CN1018845B - 病毒疫苗 - Google Patents

病毒疫苗

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Abstract

提供一种病毒疫苗，包含缺乏野生型病毒抗原的功能适当残缺的病毒，此疫苗在血清学上区别免疫动物与感染动物中是有用的，还提供了鉴别免疫接种之动物与受感染动物的方法以及多价疫苗。

Description

本发明涉及血清学上可鉴定的病毒疫苗。本发明的疫苗可用以鉴别被有强毒力野生型病毒感染的动物和用血清学上与疫苗病毒不同的病毒接种过的动物。
假狂犬病病毒（PRV）是一种能感染世界上许多种动物的病毒。PRV感染被不同地称为传染性延髓麻痹，假狂犬病以及狂痒病（mad    itch）。已经知道它可传染猪，牛，狗，猫，羊，大鼠及水貂等动物。宿主范围很广，包括大多数哺乳类动物以及至少在实验上还包括多种鸟类。（宿主详见D.P.Gustafson，“Pseudorabies”，in    Diseases    of    Swine，5th    ed.，A.D.Leman    et    al.，eds.，（1981））。此病对大多数被感染动物是致命的。但成年猪，可能还有大鼠感染此病不会致死，因此是此病的带毒者。
猪群对PRV特别敏感。尽管成年猪感染此病后极少出现症状或死亡，但当小猪感染时则急性发病。常常于24-48小时内死亡，且常无特异的临床征象。（T.C.Jones    and    R.D.Hunt，Veterinary    Pathology，5th    ed.，Lea    &    Febiger（1983））。
已用种种技术生产PRV疫苗并在欧洲流行地区实际接种达15年以上。疫苗接种已使损失减少，但接种仍在环境中留有病毒。尚未生产出预防感染的疫苗。把接过种的动物接触强毒力病毒仍可存活，然后散发更强毒力病毒。因此接种过的动物便可以携带潜伏感染，它能再次突然发作（见D.P.Gustafson，上述文献）。
PRV的减毒活疫苗或失活疫苗在美国已有市售，并已被USDA批准 〔见C.E.Aronson，ed.，Veterinary    Pharmaceuticals    &    Biologicals，（1983）〕。
由于成年猪是PRV的带毒者，许多国家已建立检验感染动物的筛选方案。问题在于如何区别携带强毒力PRV病毒的动物和作过疫苗接种的动物。强毒力病毒与疫苗中所用的病毒在抗原特征上是相同的，故不可能在感染动物与接种过的动物间加以区别。因此，对于血清学阳性的猪的处理的一些规定，也将适用于接种过的和以前感染过PRV的猪（C.E.Aronson，上述）。
PRV是一种疱疹病毒，通常疱疹病毒是属于动物病毒中最复杂的。其基因组至少编码50种病毒特异性蛋白质，并含有150，000个以上的核苷酸。糖蛋白是疱疹病毒中免疫活性最强的蛋白质，其中在病毒粒膜以及被感染的细胞膜中发现。论述PRV糖蛋白的文献至少述及四种病毒糖蛋白（T.Ben-porat    and    A.S.Kaplan，Virology，41.pp.265-73（1970）;A.S.Kaplan    and    T.Ben-Porat，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，66，pp.799-806（1970））。
据报导，有几种疱疹病毒分泌糖蛋白，进入被感染的细胞的培养基中。单纯疱疹病毒（HSV）向培养基内释放糖蛋白C和几种修剪形式的糖蛋白D（B.Norrild    and    B.F.Vestergaard，Intervirology，11，pp.104-10（1979）;R.E.Randall，et    al.，J.Gen.Virol.，48，pp.297-310（1980））。Marek病病毒向培养基内释放相当量的病毒粒糖蛋白A（D.Van    Zaane，et    al    Virology    121，116-32页（1982）;saimiri疱疹病毒也在培养基中释放一种病毒粒子糖蛋白（R.E    Randall    and    R.W.Honess，J.Gen.Virol.，51，pp.445-49（1980））。有报导PRV释放到培养基中的一种糖蛋白并不掺入病毒颗粒（T.Ben-Porat.and    A.S.Kaplan，Virology.，41，pp.265-73（1970    T.J.Rea，et    al.，J.Virol.，54，pp.21-29（1985））。
分泌到培养基中的PRV蛋白被称为3a（T.Ben-Porat    and    A.S.Kap- lan，上述，也被称为糖蛋白X（gx）（T.J.Rea，et    al.，上述）。由PRV感染的细胞中分离到gx具有以下特征：
（1）它是PRV感染的动物细胞培养物中的主要蛋白质。
（2）它是一种糖蛋白。
（3）在SDS聚丙烯酰胺凝胶上检测其分子量约为95Kd。
（4）它是一种硫酸化的蛋白质。
（5）它溶于约1%高氯酸，以及
（6）它对标准的实验室小鼠有免疫原性。
本发明克服前述有关的问题，例如在筛选PRV感染的猪时，通过提供一种免疫学上不同于野生型病毒的PRV毒株，以区别经接种的与受感染的动物，而不必杀死试验动物。
这些抗原性差异可能是由于自疫苗病毒缺失一个或多个可测定的抗原性多肽的结果。由于这些遗传改变，使有可能基于血清学特征从免疫学上区别感染与接种过的动物，而不需杀死受试动物。
M.W.Wathen和L.K.Wathen（J.Virol.，51，pp.57-62（1984））提到一种含有突变病毒糖蛋白（gp50）的PRV以及应用抗gp50的中和单克隆抗体选择突变体的方法。Wathen和Wathen并未叙述使用这种病毒做为疫苗。此外，不能从血清学上区分被该病毒免疫的动物与受感染的动物。
T.C.Holland等（J.Virol.，45，pp.672-82（1983）提到用特异性糖蛋白单克隆抗体选出的HSV的抗原变种。选出的变种中包括两种不能表达HSV糖蛋白gc的变种Holland等也未述及或提示用这些变种作疫苗。
欧洲专利公开号0133200述及一种诊断性抗原因子与某些外源凝集素结合的PRV糖蛋白亚单位疫苗一起，用于区别PRV的带毒者与非带毒者。
欧洲专利公开号0074808提及，通过使用包括疱疹性病毒胸苷激酶基因的可选择的DNA序列，可在稳定感染的真核细胞或病毒基因组中产 生特异DNA序列的插入、缺失或取代。PRV对操作敏感的基因组是另一有关的出版物也提出类似方法〔L.E.Post    and    B.Roizman，“在大基因组中删除特异基因的通用技术;1型单纯疱疹病毒的α-基因22对生长是不必需的”，Cell，25，227-232（1981）〕。这些文件中提出的方法被用于生产本发明的PRV（见下述）。
