CN87102167A - 具交叉保护作用的人单克隆抗体组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明已经制备了分泌能与不同菌种的分子结合的人的单克隆抗体的细胞系。已经发现，这些抗体能防治不同菌属的致命侵入。本发明还包括含有能够与其他的单克隆抗体，血浆部分和抗微生物制剂结合的抗体的药物组合物，以及这些组合物在控制感染方面的预防和治疗用途。
Description
本发明涉及使用免疫技术以提供用于治疗和诊断细菌感染的新物质。更具体地说，本发明涉及生产和使用人单克隆抗体，该抗体能够预防不同属的细菌所引起的感染。
革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌在受感染的病人中可引起威胁生命的疾病，这些细菌往往会引起严重的损伤和死亡。这种感染对早产婴儿、老年病人和处于严重疾病状况如烧伤、手术创伤、愈合缓慢的创伤或恶性创伤的病人中的发病率有所上升。这些感染是医院所特有的，尤其发生在因为手术、血管内损伤或长期用免疫抑制剂或抗生素治疗而长期住院的病人中。此外，免疫系统还未成熟的新生儿对于某些革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌引起的新生儿败血症和脑膜炎显然特别敏感。
在革兰氏阴性和革兰氏阳性疾病中最常遇到的微生物有：大肠杆菌（Escherichia coli）、肺炎杆菌（Klebsiella，pneumoniae）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）、产气肠杆菌和阴沟肠杆菌（Enterobacter aerogenes and cloacae）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、脑膜炎双球菌（Neisseria meningitidis）、B组链球菌（Streptococcus）和金黄色酿脓葡萄球菌（Staphylococcusaureus）（Sonnenwirth，A.C.，“肠杆菌和相似的革兰氏阴性细菌”PP 753-790，Microbiology，第二版，David，B.D.;Duebecco，R.;Eisen H.N.;Ginserberg H.S.，Wood W.B.，McCarty M.编辑，Harper和Row（1973）;McCabe W.R.“革兰氏阴性细菌”Adv.Intern.Med.19，135-138（1974）;Kreger等，“革兰氏阴性细菌Ⅲ.在612个病人中的病原学、传染病学和生态学的再评价”Am.J.Med.68，332-343（1980）;Robbins J.B.等“大肠杆菌K1荚膜聚糖与新生儿脑膜炎的关系”New Engl.J.Med.290，1216-1220（1974）;Hughs J.M.等，“医院的感染监察，1980-1982”Morb.Mort.Weekly Report，32，1ss-16ss（1983））。在这些感染中，往往不是全部，而是某些革兰氏阴性细菌的血清型如大肠杆菌、肺炎杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、绿脓杆菌和粘质沙雷氏菌在成人中引起菌血症。与成人相比较，免疫系统还未成熟的新生儿对具荚膜的大肠杆菌、B组脑膜炎双球菌、B型流感嗜血菌（Hemophilus influenzae）和B组链球菌等五种类型的菌株所引起的败血症和脑膜炎特别敏感。虽然其它细菌也可引起这些感染，但由上述感染的血样中得到的分离物主要是上述细菌。
长期以来，用于控制和根治革兰氏阳性和革兰氏阴性感染的主要治疗工具是抗菌素，然而，感染的持续发生及其严重性、抗抗菌素菌株的不断出现及某些抗菌素的固有毒性要求人们限制使用抗菌素治疗的方法。这种要求促使人们去寻找另外的预防和治疗方法。
人们大都认为，抗体与活细胞上可接近的（外露的）结构发生反应可通过几种机理中的任何一种破坏细菌。这些机理包括：（1）有血清补体存在时的细菌直接溶解，（2）通过营养去除剂受体的阻止的抑菌作用，（3）在有或没有血清补体存在时，进行细菌调理作用和随后的吞噬作用，（4）阻止细菌与宿主组织的附着（Mims C.A.，“感染中的发现”The Pathogenesis of Infectious Disease，PP 198-222，Mims C.A.编辑Academic Press（1982））。对具有表面糖分子的细菌，如类脂多糖（LPS）和/或荚膜，抗体通过调理机理起作用似乎是最有效的（Kaijser B.等，“各种免疫球蛋白的O和K抗体对大肠杆菌的预防效果”Scand.J.Immunol.1，276（1972））。因此，专一于这些可接近的糖结构的抗体可提供一种有效的灭菌方法。
通常，与致病细菌接触的哺乳动物能够产生专一于LPS或荚膜的抗体。这些化学结构不同的抗原由反复重复的低聚糖分子所组成，其存在决定了细菌菌株的血清型。由于它们往往是具有免疫优势的细菌抗原，因此，具有潜在治疗作用的抗体中研究得最多的是血清型专一性抗体（抗LPS或荚膜）。然而，由于这些抗体的有限的交叉反应性及革兰氏阳性和革兰氏阴性致病细菌上的糖抗原的表现特性的高度不一致，要生产一种只含有血清型专一性的抗体的治疗制剂是十分困难和昂贵的（Kaijser B和Ahlstedt S.;“抗体对大肠杆菌O和K抗原的预防能力”Infect.Immun.，17，286-292 1977;Morrison D.C，Ryan J.L.，“细菌内毒素和宿主的免疫反应”Adv.Immunol.，28，293-450，1979）。无论如何，各种报导都有助于看到，可以找到免疫治疗的方法以处理革兰氏阴性细菌疾病。
通过浓缩后含有专一于和预防感染微生物的免疫球蛋白抗体的人血浆分离物对绿脓杆菌的感染是有效的（Collins M.S.，Robey R.E.，“富含专一于绿脓杆菌类脂多糖抗原的抗体的静脉内免疫球蛋白（人）的预防活性”Amer.J.Med.，3，168-174，1984）。然而，由于某种固有的限制，市售产品仍然是不易得到的，这些限制妨碍了它们在治疗威胁生命的细菌疾病中的广泛使用。
与免疫球蛋白组合物有关的一种限制是，必须从血浆样品大库中收集这些组分，而且还要对这些特异抗体含量有限的血浆样品进行预选。尤其是，这些血浆库由上千个供体的样品组成，它们可能对某些病原菌的效价较低。因而，在最好的情况下，所需抗体的最终效价也只有较小的增加。
另一个限制是，预选过程本身是很为昂贵的，要连续筛选供体群以保证产品的均一性。尽管作出了很大的努力，产品在批量之间和地区范围之间仍然是不同的。
在免疫球蛋白组合物中还有一个固有的限制，其施用同时导致了大量外源蛋白类物质的服用（如病毒），它们可能引起不利的生物效应。所需抗体的低效价和外源物质的高含量相结合，往往将可施用于病人的专一而有效的免疫球蛋白数量限制在一个较低的水平上。
1975年，Kohlen和Milstein报导了某种鼠细胞系能与鼠脾细胞融合而产生杂交瘤，这种杂交瘤可以分泌纯“单克隆”抗体（Kohler G.和Milstein C.，“分泌具有预定专一性抗体的融合细胞的连续培养”Nature.256.495-497，1975）。随着这种工艺的出现，就有可能产生专一于任何特异决定基或抗原决定基的鼠抗体。
用这种工艺已从鼠中制得了鼠单克隆抗体，该小鼠用B组脑膜炎双球菌的多糖进行过免疫。观察到这种鼠的IgM单克隆抗体可/与几种K1阳性大肠杆菌菌株结合并发生调理作用，不管其LPS血清型如何（Cross.见上，Soderstrom.见上，Cross A.S.等，“在大肠杆菌引起的侵入感染中K1荚膜的重要性”J.Inf.Dis.，149，184-193，1984）。此外，单克隆抗体能在鼠中预防大肠杆菌K1和B组脑膜炎双球菌引起的致使疾病（Cross，见上，Sunderstrom，见上）。在另一例中，报导了专一于B组链球菌Ⅲ型的鼠单克隆抗体在小鼠实验感染模式中具有预防作用（Egan M.L.等，“用单克隆抗体预防B组链球菌Ⅲ型对小鼠的实验感染”J.Exp.Med.1，1006-1011，1983）。
对治疗小鼠有效的鼠单克隆抗体在用于人类时就有重要缺点。人类免疫系统能够识别任何鼠单克隆抗体这样的外源蛋白质。这能导致抗体的被加速清除，因而取消了其药物效应（Levy R.和Miller R.A.“用单克隆抗体治疗肿瘤”Fed.Pro c.42，2650-2656，1983）。更严重的是，可以想象它会导致类似于“血清病”的过敏反应而休克或甚至死亡。临床经验表明，接受鼠单克隆抗体以治疗各种肿瘤的将近半数的病人中，发生了抗鼠免疫球蛋白的反应并因此限制了这些抗体的使用（Sears H.F.等，“单克隆抗体在处理肠胃肿瘤的第一期临床试验”Lancet，1，762-764，1982和Miller R.A等，“七个患有T细胞淋巴瘤病人的单克隆抗体治疗试验”Blood，62，988-955，1983）。
因此，需要一种可用于人的、可以预防革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌疾病的单克隆抗体。然而，革兰氏阳性和革兰氏阴性致病细菌的不同抗原性有力地表明，产生专一于所有重要的细菌病原体血清型的人单克隆抗体是不实际的。
革兰氏阴性细菌的不同抗原性是由于类脂多糖（LPS）位于不同的区域所引起的，这是一种与革兰氏阴性生物外膜结合的分子。LPS分子一般认为是由三个结构区组成。靠近外膜的区称为LPS的脂质A部分。这种结构上的保守区域具有与革兰氏阴性疾病相关的内毒素活性。称为核心的第二结构区常常通过2-脱烷基-3-脱氧-D-甘露辛酯残基（KDO）与脂质A相连接，而且与脂质A区相似，当LPS的第三个最外区存在时通常是不能被抗体接近的。虽然这个区域在某些革兰氏阴性细菌中具有部分保守性，但在许多肠杆菌中发现在完整的核心中有许多差异。LPS分子的最外区是由称为O-专一性侧链的重复的低聚糖单元所组成。这些低聚糖单元中的糖包含各种分子实体，它们具有血清型结构专一性的抗原相异性。因此，这些糖本身、它们的序列及其连接通过其三级结构决定了O-侧链的抗原性。抗这些O-基因的抗体发现一般是血清专一性的。血清型一般是通过它们对专一抗血清的反应性所决定的，该抗血清只是具有与一种特异的抗原决定基结合的活性。参阅Mayer等，Meths，Microbiology，18，157-201，1985。
通过努力已制备了抗LPS核心和脂质A区的抗血清，以说明对革兰氏阴性感染的预防（Sakulramrung and Domingue，J.Inf.Dis.151，995-1104，1985;McCabe等，J.Infect.Dis.，1365，516-，1977;Mullan等，Infect.Immun.10，1195-1201，1974）。最近已生产了与保守区反应的鼠和人的单克隆抗体。虽然这些抗体有时在特殊的活体模式体系中表现出部分有效（Jeng等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，1970，1985;Bogard和Kung，专利申请No WO 85/01659），其它实验室还不能用实验说明同样的效果。参阅Elkino和Metcalf，Infect.Immun.48，597，1985;Gigliotti和Shenap，J.Inf.Dis.151，1005-1011，1985。此外，这些抗体一般与完整的、可存活的革兰氏阴性细菌或与纯化的LPS分子是不反应的（或不结合的）。这些发现表明，在细菌上的天然状态中的LPS的核心和脂质A部分不一定能够与抗体接近，而处于感染状态时不一定能接近抗体。人们普遍认为，抗核心或抗脂质A的抗体不能与革兰氏阴性细菌反应，因为后者不具有LPS。由于这些发现，在治疗人类革兰氏阴性、或在这方面对治疗革兰氏阴性细菌疾病中，抗保守的LPS核心或脂质A区的单克隆抗体是不大可能有效的。
因此，对于能够广泛地（属间）交叉预防革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌疾病的人单克隆抗体，及其实际的生产方法和这些抗体的使用，仍然存在迫切的要求。本发明达到了这些要求。
本发明提供了能生产人单克隆抗体的新细胞系，该单克隆抗体能通过与一种可接近的抗原决定基结合而专一地与多种细菌发生交叉反应，该抗原决定基包括至少存在于二种不同细菌的非核心糖部分。此外，还提供了通过服用含有多种人单克隆抗体组合物的有效量，对敏感于细菌感染的病人进行预防处理和对遭受这种感染的病人进行治疗处理的方法，该单克隆抗体中至少有一种抗体能够与非核心糖抗原决定基反应，该决定基由二种或二种以上的细菌所共有。组合物最好包含有生理上可接受的载体，也可以含有任何一种或多种下列成分：能够与其它属细菌反应的人单克隆抗体、由人血浆中提取的γ-球蛋白、该血浆来自具有与一个或多个属的细菌高水平免疫球蛋白反应的人和一种或多种抗微生物制剂。
本发明提供了能够生产人单克隆抗体的新细胞系和含有这种抗体的组合物，这些组合物能与多个属的细菌进行选择反应，这些细菌在医院、新生儿或其它感染中起作用，其中个别抗体特异地与多个属的细菌上所存在的非核心糖抗原决定基反应。所述细胞具有可鉴别的染色体，其中由细胞或细胞前体来的病菌系DNA已经重新组合，以编码一种对抗原决定基具有结合部位的抗体或其结合片段，该决定基由至少二种或二种以上的细菌属的某些血清型中的糖分子所共有。这些人单克隆抗体能广泛使用于各种方法，包括细菌疾病的诊断、预防和治疗。
