CH672072A5 - - Google Patents

Description

BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf für die Behandlung und Diagnose von bakteriellen Infektionen nützliche pharmazeutische Zusammensetzungen und auf Verfahren zu ihrer Herstellung. Die Zusammensetzungen enthalten humane, monoclonale Antikörper, welche fähig sind, einen Schutz gegen Infektionen zu verleihen, welche durch mindestens zwei Gattungen von Bakterien verursacht werden.

Gram-positive und gram-negative Bakterien können lebensbedrohende Krankheiten bei angefallenen Patienten verursachen. Diese bakteriellen Infektionen bewirken häufig eine signifikante Krankhaftigkeit und Mortalität. Es besteht ein zunehmendes Vorkommen von solchen Infektionen in früh geborenen Kindern, älteren Patienten und Patienten, welche ernsthaften medizinischen Bedingungen unterliegen, wie Verbrennungen, chirurgische Trauma, langsam heilende Wunden oder Bösartigkeiten. Diese Infektionen kommen typischerweise von Krankenhäusern (d. h. spitalangeeignet) vor und treten häufig bei Patienten auf, welche einem verlängerten Spitalaufenthalt ausgesetzt sind und gleichzeitig einem chirurgischen Eingriff unterworfen worden sind, einen intravaskulären Vorfall aufweisen oder eine Langzeit-Thera-pie mit immuno-suppressiven Mitteln oder Antibiotika durchmachen müssen. Zusätzlich sind Neugeborene, welche ein unreifes Immunsystem aufweisen, sichtbar akut anfälliger auf neonatale Sepsis und Meningitis, welche insbesondere durch gram-negative und gram-positive Bakterien verursacht werden.

Einschliesslich der häufigst vorkommenden Organismen bei gram-negativen und gram-positiven Leiden sind Escherichia coli (E. coli), Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Serratia marcescens (S. marcescens), Enterobacter aerogenes und cloacae (E. aerogenes/cloacae), Pseudomonas aerugino-

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sa (P. aeruginosa), Neisseria meningitidis (N. meningitidis), Gruppe B Streptococcus und Staphylococcus aureus (S. aureus) (Sonnenwirth, A. C., «The Enteric Bacilli and Similar Gram-Negative Bacteria», Seiten 753 — 790, in Microbiolo-gy, 2. Auflage, Davis, B. D. Dulbecco, R., Eisen, H. N., Ginserberg, H. S., Wood, W. B., und McCarty, M., Herausgeber, Harperund Row (1973); McCabe, W. R., «Gram-Negative Bacteremia», Adv. Intern. Med., 19: 135 — 138 (1974); Kreger, et al., «Gram-Negative Bacteremia III. Reas-sessment of Etiology, Epidemiology and Ecology ind 612 Patients», Am. J. Med. 68: 332—343 (1980); Robbins, J. B., et al., «Escherichia coli Kl Capsular Polysaccharide Associated With Neonatal Meningitis», New Engl. J. Med., 290: 1216—1220 (1974); und Hughs, J. M., et al., «Nosocomial Infection Surveillance, 1980—1982», Morb. Mort. Weekly Report, 32:133 — 1633 (1983)). Von diesen Infektionen verursachen einige, jedoch nicht alle Serotypen von gewissen gram-negativen Bakterien, z. B. E. coli, K. pneumoniae, E. aerogenes/cloacae, P. aeruginosa und S. marcescens Bakte-rämie unter den erwachsenen Personen. Im Gegensatz zu den Erwachsenen sind die immunologisch unreifen Neugeborenen besonders anfällig auf Septikämie und Meningitis, welche durch die eingekapselten Stämme von E. coli, N. meningitidis Gruppe B, Hemophilus influenzae Typ B und den fünf Typen von Stämmen des Streptococcus Gruppe B verursacht werden. Obschon andere Bakterien ebenfalls solche Infektionen verursachen können, sind die oben zitierten Bakterien prädominante Isolate aus den obenerwähnten Blutinfektionen.

Seit langer Zeit stellten die Antibiotika die therapeutischen Werkzeuge der ersten Wahl für die Kontrolle und Ausrottung von gram-positiven und gram-negativen Infektionen dar. Das kontinuierliche Vorkommen und die Ernsthaftigkeit der Infektionen, das kontinuierliche Auftreten von antibiotisch resistenten bakteriellen Stämmen und die einigen Antibiotika anhaftende Toxizität zeigten jedoch, dass der antibiotischen Therapie Grenzen gesetzt sind. Diese Beobachtungen haben die Forschung nach alternativen prophylaktischen und therapeutischen Wegen bewirkt.

Es besteht die weitverbreitete Annahme, dass Antikörper, welche mit den zugänglichen Strukturen (extern ausgesetzt) an lebenden Bakterien reaktiv sind, die bakterielle Zerstörung durch einige von verschiedenen Mechanismen erleichtern könnten. Diese Mechanismen umfassen:

1) direkte Lyse der Bakterien in Gegenwart des Serumkomplements,

2) Bakteriostase durch Blockierung von Nährmittelauf-fang-Rezeptoren,

3) Opsonzufuhr und anschliessende Phagocytose der Bakterien in Gegenwart oder Abwesenheit von Serumkomplement oder

4) Verhinderung des Bindens der Bakterie an das Wirtgewebe (Mims, C. A. «Recovery from Infection», in The Pa-thogenesis oflnfectious Disease, Seiten 198—222, Mims,

C. A., Herausgeber, Academic Press (1982)).

Bei Bakterien, welche Oberflächen-Kohlehydratmoleküle besitzen, wie Lipopolysaccharide (LPS) und/oder Kapseln, erscheinen die Antikörper am wirksamsten über den Opson-zufuhr-Mechanismus (Kaijser, B., et al., «The Protective Effect Against E. coli of O and K Antibodies of Différent Immunoglobulin Classes», Scand. J. Immunol., 1: 276 (1972)). Demzufolge können Antikörper, welche gegen diese zugänglichen Kohlehydratstrukturen gerichtet sind, ein wirksames Mittel für die bakterielle Elimination darstellen.

