CN1344323A - 来源于b组链球菌的核酸和蛋白质 - Google Patents

Abstract

本文描述了来源于B组链球菌的新蛋白质抗原,以及编码它们的核酸序列。本文也描述了它们在疫苗中的用途和它们的筛选方法。

Description

来源于B组链球菌的核酸和蛋白质

本发明涉及来源于无乳链球菌的蛋白质，编码这些蛋白质的核酸分子，这些蛋白质作为抗原和/或免疫原以及在检测/诊断中的用途。本发明也涉及快速筛选细菌基因组以分离与所述蛋白质有关和分泌所述蛋白质之细菌细胞膜并确定其特征的方法。

B组链球菌(GBS)(无乳链球菌)是一种包在荚膜内的细菌，作为在新生儿及成年人中引起脓毒和脑膜炎的人类主要病原体出现于二十世纪七十年代。头5天早期发作新生儿感染的发病率在每1000个新生儿0.7至3.7个之间，并且造成这种病症约20％的死亡率。从早期发作感染存活的新生儿的25-50％经常出现神经后遗症。出现在6天至三个月的后期发作感染的发病率在每1000个新生儿0.5至1.0个之间。

已经建立了分娩时母亲生殖道GBS群集和出现新生儿脓毒危险之间的关系。在人类中，已经可以证实直肠充当GBS的贮藏处。在新生儿中的易感性与低浓度的或缺乏IgG抗体有关，该抗体针对在引起人类疾病的GBS上观察到的囊多糖。在美国，从临床分离的菌株通常属于囊状血清型Ia，Ib，II，III，尽管血清型V有增加的显著性。在日本VIII型GBS是新生儿脓毒的主要病因。

一种可能的预防手段包括对母亲体内或产后施用多烯抗生素，但担心这样导致出现抗性有机体和在某些情况下出现过敏反应。免疫接种青春期女性以诱导长期持久的母体来源的免疫性是在新生儿中预防GBS感染最有前途的方法之一。就疫苗开发而言，这些有机体的荚膜多糖抗原已经引起了高度重视。健康成年志愿者研究显示血清型Ia，II和III多糖在非免疫成年人中为非毒性和免疫原性的分别为大约65％，95％和70％。在成年志愿者中的CBS多糖接种研究表明，采用荚膜抗原为疫苗的一个问题是应答速率随预免疫状态和多糖抗原而变化，并且并非所有疫苗都产生足够水平的IgG抗体。

尽管重复刺激，一些人仍然不作出反应。这些性质是因为多糖抗原的T-不依赖性。提高这些疫苗免疫原性的策略是通过将它们连接到蛋白质上增强多糖的T细胞依赖性。多糖缀合物的利用看上去有前景，但是就成熟的载体蛋白质而言仍然存在非分辩的问题。GBS的疫苗缀合物需要在疫苗的成本上增加至少4种不同的缀合物。

最近的证据也表明：细菌表面的蛋白质对赋予免疫性也可以是有用的。被称为rib的蛋白质在大多数血清型III菌株上发现，但很少在血清型Ia，Ib或II上发现，其产生免疫性，在动物模型中激发rib表达GBS (Stalhammar-Carlemalm，实验医学杂志177：1593-1603(1993))。作为疫苗组分的另一种目的表面蛋白质是C蛋白质的α抗原，其保护接种过的小鼠使之免受表达α蛋白质之菌株的致使感染。由GBS菌株所表达的抗原的量有着显著的变化。

依赖于使用囊多糖的抗GBS感染的免疫接种方法有缺点，其应答速率很可能随预免疫状态和所使用的特殊类型的多糖抗原而变化。在人志愿者中的试验结果表明，对一些关键荚膜抗原，应答速率仅约65％(Larsson等，感染与免疫性：64：3518-3523(1996))。它不清楚是否对所述疫苗应答的所有个体具有足够水平的多糖特异性的IgG，其可以跨越胎盘并带给胎儿免疫性。通过将蛋白质载体连结到多糖抗原上，将它们转化成T-细胞依赖抗原，并且提高它们的免疫原性也许是可能的。

用GBS III型多糖-破伤风类毒素缀合物进行的初步研究给人以鼓舞(Baker等，传染病回顾7：458-467(1985)，Baker等，新英格兰医学杂志319：1180-1185(1988)，Paoletti等，感染与免疫64：677-679(1996)，Paoletti等，感染与免疫62：3236-3243(1994))，但是在发达国家，使用破伤风可能是不利的，由于大多数成年人在过去五年之内针对破伤风进行过免疫。使用破伤风类毒素的另一种推动力可以导致不利的反应(Boyer.，小儿科的当前评价7：13-18(1995))。与其它种类的疫苗比较，多糖缀合物疫苗生产和制造价格昂贵，处于劣势。也存在由GBS多糖与含唾液酸的人糖蛋白之间的交叉反应导致的可能的风险问题。

多糖类作为抗原的哪一种选择是使用来源于GBS的蛋白质抗原。最近的证据表明：GBS表面相关蛋白质rib和αC蛋白质可以用来在实验模型系统中赋予针对GBS感染的免疫性(Stalhammar-Carlemalm等，(1993)[同上]，Larsson等，(1996)[同上])。然而，这两种蛋白质在导致人类疾病的GBS的所有血清型中不是保守的。假定这些抗原是免疫原性的并且在人中激发保护性水平的应答，则它们将不产生针对所有感染的保护作用，因为10％的传染性B组链球菌不表达rib或C蛋白质α。

本发明通过利用新的筛选方法致力于克服针对GBS的免疫接种问题，所述方法特定地设计来鉴别编码细菌细胞表面相关或分泌蛋白(抗原)的B组链球菌基因。由这些基因表达的蛋白质可以是免疫原性的，并且因此可以在B组链球菌感染的预防与治疗中有用。对于本申请的目的而言，术语免疫原性意指这些蛋白质将在被接种者中激发保护性免疫应答。利用这一新筛选方法，已经鉴别了大量编码新B组链球菌蛋白质的基因。

因此在第一个方面，本发明提供了B组链球菌蛋白质，或者其片段或衍生物，所说的蛋白质具有选自图1所描述的哪些序列之序列。

本领域技术人员会很清楚，所说的这一组内的蛋白质和多肽是细胞表面受体，粘着分子，输出蛋白质，膜结构蛋白质，和/或信号分子。

蛋白质的氨基酸序列可以出现改变，其不影响蛋白质的功能。这些改变包括氨基酸缺失，插入和取代，并且可以导致可变剪接和/或出现若干翻译起始位点和终止位点。作为翻译过程背信的结果，可以出现多形性。氨基酸序列上这样的改变可以容许，其确实不影响蛋白质的功能。

这样，本发明包括本发明的蛋白质，多肽，以及肽的衍生物或变体，它们至少显示出与本文所描述的蛋白质，多肽以及肽50％的同源性。序列同源性优选的程度是至少60％，更优选的是约75％。最优选的是约80％，90％或甚至是95％。

术语同源性可以用来描述两种多肽序列之间的相似性。用于实施这一方法的本领域熟知的软件包是CLUSTAL程序。它比较两种多肽的氨基酸序列，并且适当时通过在两种序列中插入间隔找到最佳序列对比。氨基酸同源性或相似性(同源性加保守氨基酸类型)也可以利用软件包如BLASTx计算。这一程序排列最大类似序列骨架，并分配适配值。对任何一种模式的比较都可以发现类似性的几个区域，每一个有不同的得分。本领域技术人员会清楚，两种不同长度的多肽可以在更长片段的全长上比较。此外，可以比较小的区域。相同的长度的普通序列为进行的有用比较被比较。

编码蛋白质的DNA的操纵对修饰蛋白质和为纯化目的产生大量蛋白质而言是特别强有力的技术。这一技术可以包括利用PCR技术扩增所需核酸序列。这样，本文提供的序列数据可以用于设计PCR引物，以便所需序列可以作为靶标，然后扩增到高的程度。

典型地引物至少五个核苷酸长，并且一般至少十个核苷酸长(例如十五至二十五个核苷酸长)。在某些情况下，可以使用至少三十或至少三十五个核苷酸长的引物。

可以使用另一种可替的化学合成。这可以自动化。比较短的序列可以化学合成，并且共同连接以提供更长的序列。

在另一方面，本发明提供了核酸分子，该分子包含以下序列或者由以下序列组成：

(i)本文图1和图2所示的任何DNA序列或者它们的RNA等同物；

(ii)互补于(i)中任何序列的序列；

(iii)与(i)或(ii)中的那些序列编码相同的蛋白质或多肽的序列；

(iv)与(i)，(ii)和(iii)的那些序列的任何序列显示实质上的同源性的序列；或

(v)编码图1或图2所示核酸分子的衍生物或片段的序列。

术语同源性也可以用来描述两个DNA序列之间的相似性。‘bestfit’程序(Smith和Waterman，应用数学进展482-489(1981))是发现两种核酸序列之间的相似性的最好节段的计算机软件的一个例子，而GAP程序使得序列沿它们的全长排列，并且适当时通过在两种序列中插入间隔找到最佳序列对比。

以上使用的术语‘RNA’等同物指给定的RNA分子具有互补于给定DNA分子的序列，在遗传密码上允许‘U’替代‘T’。核酸分子可以是分离的或重组体形式。

核酸分子可以是分离的或重组体形式。采用本领域熟知的方法可以容易地产生DNA构建体。这些技术已经公开，例如J.Sambrook等，分子克隆，第二版；冷泉港实验室出版社(1989)。DNA的构建体和表达的蛋白质的修饰，例如添加启动子，增强子，信号序列，前导序列，翻译起始和终止信号和DNA稳定性控制区，或添加融合配体可能是有利的。

通常DNA构建体插入到载体中，该载体可以是噬菌体或质粒源的。通过将载体转化或转染进真核或原核源宿主细胞可以获得蛋白质的表达。这些载体和合适的宿主细胞是本发明的另一方面。