一般说来，本发明的细胞是能够在培养中稳定地生产人类抗体的细胞，特别是不死的人淋巴细胞，这些细胞能产生抗非核心糖决定基的具有预防作用的人单克隆抗体，该决定基位于由至少二种细菌共有的可接近的分子上。“可接近的”含意是指非核心糖决定基在与单克隆抗体直接相互作用的场合下在生理上是可达到的。这样形成的单克隆抗体对于治疗或预防大范围细菌感染所引起的严重疾病是有用的。此外，这些释放到四周环境中去的非核心糖也可任意地与抗体分子直接相互作用，并通过网状内皮系统而去除。
本发明含有单克隆抗体的组合物在治疗和预防处理医院的、新生儿的及其它的感染特别有用。一般医院的感染是由以下细菌所引起的：大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎杆菌、产气肠杆菌和阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌和B组无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、抗体组合物最好能防治2、3、4或更多种这样的细菌。同样，用于新生儿的，例如用在新生儿败血症和软膜蛛网膜炎中的，要求抗体专门对下列二种或更多种细菌微生物有作用：大肠杆菌K1、B组脑膜炎双球菌、无乳链球菌和B型流感嗜血菌。其它一般的感染细菌有：金黄色酿脓葡萄球菌、表皮葡萄球菌（Staphylococcusepidermidis）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、奇异变形菌（Proteus mirabilis）、普通变形菌（Proteus vulgaris）、脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）、洋葱假单胞菌（Pseudomonas cepacia）、结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、Providencia morganii、伤寒杆菌（Salmonella typhi）、卡氏肺囊虫（Pneumccystis carinii）、不动杆菌（Aninetobacter herellea）、多杀巴斯德氏菌（Posturella multocida）、催产克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）。其它有关的致病细菌对熟悉本领域的人来说是已知的。参阅，Hughs J.M.等，““医院感染的观察1980-1982”Morb.Mort Weekly Report，32，1SS-16SS，1983以及Microbiology，第三版，David B.D.，Dulbecco.R.，Eisen H.N.，Ginserberg H.S.，Wood W.B.，McCarty M.编辑，Harper和Row，1980，这二本书列为本文参考文献。单克隆抗体可与某种细菌的全部或个别成员反应，这些成员可通过其表面抗原决定基、特别是LPS或荚膜部位如血清型所识别。
单克隆抗体具有与各种细菌，包括上面所列的临床上重要的菌种的交叉反应性，这种意外的发现提出了新的治疗和预防处理方法。结合使用预选过的交叉反应的抗体，可以生产用于处理多种不同感染细菌的几种抗体的混合物。
以一种两个单克隆抗体的混合物作为例子，而不是限制，其中一个可与至少二种有临床意义的细菌进行交叉反应，另一个至少可与二种或三种细菌进行交叉反应，这样的混合物对于处理防治4、5、6或更多种不同菌种是有用的。加入第三或第四种单克隆抗体，其中每一个可与至少二种有临床意义的菌种发生交叉反应，即使其中一种或多种细菌都同样被第一或/和第二抗体识别也是可以的，这样则在治疗5到10种或更多种细菌中增加了有效性。当然，加入一个或多个专一于一种预先确定细菌的单克隆抗体也可能是必要的，例如，单克隆抗体不能与该细菌进行交叉反应时就需要这样。
此外，本发明还提出了治疗细菌感染的新方法。同样，以一种新方法作为实例而不是限制，用这种方法处理已经感染或可能对所选择细菌的感染具有敏感性的病人。处理包括服用一种含有能与认为引起感染的细菌反应的单克隆抗体组合物，其中的单克隆抗体最初所确定的特征是与不同菌种反应的。
另一个实例是通过服用含有多种单克隆抗体的组合物来处理细菌感染，该单克隆抗体能与预选的具有临床重要性的细菌中的大多数（即大于50%、较好是60%-80%或更多、最好是90%）进行反应，其中的抗体数至少比细菌种数少二个。一般说来，如果以“n”表示细菌种数，对处理防治最多达15-20种细菌时，则组合物含有约n-2个抗体，更好的是n-4至n-8或更少的抗体。在要求处理防治广谱细菌（如25-50或更多）的情况下，组合物一般含有n-10至n-20个抗体或更少。
单克隆抗体的制备可通过启动核酸序列的表达来完成，该序列编码专一于多种细菌上的非核心糖抗原决定基的抗体或其片段。一般说来，单克隆抗体是由淋巴细胞的细胞驱动的EB病毒（EBV）转换产生的，该淋巴细胞从人供体所获得，这些人是或曾经是受到有关革兰氏阴性细菌的侵入。这样产生的分泌抗体的细胞系的特征是连续生长的类淋巴母细胞，它是双核型的，是EB核抗原（EBNA）阳性的，并能分泌IgG、IgM、IgA或IgD等同型单克隆抗体。细胞驱动的转换过程本身属于遗传系统公司的发明，并在美国专利4464465中有详细描述，该专利也列为本文参考文献。单克隆抗体可以完整或以片段形式如Fv、Fab、F（ab′）2使用，但一般是以完整形式使用。
另外，产生抗体的细胞系可通过由合适的药物标记过的人骨髓瘤、鼠骨髓瘤或人类淋巴母细胞与人的B淋巴细胞进行融合而产生杂交细胞系。
本发明的细胞系除了用于直接生产人单克隆抗体以外，还可用于其它地方。细胞系可以与其它细胞（如合适的药物标记的人骨髓瘤、鼠骨髓瘤或人类淋巴母细胞）融合而产生杂交瘤，因而使编码人单克隆抗体的基因发生转移。而且，细胞系可以用作编码免疫球蛋白的DNA源，该球蛋白可以分离并用融合以外的方法转移到细胞中。此外，编码单克隆抗体的基因可以分离，并通过DNA重组技术在各种宿主中产生专一的免疫球蛋白。特别是，通过由mRNA制备cDNA文库，可以分离到编码免疫球蛋白而没有内含子的单cDNA克隆，并可移入合适的原核或真核生物的表达载体中，随后转化到宿主中进行大批量生产。
类淋巴母细胞或杂交细胞系可以按照常规技术进行克隆，并用抗体进行筛选，该抗体能够与细胞上清液中检测到的不同细菌的抗原决定基相结合。
发现本发明的单克隆抗体作为药物组合物成分特别有效，该组合物含有治疗或预防量的至少一种本发明单克隆抗体和有效的药物载体。药物载体可以是任何适于给病人输送单克隆抗体的合适的无毒物质。载体可以包括无菌水、醇、脂肪、蜡和惰性固体。药物允许的辅助剂（缓冲剂、分散剂）也可包括在药物组合物中。这样的组合物可以包括与核心糖抗原决定基交叉反应的单克隆抗体，该决定基由二种或更多种能引起例如医院的和新生儿的（如败血症或软膜蛛网膜炎）感染的细菌所共有。或者，药物组合物可含有二种或多种单克隆抗体以形成一种混合剂。例如，包含人单克隆抗体的混合剂具有抵抗大多数常见临床分离物的活性，其中每个抗体防治2种或2种以上引起人们感染的革兰氏阴性细菌。如果有要求，可以选择一种或多种与革兰氏阴性有同样交叉反应的单克隆抗体，甚至制备出更广泛的方便使用的产品。
感兴趣的是能够与非核心糖决定基反应的、具有预防和/或治疗作用的单克隆抗体组合物，该决定基由三个或三个以上，常常至少是5个，或更通常是至少10，甚至15个或更多个细菌血清型所共有，该细菌血清型至少包括两个、常常至少是三个或更通常是5个，一般是少于10个属的细菌菌种。
特别感兴趣的是单克隆抗体组合物，该组合物能与至少约3个、最好约5个和直到包括下列全部引起医院感染的常见细菌进行反应：大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎杆菌、产气肠杆菌和阴沟杆菌、粘质沙雷氏菌和B组无乳链球菌。为处理新生儿感染要求组合物与至少2个、一般是至少3个、而更通常是至少4个或直到包括下列引起感染的全部细菌菌属相反应：大肠杆菌K1、B组脑膜炎双球菌、B组无乳链球菌、B组流感嗜血菌、金黄色酿脓葡萄球菌和表皮葡萄球菌。
每一个组合物包括至少2个、一般至少3个至5个、更好是6至10个人单克隆抗体，而其中至少一个抗体可与由2种或多种细菌共有的非核心糖抗原决定基（如LPS分子）发生反应并提供预防作用。具体地说，抗体不是与每个细菌的全部血清型结合，但可以结合2、3或更多个血清型。要求至少有一个单克隆抗体结合到至少2种革兰氏阴性细菌的可接近的非核心糖部分上，并且至少有一个单克隆抗体结合到一种革兰氏阳性细菌的可接近的糖部分上。
各种单克隆抗体成分的克分子比一般彼此相差大于于10倍，更好是不大于5倍，抗体成分相互之间的摩尔比一般约为1∶1～2。
人单克隆抗体也可以个别使用，尤其是当病原体已经确定，或者限制在某一抗体的抗菌谱的狭窄范围内时。
本发明的人单克隆抗体也可与其它单克隆抗体（例如一般称为“单克隆抗体交叉反应和预防绿脓杆菌血清型”的应用，见U.S.S.N.807394，入档日为1985、12、10，该文也列为本文参考文献）以及现存的血浆产品如市售的用于预防和治疗人类细菌疾病的γ球蛋白和免疫球蛋白一起使用。对于免疫球蛋白来说，血浆最好取自表现出与各种感染细菌有高水平免疫球蛋白反应的人供体。参阅“静脉免疫球蛋白及其共存宿主”Amer.J.Med.76（3a），Mar.30，1984，PP1-231，该文也列为本文参考文献。
本发明的单克隆抗体可以用于分开服用的组合物中，该组合物与抗菌素或抗微生物制剂一起施用。一般说来，抗微生物制剂可以包括青霉素或头孢霉素（如羧苄青霉素、青霉素G或类似物）及一种氨基糖苷（如庆大霉素、妥布霉素等），但许多本领域专业人员熟悉的添加剂（如先锋霉素、磺基药等）也是可以使用的。
本发明的人单克隆抗体及其药品组合物特别适于口服或非肠道引入机体。该药品组合物最好是通过非肠道引入机体，即经皮下、肌肉或静脉。本发明所提供的非肠道引入机体的组合物包括一种人单克隆抗体溶液或其溶解于一种合适载体中的混合剂，最好是含水载体。能使用的载体很多，例如水、缓冲溶液、0.4%生理盐水、0.3%甘氨酸等。这些溶液是无菌的且一般不含颗粒物质。这些组合物可通过常规的、众所周知的无菌技术进行消毒。组合物按邻近的生理条件的要求可含有符合药品要求的辅助剂，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。抗体在这些配方中的浓度变化范围很大，也就是说，少可低于0.5%左右，一般为或至少为1%左右，多到15-20%（以重量计），根据所选择的引入机体的特定方式，浓度的选择取决于流体体积、粘度等因素。
因此，有代表性的肌肉注射药品配方可含有1ml无菌缓冲液、以及50mg单克隆抗体。有代表性的静脉注射配方可含250ml的无菌的Ringer氏溶液，以及150mg单克隆抗体。制备非肠道引入机体组合物的现行方法是已知的或现有技术中是清楚的，而且还有较详细的记载，如Remington′s Pharmaceutical Science，第15版，Mack出版公司，Easton，Pennsy-lvania，1980。该文列为本文参考文献。
为便于储藏，本发明的单克隆抗体可冷冻干燥，使用前再重建于一种合适的载体中。就所用的常规免疫球蛋白和已知的冷冻干燥以及重建技术而言，这项技术是有效的。本领域的普通专业人员都知道，冷冻干燥和重建会使抗体活性有不同程度的损失（例如使用普通免疫球蛋白时，IgM抗体活性损失趋势较IgG抗体大），因此使用浓度须经调整以求得补偿。
含本发明人单克隆抗体的组合物或其混合剂可为了预防和/或治疗细菌感染而引入机体。用其治疗时，将该组合物引入感染病人的体内，其量要足以治疗或至少部分抑制感染及其并发症。为达到这一目的使用量规定的“治疗有效剂量”。此应用的有效量与感染的严重程度和病人自己的免疫系统的一般状况有关，然而通常的使用范围是每千克体重1～200mg抗体，使用较多的一般剂量是每千克体重5-25mg。必须记住本发明的物质通常可用于严重的疾病，即生命有危险或有潜在生命危险的情况，特别是菌血症和内毒素血症。在这种情况下，考虑到没有外加物质及本发明的人单克隆抗体才能获得的无外源物质的排斥反应的情况，主治医生施用相当过量的抗体是可行的。而且会感到是需要的。
在用于预防时，含本发明抗体的组合物或其混合剂可引入并未被相应细菌感染的病人中，这是为了提高病人对这种潜在感染的抵抗能力。该剂量规定为“有效预防剂量”。在这种情况下，精确的用量仍与病人的健康状况和一般的免疫水平有关，然而，通常的使用范围是每公斤0.1～25mg，尤其是每公斤0.5～2.5mg。
根据治疗医生所选择的剂量浓度和模式，可以进行一次或多次的组合物注射。不管在哪种情况下，治疗处方都应给足够数量的本发明抗体以有效地治疗疾病。
本发明单克隆抗体还可在体外找到各种用途。作为例子，单克隆抗体还能用于细菌鉴别、分离特异细菌株或其片段、制备疫苗等。
用于诊断时，单克隆抗体既可以标记也可不标记。典型的是，在诊断测试中需检定由单克隆抗体与有机体的LPS结合形成的一种复合物。当未标记时，发现抗体在凝集测定中有用途。另外，未标记抗体及能与单克隆抗体反应的其它标记抗体（第二抗体）能够结合使用，例如人免疫球蛋白特异性的抗体。另外，单克隆抗体能被直接标记。各种标记都可使用，如放射性核素、荧光剂、酶、酶底物、辅酶因子、酶抑制剂、配位体（特别是半抗原）等。有多种类型的免疫测定法可供使用，而作为例子，一些测定方法见于US 3817827;3850752;3901654;3935074;3984533;3996345;4034074;以及4098876，这些专利列为本文参考文献。
