列的序列：细胞壁相关序列、LPQ(S/A/T)(G/A)和疏水序列，其中生物活性多肽的表达量要能在收集自粘膜表面的样品中检测到。

在一些具体实施例中，所述细胞壁相关序列含有至少50个氨基酸。在一些具体实施例中，所述细胞壁相关序列含有至少200个氨基酸。在一些具体实施例中，异源性羧基末端细胞壁靶向区域可在该区域的羧基末端还含有带电荷的序列。在一些具体实施例中，所述乳杆菌属细菌选自：简氏乳杆菌、加氏乳杆菌、干酪乳杆菌和卷曲乳杆菌。

在一些具体实施例中，粘膜表面是阴道内粘膜表面。在一些具体实施例中，粘膜表面是胃肠道内粘膜表面。

在一些具体实施例中，所述接触步骤包括经口给予乳杆菌属细菌。在一些具体实施例中，接触步骤包括经阴道给予乳杆菌属细菌。在一些具体实施例中，接触步骤包括经直肠给予乳杆菌属细菌。

本发明提供含有启动子的表达盒。其中所述启动子通过操作性连接于一段多聚核苷酸上。该段多聚核苷酸编码一信号序列和生物活性多肽，其中生物活性多肽与异源性羧基末端细胞壁靶向区域相连，而异源性羧基末端细胞壁靶向区域含有按下列顺序排列的序列：细胞壁相关序列、LPQ(S/A/T)(G/A)和疏水序列。在一些具体实施例中，细胞壁相关序列含有至少50个氨基酸。在一些具体实施例中，细胞壁相关序列含有至少200个氨基酸。

在一些具体实施例中，异源性羧基末端细胞壁靶向区域可在该区域的羧基末端还含有带电荷的序列。

在一些具体实施例中，该细胞壁靶向区域含有氨基酸序列LPQSG。在一些具体实施例中，该细胞壁靶向区域含有氨基酸序列LPQAG。在一些具体实施例中，该细胞壁靶向区域含有氨基酸序列LPQTG。在一些具体实施例中，该细胞壁靶向区域含有氨基酸序列LPQTA。在一些具体实施例中，该细胞壁靶向区域含有SEQ ID NO：7。在一些具体实施例中，该细胞壁靶向区域含有SEQ ID NO：8。在一些具体实施例中，该生物活性多肽表达在细菌的细胞壁中。在一些具体实施例中，该生物活性多肽在10到600个氨基酸残基之间。

在一些具体实施例中，当该生物活性蛋白质与病原体接触时可与病原体结合。在一些具体实施例中，病原体是细菌病原体。在一些具体实施例中，病原体是真菌病原体。在一些具体实施例中，病原体是病毒病原体。在一些具体实施例中，病毒病原体是HIV。

在一些具体实施例中，该生物活性蛋白质是CD4或CD4的HIV结合片段。在一些具体实施例中，该生物活性蛋白质是2D-CD4。在一些具体实施例中，该生物活性蛋白质是蓝病毒素-N(CV-N)或CV-N的病毒结合片段。在一些具体实施例中，该生物活性蛋白质是单纯疱疹病毒进入介质C(HveC)或HveC的病毒结合片段。在一些具体实施例中，细胞壁靶向区域能在乳杆菌属中起作用。

本发明也提供含有一表达盒的载体，该表达盒含有一通过操作性连接于多聚核苷酸的启动子。该多聚核苷酸编码一生物活性多肽，其中生物活性多肽与异源性羧基末端细胞壁靶向区域相连，而异源性羧基末端细胞壁靶向区域含有按以下顺序排列的序列：细胞壁相关序列、LPQ(S/A/T)(G/A)和疏水序列。

定义

“生物活性蛋白质”指在天然细胞内或细胞外具有生物学活性(即，能够参与分子机理)的氨基酸序列。蛋白质的活性包括其免疫原性、催化活性和结合亲和力等。多肽疫苗包括在术语“生物活性蛋白质”里。通常该氨基酸序列形成三维结构，是该氨基酸序列在天然细胞内或细胞外的形成的。

“2D CD4”指人CD4的大约前183个氨基酸(Arthos等著，Cell.1989.57：469-81(1989))。CD4是一种细胞表面糖蛋白，见于成熟的辅助性T细胞、未成熟的胸腺细胞、单核细胞和巨噬细胞上。2D-CD4结合HIV-1 gp120的亲和力与完整的蛋白质相同，并且含有gp120的结合位点。CD4含有氨基末端胞外结构域(氨基酸残基1到137)，跨膜区域(372到395)和细胞质尾区(396到433)。

“抗体”指基本上由一个或多个免疫球蛋白基因或其片段编码的，可特异性结合并识别分析物(抗原)的多肽。识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因和无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链的分类包括κ和λ。重链的分类包括γ、μ、α、δ和ε，进而决定了免疫球蛋白的分类，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

示范性的免疫球蛋白(抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体由两对同样的多肽链组成，每对有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。每条链的N-末端有一可变区域，该区约有100到110或更多的氨基酸，主要负责识别抗原。术语可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)分别指轻链和重链。

抗体可以是，例如完整的免疫球蛋白或经过各种肽酶消化产生的很多特征已清楚的片段。例如，胃蛋白酶在抗体铰链区二硫键下面消化可产生F(ab’)2，它是轻链经二硫键与V_H-C_H1相连接的二聚体。F(ab’)2可以在温和条件下被还原，打开铰链区的二硫键使F(ab’)2二聚体转变成Fab’单体。Fab’单体基本上是带有部分铰链区的Fab(见，Paul编.Fundamental Immunology，第三版，Raven出版社，NY(1993))。当将各种抗体片段定义为完整抗体经消化得到的片段时，技术人员知道可利用化学或重组DNA的方法来从头合成这些片段。因此，文中所用的术语抗体包括修饰完整抗体产生的，或利用重组DNA方法从头合成的抗体片段(例如，单链Fv)。

当将术语“分离的”应用于核酸或蛋白质时，表示该核酸或蛋白质基本上没有自然状态下与其相关的其它细胞成份。虽然它们是干燥状态或水溶液，但优选为匀质状态。纯度和均一性一般可用分析化学技术(例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法)测定。在一制品中某种蛋白质占优势就是基本纯的。具体说，某分离的基因是与开放性读码框中该基因两侧的编码其它蛋白质的基因相分离。术语“纯化的”指在凝胶电泳中基本上只产生一条区带的核酸或蛋白质。具体说，意味着该核酸或蛋白质是至少85％纯，优选至少95％纯，最优选至少99％纯的。

术语“核酸”或“多聚核苷酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其聚合物。除非特别限制，该术语包括含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，它们与参考的核酸有相似的结合性质并以天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除非另有指出，特定的核酸序列还包括其保守性修饰的变体(例如，简并性密码子替代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体地说，简并性密码子替代可用混基(mixed base)和/或脱氧肌苷残基取代产生序列(generating sequence)中一个或多个选择(或全部)的密码子的第三位置而获得(Batzer等著，Nucleic AcidRes.19：5081(1991)；Ohtsuka等著，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Rossolini等著，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。术语“核酸”与“多聚核苷酸”可互换使用。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”指氨基酸残基的聚合物，在本文可互换使用。这些术语也适用于有一个或多个氨基酸残基是对应于天然存在氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，也适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。本文使用的这些术语包括完整长度的蛋白质(即，抗原)在内的任何长度的氨基酸链，其中氨基酸残基由肽键共价连接。

术语“氨基酸”指天然的或合成的氨基酸，以及氨基酸类似物或与天然氨基酸功能类似的氨基酸模拟物。天然氨基酸和那些后修饰的氨基酸(例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐和磷酸丝氨酸)是由遗传密码子编码的。氨基酸类似物指具有与天然氨基酸相同的基本化学结构(即，连有氢原子的α碳、羰基、氨基和R基团)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜和甲硫氨酸甲基锍。这些类似物含有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然氨基酸一样的基本化学结构。“氨基酸模拟物”指那些化学结构与氨基酸的通常化学结构不同的化合物，但是它们基因与天然氨基酸类似的功能。

本文中，氨基酸可以采用公知的三字母码也可用IUPAC-IUB生化命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)所推荐的单字母码。核苷酸也可同样地采用它们通常接受的单字母码。

将两条核酸或多肽序列进行如下所述的排序对比来测试最大一致性，如果核苷酸或氨基酸残基的序列分别相同，就说这两条核酸或多肽序列“相同”的。当将两条或多条核酸或多肽序列在比较窗口进行排列对比测定最大一致性时，可用以下的序列比较算法之一或通过手工排列对比和目测来检测。在文中，当称两条或多条核酸或多肽序列“相同”或百分比“相同”是指两条或多条序列或亚序列是相同的或有一定百分比的氨基酸残基或核苷酸是相同的。当序列相同百分比用于指蛋白质或肽时，会注意到不相同的残基位置经常是因保守性氨基酸取代而不同，这些位置的氨基酸残基被具有类似化学性质(例如，带电荷荷或疏水性)的其它氨基酸残基取代，因此不改变该分子的功能性质。当序列的区别在于保守性取代时，由于取代的保守性质应上调序列的相同性百分比。进行这种调整的方法是本领域技术人员所熟知的。一般这包括给保守性替代评一部分分数而非完全错配，从而提高序列相同百分比。因此，例如相同的氨基酸评分为1，非保守取代评分为0的话，保守取代评分0到1之间。保守取代的评分值可按软件程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California，USA)中的Meyer&Miller算法(ComputerApplic.Biol.Sci.4：11-17(1988))来计算。

本文中短语两条核酸或多肽“基本相同”指一序列或亚序列与参考序列至少有70％序列相同。此外，相同性百分比可以是从40％到100％之间的任何整数。较为优选的具体实施例包括本文所述的程序(例如，如下所述采用标准参数的BLAST程序)与参考序列(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ IDNO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8或其片段)相比至少有：40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。

在序列比较中，一般把一条序列作为参考序列，将测试序列与之相比较。当使用一种序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要可设定序列坐标和序列算法程序的参数。可采用程序参数空缺或设定其它的参数。然后用序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列相同性百分比。

本文使用的“比较窗口”包括指选自长度从20到600，一般约50到200，更常约100到150的任何毗连位置数目的区段，与毗连位置数目相同的参考序列最佳排列对比之后，在该区段中对二序列进行比较。为比较而对序列进行排列的方法是本领域公知的。为比较而对序列进行的最佳排列可用下列方法进行：Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2：482(1981))的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：443(1970))的同源性排列对比算法；Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1989))的检索相似性方法；可用计算机执行这些算法(在Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，也可以用手工排列对比或目测。

一个适用于测定序列相同性和相似性百分比的算法的实例是BLAST算法，见Altschul等人(J.Mol.Biol.215：403-410(1990))所述。执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National center for Biotechnology Information)公开获得。该算法包括首先通过鉴定在查询序列中长度为W的短字(short words)来确定高评分序列对(HSPs)，当这些短字与数据库中同样长度的字排列对比时，与某些正域值评分T或匹配或合适。T指相邻字分评域值(Altschul等著，同上)。初始命中的这些相邻字可作为开始搜索寻找更长的含有它们的HSPs的种子。使命中的字沿着每条序列的两个方向延伸直到积累的排序评分增加。以下情况命中的字在各方向上的延伸会中止，即：数量X使积累的排序评分从其最大值下降时；由于一个或多个负评分残基排序的累积使积累的评分降到0或0以下时；或到达各条序列的末端时。BLAST算法的参数W、T和X决定了排序的灵敏度和速度。使用的BLAST程序缺省字长(W)11，BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))基准(B)是50，期望值(E)是10，M＝5，N＝-4，并对两条链都进行比较。

BLAST算法也提供两条序列之间相似性的统计学分析(例如，见Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性的测定方法是最小总和概率(P(N))，它提供了两条核苷酸或氨基酸序列之间随机匹配可能性的指标。例如，如果在比较测试核酸和参考核酸中最小总和概率小于约0.2、更优选小于约0.1、最优选小于约0.001时，可认为该核酸与参考序列相似。

当术语“重组”或“重组改变的”用于指例如细胞、核酸、蛋白质或载体时，意味着该细胞、核酸、蛋白质或载体通过导入异源性核酸或蛋白质而被修饰或改变的天然核苷酸或蛋白质；或者该细胞衍生自如此修饰的细胞。因此，例如重组细胞可表达那些在该细胞的天然形式(非重组)中未发现的基因或表达其它异常表达的、表达不良的(under-pressed)或不表达的天然基因。

当术语“异源性”用于指核酸或多肽的一部分时，意味着该核酸或多肽含有的两条或多条亚序列在天然状态时彼此没有相同的关系。例如，一般重组得到的核酸有两条或多条来自于不相关基因的序列，从而产生1一种具有新功能的核酸，例如，含有一种来源的启动子和另一来源的编码区域。类似地，异源性蛋白质指该蛋白质含有两条或多条在天然状态时彼此没有相同关系的亚序列(例如，融合蛋白)。

“表达盒”是一种重组或合成产生的核酸，它具有一系列特定的核酸元件，这些元件使得该特定的核酸可以在宿主细胞中转录。表达盒可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。通常，表达载体包括操作性连接于启动子上的待转录的核酸。

附图简述

图1说明在简氏乳杆菌1153基因组测序之后鉴定到的三个细胞壁锚定蛋白的结构。所有的三个蛋白都有LPQTG分类信号，在其后是疏水区域和带电荷的C-末端尾区，都拥有独特的长重复序列。CWA代表LPQTG基序上游假定的细胞壁相关区域。

图2A-C说明简氏乳杆菌1153基因组测序得到的细胞壁锚定蛋白的序列(C14，C191和C370)。沿着锚定基序的CWA200区域用下划线标出。CWA200代表LPQTG基序上游大约200个氨基酸的假定的细胞壁相关或跨越区域。