A.J.M.Berns和A.L.J.Gielkens在欧洲专利公开号0141458中提到了PRV的缺失突变体。这些缺失不是发生在编码分泌的糖蛋白的基因内。此外，Berns既未建议也未述及使用这类突变体在血清学上区别疫苗与野生型病毒。
A.L.J.Gielkene等〔“假狂犬病病毒的野外分离株及疫苗株的基因组差异”，J.Gen.Virol.，66，pp.69-82（1985）〕报导，通过BamHI酶切图谱比较了修变的PRV活病毒疫苗株与不同PRV野生分离株的基因组。他们观察到两种类型的变异，（1）PRV基因组的TRS及IRS区衍生的片断中加入和/或缺失核苷酸序列，（2）在基因组的UL区内失去或获得BamHI酶切位点。他们推测用限制性核酸内切酶分析病毒DNA，可能提供区别PRV野生株的方法。
我们已确定了一个如同Mettenleiter等〔J.Virol.，56，pp.307-11（1985）〕报导的、目前市售的缺失糖蛋白I编码的基因的PRV疫苗，我们也证明另一市售病毒株（Bantha）缺少gp63。这些疫苗在下述本发明的某些实施例中也许是有用的。
B.Lomniczi，等〔“假狂犬病毒疫苗株的基因组缺失以及基因组的四种异构体的存在”，J.Virol.，49，pp.970-79    1984）〕报导了两种来自BarTha及Norden的市售PRV疫苗株的特性，显示它们在独特的PRV基因组短序列中0.855-0.882图谱单位之间是缺失的。这一区域位于PRV的BamHI7的片段中。这些论文任何地方都没有叙述或提到有缺乏分泌糖蛋白的PRV，一种含有这种突变体的疫苗或提出利用这种PRV突变体区 别已接种疫苗的和感染之动物的方法。
美国专利4，514，497提到PRV tk-缺失，但未提出有缺失的PRV能在血清学上区别野生型病毒感染的动物和接种疫苗的动物。
本文所说的“功能适当缺损的病毒”和该表达的变种，以及“无毒力病毒”都系指灭活的以及减毒的病毒而言。
本文中，“分泌糖蛋白”系指培养被感染细胞培养基中积累的糖蛋白。
本发明涉及一种疫苗，该疫苗包含一个至少缺失野生型病毒的可检测之抗原的功能缺损的病毒，它可供在血清学上区别接种疫苗的动物与被感染的动物。
更具体地说，本发明涉及一种假狂犬病病毒，该病毒缺少一种野生型病毒PRV血清学上可检查出的多肽。
更具体地说，本发明涉及一种缺少野生型病毒PRV之分泌糖蛋白的假狂犬病病毒。
更具体地说，本发明涉及一种缺少糖蛋白X的假狂犬病毒。
本发明还提供区别接种疫苗的动物和被感染的动物的方法，并提供一种包含上述病毒及疫苗在内的多价疫苗。
本发明涉及一种疫苗，它能从血清学上鉴别接种的和被感染的动物，而不需杀死受试动物。该疫苗包含一种缺失抗原性多肽，具体地说是缺失分泌性多肽，更具体地说是缺失分泌性糖蛋白的病毒。
我们利用重组DNA技术生产这种PRV。从一种易得的含有希望缺失的gx基因的质粒（pPRXh1，亦称pUC1129）以及另一种公众能得的质粒（pACYC184）起始，我们组建一个带有为操作方便而用克隆之gx基因的质粒（Pprxk4）。然后，从pPRXK4除去gx启动子，并将它克隆到另一个公众可得到的质粒pUC9中，以构建质粒1pPGX1。随后，我们从质粒pRB103除去HSV胸苷激酶（tk）基因，并将其插入pPGX1的一个位点上使之与gx 启动子融合，以产生质粒1pGXTK2。然后，我们从pPRXh1除去含有gx基因C-端编码区的PRV的BamHI7片段，并将它插入到pGXTK2的tk基因下游，生成一种质粒（pGXTK3），其中HSV tk基因的侧翼具有PRV gx启动子及gx基因的C-端编码区。然后，我们用tk-gx+PRV和pGXTK3（tk+gx-）共转染兔皮细胞，以通过L.E.Post及B.Roizman的方法（见下文）产生一tk+gx-PRV。最后，将tk+gx-PRV转变为tk-gx-PRV使之减毒用做疫苗。我们还证实了这种tk-gx-PRV作为抗假狂犬病疫苗的效能。
图A-K图解说明本发明的质粒的构建。为说明质粒及DNA片段采用如下的某些常规表示法：
（1）单线表示环形及线形双链DNA。
（2）星号（＊）表示该分子为环形，无星号者表示为线性分子。
（3）在线上方标出限制性核酸内切酶位点。
（4）基因示于线下方。
（5）基因与限制性酶切位点间的距离未标尺度，图上只显示其相对位置。
质粒构建所用的方法是标准的重组DNA方法，为本领域内熟练技术人员所熟知。这些方法在T.Maniatis等人的“分子克隆”〔Cold    Spring    Harbor    Laboratory    （1982）〕以及B.Perbal的“分子克隆实用指南”〔John    Wiley    &    Sons（1984）〕都有叙述，此二书被列入本文参考文献。
这里用到的许多特殊方法在L.E.Post和B.Roizman的“大基因组缺失特异基因的通法：单纯疱疹1型病毒的α基因22不是生长所必需的”，〔cell，25，pp227-32（1981）〕一文中有叙述，该文也被列为参考文献。特别是可从中找到共转染和筛选的方法。
实施例1
1.pPRXK4的构建
现在参照图A，我们叙述用于亚克隆完整gx基因之质粒的构建。
质粒pPRXh1〔也称pUC1129，得自Northern    Regional    Research    Laboratory，U.S.Department    of    Agriculture，Peoria，Illinois，其保存号为B-15772）〕含有由PRV来的gx基因及gx启动子，用限制性核酸内切酶XhoI及KpnI消化之。以产生的四个碎片段中，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离得到所产生的四个片段中第三长片段（片段1，约26Kb）。片段1用T4DNA多聚酶将末端变成齐头，并加入ECORI连接子。
用EcoRI消化载体PACYC184（得自American    Type    Culture    Collection，12301    Parklawn    Drive，Rockville，Maryland    20852，寄存号为37033）
并再用细菌碱性磷酸酶（BAP）处理，得到片段2。EcoRI切断C
Figure 86105450_IMG1
基因。
然后连接片段1和2，生成质粒pPRXK4。此质粒含有完整的gx基因，包括可能的gx启动子（见Rea等，上述文献）。
2.pPGX1的构建