通常，本发明的单克隆抗体可用于酶免疫检测法，在这些方法中来自不同种的主要抗体或第二抗体与酶相结合。当一种含某属或某血清型的一种或多种细菌的样品，如人血浆或其溶解液，与主要抗体并存时，在抗体和具有选择的抗原决定基的分子之间会发生结合。可将这样的细胞从未结合的样品中分离出来，然后加入第二抗体（用酶标记的）。然后，测定所存在的附着于细胞上的抗体一酶的结合物。现有技术中的其它常规技术也可利用。
在细菌感染及选择抗原的检测中，主要抗体也可与所提供的药箱一起使用。因此，所提供的本发明主要的单克隆抗体组合物，一般以容器内冷冻干燥的形式，既可单独又可与对其它革兰氏阴性细菌特异的附加抗体结合使用。将与标记物结合或不结合的抗体，与缓冲液如Tris、磷酸盐、碳酸盐等、稳定剂、杀虫剂、惰性蛋白如牛血清清蛋白一起装入药箱内。通常，这些物质存在量以活性抗体量计约少于5%（重量），而以抗体浓度计则其存在量至少约为0.001%左右（重量）。通常，希望有惰性补充剂或赋形剂以稀释活性组分。其中赋形量占总组成约1-99%（重量）。能与单克隆抗体结合的第二抗体可以使用，该物质通常存在于单独的小玻璃瓶里。典型的第二抗体是与一个标记结合的，并且可用与上述抗体配方相似的方式配制。
下列实验数据和资料以实例提出但不限制本发明。
实例1
本例说明生产人单克隆抗体的方法，该抗体具有与下属各细菌进行属间交叉反应的活性：大肠杆菌、粘质沙雷氏菌、肺炎杆菌和产气肠杆杆菌。此外，本实例说明了所述抗体在体内的保护活性，抵抗大肠杆菌和产气肠杆菌血清型谐同作用的致死性攻击（交叉反应）。
A.获得合适的人细胞
合适的人B细胞（淋巴细胞）是从一位已知患有膀胱纤维化病人的外周血液中采集的。单核细胞是通过常规的Ficoll-Pague离心技术从外周血液中分离出来的（Boyum A.，“人血液中单核细胞和粘性白血球的分离”，Scand.J.Clin.Lab.Invest.21，Suppl.97∶77-89 1968），在悬浮于1ml的90%的胎牛血清（FBS）和10%二甲基亚矾之前用无磷酸盐的钙一镁缓冲生理盐水洗涤两次，并在液氮中于-196℃下冷冻。
当要转化单核细胞时，将装有5×107细胞的小玻璃管于37℃下迅速解冻。再将该悬浮液加到10ml含15%FBS的Iscove培养基中，并于室温下以250xg离心10分钟。采用改进的E-复位法（E-rosetting）将单核细胞中的T细胞（淋巴细胞）去除。简单地说，细胞于4℃下以1×1017细胞/ml的浓度重悬浮于含20%FBS的PBS中。取1ml这种悬浮液置于17×100mm聚乙烯的圆底试管中，向其中加入1×1019用2-氨乙基-异硫尿鎓溴化物（AET）处理过的、悬浮于10%（V/V）Iscove培养基溶液的羊红血球细胞（Madsen，M.和Johnson，H.E.，“采用治疗羊红血球细胞AET法对E-复位形成的操作法研究”，J.Immun.Methods，27∶61-74，1979）。该悬浮液于4℃下剧烈混合5-10分钟，将E-复位细胞通过在Ficoll-Pague上于2500xg、4℃下离心8分钟而去除。在界面的带状物是E-复位阴性外周血液单核细胞（E-PBMC），将它用Iscove培养基洗涤一次，然后重悬浮于含15% W/VFBS（g/ml）、L-谷氨酰胺（2mM/l）、丙酮酸钠（1mM/l）、青霉素（100IU/ml）、链霉素（100μg/ml）、次黄嘌呤（1×10-4M）以及胸苷（1.6×10-5M）的同种培养基中。这种培养基此后称为HAT培养基。
B.外周血液单核细胞的细胞驱动的转化
E-PBMC的细胞驱动转化是通过将转化细胞系与E-PBMC一起培养而完成的。转化细胞系是一种由GM1500类淋巴母细胞系的乙基甲烷磺酸盐突变衍生出的EBNA阳性人类淋巴母细胞系。在30μg/ml6-硫鸟嘌呤存在下的选择使细胞发生3次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的缺陷并因此对HAT敏感。该细胞系命名为1A2细胞系，并于1982、3、29寄存于美国典型培养物保藏中心（ATCC），寄存号为ATCC CRL 8119。将处于对数生长期的1A2细胞悬浮于HAT培养皿中且以每一E-PBMC 30个1A2细胞的比例与E-PBMC结合。将细胞混合物置于10个圆底的96孔微量滴定板上，每孔的细胞浓度为62，000个，体积为200μl，于37℃下在含6%的CO2增湿气氛下培养。通过用新的HAT培养基换掉一半上清液在转化后喂养培养物5天。于逆转显微镜下每隔一天观察一次细胞以检测增殖情况。在接种细胞混合物后10天及由于HAT的选择而使1A2细胞死亡以后。用没有氨基蝶呤的同样HAT新培养基完成小孔中细胞的喂养。接种后的15天，观察到100%的小孔含有增殖细胞，而大多数的其它小孔中的细胞密度足够取出并检验其上清液中抗大肠杆菌或抗粘质沙雷氏菌的抗体。
C.检测分泌特异抗体的细胞
采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）筛选上清液中的抗大肠杆菌或抗粘质沙雷氏菌的抗体（Engrall，E.，“微生物学中酶免疫定量测定法（ELISA）”，Med.Biol.，55：193-200，1977）。抗原培养皿是由一系列扁平底的96孔Immunlon 2型微量滴定板组成的，平板小孔里含有能生存的大肠杆菌或是粘质沙雷氏菌血清型，它们与多-L-赖氨酸一起粘在小孔的表面。简单地说，50μlPLL（1μg/ml）的PBS溶液于室温下（RT）30分钟内加到每一孔内。培养皿用PBS洗涤三次，再向每一小孔加入PBS或50μlOD660＝0.2的混合细菌悬浮液。培养皿于37℃下培养60分钟，然后用生理盐水/0.02%Tween 20（生理盐水/T）洗涤三次以除去尚未连接的细菌。用于筛选的各种抗原培养皿包括：（1）大肠杆菌血清型01（ATCC 23499）和04（ATCC12791）的混合物;（2）粘质沙雷氏菌血清型07、015、016和018的混合物（所有参照典型株都是由阿特兰大传染病中心（CDC）得到的，GA）;（3）无菌微量滴定板。
在ELISA方法中，首先用200μl含5%W/V的干脱脂奶粉、0.0001%FoamA以及0.01%W/V乙基汞硫代水杨酸钠的混合物加于500ml的PBS的溶液中阻断检测小孔以防止非特异的蛋白质连接。室温培养1小时后，培养皿以200μl/孔/生理盐水/T洗涤液洗涤三次。向每一孔里加含0.1%Tween 20和0.2%牛血清清蛋白混合物的PBS（PTB）溶液50μl。对培养板小孔中的上清液影印培养至相应的抗原小孔和参照培养板上（50μl/小孔），培养板于RT下培养30分钟。然后移出上清液，用生理盐水/T将培养板洗涤三次，再往每一孔中加50μl生物素的山羊抗人免疫球蛋白（Ig）（用PTB稀释至1∶250的TAG O＃ 9303040）。于RT下培养30分钟后移出生物素试剂，用生理盐水/T将小孔洗五次，再向每一孔中加入50μl预先制备的抗生物素蛋白：生物素的辣根过氧化物酶复合物（Vectastain ABC Kit，Vector实验室）。于RT下30分钟后将Vectastain ABC试剂移出，小孔用生理盐水/T洗涤五次，再往每一孔中加100μl的底物（0.8mg/ml邻一苯二胺二氢氯化物于100mM柠檬酸盐缓冲溶液，pH 5.0，并加有在培养板接种前刚以等体积比混合的0.03%H2O2去离子水溶液）。黑暗中培养30分钟后，再往每一孔加50μl 3N H2SO4以终止反应。采用Dynatech MR 580微量ELISA读数器于490nm下测量吸光度，以检测含有可与培养板上的细菌进行反应的抗体的培养物上清液。
六种转化的培养物上清液经上述方法分析后，鉴别出一种在大肠杆菌和粘质沙雷氏菌血清型培养板上具有活性的孔（7D7），它在参照培养板上没有活性。在随后用大肠杆菌血清型作的ELISA中，确定这个孔至少含有下列大肠杆菌血清型的抗体反应性：08（ATCC 23504）和075（ATCC12798），但不具有04、06：K2、08：K8、09：K9或022：K13（ATCC号依次为12791、19138、23501、23505和23517）的抗体反应性。此外，这个孔还有粘质沙雷氏菌血清型012、013和015的抗体反应性，但没有已知的二十种粘质沙雷氏菌中其它的LPS血清型的抗体反应性。
D.产生特异抗体细胞的克隆
将孔7D7中的细菌进行若干次（4）克隆，直到全部克隆上清液在上述ELISA中大肠杆菌血清型08和075及粘质沙雷氏菌血清型012、013和015呈阳性反应为止。表明任何一种克隆上清液反应模式产生分离的例子从未有过，这表明孔7D7的培养物上清液具有大肠杆菌和粘质沙雷氏菌血清型如前述的真正的属间交叉反应性，而且只含有一种细胞系（每一种都具有各自的血清型反应性）。在没有喂养细胞的情况下，圆底96孔培养板经有限稀释后进行克隆。培养基是由含15%V/VFBS、L-谷酰胺（2mM/l）、丙酮酸钠（1mM/l）、青霉素（100IU/ml）以及链霉素（100μg/ml）的Iscove培养基组成的。用每三天用新的培养基换掉一半上清液的办法喂养培养物一次。通常，在接种后2-3周内小孔中类淋巴母细胞的密度足够分析抗大肠杆菌和粘质沙雷氏菌血清型特异性。
因此，在本实验中完成了一种克隆转化的人细胞系，该细胞系是连续的（不死的），而且分泌一种抗大肠杆菌和排列在粘质沙雷氏菌血清型表面的决定基的人单克隆抗体。
在提出本专利申请之前，连续的且与7D7一样的转化的细胞系寄存于MD，Rockville的ATCC，寄存号为ATCC CRL 9009。
E.属间交叉反应性的进一步特征
来自克隆的7D7细胞系抗体借助于改进的常规免疫印迹法进一步测定了其属间交叉反应性。尤其是对肺炎杆菌、产气肠杆菌以及阴沟假单胞菌的交叉反应性进行了研究，方法如下：将细菌点在分格的硝化纤维素圆纸盘上，使含细菌的圆盘和所述抗体反应，再用碱性磷酯酶/氮蓝四唑酶体系使抗体反应显色。简而言之，在硝化纤维素纸盘（Schleicher和Schuell，37mm硝化纤维素圆盘，有格0.45μm）的每一格里点上10μl的细菌（OD660＝0.4）。每一圆盘通常能盛下60种不同的细菌样品。点过样品的圆盘须经空气干燥，在25%V/V异丙醇中固定30分钟，再在前述的ELISA中用脱脂干奶粉试剂阻断10分钟。阻断的圆盘每5分钟就用PBS/Tween20洗涤三次，再转移到35×10mm组织培养物皿的盖子上。向这个盖子中加入含上清液（1.0ml）的抗体。然后于RT下培养60分钟。再用PBS/Tween20每隔5分钟洗涤3次，于RT下60分钟的间隔内添加1-2ml的1∶1000稀释的（PBS）与山羊抗人免疫球蛋白（TAGO，Burlingame，CA）连接的碱性磷酯酶。如上述洗涤圆盘，并浸于如下制备的1-2ml新鲜的底物中，制备方法是：将16.5克的溴代-氯吲哚磷酸酯和8.5mg氮蓝四唑溶于50ml碱性磷酯酶缓冲液中的具有0.1M NaCl和5mM MgCl2的0.1M Tris-HCl，pH9.5中。将溶液，置于黑暗处，使用前进行过滤。在合适的颜色出现以后（10-15分钟）通过用数批蒸馏水冲洗圆盘以终止反应。显色的圆盘干燥后可以储藏。
圆盘中含有：50个荚膜型肺炎杆菌参照株，该菌株来自WA，Seattle，华盛顿大学生物病理学系Dr.George Kenney处和ATCC，4株产气肠杆菌临床血液离析物和6株阴沟假单胞菌临床血液离析物（血液离析物来自WA，Seattle，Harborview医院）。用23种标准生化测试API20E（API Analytab产品，Plainview，NY）使肠杆菌离析物定型（即确定菌种）。该法能鉴别革兰氏阴性细菌的属和种，但不能确定血清型。因此，肠杆菌与大肠杆菌、粘质沙雷氏菌和肺炎杆菌不同，未能鉴定出其血清型，而只鉴定出属和种。
根据这些试验，观察到7D7抗体具有进一步的属间交叉反应性。这种抗体和下列血清型反应：
肺炎杆菌 大肠杆菌 粘质沙雷氏菌 产气肠杆菌
K14、57、60 08、75 012、13、15 临床分离物
因此，观察到人单克隆抗体7D7具有对属于大肠杆菌、粘质沙雷氏菌、肺炎杆菌、产气肠杆菌的菌株具有属间交叉反应性，而与属于阴沟假单胞菌的则没有。
F.单克隆抗体的特征
单克隆抗体可与一些不同的细菌属进行交叉反应这一发现，暗示该抗体能够抗一种共有的蛋白质或糖。已发现这两种分子能够解释属间交叉反应（Mutharia，L.和Hancock，R.E.W.，“绿脓杆菌Porin蛋白质下的两个表面抗原位点的特征”Canadian J.of Microbiol.，31∶381-386 1985;Orskov F.和Orskov，I.，“大肠杆菌的血清型”Methods in Microbiology，Vol.14，Bergan，T.，ed.Academic Press，Orlando，FL，43-112，1984）。