图3是用变溶菌素消化转化简氏乳杆菌1153后，以SDS抽提的蛋白质和富含细胞壁的部分经western分析的结果，而简氏乳杆菌1153是培养在37℃、5％CO₂下，MRS肉汤(A)或Rogosa SL肉汤(B)中。将蛋白质以还原性SDS-PAGE分离后，这些蛋白质电印迹到PVDF膜上用来检测抗c-Myc的单克隆抗体(mAb)。

图4是用变溶菌素消化转化简氏乳杆菌1153后，富含细胞壁组分的western分析结果，简氏乳杆菌115337℃、5％CO₂下，培养在Rogosa SL肉汤(B)中。将蛋白质以还原性SDS-PAGE分离后，电印迹到PVDF膜上用抗CD4(T4-4)的多克隆抗体(pAb)检测。表达构建包含下列元件：在pOSEL651中的P₂₃启动子-CbsA信号序列(CbsAss)-2D CD4；在p237中的C14序列的P₂₃启动子-CbsAss-2D CD4-CWA200-C14锚定序列；在pOSEL242中的C191序列的P₂₃启动子-CbsAss-2D CD4-CWA200-C191锚定序列；在pOSEL249中的C370序列的P₂₃启动子-CbsAss-2D CD4-CWA200-C370锚定序列。CWA200代表C-末端锚定结构域上游的大约200个氨基酸。

图5是对含有设计用于2D CD4分泌或表面表达的质粒的简氏乳杆菌1153流式细胞计数分析的结果。细菌细胞用抗CD4(T4-4)的兔pAb，然后用FITC-偶联的抗兔抗体检测(A)。或者，细菌细胞也可用mAb Sim4，然后用PE-偶联的抗鼠IgG检测(B)。对照组包括未染色的细胞或用荧光染料偶联的第二级抗体检测的细胞。荧光密度作为检测抗体与细菌表面结合的衡量，用FLOWOJO软件计算。

图6显示36个氨基酸长的C-末端锚定基序不足以驱动2D CD4的表面表达。其中(A)是利用简氏乳杆菌的天然锚定序列设计用于2D CD4的表面表达的构建物。(B)是含有pOSEL238或pOSEL237的简氏乳杆菌1153的流式细胞计数分析。细菌细胞用抗CD4的mAb Sim4，然后用藻红蛋白(PE)-偶联的抗鼠抗体检测。对照组包括未染色的细胞或用荧光染料偶联的第二级抗体检测的细胞。

图7显示受到C370序列中的LPQTG分类信号上游不同数目的重复性细胞壁跨越序列影响的2D CD4在简氏乳杆菌中的表面表达情况。暴露在表面并有正确折叠构型的2D CD4分子以mAb Sim4检测，对含有以下质粒的细菌细胞进行流式细胞计数分析。这些质粒是：175，阴性控制；249，两个半重复；262，没有重复；268，一个重复；278，两个重复；280，四个重复；281，7个重复；276，八个重复。

图8是各种人来源的乳杆菌中c-Myc标记蛋白质的表面展示情况。其中(A)是设计用于表达在P23启动子和CbsA信号序列(CbsAss)控制下的、C370序列的c-Myc标记的CWA200的pOSEL241示意图。(B)是用变溶菌素消化转化的简氏乳杆菌、加氏乳杆菌和干酪乳杆菌后对富含细胞壁组分的Western分析结果。在用还原性SDS-PAGE分离后，将这些蛋白质电印迹到PVDF膜上用抗c-Myc的mAb检测。(C)是含有pOSEL241的人阴道乳杆菌分离物的流式细胞计数分析的结果。细胞壁用抗c-Myc的mAb，然后用藻红蛋白(PE)-偶联的抗鼠抗体检测。对照组包括未染色的细胞或用荧光染料偶联的第二级抗体检测的细胞。

图9显示C14和C370序列LPQTG基序中的点突变对简氏乳杆菌1153的2D-CD4-CWA200表面表达的作用。用预滴定的mAb Sim4(A)或pAb T4-4(B)对细菌细胞进行表面染色，然后用PE-共轭的抗鼠或FITC共轭的抗兔抗体检测。流式细胞计数分析用FACScalibur系统进行。展示在细胞表面的pOSEL237、pOSEL249蛋白质与表达在含有突变构建物的细菌细胞内的这三种蛋白质的区别在于平均荧光强度不同。将在含有pOSEL237或pOSEL249的细菌细胞表面展示的2D CD4专断地设置为100％。

图10是在C14和C370序列的C-末端带电荷尾区缺失构建物的示意图。

图11显示C14和C370的C-末端带电荷尾区的序列缺失对2D CD4-CWA200表面展示的影响。用预滴定的pAb T4-4(A)或mAb Sim4(B)对细菌细胞进行表面染色，然后用FITC共轭的抗兔或PE-共轭的抗鼠抗体检测。用FACScalibur系统进行流式细胞计数，分析抗体与细胞壁锚定蛋白的结合情况。展示在细胞表面的pOSEL237、pOSEL249蛋白与表达在含有突变构建物的细菌细胞内的这三种蛋白的区别在于平均荧光强度不同。将在含有pOSEL237或pOSEL249的细菌细胞中的表面展示的2D CD4专断地设置为100％。

图12是含有pOSEL237-7和pOSEL249-10的和含有pOSEL651的简氏乳杆菌1153分泌的2D CD4-CWA200与2D CD4的活性比较。设计CD4ELISA用来识别在无细胞条件培养基中有正确、合适折叠构型的蛋白质。蛋白质的量根据它们对pAbT4-4的免疫反应活性标准化。将从含有pOSEl651的细菌细胞中释放出来的可溶性2D CD4蛋白质专断地设置为100％。

发明详述

I.导言

本发明提供了在革兰氏阳性细菌(例如乳杆菌)的细胞壁表达异源性多肽的新颖的基序和方法。本发明的基序可以融合于感兴趣的蛋白质，然后在细菌中以融合蛋白的形式表达。这导致该融合蛋白可以定位、嵌合和/或表面展示在细胞壁上，或是将该生物活性、稳定的融合蛋白释放到胞外基质中。

所述的基序可用于例如在寄居于包括阴道在内的人粘膜中的乳杆菌属细菌的细胞壁表面表达蛋白质。粘膜细菌的例子包括乳杆菌属细菌，例如简氏乳杆菌、加氏乳杆菌和干酪乳杆菌。

II.细胞壁靶向区域

为了表达感兴趣的多肽并使其靶向共价锚定到革兰氏阳性细菌(例如乳杆菌)的细胞壁上，可将该细胞壁靶向区域的C-末端连接于感兴趣的异源多肽。使得能在阴道相关乳杆菌或其它乳杆菌表面展示异源多肽的所述细胞壁靶向区域由四部分组成：一细胞壁相关区域、一LPQ(S/A/T)(G/A)序列和一疏水序列，一般是那样的顺序。细胞壁靶向区域的羧基末端或接近羧基端可任选含有一带电荷的区域。该带电荷的区域起着细胞膜转运终止序列的作用，从而可阻止蛋白质释放到培养基中。当然，如果将该锚定序列从蛋白质剩余部分切断，蛋白质还是会释放进培养基中。

A.细胞壁相关区域

细胞壁相关区域位于LPQ(S/A/T)(G/A)分类信号之前。其长度可以不同，一般是在40到1,000个氨基酸之间。在一些具体实施例中，该细胞壁相关区域至少大约30、50、80、100、150、200或更多个氨基酸。在一些具体实施例中，该细胞壁相关区域大约500、400、300、250、200、150、100或更少的氨基酸。在简氏乳杆菌中，含有一个与pOSEL268(描述于实施例中)的C-末端细胞壁分类信号融合的串联重复的、95个氨基酸的延伸段，使得CD4的表面表达成为可能。然而，在化脓性链球菌的M6蛋白中根据肽图谱鉴定到长约50个氨基酸(Pancholi和Fischetti，J.Bacteriol.170：2618-2624(1988))，而据推测肉质链球菌中纤连蛋白结合蛋白大约为90个氨基酸(Strauss和Gotz，Mol.Microbiol.21：491-500(1996)))。因此，50个或更短的氨基酸序列在乳杆菌中可以是有功能的。

在一些具体实施例中，所述细胞壁相关区域是疏水性的。在一些具体实施例中，该细胞壁相关区域包含长度和序列可能不同的不完全串联重复。例如，简氏乳杆菌C370的细胞壁相关区域含有两个半串联重复。然而，尽管串联重复可以出现在细胞壁相关区域，但这并非必需的。例如，C14的细胞壁相关区域就不含有重复。该细胞壁相关区域在功能性上能与肽葡聚糖层相互作用和跨越肽葡聚糖层。因此，该细胞壁相关区域也被称为细胞壁跨越或附着结构域，在膜相连分选酶锚定的蛋白质和细胞壁分类信号之间起着间隔物作用。

本发明提供的细胞壁相关区域基本上与C370序列：KKAEEVKNNSNATQKEVDDATNNLKQAQNDLDGQTTDKSKLDEAIKSADDTKSTDKYNNASDDTKSKFDEALKKAEEVKNNSNATQKEVDDATKNLKQAQNDLDGQTTNKDAINDAIKDANNAKGTDKYNNASDDTKSKFDDALKKAEDVKNDSNANQKEVDDATKNLKNTLNNLKGQPAKKANLIASKDNAKIHKQTL(SEQ ID NO：4)相同。在一些情况下，该细胞壁相关区域含有至少约40、50、75、90、100、120、150、175、200个氨基酸的C370序列片段。例如，一种细胞壁相关片段可含有以下序列：GQTTNKDAINDAIKDANNAKGTDKYNNASDDTKSKFDDALKKAEDVKNDSNANQKEVDDATKNLKNTLNNLKGQPAKKANLLASKDNAKIHKQTL(SEQ ID NO：4)。C370序列(SEQ ID NO：4)含有75个带电荷的氨基酸残基(K、R、D、E)并缺乏富含脯氨酸-甘氨酸的序列。

在一些具体实施例中，该细胞壁相关区域基本上与C14序列：VTRTINVVDPITGKISTSVQTAKFTREDKNSNAGYTDPVTGKTTMNPWTPAKQGLRAVNVEQIKGYVAKVDGNVDAVVVTPDSANMVVTITYQSNKPEGQNITVKKDTVPDPADGIKNKDDLPDGTKYTWKEVPDVNSVGEKTGIVTVTFPDGTSVDVKVTVYVDPVVESNRDTLSKEANTGNTNVAKAATVTSSKVESKKT(SEQ ID NO：6)相同。在一些情况下，该细胞壁相关区域含有至少约40、50、75、90、100、120、150、175、200个氨基酸的C370序列片段。SEQ ID NO：6含有51个带电荷的氨基酸残基(K、R、D、E)。

在一些情况下，该细胞壁相关区域衍生自非乳杆菌属的细菌或与阴道无关的乳杆菌菌株。

B.LPQ(S/A/T)(G/A)

LPQ(S/A/T)(G/A)序列在阴道相关的乳杆菌中作为细胞壁分类信号。在该细胞壁相关区域中至少有基序LPQ(S/A/T)(G/A)的一个拷贝。该基序中的括号表示此位置的氨基酸可替换(例如LPQSG、LPQAG、LPQTG、LPQSA、LPQAA、LPQTA)。

C.疏水序列

待锚定在细胞壁中的多肽的羧基末端含有一功能为跨越细菌膜的疏水区域。该区域含有至少50％的疏水性氨基酸，在一些具体实施例中含有至少60％、70％、80％或90％的疏水性氨基酸。天然疏水性氨基酸包括丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。一些疏水性较低的氨基酸(例如，甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸)也可作为这些序列的结构成份(见例如Pallen等著，Trends Microbiol.9：97-101(2001))。在分选酶样蛋白质的可利用含LPXTG的基质中，疏水序列的长度一般在约10到30个氨基酸，有时是13到24个氨基酸(Pallen等著，Trends Microbiol.9：97-101(2001))。疏水序列的例子包括：C14中的V¹⁷⁴⁰GILGLAIATVGSLLGLGV¹⁷⁵⁸和C370中的p¹⁸⁷⁷LTAIGIGLMALGAGIFA¹⁸⁹⁴

另一方面，任何革兰氏阳性细菌的细胞壁锚定蛋白的疏水区都可利用。其它疏水序列见美国专利No.5,821,088附图1中所述或基本上相同的序列。在Pallen等著的Trends Microbiol.9：97-101(2001)中表2也描述了其它的序列。

D.带电荷的序列

带电荷区可以任选地存在细胞壁靶向区域的羧基末端，一般是紧跟疏水性跨膜区域。羧基末端带电荷区域可将多肽固定在膜上，从而极大程度减少蛋白质从膜上解离进入培养基。该带电荷区域至少含有40％，在一些具体实施例中至少含有50％、60％、70％、80％或90％的带电荷的氨基酸。天然的带电荷氨基酸包括精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。带电荷序列长度可在2和20个氨基酸之间，在一些具体实施例中可在4-12或5-11个氨基酸之间。带电荷的序列的例子包括：C191中的K⁹⁶⁹KRKED⁹⁷⁴、C14中的R¹⁷⁶⁰KKRQK¹⁷⁶⁵和C370中的K¹⁸⁹⁵KKRKDDEA¹⁹⁰³。

此外，任何革兰氏阳性细菌的细胞壁锚定蛋白的带电荷区都可利用。其它带电荷序列见美国专利No.5,821,088附图1中所述或基本上相同的序列。在Pallen等著的Trends Microbiol.9：97-101(2001)中表2也描述了其它的序列。

III.重组技术

A.分子生物学方法

本发明依赖重组遗传学领域的常规方法。下列基础教材公开了本发明使用的一般方法：Sambrook等著，分子克隆，实验室手册(第三版.2001)；Kriegler，基因转化和表达：实验室手册(1990)和Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel等著，1994)。

对核酸而言，其大小可以用千碱基(kb)或碱基对(bp)表示。可从琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、核酸测序或公开的DNA序列估计。对蛋白质而言，其大小可以用千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数目表示。蛋白质的大小可从凝胶电泳、蛋白质测序、衍生的氨基酸序列或公开的蛋白质序列估计。