现在参照图B，我们叙述gx启动子的亚克隆。被限制性核酸内切酶MstI（TGCGCA）识别的核苷酸顺序位于推测编码gx    mRNA的5′端未翻译区的DNA顺序中（Rea等，上述）。用MstI酶切pPRXK4，分离出第二大片段（片段，3，约2.1Kb）。再用EcoRI酶切片段3，分离出较小片段（片段4，约400bp）。质粒PUC9（可从Pharmacia    P/L，Inc，Piscataway.NJ，USA得到）用EcoRI及SmaI酶切断，分离到较大片段（片段5，约2.6Kb）。然后将片段4及5于EcoRI位点上连接，再行MstI/SmaI融合，生成pPGXI。此质粒含有在紧接其下游带有BamHI酶切位点的gx启动子。
3.pGXTK2的构建
现在参阅图C，我们描述一个其中gx启动子与HSV    tk基因融合的质粒的构建。
上述的pPGX1质粒用BamHI酶切，并用BAP处理，得到片段6。质粒pRB103含有来自HSV-1病毒株（L.E.Post，et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.    USA，77，pp，4201-05（1980））的BamHI  Q片段。（该构建中亦可使用质粒PHSV106，市售品来自Bethesda    Research    Laboratories，Gaithersburg，MD，USA，它也含有BamHI    Q片段）。pRB103用BamHI加上BglⅡ酶切，分离出第二大片段（片段7，约2.9Kb），此片段含有无tk启动子的HSV    tk基因。使酶切的pPGX1（片段6）与含有tk基因的片段（片段7）于BamHⅠ位点连接，并经BglⅡ/BamHⅠ融合得到两个含有tk片段方向相反的质粒。通过检测BamHⅠ加EcoRⅠ酶切图谱，筛选到带有紧接在gx启动子下游之TK基因的质粒，并称为pGXTK2。
4.pGXTK3的构建
现在参照图D，我们描述一种包含HSV    tk基因和位于其侧翼之PRV序列的质粒Z。
用BamHI消化pPRXh1（见上述1）并分离出片段8（约6.9kb）〔此片段于文献中称BmaHI7（见Rea等，上述文献）〕。pGXTK2经BamHI酶切，BAP处理，产生片段9。片段8连接到pGXTK2（片段9）的BamHⅠ位点上，最后生成的质粒含有与启动子gx方向相同的片断8称为pGXTK3，此质粒具有紧接在gx启动子下游的tk基因以替代编码gx的N-端氨基酸的DNA。
5.共转染（Co-transfection）
现在参照图E，用ClaI切断pGXTK3，这样生成的DNA片段含有gx（实际为gX-的C末端区，以及与gx启动子融合的整个HSV tk基因，连同来自PRV的tk-gx+突变体的DNA一起共转染兔皮细胞，而PRV的tk-gx+突变体（称为PRV HR）是按Tatarov〔Zentralblatt Veterinarmedizin，15，pp.847-53（1968）〕的方法，通过于碘脱氧尿苷存在下培养PRV而选择到的。
此tk+gx-病毒重组体（经适当减活后，可用做疫苗）系在生长于 HAT培养基（L.E.Post和B.Roizman，上述文献）上的tk-人143细胞（J.P.Weir，et al.，Proc.Natl.Acad，Sci.USA，79，pp.1210-14（1982）;Panicali and Paoletti，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，pp.4927-31（1982）;Campione-Piccardo，et al.，J.Virol.，31，pp.281-87（1982）;K.L.Poffenberger，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.-USA，80，pp.2690-94（1983）;M.F.Stinski，et al.，J.Virol.，55，pp.431-41（1985）〕中选择的。我们将由此生长的病毒称为PRV△gxl或DT-A。DT-A系tk-，并有杀死小鼠的能力。
用35S-蛋氨酸或14C-葡萄糖胺标记病毒蛋白，接着用抗gx血清进行免疫沉淀以分析在HAT中选择生长的病毒（例如DT-A）能否合成gx。结果未测出gx。
tk+gx-病毒感染的细胞的蛋白质，以抗gx血清经Western印迹法进行分析，在突变病毒感染的细胞中未检测出gx。
除去整个gx基因也是可能的，例如，用NarI酶解片段8，可得到一个gx基因完全缺失的片段（见图D），然后可用此片段替代片段8，以产生一种完全缺失gx基因的gx-PRV。
已知道tk-PRV是无毒力的，可制成优良疫苗，故用Tatarov方法诱变和筛选tk-PRV，使DT-A功能适当缺损以制成用作疫苗的tk-病毒（例如见G.Tatarov“假狂犬病毒在5-碘代-2-脱氧尿嘧啶核苷（IUDR）诱导下的非病原突变体”，Zentralblatt Veterinarmedizin，15，pp.847-53（1968）;G Tatarov等“MK株假狂犬病毒无害性及免疫原理的研究”，Vet.Nauhi，6，pp.49-54（1969）;G.Tatarov“活疫苗MK-25用于抗假狂犬病的结果”，Vat.Sbirka，7，pp.10-12（1974），G.Tatarov“保加利亚MK-25疫苗抗假狂犬病”，Cah，Med.Vet，43，pp.347-52（1974）;G.Tatarov等“在5-溴脱氧尿苷的影响下，假狂犬病毒的无毒突变体的发育，Veterinary Science，18，pp.3-12（1981）;V.Khristova 等“假狂犬病毒的毒力株及疫苗株的胸苷激酶活性”，Veterinary    Science，22，pp.15-22（1985））;或用类似技术（W.C.Topp，Virology，113，pp.408-11（1981）;S.Kit等，Exp.Cell  Res.，31.pp.297-312（1963）;S.Kit等，Virology，130，pp.381-89（1983）〕。
含有HSV tk基因的PRV△gx1也可通过重组过程转化为tk-PRV，即用tk+gx-PRV及一种带有gx缺失的质粒共转染兔皮细胞，除去HSV tk基因，并按照L.E.Post及B.Roizman的方法，（上述文献）用araT选择tk-重组体，该方法如下所述：
现在参照图F，质粒pPGX1经BamHⅠ酶切并用BAP处理，〔如图C，步骤（a）所述〕，产生包含gx启动子的片段6。按前述和在图D，步骤（a）所述方法，质粒pPRXh1经BamHⅠ酶切，产生包含gx的C-端编码区的片段8。此片段也称做PRV    BamHI7片段。然后把片段6和8连接一起，对大肠杆菌进行转化，再用EcoRⅠ和PvuⅡ酶解，筛选出其中BamHⅠ7片段有预期之定向的克隆。经酶切产生2.0kb片段表明定向适宜。这样产生的质粒称做P△GXB7。