7D7抗体识别的分子的生化特征是借助于免疫印迹分析确定的。简单地说，由20ml过夜的肉汤培养基（大肠杆菌、粘质沙雷氏菌和产气肠杆菌血清型）或过夜生长的培养平板（肺炎杆菌）中得到的洗涤过的细菌，用含有64ml 50mM Tris pH7.6，30ml甘油，0.3g脱氧胆酸钠，0.14ml β-巯基乙醇和6ml去离子水的溶液1.0ml（Schechter，I.和Block，K.，“反式-Formesyl焦磷酸一角鲨烯合成酶的溶解和纯化”，JBC，246∶7690-7696，1971）进行提取。4℃下培养18小时后，悬浮液以10，000xg离心10分钟，取出上清液再以Bio-Rad蛋白质测定法（Bio-Rad实验室，Richmond，CA）定量蛋白质。每种细菌的100-1000ng的蛋白质（依每种细菌提取物而异进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Kusecek，B.，等，“作为01、07、016、018或075和K1、K5或K100大肠杆菌的Virulence因子的脂多糖、荚膜和繖，Infection and Immunity，43∶368-379 1984）。如其它文献中所述（Towbin，H.等，“自聚丙烯酰胺凝胶电泳转移蛋白质至硝化纤维素板：程序及应用”，Proc.Natl.Acad、Sci.，76∶4350-4354，1979）将分离的分子从凝胶上转移到硝化纤维素膜上（NCM），然后将NCM印迹用PBS-Tween（Batteiger，B.等，“Tween 20作为阻断剂在转移至硝化纤维膜的蛋白质免疫检测中的应用”，J.Immunol.Meth.，55∶297-307，1982）阻断1小时。印迹于RT下在10ml用过的7D7系培养基上清液中培养1小时。随后用PBS-Tween每隔5分钟冲洗4次，印迹在与碱性磷酯酶连接的山羊抗人的IgG中培养，并且按本文所述的细菌-硝化纤维素圆盘测定法显色。含本文所述脱氧胆酸盐细菌提取物的所有印迹呈阳性反应。在这些印迹中，7D7抗体看来好象是识别一系列规则排列的分子实体而导致出现梯状的免疫印迹。这种形状与在SDS存在下LPS的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果完全一致，因此证明，谱带的形状大小不均匀是由于分子量增长不同的一组LPS分子所致，每个分子中的O一抗原低聚糖侧链单位数不同（Palva，E.T.和Makela，P.H.，“用SDS-PAGE分析鼠伤寒沙门氏菌中脂多糖的不均一性”，Eur.J.Biochem.，107∶137-143，1980;Goldman，R.C.和Leive，L.，“大肠杆菌0111和鼠伤寒沙门氏菌LT2的脂多糖中抗原侧链长度的不均一性”，Eur.J.Biochem.，107∶137-143-154，1980）。这些数据表明，单克隆抗体7D7专一于大肠杆菌、粘质沙雷氏菌、肺炎杆菌及产气肠杆菌血清型LPS分子中所共有的抗原决定基。
为了进一步确定抗原分子的性质，在进行电泳之前，用水解蛋白的蛋白酶K（Eberling，W.等，“来自Tritirachium album Limber的蛋白酶K”，Eur.J.Biochem.，47∶91-97，1974）处理脱氧胆酸盐提取物。为了制备样品，将1.0μg样品蛋白和混合物在60分钟内加热至65℃。将样品如本文所述进行电泳和免疫印迹检测。蛋白酶K处理之后观察到的免疫印迹图型与未经处理的图型是一样的，因此表明与7D7抗体进行反应的抗原其本质不是蛋白质。
具体地谈到7D7是否与糖抗原决定基反应，在硝化纤维素纸与抗体反应之前，电转移的脱氧胆酸盐样品需经适度的高碘酸盐的氧化。此反应破坏糖抗原决定基，并因此破坏它们与抗体的反应性，但不破坏蛋白质或类脂抗原决定基（Woodward，M.P.等，“用高碘酸盐氧化对专业于糖抗原决定基的单克隆抗体的检测”，J.of Im-munol.Methods，78∶143-153，1985）。总之，在含有电泳样品的电印迹硝化纤维素纸用PBS-Tween如前述阻断之后，将该纤维纸用50mM乙酰乙酸钠pH4.5的缓冲液冲洗。硝化纤维素纸于50mM高碘酸的乙酸缓冲液中、黑暗及RT下培养60分钟。处理过的纸用PBS-Tween冲洗三次再按本文所述与抗体反应。用这种方法处理过的电印迹的脱氧胆酸盐提取物不再与7D7单克隆抗体发生反应。这些证据有力地表明这种抗体识别的抗原决定基是本文所述细菌LPS分子上的糖。
7D7单克隆抗体的同型物是用与上述专一性实验相同的ELISA方法测定的，不同的是，用生物素的山羊抗人IgG（P链特异的，TAGO）或生物素的山羊抗人IgM（μ链特异的，TAGO）代替反应性更广泛的生物素山羊抗人Ig的第二试剂。两种试剂使用时稀释1∶500，而且抗原培养板含有免疫的大肠杆菌08和075菌株的PLL库。7D7单克隆抗体与大肠杆菌株的正反应只有用抗IgM试剂才能观察到，表明单克隆抗体IgM的同型物。本领域的普通专业人员都清楚，假若上述方法重复数遍，并因此确定了所得到的属间交叉反应的单克隆抗体的同型物，人们则会发现其它的同型物如IgM和IgG（Frosch，M.等，“用于生产弱细菌抗原单克隆抗体的NZB鼠体系：专一于大肠杆菌K1和Grop Meningocci聚糖荚膜IgG抗体的分离”，Proc Natl.Acad.Sci.，82∶1194-1198，1985）。
G.离体活性
7D7单克隆抗体的离体功能活性是用离体调理噬菌作用测定法检测的，该法将人嗜中性白细胞和人补体两者存在和不存在下的抗体杀菌活性进行了对比。
细菌的制备既可采用对50μl过夜肉汤培养基（对大肠杆菌、粘质沙雷氏菌和产气肠杆菌或肺炎杆菌）的10ml胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）接种，也可在盛有Worfel-Ferguson琼脂的培养皿上划线培养。对于肉汤培养基，试管于37℃下在振荡机上培养3小时，每次取1.5ml的培养基以10，000xg离心1分钟，弃掉用过的培养基，再将沉淀悬浮于3.5ml含0.1%明胶和5mMHEPES （HBSS/凝胶）的用Hank平衡过的盐溶液中。对于在明胶培养皿上生长的细菌，将刮下的菌落涂在无菌的HBSS/凝胶上。采用测量OD660和适当稀释（大约1∶50，000）两种方法，将两种条件下生长的细菌浓度调整在3×103个细菌/ml的水平上。按照进行了某些改进的Van Furth和Van Zwet的方法（“离体测定多形核和单核巨噬细胞的吞噬作用和细胞内致死作用”，《实验免疫学手册》，Vol.2，D.M.Weired.，第二版，Blackwell科学出版社，Oxford，36.1-36.24，1973）分离人嗜中性白细胞。将10ml含肝素的血液的淡黄色外膜铺的Ficoll-Pague上面然后离心。红血球细胞（RBC）用RPMI1640培养基洗涤一次并悬浮于等体积的37℃PBS中。将3ml这种悬浮液加到6ml2%葡聚糖（于37℃PBS中）中，使内容物慢慢但充分地来回颠倒混合。于37℃下保温20分钟后使RBC沉淀，取出上清液（含嗜中性白细胞），用4℃的PBS洗涤两次，一旦在HBSS/凝胶中后，就立刻悬浮于同种介质中，使其浓度达到5×107个嗜中性白细胞/ml。为了得到和大肠杆菌及粘质沙雷氏菌一起使用的补体源，用相应于本测定法所用的有机体的活细菌库对人血清吸附两次（Bjornson，A、B.和Michael，J.G.，“促进绿脓杆菌吞噬作用的人血清因子I.调理素与细菌的相互作用”，J.of Inf.Dis.，130 Suppl：S119-S126，1974）。这种血清用煮沸过的酵母聚糖（Bjornson，见上）进一步吸附，以除去血清成分备解素，这是一种另外的补体活化途经所必需的分子。在使用肺炎杆菌和产气肠杆菌的调理噬菌作用测定法中，补体源是未被吸附的普通人血清，其最终使用浓度为1%。
制备用于定量存活/破坏细菌数的培养皿的第一步是将24孔培养皿于37℃下温热3-5小时。制备0.4%琼脂糖的TSB溶液采用的方法是将混合物于高压蒸气下处理5分钟，然后使其在水浴中冷却至50℃。在调理噬菌作用测定中，最终保温期结束前大约15分钟，将一个24孔培养平板从37℃的保温箱中取出来，放置于一块42℃的热培养平板上，并向每一小孔中加0.4ml的TSB/琼脂糖。该平板立即拿回到37℃的保温箱，以保证琼脂不会冷至37℃以下。
为了进行测定，25μl的7D7培养基上清液和25μl合适的细菌株一式两份加到96孔圆底微量滴定板上并于RT下保温30分钟。随后加入15μl人补体、15μl人嗜中性白细胞（5×106/ml）、以及70μlHBSS/凝胶。培养皿的整个表面都要用无菌棉花签擦洗，为了确实盖住整个培养皿和孔内区域，使用了粘性塑料培养皿封闭器，然后使该培养皿于37℃下旋转1小时。保温后，以转速100xg离心5分钟，将培养皿封闭器慢慢拿开，并用浸过70%乙醇的无菌棉签擦试培养皿表面使其干燥。从每一个微量滴定孔中取出50μl，然后加到24孔定量平板的各个孔里，该板每孔含有0.4ml融熔的（38-40℃）0.4%TSB/琼脂糖。将这些平板于平板振荡器上以150RPM放置1分钟，再使琼脂糖于RT下硬化15分钟。最后，往每孔加入0.4mlTSB/琼脂糖覆盖层，随之于4℃下使其硬化15分钟，再于37℃下使平板保温过夜。18小时后对菌落计数并将该数据作为每一条件下的菌落形成单位（CFU）。
用于本文中的细菌血清型，除肺炎杆菌外，在7D7单克隆抗体、活性补体源、以及人嗜中性白细胞存在下都是没有活性的（表1）。当用一些非7D7反应性细菌血清型重复这些实验时，未观察到细菌的分解作用（数据未列出），因此证实了单克隆抗体7D7的功能特异性及其调理细菌促进其吞噬作用的能力。由于调理素（特异抗体）和多形核白细胞（嗜中性白细胞）的复合作用似乎是这些细菌株免疫性的主要机理，这些数据暗示抗体7D7，在适当引入机体后，能够预防本文所述的细菌血清型导致的致死性疾病。
表1
细菌 嗜中性 抗 补 输入细菌的破坏
白细胞 体 体 %
大肠杆菌08、075 + 7D7 -a0
大肠杆菌08、075 + 6F11b+ 0
大肠杆菌08、075 - 7D7 + 0
大肠杆菌08、075 + 7D7 + 85%
粘质沙雷氏菌012、015 + 7D7 - 0
粘质沙雷氏菌012、015 + 6F11 + 0
粘质沙雷氏菌012、015 - 7D7 + 0
粘质沙雷氏菌012、015 + 7D7 + 85%
产气肠杆菌离析物（2） + 7D7 - 0
产气肠杆菌离析物（2） + 6F11 + 0
产气肠杆菌离析物（2） - 7D7 + 0
产气肠杆菌离析物（2） + 7D7 + 85%
a：（-）＝热失活（56℃下30分钟）的人补体。
b：（6F11）＝含Fisher2型绿脓杆菌的IgM人单克隆抗体的培养基上清液。
H.体内活性
为了检验上述假设，用7D7抗体及本文所述的大肠杆菌和产气肠杆菌中至少一种的生物完成了动物保护研究。7D7和阴性对照（6F11，专一于Fisher2型绿脓杆菌的人IgM单克隆抗体）抗体用固体硫酸铵（最终浓度为50%）沉淀法从用过的培养基上清液中首先浓缩出来（Good，A.J。等“免疫球蛋白及其片段的纯化”，《细胞免疫学的选择方法》，Mishell，B.B.和Shiigl，S.M.ed.，W.H.Freeman and Company，San Francis-co，CA，1980，279-286）。使沉淀物再溶于无菌水中，并在PBS中彻底地进行透析。
在硫酸铵沉淀物中的IgM抗体以亲和层析法在鼠单克隆抗体IgM抗体亲和柱中进行纯化。为了制备这种柱，将用1克脱水溴化氢活化的琼脂糖凝胶4B（Pharmacia）与15ml冰冷的1mM HCl蒸馏水溶液混合。水合凝胶用30ml偶合缓冲液（0.1M碳酸盐（NaHCO3）在0.5MNaCl中，pH8.2）洗涤，沥干成湿块后与铵盐沉淀物一起溶于1-3ml的偶合缓冲溶液中。凝胶悬浮液于RT下来回颠倒混合2小时，随后以200xg离心5分钟。为了阻断仍可能存在的反应位点，除去上清液，往凝胶中添加10ml的/M乙醇胺，并如上述继续混合。该悬浮液以200xg离心5分钟之后弃去上清液。为了制备使用的凝胶，用0.1M乙酸盐/生理盐水缓冲液（6.8g三水乙酸钠和14.6g NaCl溶于含2.9ml冰乙酸的500ml蒸馏水中，pH4.0洗涤一次，用偶合缓冲液洗涤二次，再用PBS洗涤两次。凝胶倒入Pharmacia C10/10柱于4℃下储藏备用。
为了纯化免疫球蛋白，将0.5ml盐分离的原料以PBS稀释至2.0ml，并加到亲和柱中。装上样品后，再用pH8.0的PBS冲洗柱子直到吸收监测仪指出在流过柱子的液流中不再含有蛋白质时为止。结合的抗体用2M MgCl2的PBS洗脱，用OD280确定每个组份中的蛋白质浓度，将峰值组分集中起来。含抗体的组分在G-25Sephadex柱上脱盐，如果需要的话，通过微量浓缩离心（Cen-tricon 30，Amicon Corp.）使其浓缩至1-2mg/ml。最后的制剂用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯度，然后进行蛋白质的硝酸银染色（Morrissey，J.H.，“聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的银染色：一种提高均匀灵敏性的改进方法”，Anal.Biochem.，1981，117∶307-310），再用ELISA法按本文所述检验抗体活性。
为了测定每一种细菌的攻击，将体重在20-22g的远东繁殖的Swiss-Webster雌鼠分成三组，每组10只，一个有代表性的实验如下进行：
组 细菌 抗体
A 大肠杆菌08 7D7
B 大肠杆菌08 6F11
C 粘质沙雷氏菌014 7D7
接受抗体的每一组都静脉注射含25μg纯化抗体的无菌PBS 200μl。2小时后，向所有动物的腹膜内注射3倍于各自菌株LD50的活菌300μl，细菌悬浮液是从处于对数生长期的肉汤培养基中制备的，由悬浮液离心出细菌，用PBS洗涤两次，再重悬浮于合适浓度的PBS中。观察动物5天。在B组（无关抗体）和C组（无关有机体）中的所有动物受攻击后24-48小时均死去。相反，那些接受7D7（A组）抗体的动物全都活着无症状。