不能从商业获得的寡多聚核苷酸可按照固相亚磷酰胺三酯方法用自动合成仪来化学合成。该方法首先由Beaucage和Caruthers(TetrahedronLetts.22：1859-1862(1981))描述，自动合成仪见在Van Devanter等Nucleic AcidsRes.12：6159-6168(1984)中所述。寡多聚核苷酸的纯化如Pearson和Reanier在J.Chrom.255：137-149(1983)所述，可用天然丙烯酰胺凝胶电泳或离子交换HPLC进行。

克隆的基因序列和合成的寡多聚核苷酸在克隆后可用例如测序双链模板(Wallace等著，GENE 16：21-26(1981))的链终止方法进行验证。

B.分离编码所需蛋白质核苷酸序列的克隆方法

普遍而言，编码目标蛋白质的核酸克隆自从cDNA或基因组DNA制备的DNA文库。可通过与寡多聚核苷酸探针杂交来定位特定的序列，探针的序列可得自本文公开的或是本领域公知的序列，从而为PCR引物制备提供参考并且为分离基因特异性的探针确定了合适的区域。或者，将该序列克隆到表达文库中，所表达的重组蛋白质可用抗感兴趣多肽(包括本文所公开的)的抗血清或纯化的抗体进行免疫学检测。

制造和筛选基因组和cDNA文库的方法是本领域技术人员所熟知(见例如Gubler和Hoffman，Gene 25：263-269(1983)；Benton和Davis，Scienc，196：180-182(1977)；和Sambrook，同上)。表达感兴趣蛋白质的细胞是可用于产生cDNA文库的RNA的来源。

简言之，为了制作cDNA文库，应选择富含mRNA的来源。然后，mRNA可制成cDNA，连接到重组载体中，再转染到重组宿主中用于繁殖，筛选并克隆。对基因组文库而言，从合适的组织或细胞中抽提DNA，用机械剪切或酶消化得到优选约5-100kb的片段。梯度离心分离除去不需要大小的片段后构建到细菌噬菌体λ载体中。这些载体和噬菌体在体外包装，重组噬菌体用噬菌斑杂交分析。克隆杂交一般按照Grunstein等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.72：3961-3965(1975))所述进行。

另外一个方法将合成的寡核苷酸引物和在mRNA或DNA模板上聚合酶延伸反应相结合。这种聚合酶链式反应(PCR)可直接从mRNA、cDNA、基因组文库或cDNA文库扩增编码感兴趣蛋白质的核酸。可将限制性内切酶位点掺入引物中。聚合酶链式反应或其它体外扩增方法也可用，例如，克隆编码特定蛋白质的核酸并表达该蛋白质，合成用作探针的核酸用于检测生理样品中编码本发明多肽的mRNA、核酸测序或其它目的(见美国专利Nos.4,683,195和4,683,202)。PCR反应扩增的基因可用琼脂糖凝胶纯化并克隆到合适的载体中。

用来鉴定组织或细胞样品中编码本发明多肽的基因的合适引物和探针可以得自本领域所描述的序列。要全面了解PCR可见Innis等著PCR Protocols：A Guideto Methods and Applications，Academic Press，San Diego(1990)。

可用中间载体克隆编码本发明多肽的多聚核苷酸，然后转化到乳杆菌中。这些中间载体一般是原核载体或穿梭载体。

C.转化技术

选择合适的细菌宿主菌株的标准是：它们的转化能力、异源蛋白的表达能力和/或在粘膜表面的寄居能力。用氯化铷法或电穿孔法(见例如，Wei，等著，J.Microbiol.Meth.21：97-109(1995))等标准技术赋予细菌宿主转化感受态。

电穿孔法转化简氏乳杆菌可用修改的标准方法，例如见Luchansky等著(J.Dairy Sci.74：3293-3302(1991)；Chang等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100：11672-11677(2003))。简言之，将新鲜接种的简氏乳杆菌培养在肉汤培养基中(例如，在37℃、5％CO₂培养至OD₆₀₀值为0.6-0.7)。收集细菌细胞，洗涤并重悬在冷(例如，4℃)的蔗糖和MgCl₂溶液中。将感受态细胞与DNA混合并放置于预冷凹槽比色杯中进行电穿孔。让细胞在预热的肉汤培养基中恢复(例如，在37℃大约2小时)，然后将细胞涂布到含有抗生素的其它选择性试剂的选择性琼脂板上，。

D.表达

本发明的表达盒可以包括各种用于调节表达和定位本发明多肽的成份。例如，表达盒可以包括启动子元件、编码信号序列的序列、编码感兴趣多肽和锚定序列的序列。

异源性多聚核苷酸或多肽的表达可以是组成性的(例如使用P59(Van derVossen等著，Appl.Environ.Microbiol.58：3142-3149(1992))启动子或P23(Elliot等著，Cell 36：211-219(1984))启动子，或乳杆菌更强的天然启动子)。或者，表达可在可诱导启动子的控制下。例如，芽孢杆菌的淀粉酶(Weickert等著，J.Bacteriol.171：3656-3666(1989)或木糖(Kim等著Gene 181：71-76(1996))启动子和乳球菌的乳链球菌肽启动子(Eichenbaum等著，Appl.Environ.Microbiol.64：2763-2769(1998))可用来驱动可诱导表达。此外，也可以利用酸或碱诱导的启动子。例如，可以使用在阴道内较酸性条件下具有活性的启动子。此外，受到阴道内精液导致变化所诱导的启动子也可用。例如，对精液进入阴道而导致碱性增强时，可用碱诱导的启动子诱导表达。

现已知道能引导多肽定在膜上、胞外空间或细胞壁表达的各种信号序列(例如，共价连接到肽葡聚糖上)。信号序列的例子包括来自食淀粉乳杆菌的α-淀粉酶(Giraud&Cuny，Gene.198：149-157(1997))或卷曲乳杆菌的S-层基因(cbsA)的信号序列(例如，MKKNLRIVSAAAAALLAVAPVAA或MKKNLRIVSAAAAALLAVATVSA)。信号序列一般位于多肽的氨基末端。

多肽正确的定位和折叠可用标准方法测定。例如，富含乳杆菌细胞壁的部分可用如下方法获得：将细菌悬浮在缓冲液(例如25％蔗糖、1mM的EDTA、10mM的Tris-HCl，pH 8.0)中，接着用细胞壁降解酶处理(例如，溶菌酶和变溶菌素)，然后差速离心分离得到的原生质体。所得到的组分用Western印迹法筛检确认细胞壁中的表达。

所表达的多肽的折叠和生物学活性也可用标准方法测定。例如，可采用该天然折叠多肽的特异性抗体的ELISA试验来验证该多肽的折叠和三维结构。生物学活性的试验当然因多肽的活性而不同。例如，对于能结合病毒的多肽，可用标准结合试验来测试表达的多肽与病毒蛋白质结合的能力。对于抗炎分子，可测试表达的多肽拮抗引起炎症的物质的能力。

当合成用于提高宿主细胞内表达的基因时，该基因要设计成其密码子的使用频率接近宿主细胞优选密码子的使用频率。计算宿主细胞所使用的合成基因优选密码子的使用频率的偏差百分比可首先确定宿主细胞基因的单个密码子的使用频率的偏差百分比，然后得到所有密码子的平均偏差。

可调整编码特定多肽的多聚核苷酸序列使之与特定宿主使用的密码子一致。例如，可利用乳杆菌使用的密码子来产生编码本发明多肽的含有优选的乳杆菌密码子的多聚核苷酸。宿主细胞显示的优选密码子使用频率，可通过在宿主细胞所表达的大量基因中优选密码子的平均使用频率来计算。这种分析方法优选限制用于宿主细胞高度表达的基因。例如，Pouwels等(Nucleic Acid Res.22：929-936(1994))提供了各种乳杆菌所用的显示高表达基因的密码子使用频率。密码子的使用表也可以通过因特网获得。

IV.本发明的蛋白质

本发明的多肽(例如融合于本发明细胞壁靶向区域的生物学活性多肽)可以是任何多肽。一般，本发明的多肽在可保留多肽生物学活性的条件下表达。在一些具体实施例中，表达的多肽中存在二硫键。在一些具体实施例中，二硫键是该多肽的生物活性所必需的。

本发明多肽的分子量可以是任意大小。例如，该多肽分子量可在约100-200,000道尔顿之间、约500-40,000之间、约500-10,000道尔顿之间、约10,000-50,000之间或约50,000-200,000之间。

按照本发明的方法可用于预防或治疗病原体感染的各类多肽的例子包括：例如抗病毒多肽、抗细菌多肽、抗真菌多肽和能与病毒、细菌或真菌结合的多肽，例如抗体、抗体片段或单链抗体。

在一些情况下，本发明的多肽是病毒或细菌病原体可结合从而感染宿主的受体。或者，该多肽是抑制病原体复制、活力、进入的制剂或是其它能与病原体结合的药物。在一些具体实施例中，本发明的多肽能结合或抑制性传播病原体，和其它经阴道传播或来自阴道的病原体。例如，病毒感染需要结合到靶细胞表面上的受体，那么抑制病毒与其宿主受体相互作用的策略就可以有效地预防感染。

抗病毒多肽的例子包括：例如CD4或其病毒结合片段(例如，2D-CD4)(例如，Orloff等著，J.Virol.67：1461-1471(1993))、通过三聚体基序形成的稳定的CD4三聚体(例如，Yang等著，J.Virol.76：4634-4642(2002))、十二聚体CD4-Ig融合蛋白(Arthos等著，J.Biol.Chem.277：11456-11464(2002))、α-防卫素(例如，Zhang等著，Science 298：995-1000(2002))、与17b mAb的单链可变区域融合的CD4(Dey等著，J.Virol.77：2859-2865(2003))、蓝病毒素-N或其变体(例如Bolmstedt等著，Mol Pharmacol.59：949-954(2001)；Mori等著，ProteinExpr.Purif.26：42-49.(2002))、单纯疱疹病毒进入介质C(HveC)(例如，Cocchi等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95：15700-15705(1998))和ICAM-1。其它的具体例子包括：例如病毒受体或肝素或肝素样分子，甘露糖结合性凝集素，包括树突状细胞特异性ICAM-3捕获非整联蛋白(grabbing nonintegrin)(例如，Geijtenbeek等著，Cell 100：587-597(2000)；Feinberg等著，Science 294：2163-2166(2001))、抗-HSV-1gp120单链抗体(例如，Marasco等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90：7889-7893(1993)；McHugh等著，J.Biol.Chem.277：34383-34390(2002))、人mAbb12，识别HIV-1gp120的CD4结合位点(例如，Saphire等著，Science 293：1155-1159(2001))或其它具有类似特异性的分子，包括与HSV结合的中和抗体(例如，Burioni等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91：355-359(1994))和HIV-1进入抑制蛋白(例如，Root等著，Science 291：884-888(2001)；Sia等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.99：14664-14669(2002))。

人乳头瘤病毒(HPVs)感染是宫颈癌发生相关因子(例如，zur Hausen著，Virology 184：9-13(1991)；Stanley著，BestPrat.Res.Clin.Obstet.Gynaecol.15：663-676(2001))。因此，能抑制HPV或与之结合的分子可用于预防HPV感染和宫颈癌的发生。抗HPV多肽的例子包括，例如能与人乳头瘤病毒16E6或E7类蛋白结合的中和抗体(例如，Mannhart等著，Mol.CellBiol.20：6483-6495(2000))、HPV结合蛋白或可用于引发针对该病毒的免疫反应的HPV蛋白。

赋予本发明细菌与病毒或细菌这些病原体的结合能力至少有几种方法。第一种是使细菌在其表面表达病毒的正常宿主受体，例如人鼻病毒HRV(主要组分)的受体ICAM-1和HIV的受体CD4。这些是正常的人蛋白质，很多这些蛋白的基因完全序列已经确定，储存在GenBank的数据库中。

第二种方法是在细菌表面表达可结合病毒表面保守性决定簇(例如，脊髓灰质炎病毒上的VP4或HIV上的gp120)的抗体片段或其它多肽。对任何抗原基本上特异性的的抗体片段(和多肽)可选自：噬菌体展示文库(Marks等著，J.Biol.Chem.26：16007-16010(1992))。这类抗体可针对病原体上任何表位或与病原体相关表位和下述其它表位。

第三种方法包括在细菌表面表达糖类结合多肽。这些分子的例子包括肝素结合多肽或甘露糖结合多肽。

抗细菌多肽包括那些能与尿路病原性大肠杆菌结合或抑制其生长或抑制其寄居的多肽。抗细菌多肽的例子包括：例如抗革兰氏阴性细菌(Levy著ExpertOpin.Investig.Drug 11：159-167(2002))的渗透性增加的蛋白、哺乳动物抗微生物的多肽、β-防卫素(Ganz和Lehrer著Pharmacol.Ther.66：191-205(1995))、杀菌素(例如，Loeffler等著，Science 294：2170-2172(2001))和能特异性地结合细菌的抗体。

抗真菌多肽包括那些能与真菌(例如，假丝酵母)结合或抑制其生长或抑制其寄居的多肽。

其它本发明可以使用的生物活性多肽的例子包括治疗性多肽或药物，例如抗炎症分子、生长因子、能结合或拮抗生长因子的分子、治疗性酶、抗体(包括，例如抗体片段或单链抗体)和能抑制或治疗宫颈癌等的分子。可以容易地引用大量其它有治疗活性的多肽，而不受限于这些例子。