使用磷酸钙转染技术（Mocarski等，Cell，22：243（1980）将质粒P△GXP7用得自PRV△gXl的病毒DNA共转染到兔皮细胞中。按Mocarski等所述的方法，把转染所得到的病毒铺敷在有100μg/mlaraT存在下的Vero细胞上。挑出个别的空斑，并按Mocarski等所述的方法，用限制性内切酶酶切DNA以分析所要的tk-重组病毒。此病毒称作PRV△GXTK-或DT-B（图G）。如下面例2所述，这些tk-PRV可以做为生产疫苗的减毒病毒。
为应用这些病毒以区别被感染动物与接种的动物，可采用ELISA测定法。例如一般可将使用DNA重组技术（Rea等上述）在大肠杆菌中所产生的gx蛋白质，加到合适的塑料板的孔中，经足够时间使之吸附在塑料上（过夜，20-25℃）。将塑料板洗涤后，加入阻断剂（例如BSA），以 中和在塑料板表面上任何未反应部位，洗涤后，再将猪血清加至孔中;于20-25℃保温约1小时后，洗孔，每孔中加入蛋白A-辣根过氧化物酶结合物，并于20-25℃保温1小时。再洗涤，向孔内加酶的底物（邻苯二胺），用酸终止反应，于492毫微米波长处测吸光度，以测定血清中gx抗体的含量。若无gx抗体，说明该动物未被感染。测试其它抗原，则能决定该动物是否接种过疫苗。
虽然PRV△GXTK-是一种有效的疫苗，但经在碘苷中生长所选择的PRV tk-突变则可能是一种点突变。假设它是一种点突变，则可以回复到tk+，而可能成为有毒力的。因此一种具有缺失的tk-PRV是更好的。美国专利4，514，497述及PRV tk-缺失，其中使用的标记挽救方法以制作tk-PRV，首先用于在单纯疱疹病毒中造成tk-缺失〔（J.R.Smiley，Nature，285∶333-35（1980）和L.E.Post等，Cell，24∶555-65（1981）〕。
现在参照图H，PRV tk-基因已绘于PRV的BamHⅠ 11片段处（T.BenPOrat等，Virology，127∶194-204（1983））。BamHI 11片段系由PRV Rice株经BamHⅠ酶解的DNA通过琼脂糖凝胶电泳而分离到的，并把它克隆到PBR322中以产生质粒PTK11。PTK11在tk基因内有一个单xhoⅠ酶切位点，用XhoⅠ切断PTK11，并用核酸外切酶Bal 31酶解不同时间，用连接酶使之重新连成环形，并对大肠杆菌DH1进行转化（Maniatis，上述文献p.505），这就产生一组有不同程度的tk基因缺失的质粒。
选用其中两个质粒，以氯化铯密度梯度离心提纯并以Maxam及Gilbert的方法Methods    in    Enzymology，65（部分1），pp.497-559（1980））测定顺序。质粒P△tk-3在tk基因中缺失329碱基对，质粒P△tk-4缺失275碱基对。
在tk缺失可被杂交到gx-病毒中以前，首先必需造成病毒tk+，这样tk-缺失重组体才能被选择出来。PRV△GXtk-DNA与质粒pTK11共转染到兔皮细胞内。分离出所产生的重组病毒，并使在培养于培养基HAT 内的143细胞中生长。所选出的tk+病毒，我们称之为PRV△gXtK+PRV。然后把此病毒的DNA与P△tK-4DNA共转染到兔皮细胞内。产生的病毒在araT存在下，放在Vero细胞上，以选择tk-重组体。通过制备DNA及限制性内切酶分析，从得到的病毒中筛选合适的重组体。这些重组体已经掺入tk缺失。其中一个病毒我们称之为PRV△gX△tK或DT-C。它包含有期望的tk缺失及一种gx缺失。我们测知DT-C对小鼠LD50大于107空斑单位，相比之下，PRV△gXPRVK+的LD50为3空斑单位。
虽然本文所述的特定实施方案是针对PRV并且是利用重组DNA技术的，但熟悉此技术者很清楚，采用其它技术以及应用其它病毒，例如Mare    K氏病病毒及传染性牛鼻气管炎病毒也能生产类似的含有分泌性糖蛋白缺损的疫苗。
虽然这里公开的主要是PRV，但所应用的技术也可用于产生血清学上不同的疱疹病毒，其在任何情况下象PRV那样，有利于区别接种疫苗的动物和被感染的动物。如包括马立克氏病病毒及传染性牛鼻气管炎病毒。
当我们将HSV    tk基因置于gx启动子的控制之下，含tk    DNA片段能被插入，从而可使其受到另一个PRV启动子或能发挥表达tk基因功能的任何其它启动子的控制。也可使用HSV启动子，例如，能在PRV-感染的细胞中表达HSVICP4启动子。
例如，可将PRVtk基因插入到能在PRV-感染的细胞中表达的gx基因中或在启动子的控制下的任何其它tk基因中。
在我们用tk基因作为插入的标记基因时，任何标记基因也都能被插入gx基因以使之失活，只要该标记基因允许从缺少该标记的病毒中选出携带它的病毒。例如，耐抗生素的抗药基因如抗G418或潮霉素基因即可用作标记基因。
除可选择的标记外，亦可插入其它基因到gx基因中。为构建这类病 毒，也可以把外源基因插入象pGXTK3这样的质粒中，以外源基因替换tk序列。然后此质粒可与图E中所述的来自tk+gx-病毒的DNA共转染。用araT选择，可得到有插入并表达的外源基因的重组病毒。这种基因能编码其他类型病毒的抗原，例如，可传播的肠胃炎病毒或猪微小病毒或编码一种细菌，例如大肠杆菌的抗原，它能产生抗其它病毒的免疫原反应。故本发明的实施例已生产出一种“多价疫苗”，它包含有两种或更多的病毒或其它病原体的抗原。
作为上述的一个例子，我们按下述方法将组织血纤维蛋白溶酶原激活因子（tPA）基因插入gx基因中：
pPSA18是含有tpA完整密码区的质粒，在编码区的5′-未翻译区具有一特异的BamHⅠ切点，它可按共同待批的美国专利申请SN758，517（申请日1985年7月26日）中所述的方法构建。参照图Ⅰ，pPSA18用BalI切断，加入BamHⅠ连接子以生成片段11。然后用BamHⅠ酶切片段11产生含有tpA的整个编码区的1.95Kb片段（片段12）。然后用BamHI酶切质粒pPGX1（图B），产生片段6。片段12和6连接生成质粒pPGXTPA。采用EcoRⅠ进行酶解测定tpAcDNA相对于gx启动子的合适定向。如定向正确则产生1.1Kb片段。
参照图J.质粒PGXTPA用HindⅢ酶切，产生片段13。PRV    DNA的BamHⅠ7片段按上述（片段8）方法分离得到，并加入HindⅢ连接子以产生片段14。把片段13及14连接在一起，生成PGXTPA-B7。BamHⅠ7片段插入此质粒的合适定向可以用EcoRI和SphⅠ酶切方法来测定。当方向正确时则产生5.8Kb片段。