这一动物保护模式证实了7D7抗体有抗本文所述属于3个属的有机体细菌攻击的治疗效果。有关数据列于表2。
表2
攻击细菌 抗体 存活/攻击 存活率%
大肠杆菌08 7D7 10/10 100
大肠杆菌08 6F11a0/10 0
粘质沙雷氏菌014b7D7 0/10 0
a：6F11抗体是专一于Fisher 2型阴沟假单胞菌的，它作为阳性对照抗体。
b：粘质沙雷氏菌014不与7D7抗体反应而作为非特异的对照有机体。
表2a
存活率%c
抗体 日
0 1 2 3 4
6F11 12 2 2 1 1
7D7 12 10 6 4 4
c：采用如下述注射环磷酰胺的方法进行小鼠嗜血性白细胞减少症的LD50和保护研究：第0天-150mg/kg，第二天-50mg/kg。第4天小鼠接受抗体和本文所述的细菌。
这些数据表明人单克隆抗体7D7能保护小鼠免遭三个不同属的革兰氏阴性细菌的致死性攻击。因为7D7能和LPS上的糖抗原决定基反应，但肺炎杆菌上的LPS分子却不易靠近（Orskov，I.和Orskov，F.，“克雷伯氏菌的血清型”，Method inMicrobiology，Vol.14，Bergan，T.，Ed.，Academic Press，Orlando，FL 1984，143-146），7D7抗体不一定能对肺炎杆菌的感染起保护作用（数据未列出）。然而，具有属间交叉反应性的人单克隆抗体7D7以25μg的纯化量即能提供保护以防止属于革兰氏阴性细菌的大肠杆菌和产气肠杆菌的有机体的感染。
实例2
实例2说明了生产和选择对粘质沙雷氏菌、肺炎杆菌和产气肠杆菌具有属间交叉反应性的人单克隆抗体的方法。而且这一实例表明上述抗体对同系的粘质沙雷氏菌、肺炎杆菌和产气肠杆菌血清型具有体外的调理活性。除了为表征和检测此实例中描述的抗体而有必要作某些特定的改进外，本实例将重复实例1的程序（基本上如A至G部分所述）以制备对于本文所述的细菌引起的感染产生交叉保护作用的人单克隆抗体。下面即是测定程序中的一些改变及用本文所述的单克隆抗体得到的结果。
1、通过六种转化得到的培养物上清液用上述方法进行分析，结果证实在粘质沙雷氏菌血清型平板上有一个具活性的小孔（4F10），但在大肠杆菌或对照平板上没有。接着用ELISA对于单独的粘质沙雷氏菌血清型进行了测定，这种小孔含有可与粘质沙雷氏菌血清型015和018进行反应的抗体，但没有与任何其它二十种已知的粘质沙雷氏菌LPS血清型反应的抗体。
在本专利申请之前，称为4F10的连续转化的人细胞系保藏在ATCC，保藏号为ATCC CRL9007。
2、测定了来自克隆的4F10细胞系抗体的进一步的属间交叉反应性，测定是由改进的标准免疫印迹技术进行的。特别是对于肺炎杆菌、产气肠杆菌和阴沟肠杆菌的交叉反应性进行了研究，该研究是将细菌点在分格的硝化纤维素纸盘上进行的，使含有细菌的盘与上述抗体反应，并用碱性磷酯酶/氮蓝四唑酶体系对抗体反应显色。
从这些实验观察到了4F10抗体具有进一步的属间交叉反应性。这种抗体与以下血清型反应：
肺炎杆菌 粘质沙雷氏菌 产气肠杆菌
K3、12、29、31、68、72 015、18 临床分离物
因此，人单克隆抗体4F10对属于粘质沙雷氏菌、肺炎杆菌、产气肠杆菌的细菌具有属间交叉反应性。
3.利用免疫印迹技术，在含有本文所述细菌的脱氧胆酸盐提取物的所有印迹中都记录到了阳性反应。在这些印迹中，4F10抗体似乎能识别一个较宽的组分带或是一系列规则排列的分子实体，从而产生梯状印迹。此图型与在糖部分的聚丙烯酰胺凝胶的电泳分析中看到的完全一致，这种糖分子的电泳分析表明由于特定糖序列的反复重复而使分子量有很大差异，或是由于LPS分子重量增加的不同，这种增加相应于每个分子的O-抗原的低聚糖侧链单元的数目（Vimr E.R.，等，“利用原核的衍生探查物在新生神经元薄膜中鉴定多形核白细胞（唾液酸）”Proc.Natl.Acad.Sci.（1983）81∶1971-1975;Holden K.G.等，“粘液糖蛋白的凝胶电泳I.凝胶孔隙率的作用”，Biochemistry（1971）10.3105-3109），这些数据表明单克隆抗体4F10是专一于由粘质沙雷氏菌、肺炎杆菌和产气肠杆菌的某些血清型的糖分子所共有的一种抗原决定基。
在蛋白酶K处理后观察到的免疫印迹图型和没有经过处理观察到的的图型是一致的，因此表明可与4F10抗体反应的抗原其实质不是蛋白质。
为了具体明确4F10是否与糖抗原决定其反应，在硝化纤维纸与抗体反应之前，使电转移的脱氧胆酸盐样品经受温和的高碘酸盐氧化。照这样处理过的脱氧胆酸盐提取物的电印迹不再与4F10单克隆抗体发生反应。这些数据有力地表明这种抗体识别的抗原决定基存在于本文描述的细菌所具有的分子中的糖部分。
4.4F10单克隆抗体的同型物用类似于实例1所述的专一性检测的ELISA程序测定了，不同的是，抗原板含有一个固定的粘质沙雷氏菌015和018血清型的PLL库。4F10单克隆抗体与粘质沙雷氏菌血清型的阳性反应仅仅在用IgM试剂时观察到了，表明单克隆抗体的一种IgM同型物。精通本技术的人将会知道，如果把本实例的程序重复几次，并且测定得到的具有属间交叉反应性的单克隆抗体的同型物，将会得到另外的同型物，例如IgM和IgG同型物。
5.4F10单克隆抗体的体外功能活性，在调理噬菌的测试中进行了研究。该测试是在人的嗜中性白细胞和人的补体都存在和不存在的条件下对该抗体的杀菌活性进行比较。
这里利用的细菌血清型只是在单克隆抗体4F10、活性补体源和人的嗜中性白细胞存在的条件下才会失活（表3）。当这个实验用几个非4F10反应性细菌的血清型进行重复时，没有观察到细菌破坏（数据没有给出），因此表明单克隆抗体4F10功能的专一性和它调理细菌和促进其噬菌作用的能力。
表3
嗜中性 输入细菌的
细菌 抗体 补体
白细胞 破坏 %
粘质沙雷氏菌018和015 + 7D7 -a0
粘质沙雷氏菌018和015 + 6F11b+ 0
粘质沙雷氏菌018和015 - 7D7 + 0
粘质沙雷氏菌018和015 + 7D7 + 85%
肺炎杆菌K3和K12 + 7D7 - 0
肺炎杆菌K3和K12 + 6F11 + 0
肺炎杆菌K3和K12 - 7D7 + 0
肺炎杆菌K3和K12 + 7D7 + 60%
产气肠杆菌分离物（2） + 7D7 - 0
产气肠杆菌分离物（2） + 6F11 + 0
产气肠杆菌分离物（2） - 7D7 + 0
产气肠杆菌分离物（2） + 7D7 + 85%
a：（-）＝加热失活的（50℃下30分钟）人补体。
b：（6F11）＝含有Fisher2型绿脓杆菌的IgM人单克隆抗体的培养物上清液。
实例3
实例3表明生产人单克隆抗体的方法，这种单克隆抗体对于K1型荚膜大肠杆菌和B组脑膜炎双球菌多糖都具有反应活性，而且进一步表明上述抗体在体内对同系的大肠杆菌和脑膜炎双球菌的致死性攻击的保护活性。除了需要作某些改进以表征和检测实例1中所述的抗体之外，本实例将重复实例1的方法（基本上如A至G部分所述）以制备对于本文所述细菌引起的感染具有交叉保护作用的人单克隆抗体。下面即是对实例1的方法作的一些改变和用本文所述的单克隆抗体在分析中得到的结果。
1.通过五种转化得到的培养物上清液用上述方法进行了分析，结果鉴别出四种小孔（5D4、2C10、9B10和8A8）在大肠杆菌血清型平板上含有抗大肠杆菌的专一性，但在粘质沙雷氏菌或对照平板上没有。接着用上述ELISA法对单独的大肠杆菌血清型进行了测定，这些小孔至少对于大肠杆菌血清型01（ATCC23499）、07：K1（ATCC12792）、016：K1（ATCC23511）和050（CDC1113-83）具有抗体反应性，但对04（ATCC12792）、06：K2（ATCC19138）、08：K8（ATCC23501）、09：K9（ATCC23505）或022：K13（ATCC23517）没有抗体反应性。由于9B10单克隆抗体在克隆过程中和增加抗体产量方面具有较好的性能，因此选它用作进一步的分析。
在本专利申请之前，称为9B10的连续转化的人细胞系保藏在ATCC，保藏号为ATCC CRL 9006。
2.由每种克隆所得到的单克隆抗体能与大肠杆菌O-抗原血清型的相同基团进行反应的发现，表明这些抗体专一于这些血清型所共有的细菌表面结构。用几种方法来确定这些大肠杆菌血清型所共有的表面结构。如前所述，由9B10抗体鉴定的四种大肠杆菌中的二种（07：K1和016：K1）具有K1荚膜血清型，而另外的二种（01和050）不是K抗原血清型的。因此，对K1抗原具有反应性的9B10抗体和具有O-抗原血清型01和050的大肠杆菌菌株也具有K1荚膜血清型的可能性进行了研究。
曾有人利用K1荚膜的不耐热性以证实它的存在。在100℃的沸腾水浴上加热K1阳性的大肠杆菌血清型60分钟，以除去这些菌株与抗K1血清型反应的能力并增强它们与抗O抗原血清型反应的能力（Orskov，F.和Orskov，I.，“大肠杆菌的血清型”in Methods in Microbiology，Vol.14，T.Bergan ed.，Academic Press，London（1984）PP.44-105）。沸腾的交互影响很可能是由于荚膜的脱除和增加了抗体对脂多糖（LPS）分子的可达性。将大肠杆菌K1阳性的血清型（07和016）和非K1型的血清型（01和050）如上所述进行加热，并在ELISA中与9B10抗体和LPS血清型特异的异种血清（Difco Bacto-E.Coli Typing Reagents）反应。加热处理过的机体损失了对9B10抗体的所有反应性并增加了它们与其同系的LPS血清型特异血清的反应性，而没有处理过的（对照）机体保持有与9B10培养物上清液的强有力的反应性能，并与其相应的LPS血清型特异的抗血清只保持有微弱的反应。
来自B组脑膜炎双球菌的多糖（碳水化合物）（唾液酸，2，8-连接的多-N-乙酰神经氨糖酸的均聚物）被证明在化学性质和抗原方面与大肠杆菌K1多糖是同种的（Grados，O.和Ewing，W.H.，“大肠杆菌和脑膜炎双球菌之间的关系”J.Immunol.（1973）110 262-268）。这些证据暗示如果9B10单克隆抗体对大肠杆菌K1荚膜含有专一性，那么该抗体对B组脑膜炎双球菌多糖也应有专一性，并进而对于具有K1荚膜的大肠杆菌菌株也应表现出反应性。进行了两个实验，这两个实验是（1）9B10抗体与脑膜炎双球菌反应的性能试验，（2）抗B组脑膜炎双球菌多糖的抗体与四种大肠杆菌9B10反应活性血清型进行反应的能力的试验。
使高度纯化的B组多糖（Connaught Laboratories，Toronto，Canada）和活的B组脑膜炎双球菌与9B10抗体用上述的ELISA方法进行反应。9B10单克隆抗体能与两种抗原的制备物发生强烈的反应。为了证明转化专一性，使用一种市售可得的B组脑膜炎双球菌脑膜炎测试箱（“Directagen”Direct Antigen Detection System，Hynson，Westcott，and Dunning，Beltimore，MD），该测试箱利用鼠单克隆抗体包膜B组多糖的乳球。在利用9B10阳性的大肠杆菌血清型的凝集作用测定中，所有四种血清型在这种试验系统中也是阴性的。总的说来，这些数据表明9B10单克隆抗体对于大肠杆菌K1荚膜和B组脑膜炎双球菌上的特异糖具有反应性。此外，因为这些检测可用完整的活细菌来完成，所以可以推论单克隆抗体9B10对于多唾液酸分子暴露在外的某些部分是有特异性的。
3.9B10单克隆抗体的同型物用类似于实例1中的专一性测试的ELISA进行了测定，不同的是，抗原平板含有固定的大肠杆菌K1阳性血清型的PLL库。只是用抗IgM试剂时观察到了9B10单克隆抗体对于K1阳性大肠杆菌血清型的阳性反应，表明了单克隆抗体的一种IgM同型物。熟练技术人员知道，如果本实例方法被重复几次，并且测定由此得到的K1特异性的单克隆抗体的同型物，将会发现另外的同型物，例如IgM和IgG同型物。
4.9B10单克隆抗体的体外功能活性在调理噬菌检测中进行了研究，该检测是在人的嗜中性白细胞和人的补体都存在和不存在的条件下，对该抗体的杀菌活性进行比较。
K1阳性大肠杆菌血清型只是在单克隆抗体9B10、活性补体源和人的嗜中性白细胞都存在的条件下才失活（表4）。当这个实验用几个K1阴性大肠杆菌血清型进行重复时，没有观察到细菌破坏（数据未列出），因此表明了单克隆抗体9B10的K1专一性和表明它对于调理细菌的能力和促进其噬菌作用的能力。因此调理素（特异抗体）和多形核白细胞（嗜中性白细胞）的结合作用可以认为是K1阳性大肠杆菌血清型免疫性的主要机理，这些数据暗示适当地施用抗体9B10，将对于任何具荚膜的大肠杆菌K1血清型的致死性攻击提供保护，不论它的O-抗原血清型如何。
表4
嗜中性 输入细菌的
细菌 抗体 补体
白细胞 破坏 %
大肠杆菌01：K1和018：K1 + 9B10 -a0
大肠杆菌01：K1和018：K1 + 6F11b+ 0
大肠杆菌01：K1和018：K1 - 9B10 + 0
大肠杆菌01：K1和018：K1 + 9B10 + 99%
B组脑膜炎双球菌 + 9B10 - 0
B组脑膜炎双球菌 + 6F11 + 0
B组脑膜炎双球菌 - 9B10 + 0
B组脑膜炎双球菌 + 9B10 + 99%
a：（-）＝加热失活的（50℃30分钟）人补体。
b：（6F11）＝含有Fisher2型绿脓杆菌的IgM人单克隆抗体的培养物上清液。
5.为了检验上述假定，用9B10抗体和几种K1阳性和K1阴性大肠杆菌血清型以及B组脑膜炎双球菌血清型（菌株H313，来自食品和药物局生物学部Dr.Carl Frasch细菌多糖实验室，Bethesda，MD）进行了动物保护研究。