抗炎症分子包括：例如抗体或其它能与TNF或IL-8特异结合的分子。其它抗炎症分子的例子包括IL-10和IL-11。

本发明所用的生长因子包括：例如那些参与局部组织修复的分子(例如KGF、HB-EGF、FGF和TGF-β)或这些分子的拮抗剂。

治疗性酶包括，例如一氧氮化物(NO)合成酶。

抗肿瘤分子包括那些可诱导细胞程序性死亡的、调节细胞周期的(例如p53)或可靶向肿瘤特异表位的疫苗。

本发明所用的疫苗分子包括能引发针对病毒、细菌或真菌的免疫应答反应的多肽。示范性的病毒疫苗可引发针对例如HIV、HPV、HSV-2或天花的应答反应。抗原的例子包括HSV-2的糖蛋白D、人乳头瘤病毒蛋白E6和E7、砂眼衣原体的主要外膜蛋白(Kim和DeMars著Curr.Opin.Immunol.13：429-436(2001)和白色假丝酵母的天冬酰胺蛋白酶(De Bernardis等著，Infect.Immun.70：2725-2729(2002))；尿路病原性大肠杆菌的FimH(Langermann等著，Science.276：607-611(1997))；肠外病原性大肠杆菌的IroN(Russo等著，Infect.Immun.71：7164-9(2003))。

V.传送

将工程菌传送到期望的粘膜表面依赖于该区域的可接近性和局部条件。例如，可将工程菌置于盐溶液中或在泡沫液中传送到阴道粘膜。泡沫液可以包括：例如一种或多种经疏水性修饰的多糖(例如纤维素制品和壳多糖)。纤维素制品包括，例如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羟乙基甲基纤维素等。甲壳质包括，例如下列的甲壳质盐：甲壳质乳酸盐、甲壳质水杨酸盐、甲壳质吡咯烷酮羧酸盐、甲壳质衣康酸盐、甲壳质尼克酸盐、甲壳质甲酸盐、甲壳质乙酸盐、甲壳质没食子酸盐、甲壳质谷氨酸盐、甲壳质马来酸盐、甲壳质天冬氨酸盐、甲壳质羟乙酸盐和四元胺取代的甲壳质和其盐类等。泡沫液也可包括其它的成份，例如水、乙醇、异丙醇，甘油(glycerin)、甘油(glycerol)、丙二醇和山梨醇。杀精剂可任选地包含在该细菌组合物中。泡沫液和泡沫液传送载体的其它例子见，例如美国专利No.5,595,980和No.4,922,928中所述。

此外，细菌也可用栓剂或阴道环传送。见美国专利No.4,322,399。在一些具体实施例中，本发明所述细菌装在可溶性聚合物中和/或选择具有溶解性能的复合碳水化合物制成的可溶解成份中传送。这样该成份在使用前基本上是固体形式，在使用时由于人的体温和湿度而溶解，从而能在需要的时间和以需要的剂量释放出药物。例如，见美国专利No.5,529,782。所述细菌也可用美国专利No.4,693,705所述的在海绵状输送载体中传送。

在一些具体实施例中，所述细菌可口服给予。例如，每日剂量大约为10⁸的乳杆菌可用于使泌尿生殖(urogentital)道菌群恢复正常。例如见Reid等著，FEMSImmuno.Med.Microbiol.32：37-41(2001)。

在一些具体实施例中，将工程菌应用于粘膜表面需要定期重复；最佳给药间隔可以常规方法确定，但视粘膜环境和细菌菌株的不同而不同。给药间隔可一天一次至每2-4个星期一次之间变化。

在一些具体实施例中，导入噬菌体以转化天然乳杆菌时，所选的噬菌体核酸可经过操作用异源基因取代编码噬菌体衣壳蛋白的基因，得到复制缺陷型噬菌体。将这些重组DNA分子加入含有功能性噬菌体蛋白质的细胞裂解物中将导致装配成为携带有异源基因的功能性噬菌体颗粒。然后将这些复制缺陷型噬菌体颗粒引入期望的粘膜表面感染所选择的菌群。应用于粘膜表面的感染剂量一般为10⁸-10¹²PFU/ml。加到治疗表面的溶液比例是约0.1-1.0ml/每平方厘米粘膜表面积。所用的载体与上述的细菌载体类似。

实施例

以下提供的实施例是为说明本发明的权利要求而非限制。

大多数病毒通过鼻、口腔、肠或生殖道的粘膜传播。这些粘膜天然寄居有大量共栖细菌，包括健康妇女阴道腔内的简氏乳杆菌、加氏乳杆菌和卷曲乳杆菌。我们设想用遗传修饰的简氏乳杆菌表达可锚定到细菌表面的生物活性病毒结合蛋白将病毒俘获在粘膜内，可使病毒接触下方的上皮细胞和淋巴细胞，抑制所俘获的病毒的感染过程和/或受到抗病毒化合物(例如有乳杆菌分泌的乳酸和过氧化氢)的局部灭活，从而显著减少感染性病毒颗粒的数量。因此，我们采用了一种能够表面表达高密度HIV-结合配体、CD4的2-结构域和蓝病毒素-N的遗传工程改造的乳杆菌的模块化表达方法。我们发现通过与简氏乳杆菌的天然蛋白质的蛋白结构域融合，可使10-600个氨基酸的多肽有效地固定展示在细胞壁上。

M6蛋白具有特征性细胞壁分类信号LPXTG基序，其后有一疏水性氨基酸延伸段，最后是一段含有带电荷残基的序列(KRKEEN)，这段序列是关键性的细胞表面保留信号。我们最初尝试用质粒为基础的模块化方法，利用两个特征已清楚的细胞壁锚定基序在简氏乳杆菌的表面表达CD4，这两个锚定基序来自化脓性链球菌的M6蛋白(emm6)或来自类干酪乳杆菌的PrtP蛋白酶；或是化脓性链球菌的M6蛋白的锚定基序加上M6蛋白天然序列N-末端100个氨基酸延伸段(CWA100)。与M6蛋白不同，PrtP的分类信号是LPKTA。虽然有大量的2D CD4释放到条件培养基中，但是对该条件培养基的蛋白质，和在含有M6或PrtP或CWA100作为细胞壁锚定蛋白的、经修饰的简氏乳杆菌的细胞壁或原生质体相关蛋白库的Western分析，未检测到细胞壁相关的2D CD4。流式细胞计数分析未能鉴定到暴露在表面的阳性2D CD4。

对假定的细胞壁锚定序列的鉴定

对简氏乳杆菌基因组序列进行数据库检索，鉴定到假定的细胞壁锚定基序的约30个重叠群。根据对生物技术国家中心(National Center for Biotechnology)网站可得到的非冗余数据库的更详细序列同源性检索，我们选择了三条这样的序列，命名为C14、C191和C370。它们分别与发酵乳杆菌的Rlp(Turner等著，Appl.Environ.Microbiol.69：5855-5863(2003))或路氏乳杆菌中的粘膜结合蛋白(Roos和Jonsson著，Microbiol.148：433-442(2002))，链球菌表面蛋白家族(Wastfelt等著，J.Bio.Chem.271：18892-18897(1996))和嗜热链球菌的细胞壁锚定蛋白酶(Fernandez-Espla等著，Appl.Environ.Microbiol.66：4772-4778(2000))有较低的序列相似性(23％～27％的相似性)。所有这三条序列在疏水性区域和带电荷的C-末端尾区之前都有LPQTG分类信号(见图1)。这些特点在革兰氏阳性细菌的分选酶识别的C-末端细胞壁锚定序列中是常见的(Navarre和Schneewind著，Microbiol.Mol.Bio.Rev.63，174-229(1999))。在革兰氏阳性细菌所发现的LPXTG细胞锚定基序中，只有7％与在这些简氏乳杆菌蛋白中发现的LPQTG序列匹配。C14、C191和C370蛋白均含有毗连该细胞壁锚定区域的串联重复结构域，这个结构特征经常存在于已知的细胞壁锚定蛋白中(Navarre和Schneewind著，Microbiol.Mol.Bio.Rev.63，174-229(1999))。C14、C191和C370的序列显示在图2A-C中。

假定的细胞壁锚定序列的表位标记

为测定C14、C191和C370将异源融合蛋白锚定到简氏乳杆菌的细胞壁上的效率，我们直接在LPQTG分类信号的N-末端选择了约200个氨基酸。该区域常定义为细胞壁锚定蛋白中的细胞壁相关(CWA)结构域，它有助于基质序列的保留或延长，从而有助于膜相关分选酶的适当溶解蛋白切割。为了有利于免疫检测，将c-Myc表位(EQKLISEEDL)分别与在pOSEL239、240和241中的C14、C191和C370的CWA200区域N-末端融合。用Western和流式细胞计数分析来检测c-Myc标记蛋白是否产生并定位到细胞壁。为进行Western分析，含有pOSEl175、239、240和241的修饰的简氏乳杆菌培养在MRS和Rogosa SL肉汤中到对数生长期。然后，用变溶菌素消化细胞壁，这是一种能切断成熟肽聚糖聚糖链的MurNAc-GlcNAc之间切割β1-4糖苷键的N-乙酰溶菌酶。在SDS-PAGE电泳法(Perry等著，J.Biol.Chem.277，16241-16248(2002))之后，细胞壁锚定蛋白一般迁移成为一系列的片段。当细菌细胞培养在MRS和Rogosa肉汤中时，对含有pOSEL239(C14锚定蛋白)和pOSEL(C370锚定蛋白)的细菌细胞富含细胞壁组分进行蛋白Western分析，显示在还原性SDS-PAGE上出现c-Myc标记蛋白序列梯(图3)。而含有pOSEL240(C191锚定蛋白)的细菌细胞富含细胞壁组分没有这种模式，表明所测试的含有LPQTG的序列锚定效率不同。

为确定Western印迹阳性的c-Myc表位是否暴露在含有pOSEL239和241的简氏乳杆菌细胞的表面，以含有对照质粒pOSEL175的细菌细胞为参考，对抗-c-Myc的抗体的结合情况进行了流式细胞计数分析。尽管含有pOSEL239的细菌细胞平均荧光强度与那些含有对照质粒pOSEL175的细菌并无区别，但含有pOSEL241的细菌细胞增加了160倍。尽管还不清楚是否空间位阻效应影响了与C14序列的c-Myc标记的CWA200区域的表面接近，我们的分析清晰地表明C370序列CWA200区域的N-末端尽头是暴露在表面的。这个结果说明该C370特定区域可用于将异源多肽与细菌细胞表面蛋白共价固定。

2D CD4在简氏乳杆菌细菌表面的表面表达

我们进行了Western印迹和流式细胞计数分析来确定是否2D CD4可通过C14和C370序列的CWA200区域来表面表达。为进行Western分析，在细胞壁消化后，将含有pOSEL175(对照质粒)、651(无细胞锚定蛋白的2D CD4质粒)(Chang等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100：11672-11677(2003))、237(与C14锚定蛋白融合的2D CD4)、242(与C191锚定蛋白融合的2D CD4)和249(与C370锚定蛋白融合的2DCD4)的简氏乳杆菌细胞中的蛋白质分成多个富含细胞壁的组分。在富含细胞壁的蛋白组分中，一系列高分子量的蛋白质能与含有pOSEL237和249、而非pOSEL651的细菌细胞中的pAb T4-4发生免疫反应(图4)。在变溶菌素消化后SDS-PAGE中观察到的梯序列模式装配成已知的、来自其它革兰氏阳性细菌表面细胞壁锚定蛋白质(Perry等著，J.Biol.Chem.277：16241-16248(2002))。

为确定2D CD4是否表达在细菌表面，含有pOSEL175、651、237和249的简氏乳杆菌菌株用pAb T4-4检测，然后用流式细胞计数分析抗体的结合情况。如预料的那样，该分析显示含有pOSEL175和651的细菌细胞平均荧光强度没有区别。相反，含有pOSEL237和249的细菌细胞平均荧光强度比含有pOSEL175和651的细菌有显著的增加，好像是2D CD4共价连接和表面表达所致(图5A)。为进一步验证上述方法，将含有乳杆菌优选密码子重编码(recorded)蓝病毒素-N(CV-N)基因融合到用于后续锚定2D-CD4的同一C-末端锚定结构域。对含有CV-N表达质粒的修饰的简氏乳杆菌进行的流式细胞计数分析，检测到的平均荧光强度比含有pOSEL175的细菌(数据未显示)增加了30-50倍。为测定与抗体反应的CV-N分子是通过静电相互作用而结合于表面的可能性，用5M的LiCl抽提修饰过的细胞。流式细胞计数分析显示盐抽提的含有CV-N表达质粒的简氏乳杆菌和那些用PBS和2％FBS洗涤的细菌相比平均荧光强度无差别。表面展示的CV-N分子可抵抗5MLiCl的抽提，反映了共价固定在细菌表面的蛋白质的一种行为。

为说明表面表达的2D CD4分子是否为具有结合gp120的正确折叠构型，在用能识别结构依赖表位的抗-CD4单克隆抗体Sim4检测了含有pOSEL175、237和249的细菌细胞之后，进行额外FACS分析。含有pOSEL237和249的细菌细胞平均荧光强度比含有pOSEL175的细菌显著增加，表明2D CD4以功能形式结构表达在简氏乳杆菌表面(图5B)。

还不清楚2D CD4以模块化表达方法表面表达是否会影响在修饰的简氏乳杆菌中天然细胞表面相关蛋白的表达。为说明这个问题，用磺基-NHS-生物素检测含有pOSEL175和237的细菌细胞，然后用含有0.4％SDS和10mMDTT的缓冲液抽提细胞表面相关蛋白。对SDS抽提蛋白用碱性磷酸酶偶联的亲和素检测后进行Western分析，检测到表观分子量从10到大于200kDa的一系列生物素化蛋白质。含有pOSEL237的细菌细胞中的可溶性生物素化蛋白质种类的模式与pOSEL175中的那些蛋白相似，表明天然细胞的表面表达未受影响。

