CN1377410A - 来自b族链球菌的核酸和蛋白质 - Google Patents

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Abstract

描述了来自B族链球菌的新蛋白质抗原,以及编码它们的核酸序列。也描述了疫苗的用途和筛选方法。

Description

来自B族链球菌的核酸和蛋白质
本发明涉及来自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的蛋白质，编码这些蛋白质的核酸，和这些蛋白质作为抗原和/或免疫原的应用和在检测/诊断方面的应用。本发明也涉及细菌基因组的快速筛选以分离和表征细菌细胞被膜关联或分泌的蛋白质的方法。
B族链球菌(Group B Streptococcus)(GBS)(无乳链球菌)是一种有荚膜的细菌，该细菌作为引起新生儿和成人脓毒症和脑膜炎的人类主要的病原在1970年出现。出生后头5天的早期新生儿感染的发病率为每1000个活婴中有0.7到3.7个，感染婴儿的死亡率约20％。在早期感染中活下来的新生儿中通常有25-50％患有神经后遗症。出生后6天到3个月发生的新生儿晚期感染的发病率为每1000个活婴中有约0.5到1.0个。
分娩时母亲生殖道GBS的集群和新生儿脓毒症的危险性存在明显的联系。已发现人类直肠可以充当GBS的储存库。新生儿的易感性与针对引起人疾病的GBS上发现的荚膜多糖IgG抗体的低浓度或缺乏相关。在美国从临床病例中分离到的菌株通常属于荚膜血清型Ia，Ib，II，III，尽管血清型V可能具有越来越重要的意义。血清型VIII GBS是日本新生儿脓毒症的主要原因。
可能的预防方式涉及在分娩期内或产后向母亲施用抗生素，但这可能导致抗性微生物的出现，某些情况下可出现过敏反应。对青春期女性进行接种诱导母体来源的长时间持续的免疫是预防新生儿GBS感染的最有希望的方法之一。这些生物体的荚膜多糖抗原在疫苗的发展方面已经引起极大的关注。对健康成人志愿者的研究发现血清型Ia，II和III多糖是无毒的，它们分别在大约65％，95％和70％的非免疫成人中具有免疫原性。应用荚膜抗原作为疫苗的问题之一是反应率随着免疫前状态和多糖抗原的不同而改变，正如在人类志愿者体内用GBS多糖所作的接种研究所揭示的那样，不是所有的疫苗都可以产生足够水平的IgG抗体。
尽管反复刺激但一些人仍然不产生反应。这些特征是由于多糖抗原T-非依赖性的性质。提高这些疫苗的免疫原性的一个策略是将该疫苗与蛋白质结合增强多糖的T细胞依赖特性。多糖结合物的应用看来是有前途的，但关于载体蛋白质的性质仍然存在未解决的问题。抗GBS的结合疫苗将要求至少制备4种不同的结合物，这增加疫苗的成本。
建立在荚膜多糖应用基础上的抗GBS感染的疫苗接种方法有根据免疫前状态和所使用的特定多糖类型反应率可能会产生相当大变化的缺点。人类志愿者体内的结合疫苗实验结果已经提示对于一些关键的荚膜抗原反应率可能仅仅在65％左右(Larsson等，感染和免疫(Infection and Immunity)64：3518-3523(1996))。对疫苗产生反应的所有个体是否都将会产生足够水平的能穿越胎盘并且赋予新生儿免疫力的多糖特异性IgG也还不清楚。将蛋白质载体结合到多糖抗原上可能会将多糖抗原转化成T细胞依赖性抗原并且使它们的免疫原性提高。
应用GBS III型多糖-破伤风类毒素结合物进行的初步研究一直是鼓舞人心的(Baker等，感染性疾病综述(Reviews of InfectiousDiseases)7：458-467(1985)，Baker等，新英格兰医学杂志(The NewEngland J.of Medicine)319：1180-1185(1988)，Paoletti等，感染和免疫64：677-679(1996)，Paoletti等，感染和免疫62：3236-3243(1994))，但在发达国家，因为大部分成年人在过去的五年中都接受了抗破伤风免疫，破伤风的应用可能是有缺点的。用破伤风类毒素进行的加强免疫可能会引起不良反应(Boyer.，儿科学新观点(Current Opinions in Pediatrics)7：13-18(1995))。多糖结合物疫苗与许多其它种类的疫苗相比有制备和生产昂贵的缺点。也有在GBS多糖和包含唾液酸的人糖蛋白质之间产生交叉反应的可能危险。
目前的证据提示细菌表面蛋白质对免疫的赋予也可能是有用的。在大部分血清型III菌株上发现但在血清型Ia，Ib或II上很少存在的一种叫做Rib的蛋白质在动物模型中赋予对表达Rib的GBS攻击的免疫(Stalhammar-Carlemalm等，实验医学杂志(Journal ofExperimental Medicine)177：1593-1603(1993))。作为疫苗的一个组成部分的另一个感兴趣的表面蛋白质是C蛋白质的α抗原，该抗原可以保护接种后的小鼠免受表达α蛋白质的菌株的致死性感染。由GBS菌株表达的该抗原的数量变化很明显，然而来源于GBS的蛋白质抗原的应用可替换多糖作为抗原。在实验模型系统中近期的证据提示GBS表面关联蛋白质Rib和C蛋白质可以对GBS感染提供免疫(Stalhammar-Carlemalm等，(1993)[同上]，Larsson等，(1996)[同上])。然而这两种蛋白质在引起人类疾病的所有GBS血清型中不是保守的。假设这些抗原具备免疫原性并且能在人体内引发保护水平的反应，上述抗原也不会对由于GBS引起的所有感染起到保护作用，因为感染性B族链球菌中10％不表达Rib或C蛋白质。
本发明通过采用专门为鉴定编码细菌细胞表面关联或分泌蛋白质的那些B组链球菌基因所设计的新筛选方法希望克服抗GBS的疫苗接种问题。这些基因表达的蛋白质可能具有免疫原性，因此在B族链球菌感染的预防和治疗中可能是有用的。为了本申请的目的，术语免疫原性是指这些蛋白质将在实验对象体内引发保护性的免疫反应。应用上述新的筛选方法许多编码新的B组链球菌蛋白质的基因都已被鉴定。
所以第一方面，本发明提供了具有选自表1所示那些序列的序列的B族链球菌蛋白质、多肽或肽，或它们的片段或衍生物。
上述范围内的蛋白质和多肽可能是细胞表面受体，粘着分子，转运蛋白质，膜结构蛋白质，和/或信号分子，这对本领域技术人员来说是显而易见的。
一种蛋白质的氨基酸顺序可以发生不影响其功能的改变。这些改变包括氨基酸的缺失，插入和替换，并可以是由不同的剪接和/或存在多个翻译起始和终止位点引起。多态性可以作为翻译过程的不忠实性的结果出现。所以，不影响蛋白质功能的氨基酸顺序的变化是可以容忍的。
所以本发明包括本发明的蛋白质，多肽和肽的衍生物或变异体，这些衍生物或变异体与本发明中描述的蛋白质，多肽和肽有至少50％的同一性。优选序列同一性程度是至少60％，优选大于75％，更优选大于80％，90％或甚至95％。
术语同一性能够用来描述两个多肽序列之间的相似性。实现这一过程的本领域中熟知的软件包是CLUSTAL程序。它比较两个多肽的氨基酸序列并且通过在任一序列中适当时插入空位找到最佳的比对。最佳比对的氨基酸的同一性或相似性(氨基酸类型的同一性和保守性)也能够用例如BLASTx这样的软件包计算。该程序比对相似序列的最大伸展片段并且给出一个合适的数值。对于任何一种类型的比较都可以发现相似的几个区域，每个相似的区域都有一个不同的数值。本领域的技术人员将知道不同长度的两个多肽可以以较长片段的整个长度为准进行比较。或者可以比较一些小的区域。正常地有用的比较是对同一长度的序列进行比较。
对编码蛋白质的DNA进行操作是尤其强有力的技术，该技术可以修饰蛋白质和为纯化目的产生大量蛋白质。这可能涉及用PCR技术扩增所需要的核酸序列。所以本发明提供的序列资料能够用来设计PCR中使用的引物以便能够靶向所需的序列，然后将其大量扩增。
典型地引物至少是5个核苷酸的长度，并且通常至少是10个核苷酸的长度(例如15到25个核苷酸长)。在一些情况下可能使用至少30或至少35个核苷酸长的引物。
作为另一种选择，可以采用化学合成。这可以是自动化的。可以化学合成相对短的序列，连接起来提供较长的序列。
所以另一方面本发明进一步提供包含以下序列或由以下序列组成的核酸分子，所述序列是
(i)在本文图1所示DNA序列或它们的RNA等价物中的任何序列；
(ii)与(i)中序列的任何序列互补的序列；
(iii)显示与(i)或(ii)的那些序列编码相同的蛋白质或多肽的序列；
(iv)显示与(i)、(ii)和(iii)的那些序列中的任何序列有实质同一性的序列；或
(v)编码图1所示核酸分子的衍生物或片段的序列。
术语同一性也可以用来描述两个独立DNA序列的相似性。“bestfit”程序(Smith和Waterman，应用数学进展(Advances inapplied Mathematics)，482-489(1981))是用于寻找两个核酸序列之间最佳相似性片段的一类计算机软件中的一个实例，然而GAP程序能使序列沿着它们的整个长度比对，并且通过在任一序列中适当插入空位找到最佳比对。
本发明包括这样的核酸序列，该核酸序列与此处描述的核酸序列有至少50％的同一性。优选序列同一性程度是至少60％，优选大于75％。更优选大于80％，90％或甚至95％。
上面所使用的术语“RNA等价物”是指给定的RNA分子具有与给定的DNA分子互补的序列，允许的情况是在RNA中遗传密码“U”替换了“T”。核酸分子可以以分离的，重组的或化学合成的形式存在。
DNA结构能够用本领域熟知的方法很容易地产生。这些技术已公开，例如在Sambrook等“分子克隆”(Molecular Cloning)第二版，冷泉港实验室出版社(1989)。对DNA结构和所表达蛋白质的修饰例如添加启动子，增强子，信号序列，前导序列，翻译起始和终止信号和DNA稳定性调控区域，或添加融合部分，可能变得比较容易。
正常地DNA结构可以插入至载体中，该载体可以是任何适合的载体，包括质粒，病毒，噬菌体，转座子，极微染色体，脂质体或机械载体。本发明的表达载体是适合表达编码所需蛋白质产物的DNA的DNA结构，该结构可能包括：(a)调控元件(例如启动子，操纵子，活化子(activator)，抑制子(repressor)和/或增强子)，(b)可以被转录成mRNA的结构序列或编码序列，和(c)适当的转录，翻译，起始和终止序列。载体可以进一步包含选择标记，例如抗生素抗性标记，以便于包含该载体的细胞的选择和/或鉴定。
将载体转化或转染到宿主细胞中可获得蛋白质的表达，该宿主细胞可以是真核或原核来源的。为了产生重组蛋白质，表达可以是诱导型表达或者只是在某些类型细胞中表达或者既是诱导型表达又是细胞特异性的表达。诱导型载体中尤其优选的是那些可通过易操作的环境因素，例如温度和营养添加剂，诱导表达的载体。各种适合的载体，包括应用于原核和真核宿主中的组成型和诱导型表达载体，对本领域的那些技术人员来说是熟知的和常规使用的。
多种表达载体都可以用于表达本发明的B族链球菌蛋白质。这样的载体尤其包括染色体，附加体和病毒来源的载体，例如来源于细菌质粒的载体，来源于噬菌体的载体，来源于转座子的载体，来源于酵母元件的载体，来源于病毒(例如杆状病毒，乳头多瘤空泡病毒，例如SV40，痘苗病毒，腺病毒和逆转录病毒)的载体，和来源于它们的组合的载体，例如来源于质粒和噬菌体遗传元件的那些载体，例如粘粒和噬菌粒，都可以依照本发明使用。通常，在这方面，适合在宿主中维持，增殖或表达核酸以表达多肽的任何载体都可以用于表达。因而这样的载体组成了本发明另一个方面。