对于每一种细菌的攻击，将远系繁殖的重量在20-22g之间的Swiss-Webster雌鼠分成三组，每组各为10只鼠。代表性的实验如下所述进行：
组 细菌 抗体
A 大肠杆菌K1 9B10
B 大肠杆菌K1 6F11
C 大肠杆菌K2 9B10
将含有25μg纯抗体的200μl无菌的PBS通过静脉注射注入接受抗体的每一组鼠中。2小时后，对所有动物用300μl含3倍于各自细菌LD50的活细菌在腹膜内进行攻击。细菌悬浮液从对数生长期的肉汤培养物来制备，将其中的细菌离心，用PBS洗涤二次，用PBS使之重新悬浮成适当浓度。对动物进行5天观察。在攻击24-48小时之后，B组（无关抗体）和C组（无关生物体）的全部动物死去。相反，接受9B10（A组）抗体的那些动物全部活着而且没有症状。
这种动物保护模式可表明9B10抗体对于用本文所述的二种细菌的攻击具有治疗效果。这些数据列于表5中。
表5
攻击细菌 抗体 存活/攻击 存活 %
大肠杆菌K1 9B10 10/10 100%
大肠杆菌K1 6F11a0/10 0%
大肠杆菌K2b9B10 0/10 0%
B组脑膜炎双球菌 9B10 5/5 100%
B组脑膜炎双球菌 6F11 0/5 0%
大肠杆菌K2 9B10 0/5 0%
a：6F11抗体对于Fisher2型绿脓杆菌是特异性的，并用作阴性对照抗体。
b：大肠杆菌K2是不与9B10抗体反应的，并用作非特异的对照生物。
这些数据表明人单克隆抗体9B10能够保护鼠类免于受到二种不同的革兰氏阴性细菌的致死性攻击。属间交叉保护抗体对属于革兰氏阴性细菌的大肠杆菌和B组脑膜炎双球菌生物所引起的感染能够起到被动的保护作用。
实例4
实例4表明对大肠杆菌、阴沟肠杆菌和B组链球菌具有属间交叉反应性的人单克隆抗体的生产方法。此外，本实例还说明了能与两大类主要细菌发生交叉反应的抗体，即革兰氏阴性（大肠杆菌和阴沟肠杆菌）以及革兰氏阳性（B组链球菌）细菌。本实例进一步表明了上述抗体对同系的大肠杆菌和B组链球菌血清型的致死性攻击在体内的保护活性。除了需要对实例1中的方法作某些改进以表征和检测该实例中所述的抗体之外，本实例将重复实例1的程序（基本上如A至G部分所述），以生产对于本文所述的细菌引起的感染产生交叉保护作用的人单克隆抗体，
1.利用实例1中所描述的酶联免疫吸附测定法（ELISA），从上清液中筛选抗B组链球菌的抗体，抗原平板由一系列平底96孔免疫2型微量滴定板组成。这些小孔中含有固定在小孔表面的B组荚膜型链球菌和多-L-赖氨酸（PLL）的混合物。在筛选中使用的各种平板包括：（1）B组链球菌Ia型（ATCC NO 12400）、Ib型（ATCC12401）、Ic型（ATCC27591）的混合物;（2）Ⅱ型（ATCC12973）和Ⅲ型（从西雅图儿童矫形医院传染病科的C.Wilson博士处得到的临床分离物）的混合物;和（3）没有细菌的微量滴定板。
由二种转化得到的培养物上清液用上述方法进行分析，结果在两种B组链球菌平板上鉴别出一个具有活性的小孔（4B9），但在对照平板上没有。接着用ELISA方法对单独的B组链球菌型作了测定，这个小孔含有可与所有五种参照型菌株发生反应的抗体。
因此，从这个实验中得到了一种克隆转化的人细胞系，该细胞系是连续的（不死的），并分泌一种专一于前述B组链球菌型表面上的决定基的人单克隆抗体。
在本专利申请之前，称为4B9的连续转化的人细胞系保藏在ATCC，保藏号为ATCC CRL 9008。
2.来自克隆的4B9细胞系的抗体用改进的标准免疫印迹技术，对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的交叉反应性进行了检测。具体地说，通过将细菌点在分格的硝化纤维素纸盘上研究了对大肠杆菌、肺炎杆菌、粘质沙雷氏菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、流感嗜血杆菌和金黄色酿脓葡萄球菌的交叉反应性，使含这些细菌的纸盘与上述抗体反应，并用碱性磷酯酶/氮蓝四唑酶体系对抗体反应显色（如实例1所述）。
从这些实验观察到4B9抗体对于特定的革兰氏阴性菌种具有交叉反应性。此抗体可与大肠杆菌LPS血清型04、07、018和025以及阴沟肠杆菌的临床分离物进行反应。因此，人单克隆抗体4B9在属于大肠杆菌、阴沟肠杆菌和B组链球菌的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌之间具有属间交叉反应性。
单克隆抗体可与几种不同属的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌发生交叉反应的发现，暗示了抗体是专一于共有的蛋白质或糖的。4B9抗体识别的分子的生化特征通过免疫印迹分析进行了确定。对于革兰氏阴性属的分析，将洗涤过的细菌如实例1用脱氧胆酸盐提取。对于革兰氏阳性细菌，将在改进的Todd-Hewitt肉汤中（D：fco，Todd-Hewitt肉汤含有2.8g/l无水磷酸钠，pH7.8）并在37℃下培养36小时的1.0l细菌，通过离心分离并用PBS洗涤3次进行收集。将细菌重新悬浮在85ml原生质体培养基（40%蔗糖W/V、0.03M磷酸钾缓冲液，pH6.8，10mMMgCl2）中并将该悬浮液加热到37℃10分钟。加入大约3，000单位的变熔菌素（Sigma），并将该混合物在37℃振动90分钟，或直到悬浮液的OD660减少90%以上为止。消化过的物质以2000xg在RT下离心15分钟，上清液在PBS中透析48小时（Young，M.K.和Mattingly，S.J.“通过原生质体Ⅲ型B组链球菌生物合成细胞壁肽聚糖和多糖抗原”J.Bact.，（1983）154∶211-220），用PM-10滤器（Amicon Corp.，Danvers，MA）经过正压透析将透析液浓缩10倍。
与小麦胚芽凝集素结合的糖通过亲和层析在小麦胚芽外源凝集素琼脂糖6MB柱（Sigma）上被纯化。这里所述结合的消化液用10ml 0.1M的N-乙酰葡糖胺从柱上洗脱，并且使该洗脱液在4℃下相对于蒸馏水透析。纯化的洗脱液用冻干法进行干燥，这样就得到了干的物质（Gray，B.M.等“B组链球菌类型特异的多糖与小麦胚芽凝集素和其它外源凝集素的相互作用”J.Immunol Meth，（1984）72∶269-277）。在含有此处所述的细菌的脱氧胆酸盐提取物的所有印迹中都记录到了阳性反应。在含有革兰氏阴性细菌提取物的那些印迹中，4B9抗体似乎能识别一系列排列规则的分子实体，从而在免疫印迹中产生梯状图型。这种图型与LPS的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析中看到的完全一致，在该电泳中，电泳带显示的不同大小的图型是由于LPS分子群体的重量增加不同，这种增加与每个分子中的O-抗原低聚糖侧链单元的数目相对应（Pavla，E.T.and Makela，P.H.，见上;Goldman，R.D.and Leive，L.，见上）。在含有B组链球菌型提取物的那些印迹中，4B9抗体似乎能够识别一个较宽的带上的组分。这种图型与在糖部分的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析中看到的一致，这表明是由于特定糖序列的反复重复而使分子量具有广泛的不均一性（Vmir，E.R.et.al.，见上;Holden，K.G.，见上）。这些数据指出单克隆抗体4B9专一于大肠杆菌、阴沟肠杆菌和B组链球菌的一些血清型中的分子所共有的一种抗原决定基。
为了进一步确定抗原的分子特性，脱氧胆酸盐提取物在其电泳之前用水解蛋白的酶蛋白酶K处理（Eberling，W.，见上）。在蛋白酶处理之后观察到的免疫印迹图型与没有处理观察到的那些图型是一样的，因此，暗示与4B9抗体反应的抗原实质上不是蛋白质。
为了明确与4B9反应的是否是糖抗原决定基，在用抗体与硝化纤维素纸反应之前，使电转移的脱氧胆酸盐和小麦胚芽凝集作用亲和性纯化样品经受缓慢的高碘酸盐氧化（见实例1）。这样处理过的脱氧胆酸盐提取物的电转移印迹不再与4B9单克隆抗体反应。这些证据有力地表明，此抗体识别的抗原决定基是此处所述革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌分子中的糖部分。
4.4B9单克隆抗体的同型物用类似于上述专一性检测的ELISA进行了测定，不同的是，抗原板含有一个固定的B组链球菌Ⅱ型和Ⅲ型的PLL库。4B9单克隆抗体与B组链球菌的阳性反应仅仅在用抗IgM试剂时观察到了，表明单克隆抗体的一种IgM同型物。
5.4B9单克隆抗体的体外功能活性在调理噬菌的检测中进行了研究，该检测是在人的嗜中性白细胞和人的补体都存在和不存在的条件下对该抗体的杀菌活性进行比较。
这里利用的细菌菌株只是在单克隆抗体4B9、活性补体源和人的嗜中性白细胞都存在的条件下才失活（表6）。当这个实验用几个非4B9反应的细菌血清型进行重复时，没有观察到细菌破坏（数据未列出），因此，表明了单克隆抗体4B9的功能的专一性，并表明了它对于调理细菌的能力和促进其噬菌作用的能力。因此调理素（特定的抗体）和多形核白细胞（嗜中性白细胞）的结合作用可以认为是对这些细菌菌株免疫性的主要机制，这些数据暗示抗体4B9在适当的施用之后，能够对于此处所述的细菌菌株的致死性攻击提供保护。
表6
嗜中性 输入细菌的
细菌 抗体 补体
白细胞 破坏 %
大肠杆菌018和025 + 4B9 -a 0
大肠杆菌018和025 + 6F11b+ 0
大肠杆菌018和025 - 4B9 + 0
大肠杆菌018和025 + 4B9 + 85%
阴沟肠杆菌分离物 + 4B9 - 0
阴沟肠杆菌分离物 + 6F11 + 0
阴沟肠杆菌分离物 - 4B9 + 0
阴沟肠杆菌分离物 + 4B9 + 85%
B组链球菌Ia和Ⅲ型 + 4B9 - 0
B组链球菌Ia和Ⅲ型 + 6F11 + 0
B组链球菌Ia和Ⅲ型 - 4B9 + 0
B组链球菌Ia和Ⅲ型 + 4B9 + 85%
a：（-）＝加热失活的（50℃下30分钟）人补体。
b：（6F11）＝含有Fisher2型绿脓杆菌的IgM人单克隆抗体的培养物上清液。
6.为了检验上述假定，用4B9抗体和此处所述的每属中至少一个生物进行了动物保护研究。
对于每一种革兰氏阴性细菌的攻击，将远系繁殖的重量在20-22g之间的Swiss-Webster雌鼠分成三组，每组各10只，典型实验如下述进行：
组 细菌 抗体
A 大肠杆菌018 4B9
B 大肠杆菌018 6F11
C 粘质沙雷氏菌014 4B9
将含有25μg纯化抗体的200μl无菌的PBS通过静脉注射入接受抗体的每一组鼠中。2小时后，对所有动物用300μl含3倍于各自细菌菌株LD50的活细菌在腹膜内进行攻击，细菌悬浮液用对数生长期的肉汤培养物来制备，将其中的细菌离心，用PBS洗涤二次，用PBS使之重新悬浮成适当浓度。对动物进行5天观察。在攻击24至48小时之后，B组（无关抗体）和C组（无关生物）的所有动物都死去，相反，接受4B9（A组）抗体的那些动物全部都活着而且没有症状。
对于B组链球菌的保护研究，使用了新生幼鼠。远系繁殖的Sprague-Dawley幼鼠（与其母鼠喂养在一起）基本上如前述在出生后48小时之内接受抗体和细菌。主要区别如下：1）抗体和细菌攻击是腹膜内注入，2）接种物体积减少到20μl。
这种动物保护模式可用以表明4B9抗体对于此处所述的三种细菌的攻击具有治疗效果。这些数据列于表7中。
表7
攻击细菌 抗体 存活/攻击 存活%
大肠杆菌025 4B9 10/10 100
大肠杆菌025 6F11a0/10 0
粘质沙雷氏菌014b4B9 0/10 0
B组链球菌Ia和Ⅲ 4B9 10/10 100
B组链球菌Ia和Ⅲ 6F11 0/10 0
粘质沙雷氏菌014 9B10 0/10 0
a：6F11抗体对于Fisher2型绿脓杆菌是特异性的，并用作阴性对照抗体。
b：粘质沙雷氏菌014不与7D7抗体反应，并用作非特异的对照生物。
这些数据表明人单克隆抗体4B9能够保护小鼠和鼠免于受革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的致死性攻击。具有属间交叉反应的人单克隆抗体4B9，用25μg的纯化量即能够对属于革兰氏阴性的大肠杆菌和属于革兰氏阳性的B组链球菌的生物感染提供保护。
实施例Ⅴ
实施例Ⅴ表明制备和选择对粘质沙雷氏菌、肺炎杆菌、以及产气肠杆菌具有属间交叉反应性的人的单克隆抗体的方法。而且实施例还表明所说的抗体，对同系的粘质沙雷氏菌、肺炎杆菌和产气肠杆菌血清型具有体外调理活性。除了需要进行特殊改变以表征和鉴定本例所述的抗体以外，重复实施例Ⅰ的方法（基本上如A至G部分中所述）。下面列出了用本文中所述的单克隆抗体，在测定过程中的变化和所得的结果。
1.用上述方法，分析取自四个转化作用的培养上清液，孔（7E10）的鉴定结果是对四种肺炎杆菌、含有荚膜血清型：1、2、3、4、6、8、9、19、20、21、24、27、31、43、44和55的血清型板中至少有一种具有结合活性，但在对照板上没有（没有细菌）。对从7E10细胞系得到的抗体，通过改良标准免疫印迹技术（immunoblotting technique）再测试其属间交叉反应性。特别研究了对肺炎杆菌、产气肠杆菌、粘质沙雷氏菌、大肠杆菌和绿脓菌等细菌的交叉反应性，通过把细菌点滴到有格网的硝基纤维纸园盘上，使含有细菌的园盘和所说的抗体进行反应，并用碱性磷酸酶/硝基四唑鎓酶体系使抗体反应显影。