简氏乳杆菌的活性2D CD4在宽pH范围下表面表达

在大多数妇女中，天然寄居乳杆菌的人阴道腔pH在3.6-4.5范围内变化(Boskey等著，Infect.Immun.67：5170-5175(1999))，当男性射精时暂时变成中性或弱碱性。进行了试验来检查pH值的变化如何影响修饰的简氏乳杆菌中活性2DCD4分子的表面表达。将细菌细胞接种在Rogosa SL肉汤中，或用常用pH(5.4)或用100mM的HEPES，pH7.4的缓冲液。在活跃生长到OD₆₀₀值约0.4的过程中，培养基的pH值基本上没改变。对mAb Sim.4与含有pOESL237和249的细菌细胞结合情况进行流式细胞计数分析检测到在pH5.4和7.4时平均荧光强度均显著高于pOSEL175的对照背景。而且修饰的简氏乳杆菌培养在与人阴道腔相似的酸性pH条件下时，表面表达的CV-N水平保持升高(数据未显示)。

当仅通过36个氨基酸长的C-末端锚定基序融合表达时2D CD4没有表面表达

36个氨基酸的C-末端锚定基序是否足够支持2D CD4在简氏乳杆菌中的表面有效表达还不清楚，该基序包括LPQTG信号、一疏水性区域和带电荷的C14或C370序列尾区。为说明这个问题，制备了两个命名为pOSEL238和pOSEL262的构建物，其中pOSEL238含有C14的C-末端锚定基序，而pOSEL262含有C370的C-末端锚定基序，然后参考阴性对照pOSEL175和651与阳性对照pOSEL237分析这两个构建物。在用pAb T4-4检测后，对含有pOSEl238的简氏乳杆菌的富含细胞壁成份进行Western分析，未检测到类似于pOSEL237中那些蛋白的序列梯模式。此外，对mAb Sim.4与含有pOSEL238的细菌细胞的结合情况进行流式细胞计数分析，未检测到平均荧光强度高于含pOSEL175的细胞的对照背景(图6)。类似的是，参考那些含有pOSEL175和阳性对照pOSEL249的细菌，对含有pOSEL262的细菌细胞进行FACS分析得到了类似的阴性结果。与这些观察相一致，当使用类似长度的化脓性链球菌和类干酪乳杆菌的C-末端锚定基序时，也未能实现2D CD4的表面表达。这提示在特征性LPQTG基序上游的蛋白质序列对细胞壁锚定过程有显著贡献并且是在简氏乳杆菌细胞壁上展示生物活性蛋白所必需。

为最优化表面展示生物蛋白所需的LPQTG基序上游重复性细胞壁跨越序列长度的确定

天然C370序列在其LPQTG基序上游的C-末端区域中含有8个几乎相同的串联重复基序(图1)，这是革兰氏阳性细菌中很多细胞壁锚定蛋白的一个特征。尽管pOSEL249的锚定序列中包括两个半重复序列，但仍待确定不同长度的上游序列是否能用于最大程度地展示表面蛋白。因此，制备了几个含有0、1、2、4、7和8个C370序列的重复序列的构建物。它们分别命名为pOSEL262、268、278、280、281和276。为确定采用正确折叠构型的2D CD4分子的水平，用mAb Sim.4检测转化的细菌进行流式细胞计数分析(图7)。含有pOSEL262(0重复)的细菌与阴性对照pOSEL175相比平均荧光强度没有区别，提示重复序列对于正确地表面表达异源蛋白质是需要的。此外，当重复序列数目从pOSEL262中的0个增加到pOSEL278中的3个时，荧光强度显著增加。当重复序列数目再增加时荧光强度保持稳定。

简氏乳杆菌的天然锚定序列在支持多种乳杆菌蛋白质表面展示中的用途

为确定简氏乳杆菌1153的天然C370锚定序列是否能支持蛋白质在其它简氏乳杆菌菌株和人来源的乳杆菌种中表面展示，设计将c-Myc表位与C370序列CWA200融合的pOSEL175或pOSEL241通过电穿孔法引入简氏乳杆菌Xna(L.jensenii Xna)、加氏乳杆菌1151和干酪乳杆菌Q(L.casei Q)中。转化的细菌以含有pOSEL241的阳性对照简氏乳杆菌1153为参考进行Western分析和流式细胞计数分析。用抗c-Myc的mAb检测之后对细胞壁消化物进行Western分析，在含有pOSEL241的简氏乳杆菌Xna和加氏乳杆菌1151中检测到的序列梯模式与简氏乳杆菌1153中的类似，而在干酪乳杆菌Q中程度较低(图8B)。用抗c-Myc的mAb进行细菌细胞免疫染色之后作的流式细胞计数分析，检测到在所有含pOSEL175的乳杆菌菌种中荧光水平较低(图8)，但在含pOSEL241的简氏乳杆菌Xna和加氏乳杆菌1151中的荧光强度增加，这是抗体与表面展示的c-Myc表位的结合所致结果。此外，与含有pOSEL175的干酪乳杆菌相比，含有241的干酪乳杆菌Q中荧光强度增加了大约19倍。综合这些数据，简氏乳杆菌1153的天然锚定序列清楚地显示可广泛地用于支持包括人来源的多种乳杆菌表面展示蛋白质。

诱变的LPXTG基序对简氏乳杆菌表面表达2D CD4的作用

金黄色葡萄球菌的蛋白A是一种研究透彻的细胞壁锚定蛋白，当其LPETG细胞壁分类基序突变时，发现用天门冬酰胺(N)取代LPQTG中的脯氨酸(P)会降低蛋白表面展示的效率，而用丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)对蛋白表面展示的效率几乎没有影响(Navarre和Schneewind著，Microbiol.Mol.Biol.Rev.63：174-229(1999))。这项研究表明P残基可能是LPXTG基序中最重要的残基，而T残基可被类似的氨基酸S取代。为确定在C14和C370中的LPQTG基序是否的确是关键的分类信号，研究了LPQTG序列中P和T的重要性。PCR在C14和C370序列的LPQTG基序中产生点突变。P残基突变为丙氨酸(A)或天门冬酰胺(N)；氨基酸T突变为A、S或甘氨酸(G)；LPXTG基序中的氨基酸G突变为A。将含有改变的LPQTG基序的质粒分别命名为pOSEL237P(A)、pOSEL237P(N)、pOSEL237T(A)、pOSEL237T(G)、pOSEL237T(S)、pOSEL237G(A)、pOSEL249P(A)、pOSEL249P(N)、pOSEL249T(A)、pOSEL249T(G)、pOSEL249T(S)和pOSEL249G(A)。对含有突变构建物的简氏乳杆菌1153进行了Western和流式细胞计数分析。与含有亲代pOSEL237和pOSEL249的简氏乳杆菌相比，在用pAb T4-4对富含细胞壁蛋白组分进行Western印迹时，那些含有pOSEL237P(A)、pOSEL237P(N)、pOSEL249P(A)和pOSEL249P(N)的未显示出特征性的较高分子量的蛋白谱。而分泌到条件培养基中的2D CD4-CWA200融合蛋白显著增加，表明2DCD4-CWA200融合蛋白未共价连接到细胞壁上。与野生型pOSEL237和pOSEL249中观察到的那些蛋白相类似，对含有poSEL237T(S)和pOSEL249T(S)的简氏乳杆菌的细胞壁消化显示了较高分子量蛋白的特征图谱，提示C14和C370的LPQTG中的氨基酸T可有效地用S取代(数据未显示)。

为进一步确定诱变LPXTG对简氏乳杆菌表面蛋白展示的影响，用pAb T4-4或mAb Sim.4检测了含有pOSEL175、651、237、249的简氏乳杆菌菌株和各种突变构建物，然后用流式细胞计数分析抗体的结合情况。含有pOSEL237P(A)、pOSEL237P(N)的细菌细胞与含有pOSEL237的相比，含有pOSEL249P(A)、pOSEL249P(N)的细菌细胞与含有pOSEL249的相比，平均荧光强度大大降低，即使有一些2D CD4蛋白展示在细胞表面上也是极少的。但是，含有pOSEL237T(S)、pOSEL237T(A)、pOSEL249T(S)、pOSEL249T(A)的细菌细胞的平均荧光强度与含有pOSEL237和249的简氏乳杆菌相当，表明用S或A取代T对细胞壁锚定效率几乎没有影响(图9)。

Western印迹和流式细胞计数分析的数据表明C14和C370的LPQTG基序中的氨基酸P是不能随意取代的。相反，氨基酸T可用S或A取代依旧可以产生能有效地锚定到简氏乳杆菌细胞壁上的蛋白质。

C-末端带正电尾区缺失对简氏乳杆菌2D CD4表面表达的影响

革兰氏阳性细胞壁锚定结构域的一个特征是该蛋白C-末端尽头有一段带正电氨基酸延伸段。在M6蛋白中，这段序列(KRKEEN)作用是关键的细胞壁保留信号。在其它革兰氏阳性细菌中也发现了这些特征序列，包括葡萄球菌、肠球菌、李斯特菌和乳杆菌(Navarre和Schneewind著，Microbiol.Mol.Biol.Rev.63：174-229(1999))。两条序列RKKRQK¹⁷⁶⁵和KKKRKDDEA¹⁹⁰³分别鉴定为C14和C370假定锚定序列中的带正电尾区(图1)。为确定这两条序列是否可作为细胞表面保留信号，建立了一系列的缺失构建物(图10)。将它们分别命名为pOSEL237-5、pOSEL237-6、pOSEL237-7、pOSEL249-8、pOSEL249-9和pOSEL249-10。

对含有这些构建物的简氏乳杆菌进行了Western和流式细胞计数分析。迁移到48kDa处的蛋白质代表与CWA200融合的2D CD4，在SDS-PAGE后，用pAb T4-4可在所有含带电尾区被敲除构建物的简氏乳杆菌中检测到它。与含有亲代pOSEL237和249的细胞相比，含有pOSEL237-5、pOSEL237-6、pOSEL237-7、pOSEL249-8、pOSEL249-9和pOSEL249-10的简氏乳杆菌细胞分泌蛋白更丰富。对所有缺失突变株富含细胞壁组分的蛋白进行Western分析，未能检测到在含有pOSEL237或249的简氏乳杆菌中观察到的特征的序列梯模式(数据未显示)。这些数据提示2D CD4-CWA200融合蛋白未共价连接到细胞壁上。

用抗-CD4的pAb T4-4或mAb Sim.4检测后，对修饰的简氏乳杆菌进行流式细胞计数分析，与含有亲代pOSEL237或249的细菌细胞相比，检测到含有这些突变质粒的细菌细胞的平均荧光强度明显下降(图11)。这些数据结论性地表明C14和C370的带正电的C-末端缺失抑制了它们锚定到细胞壁和展示异源蛋白质的能力。

LPQTG基序作为细胞壁锚定信号的可行性

尽管革兰式阳性细菌的大多数细胞壁锚定蛋白有相同的分类信号LPXTG，但一些蛋白含有不同的基序。例如，类干酪乳杆菌的PrtP的分类信号是LPKTA(Holck和Nase著J.Gen.Microbiol.138：1353-1364(1992))。蛋白L和大消化链球菌的人血清白蛋白结合蛋白含有同样的LPXAG(基序de Chteau 和Bjrck著J.Biol.Chem.269：12147-12151(1994)；Keller等著，EMBO J.11：863-874(1992)；Murphy等著DNA Seq.4：259-265(1994))。当C14或C370锚定蛋白中的LPQTG突变为LPQAG或LPQSG时，2D CD4的表面展示仅有微弱下降，如SDS-PAGE后用流式细胞计数或Western印迹测定的那样。然而，根据以下证据，这些序列单独是不足以将蛋白质锚定到阴道的乳杆菌细胞壁上。这些证据是：1)36个氨基酸的C-末端锚定结构域单独不能将c-Myc表位或2D CD4固定到细胞表面，2)即使把高达200个氨基酸的上游序列包括进去，原型M6细胞壁锚定序列也(由化脓链球菌emm6基因编码)不能将异源蛋白质锚定到阴道乳杆菌细胞壁上(我们发现当使用类干酪乳杆菌的LPXTA基序时有类似的结果，和3)C191蛋白不是一种有效的锚定蛋白。这些发现证明C14和C370的CWA200区域中所含的上游序列也对细胞壁锚定过程有显著贡献。

2D CD4与C14和C370的CWA200融合对其生物学活性的提高

为了评价其生物学活性，用CD4ELISA分析了含有pOSEL237-7和pOSEL249-10的简氏乳杆菌1153释放的C14和C370蛋白的2D CD4-CWA200。将含有pOSEL651、pOSEL237-7和pOSEL249-10的细菌细胞培养在Rogosa SL肉汤中至不同的细胞密度。然后，收集无细胞的条件培养基。在OD₆₀₀＝0.8时，Western印迹检测到从pOSEL651释放到培养基中的2D CD4量和从pOSEL237-7或249-10释放入培养基的2D CD4-CWA200量相类似。然而，含有pOSEL237-7和pOSEL249-10的细菌细胞释放的2D CD4-CWA200量与含有pOSEL651释放的2D CD4蛋白相比活性高2-3倍。可能是辅助了蛋白的折叠过程，C14或C370的CWA200区域与2D CD4融合看来提高了蛋白质的活性。此相同的发现也用gp120结合试验得以证实(数据未显示)。对这些蛋白的Western印迹分析提示2D CD4-CWA200远比2D CD4稳定，可能这就是其生物活性得到提高的原因。

材料和方法

细菌菌株和培养

简氏乳杆菌、卷曲乳杆菌和干酪乳杆菌的人阴道菌株通过对健康妇女阴道样品进行细菌培养分离得到。用乳杆菌rRNA的两个特异性引物扩增16S-23S基因间隔区后，对照GenBank中的参考菌株DNA序列进行基因型分类(Tannock等著Appl.Environ.Microbiol.65：4264-4267(1999))。将菌株惯常地在37℃、5％的CO₂下，常规培养在MRS或Rogosa SL肉汤(Difico，Detroit，MI)中或MRS琼脂平皿上。