本文描述的B组链球菌蛋白质(抗原)另外可以用来产生抗体，或产生亲和抗体(affibody)。这些抗体可以用来发现B组链球菌。

由此，另一方面，本发明提供了抗体，亲和抗体，或其衍生物，它们结合本文所描述的任何一种或多种蛋白质，多肽，肽，它们的片段或它们的衍生物。

在本发明的范围内的抗体可以是单克隆或多克隆抗体。多克隆抗体可以通过将本文所描述的蛋白质，其同系物，衍生物或片段注射进动物，在合适的动物宿主(例如小鼠，大鼠，豚鼠，兔，绵羊，山羊或猴子)中刺激它们产生得到提高。如果需要，可以与蛋白质一道施用佐剂。众所周知的佐剂包括Freund’s佐剂(完全和不完全)和氢氧化铝。然后，借助于它们结合到本文所描述的蛋白质上，可以纯化抗体。

可以由杂交瘤产生单克隆抗体。这些杂交瘤可以通过融合骨髓瘤细胞和合产生所需抗体的脾细胞以形成无限增殖细胞系来形成。这样可以使用众所周知的Kohler与Milstein技术(自然256(1975))或后续改进。

用以产生结合到一种特殊多肽/蛋白质上的单克隆和多克隆抗体的技术在本领域是充分发展的。它们在标准免疫学教科书中有讨论，例如Roitt等，免疫学，第二版(1989)，Churchill Livingstone，伦敦。

除整个抗体之外，本发明还包括它们的衍生物，这些衍生物能够结合到本文所描述的蛋白质等上。这样本发明包括抗体片段和合成构建体。抗体片段和合成构建体的例子由Dougall等在Tibtech 12 372-379(1994年9月)中给出。

抗体片段包括，例如，Fab，F(ab′)₂和Fv片段(这些Fab片段在Roitt等[同上]中讨论)。Fv片段可被修饰来产生被称为单链Fv(scFv)分子的合成构建体。这一构建体包括共价连接Vh与V1区的肽接头，其对分子的稳定性有贡献。可以使用的其它合成构建体包括CDR肽。这些是包含抗原-结合决定簇的合成肽。也可以使用肽模拟物。这些分子通常是构象上受限制的有机环，其模拟CDR环结构，并包含抗原-反应性侧链。

合成构建体包括嵌和分子。这样，例如，人化的(或灵长化)抗体或其衍生物在本发明的范围之内。人化的抗体的一个例子是具有人构架区，但不具有啮齿动物高变区的抗体。产生嵌和抗体的方法在例如以下文献中有描述：Morrison等，PNAS，81，685 1-6855(1984)和Takeda等，自然314，452-454(1985)。

合成构建体也包括这样的分子，其包含提供具有某些所需性质(除了抗原结合外)的分子的附加部分。例如该部分可以是标记(例如荧光的或放射性标记)。此外，它可以是一种药学上的活化剂。

抗体是被发现以低的离解常数结合到靶蛋白质上的蛋白质，它们从表达兴趣靶蛋白节段的噬菌体显示文库中选择(Nord K，GunneriussonE，Ringdahl J，Stahl S，Uhlen M，Nygren PA.，皇家技术学院，生物化学和生物技术系(KTH)，斯德哥尔摩，瑞典)。

在另一方面，本发明提供了一种免疫原性组合物，该组合物包含以上描述的蛋白质，多肽，肽，它们的片段或它们的衍生物，或者核酸序列。这一种类的组合物可以在治疗或预防B组链球菌感染中有用。在本发明的一个优选的方面所说的免疫原性组合物是疫苗。

在其它方面，本发明提供了：

i)本文所描述的免疫原性组合物在制备治疗或预防B组链球菌感染之药物上的用途。优选的药物是疫苗

ii)一种检测B组链球菌的方法，该方法包括使待试样品与本文所描述的至少一种抗体，亲和抗体，或其衍生物接触的步骤。

iii)一种检测B组链球菌的方法，该方法包括使待试样品与本文所描述的至少一种蛋白质，多肽，肽，它们的片段或它们的衍生物接触的步骤。

iv)一种检测B组链球菌的方法，该方法包括使待试样品与本文所描述的至少一种核酸分子接触的步骤。

v)一种用于检测B组链球菌的试剂盒，该试剂盒包含本文所描述的至少一种抗体，亲和抗体，或其衍生物。

vi)一种用于检测B组链球菌的试剂盒，该试剂盒包含本文所描述的的至少一种蛋白质，多肽，肽，它们的片段或它们的衍生物。

vii)一种用于检测B组链球菌的试剂盒，该试剂盒包含本文所描述的至少一种核酸分子。

如前所述，利用新的筛选方法鉴别和分离本文所描述的新蛋白质，该方法专门确定编码细菌细胞膜相关或分泌蛋白质的B组链球菌基因。

对于蛋白质的分泌/输出必需的信息在细菌中得到了广泛研究。在大多数情况下，输出需要位于前体蛋白质N-末端以便在膜上靶向前体至转移位点的信号肽。在转移期间或之后，信号肽由信号肽酶除去。蛋白质的最终目的地/定位(它是否孢外分泌或锚定到细菌表面等)由序列而不是前导肽序列决定。

前不久，Poquet等(细菌学杂志，180：1904-1912(1998))描述了一种筛选载体，其掺入了缺乏其自身作为报道基因的信号前导的nuc基因，以在革兰氏阳性菌中鉴别输出的蛋白质，并将该载体用于乳酸乳球菌。葡萄球菌核酸酶是自然分泌的热稳定的单体酶，其已经在许多和革兰氏阳性菌中得到有效地表达和分泌(Shortle.，基因，22：181-189(1983)，Kovacevic等，细菌学杂志，162：521-528(1985)，Miller等，细菌学杂志，169：3508-3514(1987)，LiebI等，细菌学杂志，174：1854-1861(1992)，Le Loir等，细菌学杂志，176：5135-5139(1994)，Poquet等，1998[同上])；筛选载体(pFUN)包含pAMβl复制子，除ColE 1复制子(促进在大肠杆菌和某些其它革兰氏阴性细菌中的复制)之外，它在宽范围的革兰氏阳性菌中起作用。存在于该载体中的唯一克隆位点可以用来产生克隆的基因组DNA片段与截短的nuc基因(避免其自身分泌前导序列)的开放读框之间的转录和翻译融合。nuc基因产生一个理想的报道基因，因为利用以下简单和敏感的平板试验，可以容易地被检测到核酸酶的分泌：分泌核酸酶的重组体菌落产生粉红环，而对照菌落仍然是白的(Shortle，1983[同上]，Le Loir等，1994[同上])。

本发明发明人已经开发了一种直接筛选法，以在病原菌中鉴别和分离编码细菌细胞膜相关或分泌蛋白质(抗原)的DNA，发明人在乳酸乳球菌中采用一种载体系统(pTREP1表达载体)，从B组链球菌特异性地检测邻近于并相关于编码表面蛋白质的DNA序列。筛选载体也掺合编码葡萄球菌核酸酶的nuc基因作为报道基因。

在乳酸乳球菌中仅编码成熟核酸酶蛋白质的nuc基因的一部分(减它的信号肽序列)被克隆进pTREP1表达载体。在这一形式中，nuc-编码的核酸酶不能分泌，甚至当胞外表达时。然后报道载体与适当消化的B组链球菌基因组DNA随机结合，克隆进乳酸乳球菌，并且用作允许核酸酶输出的序列的筛选系统。以这种方式分离编码B组链球菌输出蛋白质的基因/部分基因序列。一旦获得部分基因序列，利用本领域熟知的技术就可以容易地获得编码输出蛋白质的全长序列。

在持有启动子中，pTPEP1-nuC载体不同于由Poquet等(1998)[同上]描述的pFUN-载体，这用通过直接在乳酸乳球菌中直接筛选输出蛋白质来鉴别输出蛋白质。因为pFUN载体不含有Nuc开放读框启动子上游，除了翻译起始和Nuc分泌所需的那些元件之外，克隆的基因组DNA片段也必须提供转录信号。

这一局限性可以阻止远离启动子的基因的分离，例如在多顺反子操纵子之内的基因。此外，来源于其它细菌物种的启动子识别乳酸乳球菌和在其中起作用可能是没有保证的。某些启动子可以在天然宿主中但不是乳酸乳球菌中受到严格的调节。相对地，在pTREP1-nuc载体系列中P1启动子的存在确保没有启动子的DNA片段(或包含在乳酸乳球菌中非活性的启动子序列的DNA片段)仍然可以转录。目前本发明的另一个优点是在其它筛选中错过的基因可以得到鉴定。

因此，在另一方面，本发明提供了一种在革兰氏阳性菌中筛选编码与表面抗原相关之细菌细胞膜的DNA的方法，该方法包括以下步骤：

-将报道载体与革兰氏阳性菌的DNA组合在一起，所说的报道载体包括编码来源于葡萄球菌核酸酶基因之成熟序列的核苷酸序列和上游启动子区；

-将所形成的载体转化进乳酸乳球菌细胞；

-检测葡萄球菌核酸酶蛋白在转化细胞中的分泌。

优选地，报道载体是图4所示的一种pTREP1-nuc载体。

另一方面，本发明提供了图4所示的载体在革兰氏阳性菌中筛选编码输出或表面抗原上的用途，可以筛选的革兰氏阳性菌的例子是B组链球菌，肺炎链球菌，金黄色葡萄球菌或致病性A组链球菌。

假定发明人已经鉴定了一组重要的蛋白质，则这样的蛋白质是抗微生物治疗的潜在的靶。然而，有必要确定每一个体蛋白质是否对有机体生存十分重要。这样，本发明也提供了一种确定本文所描述的蛋白质或多肽是否代表潜在的抗微生物靶的方法，该方法包括灭活所说的蛋白质，并且确定B组链球菌是否仍然能生存。

用于灭活蛋白质的合适的方法是使所选择的基因失效，即阻止蛋白质的表达，并且确定这一过程是否导致致死变化。用于实施这样的基因失效的合适方法在Li等，P.N.A.S.，94：13251-13256(1997)和Kolkman等中有描述。