从这些实验中观察到，7E10抗体还具有属间交叉反应性。这抗体与下面的菌种及血清型反应：
肺炎杆菌 粘质沙雷氏菌 产气肠杆菌
K2、8、11、12、13、21、26、 04、12 临床分离物
29、30、33、42、68、69
因此，人的单克隆抗体7E10，对肺炎杆菌、粘质沙雷氏菌和产气肠杆菌菌属的细菌具有属间交叉反应性。
2.除了抗原板含有PLL（聚L-赖氨酸）库固相肺炎杆菌K8和K11血清型以外，用类似于实施例1中所述的特异性试验的ELISA方法测定7E10单克隆抗体的同型物。只有用抗IgM试剂才观察到7E10单克隆抗体与肺炎杆菌血清型具有阳性反应，证明了单克隆抗体的IgM同型物。本技术领域的专业人员知道，如果将实施例重复几次，并且测定这样得到的属间交叉反应的单克隆抗体的同型物，则就可以得到另外的同型物，例如IgM和IgG同型物。
3.在调理吞噬作用试验中，测定7E10单克隆抗体的体外功能活性，该试验在有和没有人的嗜中性白细胞和补体二者存在时的两种情况下，比较了其杀菌活性。其中所用的细菌血清型，只有在单克隆抗体7E10、活性补体源和人的嗜中性白细胞都存在时才失活（表8）。用与抗体7E10不反应的血清型重复进行试验时，则可以看到细菌没有破坏（数据没有列出）。这些试验表明单克隆抗体7E10的功能特异性以及其调理细菌和促进吞噬作用的能力。
表8
嗜中性 所加入细菌的
细菌 抗体 补体
白细胞 破坏率 %
粘质沙雷氏菌012 + 7E10 -a0
粘质沙雷氏菌012 + 6F11b+ 0
粘质沙雷氏菌012 - 7E10 + 0
粘质沙雷氏菌012 + 7E10 + 86%
肺炎杆菌K8和K11 + 7E10 - 0
肺炎杆菌K8和K11 + 6F11 + 0
肺炎杆菌K8和K11 - 7E10 + 0
肺炎杆菌K8和K11 + 7E10 + 94%
产气肠杆菌分离物 + 7E10 - 0
产气肠杆菌分离物 + 6F11 + 0
产气肠杆菌分离物 - 7E10 + 0
产气肠杆菌分离物 + 7E10 + 60%
a和b＝见表3脚注。
实施例Ⅵ
实施例Ⅵ表明制备和选择对粘质沙雷氏菌和肺炎杆菌菌种具有属间交叉反应性的人的单克隆抗体的方法。而且实施例还表明所说的抗体，对同系的粘质沙雷氏菌、肺炎杆菌血清型的体外调理活性。除了需要进行特殊改变以表征和鉴定本例所述的抗体以外，重复实施例Ⅰ的方法（基本上如A至G部分中所述）下面列出了用本文所述的单克隆抗体，在测定过程中的变化和所得的结果。
1.用上述方法，分析取自四个转化作用的培养上清液，孔（8C9）的鉴定结果是对四种肺炎杆菌、含有荚膜血清型：1、2、3、4、6、8、9、19、20、21、24、27、31、43、44和55的血清型板中至少有一种具有结合活性，但在对照板上没有（没有细菌）。对8C9细胞系得到的抗体，通过改良标准免疫印迹技术再测试其属间交叉反应性。特别是研究了对肺炎杆菌、产气肠杆菌、粘质沙雷氏菌、大肠杆菌和绿脓杆菌等细菌的交叉反应性，通过将细菌点滴到有格网的硝基纤维纸园盘上，使含有细菌的园盘与所说的抗体进行反应，并用碱性磷酸酶/硝基兰四唑鎓酶体系使抗体反应显影。
从这些实验中观察到，8C9抗体还具有属间交叉反应性。这抗体与下面的菌种及血清型反应：
肺炎杆菌 粘质沙雷氏菌
K5、6、7、14、27、36、 03
55、64
因此，人的单克隆抗体8C9对肺炎杆菌和粘质沙雷氏菌菌种的细菌具有属间交叉反应性。
2.除了抗原板含有PLL库固相肺炎杆菌K14和K27血清型以外，用类似于实施例1中所述的特异性试验的ELISA方法测定8C9单克隆抗体的同型物。只有用抗IgM试剂才观察到8C9单克隆抗体与肺炎杆菌血清型具有阳性反应，证明了单克隆抗体的IgM同型物。本技术领域的专业人员知道，如果将实施例重复几次，并且测定这样得到的属间交叉反应的单克隆抗体的同型物，则就可以得到另外的同型物，例如IgM和IgG同型物。
3.在调理吞噬作用试验中，测定8C9单克隆抗体的体外功能活性，该试验在有和没有人的嗜中性白细胞和补体二者存在时的两种情况下比较了其杀菌活性。其中所用的细菌血清型，只有在单克隆抗体8C9、活性补体源和人的嗜中性白细胞都存在时才失活（表9）。用与抗体8C9不反应的血清型重复进行试验时，则可以看到细菌没有破坏（数据没有列出）。这些试验表明单克隆抗体8C9的功能特异性以及其调理细菌和促进吞噬作用的能力。
表9
嗜中性 所加入细菌
细菌 抗体 补体
白细胞 的破坏率%
粘质沙雷氏菌03 + 8C9 -a0
粘质沙雷氏菌03 + 6F11b+ 0
粘质沙雷氏菌03 - 8C9 + 0
粘质沙雷氏菌03 + 8C9 + 70%
肺炎杆菌K14和K27 + 8C9 - 0
肺炎杆菌K14和K27 + 6F11 + 0
肺炎杆菌K14和K27 - 8C9 + 0
肺炎杆菌K14和K27 + 8C9 + 93%
a和b＝见表3脚注。
实施例Ⅶ
实施例Ⅶ表明制备和选择对粘质沙雷氏菌、肺炎杆菌、产气肠杆菌和阴沟肠杆菌菌种具有属间交叉反应性的人的单克隆抗体的方法。而且，实施例还表明所说的抗体，对同系的粘质沙雷氏菌、肺炎杆菌、产气肠杆菌和阴沟肠杆菌血清型具有体外调理活性。除了需要进行特殊改变以表征和鉴定本例所述的抗体以外，重复实施例Ⅰ的方法（基本上如A至G部分中所述）。下面列出了用本文中所述的单克隆抗体，在测定过程中的变化和所得的结果。
1.用上述方法，分析取自四个转化作用的培养上清液，孔（1E4）的鉴定结果是对四种肺炎杆菌，含有荚膜血清型：1、2、3、4、6、8、9、19、20、21、24、27、31、43、44和55的血清型板中至少有一种具有结合活性，但在对照板上没有（没有细菌）。对从1E4细胞系得到的抗体，通过改良标准免疫印迹技术再测试其交叉反应性。特别是研究了对肺炎杆菌、产气肠杆菌、粘质沙雷氏菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌和绿脓杆菌的属间交叉反应性，通过把细菌点滴到有格网的硝基纤维纸园盘上，使含有细菌的园盘和所说的抗体进行反应，并用碱性磷酸酶/硝基兰四唑鎓酶体系使抗体反应显影。
从这些实验中观察到，1E4抗体还具有属间交叉反应性。这抗体与下面的菌种和血清型反应。
肺炎杆菌 粘质沙雷氏菌 产气肠杆菌 阴沟肠杆菌
K1、3、8、9、13、15、 015 临床分离物 临床分离物
29、31、33、36、68、69
因此，人的单克隆抗体1E4，对肺炎杆菌、粘质沙雷氏菌、阴沟肠杆菌和产气肠杆菌菌属的细菌具有属间交叉反应性。
2.除了抗原板含有PLL库固相肺炎杆菌K3和K8血清型以外，用类似于实施例1中所述的特异性试验的ELISA方法测定1E4单克隆抗体的同型物。只有用抗IgM试剂中观察到1E4单克隆抗体与肺炎杆菌血清型具有阳性反应，证明了单克隆抗体的IgM同型物。本技术领域的专业人员知道，如果将实施例重复几次，并且测定这样得到的属间交叉反应的单克隆抗体的同型物，则就可以得到另外的同型物，例如IgM和IgG同型物。
3.在调理吞噬作用试验中，测定1E4单克隆抗体的体外功能活性，该试验在有和没有人的嗜中性白细胞和补体二者存在时的两种情况下比较了其杀菌活性。其中所用的细菌血清型，只有在单克隆抗体1E4、活性补体源和人的嗜中性白细胞都存在时才失活（表10）。用与抗体1E4不反应的血清型重复进行试验时，则可以看到细菌没有破坏（数据没有列出）。这些试验表明单克隆抗体1E4的功能特异性以及其调理细菌和促进吞噬作用的能力。
表10
嗜中性 所加入细菌的
细菌 抗体 补体
白细胞 破坏率 %
粘质沙雷氏菌015 + 1E4 -a0
粘质沙雷氏菌015 + 6F11b+ 0
粘质沙雷氏菌015 - 1E4 + 0
粘质沙雷氏菌015 + 1E4 + 86%
肺炎杆菌K3和29 + 1E4 - 0
肺炎杆菌K3和29 + 6F11 + 0
肺炎杆菌K3和29 - 1E4 + 0
肺炎杆菌K3和29 + 1E4 + 80%
产气肠杆菌分离物（2） + 1E4 - 0
产气肠杆菌分离物（2） + 6F11 + 0
产气肠杆菌分离物（2） - 1E4 + 0
产气肠杆菌分离物（2） + 1E4 + 80%
阴沟肠杆菌分离物 + 1E4 - 0
阴沟肠杆菌分离物 + 6F11 + 0
阴沟肠杆菌分离物 - 1E4 + 0
阴沟肠杆菌分离物 + 1E4 + 80%
a和b＝见表3脚注。
实施例Ⅷ
实施例Ⅷ表明制备和选择对粘质沙雷氏菌、肺炎杆菌、产气肠杆菌和绿脓杆菌，具有属间交叉反应性的人的单克隆抗体的方法。而且实施例还表明所说的抗体，对同系的粘质沙雷氏菌、肺炎杆菌、产气肠杆菌和绿脓杆菌血清型具有体外调理活性。除了需要进行特殊改变以表征和鉴定本例所述的抗体以外，重复实施例Ⅰ的方法（基本上如A至G部分中所述）。下面列出了用本文中所述的单克隆抗体，在测定过程中的变化和所得的结果。
1.用上述方法，分析取自四个转化作用的培养上清液，孔（9D1）的鉴定结果是对四种肺炎杆菌，含有荚膜血清型：1、2、3、4、6、8、9、19、20、24、27、31、43、44和55的血清型板中至少有一种具有结合活性，但在对照板上没有（没有细菌）。对从9D1细胞系得到的抗体，通过改良标准免疫印迹技术再测试其属间交叉反应性。特别是对肺炎杆菌、产气杆菌、粘质沙雷氏菌、大肠杆菌和绿脓杆菌等细菌的交叉反应性进行研究，通过将细菌点滴到有格网的硝基纤维纸园盘上，使含有细菌的园盘和所说的抗体进行反应，并用碱性磷酸酶/硝基兰四唑鎓酶体系使抗体反应显影。
从这些实验中看到，9D1抗体还具有属间交叉反应性。这抗体与下面的菌种和血清型反应：
肺炎杆菌 粘质沙雷氏菌 产气肠杆菌 绿脓杆菌
E9、13、15、29、33 03、9、15、18 临床分离物 F6
因此，人的单克隆抗体9D1，对肺炎杆菌、粘质沙雷氏菌、产气肠杆菌和绿脓杆菌菌种的细菌，具有属间交叉反应性。
2.除了抗原板含有PLL库固相肺炎杆菌K13血清型以外，用类似于实施例1中所述的特异性试验的ELISA方法测定9D1单克隆抗体的同型物。只有用抗IgM试剂才观察到9D1单克隆抗体与肺炎杆菌血清型具有阳性反应，证明了单克隆抗体的IgM同型物。本技术领域的专业人员知道，如果将实施例重复几次，并且测定这样得到的属间交叉反应的单克隆抗体的同型物，则就可以得到另外的同型物，例如IgM和IgG同型物。
3.在调理吞噬作用试验中，检测9D1单克隆抗体的体外功能活性，该试验在有和没有人的嗜中性白细胞和补体二者存在时的两种情况下比较了其杀菌活性。其中所用的细菌血清型，只有在单克隆抗体9D1、活性补体源和人的嗜中性白细胞都存在时才失活（表11）。用与抗体9D1不反应的血清型重复进行试验时，则可以看到细菌没有破坏（数据没有列出）。这些试验表明单克隆抗体9D1的功能特异性以及其调理细菌和促进吞噬作用的能力。
表11
嗜中性 所加入细菌
细菌 抗体 补体
白细胞 的破坏率%
粘质沙雷氏菌03 + 9D1 -a0
粘质沙雷氏菌03 + 6F11b+ 0
粘质沙雷氏菌03 - 9D1 + 0
粘质沙雷氏菌03 + 9D1 + 87%
肺炎杆菌K13 + 9D1 - 0
肺炎杆菌K13 + 6F11 + 0
肺炎杆菌K13 - 9D1 + 0
肺炎杆菌K13 + 9D1 + 50%
产气肠杆菌分离物（2） + 9D1 - 0
产气肠杆菌分离物（2） + 6F11 + 0
产气肠杆菌分离物（2） - 9D1 + 0
产气肠杆菌分离物（2） + 9D1 + 70%
表11
嗜中性 所加入细菌的
细菌 抗体 补体
白细胞 破坏率 %
绿脓杆菌F6 + 9D1 - 0
绿脓杆菌F6 + 6F11 + 0
绿脓杆菌F6 - 9D1 + 0
绿脓杆菌F6 + 9D1 + 75%
a和b＝见表3脚注
实施例Ⅸ
实施例Ⅸ表明制备对绿脓杆菌、大肠杆菌和粘质沙雷氏菌菌种具有属间交叉反应性的人的单克隆抗体的方法;而且本实施例还说明，所说的抗体对同系的绿脓杆菌、大肠杆菌和粘质沙雷氏菌血清型的致命侵入具有体内防治活性。重复实施例Ⅰ的步骤（基本上如在A至G部分所述），以制备人单克隆抗体，该抗体交叉防治能与抗体结合的细菌所引起的感染。在本实施例中叙述了对实施例Ⅰ方法所作的特殊改变，以表征和鉴定抗体。下面列出了用单克隆抗体在测试步骤中的变化和所得的结果。
1.使用实施例Ⅰ中所述的ELISA方法，筛选存在抗绿脓杆菌抗体的上清液。抗原板是有96平底孔的微量滴定板Immunolon 2（Dynatech，Alexandria，VA），这些孔含有多聚-L-赖氨酸（PLL）固相细菌的混合物，这些细菌是7种绿脓杆菌Fisher参考菌株（Fisher M.W等人，J of Bacteriology（1969）98，835-836，A.T.C.C.No.s 27312-27318）。
用上述方法分析取自一种转化的培养上清液，鉴定一孔的结果是：绿脓杆菌板上具有活性，而PLL对照板上没有活性。在随后的ELISA方法中用列于国际抗原标准表（IATS，A.T.C.C.Nos33348-33364）中的17种单个绿脓杆菌血清型进行测试，结果，主孔9C3，含有与Ⅰ型IATS血清型相结合的抗体（Liu P.V.Int.J.Syst.Bacteriol（1983）33，256-264，该文列入本文的参考）。
因此，从这实施例得到了无性繁殖的转化的人的细胞系，该细胞系是连续的（不死的），并且分泌一种单个人的单克隆抗体，该抗体结合到绿脓杆菌Ⅰ型IATS表面的决定子上。
在本专利申请之前，以9C3标誌的连续转化的人的细胞系保藏在美国标准培养物收集所（American Type Culture Collec-tion）（Rockrille，MD）在A.T.C.C.的保藏号为NO CRL9239.