通过多种熟知的和常规的技术中的任何技术可以将适当的DNA序列插入到载体中。
在表达载体中核酸序列可操作性地与适当的表达调控序列连接，这些调控序列包括，例如指导mRNA转录的启动子。这样的启动子的代表包括，但不限于，噬菌体λPL启动子，T3和T7启动子，大肠杆菌lac，trp，和λPL启动子，微生物的真核生物GAL，葡糖淀粉酶和纤维二糖水解酶启动子和哺乳动物金属硫蛋白质(小鼠)和热休克(人)启动子。
一般地，表达载体将包含转录起始和终止位点，并在转录区中包含翻译时所用的核糖体结合位点。该结构表达的成熟转录本的编码部分通常包括开始时的翻译起始密码子AUG和位于将被翻译的多肽末端适当位置的终止密码子。
本发明用于B族链球菌蛋白质重组表达的适当宿主的代表性实例包括细菌细胞，例如链球菌，葡萄球菌，大肠杆菌，链霉菌和枯草芽胞杆菌细胞；真菌细胞，例如酵母细胞和曲霉细胞；昆虫细胞例如果蝇S2和Spodoptera Sf9细胞；动物细胞例如CHO，COS，HeLa和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。这样的宿主细胞形成本发明的另一个方面。
可通过任何方便的方法破坏在蛋白质表达中使用的微生物细胞，这些方法包括反复冻融，超声处理，机械破坏，或应用细胞裂解剂，这些方法对本领域的技术人员是知悉的。
可以采用人们熟知的方法从重组细胞培养物中收回和纯化多肽，上述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸抽提，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，亲和层析，羟磷灰石层析和植物血凝素层析。在分离和或纯化期间多肽变性时使蛋白质重新折叠的众所周知的技术可以用来重现活性构象。
此处描述的B组链球菌蛋白质还能够用作产生抗体或亲和体(affibody)的靶抗原。这些可用来检测B族链球菌。
所以本发明在另一方面提供了与本文所述的任何一种或多种蛋白质，多肽，肽，它们的片段或衍生物结合的抗体，亲和体，或其衍生物。
本发明范围内的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。当将本发明描述的蛋白质，或其类似物，衍生物或片段注射给适当的动物时，在动物宿主(例如小鼠，大鼠，豚鼠，兔子，绵羊，山羊或猴子)体内通过刺激可以产生多克隆抗体。如果需要，可以将佐剂与蛋白质一起施用。人们熟知的佐剂包括弗氏佐剂(完全和不完全弗氏佐剂)和氢氧化铝。然后可以通过抗体与本发明描述的蛋白质的结合和本领域技术人员熟知的许多其它方法将抗体纯化。
单克隆抗体可以从杂交瘤中产生。这些杂交瘤可以通过将骨髓瘤细胞与产生所需抗体的脾细胞融合以形成永生化细胞系来制备。为此可以采用人们熟知的Kohler和Milstein技术(Nature 256(1975))或在此技术基础上后来变更的技术。
制备与特定多肽/蛋白质结合的单克隆抗体和多克隆抗体的技术在本领域已发展完善。在标准免疫教科书中讨论了这些技术，例如在Roitt等，免疫学(Immunology)，第二版(1989)，ChurchillLivingstone，伦敦中。
除了全抗体，本发明包括能与本发明描述的蛋白质等结合的抗体衍生物。所以，本发明包括抗体片段和合成的结构。在Dougall等，Tibtech 12 372-379(1994年九月)有抗体片段和合成结构的实例。
抗体片段包括，例如，Fab，F(ab’)2和Fv片段。能够对Fv片段进行修饰产生一种合成的结构，称为单链Fv(scFv)分子。该分子包括共价连接Vh和Vl区的肽接头，该肽接头有助于该分子的稳定性。其它能够使用的合成结构包括CDR肽。该肽是包含抗原结合决定簇的合成肽。肽模拟物也可以使用。这些分子通常是构象限制性的有机环，该环模拟CDR环结构同时包括与抗原相互作用的侧链。
合成的结构包括嵌合分子。所以，例如，人源化(或灵长类化)抗体或它们的衍生物包括在本发明的范围内。人源化抗体的一个实例是具有人构架区和啮齿动物高变区的抗体。例如Morrison等在PNAS，81，6851-6855(1984)和Takeda等在自然(Nature)，314，452-454(1985)中讨论了产生嵌合抗体的方式。
合成的结构也包括包含了附加部分的分子，该附加部分为该分子提供了除结合抗原外的一些期望得到的特性。例如，该部分可以是一种标记(例如荧光或放射性标记)。或者，该部分可以是药物学活性剂。
已发现亲和体是与靶蛋白质以低解离常数结合的蛋白质。它们是从表达目的靶蛋白质片段的噬菌体展示文库中选择出来的(Nord K，Gunneriusson E，Ringdahl J，Stahl S，Uhlen M，Nygren PA，生物化学和生物工程系，皇家工程学院(KTH)，Stockholm，瑞士)。
本发明进一步提供了包含本发明描述的一种或多种蛋白质，多肽，肽，其片段或衍生物，或核苷酸序列的免疫原性组合物。该免疫原性组合物可以包括本发明描述的ID-65和/或ID-66核酸序列。或者，该免疫原性组合物可以包含包括本发明描述的ID-65，ID-83，ID-89，ID-93和/或ID-96在内的蛋白质/多肽，或其片段或衍生物。该种组合物在治疗或预防实验对象体内的B族链球菌感染方面可能是有用的。在本发明的一个优选方面中免疫原性组合物是疫苗。
在其它方面本发明提供：
i)本发明描述的免疫原性组合物在制备用于治疗或预防B族链球菌感染的药物中的应用。优选该药物是疫苗。
ii)B族链球菌的检测方法，该方法包括使待检样品与至少一种本发明描述的抗体，亲和体，或其衍生物接触的步骤。
iii)B族链球菌的检测方法，该方法包括使待检样品与至少一种本发明描述的蛋白质，多肽，肽，片段或衍生物接触的步骤。
iv)B族链球菌的检测方法，该方法包括使待检样品与至少一种本发明描述的核酸分子接触的步骤。
v)检测B族链球菌的试剂盒，该试剂盒包含至少一种本发明描述的抗体，亲和体，或其衍生物。
vi)检测B族链球菌的试剂盒，该试剂盒包含至少一种本发明描述的B族链球菌蛋白质，多肽，肽，其片段或衍生物。
vii)检测B族链球菌的试剂盒，该试剂盒包含至少一种本发明的核酸。
正如以上所述，可以用特异鉴定编码细菌细胞被膜关联或分泌蛋白质的那些B族链球菌基因的筛选方法鉴定和分离本发明描述的新蛋白质。
假如发明人已经鉴定出一组重要的蛋白质，那么这些蛋白质便是抗微生物治疗的潜在的靶标。然而必需确定每一种蛋白质对微生物的存活是否是必需的。所以，本发明也提供了一种确定本发明描述的蛋白质或多肽是否代表潜在的抗微生物靶标方法，该方法包括使所述蛋白质失活并确定B族链球菌是否还存活。
使蛋白质失活的适当的方法是使所选择的基因敲除，即阻止蛋白质表达，并确定该做法是否导致了致死性的改变。实施该基因敲除的适当的方法在Li等，P.N.A.S.，94：13251-13256(1997)和Kolkman等，生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)，272：19502-19508(1997)；Kolkman等，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)，178：3736-3741(1996)有描述。
在最后一方面，本发明提供了能够拮抗、抑制或以其它方式干扰本发明的蛋白质或多肽的功能或表达的药剂在生产用于治疗或预防B族链球菌感染的药物中的应用。
现在通过以下实施例对本发明进行描述，这些实施例不应以任何方式理解为限制本发明。这些实施例涉及如下附图，其中：
图1：(A)显示编码抗原性B族链球菌蛋白质的一些全长核苷酸序列和它们相应的氨基酸顺序。
图2：显示使用蛋白质ID-65和ID-66的疫苗实验结果。
图3：显示在筛选过程中使用的许多寡核苷酸引物。
所设计的nucS1引物用以扩增nuc A基因的成熟形式。
所设计的nucS2引物用以扩增nuc A基因的成熟形式。
所设计的nucS3引物用以扩增nuc A基因的成熟形式。
所设计的nucR引物用以扩增nuc A基因的成熟形式。
所设计的nucseq引物用以测定克隆到pTREP-Nuc载体中的DNA的序列。
pTREPF核酸序列包含ECORV的识别位点，用于将片段克隆到pTREX7中。
pTREPR核酸序列包含BAMH1的识别位点，用于将片段克隆到pTREX7中。
PUCF正向测序引物，使克隆的DNA片段直接测序。
VR基因特异性引物的例子，通过DNA步移的方法用来获得进一步的抗原DNA序列。
V1基因特异性引物的例子，通过DNA步移的方法用来获得进一步的抗原DNA序列。
V2基因特异性引物的例子，通过DNA步移的方法用来获得进一步的抗原DNA序列。
图4：(i)图示了pTREP1-nuc1，pTREP1-nuc2和pTREP1-nuc3中成熟nuc基因紧上游的单一基因克隆位点的核苷酸序列。每个pTREP-nuc载体包含一个EcoRV(pTREP1-nuc2中的一个SmaI位点)切割位点，对成熟nuc基因来说该位点可允许在3个不同框架中克隆基因组DNA片段。
(ii)pTREP1-nuc载体的物理和遗传的概括性图谱。描述了包含nuc，大环内酯、lincosamides和链阳性菌素B(MLS)抗性决定子，和复制子(rep)Ori-pAMβ1的表达盒(未按比例画)。
(iii)图示了具有与基因表达和单一限制性内切酶位点的定位有关的各种序列元件的表达盒(未按比例画)。
图5：在12％的聚丙烯酰胺凝胶上对附加His的ID-65和ID-83蛋白质抗原(预计的分子量分别为57,144和25,000道尔顿)的纯化制品的SDS-PAGE分析。各泳道为：MW，分子量标准；1，附加His的ID-65蛋白质；2，附加His的ID-83蛋白质。
图6：在12％的聚丙烯酰胺凝胶上对附加His的ID-93蛋白质抗原(预计的分子量＝28,000道尔顿)的纯化制品的SDS-PAGE分析。
各泳道为：MW，分子量标准；1，附加His的ID-93蛋白质。
图7：在12％的聚丙烯酰胺凝胶上对附加His的ID-89和ID-96蛋白质抗原(预计的分子量分别为35,000和31,000道尔顿)的纯化制品的SDS-PAGE分析。各泳道为：MW，分子量标准；1，附加His的ID-89蛋白质；2，附加His的ID-96蛋白质。
图8：抗ID-65和ID-83蛋白质的IgG效价
1＝ID-65+氢氧化铝组-第5周放血
2＝PBS+氢氧化铝对照组-第5周放血
(对1和2组进行纯化的ID-65蛋白质的ELISAs)
3＝ID-83+氢氧化铝组-第5周放血
4＝PBS+氢氧化铝对照组-第5周放血
(对3和4组进行纯化的ID-83蛋白质的ELISAs)
图9：显示用蛋白质ID-93的疫苗实验结果
图10：抗ID-93蛋白质的IgG效价
1＝ID-93+氢氧化铝组-第3周放血
2＝ID-93+氢氧化铝组-第6周放血
3＝PBS+氢氧化铝对照组-第3周放血
4＝PBS+氢氧化铝对照组-第6周放血
图11：抗ID-89和ID-96蛋白质的IgG效价
1＝ID-89+TitreMax金组-第3周放血
2＝ID-89+TitreMax金组-第6周放血
3＝PBS+TitreMax金对照组-第3周放血
4＝PBS+TitreMax金对照组-第6周放血
5＝ID-96+TitreMax金组-第3周放血