在最后一方面，本发明提供了能够拮抗，抑制或以其它方式干扰本发明的蛋白质或多肽的功能或表达之药剂在制造用于治疗预防B组链球菌感染的药物上的用途。

现在将借助下列实施例描述本发明，这些实施例不以任何方式限制本发明，它们参照了附图，其中：

图1：(A)显示了编码抗原性B组链球菌蛋白质的一些全长核苷酸序列。(B)显示了对应的氨基酸序列。

图2：显示了用于筛选过程的一些寡核苷酸引物

nucS1引物设计来扩增成熟形式的nucA基因

nucS2-引物设计来扩增成熟形式的nucA基因

nucS3引物设计来扩增成熟形式的nucA基因

nucR引物设计来扩增成熟形式的nucA基因

nucseq引物设计来将序列DNA克隆进pTREP-Nuc载体

pTREPF含有ECORV识别位点的核酸序列。用于克隆片段进pTREX7

pTREPR含有BAMH 1识别位点的核酸序列。用于克隆片段进pTREX7

PUCF正向测序引物，使得能够直接测序克隆的DNA片段

VR用于通过DNA步行法获得其它抗原DNA序列的基因特异性引物的例子

V1用于通过DNA步行法获得其它抗原DNA序列的基因特异性引物的例子

V2用于通过DNA步行法获得其它抗原DNA序列的基因特异性引物的例子

图3：(i)pTREP1-nuc1，pTREP1-nuc2和pTREP1-nuc3中就在成熟nuc基因上游的唯一基因克隆位点的核苷酸序列的示意图。每一种pTREP-nuc载体都含有EcoRV(在pTREP1-nuc2中SmaI位点)切割位点，其使得可以在成熟nuc基因的3种不同框架中克隆基因组DNA片段。

(ii)pTREP1-nuc载体的物理和遗传概要图。绘出了掺入nuc的表达盒，大环内酯，lincosamides和链阳性菌素B(MLS)抗性决定簇，以及复制子(rep)OripAMβl(不是按比例绘制)。

(iii)显示了涉及基因表达以及唯一限制性核酸内切酶位点定位的各种序列元件的表达盒(不是按比例绘制)。

图4：显示各种DNA疫苗的试验结果；

图5：显示第二组DNA疫苗的试验结果；

图6-11：显示各种不同的B组链球菌菌株的Southern印迹分析。

实施例1

利用本发明的核酸酶筛选系统已经鉴别了远超过100个在无乳链球菌中推定的编码输出蛋白基因/部分基因序列。进一步地分析了这些以除去人工因子。利用所说的筛选系统鉴别的基因的核苷酸序列已经利用以下描述的一些参数进行了表征。所有这些序列都是新的，它们以前还没有描述过。

1.所有推定的表面蛋白质分析了前导/信号肽序列。细菌信号肽序列享有一种共同的结构。它们的特征是：短的荷电N-末端(N区)直接位于疏水残基骨架(中央部分-h区)之前，接着包含切割位点的更极化的C-末端部分(C-区)。计算机软件用来完成推定的蛋白质亲水性轮廓的确定(Marcks，核酸研究，16：1829-1836(1988))，其被用来确定明显疏水部分(h-区)典型的前导肽序列。此外，也注明了存在/缺乏潜在的核糖体结合位点(翻译所需的Shine-Dalgarno序列)。

2.所有推定的表面蛋白质序列用于研究OWL序列数据库，其包括GENBANK与SWISSPROT数据库的翻译。这使得可以鉴别类似序列，这些序列以前不仅在序列水平上而且在功能水平上确定了特征。它也可以提供表明这些蛋白质是真的表面相关和非人工因子的信息。

3.也估价了推定的无乳链球菌表面蛋白质的新颖性。某些鉴别的蛋白质可以也可以不具有典型的前导肽序列，并且可以不显示与数据库中任何DNA/蛋白质序列的同源性。这些蛋白质确实可以表明我们的筛选方法的主要优点，即分离非典型表面-有关蛋白质，它在以前描述筛选方案中已经被错过。

现在描述三个报道载体的构建以及它们用于乳酸乳球菌从病原细菌鉴别和分离编码分泌和表面相关蛋白质的基因组DNA片段的用途。

报道载体pTREP1-nuc系列的构建

(a)表达质粒pTREP1的构建

pTREP1质粒是高拷贝数(每细胞40-80)θ-复制革兰氏阳性质粒，它pTREX质粒的衍生物，后者本身是以前所出版的pIL253质粒的衍生物。pIL253掺合了广泛的革兰氏阳性宿主pAMβ1复制子(Simon和Chopin，1988)，并且是乳酸乳球菌性-因子非移动性的。pIL253也缺乏tra功能，该功能对通过亲本质粒(由pIL50l说明)转换或有效移动是必需的。肠球菌pAMβl复制子以前已经被转移到包括链球菌、乳杆菌和芽孢杆菌以及丙酮丁醇梭菌在内的各种物种(LeBlanc等，美国国家学院论文集，7：3484-3487(1978))，表明潜在的宽范围的宿主可以利用。pTREP1质粒代表一种组成型转录载体。

pTREX载体按如下构建。通过退火2种互补的寡核苷酸，并且用Tfl DNA聚合酶延伸产生包含推定的RNA稳定化序列，翻译起始区(TIR)，插入靶基因和转录终止子的多克隆位点的人工DNA片段。促进克隆的分别在5’末端的有意和反意寡核苷酸包含NheI和BamHI的识别位点。这一片段在pUCl9NT7中被克隆在XbaI和BamHI位点之间，pUCl9NT7是pUC19的衍生物，后者包含pLETl的T7表达盒(Well等，应用细菌学杂志，74：629-636(1993))，在EcoRI和HindIII位点之间克隆。所形成的构建体被指定为pUCLEX。通过用HindIII切割和退火，在克隆进pIL253的EcoRI和SacI(退火的)位点前用EcoRI切割除去pUCLEX的完全表达盒，以产生载体pTREX(Wells和Schofield，代谢，遗传和应用的当代进展-NATO ASI系列，H 98：37-62.(1996))。推定的RINA稳定化序列和TIR来源于大肠杆菌T7噬菌体序列，在一核苷酸位点上得到修饰以增加Shine Dalgarno(SD)基元与乳酸乳球菌核糖体16s RNA的互补性(Schofield等，pers.coms.剑桥大学病理学系)。

将表现出启动子活性的乳酸乳球菌MG1363染色体DNA片段(其后指定为P7)克隆到存在于表达盒中的EcoRI和BglII之间，产生pTREX7。以前利用启动子探针载体pSB292(Waterfield等，基因165：9-15(1995))分离了这一活性启动子区。根据制造商的说明用WentDNA聚合酶由PCR扩增启动子片段。

然后按照以下构建pTREP1载体。通过退火两个重叠的部分互补合成寡核苷酸，并且根据制造商的说明用测序酶延伸产生人工DNA片段，其包含转录终止子，正向pUC测序引物，启动子多克隆位点和万用翻译终止序列。有义和反义(pTREP_F和pTREP_R)寡核苷酸在其5′末端分别包含EcoRV和BamNI的识别位点，以利于克隆进pTREX7。转录终止子是芽孢杆菌青霉素酶基因，其已经显示出在乳球菌中有效(Jos等，应用和环境微生物学50：540-542(1985))。这被认为是必需的，因为在pTREX载体中靶基因的表达被观察到是渗漏的，并且被认为是在源区中隐藏启动子活性的结果(Schofield等，pers.coms.剑桥大学病理学系)。正向pUC引物测序被包括进来，以便能够指导克隆的DNA片段的测序。在3种不同的框架中编码终止密码子的翻译终止序列被包括进来，以阻止载体基因和克隆的DNA片段之间的翻译融合。pTREX7载体首先以EcoRI消化，并且根据制造商的说明用T4 DNA聚合酶(NEB)的5’-3’聚合酶活性平端化。然后用Bgl II消化EcoRI消化和平端化的pTREX7载体，由此除去P7启动子。从退火的合成寡核苷酸衍生的人工DNA片段以EcoRV和Bam HI消化，然后克隆进EcoRI(平端化的)-Bgl II消化的pTREX7载体，以产生pTREP。然后将制定为P1的乳酸乳球菌MG1363染色体启动子在存在于pTREP表达盒的EcoRI和BglII之间，形成pTREP1。采用启动子探针载体pSB292也分离了这一启动子，并被Waterfield等，(1995)[同上]确定了特征。按照制造商的说明，采用Vent DNA聚合酶由PCR原始扩增P1启动子片段，并作为EcoRI-BglII DNA片段克隆进pTREX。通过限制性内切酶消化从pTREXI除去包含片段的EcoRI-BglII P1启动子，并且用于克隆进pTREP(Schofield，pers.coms.剑桥大学病理学系)。

(B)金黄色葡萄球菌nuc基因的PCR扩增

将金黄色葡萄球菌nuc基因的核苷酸序列(EMRL数据库接登记号V01281)用来设计PCR扩增的合成寡核苷酸引物。该引物被设计来扩增成熟形式的nuc基因(指定为nucA)，其是由指定为Snase B的分泌肽的N-末端19至21位氨基酸的蛋白水解切割产生的(Shortle，1983[同上])。设计三种有义引物(nucS1，nucS2和nucS3，在图3中显示)，每一个都在nuc基因的不同读框中具有平端化的EcoRV或SmaI的限制性核酸内切酶切割位点，另外BglII和BamHI分别在有义与-反义引物的5′末端掺入，有利于克隆进BamHI和BglII切口pTREP1。所有引物的序列在图3中给出。由PCR利用各有义结合反义引物扩增编码成熟形式的核酸酶基因(NucA)的三种nuc基因DNA片段。由PCR利用金黄色葡萄球菌基因组DNA模板，Vent DNA聚合酶(NEB)以及制造商推荐的条件扩增nuc基因片段。初始变性步骤在93℃下进行2分钟，接着进行93℃下的45秒的30个循环，50℃下退火45秒，73℃下延伸1分钟，然后进行73℃下步骤最后5分钟。利用Wizard清洁柱(Promega)纯化PCR扩增产物，除去未掺入的核苷酸和引物。

(C)pTREP1-nuc载体的构建

利用标准的条件以Bgl II和BamHI消化b部分描述的纯化的nuc基因片段，并且连接BamHI和BglII切口，脱磷酸化的pTREP1，以产生pTRBP1-nucl，pTREP1-nuc2，以及pTREP1-nuc3系列报道载体。这些载体在图4中描述。利用制造商供给的试剂与缓冲液或利用标准的技术(Sambrook和Maniatis，分子扩增：实验室手册。冷泉港实验室出版社：冷泉港(1989))实施一般的分子生物学技术。在每一种pTREP1-nuc载体中，表达盒包含转录终止子，乳球菌属启动子P1，唯一克隆位点(BglII，EcoRV或SmaI)，其后为成熟形式的nuc基因和第二转录终止子。注意翻译和分泌nuc基因所需的序列在这一构建体中故意被排除。这一元件仅可以由适当消化的外源DNA片段(代表靶细菌)提供，该片段可被克隆到就存在于nuc基因上游的唯一限制酶切位点。