把质粒PGXTPA-B7与来自PRV△GX1的病毒DNA共转染入兔皮细胞中。在araT存在下，将生成的病毒铺敷在Vero细胞上，以选择tk-重组体。我们称照此选得的一个病毒为PRV-GXTPA。当此基病毒感染细胞时，通过用抗tpA抗血清的免疫沉淀法检查细胞产生并分泌tpA。以血纤维 蛋白溶解法（Unkeless    et    al.，J.Exp.Med.，137，pp.85-111（1973）;Luskutoff    et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，3903-07（1977）测定，tpA活性为20ng/ml。
实施例2
在本例中我们叙述用PRV的胸苷激酶缺损及糖蛋白×缺失突变体（tk-gx-）进行疫苗接种，以防止小鼠及猪由PRV所引起的死亡。
1.动物
雌性CF-1小鼠，5-6周龄，得自Charles    River公司。
18只杂种猪，5-6周龄的雌和雄性，得自J.Gilmore企业公司。随机将猪置于三个房间内，每间六头猪。
对猪和小鼠饲予无药食料和水。
2.病毒及细胞
由上述亲代PRV（HR株;tk-gx+）构建PRV缺失突变体DT-A（HSVtk+gx-）及DT-B（tk-gx-）。DT-B不能合成胸苷激酶，并由于缺失gx基因所以也不能合成gx。全部保护研究中均用致病的PRV（Rice株）作为攻击病毒。病毒在vero细胞或猪肾-15（PK-15）细胞中繁殖。
3.微量中和分析法
微量中和分析系按T.C.Holland等叙述的方法（J.Vriol，45，pp672-82（1983））进行的。小鼠血清与病毒及10%兔补体于37℃保温3小时，但猪血清则与病毒在无补体存在下，于37℃保温1小时。以保护50%以上的细胞不发生细胞病理效应的血清最大稀释度的倒数表示中和滴度。
4.酶连免疫吸附分析法（ELISA）
用Voller氏缓冲液（50毫摩尔NaHCO3，0.03%NaN3，用NaOH调pH到9.6）稀释gx融合蛋白（p60-11，按1986年4月17日提交的美国共同待批专利申请号SN853087中所述方法生产的，到20微克/毫升以制备抗原稀释液。此溶液通过0.45微米无菌过滤器（Sartorius SM 165 55K）过滤。如 需要，可在使用前再用Voller氏缓冲液稀释过滤的溶液。
将100微升溶有蛋白-p60-11的Voller氏缓冲液（浓度约2微克/毫升）加到96孔培养板（Costar 3590，EIA）的各孔中。于室温下保温过夜期间发生吸附，各孔用约300微升Dulbecco氏PBS（8克/升Nacl，0.2克/升KCl，0.2克/升KH2PO4，和1.14克/升Na2HPO4;最终pH7.3-7.4）洗三次。于塑料表面未反应部位在与溶于Dulbecco氏PBS（每孔200微升）中的3%BSA于37°保温2小时期间得以中和。每孔用300微升Dulbecco氏PBS液洗一次。然后，吸附的抗原与在100微升稀血清中的抗体（由接触PRV的猪体内得到的）反应并在4℃保温过夜。未反应的抗体用Dulbecco氏PBS（300毫升/每孔）洗三次而除去。然后每孔加入100ml蛋白A-辣根过氧化物酶结合物（对小鼠血清稀释1/800，对猪血清稀释1/15，000;稀释在50毫摩尔Tris、0.05%Tween-20、1%BSA;0.02%NaN3，pH8.0中）于37°保温2小时。各孔再用Dulbecco氏PBS液洗3次（300毫升/每孔）。每孔加入100微升底物溶液，此溶液是将10毫克邻苯二胺（事先溶于0.5毫升甲醇）和25微升30%（w/v）H2O2加至49.5毫升缓冲液（17毫摩尔柠檬酸，65毫摩尔磷酸盐及0.01%硫柳汞用NaOH调节pH至6.3）配制的。酶反应于室温持续十分钟，然后每孔加入100微升4.5摩尔H2SO4。用Titartek Multiskan分光光度仪于492nm波长处测定生色团的吸光度。
5.鼻拭子的病毒分离
试验猪的鼻拭子分别置于1毫升加有3%胎牛血清（FBS）及抗生素的Eagles基本培养基（BME;M.A.生物制品）中。拭子在检查其病毒的存在前贮存于-70°下。进行病毒分离鉴定时，鼻拭子于BME中解冻，并弃去拭子。将样品（0.1毫升）接种至单层猪肾-15-细胞（Pk-15;ATCC    CCL33）上（重复两份），于37℃保温1小时，使病毒吸附。于细胞培养物上续加补充以4%FBS，抗生素，1%琼脂的培养基-199（Flow实验室）。 三天后，单层细胞用中性红染色，并计数空斑。
6.对小鼠研究的实验设计
四株PRV的毒力通过测定各病毒株在小鼠体内的半数致死量（LD50）来评定。四株PRV为：1）野生型（Rice株）、2）DT-A、3）DT-B及4）HR。每一株病毒以不同剂量给予5或6组小鼠（每组10只）。小鼠经足垫途径给予50微升相应病毒（第0天），给病毒后14天（第14天）测定其LD50值，对接受最高剂量的相应病毒的存活动物组取其血清，用Spearman-Karber法计算各株病毒的LD50值。
LD50毒力试验中存活动物于第14天再由腹腔给予十倍于LD50（由腹腔途径测定）的PRV Rice株病毒（10LD50＝5.4×102pfu/小鼠）本实验于毒株攻击后第14天（第28天）结束。
7.对猪研究的实验设计
实验猪于第0天肌肉注射2毫升DT-B株（约1.5×107pfu/猪只），按制造者的建议给2毫升Norden活疫苗（PR-Vac），或生理盐水。所有的猪均于第20天用大约40×LD50的毒力PRV（Rice株（40LD50＝1.1×105pfu/猪只）攻击。研究于第34天结束。
取得血清样品，并于第1，20及34天分别对每只猪称体重，于第19天至34天期间，每天取鼻拭子。
8.效力评定的标准
PRV DT-B株（tk-gx-）作为疫苗的效力是基于对PRV诱发的死亡率的保护作用以及从血清学上区别PRV DT-B处理的猪和暴露于野型病毒的猪的能力来评定的。
表1显示以相应LD50测定值来表示四株PRV对小鼠的相对毒力。DT-B及HR与野生型株及DT-A相比，毒力大为降低，至少低1000倍。
给予各种PRV株病毒后存活的小鼠，于第14天由腹腔用十倍于LD50（5.4×102pfu/小鼠）剂量的强毒力野生型PRV进行攻击。如表2所 示，给予1×103pfu或更高剂量的DT-B的小鼠，以及给予2.3×103pfu或更高剂量的HR能保护小鼠免受有毒力的野生型PRV的攻击。此外，对接受DT-B的小鼠，于攻击前采集的血清含有较高滴度中和抗体（中和滴度＝1024），但根据ELISA数据与gx抗原决定基的反应则不够明显，（ELISA吸光度＝0.05）。对接受HR的小鼠，于攻击前取的血清中和抗体滴度较高（中和滴度＝2048）。同时与gx抗原决定基的反应是显著的（ELISA吸光度＝0.60）。