Im allgemeinen produzieren Säugetiere, welche krankheitserregenden Bakterien ausgesetzt sind, Antikörper, welche spezifisch auf die LPS oder Kapseln sind. Diese Antigene sind chemisch verschiedene Strukturen, die aus häufig

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wiederholenden Oligosaccharid-Molekülen aufgebaut sind und deren Gegenwart den Serotypen von bakteriellen Stämmen bestimmt. Da sie häufig die immunodominanten Bakte-rien-Antigene darstellen, wurden Serotyp-spezifische Antikörper (Anti-LPS oder Kapsel) am meisten auf potentielle therapeutische Antikörper untersucht. Wegen der begrenzten Kreuzreaktivität dieser Antikörper und der offensichtlich stark verschiedenen Natur von Kohlehydrat-Antigenen bei pathogenen, gram-positiven und gram-negativen Bakterien, wäre es jedoch aussergewöhnlich schwierig und kostspielig, eine therapeutische Formulierung herzustellen, welche nur Serotyp-spezifische Antikörper enthält (vgl. z. B. Kaijser, B. und Ahlstedt, S., «Protective Capacity of Antibodies Against Escherichia coli O and K Antigens», Infect. Immun., 17: 286—292 (1977); und Morrison, D. C. und Ryan, J. L., «Bacterial Endotoxins and Host Immune Response», Adv. Immunol., 28:293—450 (1979)). Dessen ungeachtet, haben verschiedene Publikationen Visionen angeregt, dass immunotherapeutische Wege gefunden werden können, um Krankheiten, welche durch gram-negative Bakterien verursacht werden, zu behandeln.

Fraktioniertes humanes Plasma, in welchem die Immunoglobuline angereichert sind und spezifische und protektive Antikörper gegen die infiszierenden Organismen enthält, besitzt eine gewisse Wirksamkeit gegen P. aeruginosa-Infektio-nen (Collins, M. S., und Robey, R. E., «Protective Activity of an Intravenous Immune Globulin (Human) Enriched in Antibody Against Lipopolysaccharide Antigens of Pseudomonas aeruginosa», Amer. J. Med., 3:168 —174 (1984)). Kommerzielle Produkte sind jedoch noch nicht leicht erhältlich wegen gewissen innewohnenden Begrenzungen, welche ihre weitverbreitete Verwendung für die Behandlung von lebensbedrohenden bakteriellen Leiden verhindert haben.

Eine solche Begrenzung besteht darin, dass die Immun-globulin-Zusammensetzungen aus grossen Pools von Plasmaproben zusammengesetzt sind, welche in Übereinstimmung mit der Gegenwart einer begrenzten Anzahl von besonderen Antikörpern ausgewählt worden sind. Typischerweise bestehen diese Pools aus Proben von Tausend Spendern, welche niedere Titer von einigen pathogenen Bakterien aufweisen. Demzufolge besteht bestenfalls nur eine bescheidene Zunahme des resultierenden Titers der gewünschten Antikörper.

Eine andere solche Begrenzung besteht darin, dass das Auswahlverfahren als solches sehr teuer ist und für die Sicherstellung der Konsistenz des Produktes ein kontinuierliches Aussieben der Spender erforderlich ist. Ungeachtet der beträchtlichen Anstrengungen können Fabrikationsanteile immer nach Ansätzen und geographischen Gebieten variieren.

Eine weitere Einschränkung, welche noch den Immun-globulin-Zusammensetzungen eigen ist, besteht darin, dass ihre Verwendung zur Verabreichung von grossen Mengen fremden proteinhaltigen Substanzen (z. B. Viren) führt, was zu nachteiligen biologischen Effekten führen kann. Die Kombination von niederen Titern der gewünschten Antikörpern und der hohe Gehalt an fremden Substanzen beschränkt oft den Anteil von spezifischen demzufolge vorteilhaften Immunoglobulinen, welche dem Patienten verabreicht werden können, auf einen suboptimalen Anteil. 1975 schilderten Köhler und Milstein, dass gewisse Mäusezellini-en mit Mäusemilzzellen verschmolzen werden konnten, wobei Hybridoma gebildet wurden, welche reine «monoclonale» Antikörper ausschieden (Köhler, G. und Milstein, C., «Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity», Nature, 256:495—497 (1975)). Mit dem Aufkommen dieser Technologie existierte ein Potential,

um Mäuse-Antikörper gegen jede besondere Determinante oder Determinanten Antigenen herzustellen.