(D)在B组链球菌中筛选分泌蛋白质

用限制性内切酶Tru9I消化从B组链球菌(无乳链球菌)分离的基因组DNA。使用识别5′-TTAA-3′的这种酶，因为它有效地切割富含A/T的染色体组，并且可以随机产生在优选大小范围内的(通常平均为0.5-1.0kb)的基因组DNA片段。这一大小范围是优选的，因为存在这样一种增加的可能性：P1启动子可以用于转录一种新的基因序列。然而，在所有情况下，P1启动子可以是不必要的，因为可能许多链球菌启动子在乳酸乳球菌中被识别。从无乳链球菌基因组DNA的部分Tru9I消化物纯化不同大小范围的DNA片段。因为Tru 91限制性内切酶产生错开的末端，在连接到EcoRV或SmaI切口pTREP1-nuc载体之前，DNA片段不得不平端化。这通过利用克列诺酶的5′-3′聚合酶活性在酶反应中部分填充来实现。简言之，将Tru9I消化的DNA溶解在一种溶液中(一般总共在10-20微升之间)，该溶液补充有T4 DNA连接酶缓冲液的补充(New England Biolabs；NEB)(1X)和33μM各种所需的dNTPs(在这种情况下是dATP和dTTP)。添加克列诺酶(每1微克DNA1单位的克列诺酶(NEB))，反应液在25℃下温育15分钟。通过在75℃下温育20分钟终止反应。添加EcoRV或SmaI消化的pTREP-nuc质粒DNA(通常添加200-400毫微克)。向混合物添加400单位的T4 DNA连接酶(NEB)和T4 DNA连接酶缓冲液(1X)，在16℃下温育过夜。连接混合直接在100％乙醇和1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)中沉淀，并用于转化乳酸乳球菌MG1363(Gasson，细菌学杂志154：1-9(1983))。此外，pTREP-nuc载体的基因克隆位点也含有BglII位点，其可以用于克隆，例如Sau3AI消化的基因组DNA片段。

将乳酸乳球菌转化体菌落在脑心浸液琼脂上培养，由甲苯胺蓝-DNA-琼脂覆层(0.05M Tris pH值9.0，每升10克琼脂，每升10克NaCl，0.1mMCaCl₂，0.03％wt/vol。鲑精DNA和90mg甲苯胺蓝的O染料)检测分泌核酸酶(Nuc⁺)克隆(实质上如Shortle，1983[同上]，和Le Loir等，1994[同上]所描述的)。然后将平板在37℃下温育2小时。分泌核酸酶的克隆出现一容易辨认的粉红环。从Nuc⁺重组体乳酸乳球菌克隆分离质粒DNA，采用图3中所描述的NucSeq测序引物(其通过DNA插入物直接测序)在单链上测序DNA插入物。

虽然以上描述的例子特别针对相关的B组链球菌，但本领域技术人员会清楚，相同的筛选技术可以用来在其它革兰氏阳性细菌，例如肺炎链球菌中检测输出和分泌蛋白质。

实施例2：在DNA接种实验中，筛选B组链球菌来源的基因。

pcDNA3.1+作为DNA疫苗的载体

市售的pcDNA3.1+质粒(Invitrogen)，此后称作pcDNA3.1，在所有涉及用LIFEP系统衍生的基因靶的DNA免疫实验中用作载体。pcDNA 3.1设计得在哺乳动物细胞中高度稳定和瞬时表达，并且被广泛地成功地用作宿主载体在DNA接种实验中从各种微生物致病体试验候选基因(Zhang等，1997；Kurar和Splitter，1997：Anderson等，1996)。

该载体具有若干克隆位点，它有利于克隆人巨细胞病毒(CMV)的立即早期启动子/增强子(其使得可以有效，高水平地在各种哺乳动物细胞和细胞类型，包括肌肉和免疫细胞中表达靶基因)下游的多基因靶。这对最佳免疫应答来说重要，因为这种细胞类型在体内产生保护性应答中最重要，这一点仍然是未知的。所说的质粒也包含ColEI复制起点，它使得可以在大肠杆菌中方便的高拷贝数复制和生长，并用于在大肠杆菌中选择氨苄青霉素抗性基因(Blactamase)。此外，pcDNA 3.1具有MCS上游的T7启动子/引导位点，其使得可以在有义方向体外转录克隆的基因。

DNA疫苗的制备

寡核苷酸引物设计来用于每一个利用LEEP系统获得的兴趣基因。前面检测每一个基因，并且如有可能，设计这样的引物，以便它们靶向被认为仅编码蛋白质的成熟部分之基因的部分(附录I)。人们希望表达仅编码蛋白质成熟部分的那些序列，在哺乳动物细胞中表达时有利于它的正确折叠。例如，在大多数情况下，设计这样的引物，以便推定的N-末端信号肽序列不被包含在将要克隆进pcDNA3.1表达载体的最终扩增产物中。信号肽指导多肽前体经由蛋白质输出途径到达细胞膜，此时它通常被信号肽酶I(或信号肽酶II，脂蛋白时)切割。因此，信号肽酶不构成成熟蛋白质的任何部分，不论其显示在细菌表面或被分泌。在N-末端前导肽序列不是十分明显时，设计靶向克隆并最终在pcDNA3.1中表达的全基因序列。

所有正向和反向寡核苷酸引物都掺入了有利于克隆进pcDNA3.1MCS区的适当的限制性内切酶位点。正向引物也设计得包括保守的Kozak核苷酸序列5′-ghccacc-3′，其就在具有靶基因插入物的读框中的′atg′翻译起始密码子的上游。Kozak序列有利于启动序列由真核核蛋白体识别。典型地，掺入BamHI限制性内切酶的正向引物将由序列5′-cgggatccgccaccatg-3′开始，接着是同源于被扩增的基因的部分5′末端的序列。所有反向引物都掺入了NotI限制性内切酶位点序列5′-ttgcggccgc-3′。所有基因-特异性正向和反向引物用合适的解链温度设计以便有利于它们的扩增。

采用由制造商推荐的条件利用Vent DNA聚合酶(NEB)或rTth DNA聚合酶(PE应用生物系统)，由PCR从无乳链球菌基因组DNA模板扩增所有基因靶。典型的扩增条件包括：初始变性步骤在95℃下进行2分钟，接着进行95℃下的30秒的35个循环，合适的解链温度下退火30秒，72℃下延伸1分钟(被扩增DNA的每1千个碱基1分钟)，然后进行72℃下最后10分钟的延伸。所有PCR扩增产物以苯酚氯仿提取一次(2∶1∶1)，以氯仿提取一次(1∶1)，以乙醇沉淀。

利用QlAquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶分离特异性DNA片段。适当的限制酶消化纯化的扩增基因DNA片段，并以大肠杆菌为宿主克隆进pcDNA3.1质粒载体。成功的基因克隆和维持通过限制性酶切图确认和DNA测序证实。利用质粒Mega试剂盒(Qiagen)大规模被分离重组体质粒DNA(大于1.5mg)。

发明人决定在至少一个DNA免疫实验中包括作为阳性对照的无乳链球菌rib基因。

以便以便在的种考验中包含作为正控制。针对rib蛋白质的兔抗血清(Stalhammar-Carleman等，1993)和高度纯化rib蛋白质本身的制剂(Larsson等，1999；在的Larsson等，1996)已显示出给出针对表达所述抗原的菌株的致死感染的保护作用。

所有血清型III菌株显示表达rib抗原，同时在实验室完成的Southern印迹分析已确认无乳链球菌血清型III(菌株97/0099)确实包含rib基因，因此作为DNA疫苗一部分的rib基因将代表所有DNA免疫实验的潜在正对照。寡核苷酸引物设计得(附录I)仅靶向rib基因的成熟部分，其包含克隆进pcDNA3.1的限制性内切酶位点。利用由制造商推荐的条件用rTth DNA聚合酶(FE应用生物系统)扩增rib。克隆条件类似于以前描述的那些。

无乳链球菌标准接种物的制备

菌株证实

无乳链球菌血清型III(菌株97/0099)是来源于患有脑膜炎的一个新生儿的脑部脊髓液的最近的临床分离物。B组链球菌的这一溶血菌株在呼吸和全身感染实验室，PHLS中央公共卫生实验室(61 CollindaleAvenue，London NW9 5HT)进行了流行病学试验和证实。菌株在它到达实验室之前仅继代培养两次。在其到达琼脂斜面上后，4-5块菌落立即用来接种Todd Hewitt/5％马血培养基，静态过夜培养。然后，将这一过夜培养的0.5毫升试样用于制备细菌的20％甘油保藏物，用于在-70℃下长期保藏。甘油保藏物在Todd Hewitt/5％马血培养基琼脂平板上划线培养证实其生存力。

B组链球菌的体内通过

无乳链球菌血清型III(菌株97/0099)冻结培养物(在菌株证实部分描述的)在Todd Hewitt/5％马血培养基琼脂平板上划线培养成单菌落(在37℃下过夜培养)。4-5块菌落用来接种Todd Hewitt/5％马血培养基，再过夜培养。将这一过夜培养的0.5ml试样用来接种50ml ToddHewitt培养基(1∶100稀释)，在37℃下培养。制备10倍系列稀释的过夜培养物(由于这一菌株的毒力是未知的)，将每一种重复在CBA/ca小鼠中腹膜内通过(IP)。在用于通过的各种接种物上进行活菌计数。小鼠组用范围在10⁸至10⁴菌落形成单位(cfu)的各种浓度的病原体激发。将发生症状的小鼠末期麻醉，并进行心脏穿刺(仅以最高剂量，即1×10⁸cfu激发，发生症状的小鼠)。重新得到未凝结的血液直接用于接种50ml血清培养基(Todd Hewitt/20％灭活的胎牛血清)。经常监测培养物，使其生长至后对数期。在培养基中血的出现用OD600读数监测，由于随着细菌的生长，胞溶日益增长，因此需要经常监测培养物。一旦培养达到后对数期/早平稳期，就将培养物转移到一根新鲜的50ml管中，以排除死亡的细菌细胞和余下的血液细胞，其将在管子底部沉淀。然后将0.5ml试样转移到无菌冷冻管中，在液氮中冻结，并且在在-70℃保藏。在单一标准接种物小份上进行活菌计数，以确定细菌数量。其被确定为大约每ml 5×10⁸cfu。