6＝ID-96+TitreMax金组-第6周放血
7＝PBS+TitreMax金对照组-第3周放血
8＝PBS+TitreMax金对照组-第6周放血
对1-4组进行纯化的ID-89蛋白质的ELISAs
对5-6组进行纯化的ID-96蛋白质的ELISAs
图12：对基因组DNA的Southern印迹分析。将来自表7列出的每一菌株的基因组DNA用Hin DIII(NEB)彻底消化，然后在0.8％的琼脂糖中40伏电泳6小时，再通过Southern印迹将其转移到HybondN+(Amersham)膜上，与地高辛配基标记的rib基因探针杂交。特异结合的DNA探针用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer Mannheim)鉴定。
图13：对基因组DNA的Southern印迹分析。将来自表6列出的每一菌株的基因组DNA用Hin DIII(NEB)彻底消化，然后在0.8％的琼脂糖中40伏电泳6小时，再通过Southern印迹将其转移到HybondN+(Amersham)膜上与地高辛配基标记的ID-65基因探针杂交。特异结合的DNA探针用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer Mannheim)鉴定。
图14：对基因组DNA的Southern印迹分析。将来自表6列出的每一菌株的基因组DNA用Hin DIII(NEB)彻底消化，然后在0.8％的琼脂糖中40伏电泳6小时，再通过Southern印迹将其转移到HybondN+(Amersham)膜上与地高辛配基标记的ID-89基因探针杂交。特异结合的DNA探针用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer Mannheim)鉴定。
图15：对基因组DNA的Southern印迹分析。将来自表6列出的每一菌株的基因组DNA用Hin DIII(NEB)彻底消化，然后在0.8％的琼脂糖中40伏电泳6小时，再通过Southern印迹将其转移到HybondN+(Amersham)膜上与地高辛配基标记的ID-93基因探针杂交。特异结合的DNA探针用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer Mannheim)鉴定。
图16：对基因组DNA的Southern印迹分析。将来自表6列出的每一菌株的基因组DNA用EcoRI(NEB)彻底消化，然后在0.8％的琼脂糖中40伏电泳6小时，再通过Southern印迹将其转移到HybondN+(Amersham)膜上与地高辛配基标记的ID-96基因探针杂交。特异结合的DNA探针用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer Mannheim)鉴定。
实施例1
除非另外说明，应用本发明描述的核酸酶筛选系统即LEEP(输出蛋白质的乳球菌表达(Lactococcus Expression of ExportedProteins))系统已经鉴定出推测在无乳链球菌(S.agalactiae)中编码输出蛋白质的基因/部分基因序列。对这些序列进行了进一步的分析以除去假的序列。用以下描述的许多参数对使用该筛选系统鉴定的基因的核苷酸序列进行表征。
1.对所有推测的表面蛋白质的前导肽/信号肽序列进行分析。细菌的信号肽序列具备共同的设计。这些信号肽的特点是一个短的带正电荷的N末端(N区)之后紧接着一段疏水性残基(中间部分-h区)，疏水性残基之后是包含切割位点的更具极性的C末端部分(c-区)。采用计算机软件对推测蛋白质进行亲水性作图(Marcks，核酸研究(Nuc.Acid.Res.)，16：1829-1836(1988))，该方法可以用来鉴定前导肽序列的典型的独特疏水部分(h区)。另外，也可以发现是否存在潜在的核糖体结合位点(翻译所需的Shine-Dalgarno序列)。
2.应用所有的推测的表面蛋白质序列搜索包括GENBANK和SWISSPROT数据库翻译在内的OWL序列数据库。这可以找出与不但在序列水平而且在功能水平上可能早已得到表征的序列的相似序列。这也可以提供上述蛋白质确实是表面相关蛋白质而不是假蛋白质的信息。
3.对推测的无乳链球菌表面蛋白质的新颖性也进行评估。一些已发现的蛋白质可能具有也可能不具有典型的前导肽序列，并且可能与数据库中的任何DNA/蛋白质序列都无同源性。确实，这些蛋白质可能会显示出我们的筛选方法的主要优点，即分离非典型的表面相关蛋白质，该蛋白质在所有以前描述的筛选方法中会被遗漏。
本发明描述三个报告载体的构建和它们在鉴定和分离来自病原菌的编码分泌或表面关联蛋白质的基因组DNA片段中的应用。
pTREP1-nuc系列报告载体的构建
(a)pTREP1表达质粒的构建
pTREP1质粒是高拷贝数(每个细胞40到80个)θ复制型革兰氏阳性质粒，该质粒是pTREX质粒的衍生物，pTREX本身是以前公开的pIL253质粒的衍生物。pIL253质粒引入了pAMβ1(Simon和Chopin，Biochemie 70：559-566(1988))L lactis性因子的大范围革兰氏阳性宿主复制子。pIL253也缺乏可被以pIL501为实例的结合型亲代质粒转移或有效带动转移所必需的tra功能。早先已将肠球菌pAMβ1复制子转移到包括链球菌，乳杆菌和芽孢杆菌及丙酮丁醇梭菌的各物种中(LeBlanc等，Proceedings of the National Academy of Science USA，75：3484-3487(1978))，这提示该复制子具有潜在的广泛宿主适用范围。pTREP1质粒代表一种组成型转录载体。
pTREX载体的构建如下。通过对2个互补的寡核苷酸退火然后用Tf1 DNA聚合酶延伸，制备包含推测的RNA稳定序列，翻译起始区(TIR)，用于基因插入的多克隆位点和转录终止子的人工DNA片段。有义和反义寡核苷酸各自在5’末端包含NheI和BamHI的识别位点使克隆易于进行。该片段被克隆在pUC19NT7中的Xbal和BamHI位点之间，pUC19NT7是pUC19的衍生物，其包含来自pLET1(Wells等，应用细菌学杂志(J.Appl.Bacteriol.)，74：629-636(1993))的克隆在EcoRI和HindIII位点之间的T7表达盒。所得结构称为pUCLEX。然后用HindIII切割切下pUCLEX的完全表达盒并且进行钝化，此后用EcoRI切割，之后克隆到pIL253的EcoRI和SacI(钝化的)位点产生载体pTREX(Wells和Schofield，在代谢，遗传学和应用方面的新近展-NATOASI系列H 98：37-62(1996))。推测的RNA稳定序列和TIR来源于大肠杆菌T7噬菌体序列，并且在一个核苷酸位置对其进行修饰以提高Shine Dalgarno(SD)基序与乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)核糖体16sRNA的互补性(Schofield等，pers.coms.剑桥大学病理学系)。
表现启动子活性的乳酸乳球菌MG1363染色体DNA片段随后被称为P7，该片段克隆在表达盒的EcoRI和Bg1II位点之间，创建了pTREX7。先前已用启动子探针载体pSB292(Waterfield等，基因(Gene)，165：9-15(1995))将该活性启动子区分离。应用VentDNA聚合酶，依照产品说明通过PCR扩增该启动子片段。
pTREP1载体的构建如下。将两个重叠并且部分互补的合成寡核苷酸一起退火，然后依照生产商的使用说明用测序酶延伸，创建包括转录终止子，正向pUC测序引物，启动子多克隆位点区和通用翻译终止序列的人工DNA片段。有义和反义(pTREPF和pTREPR)寡核苷酸各自在5’末端包含EcolV和BamHI识别位点使其易于克隆到pTREX7中。转录终止子是在乳球菌属中已证明有效的芽孢杆菌青霉素酶基因的终止子(Jos等，应用和环境微生物学(Applied and EnviromentalMicrobiology)，50：540-542(1985))。因为观察到在pTREX载体中的靶基因的表达有渗漏并且认为这是起始区域隐藏的启动子活性的结果(Schofield等，pers.coms.剑桥大学病理学系)，故该转录终止子被认为是必需的。为能直接对克隆的DNA片段测序，正向pUC测序引物包括在上述DNA片段之内。包括了在3个不同框架中编码终止密码子的翻译终止序列，这可防止载体基因和克隆DNA片段之间的翻译融合。依照生产商的使用说明，将pTREX7载体首先用EcoRI消化然后用T4 DNA聚合酶(NEB)的5’-3’聚合酶活性将其钝化。然后将经EcoRI消化和末端钝化后的pTREX7载体用Bg1 II消化，除去P7启动子。将人工合成的寡聚核苷酸退火后形成的人工DNA片段用EcoRV和BamH I消化，然后克隆到经EcoRI(钝化的)和Bg1 II消化的pTREX7载体中产生pTREP。然后将称为P1的乳酸乳球菌MG1363染色体启动子克隆到pTREP表达盒中存在的EcoRI和Bg1 II位点之间形成pTREP1。同样用启动子探针载体pSB292分离该启动子然后通过Waterfield等，(1995)[同上]描述的对其进行表征。最初应用ventDNA聚合酶依照生产商的使用说明对P1启动子片段进行PCR扩增，然后将该片段作为EcoRI-Bgl II DNA片段克隆到pTREX中。将包含EcoRI-Bgl II P1启动子的片段用限制性酶消化从pTREX1中移出，克隆到pTREP中(Schofieldt等，pers.coms.University of Cambridge，Dept.Pathology)。
(b)S.aureus nuc基因的PCR扩增
S.aureus nuc基因的核苷酸序列(EMBL数据库编号V01281)用来设计PCR扩增所用的合成寡核苷酸引物。将引物设计成扩增nuc基因成熟形式的引物，该基因的成熟形式称为nucA，是通过蛋白质水解酶切割分泌型的称为Snase B(Shortle，1983[同上])的前肽的N末端19到21个氨基酸后形成的。设计三个有义引物(在图3中显示的nucS1，nucS2和nucS3)，对nuc基因来说在不同的阅读框中每个引物有一个EcoRV或Sam I的平端限制性内切酶切点。另外，将Bg1 II和BamH I各自引入有义和反义引物的5’末端以便入克隆至经BamH I和Bg1 II切割的pTREP1中。所有引物的序列在图3中给出。采用与反义引物结合的每个有义引物对编码核酸酶基因的成熟形式(NucA)的三个nuc基因DNA片段进行PCR扩增。应用S.aureus基因组DNA模板，Vent DNA聚合酶(NEB)和生产商所推荐的条件对nuc基因片段进行PCR扩增。开始的变性步骤是93℃，2分钟，然后是93℃，45秒变性，50℃，45秒退火，73℃，1分钟延伸的30个循环，最后，73℃延伸5分钟。用Wizard纯化柱(Promega)除去未掺入的核苷酸和引物纯化PCR扩增产物。
(c)pTREP1-nuc载体的构建