Unter Verwendung dieser Technologie sind monoclonale Mäuse-Antikörper von Mäusen abgeleitet worden, welche s mit Polysaccharid von Neisseria meningitidis Gruppe B immunisiert worden sind. Es wurde beobachtet, dass diese IgM monoclonalen Antikörpern von Mäusen verschiedene Kl-positive E. coli-Stämme binden und opsonieren, ungeachtet ihrer LPS-Serotypen (Cross, supra, Soderstrom, supra und io Cross, A. S., et al., «The Importance of the Kl Capsule in Invasive Infections Cause by Escherichia coli», J. Inf. Dis., 149: 184—193 (1984)). Überdies sind monoclonale Antikörper in Mäusen gegen lethale Herausforderungen mit E. coli Kl und die Gruppe B von meningococcale Organismen i5 (Cross, supra, und Sunderstrom, supra). In einem anderen Beispiel wurde über monoclonale Mäuse-Antikörper berichtet, welche spezifisch auf den Typ III der Gruppe B Streptococcus waren und eine Schutzwirkung in einem experimentellen Infektionsmodell bei Mäusen zeigten (Egan, M. L., et 20 al. «Protection of Mice from Expérimental Infection with Type III Groupt B Streptococcus Using Monoclonal Antibodies», J. Exp. Med., 1: 1006-1011 (1983)).

Ein monoclonaler Mäuse-Antikörper besitzt, obwohl er für die Behandlung von Mäusen nützlich ist, verschiedene 25 Hauptnachteile für die Verwendung bei Menschen. Das menschliche Immunsystem ist fähig, jeden monoclonalen Mäuse-Antikörper als fremdes Protein zu erkennen. Dies kann zu einer beschleunigten Wegschaffung des Antikörpers und demzufolge zu einer beschleunigten Aufhebung des 30 pharmakologischen Effektes führen (Levy, R. und Miller, R. A., «Tumor Therapy with Monoclonal Antibodies», Fed. proc., 42: 2650—2656 (1983)). Ernsthafter, es ist denkbar, dass dies bei ernsten Fällen zu einem Schock und sogar zum Tod wegen allergischen Reaktionen führen kann, welche 35 analog zur «Serumkrankheit» sind. Die klinische Erfahrung hat gezeigt, dass Antimaus-Immunoglobulinreaktionen die Nützlichkeit dieser Antikörper bei etwa der Hälfte der Patienten, welche monoclonale Mäuse-Antikörper für die Behandlung von verschiedenen Tumoren erhalten hatte, ver-40 minderte (Sears, H. F., et al., «Phase I Clinical Trial of Monoclonal Antibody in Treatment of Gastrointestinal Tumor», Lancet, 1: 762—764 (1982); und Miller, R. A., et al., «Monoclonal Antibody Therapeutic Trials in Seven Patients with T-Cell Lymphoma», Blood, 62: 988—995 (1983)). 45 Es besteht demzufolge ein Bedürfnis für humane, monoclonale Antikörper, welche eine Schutzwirkung gegen gramnegative und gram-positive bakterielle Leiden bewirken. Die unterschiedliche Antigenizität von gram-positiven und gram-negativen Leiden verursachenden Bakterien, führt je-50 doch zum Schluss, dass die Herstellung von Serotypen-spezifischen humanen, monoclonalen Antikörpern für jedes der vielen wichtigen bakteriellen Pathogenen undurchführbar wäre.

Die unterschiedliche Antigenizität von gram-negativen 55 Bakterien wird den verschiedenen Regionen von Lipopoly-sacchariden (LPS) zugeschrieben, einem Molekül, welches mit der äusseren Membrane von gram-negativen Organismen verbunden ist. Es wird im allgemein angenommen, dass das LPS-Molekül aus drei strukturellen Regionen besteht. 60 Die Region, welche am nächsten der äusseren Membrane liegt, ist der sogenannte Lipid-A-Teil des LPS. Diese strukturell konservierte Region besitzt die endotoxische Aktivität, welche zum gram-negativen Leiden führt. Die zweite strukturelle Region, die als Kern bezeichnet wird, ist mit einem 65 Lipid A verbunden, oft über ein 2-Keto-3-desoxy-D-mannooctonat-Rest (KDO) und ist ähnlich der Lipid-A-Region, dem Antikörper nicht zugänglich, wenn die dritte äusserste Region des LPS vorhanden ist. Obschon diese Re-

gion partiell in einigen gram-negativen bakteriellen Spezies vorhanden ist, sind viele Abweichungen im vollständigen Kern bei den Mitgliedern der Familieren der Enterobacteria-ceae gefunden worden. Die äusserste Region des LPS-Mole-küls, ist aus sich wiederholenden Oligosaccharid-Einheiten zusammengesetzt und ist als O-spezifische Seitenkette bekannt. Die Zucker in diesen Oligosaccharid-Einheiten enthalten molekulare Einheiten, welche Serotypen-spezifische strukturelle antigenische Unterschiede zeigen. Die Zucker selbst, ihre Sequenz und ihre Bindungen bestimmen somit die O-Seitenketten-Antigenizität über ihre Tertiär-Struktur. Es wurde gefunden, dass Antikörper zu diesen O-Gruppen im allgemein Serotypen-spezifisch sind. Die Serotypen werden im allgemein durch ihre Reaktivität mit monospezifischen Antiseren, welche eine Bindungsaktivität für nur eine besondere antigenische Determinante besitzen, bestimmt. Vergleiche allgemein Mayer et al., Meths. Microbiology, 18: 157-201 (1985).