为评价PRV    DT-B株的保护效能以及诊断意义，于第0天给猪肌肉内接种DT-B，Norden活疫苗（PR-Vac）或生理盐水，并于14天经鼻内用野生型Rice株攻击。表3所示的结果表明，在引起有意义的中和抗体反应以及对毒力型Rice株的攻击提供保护方面DT-B株与Norden活疫苗（PR-Vac）两者相类似。用gx融合蛋白所作ELISA试验的结果表明用DT-B免疫的猪不产生抗gx抗体，而曾暴露于野生型Rice株的恢复期猪血清则产生该抗体。本研究中，由给予Norden活疫苗（PR-Vac）的猪采的血清与gx抗原决定基的反应无统计学意义（P＞0.05）。但基于前面的研究，给予Norden活疫苗（PR-Vac）的猪可能产生抗gx抗体，因为Norden株具有编码gx的基因。因此，由接种Norden活疫苗（PR-Vac）的采集的血清对gx抗原决定子的反应性可以有所变化。
用DT-B及Norden活疫苗处理的猪，于攻击后偶而散发病毒，而生理盐水处理的猪，大多数都不断地散发病毒，直至死亡。在一只用DT-B处理的猪以及一只用Norden活疫苗（PR-Vac）处理的猪的鼻排泄物中未检出病毒，这些结果提示免疫的猪不像未免疫的猪那样容易散发病毒。
用DT-B处理的猪在20天时（攻击前）的平均体重与用生理盐水处理的对照猪的平均体重无明显差别（P＞0.05），这表明用DT-B免疫对猪的生长无不利影响。
这些结果表明DT-B对用毒力型PRV攻击的猪有保护作用，并可从血 清学上鉴别作过免疫接种的猪与曾暴露于毒力型PRV的恢复期猪。DT-B并不影响被处理猪的生长。此外，对小鼠的毒力学研究表明在猪以外的其他种动物中，DT-B较tk+PRV病毒株毒力低。
表1
小鼠LD50
病毒株 基因特征 LD50
Rice株 PRVtk+gX-40pfu/小鼠
DT-A HSVtk+gX-34pfu/小鼠
DT-B tk-gX-9.4×104pfu/小鼠
HR tk-gX-＞2.3×106pfu/小鼠
表2
用减弱的PRV株接种的小鼠的保护作用
病毒株    基因特征    剂量    攻击后的    中和    ELISA
（pfu/小鼠） 死亡率 滴度a吸光率b
DT-B tk-gX-1.0×1050/6 1024 0.05
1.0×1040/10
1.0×1030/10
1.0×1024/10
1.0×1017/10
1.0×1009/10
HR tk-gX+2.3×1060/10 2048 0.60
2.3×1050/10
2.3×1040/10
2.3×1030/10
2.3×1022/10
对照    -    10/10    0.00
a.中和滴度＝自存活动物用PRV    Rice株攻击前）采集的保护50%以上细胞不受致细胞病变作用的血清之最大稀释度的倒数。
b.血清所作ELISA反应的结果。吸光率值代表使用1/10稀释之血清与用于中和试验者相同。
表3
用减毒PRV    DT-B接种猪的保护作用
制剂 死亡率 几何平均滴度bELISA吸光度d的算术平均值
DT-B 0/6 91 0.072±0.016e
PR-Vac 0/6 36 0.130±0.061e
生理盐水    6/6    ＜4c    0.093±0.024
Ricea- - 0.942±0.228f
a.前一实验中，对五只存活的暴露于Rice株的恢复期猪取血。它们包括在这里以提供在ELISA中作对照用的gx反应性血清。
b.几何平均滴度系各组六只中每只动物于被攻击前所得的中和滴度的几何平均值。每个中和滴度则是保护50%以上细胞不受致细胞病变作用的最大血清稀释度的倒数值。
c.没有可检出的抗体。
d.ELISA吸光率的算术平均值系对各组六只动物的每只在被攻击前所取血清的ELISA吸光率（血清稀释至1/40）的算术平均值，最后的数值除外（见上面的注a）。
e.与生理盐水处理的猪无显著差异（P＞0.05;双尾斯氏t试验）。
f.与生理盐水处理的猪差异显著（P＜0.05;双尾斯氏t试验）。
实施例3
按照前面例2所述大致相同的方法，我们还对PRV的DT-C病毒株进行了相似实验，DT-C缺失PRV    tk基因，因而是本发明的更好的实例。这些实验的结果示于表4-8，表4及8显示DT-C在猪，羊，及小牛中毒力 降低，表5及6显示DT-C的保护能力。表7显示DT-C对猪的剂量滴定。
表4
小鼠LD50
病毒株 基因特征 LD50
Rice株 PRVtk+gX+9pfu/小鼠
DT-C tk-gX-＞1.0×107pfu/小鼠
HR tk-gX+＞1.5×107pfu/小鼠
表5
用减毒的PRV株免疫接种对小鼠的保护作用
病毒株    基因特征    剂量    攻击后的    中和    ELISA
（pfu/小鼠） 死亡率 滴度a吸光率b
DT-C tk-gX-1.0×1070/8 5120 0.051
1.0×1060/8
1.0×1050/8
1.0×1040/8
1.0×1030/8
1.0×1022/7
1.0×1017/8
HR tk-gX+1.5×1070/6 2560 0.974
1.5×1060/7
1.5×1050/8
1.5×1040/8
1.5×1030/8
1.5×1023/8
1.5×1015/8
对照    -    7/8    ＜200.000
（“a”“b”的注解见表2）
表6
用减毒的PRV    DT-C免疫接种对猪的保护作用
制剂a死亡率 几何平均滴度bELISA吸光度c的算术平均值
DT-C 0/6 26 0.072d0.388e
PR-Vac 0/6 16 0.105e0.645e
BME 3/6 ＜8 0.059d0.250e
a.接受DT-C，PR-Vac及BME的存活猪于本试验的0-35天内体重分别由8.1增至27.1，6.5增至23.0，及6.0增至11.4kg。
b.在攻击前各组六只猪的每一只所得的中和滴度的几何平均值，每个中和滴度系保护50%以上细胞不受细胞病变作用的血清最高稀释度的倒数。
c.在攻击前各组六只猪中每只所取的血清（血清1/40稀释）的ELISA吸光率的算术平均值。不同肩字的平均值与第20天的BME（Eagle基本培养基）对照值有显著不同（P＜0.05），第一个数是攻击前的，第二个数是攻击后的。
表7
DT-C对猪的剂量滴定
剂量 死亡率a几何平均
（pfu/猪） （Rice免疫后） 滴度b
1×1070/6 23
1×1060/6 25
1×1050/6 18
1×1040/6 18
1×1030/6 18
1×1020/6 20
对照    5/6    ＜4
a.于第0天时，按所示剂量每只猪肌肉注射制剂各2毫升，并于第21天用大约80×LD50（2.2×105pfu/只猪）PRVRice病毒株进行攻击。