B组链球菌标准接种物的腹膜激发和毒力试验

为了确定标准接种物对用于疫苗试验中具有适当的毒性，利用一个剂量范围进行激发。冷冻的标准的接种物菌株试样在室温下解冻。从活菌计数数据已经知道标准接种物每ml的cfu数量。最初，已经用Todd Hewitt培养基制备了系列稀释的标准接种物，小鼠用剂量范围在500μl体积Todd Hewitt培养基中1×10⁸至1×10⁴cfu腹膜内激发。比较不同的剂量细菌注射的小鼠组的生存时间。测得标准接种物是适当毒性的，对进一步的疫苗试验，1×10⁶cfu被认为接近最佳。通过用剂量范围在5×10⁵至5×10⁶cfu之间激发的比较进行进一步的优化。最佳剂量估计为约2.5×10⁶cfu。这代表100％致死量，并且但用集中在一个窄的时间范围内的存活时间测定时，最终重复一致，通过所有这些实验，经常监测激发小鼠，以便澄清症状，症状发生阶段以及计算生存时间。

疫苗试验

通过将DNA施用至6周龄CBA/ca小鼠(Harlan，英国)完成在小鼠中的疫苗试验。将待接种的小鼠分成六个组，每组用重组pcDNA3.1质粒DNA免疫，所说的DNA含有用LEEP系统获得的特异性目标-基因序列。总共100微升在Dulbecco’s PBS(Sigma)中的DNA肌内注射进两条后腿的胫骨前面的肌肉。四周后利用相同量的DNA重复这一方法。为了比较，在所有疫苗试验中包含对照小鼠组。这些对照组既不是DNA-接种的，也不仅是非重组pcDNA3.1质粒DNA免疫的，用以上所描述的相同的时程。在第二次免疫后的四周，所有小鼠组用致死量的无乳链球菌血清型III(菌株97/0099)腹膜内激发。所施用的细菌的实际数量通过在Todd-Hewitt/5％血琼脂平板上的系列稀释接种物测定。所有小鼠在感染后3或4天处死。在感染过程中，监测激发小鼠与无乳链球菌诱导的疾病出现相关的症状的产生。在适当秩序中的典型症状包括竖毛，逐渐耸肩，流泪，增加嗜眠，不爱动，这常是较低身体部位/后腿区明显瘫痪的结果。后面的症状通常符合垂死状态的出现，剔出在此阶段的动物，以阻止进一步患病。这些小鼠被认为十分接近死亡，剔出时间用来确定统计分析的存活时间。在发现小鼠死亡时，通过平均时间计算，此时在发现某些小鼠死亡时观察到特定小鼠存活，以便确定更准确的死亡时间。

结果的解释

对任何克隆和用于以上描述的激发实验的DNA序列获得一种阳性结果，并且给出针对那种激发的保护作用。如果符合以下条件，则DNA序列被确定为保护性的。

-用Mann-Whitney U试验测定时，DNA序列给出统计学上显著性保护作用(95％置信水平(P大于0.05))。

-用Mann-Whitney法，DNA序列为边缘状态或者是非显著性的，但显示某些保护性特征，例如，当与对照小鼠比较时，一个或多个小鼠可以存活更长的时间。此外，当与对照组的小鼠比较时，第一次死亡的时间也可以延长。

当澄清某些结果可以由与DNA疫苗的施用相关的问题影响时，边缘状态或者是非显著性的结果被认为是潜在阳性的是可以接受的。确实，许多不同的存活时间可以反映给定组的不同成员之间的不同免疫应答水平。

结果

存活时间的统计学分析-LEEP DNA免疫和GBS激发试验1(图4a)

	平均存活时间(小时)
						pcDNA3.1	17(ID-8)	18(ID-9)	20(ID-25)	rib
	1	26.833	14.916	27.750	30.500						88.666
2						42.333	94.000(T)	34.333	33.333	28.166
	3	47.916	45.166	41.083	34.083						37.250
4						28.333	30.750	47.083	23.500	37.250
	5	42.333	74.666	94.000(T)	94.000(T)						94.000(T)
6						25.333	25.000	26.166	30.500	45.750
	平均值	37.549	51.899	48.849	43.083						57.066
sd						9.3943	32.214	26.257	28.768	31.556
	p值1		0.4049	0.4049	0.5000						0.1481
p值2						＞39.0	＞39.0	＞39.0	＞39.0

(T)在实验结束时终止但显示出感染症状。

p值1指当与pcDNA3.1对照比较时，统计学上显著。

p值1指当与rib阳性对照比较时，统计学上显著。

所有DNA疫苗显示出与开始用作阳性对照的rib DNA疫苗相似的保护模式。17(ID-8)

当与未接种的组比较时，用17(ID-8)DNA疫苗免疫的小鼠不显示出明显更长的存活时间。然而，有两只例外，其中一只小鼠尽管出现症状但在整个实验期间存活。该组也表现出更宽范围的存活时间，这一点由高于未接种的对照组所显示的14个小时反映出来。18(ID-9)

当与未接种的组比较时，用18(ID-9)DNA疫苗免疫的小鼠不显示出明显更长的存活时间。然而，有一只例外，其尽管出现症状但在整个实验期间存活。20(ID-25)

当与未接种的组比较时，用20(ID-25)DNA疫苗免疫的小鼠不显示出明显更长的存活时间。然而，有一只例外，其尽管出现症状但在整个实验期间存活。

存活时间的统计学分析-LEEP DNA免疫和GBS激发试验2(图4b)

	平均存活时间(小时)
					pcDNA	UnVacc	22(ID-10)	28(ID-13)
	1	45.00	27.916	44.666					72.000(T)
2					37.333	45.083	51.416	33.000
	3	37.333	37.583	40.791					36.083
4					35.291	24.583	44.666	72.000(T)
	5	24.333	37.583	36.916					49.166
6					45.000	33.166	57.833	36.083
	平均值	38.858	34.549	43.691					52.449
sd					7.4342	8.2567	5.3825	18.850
	p值1		＞39.0	0.1137					0.2340
p值2					0.4679		0.0323	0.1137

(T)在实验结束时终止但显示出感染症状。

p值1指当与pcDNA3.1对照比较时，统计学上显著。

p值2指当与未接种的对照比较时，统计学上显著。

由pcDNA3.1和未接种的对照组表现出的存活时间没有任何显著性差异。这由35.858小时(pcDNA3.1)和34.166小时(未接种的)这些非常类似的存活时间所证实。22(ID-10)

当与未接种的对照组比较时，用22(ID-10)DNA疫苗免疫的小鼠显示出明显更长的存活时间，但与pcDNA3.1对照组比较时，不是如此。此外，当与pcDNA3.1和未接种的对照组比较时，在这一组中的第一次死亡时间延长约12个小时。43.691小时的平均存活时间也被认为高于由两个对照组所测得的。28(ID-13)

当与pcDNA3.1和未接种的对照组比较时，用28(ID-13)DNA疫苗免疫的小鼠不显示出明显更长的存活时间。然而，有三只例外，其中两只小鼠尽管出现症状但在整个实验期间存活。此外，当与pcDNA3.1和未接种的对照组比较时，在这一组中的第一次死亡时间延长约9个小时。52.449小时的平均存活时间也被认为高于由两个对照组所测得的，并说明宽范围的存活时间。

存活时间的统计学分析-LEEP DNA免疫和GBS激发试验3(图4c)

	平均存活时间(小时)
						UnVacc.	70(ID-42)	94(ID-48)	86(ID-47)	51(ID-37)
	1	27.583	25.166	34.666	32.146						43.749
2						27.583	42.666	49.500	32.146	38.333
	3	24.583	34.666	27.000	42.500						50.666
4						22.250	42.666	30.500	34.500	45.166
	5	35.916	30.583	30.500	34.500						69.082
6						22.250	25.166	42.666	42.500	31.366
	平均值	27.583	35.149	34.433	35.266						49.399
sd						5.1691	7.6444	8.8495	4.1758	11.846
	p值		0.0628	0.0321	0.0153						0.0041

p值指当与未接种的对照比较时，统计学上显著。70(ID-42)

当与未接种的对照组比较时，用70(ID-42)DNA疫苗免疫的小鼠不显示出明显更长的存活时间。然而，当与未接种的对照组比较时，在这一组中的第一次死亡时间延长(约3个小时)。此外，该组具有高于未接种组约8小时的平均存活时间。94(ID-48)

当与未接种的对照组比较时，用94(ID-48)DNA疫苗免疫的小鼠显示出明显更长的存活时间。86(ID-47)

当与未接种的对照组比较时，用86(ID-47)DNA疫苗免疫的小鼠显示出明显更长的存活时间。51(ID-37)

当与未接种的对照组比较时，用51(ID-37)DNA疫苗免疫的小鼠显示出明显更长的存活时间。

存活时间的统计学分析-LEEP DNA免疫和GBS激发试验4(图4d)

	平均存活时间(小时)
			UnVacc	9(ID-6)
	1	32.666			35.250
2			21.666	30.958
	3	23.916			69.333
4			22.999	52.333
	5	25.916			44.916
6			35.916	47.083
	平均值	25.432			46.041
sd			4.3291	16.096
	p值				0.0101

(T)在实验结束时终止但显示出感染症状。

p值指当与未接种的对照比较时，统计学上显著。9(ID-9)

当与未接种的对照组比较时，用39(ID-9)DNA疫苗免疫的小鼠显示出明显更长的存活时间。

存活时间的统计学分析-LEEP DNA免疫和GBS激发试验6(图4e)

	平均存活时间(小时)
						pcDNA	UnVacc	32(ID-15)	39(ID-17)	57(40)
	1	33.541	36.000	25.041	52.333						28.333
2						36.750	29.999	30.458	44.750	32.708
	3	36.750	32.749	44.833	44.750						36.083
4						36.750	44.500	30.458	36.250	40.333
	5	29.000	28.333	64.833	36.250						72.000(T)
6						30.750	31.666	72.000(T)	28.583	33.750
	平均值	34.558	34.316	39.124	44.016						38.103
sd						3.4036	6.3921	16.140	13.833	12.986
	p值1		＞39.0	0.4043	0.1867						0.4044
p值2						0.2862		0.2873	0.0458	0.2113