Man hat sich bemüht, Antiseren zu den Kern- und Lipid-A-Regionen von LPS herzustellen, um den Schutz gegen gram-negative Infektionen zu demonstrieren. Sakulramrung und Domingue, J. Inf. Dis., 151: 995—1104 (1985); McCabe, et al., J. Infect. Dis., 1365: 516 (1977); und Mullan, et al., Infect. Immun., 10:1195—1201 (1974). Kürzlich wurden monoclonale Antikörper von Mäusen und Menschen produziert, welche mit den konservierten Regionen reaktiv sind. Obschon diese Antikörper manchmal eine partielle in vivo-Wirksamkeit in zugeschneiderten Modellsystemen gezeigt haben (Teng, et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 82: 1790 (1985); und Bogard und Kung, Patent-Anmeldung Nr. 085/ 01659) waren andere Laboratorien nicht in der Lage, ähnliche Effekte zu demonstrieren. Vergleiche Elkins und Metealf, Infect. Immun., 48: 597 (1985); und Gigliotti und She-nap, J. Inf. Dis., 151: 1005 — 1011 (1985). Überdies reagieren (binden) diese Antikörper im allgemein nicht intakte lebensfähige gram-negative Bakterien oder gereinigte LPS-Mole-küle. Diese Erkenntnis lässt den Schluss zu, dass es zweifelhaft ist, ob Kern- oder Lipid-A-Teile des LPS an Bakterien in ihrem natürlichen Zustand zugänglich wären und ob sie in ihrem infektiösen Zustand für den Antikörper zugänglich wären. Es ist ebenfalls anerkannt, dass Antikem- oder Anti-lipid-A-Antikörper nicht mit gram-positiven Bakterien reagieren, da die letzteren keine LPS aufweisen. In Anbetracht dieser Erkenntnisse ist es unwahrscheinlich, dass monoclonale Antikörper gegen konservierte Kern- oder Lipid-A-Gebiete des LPS wirkungsvoll bei der Behandlung von humanen, gram-negativen oder in diesem Fall gram-positiven bakteriellen Leiden wären.

Es besteht demnach ein signifikantes Bedürfnis nach humanen, monoclonalen Antikörpern, welche breit (interge-nus) kreuz protektiv gegen gram-positive und gram-negative bakterielle Leiden sind, ebenso wie für Verfahren für die praktische Herstellung und Verwendung solcher Antikörper. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Bedürfnisse.

Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäss Anspruch 1, Verfahren zu ihrer Herstellung gemäss den Ansprüchen 10 und 11, die immortalen Zellinien gemäss Anspruch 12 und die monoclonalen Antikörper gemäss Anspruch 15.

Es werden neue Zellinien zur Verfügung gestellt, welche humane monoclonale Antikörper ausscheiden, welche fähig sind, eine spezifische Kreuzreaktion mit einer Vielzahl von Bakterienarten einzugehen, durch Binden eines zugänglichen Epitopes, welches ein Nicht-Kern-Kohlehydratrest, welcher in mindestens zwei verschiedenen Bakterienarten vorhanden ist, umfasst. Diese monoclonalen Antikörper können für die prophylaktische Behandlung von humanen Patienten verwendet werden, welche auf bakterielle Infektionen empfind5 672 072

lieh sind und zur therapeutischen Behandlung von Patienten, welche von einer solchen Infektion befallen sind. Zur Verabreichung werden therapeutische Zusammensetzungen verwendet, welche mehrere humane Antikörper enthalten, wo-s bei mindestens einer dieser Antikörper fähig ist, mit Nicht-Kern-Kohlehydrat-antigenischen Determinanten, welche durch zwei oder mehr bakterielle Spezies geteilt wird, eine Bindung einzugehen. Die Zusammensetzung umfasst vorzugsweise einen physiologisch annehmbaren Träger und io kann eine oder mehrere der folgenden Komponenten enthalten: zusätzliche humane, monoclonale Antikörper, welche fähig sind, mit anderen bakteriellen Gattungen eine Bindung einzugehen; eine Gammaglobulin-Fraktion von humanem Blutplasma; eine Gammaglobulin-Fraktion von humanem i5 Blutplasma, wobei das Plasma von Spendern erhalten wurde, welche einen erhöhten Spiegel an Immunoglobulinen aufwiesen, welche mit einer oder mehreren Bakteriengattungen reaktiv sind; und eines oder mehrere antimikrobielle Mittel.

20 Erfindungsgemäss werden neue Zellen zur Verfügung gestellt welche fähig sind, humane, monoclonale Antikörper zu produzieren und Zusammensetzungen, welche solche Antikörper enthalten; solche Zusammensetzungen sind fähig, selektiv mit einer Vielzahl von Bakteriengattungen zu reagie-25 ren, welche für nosocomiale, neonatale oder andere Infektionen verantwortlich sind, wobei die individuellen Antikörper typischerweise mit Nicht-Kern-Kohlehydratepitopen, welche an vielen Bakteriengattungen vorhanden sind, reagieren. Die hauptsächlichen Zellen besitzen identifizierbare Chro-30 mosome, worin die Keimlinien DNA oder eine Vorläuferzelle so umgeformt werden, damit sie einen Antikörper oder ein Bindungsfragment davon, codieren, welche ein Bindungszentrum für eine Antigen-Determinante (Epitop) besitzt welche durch Kohlehydrat-Moleküle geteilt werden, welche bei 35 mindestens einigen Serotypen von zwei oder mehr Bakteriengattungen gefunden wird. Diese humanen, monoclonalen Antikörper können auf viele Weisen verwendet werden, einschliesslich für die Diagnose, Prophylaxe und Therapie von bakteriellen Leiden.