将b部分中描述的纯化的nuc基因片段用Bg1 II和BamH I在标准条件下消化，然后连接到经BamH I和Bg1 II切割和脱磷酸后的pTREP1上产生报告载体的pTREP1-nuc1，pTREP1-nuc2和pTREP1-nuc3系列报告载体。这些载体描述在图4中。使用生产商提供的试剂和缓冲液或使用标准技术(Sambrook和Maniatis分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社：冷泉港(1989))完成一般的分子生物学操作。在每个pTREP1-nuc载体中，表达盒包含一个转录终止子，一个乳球菌启动子P1，单一克隆位点(Bg1 II，EcoRV或Sam I)，然后是nuc基因的成熟形式和第二个转录终止子。应当注意到的是nuc基因翻译和分泌所需的序列故意地被排除在该结构之外。这些元件只能通过适当消化后的外来DNA片段(代表靶细菌)提供，上述片段能够克隆到nuc基因上游近端存在的单一限制性位点。
(d)对B族链球菌中的分泌蛋白质的筛选
将从B族链球菌(无乳链球菌)分离到的基因组DNA用限制酶Tru9I消化。该酶可以识别5’-TTAA-3’序列，使用该酶的原因是其能有效地切割A/T丰富的基因组并且能产生在优选大小范围内的(通常平均在0.5-1.0kb之间)随机基因组DNA。因为这可以增加利用P1启动子转录新的基因序列的可能性，所以这个大小范围是优选的。然而，P1启动子不是在所有的情况下都是必需的，因为许多链球菌启动子在乳酸乳球菌中可以被识别。不同大小的DNA片段可以从无乳链球菌基因组DNA的部分Tru9 I消化物中纯化得到。
因为Tru9 I限制酶产生交错末端，所以在将DNA片段连接到经EcoRV或Sam I切割的pTREP1-nuc载体之前必需对其末端进行钝化。这可以应用Klenow酶的5’-3’聚合酶活性通过部分填充的酶反应实现。简言之，将Tru9 I消化的DNA溶解在一种溶液中(通常溶液总量为10-20μl)，该溶液补充有T4 DNA连接酶缓冲液(New EnglandBiolabs；NEB)(1X)和所需的dNTPs，在这种情况下是dATP和dTTP，各33μM。加入Klenow酶(每μgDNA加入一个单位Klenow酶(NEB))，25℃反应15分钟。将该混合物75℃放置20分钟终止该反应。然后加入EcoRV或Sam I消化的pTREP-nuc质粒DNA(通常在200-400ng之间)。然后在该混合物中加入400单位T4 DNA连接酶(NEB)和T4 DNA连接酶缓冲液(1X)，然后16℃孵育过夜。将该连接反应混合物直接沉淀在100％的乙醇和1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)中，用于转化乳酸乳球菌MG1363(Gasson，细菌学杂志(J.Bacteriol.)，154：1-9(1983))。或者，pTREP-nuc载体的基因克隆位点也包含一个Bg1 II位点，该位点可以用来克隆例如Sau3A I消化的基因组DNA片段。
将L.lactis转化体克隆培养在脑心浸液琼脂上，分泌核酸酶的(Nuc+)克隆可以通过甲苯胺蓝-DNA-琼脂覆盖(0.05M Tris pH9.0，每升溶液中琼脂10g，每升溶液中NaCl 10g，0.1mM CaCl2，0.03％wt/vol.鲑鱼精子DNA和90mg甲苯胺蓝O染料)基本依照Shortle，1983[同上]，和Le Loir等，1994[同上]中的描述检测。然后将培养板37℃孵育长达2个小时。分泌核酸酶的克隆产生容易分辨的粉红色晕轮。从Nuc+重组乳酸乳球菌克隆中分离质粒DNA，在一条链上用图3中描述的可直接测定DNA插入部分序列的NucSeq测序引物对DNA插入片段进行测序。
实施例2
无乳链球菌标准接种物的制备
菌株的确认
无乳链球菌血清型III(菌株97/0099)是从患脑膜炎的新生儿脑脊髓液得来的一种新的临床分离株。对这个B族链球菌的溶血菌株进行了流行病学的检测，并且在呼吸道和系统性感染实验室，PHLS公共卫生中心实验室，61 Colidale Avenue，伦敦NW9 5HT进行了确认。该菌株在到达之前在实验室中仅传代培养两次。到达时其在琼脂斜面上，一次扫到的4到5个菌落用来接种Todd Hewitt/5％马血培养液，然后于37℃静置孵育过夜。然后用此过夜培养物0.5ml等分试样制备20％甘油的细菌原种，用于-70℃长期保存。甘油原种在Todd Hewitt/5％马血琼脂平板上划线以确认其活力。
B族链球菌的在体传代
将无乳链球菌血清型III(菌株97/0099)的冷冻培养物(描述于“菌株的确认”)在Todd-Hewitt/5％马血琼脂平板上划线成单菌落，该平板于37℃培养过夜。刮下4-5个菌落用于接种Todd Hewitt/5％马血培养液，再将其培养过夜。从过夜的培养物中分出0.5ml等分试样用来接种50ml的Todd Hewitt液体培养基中(1∶100稀释)，37℃孵育。将过夜的培养物进行10倍的连续稀释(因为该菌株的毒力是未知的)，将每一稀释培养物在CBA/ca小鼠中腹膜内传代，一式二份。对用于传代的各种接种物进行存活数量的计数。用108到104菌落形成单位(cfu)的不同浓度的病原体攻击各组小鼠。对出现症状的小鼠在最后进行麻醉和心脏穿刺(仅仅是那些用高浓度，即1×108cfu攻击过的小鼠出现了症状)。上述穿刺所获得的未凝固的血液用来直接接种50ml血清液体培养基(Todd Hewitt/20％灭活的胎牛血清)。对培养物进行密切监视使其生长到晚期对数期。因为随着细菌的生长血液被越来越多地溶解致使培养基中血液的存在干扰了OD600nm的读数，所以需要对培养物密切监视。到晚期对数期/早期静止期时将培养物转移到一个新鲜的50ml管中，以排除沉淀在试管底部的死细菌细胞和残留的血细胞。从上述培养物中取出0.5ml等分试样转移到无菌的冷冻管中，在液氮中冷冻，储存在-70℃。为确定细菌的数量，对单个标准接种等分试样进行活菌计数。计数结果大约为5×108cfu/ml。
B族链球菌标准接种物的腹膜内攻击和毒力测定
为确定标准接种物的毒力是否适合疫苗实验中使用，采用一个剂量范围的接种物进行攻击。将冷冻的标准接种菌株等分试样在室温下融解。从活菌计数数据中已经知道标准接种物中每ml含有的cfu数量。最初，将标准接种物在Todd Hewett液体培养基中进行连续的稀释，然后以500μl Todd Hewitt液体培养基中含有1×108到1×104cfu的剂量腹膜内攻击小鼠。对注射不同剂量的各组小鼠的存活时间进行比较。确定标准接种物毒力适合，1×106cfu的剂量被认为是疫苗实验中进一步使用时接近最佳的剂量。进一步优化可通过比较用5×105到5×106cfu的剂量攻击的小鼠来实现。最佳剂量估计约在2.5×106cfu。该剂量代表100％的致死剂量，并且可重复地与通过集中在一个窄的时间范围内的存活时间确定的终止点相一致。在所有这些实验过程中，要经常监视受攻击的小鼠以阐明症状，症状发展的阶段和计算存活时间。
在DNA接种实验中对B族链球苗LEEP来源基因的筛选
pcDNA3.1+作为DNA疫苗载体
商业获得的pcDNA3.1+质粒(Invitrogen)，此后称为pcDNA3.1，除非另有说明，在所有涉及用LEEP系统产生的基因靶的DNA免疫实验中用作载体。设计pcDNA3.1用于在哺乳动物细胞中高水平稳定和短暂表达，并且在DNA疫苗实验中pcDNA3.1作为宿主载体以检测来自多种病原体的候选基因，已得到广泛且成功地应用(Zhang等，感染和免疫，176：1035-40(1997)；Kurar和Splitter，疫苗(Vaccine)，15：1851-57(1997)；Anderson等，感染和免疫，64：3168-3173(1996))。
上述载体包含便于多个基因靶克隆在人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子/增强子的下游的多克隆位点，上述启动子/增强子可使靶基因在多种哺乳动物细胞和包括肌肉和免疫细胞的细胞类型中有效而高水平地表达。这对最佳的免疫反应是重要的，因为在体内产生保护性反应的过程中哪些细胞是最重要的尚不为人们所知。该质粒也包含允许其在大肠杆菌中方便地高拷贝数复制和生长的ColE1复制起点和用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因(B-内酰胺酶)。另外pcDNA3.1在MCS上游含有一个T7启动子/引发位点，该位点可使克隆的基因以有义方向体外转录。
DNA疫苗的制备
为每个用LEEP系统产生的目的基因设计寡核苷酸引物，除非另有说明。对每个基因进行彻底检查，并可能地，将引物设计成可靶向被认为是仅编码蛋白质成熟部分的基因部分(附录I)；此目的是表达那些仅编码靶基因蛋白质成熟部分的序列以便于蛋白质在哺乳动物细胞中表达时进行正确的折叠。例如，在大多数情况下引物的设计使推测的N末端信号肽序列不包括在将克隆到pcDNA3.1表达载体内的最终扩增产物中。信号肽引导多肽前体通过蛋白质输出途径到达细胞膜，正常情况下在该途径信号肽被信号肽酶I(如果是脂蛋白质，通过信号肽酶II)降解。所以，信号肽不组成成熟蛋白质的任何部分，不管该成熟蛋白质是出现在细菌的表面上还是被分泌。在N末端前导肽序列不十分明显的情况下，将引物设计成靶向整个基因序列以便在pcDNA3.1中克隆和最终表达。
所有正向和反向寡核苷酸引物引入了适当的限制酶位点以便于克隆到pcDNA3.1MCS区。设计的所有正向引物在‘atg’翻译起始密码子紧上游也包括符合靶基因插入片段读框的保守Kozak核苷酸序列5’-gccacc-3’。Kozak序列促进真核生物核糖体对起始区序列的识别。典型地，引入BamH I限制酶位点的正向引物开始的序列是5’-cgggatccgccaccatg-3’，随后是与要扩增的那部分基因的5’端同源的序列。所有的反向引物引入了一个Not I限制酶位点序列5’-ttgcggccgc-3’。所设计的所有基因特异性的正向和反向引物都具有相容的熔解温度以便于它们的扩增。
应用Vent DNA聚合酶(NEB)或rTth DNA聚合酶(PE应用生物系统)在生产商推荐的条件下通过PCR从无乳链球菌基因组模板扩增所有基因靶标。典型地扩增反应涉及一个95℃ 2分钟的起始变性步骤，然后是95℃变性35秒，适当融解温度下退火30秒，和72℃延伸1分钟的35个循环(1分钟扩增1kb的DNA)。此后，72℃ 10分钟进行最后的延伸。将所有的PCR扩增产物用酚氯仿(2∶1∶1)抽提一次，然后用氯仿(1∶1)抽提一次，再用乙醇沉淀。将特异的DNA片段用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中分离出来。将纯化后的扩增基因DNA片段用适当的限制酶消化，然后克隆到pcDNA3.1质粒载体中，用大肠杆菌作为宿主。基因的成功克隆和维持通过限制性作图和DNA测序确定。用Plasmid Mega试剂盒(Qiagen)对重组质粒DNA进行大规模(＞1.5mg)分离。
DNA疫苗接种实验