简氏乳杆菌1153基因组DNA的分离

简氏乳杆菌1153染色体DNA的分离依据以前用于分离卷曲乳杆菌JCM 5801染色体DNA的改进方法(Sillanpaa等著，J.Bacteriol.182：6440-6450(2000))。将简氏乳杆菌细菌在37℃、5％CO2下培养在200mlMRS培养基中直至600nm光密度达到1.0(0D600＝1.0)。6，600xg离心10min收集细胞，在25mMTris-HCl、pH8.0，10mM的EDTA，50mM葡萄糖液中洗涤一次，每100ml细菌培养物中加入2.5ml的20mM、pH8.0Tris-HCl，5ml24％的聚乙二醇8000和2.5ml的溶菌酶(4mg/ml，SigmaChemical Co.，St.Louis，Mo)重悬。所得细菌悬浮液37℃孵育1小时。加入5ml的0.2MEDTA后，4℃1,000xg离心细胞10min，然后重悬在10ml含有50μl变溶菌素(15,000U/ml；Sigma Chemical Co.)的20mM、pH8.0Tris中。37℃孵育1小时后，加入1.5ml9％Sarkosyl(Sigma Chemical Co.)和3ml5MNaCl使细胞裂解。然后将细胞裂解物与2.9ml5M高氯酸钠混合。以17.5ml氯仿-异丙醇(24∶1v/v)抽提染色体DNA，乙醇沉淀，空气干燥，重悬在100mM、pH8.0的Tris-HCl，1mMEDTA中，浓度为1.5mg/ml。最后，所制备的基因组DNA用无DNA酶的RNA酶处理。

简氏乳杆菌基因组文库的构建

将简氏乳杆菌1153的基因组DNA用HydroShear(GeneMachine，San Carlos，CA)机械剪切成期望的大小。剪切的DNA片段用T4DNA聚合酶和Klenow酶处理成平端，在琼脂糖凝胶电泳后用QIAquick Gel Extraction试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化得到3-8Kb的DNA片段。将所得DNA片段连接到pUC18载体中，再转化到大肠杆菌DH 10B细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中得到3-8-Kb的基因组文库。细菌转化物在含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的LB平皿上选出，所得到的菌落用Q-pix机器人(Genetix Ltd.，UK)排列到96-孔板中。测试由96个克隆组成的平板的插入片段大小的一致性和非重组物的百分比来确定文库的质量。两个文库含有少于5％的非重组物，超过90％的插入片段在预期大小的20％之内。

简氏乳杆菌基因组测序和装配

用全基因组鸟枪法确定简氏乳杆菌的基因组序列。从基因组文库选出克隆的质粒DNA用磁珠或用滚环法纯化，然后用ABI BigDye终止子试剂盒(AppliedBiosystems，Foster City，CA)测定两端序列。所有的测序反应均在ABI PRISM3700自动DNA测序仪(Applied Biosystems)上进行。总共读取了15,360个序列或作了160个序列板覆盖了3倍的简氏乳杆菌1153基因组。只有当一个序列阅读产生超过Q20的50个碱基(在100个碱基中有1个可能的错误)或符合更高的精确性时，才认为是成功的。将序列谱自动转移到UNLX系统用Phred(Ewing等著，GenomeResearch 8：175-185(1998))进行碱基调用和质量评价。通过率超过80％，平均阅读长度范围为400-500碱基。用Paracel GenomeAssembler或CAP4(Paracel，Inc.，Pasadena，CA)进行序列装配。共装配了484个毗连群。简氏乳杆菌1153基因组中含细胞壁锚定基序的蛋白序列的鉴定

革兰氏阳性细菌的细胞壁锚定蛋白含有保守的C-末端LPXTGX基序(Fischetti等著，Mol.Microbiol.4：1603-1605(1990))。这个六肽之后是疏水性氨基酸延伸段和短的带电荷尾区，也称为终止转移序列(Schneewind等著，Cell70：267-281(1992))。此外，在类干酪乳杆菌中也鉴定到另一个独特的LPXTA分类基序(Holck和Naes著，J.Gen.Microbiol.138：1353-1364(1992))。为鉴定天然的细胞壁锚定序列，编写了计算机文本以鉴定装配的毗连群所有读码框中与LPXTG和LPXTA相似的基序(估计得自简氏乳杆菌1153完全基因组序列的75％)。用BLAST检索与革兰氏阳性细菌的细胞壁锚定蛋白序列同源性进一步验证所得到的含有假定细胞壁锚定基序的毗连群。

穿梭载体的构建

用于这些研究的原代穿梭载体pOSEL175是pLEM7的修饰版本(Fons等著，Plasmid 37：199-203(1997))。首先用Sma I切割，Nde I部分消化，Klenow片段使之成为平端然后再连接使其部分IS元件缺失。最后，该质粒经定点诱变去除了pOSEL144的erm基因中两个Mfe I位点(Chang等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100：11672-11677(2003))。所得到的pOSEL175质粒含有大肠杆菌(ColE1)和乳杆菌(repA)二者的复制起始点，因而含有可用于在各种乳杆菌菌种中表达异源蛋白的穿梭质粒的主链。

简氏乳杆菌中表达盒的构建

为方便在简氏乳杆菌中表达表面锚定蛋白，构建了一表达盒并将其亚克隆到pOSEL175的SacI和XbaI位点中。该表达盒含有4种成份，包括乳杆菌相容的P23启动子、卷曲乳杆菌的CbsA信号序列、编码异源蛋白的DNA和革兰氏阳性细菌的已知或假定的细胞表面蛋白的共价细胞壁锚定结构域。我们对含有一系列启动子和信号序列的构件的详细分析暗示了结合乳酸乳球菌的P23启动子(van derVossenet等著，Appl.Environ.Microbiol.53：2452-2457(1987))和来自卷曲乳杆菌的CbsA(CbsAss)的信号序列组合可驱动命名为pOSEL651的构建物中的2D CD4蛋白最高水平表达(Chang等著，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100：11672-11677(2003))。将独特的限制性位点，包括SacI、EcoRI、NheI、MfeI和XbaI，分别置于5’到3’末端各成份之间。用Pfu DNA聚合酶进行PCR反应对每个组分进行扩增。用于本研究中详细说明的融合构建物不同部分PCR扩增的寡多聚核苷酸引物如下：

P23.f 5’-GTG GAGCTCCCCGAAAAGCCCTGACAACCC-3’

P23.r 5’-GGAAACAC GCTAGCACTAACTTCATT-3’

2DCD4.f 5’-GCG GCTAGCAAGAAAGTTGTTTTAGGTAAA-3’

2DCD4.r 5’-GCA CAATTGTGATGCCTTTTGAAAAGCTAA-3’

CbsAss.f 5’-GCGAATTCAAGGAGGAAAAGACCACAT-3’

CbsAss.r 5’-1CCAGCTAGCTGAAACAGTAGAAACGGC-3’

计划基序表面表达的蛋白质包括10个氨基酸的c-Myc多肽(EQKLISEEDL)和含人CD4(2D CD4)N-末端两个细胞外结构域的前183个氨基酸。按照优选的乳杆菌密码子利用率将2D CD4蛋白重新编码。所有的表达构建物用DNA序列分析验证后转化到简氏乳杆菌中。

c-Myc与简氏乳杆菌假定的细胞壁锚定序列融合物的构建

我们最初选择表位标记来测定蛋白质表达的水平和采用确定长度的假定细胞壁锚定序列来表面展示生物活性蛋白是否可行。为不破坏C-末端分类基序的功能，设计了5’末端含有10个氨基酸c-Myc表位(EQKLISEEDL)的寡多聚核苷酸引物，它可将c-Myc表位融合到假定的细胞壁锚定序列(包括简氏乳杆菌1153的C14、C191和C370)的N-末端。该c-Myc序列或以直接融合于这些蛋白(C14、C191和C370的C-末端的30个氨基酸)的细胞壁锚定基序，或融合于含有C-末端细胞壁锚定结构域和各种长度的上游毗连氨基酸的序列。最值得注意的是，c-Myc融合于含有细胞壁锚定结构域和上游氨基酸的200个氨基酸的序列(命名为CWA200)上。

Myc14nhe(5’引物)

(GC GCTAGCGAACAGAAACTGATCTCCGAAGAGGACCTGGTAACTCGTACTATCAATGTA)

Myc14mfe(3’引物)

(CGC CAATTGCTACTTTTGACGTTTCTTTCT)

Myc191nhe(5’引物)

(GC GCTAGCGAACAGAAACTGATCTCCGAAGAGGACCTGGACGTAGTAATTCCAGGAA)

Myc191mfe(3’引物)

(GCG CAATTGTTAATCTTCTTTTCTCTTCTT)

Myc370nhe(5’引物)

(GC GCTAGCGAACAGAAACTGATCTCCGAAGAGGACCTGTTGAAGAAGGCAGAAGAAGT)

Myc370mfe(3’引物)

(CCG CAATTGTTATGCTTCATCATCTTTTCT)

将所有期望大小的PCR产物用凝胶纯化并用MfeI和NheI消化。所得片段与用MfeI/NheI双重消化的pOSEL651连接使c-Myc分别与pOSEL239(经由C14序列的CWA200)、pOSEL240(经由C191序列的CWA200)和pOSEL241(经由C370序列)融合。所得到的质粒通过电穿孔进入简氏乳杆菌1153。

将细胞壁锚定序列亚克隆到穿梭载体中

选择了3个含有C-末端LPQTG锚定基序的假定表面蛋白，测定它们在简氏乳杆菌1153的细胞壁上表达外源蛋白的能力。含有C-末端LPQTG结构域和这些表面蛋白上游200个氨基酸(暂命名为CWA200区域)的DNA区域用如下3套引物扩增，

C14： 5’引物(GCG CAATTGGTAACTCGTACTATCAATGTA)

3’引物(CGC TCTAGATACACAAACTATTTTACGGTC)

C191：5’引物(GCG CAATTGGACGTAGTAATTCCAGGAACA)

3’引物(CGG TCTAGACCAAGCAATTTATATATTGCT)

C370：5’引物(GCG CAATTGAAGAAGGCAGAAGAAGT)

3’引物(CCG TCTAGATTATGCTTCATCATCTTTTCT)

对C14锚定结构域的内部MfeI位点和C370锚定结构域的XbaI位点在限制性酶切反应之前进行定点诱变。所有具有预期大小的PCR产物用凝胶纯化并用MfeI和XbaI消化。将所得片段与用MfeI/NheI双重消化的、含有P23-调控分泌的2D CD4的pOSEL651连接，分别制备质粒pOSEL237(经由C14序列的CWA200)、pOSEL242(经由C191序列的CWA200)和pOSEL249(经由C370序列的CWA300)。或者将C14序列的C-末端36个氨基酸的锚定基序用下述两个引物类似地克隆到穿梭载体中。

Mfecl4up：5’GCGC AATTGCCACAAACTGGTTCTAAGACT

Xnacl4lo：3’引物(CGC TCTAGATACACAACTATTTTACGGTC)

将所有得到的质粒在验证了DNA序列后用电穿孔进入简氏乳杆菌、加氏乳杆菌和干酪乳杆菌中。

C370序列的重复细胞壁跨越区域的亚克隆

从简氏乳杆菌1153基因组DNA扩增C370的LPQTG基序上游的不同重复性细胞壁跨越区域。每个PCR反应使用以下的5’引物和与之配对的相同的3’引物(5’-CCG TCTAGATTATGCTTCATCATCTTTTCT-3’)。

0重复： 5’-CGG CAATTGCCTCAAACTGGTACTGA-3’

1个重复： 5’-CGG CAATTGGGTCAAACTACAAATAAAGAT-3’

2个重复： 5’-CGC CAATTGGGTCAAACTACTGATAAGAGT-3’

3个重复： 5’-GCG CAATTGGGTCAAACTACAAATAAAGAT-3’

4-8个重复：5’-CGG CAATTGGGTCAAACTACTGACAAGAGC-3’

下划线的是这些引物中的MfeI和XbaI位点。

将所有具有预期大小的PCR产物用凝胶纯化并用MfeI和XbaI消化。将所得片段与用MfeI/XbaI双重消化的、含有P23-调控分泌的2D CD4的pOSEL237连接分别制备质粒pOSEL262(无重复)、pOSEL268(一个重复)、pOSEL278(两个重复)、pOSEL284(三个重复)、pOSEL280(四个重复)、pOSEL275(六个重复)、pOSEL281(七个重复)和pOSEL276(八个重复)。

细菌转化

将质粒通过电穿孔引入大肠杆菌DHl2S(Invitrogen)中。为构建和维持穿梭质粒，将转化的大肠杆菌DHL2S细胞37℃培养在添加有10μg/ml氨苄西林或300μg/ml红霉素的LB肉汤(Difco)中。在验证DNA序列后，按照Luchansky等人所述(J.Dairy Sci.74，3293-3302(1991))的改进方法将得自大肠杆菌的质粒转化到进简氏乳杆菌、加氏乳杆菌和干酪乳杆菌中。简言之，将新鲜接种的简氏乳杆菌37℃、5％CO₂培养在MRS肉汤中直至OD₆₀₀值为0.6-0.7。收集细菌细胞，洗涤，4℃重悬在925mM蔗糖和3.5mMMgCl₂中。使用预冷的0.2cm的凹口比色杯，在感受态细胞中加入1～2μg的DNA立即用Gene Pulser II(Bio-Rad，Hercules，CA)以2.5kV/cm和200ohms对细胞进行电穿孔。细胞在37℃、预热的MRS肉汤中恢复2小时后，接种到含有20μg/ml红霉素(通常用于在液体培养基中常规增殖转化的简氏乳杆菌的浓度)的选择性MRS平板上。

假定的细胞壁锚定序列的LPXTG基序的定点诱变

使用Stratagene(La Jolla，CA)的QuickChangeXL定点诱变试剂盒来产生点突变。采用质粒pOSEL237(通过C14序列的CWA200表达锚定的2D CD4)和质粒pOSEL249(通过C370序列的CWA200表达锚定的2D CD4)作为模板。根据对应于LPQTG和它在C14和C370侧翼序列的核苷酸序列设计诱变用引物：