40 Typischerweise sind die erfindungsgemässen Zellen fähig, eine stabile Produktion von humanen Antikörpern in Kulturen, insbesondere in immortalisierten, humanen Lymphocy-ten, welche protektive humane monoclonale Antikörper für Nicht-Kern-Kohlehydratdeterminanten an zugänglichen 45 Molekülen, welche durch mindestens zwei bakterielle Arten geteilt werden, zu gewährleisten. Durch «zugänglich» wird verstanden, dass die Nicht-Kern-Kohlehydratdeterminanten in der Umgebung der Verwendung physikalisch für die direkte Wechselwirkung mit den monoclonalen Antikörpern so zugänglich sind. Die zur Verfügung gestellten monoclonalen Antikörper sind nützlich für die Behandlung oder Prophylaxis von ernsthaften Leiden, welche durch einen grossen Bereich von bakteriellen Infektionen verursacht werden. Überdies sind diese Nicht-Kern-Kohlehydratmoleküle, welche in 55 die umliegende Umgebung freigesetzt werden, ebenfalls frei direkt mit den Antikörper-Molekülen in Wechselwirkung zu treten und durch das reticulo-endotheliale System entfernt zu werden.

Die Zusammensetzungen enthalten die erfindungsgemäs-60 sen monoclonalen Antikörper, welche typischerweise für die therapeutische und prophylaktische Behandlung von noso-comialen, neonatalen und anderen Infektionen sind. Als nosocomiale Infektionen werden typischerweise Infektionen durch folgende Bakterien verursacht: Escherichia coli, Pseu-65 domonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes/cloacae, Serratia marcescens und Streptococcus agalactiae Gruppe B, Antikörperzusammensetzungen gegen zwei, drei, vier oder mehr solcher Bakterien werden bevor

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zugt. Ähnlich sind für den Gebrauch bei Frühgeborenen für die Behandlung der neonatalen Sepsis oder Meningitis die Antikörper gewünschtenfalls spezifisch gegen zwei oder mehr der folgenden bakteriellen Organismen: Escherichia coli Kl, Neisseria mengitidis Gruppe B, Streptococcus agalactiae Gruppe B und Hemophilus influenzae Typ B. Andere gewöhnliche infektiöse Bakterien umfassen: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Bacteroides fragilis, Pseudomonas cepacia, Mycobacterium tuberculosis, Provi-dencia morganii, Salmonella typhi, Pneumocystis carinii, Acinetobacter herellea, Pastorella multocida, Klebsiella oxy-toca. Für zusätzliche pathogene Bakterien, welche dem Fachmann bekannt sind, vergleiche Hughs, J. M., et al., «Nosocomial Infection Surveillance, 1980—1982», Morb. Mort. Weekly Report, 32: ISS — 16SS (1983) und allgemein Microbiology, 3. Auflage, Davis, B. D., Dulbecco, R., Eisen, H. N., Ginserberg, H. S., Wood, W. B., und McCarty, M., Herausgeber, Harper und Row (1980), auf welche hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Die monoclonalen Antikörper reagieren mit individuellen Mitgliedern oder allen Mitgliedern einer besonderen Bakterienart, falls die Mitglieder durch ihre Oberflächenepitope, insbesondere das LPS oder durch Kapselstellen, z. B. Serotypen, unterschieden werden können.

Die unerwartete Entdeckung von monoclonalen Antikörpern, welche kreuzreaktiv gegen verschiedene Bakterienarten waren, umfasst die klinisch wichtigen Arten, welche oben aufgelistet sind und stellt ein neues Mittel für die therapeutische und prophylaktische Behandlung zur Verfügung. Bei der Verwendung einer Kombination von vorgewählten kreuzreaktiven Antikörpern, kann eine Mischung von wenigen Antikörpern für die Verwendung gegen eine Anzahl von verschiedenen Arten von infektiösen Bakterien verwendet werden.

Beispielsweise kann eine Mischung von zwei monoclonalen Antikörpern, von welchen einer kreuzreaktiv mit mindestens zwei und ein zweiter kreuzreaktiv mit mindestens zwei oder drei verschiedenen klinisch bedeutsamen Bakterienarten sind, nützlich für die Behandlung gegen vier, fünf oder sechs verschiedene Arten sein. Die Zugabe eines dritten oder vierten monoclonalen Antikörpers, von welchen jeder kreuzreaktiv mit mindestens zwei klinisch wichtigen Arten ist, sogar wenn einer oder mehr der Arten die gleich ist, wie diejenige, welche durch den ersten/oder zweiten Antikörper erkannt wird, kann die Nützlichkeit für die Behandlung gegen fünf bis zehn oder mehr Arten steigern. Es kann selbstverständlich erforderlich sein, einen oder mehr monoclonale Antikörper zuzuführen, wovon jeder nur für eine einzelne ausgewählte Bakterienart spezifisch ist, beispielsweise wenn die monoclonalen Antikörper, welche mit der genannten Art kreuzreaktiv sind, nicht erhältlich sind.

Demzufolge sind neue Verfahren zur Behandlung von bakteriellen Infektionen möglich. Diese dienen insbesondere zur Behandlung von Patienten, von welchen angenommen wird, dass sie von der bestimmten Bakterienart befallen sind oder solche, welche gegenüber der Bakterienart empfindlich sind. Die Behandlung umfasst die Verabreichung einer Zusammensetzung, welche einen monoclonalen Antikörper enthält, der gegen die Bakterienart gerichtet ist, von welcher angenommen wird, dass sie die Infektion verursacht, wobei der monoclonale Antikörper ursprünglich als Reaktiv mit einer anderen Bakterienart charakterisiert wurde.