小鼠体内DNA疫苗实验通过向6周龄的CBA/ca小鼠(Harlan，UK)施用DNA完成。将进行疫苗接种的小鼠分为6组，每组用包含特定的用LEEP系统产生的靶基因序列的重组pcDNA3.1质粒DNA免疫，除非另有说明。将在Dulbecco’s PBS(Sigma)中的100μg总量的DNA肌肉注射到两个后腿的胫骨前肌中。4周后用同量的DNA重复此步骤。为了进行比较，所有的疫苗实验中都包括对照小鼠组。这些对照组或者不进行DNA疫苗接种或者只用非重组pcDNA3.1质粒DNA免疫，接种的时间安排如以上描述。第二次免疫后4周，所有小鼠组用致死剂量无乳链球菌血清型III(97/0099菌株)腹膜内攻击。实际投放的细菌数通过在Todd-Hewitt/5％血琼脂平板上铺板接种物的连续稀释物确定。将所有小鼠在感染后3到4天处死。在感染期间，监视受攻击小鼠以发现与无乳链球菌所致疾病的发作相关的症状。以适当次序排列的典型症状包括竖毛，越来越严重的弓背姿势，眼排泄物，越来越嗜睡和不愿活动，不愿活动经常是下部身体/后腿区域明显瘫痪的结果。上述次序中靠后的症状通常与垂死状态的出现同时发生，在该阶段对小鼠进行挑出杀死以阻止进一步的疾患。这些小鼠被判断会非常快地死亡，挑出杀死的时间用来确定统计分析使用的存活时间。当发现小鼠死亡时，该小鼠的存活时间通过把一只特定小鼠最后观察到活着的时间和发现死亡的时间进行平均获得，以确定更准确的死亡时间。该实验的结果在表1中显示，在图2中以图呈现。
对结果的解释
上述被克隆且用于攻击实验的任何DNA序列对攻击起到了保护作用，则获得阳性结果。在下列条件下DNA序列可确定具有保护作用：
-如果该DNA序列与对照组比较呈现的保护作用用Mann-WhitneyU检验确定具有统计学显著性(95％的可信水平(p＞0.05))。
-如果用Mann-Whitney检验该DNA序列是显著性介于两者间的或不显著的，但显示一些保护特征。例如，一个或一些远离中心的小鼠与对照小鼠比较超出的存活时间有统计学显著性。或者，与对照组中的对应小鼠比较最先死亡的时间也可以是延长的。当对一些结果的阐述受到与DNA疫苗投放有关的问题影响时将显著性介于两者间的或不显著的结果视为潜在的阳性结果是可以接受的。确实，存活时间上的巨大差异可以反应给定小组的不同成员之间免疫反应的不同水平。
表1
LEEP DNA免疫和GBS攻击实验
存活时间的统计学分析
  平均存活时间(小时)
未接种的 3-60(ID-65) 3-5(ID-66)
 1  27.583  54.416  42.916
 2  27.583  31.000  42.916
 3  24.583  43.000  32.874
 4  22.250  34.916  42.916
 5  35.916  38.958  27.333
 6  22.250  34.916  30.916
平均值  27.583  40.458  37.791
 sd  5.1691  8.9959  7.2860
 p值  0.0098  0.0215
p值指当与非疫苗接种的对照组比较时的统计学显著性。
评价
ID-65(3-60)
与未经接种的对照组比较时用“3-60(ID-65)”DNA疫苗免疫的小鼠显示显著更长的存活时间。
ID-66(3-5)
与未经接种的对照组比较时用“3-5(ID-66)”DNA疫苗免疫的小鼠显示显著更长的存活时间。
实施例3
在蛋白质疫苗接种实验中B族链球菌LEEP来源的蛋白质的表达和筛选
蛋白质表达
将优选的基因，即基于序列特点推导出的(如图1中描述)预测表达特征选择的那些基因，利用大肠杆菌作宿主用pET系统(Novagen，Inc.，Madison，WI)克隆和作为重组蛋白质表达。将靶基因克隆到pET28b(+)质粒表达载体中。pET28b(+)载体设计用于靶蛋白质高水平表达和纯化。该载体携带一个用于靶基因转录的T7启动子，然后是一个N末端His·Tag/凝血酶/T7·Tag构型，一个包含克隆用的单一限制酶位点的多克隆位点，和一个可选择的C末端His·Tag序列。为进行选择和维持靶基因的表达该载体也携带一个卡那霉素抗性基因(pET系统手册，第8版，Novagen)。
蛋白质疫苗的制备
为每个用LEEP系统产生的靶基因设计寡核苷酸引物，除非另有说明。对每个基因进行彻底检查。在可能时，设计引物使它们靶向预计仅编码蛋白质成熟部分的那部分基因(附录II)。希望表达只对应于预计的成熟蛋白质的那些基因可以促进蛋白质最后在体外表达时的正确折叠。设计寡核苷酸引物使编码推测的靶蛋白质N末端的信号肽序列不包括在将被克隆至pET28b(+)中的最终扩增产物内。信号肽引导多肽前体通过蛋白质输出途径到达细胞膜，正常情况下在该途径中信号肽被信号肽酶I(如果是脂蛋白质通过信号肽酶II)降解。所以，不管该成熟蛋白质是出现在细菌的表面还是形成分泌的蛋白质，预期信号肽不构成成熟蛋白质的任何部分。为达到此目的，用预测来自不同生物的氨基酸序列中信号肽切割位点的存在和位置的DNA StriderTM程序(CEA，法国)和SignalP V1.1程序(Nielsen等，蛋白质工程(ProteinEngineering)10：1-6(1997))预测传统的信号肽和它们的切割位点。当N末端前导肽序列不明显时，将引物设计成包括整个基因序列用于克隆和表达。
设计所有寡核苷酸引物使它们引入适当的限制酶位点以便于其克隆到pcDNA3.1 MCS区(附录II)。正向引物包括一个Nco I(5’-ccatgg-3’)或Nhe I(5’-gctagc-3’)限制酶位点和与靶基因开放阅读框(orf)在读框内相符的“ATG”起始密码子。所有的反向引物包括一个Not I限制酶位点5’-gcggccgc-3’，设计所有的反向引物以便靶基因能够在包含C末端His·Tag的读框中表达(即靶基因的终止密码子不包括在其中)。应用Nco I和Not I可将N末端His·Tag，凝血酶和T7·TagDNA序列除去。同时在高效核糖体结合位点(来自噬菌体T7主要荚膜蛋白质)的紧下游克隆靶基因，以便于T7 RNA聚合酶对靶基因高水平表达/翻译，并且通过C末端的His·Tag便于下一步的纯化。设计所有靶基因特异的正向和方向引物使它们具有相容的熔解温度以便于它们扩增。
应用Vent DNA聚合酶(NEB)在生产商推荐的条件下通过PCR从无乳链球菌基因组模板扩增所有基因靶标。典型的扩增反应涉及一个95℃ 2分钟的起始变性步骤，然后是95℃变性35秒，适当熔解温度下退火30秒，72℃延伸1分钟的35个循环(1分钟扩增1kb的DNA)。之后，72℃ 10分钟进行最后的延伸。将所有的PCR扩增产物用酚∶氯仿(2∶1∶1)抽提一次，然后用氯仿(1∶1)抽提一次，再用乙醇沉淀。将特异的DNA片段用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中分离出来。然后将纯化后的靶基因DNA扩增物用Nco I(或Nhe I)和Not I限制酶消化，然后克隆到用Nco I和Not I消化后的pET28b(+)质粒载体中，用大肠杆菌DH5α或大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主。基因的成功克隆和维持通过限制性内切酶作图确定。
对靶蛋白质的表达和可溶性的确定
表达重组蛋白质的大肠杆菌BL21 DE3 pET28b(+)菌株的甘油储存物用于接种10ml包含卡那霉素(30μg/ml)的Luria液体培养基，剧烈振荡(300rpm)，37℃培养过夜。
将步骤1中的过夜培养物1∶100稀释接种20-40ml包含卡那霉素(30μg/ml)的Luria液体培养基，并剧烈摇动(300rpm)，37℃培养。当培养物的OD600达到0.6到1.0之间时加入IPTG，使终浓度达到1mM。典型地培养物需诱导3个小时。然后7000g 10分钟离心收获细胞。然后将细胞沉淀重新悬浮在1/10体积的裂解缓冲液中(50mM NaH2PO4，pH8.0；300mM NaCl；10mM咪唑；10％甘油)。然后加入溶菌酶至1mg/ml的终浓度，将此悬浮液在冰上孵育30分钟。然后将该悬浮液在冰上进行超声处理(200-300W，10秒钟脉冲，进行6次，中间冷却10秒针)。将裂解物10,000g离心20分钟。将上清液(包含可溶性蛋白质)转移到一个无菌的2ml eppendorf管中。将沉淀重新悬浮在2ml的裂解缓冲液(8M尿素；50mM NaH2PO4，pH8.0；300mM NaCl；10％甘油)中。该悬浮液包含不溶性的蛋白质组份。从可溶性和不溶性组份中各取等分试样转移到新的eppendorf管中。加入等量的2×SDS-PAGE缓冲液，然后95℃加热5分钟使蛋白质样品变性。将变性后的提取物样品进行SDS-PAGE分析以确定靶基因的表达和溶解性。
重组靶蛋白质的大规模表达
表达重组蛋白质的大肠杆菌BL21 DE3 pET28b(+)菌株的甘油储存物用于接种10ml包含卡那霉素(30μg/ml)的Luria液体培养基，剧烈摇动(300rpm)，37℃培养过夜。取5ml重组菌株的过夜培养物用于接种250ml包含卡那霉素(30μg/ml)的Luria液体培养基，并剧烈摇动(300rpm)，37℃培养。当培养物的OD600达到0.6到1.0之间时加入IPTG至终浓度1mM。典型地将培养物诱导3个小时。然后将培养物离心成沉淀块在-20℃冷冻储存。
靶蛋白质的纯化
Ni-NTA琼脂糖(Qiagen LTD，West Sussex，UK；Cat.No.30210)用来纯化附加His的重组蛋白质。在阅读框中和pET28b(+)中的靶蛋白质表达的6×His亲和标记物便于其与Ni-NTA的结合。Ni-NTA具备高结合能力(非特异性结合极微)，每ml树脂能够结合5-10mg 6×His-标记的蛋白质。6×His-标记物免疫原性极弱，pH8.0时，该标记物小且无电荷，所以一般不干扰蛋白质的结构和功能(TheQIAexpressionist，Qiagen Handbook，March 1999)。
注意：此处描述的所有蛋白质(LEEP来源的，除非另有说明)除了ID-65外都是在变性的条件下纯化的。ID-65的制备和纯化是在天然的条件下进行的。
在天然条件下的纯化
将冰冻的细胞沉淀在冰上融化15分钟，然后将其重新悬浮在10ml裂解缓冲液中(50mM NaH2PO4，pH8.0；300mM NaCl；10mM咪唑；10％甘油)，然后加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，将悬浮液在冰上孵育30分钟。然后将该悬浮液在冰上进行超声处理(200-300W，10秒钟脉冲，进行6次，中间冷却10秒针)。然后将Dnase I(5μg/ml)加到裂解物中，再将该裂解物冰上孵育10-15分钟。将裂解物在4℃，10,000rpm离心20分钟以沉淀细胞碎片。将澄清的裂解物上清液装载到聚丙烯柱上(Qiagen；Cat.No.34964)，盖好底部的盖子。然后加入1.5ml 50％的Ni-NTA，将柱子密封，4℃，用摆动轮轻轻混合悬浮液1-2小时。再将包含裂解物/Ni-NTA混合物的柱子直立在曲颈瓶架上使Ni-NTA沉淀下来。将底部的盖子取走，使裂解物流出。用3到6个4ml体积的冲洗缓冲液(50mM NaH2PO4，pH8.0；300mM NaCl；20mM咪唑；10％甘油)冲洗柱子。然后将蛋白质洗脱在0.5等份的洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4，pH8.0；300mM NaCl；500mM咪唑；10％甘油)中。对各部分洗脱物通过SDS-PAGE进行分析，将那些包含蛋白质的洗脱物收集在一起对一种PBS(pH7.0)-甘油(10％)溶液透析。
在变性条件下的纯化和重折叠