(T)在实验结束时终止但显示出感染症状。

p值1指当与pcDNA3.1对照比较时，统计学上显著。

p值2指当与未接种的对照比较时，统计学上显著。

由pcDNA3.1和未接种的对照组表现出的存活时间没有任何显著性差异。这由34.558小时(pcDNA3.1)和34.316小时(未接种的)这些非常类似的存活时间所证实。32(ID-15)

当与pcDNA3.1和未接种的组比较时，用32(ID-15)DNA疫苗免疫的小鼠不显示出明显更长的存活时间。然而，32(ID-15)组有两只例外，其中一只小鼠尽管出现症状但在整个实验期间存活。该组也表现出更宽范围的存活时间。39(ID-17)

当与未接种的对照组比较时，用39(ID-17)DNA疫苗免疫的小鼠显示出明显更长的存活时间，但与pcDNA3.1对照组比较时，不明显。该组具有44.016小时的平均存活时间，高于由两个对照组所测得的。57(ID-40)

当与pcDNA3.1和未接种的组比较时，用32(ID-15)DNA疫苗免疫的小鼠不显示出明显更长的存活时间。然而，32(ID-15)组有两只例外，其中一只小鼠尽管出现症状但在整个实验期间存活。

存活数据-B组

存活时间的统计学分析-LEEP DNA免疫和GBS激发试验6(图4e)

	平均存活时间(小时)
				pcDN	UnVacc	13(ID-72)
	1	45.000	27.916				69.166
2				37.777	45.083	36.333
	3	37.333	37.583				43.916
4				35.291	24.583	32.166
	5	24.333	37.583				36.333
6				45.000	33.166	43.916
	平均值	35.858	34.549				43.582
sd				7.4342	8.2567	14.917
	p值1		＞39.0				0.4679
p值2				0.4679		0.1880

p值1指当与pcDNA3.1对照比较时，统计学上显著。

p值2指当与未接种的对照比较时，统计学上显著。

由pcDNA3.1和未接种的对照组表现出的存活时间没有任何显著性差异。这由35.858小时(pcDNA3.1)和34.166小时(未接种的)这些非常类似的存活时间所证实。13(ID-72)

当与pcDNA3.1和未接种的组比较时，用13(ID-72)DNA疫苗免疫的小鼠不显示出明显更长的存活时间。然而，有两一只例外小鼠，其存活约24小时，分别比pcDNA3.1和未接种的组中最长的存活时间更长。此外，当与pcDNA3.1和未接种的对照组比较时，在这一组中的第一次死亡时间延长。43.582小时的平均存活时间也被认为高于由两个对照组所测得的。

存活时间的统计学分析-LEEP DNA免疫和GBS激发试验3(图5b)

	平均存活时间(小时)
				UnVacc	3-60(ID-65)	3-5(ID-66)
	1	27.583	54.416				42.916
2				27.583	31.000	42.916
	3	24.583	43.000				32.874
4				22.250	34.916	42.916
	5	35.916	38.958				27.333
6				22.250	34.916	30.916
	平均值	27.583	40.458				37.791
sd				5.1691	8.9959	7.2860
	p值		0.0098				0.0215

p值指当与未接种的对照比较时，统计学上显著。3-60(ID-65)

当与未接种的组比较时，用3-60(ID-65)DNA疫苗免疫的小鼠显示出明显更长的存活时间。3-5(ID-66)

当与未接种的组比较时，用3-5(ID-66)DNA疫苗免疫的小鼠显示出明显更长的存活时间。

存活时间的统计学分析-LEEP DNA免疫和GBS激发试验4(图5c)

	平均存活时间(小时)
					UnVacc	3-40(ID-67)	3-30(ID-69)	3-38(ID-69)
	1	32.666	79.750	35.500					68.583
2					21.666	35.833	28.333	29.916
	3	23.916	30.500	31.208					29.916
4					22.999	22.708	98.000(T)	31.041
	5	25.916	28.583	73.500					32.166
6					35.916	40.791	32.333	29.916
	平均值	25.432	39.474	53.308					38.324
sd					4.3291	22.998	30.961	16.940
	p值		0.1149	0.0463					0.1132

(T)在实验结束时终止但显示出感染症状。

p值指当与未接种的对照比较时，统计学上显著。3-40(ID-67)

当与未接种的组比较时，用3-40(ID-67)DNA疫苗免疫的小鼠不显示出明显更长的存活时间。然而，有两一只例外小鼠，其存活约43小时，比未接种的组中最长的存活时间更长。3-30(ID-68)

当与未接种的组比较时，用3-30(ID-68)DNA疫苗免疫的小鼠不显示出明显更长的存活时间。3-38(ID-69)

当与未接种的组比较时，用3-38(ID-69)DNA疫苗免疫的小鼠不显示出明显更长的存活时间。然而，有两一只例外小鼠，其存活约32小时，比未接种的组中最长的存活时间更长。此外，当与未接种的对照组比较时，第一次死亡时间延长(约8个小时)。存活时间的统计学分析-LEEP DNA免疫和GBS激发试验5(图5d)

	平均存活时间(小时)
						UnVacc	141(ID-70)	3-20(ID-71)	2-19(ID-73)	3-6(ID-74)
	1	27.833	47.500	36.166	36.166						44.666
2						45.666	52.833	44.833	49.833	36.000
	3	45.666	49.333	26.750	55.833						75.416
4						34.333	46.250	36.166	68.583	36.000
	5	34.333	47.500	55.916	33.333						55.916
6						45.666	36.5010	44.833	30.583	36.000
	平均值	37.566	48.683	37.234	48.749						49.599
sd						7.8558	2.5672	8.4103	14.497	16.587
	p值		0.0101	0.5000	0.2336						0.1854

p值指当与未接种的对照比较时，统计学上显著。141(ID-70)

当与未接种的对照组比较时，用141(ID-70)DNA疫苗免疫的小鼠显示出明显更长的存活时间。3-20(ID-71)

当与未接种的对照组比较时，用3-20(ID-71)DNA疫苗免疫的小鼠不显示出明显更长的存活时间。然而，有一只例外，其存活约10小时，比未接种的组中最长的存活时间更长。2-19(ID-73)

当与未接种的对照组比较时，用2-19(ID-73)DNA疫苗免疫的小鼠不显示出明显更长的存活时间。然而，有三只例外，它们存活约4，10和23小时，比未接种的组中最长的存活时间更长。这一点由48.749小时的平均存活时间和宽范围的存活时间所反映。3-6(ID-74)

当与未接种的对照组比较时，用3-6(ID-74)DNA疫苗免疫的小鼠不显示出明显更长的存活时间。然而，有三只例外，它们存活约4，10和23小时，比未接种的组中最长的存活时间更长。这一点由49.599小时的平均存活时间和宽范围的存活时间所反映。存活时间的统计学分析-LEEP DNA免疫和GBS激发试验6(图5e)

	平均存活时间(小时)
					pcDNA3.1	UnVacc.	3-51(ID-75)	3-56(ID-76)
	1	33.541	36.000	36.333					46.583
2					36.750	29.999	30.291	29.833
	3	36.750	32.749	32.000					40.166
4					36.750	44.500	52.333	46.583
	5	29.000	28.333	72.000(T)					46.583
6					30.750	31.666	40.499	--
	平均值	34.558	34.316	44.591					40.791
sd					3.4036	6.3921	16.615	7.9070
	p值1		＞39.0	0.1876					0.0386
p值2					0.2862		0.0867	0.0587

(T)在实验结束时终止但显示出感染症状。

p值1指当与pcDNA3.1对照比较时，统计学上显著。

p值2指当与未接种的对照比较时，统计学上显著。由pcDNA3.1和未接种的对照组表现出的存活时间没有任何显著性差异。这由34.558小时(pcDNA3.1)和34.316小时(未接种的)这些非常类似的存活时间所证实。3-15(ID-75)

当与pcDNA3.1对照比较，用3-15(ID-75)DNA疫苗免疫的小鼠不显示出明显更长的存活时间。但当与未接种的对照组比较时，相当接近明显。3-15组有两只例外小鼠，其中一只小鼠尽管出现症状但在整个实验期间存活。44.499小时的平均存活时间也被认为高于由两个对照组所测得的，该组也显示出非常宽范围的存活时间。3-56(ID-76)

当与pcDNA3.1对照比较，用3-56(ID-76)DNA疫苗免疫的小鼠显示出明显更长的存活时间。但当与未接种的对照组比较时，接近不明显。

实施例3：B组链球菌不同分离物中候选疫苗抗原基因的保守性和变异性

进行起始Southern印迹分析，以利用LEEP系统测定新的B组链球菌基因分离物的交叉血清型保守性。分析靶基因血清型分布也确定它们在疫苗GBS中作为疫苗组分的潜在用途。DNA被作为这一研究的一部分分析的B组链球菌菌株在附录II中列出。作为Southern印迹分析DNA探针的特异性目标基因的扩增和标记

为用LEEP系统得到的每一个目的基因设计寡核苷酸引物。引物设计得靶向所研究的整个基因(所有引物在附录III中列出)。根据制造商的说明利用Vent DNA聚合酶(NEB)由PCR扩增特异性基因靶。典型的反应在包含GBS模板DNA，十分之一体积的酶反应缓冲液，1μM各引物，250μM各dNTP，2单位的Vent DNA聚合酶的100μl体积中进行。典型的反应包括变性步骤在95℃下进行2分钟，接着进行95℃下的30秒的35个循环，合适的解链温度下退火30秒，72℃下延伸1分钟(被扩增DNA的每1千个碱基1分钟)。退火温度由两个寡核苷酸引物的低解链温度确定。然后进行72℃下最后10分钟的延伸。

所有PCR扩增产物以苯酚氯仿提取一次(2∶1∶1)以氯仿提取一次(1∶1)，以乙醇沉淀。利用QlAquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶分离特异性DNA片段。为用作探针，将纯化的扩增基因DNA片段以根据制造商的说明用DIG核酸标记试剂盒(BoehringerMannheim)digoxygenin标记。B组链球菌基因组DNA的Southern印迹杂交分析