b.见表6注b
表8
DT-C对羊和小牛的致病力
动物 接种物 途径a死亡数/受试数 阳性
（pfu/动物） 鼻拭子b
羊 4×107鼻内 1/3c0/3
4×107肌内 0/3 0/3
小牛 4×107鼻内 0/3 0/3
4×107肌内 0/3 0/3
a.鼻内或肌肉途径给予总体积为2毫升（每个鼻孔1毫升）的病毒悬液，给药后的21天内观察假狂犬病症状。
b.试验结束时每只动物取鼻粘膜拭子，照上述方法检验PRV。
c.14天时死亡一只羊，但无假狂犬病症状，也未散发病毒。此动物的可能死因是球虫病。两实验组的其它羊均诊断出此病。
本发明的另一方面，为保证gx-tk+有毒力PRV不是由理论上可能的本发明gx-tk-PRV与野生型PRV间的重组的结果，而将gx-tk-PRV进一步工程化。按照前述一般方法，在PRV gp50基因的原始座位造成缺失，将pg50基因的拷贝插入tk基因闭合连锁中或tk基因之内。为造成原始pg50基因缺失，可用片段8（见图D）的PvuⅡ/BamHI片段照前述的方法进行标记挽救试验。产生的病毒将是gx-tk-并具有与tk基因序列的残留部分紧密相连或者在残留部分内的gp基因的拷贝。由于gp50对病毒的活力是必要的，重组所得的任何gx-病毒也将是gp50-并且是无活力的。因此，不可能用重组法使gx-和tk-分开以产生强毒力gx-PRV。
现参照图K，作进一步说明。将所得到的P△TK-4用SPhI及BamHI酶解，产生含tk缺失的片断，然后分离该片断。PUC19（可由Pharmacia/PL公司购得）用BamHI及SphI酶切并分离出由此产生的较大的片断。然后连接此两片断生成一个单一SalI位点毗邻于tk缺失的质粒PUC△TK4-V。然后用SalI切割PUC△TK4-V，末端用T4DNA多聚酶处理变成平头，得到片断A。
上面得到的片断8（BamHⅠ7）用NdeⅠ（它在gx和gp50基因之间切割）和StuⅠ（它在gp63基因内切割）酶切，生成一含有gp50基因（片断B，约1.8kb）的NdeⅠ/StuⅠ片断，用T4DNA多聚酶将该片段末端添平，然后连接片断A及B，以产生质粒P△TK4gp50-8。
质粒P△TK4gp50-8用HindⅢ切断，再与PRV DNA共转染入兔皮细胞。生成的病毒在含有araT的选择培养基中生长以分离出具有图K（C）所示结构的tk-重组体。我们称此病毒为PRV△TKgp50。
然后把PRV△TKgp50再与上面得到的PGXTK3共转染，并在HAT培养基中143细胞上选择tk+病毒，此病毒称为PRV△TKgp50tk+（HSV），为gx-。
接下来，将使用这些酶消化BamHⅠ7制得的含gp63及gⅠ基因的PvuⅡ/BamHⅠ片断再克隆到PBR322的PvuⅡ/BamHⅠ片断中，以产生质粒pPR28-1（见共同待批的美国专利申请844，113号，申请日为1986年3月26日）。质粒pPR-28-1用PvuⅡ切割，加入BamHⅠ连接子，由此生成的片断再用BamHⅠ酶解，从而将5kb PvuⅡ/BamHⅠ片断转变成BamHⅠ片断。然后把此BamHⅠ片断克隆到pPGX1（上面所得的）的BamHⅠ位点上。所得质粒与PRV△TKgp50tk+（HSV）共转染。生成的病毒在araT上生长，以选择tk-表型。选得的病毒具有插入tk基因的保留部分中的gp50基因并且在其正常座位上是缺失该基因的。他们也系gx-。故与产生tk-gx-病毒的野型病毒进行任何重组将产生缺失gp50基因的病毒。因为 gp50是一必要的基因。这样的病毒应是无活力的。
虽然我们的例子只是涉及PRV，但高练这项技术者很清楚：用同样的技术也可在其他疱疹病毒中生产类似的重组病毒疫苗。一般说来，步骤包括1）在邻近授予毒性突变处插入必要基因，及2）使必要的基因从正常座位上丢失，使之与缺失的分泌蛋白质基因相连接。更为普遍的是，从正常位置上除去必要基因，将减少与野生型病毒重组的可能性。为构建一缺失gx的PRV，并不绝对需要插入一个可选择的标记。例如，可在gx基因内缺失碱基对BamHI片断制备出包含在gx编码区有缺失的质粒。此质粒与PRV    DNA共转染，然后从转染产生的病毒中用核酸杂交法筛选出没有缺失之DNA小片断的病毒或用抗体筛选法筛选出缺少gx的病毒（Holland等，J.Virol.，46，649-52页1983））。
本发明疫苗中应用的缺失多肽（如gx-）病毒也可由其它方法产生，如突变接着筛选缺失多肽（如gx）的病毒，或用其它用于产生有缺失之病毒的任何技术，其中所说的缺失可使疫苗病毒在血清学上不同于野生型病毒。例如，虽然人们不能选出gx-PRV（抗gx抗体并不中和PRV），但可使用上述T.C.Holland等的方法选出在本发明的疫苗中有用的缺失gⅠ或gⅢ的PRV〔（Wathen J.Virol.，58，173-78（1986）〕。
虽然通过灭活或缺失tk基因（Tatarov，上述文献;Post和Roizman，上述文献）来减毒是较好的方法，但是本发明的gx-病毒可经受常规化学或物理的灭活过程，而使病毒无致病性但仍保留其抗原性。这些灭活疫苗可以加适当的佐剂例如明矾配制。各种疫苗制备技术的一般叙述见J.I.Duffy：疫苗制备技术，Noyes Data Corporation（1980）及G.W.Warr：“抗原的制备及免疫原理”〔J.J.Marchalonis & G.W.Warr编，“Antibody As A Tool-The Application of Immuniochemistry，”21-58页，John Wiley & Sons（1982）〕。
强毒力PRV病毒可在动物组织培养物中传代，直至病毒无致病性， 即无毒力的。PRV可在许多种类组织培养系统，如包括鸡胚，鸭胚，猪肾，猪睾丸，牛胚肾，猫肾，犬肾，及猴肾中增殖，也可在已建立的细胞系如Madin    Darby牛肾（MDBK）及Madin    Darby犬肾（MDCK）细胞系中增殖。
PRV的减毒可由标准的连续传代法完成，包括终端稀释传代技术，即在易感染的组织培养中传代达到足够代数，直至病毒成为无致病性但又不失去免疫原性的。
传代时间间隔应当使病毒在两代间有足够的时间复制，保温温度宜在约30～38℃。最佳传代时间视不同病毒，培养系统及所用温度而不同。
疫苗成品应含有一定量的无毒的PRV，而其量足以刺激易感动物产生免疫反应并仍是无致病性的。推荐用于易感动物的病毒滴度大约为103-105空斑形成单位，最好约104空斑形成单位。
本发明的病毒制剂可用水稀释以调节其效力，可加入稳定剂诸如右旋糖，乳糖或其它无毒物质。此病毒制剂亦能再冷冻干燥以便储存，或随后配成液体疫苗。