Ein anderes Behandlungsverfahren besteht darin, dass die internen bakteriellen Infektionen durch Verabreichung von Zusammensetzungen behandelt wird, welche eine Vielzahl von monoclonalen Antikörpern enthält, welche mit einem wesentlichen Anteil, d. h. mehr als 50%, vorzugsweise

60 oder 80% oder mehr, am bevorzugtesten 90%, einer gewählten klinisch wichtigen Bakterienart sind, wobei die Anzahl der Antikörper mindestens etwa 2 kleiner ist. als die Anzahl der Bakterienarten. Wenn in typischen Fällen «n» die Anzahl der Bakterienarten darstellt, kann die Zusammensetzung etwa n — 2 Antikörper enthalten, noch typischer etwa n — 4 bis n — 8 oder weniger Antikörper für die Behandlung von bis zu 15 bis 20 Bakterienarten. In Situationen, wo die Behandlung gegen ein breites Spektrum, z. B. 25 bis 50 oder mehr, der Bakterienarten gewünscht ist, kann die Zusammensetzung typischerweise n — 10 bis n — 20 Antikörper oder weniger enthalten.

Die Herstellung der monoclonalen Antikörper kann durchgeführt werden, indem die Expression von Nukleinsäuresequenzen, welche die Antikörper oder Bindungsfragmente davon für ein Nicht-Kern-Kohlehydratepitop, welches in mehreren Bakterienarten spezifisch ist, codieren, im-mortalisiert wird. Typischerweise werden die monoclonalen Antikörper durch eine zellgetriebene Epstein-Barr-Virus (EBV)-Transformation von Lymphocyten durchgeführt, welche von humanen Spendern stammen, welche von den entsprechenden gram-negativen Bakterien befallen sind oder befallen waren. Die so hergestellten Antikörper-ausscheiden-den Zellinien, werden als kontinuierlich wachsende Lympho-blastoidzellen charakterisiert, welche einen diploiden Karyotyp besitzen, sind Epstein-Barr-Kernantigen (EBNA)-positiv und scheiden monoclonale Antikörper des IgG, IgM, IgA oder IgD-Isotyps aus. Das zellgetriebene Transformationsverfahren selbst ist im einzelnen in der US-A-4 464 465 (Ge-netic Systems Corporation) beschrieben und es wird hier darauf ausdrücklich Bezug genommen. Die monoclonalen Antikörper können als Ganze oder als Fragmente eingesetzt werden, z. B. als Fv, Fab und F(ab')2, jedoch üblicherweise intakt.

Alternativ könnten Zellinien, welche die Antikörper produzieren, durch Zellfusion zwischen einem zweckmässigen drogenmarkierten humanen Myelom, Mäusemyelom oder humanen Lymphoblastoidzellen mit humanen B-Lymphocy-ten, wobei Hybridzellinien erhalten werden.

Die erfmdungsgemässen Zellinien können direkt für die Herstellung von monoclonalen humanen Antikörpern Anwendung finden. Die Zellinien können mit anderen Zellinien fusioniert werden (wie beispielsweise drogenmarkiertes humanes Myelom, Mäusemyelom oder humane Lymphoblastoidzellen) um Hydridome zu produzieren und dienen demzufolge für den Transport der Gene, welche die humanen, monoclonalen Antikörper codieren. Alternativ können die Zellinien für die DNA-Codierung der Immunoglobuline verwendet werden, welche isoliert und in Zellen transferiert werden können, durch Techniken, welche von der Fusion verschieden sind. Zusätzlich können die Gene, welche die monoclonalen Antikörper codieren, isoliert werden und gemäss der rekombinanten DNA-Technik für die Herstellung von spezifischem Immunoglobulin in einer Vielzahl von Wirten eingesetzt werden. Insbesondere kann durch Herstellung von cDNA-Genbanken aus Messenger-RNA, ein einziges cDNA-Clon, welches das Immunoglobulin codiert und frei von Intronen ist, isoliert werden und in einen zweckmässigen prokaryotischen oder eukaryotischen Expressions-Vektor eingeführt werden und anschliessend in einem Wirt für die Massenproduktion transformiert werden.

Die Lymphoblastoid- oder Hybridzellinien können in üblicher Weise geclont und einem Screening unterworfen werden, mit Antikörpern, welche fähig sind, die Epitope von verschiedenen Bakteriengattungen, welche im Zellüberstand nachgewiesen werden, zu binden.

Die erfmdungsgemässen monoclonalen Antikörper finden insbesondere Anwendung als Komponenten von phar6