将冰冻的细胞沉淀在冰上融化15分钟，然后将其重新悬浮在10ml包含8M尿素，300mM NaCl，10％甘油，0.1M NaH2PO4，pH8.0，和10mM咪唑的缓冲液中。然后将细胞在室温下轻轻旋涡摇动1小时裂解。将裂解物10,000g离心20分钟以沉淀细胞碎片。将澄清的裂解物上清液装载到聚丙烯柱上(Qiagen；Cat.No.34964)，盖好底部的盖子。然后加入1.5ml 50％的Ni-NTA浆，将柱子密封，在室温，用摆动轮轻轻混合悬浮液1-2小时。再将包含裂解物/Ni-NTA混合物的柱子直立在曲颈瓶架上使Ni-NTA沉淀下来。将底部的盖子取走，使裂解物流出。用4-8ml包含8M尿素，300mM NaCl，10％甘油，0.1M NaH2PO4，pH8.0，和10mM咪唑的缓冲液冲洗柱子。用6-0M的梯度在包含0.1M NaH2PO4，pH8.0，300mM NaCl，和10％甘油的缓冲液中冲洗树脂以促使尿素的缓慢移出和靶蛋白质的逐步的重新折叠。用包含0.1M NaH2PO4，pH7.0，500mM NaCl，和10％甘油的缓冲液再冲洗树脂。然后将重组蛋白质洗脱在0.5ml等份的洗脱缓冲液(500mM咪唑，0.1M NaH2PO4，pH7.0，500mM NaCl，和10％甘油)中。对各洗脱组分通过SDS-PAGE进行分析，将那些包含蛋白质的洗脱物收集在一起对一种PBS(pH7.0)-甘油(10％)溶液透析。
在蛋白质作为抗原用于免疫和疫苗接种实验之前将所有蛋白质进行SDS-PAGE分析，结果显示在图5，6和7中。
蛋白质的接种
疫苗是由磷酸盐缓冲盐水/10％甘油中的靶蛋白质组成，并且与氢氧化铝(alum)混合(ImjectAlum，Pierce，Rockford，Ill.)。每剂疫苗(除非另有说明)在50μl PBS/10％甘油中包含25μg的纯化蛋白质，与50μl氢氧化铝混合。6-8 CBA/ca小鼠的各组(Harlan，UK)用疫苗皮下免疫，4周后再免疫一次。对照组接受100μl剂量的PBS/10％甘油和氢氧化铝。所有被接种的组都由6只小鼠组成。在第7周攻击小鼠(除非另有说明)。将2.5-5×106的细菌稀释在0.5ml的Todd-Hewitt液体培养基中，腹膜内注射小鼠。每天记录死亡共计7天。每天观察受攻击的小鼠的疾病症状。以适当次序出现的典型症状包括竖毛，越来越严重的弓背姿势，眼分泌物，越来越嗜睡和不愿活动，不愿活动经常是下部身体/后腿区域明显瘫痪的结果。上述次序中靠后的症状通常与垂死状态的出现同时发生，在该阶段对小鼠进行选出杀死以阻止进一步的疾患。这些小鼠被判断会非常快地死亡，挑出杀死的时间用来确定统计分析使用的存活时间。为确定一个比较准确的死亡时间，当发现小鼠死亡时，把这只特定小鼠最后观察到活着的时间和发现死亡的时间进行平均即为该小鼠的存活时间。
抗体反应的分析
用2剂疫苗间隔4周免疫小鼠(每组6只)。在初次免疫后的第3周和第6周进行小鼠尾部放血以获得血清。用最初的纯化蛋白质作为包被抗原，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)确定血清中针对疫苗蛋白质成分的总的免疫球蛋白质G(IgG)效价。
标准的ELISA操作步骤
溶液
碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH9.8
0.80g Na2CO3
1.46g NaHCO3
用HCl调pH至9.6
加蒸馏水(dH2O)至终体积为500ml。
n-硝基苯磷酸底物
二乙醇胺缓冲液，pH9.8
48.5ml二乙醇胺
用1M HCl调pH到9.8
加dH2O至终体积为500ml。
注意：对于用来免疫的每种蛋白质来说ELISAs都是优化的
操作步骤
1.ELISA反应板(Greiner Labortechnik 96孔板：Cat.No.655061)用碳酸盐/碳酸氢缓冲液(50μl/ml)稀释的适当浓度的重组蛋白质包被。用塑料或铂覆盖板4℃放置过夜。
2.在包含PBS/0.05％Tween-20的盆/容器中快速冲洗反应板2次然后拍干。
3.用PBS/Tween中的3％BSA(100μl/孔)室温封闭反应板1小时。
4.如前述用PBS/Tween冲洗3次然后如前述拍干。
5.将(第一抗体)蛋白质特异性抗血清在PBS/Tween中从1/50开始倍增连续稀释，加入反应板中(50μl/孔)，然后室温孵育90分钟。
6.如前述冲洗反应板(快速3次)，然后3分钟浸泡2次(在PBS/Tween中)。
7.加入稀释的第二抗体碱性磷酸酶结合物。将抗小鼠总IgG碱性磷酸酶结合物(羊抗小鼠IgG-AP，Southern BiotechnologyAssociates，Birmingham，AL.Cat.NO.1030-04)在PBS/Tween中进行1/3000稀释，然后每孔加入50μl，室温孵育90分钟。
8.如步骤6中所述冲洗反应板。
9.加入底物。将一片5mg的硝基苯磷酸(Sigma：低温保存)溶解在5ml二乙醇胺缓冲液中。然后每孔加入100μl。用铂覆盖(光敏感反应)，然后在室温放置30分钟。在405nm波长处读取光密度值(OD)。
10.画出OD值对稀释度的曲线(log标度)。当某稀释度的OD值与包含1/50稀释度的免疫前血清的孔所测得的OD值的均值相同时计算为终点效价。
ELISA反应板的格式
 2° 1/50  1/100  1/200  1/400  1/800  1/1600  1/3200  1/6400  1/12800  1/25600  1/51200
 1° 重复
 Pre
 Pre
 Pre
表的概述
Pre将聚集的接种前的血清进行1/50稀释，为进行终点效价的计算，每块反应板上包含加入该血清(每孔50μl)的重复孔。
2°一个空白对照孔，其中没有加入第二抗体结合物，代之以PBS/Tween
1°一个空白对照孔，其中没有加入第一抗体，代之以PBS/Tween
重复  每种血清以重复形式分析
对所用的稀释系列进行了说明(参见此表的第一行)。从1/50稀释度开始，在PBS/Tween中将血清进行2倍稀释，如表所示连续进行倍比稀释。
蛋白质免疫数据
ID-65和ID-83
ID-65和ID-83疫苗由与氢氧化铝(alum)(ImjectAlum，Pierce，Rockford，III.)混合的磷酸盐缓冲盐水/10％甘油中的靶蛋白质组成。每剂疫苗在100μl PBS/10％甘油中包含20μg的纯化蛋白质，与50μl氢氧化铝混合。一组6-8周龄的CBA/ca小鼠(Harlan，UK)用ID-65和ID-83疫苗皮下免疫，4周后再免疫一次。对照组接受150μl剂量的PBS/10％甘油(2∶1)和氢氧化铝。所有组都包含6只小鼠。在初次免疫后5周时进行小鼠尾部放血以获得血清。用纯化蛋白质作为包被抗原，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)确定血清中针对ID-65和ID-83蛋白质的总的免疫球蛋白质G(IgG)抗体的存在。也用最初的疫苗接种后6周从PBS/10％甘油免疫的对照组中获得的血清进行ELISA。
注意：ELISA反应板用ID-65和ID-83蛋白质以1μl/ml的浓度进行包被。
ID-65和ID-83蛋白质疫苗接种的ELISA结果
用2剂ID-65和ID-83疫苗间隔4周免疫小鼠(每组6只)。在初次免疫后的第5周进行小鼠尾部放血以获得血清。用纯化的ID-65和ID-83蛋白质作为包被抗原，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)确定血清中存在的针对疫苗蛋白质成分的免疫球蛋白质G(IgG)效价。优化后，纯化的ID-65和ID-83都以1μg/ml的浓度包被ELISA反应板。检测免疫前血清(1/50稀释度)的总的IgG效价。结果显示在表2，图示见图8。
表2
血清(组) ID-65+Alum(n＝6)   PBS+Alum(n＝6)  ID-83+Alum(n＝6)  PBS+Alum(n＝6)
包被抗原           ID-65           ID-83
采血     5周     5周     5周     5周
总IgG效价(小鼠1-6)     7535763     965     82081     61
    1557649     90     50027     50
    3319737     108     154670     80
    1832259     176     57901     96
    8794360     371     66497     125
    1445728     0     49928     0
  平均值     4080916     285     76851     69
  标准差     3258818     355     39985     43
蛋白质免疫和攻击数据(ID-93)
ID-93
ID-93疫苗是由磷酸盐缓冲盐水/10％甘油中的靶蛋白质与氢氧化铝混合(alum)(ImjectAlum，Pierce，Rockford，III.)组成。每剂疫苗在100μl PBS/10％甘油中包含25μg的纯化蛋白质，与100μl氢氧化铝混合。一组6-8周龄的CBA/ca小鼠用ID-93疫苗皮下免疫，4周后再免疫一次。对照组接受PBS/10％甘油和氢氧化铝。2组都包含6只小鼠。在第7周攻击小鼠(除非另有说明)。将5×106的细菌稀释在0.5ml的Todd-Hewitt液体培养基中进行腹膜内(i.p.)注射。每天观察受攻击的小鼠的疾病症状。每天记录小鼠的死亡，共记录7天。存活的数据显示在表3，图示见图9。
在初次免疫后的第3周和第6周进行小鼠尾部放血以获得血清。用纯化的ID-93蛋白质作为包被抗原，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)确定血清中针对ID-93蛋白质的总的免疫球蛋白质G(IgG)抗体的存在。也用在最初的疫苗接种后6周时从PBS/10％甘油免疫的对照组中获得的血清进行ELISA。注意：ELISA反应板用ID-93蛋白质以1μl/ml的浓度进行包被。表3ID-93蛋白质免疫和GBS攻击实验存活时间的统计学分析
   组   PBS+Alum     ID-93+Alum
存活时间(小时)     22.37     29.37
    22.37     35.12
    15.37     32.62
    28.03     32.62
    29.53     37.12
    26.53     27.87
  平均值     24.03     32.45
  sd     5.16     3.45
  p值     0.01
p值代表当与非免疫的对照组相比时统计学显著性。
评价
ID-93(RS-70)
用ID-93-氢氧化铝疫苗免疫的小鼠与用PBS-氢氧化铝的对照组相比显示存活时间显著延长。
(用95％置信水平(p＞0.05)的Mann-Whitney U检验确定统计学显著性)。
ID-93蛋白质疫苗接种的ELISA结果