基因组DNA以前已经从所有B组链球菌菌株(其已经分析了LEEP-来源的基因靶的保守性)分离。根据制造商说明，用Hin DIII，Eco RI或Bgl II限制性核酸内切酶(NEB)消化适当的DNA浓度，并经琼脂糖凝胶电泳分析。在DNA样品的琼脂糖凝胶电泳后，将凝胶在0.25M HCl中变性20分钟，把DNA转移到Hybond ^TMN⁺膜(Amersham)上，过夜毛细管印迹。方法基本上按在Sambrook等(1989)中描述的，用Whatman 3MM芯，在置于0.4M NaOH贮液槽之上的平台上进行。在转移之后，滤膜用2x SSC简短冲洗，并于4℃贮存在Saran包(Dow化学公司)中。

采用Boehringer Mannheim推荐的条件(当利用他们的DIG核酸检测试剂盒时)使滤膜与地高辛配基标记的DNA预杂交，杂交和洗涤。在杂交缓冲液(1％W/V供给阻断试剂，5x SSC，0.1％V/V N-月桂基肌氨酸，0.02％V/V十二烷基硫酸钠[SDS])中，使滤膜在68℃下杂交一小时。在添加到杂交缓冲液中之前，地高辛配基标记的DNA探针在99.90℃变性10分钟。使杂交在Hybaid小型-杂交烘箱中旋转的的Hybaid管中过夜进行。通过在室温下以2x SSC-0.1％SDS洗涤滤膜5分钟两次，除去未结合的探针。为增加严格性，将滤膜在68℃以0.1xSSC-0.l％SDS洗涤15分钟两次。使用DIG核酸检测试剂盒(BoehringerMannheim)免疫学检测特异性结合的地高辛配基标记DNA探针。Southern印迹分析结果

在表1中在道顺序后列出了所有基因组消化物和它们相应的Southern印迹。

表1

道	1	2	3	4	5	6	7
								菌株	1kb分子量标记	515	A909	SB35	H36B	18RS21	1954/92
血清型	Ia	Ia	Ib	Ib	II	II

道	8	9	10	11	12	13	14
								菌株	118/158	97/0057	BM110	BS30	M718	97/0099	3139
血清型	II	II	III	III	III	III	IV

道	15	16	17	18	19	20
							菌株	1169-NT	GBS6	7271	JM9	A组链球菌	肺炎链球菌
血清型	V	VI	VII	VIII	-	14

为了比较的目的，决定进行编码一只保护性免疫原Rib的GBS rib基因的血清型分布分析，rib以前已显示存在于血清型III和血清型II的一些菌株上，但不是在血清型Ia或Ib(Stalhammar-Carlemalm等，1993)上。这一模式的证实将不仅在尔后结果的解释中给出增加的信心，而且也将确定rib基因同源染色体是否存在于这里所已经的余下的GBS血清型中。设计来用于扩增rib和将其后续克隆进pcDNA3.1的引物(附录I)被用于产生Southern印迹分析的rib基因探针。Southern印迹分析-rib(图6)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

以Hin DIII(NEB)完全消化各菌株的基因组DNA，在0.8％琼脂糖中40伏下电泳6小时，通过Sourhern印迹转移到Hybond N⁺膜(Amersham)上，与地高辛配基标记的rib基因探针杂交。用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer Mannheim)鉴别特异性结合的DNA探针。评价

在图7中描述的Southern印迹分析表明所有GBS血清型中rib基因不是保守的。在所有血清型Ia和Ib菌株(道2至5)以及血清型II的118/158和97/0057(道8至9)中rib表现出不存在。然而，rib表现出存在于血清型II的菌株18RS21和1954/92(道6至7)和血清型III的所有菌株(道10至13)中。这符合以前出版的数据(Stalhammar-Carlemalm等，1993)。rib也表现出存在于代表血清型VII和VII(道17和18)的菌株中，但在代表血清型IV、V和V(道14至16)的菌株以及对照菌株(道19和20)中不存在。rib基因探针确实以低强度与代表血清型Ia，Ib，IV，VI，VII的菌株和血清型II菌株118/158和97/0057的基因组DNA片段杂交。这可以表明这些菌株存在与rib同源性低的基因。这些杂交DNA片段可以包含编码钙蛋白质抗原的GBSbca基因的同源染色体，所说的抗原已经显示出密切同源于rib蛋白质(Wastfelt等，1996)。如果情况如此，这将符合以前显示所有血清型Ia，Ib，II和III菌株对两种蛋白质之一阳性的(Stalhammar-Carlemalm等，1993)的工作。然而，在不同GBS血清型中rib基因明显可变的分布，使得对于用作针对所有血清型交叉保护性的GBS疫苗而言不是理想的候选者。Southern印迹分析-4(ID-1)(图7)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

以Hin DIII(NEB)完全消化各菌株的基因组DNA，在0.8％琼脂糖中40伏下电泳6小时，通过Sourhern印迹转移到Hybond N⁺膜(Amersham)上，与地高辛配基标记的4(ID-1)基因探针杂交。用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer Mannheim)鉴别特异性结合的DNA探针。

评价

图7中所描述的Southern印迹分析表明在所有GBS血清型中4(ID-1)是保守的。基因探针特异性地杂交到所有GBS代表物DNA消化物中约3.5kb的Hin DIII消化的基因组DNA片段上，但是在两个对照菌株(道19和20)中不存在。Southern印迹分析-5(ID-2)(图8)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

以Eco RI(NEB)完全消化各菌株的基因组DNA，在0.8％琼脂糖中40伏下电泳6小时，通过Sourhern印迹转移到Hybond N⁺膜(Amersham)上，与地高辛配基标记的5(ID-2)基因探针杂交。用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer Mannheim)鉴别特异性结合的DNA探针。

评价

图7中所描述的Southern印迹分析表明在所有GBS血清型中4(ID-1)是保守的。基因探针特异性地杂交到所有GBS代表物DNA消化物中约6.2kb的Eco RI消化的基因组DNA片段上，但是在两个对照菌株(道19和20)中不存在。Southern印迹分析-15(ID-7)(图9)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

以Eco RI(NEB)完全消化各菌株的基因组DNA，在0.8％琼脂糖中40伏下电泳6小时，通过Sourhern印迹转移到Hybond N⁺膜(Amersham)上，与地高辛配基标记的15(ID-7)基因探针杂交。用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer Mannheim)鉴别特异性结合的DNA探针。

评价

图7中所描述的Southern印迹分析表明在所有GBS血清型中15(ID-7)是保守的。基因探针特异性地杂交到所有GBS代表物DNA消化物中约6.2kb的Eco RI消化的基因组DNA片段上，但是在两个对照菌株(道19和20)中不存在.基因探针与范围在约3.5kb到约5.2kb的Eco RI-消化的DNA片段杂交。Southern印迹分析-17(ID-8)(图10)图51 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

以Hin DIII(NEB)完全消化各菌株的基因组DNA，在0.8％琼脂糖中40伏下电泳6小时，通过Sourhern印迹转移到Hybond N⁺膜(Amersham)上，与地高辛配基标记的17(ID-8)基因探针杂交。用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer Mannheim)鉴别特异性结合的DNA探针。

评价

图7中所描述的Southern印迹分析表明在所有GBS血清型中17(ID-8)是保守的。基因探针特异性地杂交到所有GBS代表物DNA消化物中约2.3kb的Hin DIII消化的基因组DNA片段上，但是在两个对照菌株(道19和20)中不存在。Southern印迹分析-22(ID-10)(图11)图61 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

以Bgl II(NEB)完全消化各菌株的基因组DNA，在0.8％琼脂糖中40伏下电泳6小时，通过Sourhern印迹转移到Hybond N⁺膜(Amersham)上，与地高辛配基标记的22(ID-10)基因探针杂交。用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer Mannheim)鉴别特异性结合的DNA探针。

评价

图7中所描述的Southern印迹分析表明在所有GBS血清型中22(ID-10)是保守的。基因探针特异性地杂交到所有GBS代表物(除了血清型Ib菌株H36B外)DNA消化物中约3.1kb的Bgl II消化的基因组DNA片段上，此时基因探针特异性杂交到BglII消化的基因组DNA片段上，但是在两个对照菌株(道19和20)中不存在22(ID-10)。结论

本文所描述的Southern印迹分析代表在不同GBS血清型中LEEP-来源的基因的保守水平的一个初步研究。初始结果表明基因4(ID-1)，5(ID-2)，15(ID-7)，17(ID-8)和22(ID-10)存在于所有GBS血清型中，并且代表用于GBS疫苗的潜在的候选基因。有关本专利中包含的各基因的类似分析正在进行。

附录I

ID-8(17)

正向引物

5′-cgggatccgccaccatgACCACTTCTCAAGCTGTTTTAGC-3′

反向引物

5′-ttgcggccgcACGATTATCAACAAAGTTCTG-3′

ID-9 (18)

正向引物

5′-cggatccgccaccatgGCTACTCATATTGGAAGTTACCAGC-3′

反向引物

5′-ttgcggccgcAGGGTTTATTTGTTGAAGTGTCTTG-3′

ID-10 (22)

正向引物

5′-cggatccgccaccatgTATCTATATCATTTACCAATGCCC-3′

反向引物

5′-ttgcggccgcTTTATGTATAGAAACAGCAGTCCC-3′

ID-13 (28)

正向引物

5′-cggatccgccaccatgAAAGGAAGAACAACCTATTCGTTTAG-3′

反向引物

5′-ttgcggccgcAAGAGCAAATTTTCGTATCTCCTC-3′

ID-15 (32)

正向引物

5′-cggatccgccaccATGATTGTTGGACACGGAATTG-3′

反向引物

5′-ttgcggccgcTTTTTCTTCCTCCAAAATAACACTAGC-3′

ID-17 (39)

正向引物

5′-cggatccgccaccatgGCGACTAAAGAGTTAGGTGTTAG-3′

反向引物

5′-ttgcggccgcTATAGTTTTAGTTTCAACTTGTCTAGATG-3′

ID-25 (20)

正向引物

5′-cggggatccaccatgTATACGAGTTTACAACCAAATCATG-3′

反向引物

5′-ttgcggccgcGTCAGCTCGTACTGTTTTTTTAGC-3′

ID-37 (51)