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mazeutischen Zusammensetzungen, welche eine therapeutische oder prophylaktische Menge von mindestens einem der monoclonalen Antikörper in Konjugation mit einem pharmazeutisch wirksamen Träger enthalten. Ein pharmazeutischer Träger kann jede kompatible, nicht-toxische Substanz sein, welche für die Verabreichung der monoclonalen Antikörper an den Patienten zweckmässig ist. Steriles Wasser, Alkohol, Fette, Wachse und inerte Feststoffe können im Träger enthalten sein. Pharmazeutisch annehmbare Adju-vantien (Pufferungsmittel, Dispergiermittel) können der pharmazeutischen Zusammensetzung ebenfalls zugesetzt sein. Solche Zusammensetzungen können einen einzelnen monoclonalen Antikörper enthalten, welcher kreuzreaktiv mit Nicht-Kern-Kohlehydratepitopen ist, welche durch zwei oder mehr Bakterienarten geteilt werden, welche beispielsweise nosocomiale und neonatale Infektionen (z. B. Sepsis oder Meningitis) verursachen. Alternativ kann eine pharmazeutische Zusammensetzung zwei oder mehr monoclonale Antikörper zur Bildung eines Cocktails enthalten. Beispielsweise kann ein Cocktail, welches humane monoclonale Antikörper enthält, die einen Schutz gegen zwei oder mehr gramnegative Bakteriengattungen bewirken, die für humane Infektionen verantwortlich sind, eine Aktivität gegen die grosse Mehrheit der gewöhnlichen klinischen Isolaten bewirken. Gewünschtenfalls kann einer oder mehrere der monoclonalen Antikörper so ausgewählt werden, dass er ebenfalls kreuzreaktiv mit gram-positiven Bakterien ist, das eine breitere Produkteanwendung ermöglicht. Von Interesse sind prophylaktische und/oder therapeutische monoclonale Antikörper-Zusammensetzungen, welche fähig sind, mit NichtKern-Kohlehydratdeterminanten, welche durch drei oder mehr, normalerweise mindestens fünf oder mehr, üblicherweise bis zehn und bis zu fünfzehn oder mehr bakteriellen Serotypen zu teilen, welche mindestens zwei, normalerweise drei oder mehr, üblicherweise mindestens fünf und normalerweise weniger als zehn bakterielle Gattungen einschlies-sen.

Von besonderem Interesse sind monoclonale Antikörper-Zusammensetzungen, welche mit mindestens etwa drei, vorzugsweise mindestens etwa vier und mehr, der folgenden Bakterien reagieren, welche gewöhnliche nosocomiale Infektionen bewirken: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes/cloacae, Serratia marcescens, und Streptococcus agalactiae Gruppe B. Für die Behandlung von neonatalen Infektionen reagieren die Zusammensetzungen gewünschtenfalls mit mindestens zwei, normalerweise drei und mehr, üblicherweise mit mindestens vier und bis zu und einschliesslich sämtliche der folgenden Infektions-verursachenden Bakteriengattungen: Escherichia coli Kl, Neisseria meningitidis Gruppe B, Streptococcus agalactiae Gruppe B, Hemophilus influenzae Typ B, Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis.

Jede der Zusammensetzungen umfasst mindestens zwei, normalerweise mindestens drei bis fünf und in der Regel sechs bis zehn humane monoclonale Antikörper, wobei mindestens ein Antikörper mit einem Nicht-Kern-Kohlehydra-tepitop reagiert (z. B. der LPS-Moleküle), welche mit zwei oder mehr Bakteriengattungen geteilt werden und einen Schutz verleiht. Typischerweise bindet der Antikörper nicht alle Serotypen jedes Bakteriums, kann jedoch zwei, drei oder mehr Sero typen binden. Gewünschtenfalls ist mindestens ein monoclonaler Antikörper vorhanden, welcher einen zugänglichen Nicht-Kern-Kohlehydratrest von mindestens zwei Gattungen von gram-negativen Bakterien bindet und mindestens ein monoclonaler Antikörper, welcher einen zugänglichen Kohlehydratrest eines gram-negativen und gram-posi-tiven Bakteriums bindet.

Das Mol-Verhältnis der verschiedenen monoclonalen Antikörper-Komponenten zueinander, unterscheidet sich normalerweise um nicht mehr als den Faktor 10, üblicherweise um nicht mehr als den Faktor 5; sie liegen in der Regel s in einem Mol-Verhältnis von etwa 1:1—2 vor.

Die humanen monoclonalen Antikörper können ebenfalls individuell angewendet werden, insbesondere wenn das Pathogen identifiziert worden ist oder eine Einschränkung auf einen schmalen Bereich von Pathogenen innerhalb des io Bindungsspektrum eines besonderen Antikörpers besteht. Die erfmdungsgemässen humanen monoclonalen Antikörper können ebenfalls in Kombination mit anderen monoclonalen Antikörpern verwendet werden (z. B. durch einen monoclonalen Antikörper, der kreuzreaktiv und protektiv ge-15 gen die P. aeruginosa-Serotypen ist, welche in der US-A-807 394, die am 10.12.85 eingereicht wurde, beschrieben ist); sie können ebenso in Kombination mit humanen Blutplasmaprodukten verwendet werden, wie kommerziell erhältliche Gammaglobulin- und Immunoglobulinprodukte, welche 20 für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung von bakteriellen Leiden bei Menschen eingesetzt werden. Vorzugsweise wird das Plasma für die Immunoglobuline von humanen Donoren gewonnen, welche einen erhöhten Spiegel an Immunoglobulinen aufweisen, die mit verschiedenen in-25 fektiösen Bakteriengattungen reaktiv sind. Vergleiche im allgemeinen das Compendium «Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host», Amer. J. Med., 76 (3a), 30.3.84, Seiten 1—231, auf welches ausdrücklich Bezug genommen wird.