C14-GAAAGTAAGAAGACT TTACCACAAACTGGTTCTAAGACTGAA

用简氏乳杆菌1153优选的密码子选出取代的核苷酸：

237P(A)：用丙氨酸取代C14的LPQTG上的脯氨酸

5’-GAAAGTAAGAAGACTTTA GCACAAACTGGTTCTAAGA-3’

5’-GTCTTAGAaccAGTTTG TGCTAAAGTCTTCTTACTTTC-3’

237P(N)：用天门冬酰胺取代C14的LPQTG上的脯氨酸

5’-GAAAGTAAGAAGACTTTA AATCAAACTGGTTCTAAGAC-3’

5’-GTCTTAGAACCAGTTTG ATTTAAAGTCTTCTTACTTTC-3’

237T(A)：用丙氨酸取代C14的LPQTG上的苏氨酸

5’-AGAAGACTTTACCACAA GCTGGTTCTAAGACTGAAC-3’

5’-GTTCAGTCTTAGAACC AGCTTGTGGTAAAGTCTTCT-3’

237T(G)：用甘氨酸取代C14的LPQTG上的苏氨酸

5’-AGAAGACTTTACCACAA GGTGGTTCTAAGACTGAAC-3’

5’-GTTCAGTCTTAGAACC ACCTTGTGGTAAAGTCTTCT-3’

237T(S)：用丝氨酸取代C14的LPQTG上的苏氨酸

5’-AGAAGACTTTACCACAA AGTGGTTCTAAGACTGAAC-3’

5’-GTTAGTTTCAGTACC ACTTTGAGGCAATAGAGTTTG-3’

237G(A)：用丙氨酸取代C14的LPQTG上的甘氨酸

5’-GACTTTACCACAAACT GCTTCTAAGACTGAACAAG-3’

5’-CTTGTTCAGTCTTAGA AGCAGTTTGTGGTAAAGTC-3’

249P(A)：用丙氨酸取代C370的LPQTG上的脯氨酸

5’-CATAAGCAAACTCTATTG GCTCAAACTGGTACTGAAAC3’

5’-GTTTCAGTACCAGTTTG AGCCAATAGAGTTTGCTTATG-3’

249P(N)：用天门冬酰胺取代C370的LPQTG上的脯氨酸

5’-CATAAGCAAACTCTATTG AATCAAACTGGTACTGAAAC3’

5’-GTTTCAGTACCAGTTTG ATTCAATAGAGTTTGCTTATG-3’

249T(A)：用丙氨酸取代C370的LPQTG上的苏氨酸

5’-CAAACTCTATTGCCTCAA AGTGGTACTGAAACTAA-3’

5’-GTTAGTTTCAGTACC AGTTTGAGGCAATAGAGTTTG-3’

249T(G)：用甘氨酸取代C370的LPQTG上的苏氨酸

5’-CAAACTCTATTGCCTCAA GGTGGTACTGAAACTAAC-3’

5’-GTTAGTTTCAGTACC ACCTTGAGGCAATAGAGTTTG-3’

249T(S)：用丝氨酸取代C370的LPQTG上的苏氨酸

5’-CAAACTCTATTGCCTCAA AGTGGTACTGAAACT-3’

5’-GTTAGTTTCAGTACC ACTTTGAGGCAATAGAGTTTG-3’

249G(A)：用丙氨酸取代C370的LPQTG上的甘氨酸

5’-CTCTATTGCCTCAAACT GCTACTGAAACTAACCCAC-3’

5’-GTGGGTTAGTTTCAGT AGCAGTTTGAGGCAATAGAG-3’

聚合酶链式反应(PCR)循环的条件是95℃50秒、60℃50秒和68℃12分钟，共进行16轮循环。

将Dpn I酶加入PCR反应后的扩增混合物中降解亲代质粒。按照生产商推荐方法将新合成的质粒导入化学感受态大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen)中。将质粒在添加有200μg/ml红霉素的LB肉汤(Difco)中维持并扩增。验证DNA序列后，按照Luchansky等人所述(j.Dairy Sci.74，3293-3302(1991))的改进方法将得自大肠杆菌的质粒转化到简氏乳杆菌中。使用含有20μg/ml红霉素的MRS选择含有诱变质粒的转化简氏乳杆菌并使之增殖。

假定的细胞壁锚定蛋白的带正电C-末端序列的缺失分析

用PCR扩增产生了一系列正电荷氨基酸位于C14和C370的C-末端的缺失突变体。用质粒pOSEL237和pOSEL249作为模板。与pOSEL237和pOSEL249上的2D CD4序列互补的寡聚核苷酸(CD4F5’-GATCGTGCTGATTCACGTCGT-3’)用作正向引物。下列的寡聚核苷酸(下划线处是限制酶切位点)用作反向引物，扩增2D CD4cDNA和完整的C14和C370CWA200序列的C-末端。

C14-7 5’-GCGC TCTAGACTAAACACCTAAGCCTAATAAGC-3’

C14-6 5’-GCGC TCTAGACTAGTTAACACCTAAGCCTAATAAG-3’

C14-5 5’-GCGC TCTAGACTATCTGTTAACACCTAAGCC-3’

370-10 5’-GCGC TCTAGATTAAAAAATTCCTGCGCCTAATG-3’

370-9 5’-GCGC TCTAGATTATGCAAAAATTCCTGCGCCTAATG-3’

370-8 5’-GCGC TCTAGATTACTTTGCAAAAATTCCTGCGCC-3’

所有的反向引物均含有一XbaI限制位点。循环条件是94℃45秒、60℃45秒和72℃90秒，共进行18轮循环。PCR产物用凝胶纯化并用MfeI和XbaI消化，然后分别亚克隆到MfeI/XbaI双重消化的pOSEL237和pOSEL249中。序列用核苷酸测序进行验证，并通过电穿孔将构建物转入简氏乳杆菌作蛋白分析。

在简氏乳杆菌中表达的异源蛋白质的Western分析

将遗传学修饰的简氏乳杆菌在37℃、5％CO₂，培养在含100mMHEPES、pH7.1的Rogosa SL缓冲肉汤中。为测定可溶性蛋白质水平，12,000xg离心后收集条件培养基，然后用终浓度20％的TCA沉淀蛋白。TCA沉淀物用乙醇洗涤，空气干燥，在50mMTris-HCl、pH6.8，0.4％SDS，6％蔗糖，10mM二硫苏糖醇和0.01％溴酚蓝(1x还原性SDS-PAGE缓冲液)中加热变性。为测定简氏乳杆菌中细胞相关蛋白的相对量，不诱导细胞裂解，37℃每OD600单位用100μl的1xSDS-PAGE缓冲液抽提30分钟。12,000xg离心5分钟后收集抽提的蛋白质，接着加热使之变性。14,000xg离心细菌细胞分离可溶性蛋白，然后按照生产商建议使用抗氧化剂在4-12％NuPAGE系统(Invitrogen)中用SDS-PAGE分辨该可溶性蛋白质。电泳分离后，蛋白在20％甲醇、20mMTris和50mM甘氨酸中电印迹到聚二氟乙烯(polyvinylidinedifluoride)膜(Millipore)上。然后用多克隆兔抗-CD4抗体、T4-4(NIH AIDSResearch and Reference Reagent Program)或兔抗-CV-NpAb和抗c-Myc的单克隆抗体(Invitrogen)检测印迹。用碱性磷酸酶偶联的抗-兔IgG(检测CD4)的显色检测试剂(Promega，Madison，WI)或用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗-鼠IgG(检测c-Myc)的增强化学发光试剂(Amercham Bioscience，Piscataway，NJ)显现抗原-抗体反应。类似的，c-Myc标记蛋白的水平用抗c-Myc的mAb(Invitrogen)检测，结合抗体用HRP偶联的抗-鼠第二抗体检测(Amersham Bioscience)。

用溶菌酶对简氏乳杆菌细胞壁进行酶消化

将含有10⁹个细菌的细菌培养物12,000xg离心5分钟。所得到的细菌沉淀用pH7.2的20mMHEPES中洗涤一次，重悬在100μl的10mMTris-HCl、pH8.1，1mMEDTA，25％的蔗糖(Piard等著，J.Bacteriol.179：3068-3072(1997))中。存在溶菌酶时，将细菌细胞壁在37℃、用终浓度为15单位/ml的变溶菌素(Sigma Chemical Co.)消化1小时。然后，2,500xg离心细胞10分钟将富含细胞壁的组分与富含原生质体的组分相分离。在富含细胞壁或原生质体的组分中分别加入25μl的4x或125μl的1x还原性SDS-PAGE缓冲液，将所得样品加热变性。此外，不额外处理样品，用CD4ELISA分析富含细胞壁组分中的蛋白质。

用磺基-NHS-生物素标记简氏乳杆菌中表面暴露的蛋白质

用不渗透磺基-N-羟琥珀酰亚胺基(NHS)-生物素的膜检测简氏乳杆菌表面蛋白中表面暴露的赖氨酰残基。NHS-生物素表面标记的革兰氏阴性菌幽门螺杆菌可以鉴定真性细胞表面蛋白(Sabarth等著，J.Biol.Chem.70：27896-27902(2002))。取对数生长期的大约10⁹个简氏乳杆菌细菌用PBS洗涤一次并重悬。在1ml的细胞悬液中加入磺基-NHS-生物素至终浓度1mM，室温、连续摇动孵育30分钟。然后加入pH8.0、50mMTris终止生物素化反应，细胞用pH7.2、20mMHEPES洗涤一次。不诱导细胞裂解，37℃，用pH6.8的125μ l0.4％SDS、6％蔗糖、10mMDTT、50mMTris-HCl中抽提细胞相关蛋白30分钟。14,000xg离心5分钟使抽提的蛋白与细菌细胞分离。加热变性后，在4-12％NuPAGE(Invitrogen)中分辨蛋白质。在用碱性磷酸酶偶联的链霉亲和素或其它免疫学探针检测后，测定了生物素化蛋白质和其迁移率。

用流式细胞计数分析2D CD4的表面表达

将含有能在pOSEL651中表面表达蛋白或分泌蛋白的质粒转化的简氏乳杆菌37℃、5％CO₂，在含有20μg/ml红霉素的MRS肉汤中培养过夜(OD600＞3)。将过夜培养物以1∶50～100稀释液亚培养在用pH7.1、100mMHEPES缓冲(除非另有暗示)的含红霉素的MRS或Rogosa SL肉汤中。12,000离心1mlOD～＝0.4的细胞培养物5分钟。洗涤所得细胞沉淀两次，用含有2％FBS的1xPBS液重悬。然后，细胞用含2％FBS的1xPBS配制的特异性抗体(1∶1000稀释的兔多克隆T4.4或每2×10⁸个细胞用50μg/ml的单克隆Sim.4)处理30分钟，接着用FITC或藻红素-偶联的抗-兔或鼠抗体(Becton-Dickinson，Mountain View，CA)处理进行表面染色。检测表面表达的CV-N方法类似。对照同型-匹配的单克隆抗体处理(Becton-Dickinson)。标记的细胞用1％(v/v)多聚甲醛固定并用带CellQuest软件运行的FACScalibur系统(Becton-Dickinson)分析。背景对照的密度图谱输出(侧向散射或正向散射对荧光作图)得自含有pOSEL175的简氏乳杆菌。各图谱之间平均荧光强度的改变用作抗体与细菌表面结合的一种衡量，并用FLOWJO软件计算。

酶联免疫吸附试验

用McCallus等著(Viral Immunol.5：209-219(1992))的改进CD4捕获酶联免疫吸附试验(ELISA)来测定正确折叠的2D CD4蛋白质浓度。在Maxisorp96孔板(Nalge Nunc International，Denmark)上，用2.5μg/ml的单克隆抗体Sim.4捕获无菌条件培养基中的正确构型的2D CD4蛋白。结合的CD4分子用含0.05％Tween20的1xTris缓冲盐水洗涤后，以大肠杆菌重折叠的2D CD4标准品为参考，用兔多克隆抗体T4-4检测，然后于室温、黑暗中，在含有3，3’5，5’四甲基联苯胺(Neogen Corp.，Lexington，KY)的情况下用辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG(Amersham Bioscience)进行了30分钟的检测。加入100μl0.5MH₂SO₄终止反应，用微滴板阅读仪(Molecular Device，Sunnyvale，CA)读取450nm吸光度。

提供上述实施例是为了说明本发明而非限制其范围。对本发明的其它改变对本领域普通技术人员不难明白均包括在本发明的权利要求中。本文引用的所有出版物、数据库、Genebank序列、专利和专利申请均包括在参考文献中。