用2剂ID-93疫苗间隔4周免疫小鼠(每组6只)。在初次免疫后的3周和6周进行小鼠尾部放血以获得血清。用纯化的ID-93蛋白质作为包被抗原，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)确定血清中存在的针对疫苗蛋白质成分的免疫球蛋白质G(IgG)效价。优化后，纯化的ID-93以1μg/ml的浓度包被ELISA反应板。检测免疫前血清(1/50稀释度)的总的IgG效价。结果显示在表4，图示见图10。
表4
血清组     ID-93+Alum(n＝6)     PBS/10％甘油(n＝6)(对照)
包被抗原     ID-93     ID-93     ID-93     ID-93
采血     3周     6周     3周     6周
总IgG效价(小鼠1-6)     87196     3000000     39     100
    99544     8000000     31     16
    19620     2000000     31     79
    34724     10000000     59     48
    59990     10000000     24     328
    30041     4000000     13     40
  平均值     55186     6166667     33     102
  标准误     32654     3600926     15     115
蛋白质免疫数据
ID-89和ID-96
ID-89和ID-96疫苗是由磷酸盐缓冲盐水/10％甘油中的靶蛋白质组成，依照生产商的使用说明与TitreMax金(TritreMax Gold)佐剂(Sigma，Missouri，USA)混合的。ID-89疫苗在50μl PBS/10％甘油中包含25μg的纯化蛋白质，与50μl TitreMax金混合。ID-96疫苗在50μl PBS/10％甘油中包含12.5μg的纯化蛋白质，与50μl TitreMax金混合。各组6-8周龄的CBA/ca小鼠(Harlan，UK)用ID-89和ID-96疫苗皮下免疫，4周后再免疫一次。对照组接受100μl剂量的PBS/10％甘油和TitreMax金(1∶1)。两组都包含6只小鼠。在初次免疫后3周和6周时进行小鼠尾部放血以获得血清。用纯化蛋白质作为包被抗原，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)确定血清中针对ID-89和ID-96蛋白质的所有免疫球蛋白质G(IgG)抗体的存在。也用最初的疫苗接种后3周和6周从PBS/10％甘油免疫过的对照组中获得的血清进行ELISA。
注意：ELISA反应板用ID-89或ID-96蛋白质各自以1μl/ml和3μl/ml的浓度进行包被。
ID-89和ID-96蛋白质疫苗接种的ELISA结果
用2剂ID-89和ID-96疫苗间隔4周免疫小鼠(每组6只)。在初次免疫后的3周和6周进行小鼠尾部放血以获得血清。用纯化的ID-89和ID-96蛋白质作为包被抗原，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)确定血清中存在的针对疫苗蛋白质成分的免疫球蛋白质G(IgG)效价。优化后，纯化的ID-89和ID-96分别是以1μg/ml和3μg/ml的浓度包被ELISA反应板。检测免疫前血清(1/50稀释度)的总的IgG效价。也用最初的疫苗接种后3周和6周时从PBS/10％甘油免疫过的对照组中获得的血清进行ELISA。结果显示在表5a和5b中，图示见图11。
表5a
血清   ID-89+TitreMax Gold(n＝6) ID-96+TitreMax Gold(n＝6)
包被抗原          ID-89            ID-96
  采血     3周     6周     3周     6周
总IgG效价(小鼠1-6)   146940     1000000     190371   10000000
  89672     1000000     212505   10000000
  173532     2000000     167613   5000000
  85161     751210     110378   5000000
  88956     551281     142614   1000000
  27880     2000000     191085   1000000
平均值   102024     1217082     169094   5333333
标准差   51451     629364     37341   4033196
表5b
血清 PBS/10％甘油(n＝6)   PBS/10％甘油(n＝6)
包被抗原          ID-89        ID-96
采血    3周     6周   3周     6周
总IgG效价(小鼠1-6)     3     7     33     31
    8     18     77     62
    29     31     77     1
    34     4     52     29
    0     2     125     31
    5     1     113     0
平均值     13     11     80     26
标准差     15     12     35     23
实施例4
候选疫苗抗原基因在B族链球菌不同的分离物中的保守性和可变性
为确定用LEEP系统分离出的新的B族链球菌基因的交叉-血清型保守性进行初步的Southern印迹分析，除非另有说明。对靶基因血清型分布的分析也可以确定它们作为GBS疫苗中的抗原成分的潜在用途。作为本研究的一部分对其DNA进行了分析的B族链球菌菌株在附录III中列出。
Southern印迹分析时用做DNA探针的特定靶基因的扩增和标记
为每个采用LEEP系统来源的目的基因设计寡核苷酸引物，除非另有说明。已在附录II中描述的相同的引物用于扩增相应的基因特异性的DNA探针。特异的靶基因应用Vent DNA聚合酶(NEB)依照生产商的使用说明通过PCR扩增。典型的反应在包含50ng GBS模板DNA的100μl体积中进行，其中还包含十分之一体积的酶反应缓冲液，每种引物1μM，每种dNTP 250μM和2单位的Vent DNA聚合酶。典型的反应包含最初的95℃变性2分钟，然后是95℃变性30秒，适当的熔解温度下退火30秒，和72℃延伸1分钟(扩增一千个DNA碱基需要1分钟)的35个循环。退火温度通过两个寡核苷酸引物中熔解温度较低的确定。最后72℃延伸10分钟后结束反应。
将所有的PCR扩增产物用酚氯仿(2∶1∶1)抽提一次，然后用氯仿(1∶1)抽提一次，再用乙醇沉淀。将特异的DNA片段用QIA quick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中分离出来。
用作DNA探针时，扩增后纯化的基因DNA片段用DIG核酸标记试剂盒(Boehringer Mannheim)依照生产商的使用说明进行地高辛配基标记。
B族链球菌基因组DNA的Southern印迹杂交分析
基因组DNA先前已从做过LEEP来源(除非另有说明)的基因靶的保守性研究的所有B族链球菌菌株中分离。用Hin D III或者EcoR I限制酶(NEB)依照生产商的使用说明对适当浓度的DNA进行消化和琼脂糖凝胶电泳的分析。DNA样品的琼脂糖凝胶电泳后，把凝胶在0.25M HCl中变性20分钟，然后将DNA通过毛细管印迹的方式过夜转移到HybondTM N+膜(Amersham)上。该方法基本如Sambrook等(1989)所述，Whatman 3MM的芯放在0.4M NaOH的池子上面的平台上。转移完成后，将滤膜在2×SSC中简短地冲洗，放在Saran包装套(Dow化学公司)中4℃储存。
当使用DIG核酸检测试剂盒时按Boehringer Mannhein推荐的条件对滤膜进行预杂交，用地高辛配基标记的DNA探针杂交，然后进行冲洗。将滤膜在杂交缓冲液(1％ w/v提供的封闭剂，5×SSC，0.1％ v/vN-月桂基肌氨酸，0.02％ v/v十二烷基硫酸钠[SDS])中68℃预杂交1小时。将地高辛配基标记的DNA探针在加入到杂交缓冲液之前99.9℃变性10分钟。允许在Hybaid微杂交炉中旋转的Hybaid管中进行过夜杂交。用2×SSC-0.1％SDS室温下冲洗滤膜5分钟2次将未结合的探针除去。然后为增加严格性将滤膜用0.1×SSC-0.1％SDS 68℃冲洗15分钟2次。DIG核酸检测试剂盒(Boehringer Mannheim)用来免疫学检测特异结合的地高辛配基标记的DNA探针。
Southern印迹分析的结果
除非另有说明，所有的基因组消化物和它们相应的Southern印迹都遵循下面表6中描述的相同泳道顺序。
表6
  泳道   1   2   3   4    5     6     7
  菌株   1kb分子量标准 515  A909  SB35  H36B  18RS21  1954/92
  血清型 Ia  Ia  Ib  Ib  II  II
泳道   8  9  10 11 12 13  14
菌株  118/158  97/0057  BS30 M781 97/0099 3139  1169-NT
血清型   II  II  III III III IV  V
  泳道 15  16  17  18 19 20
  菌株 GBS6  7271  JM9  A族链球菌 Streptococcuspneumoniae(肺炎链球菌) 1kb分子
  血清型 VI  VII  VIII  -  14 量标准
为达到比较的目的，决定分析GBS rib基因的血清型分布，rib基因编码已知的保护性的免疫原Rib。以前已发现Rib在血清型III中和血清型II的一些菌株中存在，但在血清型Ia和Ib中不存在(Stalhammar-Carlemalm等，实验医学杂志(J.Exp.Med.)177：1593-1603(1993))。
这种模式的确定不仅对后续的结果的解释增加了可信度，而且也可以确定rib同源基因在此处研究的其余GBS血清型中是否存在。为在Southern印迹分析中作为基因探针应用的rib的扩增所设计的引物在附录II中描述。
表7-图12的泳道顺序(rib基因的Southern印迹分析)
泳道 1 2  3  4  5  6  7
菌株 1kb分子量标准 515  A909  SB35  H36B  18RS21  1954/92
血清型 Ia  Ia  Ib  Ib  II  II
泳道 8  9  10  11  12  13  14
菌株 118/158  97/0057  BM110  BS30  M781  97/0099  3139
血清型 II  II  III  III  III  III  IV
泳道 15  16  17  18  19 20
菌株 1169-NT  GBS6  7271  JM9  A族链球菌 肺炎链球菌
血清型 V  VI  VII  VIII  - 14
对Rib(图12)的评论