2.用改进的标准免疫印迹技术也测试了由无性繁殖的9C3细胞系的抗体对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的交叉反应性。特别是研究了对大肠杆菌、肺炎杆菌、粘质沙雷氏菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、流感嗜血菌和金黄色葡萄球菌的交叉反应性，将细菌点滴到有格网的硝基纤维纸盘上，使含有细菌的园盘与9C3抗体反应，并且用碱性磷酸酶/硝基兰四唑鎓酶体系的显示抗体反应（如实施例1所叙）。
从这些实验中可以观察到抗体9C3是结合到大肠杆菌06血清型和粘质沙雷氏012和014血清型上。因此，人的单克隆抗体9C3在大肠杆菌、粘质沙雷氏菌和绿脓杆菌的特殊血清型的革兰氏阴性细菌中具有属间交叉反应性。
3.单克隆抗体与几种不同的菌属交叉反应的发现，提出了抗体可以与共有的抗原决定子结合。由9C3抗体所识别的分子种类的生物化学特性是由例1所描述的免疫印迹分析法进行检测的。注意到了在由绿脓杆菌和大肠杆菌而不是粘质沙雷氏菌所得到的反应性血清型的脱氧胆酸盐萃取物中的反应。虽然还不清楚抗体9C3为什么与粘质沙雷氏菌制剂不反应，可能是抗体能够识别因制剂处理而破坏的构象抗原决定基。对大肠杆菌和绿脓杆菌抗体9C3显示出识别一系列有规则隔开的分子组织，该组织产生一种梯状形式的免疫印迹，这种图形与在有SDS存在的情况下，在LPS的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析中所看到的完全一致，这里表明，所显示的大小不一的带是由于LPS分子群，因重量增加的差别而引起的，该增加量相当于在每个分子中存在的O-抗原的低聚糖侧链单元的数量（Pavla E.T.and Makela.P.H.，上文，and Goldman R.D，and Leive L.上文）。
为了进一步确定抗原分子的性质，在电泳之前，用蛋白水解酶、蛋白酶K处理脱氧胆酸盐萃取物（Eberling W.，上文）。蛋白酶K处理以后观察到的免疫印迹图形与没经处理观察到的图形是一样的，因此提出，与9C3抗体反应的抗原，在性质上不是蛋白质。
4.确定9C3单克隆抗体的同型物，是在类似于上述特异性试验的ELISA方法测试，除了抗原板含有PLL-固相的Fisher血清型4的绿脓杆菌细菌以外。9C3单克隆抗体与绿脓杆菌菌株的阳性反应，只有用抗IgM试剂时才能观察到，这说明是对单克隆抗体的IgM同型物。
5.9C3单克隆抗体的体外功能活性是在调理吞噬作用实验中测定的，该实验比较了有和没有人的嗜中性白细胞和人的补体二者存在的二种情况下的杀菌活性。
其中所用的细菌菌株，只有在单克隆抗体9C3、活性的补体和人的嗜中性白细胞都存在的情况下才消灭（表12）。用几种非9C3活性细菌血清型重复进行该试验时，没有观察到细菌破坏。这就说明单克隆抗体9C3的功能特异性和其调理细菌和促进吞噬作用的能力。由于调理素（特殊抗体）和多形核白细胞（嗜中性的）的结合作用，显示了对这些细菌株免疫性的初步机理，这些数据表明，适量服用抗体9C3之后，可以防治因本文中所述细菌菌种的致命侵入。
表12
嗜中性 所加入细菌的
细菌 抗体 补体
白细胞 破坏率 %
大肠杆菌06 + 9C3 -（a）0
大肠杆菌06 + 6F11（b）+ 0
大肠杆菌06 - 9C3 + 0
大肠杆菌06 + 9C3 + 98%
粘质沙雷氏杆菌014 + 9C3 - 0
粘质沙雷氏杆菌014 + 6F11 + 0
粘质沙雷氏杆菌014 - 9C3 + 0
粘质沙雷氏杆菌014 + 9C3 + 94%
绿脓杆菌Fisher4 + 9C3 - 0
绿脓杆菌Fisher4 + 6F11 + 0
绿脓杆菌Fisher4 - 9C3 + 0
绿脓杆菌Fisher4 + 9C3 + 79%
（a）-＝加热失活的（56℃30分钟）人的补体。
（b）6F11＝含有对Fisher2型的绿脓杆菌的IgM人的单克隆抗体的培养上清液。
6.为了试验9C3抗体的防治特性，至少用本文所述的每种菌属中的一种微生物进行动物防治研究。
用烧伤小鼠标本进行了Fisher4型绿脓杆菌和014型粘质沙雷氏菌的防治实验。对每种细菌的侵入研究，将产自瑞士（Swiss-Webster）的、体重22-25克的雌性小鼠分成三组，每组7只或8只小鼠。所进行的典型实验如下：
组 细菌 抗体
A F4绿脓杆菌 9C3
B F4绿脓杆菌 6F11
C F2绿脓杆菌 9C3
实验的前一天，对每只小鼠进行了剃刮，并用脱毛剂处理，以除去背面上的所有的毛（烧伤部位）。在实验那天，每只动物的每只大腿上注射0.1毫升的麻醉盐溶液，该麻醉液含有0.7毫升的85%NaCl、0.2毫升甲苯噻嗪（20毫克/毫升）和0.1毫升氯胺酮（100毫克/毫升），以致使每只小鼠的剂量为20毫克/千克的甲苯噻嗪和180毫克/千克的氯胺酮。麻醉的小鼠接受了总躯体表面积的10%的、足够深度的三度气体火焰烧伤。施行烧伤后，立即在这些小鼠焦疤附近处注射0.5毫升、4℃的含有与5-10倍半数致死量（LD50）的细菌的予混合的废培养液的抗体。细菌悬浮液是在肉汤培养到对数生长期，由此离心分离细菌，在PBS中洗涤二次，并在PBS中再悬浮到合适的浓度而制备的。观察动物10天，细菌侵入3至5天后，B组的全部动物（与发明无关的抗体）和C组（与本发明无关的有机体）都死亡。相比之下，接受9C3（A组）抗体的全部动物都存活，并且症状也消失（表13）。
对06大肠杆菌的防治研究，将健康的瑞士小鼠（Swiss-We-bster）（20-22克），以每10只为一组分成三组。每组用静脉注射含有25微克纯化抗体的无菌PBS200微升而接受抗体。2小时后，对所有动物，用含有3倍半数致死量的有关的细菌菌株的30微升活性细菌在腹膜内侵入（结果见表13）。
表13
实
验 侵入的细菌 抗体 存活数/侵入数 存活率%
号
1 F4绿脓杆菌 9C3 6/7 86%
F4绿脓杆菌 6F11（a）0/7 0
F2（b）绿脓杆菌 9C3 0/7 0
2 06大肠杆菌 9C3 6/10 60%
06 大肠杆菌 6F11 0/10 0
3 014粘质沙雷氏菌 9C3 8/8 100%
014 粘质沙雷氏菌 6F11 0/8 0
（a）6F11抗体是专一对Fisher免疫2型绿脓杆菌，并且作为阴性对照抗体。
（b）F2绿脓杆菌与9C3抗体不反应，并且作为一种非专一的对照有机体。
这些数据说明，人的单克隆抗体9C3能够防治小鼠的三种革兰氏阴性菌属细菌的致命侵入。属间交叉反应的人的单克隆抗体9C3，可以用含有培养上清液的抗体或纯化抗体防治因革兰氏阴性菌属大肠杆菌、粘质沙雷氏菌和绿脓杆菌有机体所引起的感染。
从上文可以看到，本发明的细胞系提供了人的单克隆抗体组合物和其片段，与各种细菌菌种即革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌进行交叉反应并对之交叉防治。这就使予防和治疗组合物更易于发展，并且能够有效地防治医院和新生儿的由于大多数（如果不是全部）细菌菌种引起的感染。通过抗体的结合，能够得到广泛的，防治的大部分的往往不是全部的临床有效的抗体。另外，该细胞系提供了用于免疫试验和其他已知方法的抗体。
为了清楚理解的目的，本发明用说明和实施例详细描述，但显然，从所附权利要求范围内是可以实施某些改变和修正的。
Claims (17)
1、一种用于予防和/或治疗细菌感染的组合物，其特征在于该组合物含有予防或治疗有效量的多种人的单克隆抗体，该单克隆抗体与至少两个菌属的至少两个菌种反应，至少有一种所说的抗体或其结合片段，能特异地与两个不同菌种的血清型共有的非核心的糖抗原决定基反应。
2、一种根据权利要求1的组合物，其中至少一种所说的抗体或其结合片段，与至少三个菌属和菌种的细菌的血清型反应。
3、一种根据权利要求1的组合物，其中至少一种所说的菌种是革兰氏阳性，而第二种是革兰氏阴性。
4、一种根据权利要求1的组合物，其中至少两种所说的每种抗体是防治属于至少两个不同属的细菌所引起的感染。
5、一种用于予防和/或治疗处理细菌感染的组合物，该组合物含有予防或治疗量的至少两种人的单克隆抗体或其结合片段，其中每一种所说的抗体能特异地与非核心的糖抗原决定基反应，该决定基由两种或多种不同属的菌种的血清型和至少一个菌种的多种血清型共有，其中所说的菌种包括：大肠杆菌、脑膜炎双球菌、粘质沙雷氏菌、肺炎杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、绿脓杆菌和B组无乳链球菌。
6、一种根据权利要求的组合物，该组合物含有至少一种人的单克隆抗体，该单克隆抗体与至少下列细菌菌种组合相反应：（a）大肠杆菌、粘质沙雷氏菌、产气肠杆菌，（b）大肠杆菌和脑膜炎双球菌，（c）大肠杆菌、阴沟肠杆菌和B组无乳链球菌，（d）肺炎杆菌、粘质沙雷氏菌和产气肠杆菌，（e）肺炎杆菌和粘质沙雷氏菌，（f）肺炎杆菌、粘质沙雷氏菌、产气肠杆菌和阴沟肠杆菌、（g）肺炎杆菌、粘质沙雷氏菌、产气肠杆菌和绿脓杆菌，或（h）大肠杆菌、粘质沙雷氏菌和绿脓杆菌。
7、一种药物组合物，含有根据权利要求1-6的任何一项中的组合物和一种生理上可接受的载体。
8、一种在人类宿主中抑制细菌疾病症状的方法，该方法包括：给药与所说的宿主一种具有予防或治疗有效量的根据权利要求1-6中的任一项的组合物，一种生理上可接受的载体，和一种抗微生物制剂和/或一种来自人类血浆的丙种球蛋白组分。
9、一种不死的细胞系，该细胞系分泌一种人的单克隆抗体或其结合片段，能特异地与抗原决定基交叉反应，该决定基含有部分存在于不同细菌菌属的两个不同菌种的至少两种血清型上的一种易接近的非核心的糖。
10、一个根据权利要求9的细胞系，其中所说的菌种是下列菌种中的至少两种：大肠杆菌、粘质沙雷氏菌、脑膜炎双球菌、肺炎杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、绿脓杆菌和B组无乳链球菌。
11、一种根据权利要求9的细胞系，其ATCC的保藏号为：NOCRL9006、CRL9007、CRL9008、CRL9009和CRL9239。
12、一种人的单克隆抗体或其结合片段，能结合到一种糖抗原决定基上，该决定基与根据权利要求11的细胞系产生的一种单克隆抗体反应。
13、一种用于检测不同菌属的至少两种菌种存在的工具，所说的工具包括含有至少一种单克隆抗体的一种单克隆抗体组合物的容器，其中所说的抗体与不同菌种的至少两种菌种共有的非核心糖的决定子反应，和一种提供检测信号用的标记，该信号共价结合到所说的抗体或共价结合到与所说的单克隆抗体反应的第二种抗体上。
14、一种用于予防和/或治疗新生儿败血症或脑膜炎的组合物，所说的组合物含有予防或治疗有效量的至少两种人的单克隆抗体或其结合片段，其中每种所说的抗体特异地与不同属的两种或更多种菌种的血清型共有的非核心的糖抗原决定基反应，其中所说的菌种包括：K1大肠杆菌、B组脑膜炎双球菌、B型流感嗜血杆菌和B组无乳链球菌。
15、一种用于予防和/或治疗处理予选的多种菌种的组合物，所说的组合物含有予防或治疗有效量的两种或更多种人的单克隆抗体或其结合片段，其中所说的抗体能与总数至少为四种菌种反应，和一个可接受的载体。
16、一个用于生产一种用于予防或治疗处理细菌感染的药物组合物的方法，所说的方法包括：结合多种人的单克隆抗体，其中所说的组合物与至少两个菌属的至少两个细菌菌种反应，其中至少一种所说的单克隆抗体或其结合片段，能特异地与两个不同菌种的血清型共有的非核心的糖抗原决定基反应。
17、一种用于生产用于予防或治疗处理新生儿败血症或脑膜炎的药物组合物的方法，其中所说的方法包括：结合予防或治疗量的至少两种人的单克隆抗体或其结合片段，其中每种所说的抗体特异地与非核心的糖抗原决定基反应，该决定基由不同菌属的两种或更多种菌种的血清型共有，其中所说的菌种包括：K1大肠杆菌、脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌和B组无乳链球菌。
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