序列表

SEQ ID NO：1

C14序列

¹MNDSSIGTINITNDITITGKVNGLTTSGISDINKHFLYLQSEGSARDLTINGNGHRINFA

GYSLALQNKNYTNAANPWNITLKDMTIEGSKYDYSPISFYGRKSNTENSKLTFDGVT

ANLNDRPLVDKYGENLPVHFAGENNITLNNMSIGYNLVTGKTVKFDSGNTTFNVDG

KVTGNSINPDNWVIRSTENASNSENPSTLINEGATVTINAKSDDLRGIYAGRQLTAGQ

PIYGVTVINGTLNAKMAAGHSTAIWSHDLEIGKKGNVTIHTKQTNQADGVENGTSNS

VTNYNGTHYAPISLGVGPISSVASPLSKQTVSLINNGSLTIIRDTAKKTLVPLISMGDGS

LSSNTTLKFSVGAGATLDLQDKAGTFRYGIEPSTPLNGLVTLWGTSGTDLLEFLTPAY

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QTLSDLDANKGLKDLIGPDEQPITDFKDIVKHVTWYNSATDKDEWNKIMIQPTDSKD

PSARVPYPEPQNPTGNLRTTDGFAWAKVTYADGSVDFVKIPLKVTEKKYSEELTPSY

PGVSVEQGKSDSVDPSFKDENDKAADAPAGTKYTAGENTPDWIKVDPDTGKVTVSP

TDDTSVGSHDISVTVTYPDSSTDQLTVPVTVTEKSNLAEKYPVSYDKLNVEKPSGDT

PATGAVDPKAAADMPEGAITGYEKGDFDAPAGVTIDVNHDTGKVTASVGKNATLG

SFEVPVKVTYSDGTYAEVKVPVSITGNKVDPGSGDVVYYGDQSMVVFNGNLTTVH

KTTDSHELSAKDSAFQTITYYSDWNKKGNIVSDYNKHVIYKLSADGTKYVNEADAT

DSFDASAISFNWQKGYEVNTGVDNFSNGSADTLYQLEKGAVNSEEQTDANDPSGLA

GNSKYRYDFSISDTNVLQKLGLSPAGYNAWANVYNFLGATGKINIPVNYGSEVSTD

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KLNVQVTFKTGSHVSTSGSKVNDDTNLYVERTIEYDVTGTGHSPINSVTQKVHYVRD

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GYTPSQAKVEAKTVTAETEAASVTISYTKNADIPVPYKPGKDGVNDAINRYVTRTIIV

KEPGKEPQTITQTVHFTNEDKDGNSGYKDPVTGEIKYNIDWHVASDLNAKTGSWEE

YTAPSVTGYTPSQAKVEAKTVTAETEAASVTISYTKNADIPVPFDPSNKDMYRE VTR

TNVVDPITGKISTSVQTAKFIREDKNSNAGYTDPVTGKTTMNPWTPAKPGLRAVNV

EQIKGYVAKVDGNVDAVVVTPDSANMVVTTTYQANKPEGQNITVKKDTVPDPADGI

KNKDDLPDGTKYTWKEVPDVNSVGEKTGIVTVTFPDGTSVDVKVTVYVDPVVESN

RDTLSKEANTGNTNVAKAATVTSSKVESKKTLPQTGSKTEQVGILGLAIATVGSLLG

LGVNRKKRQK ¹⁷⁶⁵

SEQ ID NO：2

C191序列

¹MPVANKPEGTVHTTYSWKDNIIPDTTKPGTKYGIVEVNFPDGSTKDVPVEVKVTSL

ASDYQNKIDTKQIIAKYKGNIPQASDGIANKDQATKEGDKDFPSLADVLAPNGIQWK

KNFEPDLSKPGLTSGEAILTFKDGSTAEVTIPVLVQTDADRNTPETQTIKTLPGQTVNP

EDGVINLHKPGENNPQLPDGTKVTFDNQSDVDDFIKHGMPGSDKSFDATVTYPDGT

TDKIKLPVHITADNEVNTPITQGIITPKDSVPDANKGIANLKKATTKEGKTYPALPENT

TVEWVNPGQMKTELENAKGGTTKNYDAVVIYDKSTEIVSIPVTVATDADTYKVVT

QPIDLKDRNLPDNADDGITNLHKPADFKTPQLPDGTHAEWQDKDAAQEVVKNLKPG

ETVKLPATVVFPDGSKKGEGIDVSVHLHGQSDDYNIETQPVNTDKDGNLPENADSGI

KNLGKLPEGTHASWGDGAQDIAKNLKPGETKDVPATVVFPDGSKKEITIPVHREGQS

DGYDVEPQLVNTDKNGQLPNAKEGIKNLADLPEGTNPTWADRAQDKINKTKPGTDT

TAQVVVTFPDGSTKEVTVPVHKHGQSDDYGDKIVTQRVETDSHGQLPENADSGIKN

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QDVVIPGTETVVEKQKESLNPPTDKVPVDDTKHITDEDKGKVIDNVKKSNPDKDITD

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VIDNVKKSNPDKDITDAHVDDDGTFHGKVDGQDVVIPGIETVVEKSTNNQKSDTNK

GLISNDNSEKNSHMINANVNTKSRNSLSAKQNRLPQTGSETSGLSALGLAMLSLVGL

GFLIKKRKED ⁹⁷⁴

SEQ ID NO：3

C370序列

¹MFYQIDPALAPYIDKIVFSRALLSDGEATKDTSNEVPGATNVWTSGVLTTQNGPIRA

ALAGSTSSTYKIYLKADTPNSILSKPLSPTMWARYSSGHDMVSDFSKNLILNDNETTT

FSSNNFFKSLDIVNNDGPILDNMSVDYSNKTVNTRYPRVNGSLLGDKSNLTLRIRGND

NLLKLIDKVKISNKTYTLANNTLKYRTGELYINDIGGSLGFLSSLSNRQDFNVTFYLK

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QNNFQKGNPLIQPASPTAVTAVTIKASDGTNNSTTVTGKAAAGETVTVKDSSGNEIG

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KLDEAITDANNTKLTDKYNNASDDTKSKFDEALKKAENVKNDSNATQKEVDDATN

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NATQKEVDDATKNLKQAQNDLDGQTTNKDAINDAIKDANNAKGTDKYNNASDDT

KSKFDDALKKAEDVKNDSNANQKEVDDATKNLKNTLNNLKGQPAKKANLIASKDN

AKIHKQTLLPQTGTETNPLTAIGIGLMALGAGIFAKKKRKDDEA ¹⁹⁰³

SEQ ID NO：4

KKAEEVKNNSNATQKEVDDATNNLKQAQNDLDGQTTDKSKLDEAIKSADDTKSTD

KYNNASDDTKSDALKKAEEVKNNSNATQKEVDDATKNLKQAQNDLDGQTTN

KDAINDAIKDANNAKGTDKYNNADSSTKSKFDDALKKAEDVKNDSNANQKEVDD

ATKNLKNTLNNLKGQPAKKANLIASKDNAKIHKOTL

SEQ ID NO：5

GQTTNKDAINDAIKDANNAKGTDKYNNASDDTKSKFDDALKKAEDVKNDSNANQK

EVDDATKNLKNTLNNLKGQPAKKANLIASKDNAKIHKQTL

SEQ ID NO：6

VIRTINVVDPITGKISTSVQTAKFTREDKNSNAGYTDPVTGKTTMNPWTPAKQGLRA

VNVEQIKGYVAKVDGNVDAVVVTPDSANMVVTITYQANKPEGQNITVKKDTVPDP

ADGIKNKDDLPDGTKYTWKEVPDVNSVGEKTGIVTVTFPDGTSVDVKVTVYVDPVV

ESNRDTLSKEANTGNTNVAKAATVTSSKVESKKT

SEQ ID NO：7

VTRTINVVDPITGKISTSVQTAKFTREDKNSNAGYTDPVTGKTTMNPWTPAKQGLRA

VNVEQIKGYVAKVDGNVDAVVVTPDSANMVVTITYQANKPEGQNITVKKDTVPDP

ADGIKNKDDLPDGTKYTWKEVPDVNSYGEKTGIVTVTFPDGTSVDVKVTVYVDPVV

ESNRDTLSKEANTGNTNVAKAATVTSSKVESKKTLPQTGSKTEQVGILGLAIATVGS

LLGLGVN

SEQ ID NO：8

KKAEEVKNNSNATQKEVDDATNNLKQAQNDLDGQTTDKSKLTEAIKSADDTKSTD

KYNNASDDTKSKFDEALKKAEEVKNNSNATQKEVDDATKNLKQAQNDLDGQTTN

KDAINDAIKDANNAKGTDKYNNASDDTKSKFDDALKKAEDVKNDSNANQKEVDD

ATKNLKNTLNNLKGQPAKKANLKDNAKIHKQTLLPQTGTETNPLTAIGIGLMAL

GAGIFA

Claims

1.一种含有表达盒的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述表达盒含有操作性连接于编码信号序列和生物活性多肽的多聚核苷酸的启动子，其中，所述生物活性多肽与异源性羧基末端细胞壁靶向区域相连，其中所述异源性羧基末端细胞壁靶向区域含有按以下顺序排列的序列：

细胞壁相关序列；

LPQ(S/A/T)(G/A)；和

疏水序列。

2.如权利要求1所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述细胞壁相关序列含有至少50个氨基酸。

3.如权利要求1所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述细胞壁相关序列含有至少200个氨基酸。

4.如权利要求1所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述异源性羧基末端细胞壁靶向区域在该区域的羧基末端还含有一带电荷的序列。

5.如权利要求1所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述乳杆菌属细菌是寄居在阴道的菌株。

6.如权利要求1所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述乳杆菌属细菌选自：简氏乳杆菌、加氏乳杆菌和干酪乳杆菌。

7.如权利要求1所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述细胞壁靶向区域含有氨基酸序列LPQSG。

8.如权利要求1所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述细胞壁靶向区域含有氨基酸序列LPQAG。

9.如权利要求1所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述细胞壁靶向区域含有氨基酸序列LPQTG。

10.如权利要求1所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述细胞壁靶向区域含有氨基酸序列LPQTA。

11.如权利要求1所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述细胞壁靶向区域含有SEQ ID NO：7。

12.如权利要求1所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述细胞壁靶向区域含有SEQ ID NO：8。

13.如权利要求1所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述生物活性多肽表达在细菌细胞壁上。

14.如权利要求1所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述生物活性多肽在10-600个氨基酸之间。

15.如权利要求1所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，当生物活性蛋白与病原体接触时能与病原体结合。

16.如权利要求15所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述病原体是细菌病原体。

17.如权利要求15所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述病原体是真菌病原体。

18.如权利要求15所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述病原体是病毒病原体。

19.如权利要求18所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述病毒病原体是HIV。

20.如权利要求19所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述生物活性蛋白是CD4或CD4的HIV结合片段。

21.如权利要求19所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述生物活性蛋白是2D-CD4。

22.如权利要求18所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述生物活性蛋白是蓝病毒素-N或蓝病毒素-N的病毒结合片段。

23.如权利要求18所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述病毒病原体是单纯疱疹病毒。

24.如权利要求18所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述生物活性蛋白是单纯疱疹病毒进入介质C(HveC)或HveC的病毒结合片段。

25.如权利要求1所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述生物活性多肽释放自乳杆菌属细菌。

26.如权利要求4所述的乳杆菌属细菌，其特征在于，所述生物活性多肽锚定到乳杆菌属细菌的细胞壁上。

27.一种在乳杆菌属细菌的细胞壁上表达生物活性多肽的方法，其特征在于，所述方法包括：

提供含有一表达盒的乳杆菌属细菌，该表达盒含有一通过操作性连接于编码信号序列和生物学活性多肽的多聚核苷酸的启动子，其中所述生物活性多肽与异源性羧基末端细胞壁靶向区域相连，该异源性羧基末端细胞壁靶向区域含有按下列顺序排列的序列：

细胞壁相关序列；

LPQ(S/A/T)(G/A)；和

疏水序列；并且

在诱导表达该多肽的条件下培养这种细菌，从而在乳杆菌属细菌细胞壁上表达生物活性多肽。

28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述细胞壁相关序列至少含有50个氨基酸。

29.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述细胞壁相关序列至少含有200个氨基酸。

30.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述异源性羧基末端细胞壁靶向区域在该区域的羧基末端还含有一带电荷的序列。

31.如权利要求27所述的方法，其特征在于，提供的步骤包括将所述表达盒转移到所述细菌中。

32.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述细胞壁靶向区域含有氨基酸序列LPQSG。

33.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述细胞壁靶向区域含有氨基酸序列LPQAG。

34.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述细胞壁靶向区域含有氨基酸序列LPQTG。

35.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述细胞壁靶向区域含有氨基酸序列LPQTA。

36.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述细胞壁靶向区域含有SEQID NO：7。

37.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述细胞壁靶向区域含有SEQID NO：8。

38.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述细胞壁靶向区域含有至少200个氨基酸。

39.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述乳杆菌属细菌是寄居在阴道的菌株。

40.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述乳杆菌属细菌选自：简氏乳杆菌、加氏乳杆菌和干酪乳杆菌。

41.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述生物活性多肽在10-600个氨基酸之间。

42.如权利要求27所述的方法，其特征在于，当生物学活性蛋白与病原体接触时能与病原体结合。

43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述病原体是细菌病原体。

44.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述病原体是真菌病原体。

45.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述病原体是病毒病原体。

46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述病毒病原体是HIV。

47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述生物活性蛋白是CD4或CD4的HIV结合片段。

48.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述生物活性蛋白是2D-CD4。

49.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述生物活性蛋白是蓝病毒素-N或蓝病毒素-N的病毒结合片段。

50.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述病毒病原体是单纯疱疹病毒。

51.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述生物学活性蛋白是单纯疱疹病毒进入介质C(HveC)或HveC的病毒结合片段。

52.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述生物活性多肽释放自乳杆菌属细菌。

53.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述生物活性多肽锚定到乳杆菌属细菌的细胞壁上。

54.一种在哺乳动物粘膜表面提供生物活性蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：

使粘膜表面与乳杆菌属细菌相接触，该细菌经重组转变可表达操作性连接于一生物活性多肽的信号序列，而该生物活性多肽连接于异源性羧基末端细胞壁靶向区域，该异源性羧基末端细胞壁靶向区域含有按以下顺序排列的序列：

细胞壁相关序列；

LPQ(S/A/T)(G/A)；和

疏水序列，

其中，收集自粘膜表面的样品中所述生物活性多肽的表达量要能被检测到。

55.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述细胞壁相关序列至少含有50个氨基酸。

56.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述细胞壁相关序列至少含有200个氨基酸。

57.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述异源性羧基末端细胞壁靶向区域在该区域的羧基末端还含有一带电荷的序列。

58.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述乳杆菌属细菌选自：简氏乳杆菌、加氏乳杆菌和干酪乳杆菌。

59.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述粘膜表面位于阴道内。

60.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述粘膜表面位于胃肠道内。

61.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述接触步骤包括经口给予所述乳杆菌属细菌。

62.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述接触步骤包括经阴道给予所述乳杆菌属细菌。

63.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述接触步骤包括经直肠给予所述乳杆菌属细菌。

64.一种含有操作性连接于编码一信号序列和生物活性多肽的多聚核苷酸的启动子的表达盒，其特征在于，所述生物活性多肽与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8相连。

65.一种含有权利要求64所述表达盒的载体。