疫苗可经不同途径给予动物，包括肌肉内，静脉内，皮下，气管内及鼻内，较好的途径是肌肉内。
给大母猪接种，可用双剂量方案。第一剂量可在下小猪前数月至大约5-7周给予。第二剂量疫苗则在第一剂量后数周给予，例如约2-4周后给予，然后疫苗能一直给到下小猪前。或者，可单次给予2毫升剂量的疫苗，例如在产前约5-7周给予。但为使仔猪得以最有效的免疫，认为双剂量给药法是较好的。对生育的动物建议半年后再接种。公猪可在任何时间再接种，同样，母猪可在生育前再接种。未接种的母猪所生的小猪可在约第三天接种。
该疫苗也可与防治其他疾病的疫苗结合产生多价疫苗，并可经前述的任何途径接种。它可与其他药物例如抗生素合用。
按照本发明方法制备的疫苗可刺激对此疾病易感的动物产生免疫反应而不发生任何明显的由毒力型病毒所致的临床症状。药学有效量的疫苗可与药学上接受的载体或稀释剂一起应用于接种动物，例如猪，牛，羊，山羊，以及其它哺乳动物。图A.PPRXK4的构建
（a）pPRXhI用xhoⅠ和Kpn酶切，得到片断1（2.6kb）
Figure 86105450_IMG2
（b）和T4DNA多聚酶将片段1填成平端并加入EcoRⅠ连接子。
Figure 86105450_IMG3
（c）PACYC184用EcoRI酶切，并用BAP处理，产生片断2。
Figure 86105450_IMG4
（d）连接片断1和2，产生pPRXK4
X＝糖蛋白X基因
cm ＝氯霉素抗性基因
Tet ＝四环素抗性基因
Pgx＝gx启动子
图B.pPGX1构建
（a）pPRXK4用MstⅠ酶切，得到片断3（2.1kb）
（b）片断3用EcoRⅠ切割以产生片断4（400bp）
Figure 86105450_IMG9
（c）PUC9用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切断，产生片断5（2.6kb）
（d）连接片断4和5，生成pPGX1
Figure 86105450_IMG11
图C.pGXTK2的构建
（a）pPGX1用BamHⅠ酶切，用BAP处理，产生片断6.
Figure 86105450_IMG12
（b）pRB103用BamHⅠ和Bg1Ⅱ酶切，产生片断7（2.9kb）
片断7
（c）片断6和7相连接，得到pGXTK2
Figure 86105450_IMG14
Ptk＝胸苷激酶启动子
t＝胸苷激酶基因。
图D.pGXTK3构建
（a）pPRXh1用BamⅡⅠ酶切，产生片断8（6.9kb）
Figure 86105450_IMG15
（b）pGXTK2用BamHⅠ酶切，用BAP处理，产生片断9
（c）片断8和9相连接，产生pGXTK3
gx-ct＝gx基因的C-端编码区
50＝糖蛋白50基因
63＝糖蛋白63基因
Ⅰ＝糖蛋白Ⅰ基因
图E.用pGXTK3和一个tk-PRV共转染
（a）pGXTK3和一个tk-gx-PRV共转染产生tk+gx-PRV△gx1（或DT-A）
Figure 86105450_IMG18
图F.P△GXB7的构建
（a）pPGX1用BamHⅠ酶切，并用BAP处理，得到片断6
Figure 86105450_IMG19
（b）pPRXh1用BamHⅠ酶解，产生片断8（6.9kb）
（c）片断6与8连接，产生质粒p△GXB7。
图G.用重组法构建PRV△GXTK-
（a）PRV△GX1和p△GXB7共转染，并重组产生PRV△GXTK-
Figure 86105450_IMG22
＝交换区（右边交换区的比例出入较大）
图H.tk缺失质粒的构建
（a）BamⅠ11克隆到PBR322中，产生质粒PTK11
Figure 86105450_IMG23
（b）pTK11用XhoⅠ酶切，产生片断10。
Figure 86105450_IMG24
（c）片断10用Ba1    31酶切，然后再连接成环，产生tk基因，有不同长度缺失的质粒，例如，p△tk-3和p△tk-4。
Figure 86105450_IMG25
tk＝胸苷激酶基因
d＝在胸苷激酶基因中缺失
图I.pGXTPA的构建
（a）质粒pPSA18用BalⅠ切割，加入BamHⅠ连接子，生成片断11。
pPSA18：
片段11：
Figure 86105450_IMG27
（b）片断11用BamHⅠ酶切，生成片断12（1.95kb）
Figure 86105450_IMG28
（c）质粒pPGXI（图B）用BamHⅠ切割，产生片断6
Figure 86105450_IMG29
（d）连接片断6和12，生成质粒pGXTPA。
Figure 86105450_IMG30
tp＝组织纤维蛋白溶酶原激活因子基因
L＝BamHⅠ连接子
图J.质粒pGXTPA-B7的构建
（a）质粒pGXTPA用HindⅢ酶切，产生片断13
（b）HindⅢ连接子加到片断8中（图D），产生片断14
Figure 86105450_IMG32
（c）然后，将片断13和14连接到一起，产生pGXTPA-B7。
Figure 86105450_IMG33
HL＝HindⅢ连接子
图K.重组验证病毒的生产
（a）p△TK-4
（b）BamHⅠ7
（c）PRV△TKgp50
Figure 86105450_IMG36

Claims (5)

1、一种生产用于疫苗的假狂犬病病毒的方法，该方法包括通过遗传工程技术，改变或缺失编码分泌性糖蛋白(糖蛋白X)的DNA，使病毒经复制后不产生糖蛋白X。
2、按权利要求1的方法，其中编码分泌性糖蛋白的DNA是通过缺失编码糖蛋白X的DNA碎片来改变的。
3、按权利要求1的方法，其中所述遗传工程技术包括下列步骤。
（1）从含有gX基因的质粒pPRXh1（pUC1129）和质粒pACYC184构建含有gX基因的质粒pPRXK4;
（2）除去pPRXK4中的gX启动子，将其克隆到质粒pUC9中，以构建质粒pPGX1;
（3）从质粒pRB103除去HSV胸苷激酶（tk）基因，将其插入pPGX1的一个位点上，使之与gX启动子融合，以产生质粒pGXTK2;
（4）从pPRXh1除去含有gX基因C-端编码区的PRV的BamH17片段，并将它插入到pGXTK2的tk基因下游，生成质粒pGXTK3;
（5）用tKgXPRV和pGXTK3（tKgX）共转染兔皮细胞，然后按L.E.Post及B.Roizman，方法产生tKgX  PRV;和
（6）将tKgXPRV转变为tKgX  PRV病毒，减毒后用做疫苗。
4、按权利要求1至3中任一项的方法，进一步包括改变或缺失该病毒的DNA，使其不产生功能性的胸苷激酶。
5、根据权利要求1的方法制备的假狂犬病毒gX缺失突变株，经常规减毒处理后作为疫苗的应用。
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