图12显示的Southern印迹分析提示rib基因不是在所有GBS血清型中都是保守的。血清型Ia和Ib的所有菌株(泳道2到5)和血清型II的118/158和97/0057菌株(泳道8和9)中都不存在rib。然而，rib在血清型II的18RS21和1954/92(泳道6和7)菌株和血清型III的所有菌株(泳道10到13)中都存在。这与以前发表的数据相一致(Stalhammar-Carlemalm等，1993[同上])。Rib也在代表血清型VII和VIII的菌株(泳道17和18)中存在，但在代表血清型IV，V和V(泳道14到16)的菌株和对照菌株(泳道19和20)中不存在。rib基因探针以较低的强度与来自代表血清型Ia，Ib，IV，VI，VII的菌株和血清型II的菌株118/158和97/0057的基因组DNA片段杂交。这可能提示在这些菌株中存在与rib低水平同源性的基因。这些杂交的DNA片段可能包含编码与Rib蛋白质同源性很高的Ca蛋白质抗原的GBS bca基因(Wastfelt等，生物化学杂志(J.Biol.Chem)，271：18892-18897(1996))的同源基因。如果情况确是如此，这将与以前的工作即上述2种蛋白质之一在血清型Ia，Ib，II和III的所有菌株中都是阳性(Stalhammar-Carlemalm等，1993[同上])的相一致。然而，rib基因在不同GBS血清型之间明显的可变性的分布使它作为用于对抗所有血清型的交叉保护性的GBS疫苗的候选物质不够理想。
对ID-65(图13)的评论
图13中描述的Southern印迹分析提示基因ID-65在所有GBS血清型中是保守的。该基因探针特异性地与来自所有GBS代表菌的DNA消化物中大约3.0kb的Hin DIII消化的基因组DNA片段杂交，而在两个对照菌株中都不存在(泳道18和19)。这提示ID-65基因在所有GBS血清型(和菌株)中在基因和基因座水平是保守的。ID-65 DNA探针也与1.636bp的分子量标准物进行微弱的杂交(来自NEB的1kb的DNA梯用来估计所有Southern印迹分析中的DNA片段的大小)。
对ID-89(图14)的评论
图14中描述的Southern印迹分析提示基因ID-89并排在所有GBS血清型中保守。来自16个GBS菌株中12个菌株的4.0kb Hin DIII消化的基因组DNA片段与ID-89基因探针特异性地杂交。另外，来自GBS菌株Ib(SB35)(泳道4)的3.25kb Hin DIII消化的基因组DNA片段也与ID-89基因探针特异性地杂交。然而，ID-89基因探针不与来自菌株Ia(515)[泳道2]，IV(3139)[泳道13]和V(1169-NT)[泳道14]的消化的基因组DNA片段杂交，这提示这些菌株不存在ID-89同源物。
对ID-93(图15)的评论
图15中描述的Southern印迹分析提示基因ID-93在所有GBS血清型中是保守的。该基因探针特异性地与来自所有GBS代表菌的DNA消化物中大约3.25kb的Hin DIII消化的基因组DNA片段杂交，而在两个对照菌株中不存在(泳道18和19)。这提示ID-93基因在所有GBS血清型(和菌株)中在基因和基因座水平是保守的。
对ID-96(图16)的评论
图16中描述的Southern印迹分析提示基因ID-96在所有GBS血清型中是保守的。基因探针特异性地与来自所有GBS代表菌的DNA消化物中大约12.0个kb的EcoR I-消化的基因组DNA片段杂交，而在两个对照菌株中不存在(泳道18和19)。这提示ID-96基因在所有GBS血清型(和菌株)中在基因和基因座水平是保守的。
附录I
ID-65
正向引物
5’-cggatccgccaccatgGCGGATCAAACTACATCGGTTC-3’
反向引物
5’-ttgcggccgcGTTGGGATAACTAGTCGGTTTAGTCG
长度(包括限制性位点)＝1541bp
纳入1515bp编码推测的成熟蛋白质的505个氨基酸的基因特异性序列。
PCR扩增的退火温度＝60℃
预测编码信号肽的序列从扩增产物中略去
ID-66
正向引物
5’-cggatccgccaccatgAATCTTTATTTCCATAGTACTCCCTTGC-3’
反向引物
5’-ttgcggccgcAAAATGATCAGTTTGAGGGTAAAAGAG-3’
长度(包括限制性位点)＝767bp
纳入747bp编码推测的成熟蛋白质的247个氨基酸的基因特异性序列。
PCR扩增的退火温度＝60℃
预测编码信号肽的序列从扩增产物中略去
附录II
ID-65
正向引物
5’-catgccatgGCGGATCAAACTACATCGGTTC-3’
反向引物
5’-ttgcggccgcGTTGGGATAACTAGTCGGTTTAGTCG
长度(包括限制性位点)＝1534bp
纳入1515bp编码推测的成熟蛋白质的505个氨基酸的基因特异序列。
PCR扩增的退火温度＝60℃
ID-83
正向引物
5’-catgccatggcaAAAATAGTAGTACCAGTAATGCCTC-3’
反向引物
5’-ttgcggccgcCTCTGAAATAGTAATTTGTCCG-3’
长度(包括限制性位点)＝626bp
纳入624bp编码推测的成熟蛋白质的208个氨基酸的基因特异序列。
PCR扩增的退火温度＝52℃
ID-89
正向引物
5’-catgccatgggaAAGAAAGCAAATAATGTCAGTCC-3’
反向引物
5’-ttgcggccgcATTGGGTGTAAGCATTTTTTC-3’
长度(包括限制性位点)＝990bp
纳入969bp编码推测的成熟蛋白质的323个氨基酸的基因特异序列。
PCR扩增的退火温度＝54℃
TD-93
正向引物
5’-catgccatgggaACTGAGAACTGGTTACATACTAAAG-3’
反向引物
5’-ttgcggccgcATTAGCTTTTTCAACAATTTCTC-3’
长度(包括限制性位点)＝759bp
纳入744bp编码推测的成熟蛋白质的248个氨基酸的基因特异序列。
PCR扩增的退火温度＝51℃
ID-96
正向引物
5’-ctagctagccgATGTTTGCGTGGGAAAG-3’
反向引物
5’-ttgcggccgcATAAGATTTAACAATACCAAGTAATATAGC-3’
长度(包括限制性位点)＝944bp
纳入921bp编码推测的成熟蛋白质的307个氨基酸的基因特异序列。
PCR扩增的退火温度＝53℃
rib(对照)
正向引物
5’-ggggtaccggccaccATGGCTGAAGTAATTTCAGGAAGT-3’
反向引物
5’-cggaattccgTTAATCCTCTTTTTTTCTTAGAAACAGAT
长度(包括限制性位点)＝3559bp
纳入3531bp编码推测的成熟蛋白质的1177个氨基酸的基因特异序列。
PCR扩增的退火温度＝55℃
附录III
以下列出的是对其DNA做过基因保守性分析的B族链球菌菌株(血
清型和菌株名称)的详细资料。
血清型           菌株
Ia               515
Ia               A909
Ib               SB35
Ib               H36B
II               18RS21
II               1954/92
II               118/158
II               97/0057
III              BM110
III              BS30
III              M781
III              97/0099
IV               3139
V                1169/NT
VI               GBS VI
VII              7271
VIII             JM9
在分析中还包括了用作对照目的的A族链球菌菌株(血清型M1，菌株NCTC8198)和肺炎链球菌(血清型14)。

Claims (24)

1.B族链球菌的多肽或蛋白质、或其片段或衍生物，其中该多肽或蛋白质具有从图1描述的那些序列中选择的序列。
2.权利要求1中所述的蛋白质、多肽和肽的衍生物或变异体，其与权利要求1中所述的那些蛋白质、多肽和肽有至少50％的同一性。
3.权利要求1或2中所述的B族链球菌的多肽或蛋白质、或其衍生物或变异体，是分离的或重组的。
4.包含或由一种序列组成的核酸分子，该序列是：
(i)在说明书图1所示DNA序列或它们的RNA等价物中的任何序列；
(ii)与(i)中序列的任何序列互补的序列；
(iii)与(i)或(ii)的那些序列编码相同的蛋白质或多肽的序列；
(iv)显示与(i)、(ii)和(ii)的那些序列中的任何序列有实质同一性的序列；或
(v)编码图1所示核酸分子的衍生物或片段的序列。
5.载体，其包含一个或多个权利要求4中所定义的核酸分子。
6.权利要求4中所述的载体，该载体进一步包含编码以下成员任何一个或多个的核酸：启动子，增强子，信号序列，前导序列，翻译起始和终止信号，DNA稳定性控制区域，或融合部分。
7.权利要求5或6中所述的载体在转化或转染原核或真核宿主中的应用。
8.转化了权利要求5或6中定义的载体的宿主细胞。
9.产生权利要求1或2中所述的B族链球菌多肽或蛋白质、或其衍生物或变异体的方法，该方法包括在权利要求8所述的宿主细胞中表达上述多肽或蛋白质。
10.与权利要求1到3之任何一项所定义的蛋白质、多肽、肽、其片段或衍生物中的一个或多个结合的抗体、亲和体或其衍生物。
11.一种免疫原性组合物，该组合物包含权利要求1到3之任何一项所定义的蛋白质、多肽、肽、其片段或衍生物中的一个或多个。
12.权利要求11中所述的免疫原性组合物，其中蛋白质、多肽、肽、或其片段或衍生物包括ID-65或ID-83，ID-89，ID-93或ID-96。
13.权利要求11或12中所述的免疫原性组合物，其是疫苗。
14.一种免疫原性组合物，该组合物包含权利要求4中定义的核酸序列的一个或多个。
15.权利要求14中所述的免疫原性组合物，其中核酸序列包括ID-65或ID-66。
16.权利要求14或15中所述的免疫原性组合物，其是疫苗。
17.权利要求11到16之任何一项所定义的免疫原性组合物在制备用于治疗或预防B族链球菌感染的药物中的应用。
18.一种检测B族链球菌的方法，该方法包括使待检样品与至少一个权利要求10所述的抗体、亲和体或其衍生物接触的步骤。
19.一种检测B族链球菌的方法，该方法包括使待检样品与至少一个权利要求1到3之任何一项所定义的蛋白质、多肽、肽、片段或衍生物接触的步骤。
20.一种检测B族链球菌的方法，该方法包括使待检样品与至少一个权利要求4所定义的核酸分子接触的步骤。
21.一种检测B族链球菌的试剂盒，该试剂盒包含至少一个权利要求10所定义的抗体、亲和体、或其衍生物。
22.一种检测B族链球菌的试剂盒，该试剂盒包含至少一个权利要求1到3之任何一项所定义的B族链球菌蛋白质、多肽、肽、其片段或衍生物。
23.一种检测B族链球菌的试剂盒，该试剂盒包含至少一个权利要求4所定义的核酸分子。
24.确定权利要求1到3之任何一项所定义的蛋白质、多肽、肽、其片段或衍生物是否代表潜在的抗微生物靶标的方法，该方法包括使所述蛋白质失活和确定B族链球菌是否仍然存活。
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