正向引物

5′-cggatccgccaccatgTGTCAAATGAATAGTGAACATAAAAG-3′

反向引物

5′-′ttgcggccgcCTCAAATAATTTACCTCCAATTCG-3′

ID-40 (51)

正向引物

5′-cggatccgccaccatgGCTCCATTCGAATTTAAAGATTC-3′

反向引物

5′-ttgcggccgcTGATTTACCAGTTTGGAAGAGTTC-3′

ID-42 (70)

正向引物

5′-cggatccgccaccATGAATACTATTTATAATACATTGAGAACAG-3′

反向引物

5′-ttgcggccgcTTCTTTGTTCCAACTTTCTGG-3′

ID-47 (86)

正向引物

5′-cggatccgccaccATGATAGAGTGGATTCAAACACATTTAC-3′

反向引物

5′-ttgcggccgcTTTATGACTCAAGCGACGTGTTA-3′

ID-48 94

正向引物

5′-cggatccgccaccATGGAGTTAGTAATTAGAGATATTCGTAAG

反向引物

5′-ttgcggccgcCTTGTCATATTCATCTCCCTTCAAC

ID-67 (3-40)

正向引物

5′-cggatccgccaccatgGCTAGTTTTGTCATGAATCATAATGAC-3′

反向引物

5′-ttgcggccgcGTTATTTGCTCGTTGTTTAGCTAAATC-3′

ID-68 (3-30)

正向引物

5′-cggatccgccaccatgGCTCTTAGTTTTTTTATGGTTTCAGTTCAAGC-3′

反向引物

5′-ttgcggccgcGAAGGCACCGCCACCTCC-3′

ID-69 (3-38)

正向引物

5′-cggatccgccaccatgGGTGAAACCCAAGATACCAATCAAGC-3′

反向引物

5′-ttgcggccgcAACACCTGGTGGGCGTTTGG-3′

ID-70 (141)

正向引物

5′-cggatccgccaccATGGCTGGGAATCGTAATAACG-3′

反向引物

5′-ttgcggccgcAGCCGTCTCTAAAACAGGCTTG-3′

ID-71 (3-20)

正向引物

5′-cggatccgccaccatgCTTCCAACGCAGCCGCAAAAC-3′

反向引物

5′-ttgcggccgcATTTAGTGTTATTTCTCCTGTTGCATAATCC-3′

ID-72(13)

正向引物

5′-cgggatccaccatgTACACGCATATTGTTGAAAAAAG-3′

反向引物

5′-ttgcggccgcAAATAATTTCTTTTGGTTGTTTG-3′

ID-73 (2-19)

正向引物

5′-cggatccgccaccatgAGTAATCAAGAAGTTTCAGCAAGC-3′

反向引物

5′-ttgcggccgcCCATTGTGGAATATCAGCTGAAG-3′

ID-74 (3-6)

正向引物

5′-cggatccgccaccatgGTGCAGGCAGTGGTACCGCT-3′

反向引物

5′-ttgcggccgcGCGCATTGTAACAAATTCCTCAG-3′

ID-75(3-51)

正向引物

5′-cgggatccaccatgGCTGCCGAGAAGGATAAAG-3′

反向引物

5′-ttgcggccgcATTATTTAGCTGCTTTTTTAATGG-3′

ID-76(3-56)

正向引物

5′-cgggatccaccatgTGTCAGGTTGTTTATGCAAGTTTTC-3′

反向引物

5′-ttgcggccgcTTTACTAATTGATAAAGAGCAACTTCG-3′

rib(对照)

正向引物

5’-ggggtaccggccaccATGGCTGAAGTAATTTCAGGAAGT-3’

反向引物

5’-cggaattccgTTAATCCTCTTTTTTTCTTAGAAACAGAT

附录II

下表是DNA用于基因保守性分析的B组链球菌的详细情况

(血清型和菌株名称)。

血清型  菌株

Ia      515

Ia      A909

Ib      SB35

Ib      H36B

II      18RS21

II      1954/92

II      118/158

II      97/0057

III     BM110

III     BS30

III     M781

III     97/0099

IV      3139

V       1169/NT

VI      GBSVI

VII     7271

VIII    JM9

为了对照目的，分析中也包括了一组A组链球菌菌株(血清型M1，

菌株NCTC8198)和肺炎链球菌(血清型14)。

附录III

ID-1(4)

正向引物

5’-atggaaaaaaatacttggaaaaaattac-3’

反向引物

5’-ctattttgttttagcgatgtctttatc-3’

ID-2 (5)

正向引物

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反向引物

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ID-6 (9)

正向引物

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反向引物

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ID-7 (15)

正向引物

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反向引物

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ID-8 (17)

正向引物

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反向引物

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ID-10 (22)

正向引物

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反向引物

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参考文献

Anderson，R.，Gao，X.-M.，Papakonstantinopoulou，A.，Roberts，M.和Dougan，G.(1996)，用编码破伤风毒素C片段之DNA免疫的小鼠的免疫应答。感染与免疫，64，3168-3173。

Kurar，E.和Splitter，G.A.(1997)，Bruce/la流产胎核糖体L7/L12基因的核酸免疫接种引起免疫应答。疫苗，15，1851-57。

Larsson，C.，Stalhammar-Carlemalm，M.，和Lindahl，G.1996，用细胞表面蛋白质rib的纯化制剂针对B组链球菌(一种包在荚膜内的细菌)的实验接种。感染与免疫64：3518-3523。

Larsson，C.，Stalhammar-Carlemalm，M.，和Lindahl，G.1999.用二价蛋白质疫苗免疫对B组链球菌实验感染的保护作用。疫苗。17：454-458.

Stalhammar-Carlemalm，M.，Stenberg，L.，和Lindahl，G.1993，蛋白质rib：一种新的B组链球菌蛋白质，该蛋白质赋予保护性免疫，并且由引起侵入性感染的大多数菌株表达：实验医学杂志.177：1593-1603。

Wastfelt，M.，Stalhammar-Carlemalm，M.，(1996)，具有非常重复结构的链球菌表面蛋白质家族的鉴别。生物化学杂志271：18892-18897。

Zhang，D.，Yang，X.，Berry，J.Shen，C.，McClarty，G.和Brunham，R.C.(1997)

用主要外膜蛋白质基因诱导的针对Chlamydia trachomatis(小鼠肺炎)感染的获得性免疫之DNA免疫接种。感染与免疫，176，1035-40。

Claims (23)

1.一种B组链球菌蛋白质，或者其片段或衍生物，所说的蛋白质具有选自图1所描述的那些序列之序列。

2.一种B组链球菌多肽或肽，或者其片段或衍生物，所说的多肽或肽具有选自图2所描述的那些序列之序列。

3.权利要求1和2中所要求的蛋白质、多肽和肽的衍生物或变体，该衍生物或变体显示出与权利要求1和2中所要求的蛋白质、多肽和肽至少50％的同源性。

4.一种核酸分子，该分子包含以下序列或者由以下序列组成：

(i)本文图1和图2所示的任何DNA序列或者它们的RNA等同物；

(ii)互补于(i)中任何序列的序列；

(iii)与(i)或(ii)中的那些序列编码相同的蛋白质或多肽的序列；

(iv)与(i)，(ii)和(iii)的那些序列的任何序列显示实质上的同源性的序列；或

(v)编码图1或图2所示核酸分子的衍生物或片段的序列。

5.一种载体，该载体包含编码权利要求1-3所要求的任何一种或多种蛋白质，多肽，肽，它们的片段或它们的衍生物之表达的DNA。

6.如权利要求5所要求的载体，该载体还包含编码下列任何一种或多种的DNA：启动子，增强子，信号序列，前导序列，翻译起始和终止信号，DNA稳定性控制区，或融合配体。

7.权利要求5和6所要求的载体在转化或转染原核或真核宿主中的用途。

8.适于权利要求5和6所要求的载体转化的宿主细胞。

9.一种抗体，亲和抗体，或其衍生物，它们结合到权利要求1到3之任一所要求的蛋白质，多肽，肽，它们的片段或它们的衍生物上。

10.一种免疫原性组合物，该组合物包含权利要求1到3之任一或权利要求4所要求的蛋白质，多肽，肽，它们的片段或它们的衍生物，或者核酸序列。

11.如权利要求10所要求的免疫原性组合物，其是一种疫苗。

12.权利要求10所要求的免疫原性组合物在制备治疗或预防B组链球菌感染之药物上的用途。

13.一种检测B组链球菌的方法，该方法包括使待试样品与本文所描述的至少一种抗体，亲和抗体，或其衍生物接触的步骤。

14.一种检测B组链球菌的方法，该方法包括使待试样品与本文所描述的至少一种蛋白质，多肽，肽，它们的片段或它们的衍生物接触的步骤。

15.一种检测B组链球菌的方法，该方法包括使待试样品与本文所描述的至少一种核酸分子接触的步骤。

16.一种用于检测B组链球菌的试剂盒，该试剂盒包含权利要求9所要求的至少一种抗体，亲和抗体，或其衍生物。

17.一种用于检测B组链球菌的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1到3所要求的至少一种蛋白质，多肽，肽，它们的片段或它们的衍生物。

18.一种用于检测B组链球菌的试剂盒，该试剂盒包含权利要求4所要求的至少一种核酸分子。

19.一种在革兰氏阳性菌中筛选编码与表面抗原相关之细菌细胞膜的DNA的方法，该方法包括以下步骤：

-将报道载体与革兰氏阳性菌的DNA组合在一起，所说的报道载体包括编码来源于葡萄球菌核酸酶基因之成熟序列的核苷酸序列和上游启动子区；

-将所形成的载体转化进乳酸乳球菌细胞；

-检测葡萄球菌核酸酶蛋白在转化细胞中的分泌。

20.如权利要求19所要求的方法，其中所说的报道载体是一种图4所示的pTREP 1-nuc载体。

21.如权利要求19或20所要求的方法，其中所说的革兰氏阳性菌是B组链球菌，肺炎链球菌，金黄色葡萄球菌或致病性A组链球菌。

22.图4所示的载体用于在革兰氏阳性菌中筛选编码细菌细胞膜相关或分泌抗原之DNA。

23.一种确定权利要求1到3所要求的蛋白质，多肽，肽，它们的片段或它们的衍生物是否代表潜在的抗微生物靶的方法，该方法包括灭活所说的蛋白质，并且确定B组链球菌是否仍然能生存。

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