30 Die erfmdungsgemässen monoclonalen Antikörper können als separat verabreichte Zusammensetzungen in Konjugation mit Antibiotika oder antimikrobiellen Mitteln verwendet werden. Typischerweise können die antimikrobiellen Mittel, Penicillin oder Cephalosporin (z. B. Carbapenicillin, 35 Penicillin G oder dergleichen) in Konjugation mit einem Aminoglykosid (z. B. Gentamicin, Tobramycin usw.) verabreicht werden, es ist jedoch möglich, zahlreiche andere Mittel (wie z. B. Cephalosporine, Sulfa-Drogen usw.), welche dem Fachmann wohlbekannt sind, zu verwenden. 40 Die erfmdungsgemässen humanen monoclonalen Antikörper und pharmazeutische Zusammensetzungen davon, sind insbesondere für die orale oder parenterale Verabreichung nützlich. Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen parenteral, d. h. subcutan, intramus-45 kulär oder intravenös verabreicht. Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung zur Verfügung, welche eine Lösung des humanen monoclonalen Antikörpers oder ein Bruchteil davon in einem annehmbaren Träger aufgelöst, vorzugsweise in ei-50 nem wässrigen Träger enthalten. Eine Anzahl von wässrigen Trägern, wie beispielsweise Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Kochsalzlösung, 0,3% Glycin und dergleichen, können verwendet werden. Diese Lösungen sind steril und im allgemeinen frei von partikelförmigem Material. Diese Zu-55 sammensetzungen können durch übliche bekannte Sterilisationstechniken sterilisiert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen enthalten, wie sie erforderlich sind, um ungefähr physiologische Bedingungen zu erzielen, wie beispielsweise pH-Einstellungs-60 und Pufferungsmittel, Toxizitätseinstellungsmittel und dergleichen, z. B. Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kalziumchlorid, Natriumlactat usw. Die Konzentration des Antikörpers in diesen Formulierungen kann in einem weiten Bereich variieren, von weniger als 0,5%, in der Regel 65 mindestens etwa 1% bis etwa 15 oder 20 Gew.-% und werden primär auf Basis des Flüssigkeitsvolumens, der Viskosität usw. in Übereinstimmung mit der besonderen Verabreichungsart ausgewählt. Demzufolge könnte eine typische

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pharmazeutische für die intramuskuläre Injektion so aufgearbeitet werden, dass sie 1 ml steriles gepuffertes Wasser und 50 mg des monoclonalen Antikörpers enthält. Eine typische Zusammensetzung für die intravenöse Infusion, könnte hergestellt werden, so dass sie 250 ml sterile Ringer-Lösung und 150 mg des monoclonalen Antikörpers enthält. Die gegenwärtig angewandten Methoden für die Herstellung von parenteral verabreichbaren Zusammensetzung sind den Fachleuten wohlbekannt und sind im einzelnen im Remington's Pharmaceutical Science, 15. Auflage, Mack Publishing Company, Easton, PA (1980) beschrieben, worauf ausdrücklich Bezug genommen wird.

Die erfmdungsgemässen monoclonalen Antikörper können für die Lagerung lyophilisiert werden und in einem zweckmässigen Träger vor dem Gebrauch rekonstituiert werden. Diese Technik hat sich bei den konventionellen Immunoglobulinen als wirksam erwiesen und die dort bekannte Lyophilisierung und Rekonstitution kann ebenfalls verwendet werden. Es ist den Fachleuten bekannt, dass die Lyophilisation und die Rekonstitution in unterschiedlichen Aus-mass zu Aktivitätsverlusten bei den Antikörpern führen kann (z. B. tendieren bei den konventiellen Immunoglobulinen die IgM-Antikörper zu einem grösseren Aktivitätsverlust als die IgG-Antikörper) und dass die Konzentration bei der Verwendung zur Kompensation der Aktivitätsverluste angepasst werden muss.

Die Zusammensetzungen, welche die erfmdungsgemässen humanen monoclonalen Antikörper oder ein Cocktail davon enthalten, können für prophylaktische und/oder therapeutische Behandlung von bakteriellen Infektionen eingesetzt werden. Bei der therapeutischen Anwendung werden die Zusammensetzungen dem schon infiszierten Patienten in einer genügenden Menge verabreicht, um ihn zu heilen oder zumindest die Infektion und ihre Komplikationen zum Stillstand zu bringen. Eine dazu geeignete zweckmässige Menge ist in einer «therapeutisch wirksamen Dosis» definiert. Wirksame Mengen für diesen Zweck hängen von der Ernsthaftigkeit der Infektion und allgemeinen Zustand des Immunsystems des Patienten ab, variieren jedoch im Bereich von 1 bis 200 mg Antikörper pro Kilogramm Körpergewicht, wobei Dosen von 5 bis 25 mg üblicherweise verwendet werden. Es muss ebenfalls berücksichtigt werden, dass die erfmdungsgemässen Materialien im allgemeinen bei ernsthaften Krank-heitszuständen verwendet werden, d. h. bei lebensbedrohenden und potentiell lebensbedrohenden Situationen, insbesondere bei der Bakterämie und der Endotoxämie. In solchen Fällen ist es in Anbetracht der von aussen kommenden Substanzen und der Abwesenheit der «Fremdsubstanzen»-Zurückweisungen welche durch die vorliegenden erfmdungsgemässen humanen monoclonalen Antikörpern erzielt werden, möglich und vom behandelnden Arzt erwünscht, einen wesentlichen Überschuss dieser Antikörper zu verabreichen.

Bei prophylaktischen Anwendungen werden Zusammensetzungen, welche den vorliegenden Antikörper oder ein Cocktail davon enthalten, einem Patienten, welcher noch nicht durch die entsprechenden Bakterien infisziert worden ist, zur Verbesserung der Widerstandsfähigkeit des Patienten gegen eine solche potentielle Infektion verabreicht. Eine solche Menge wird als «prophylaktisch wirksame Dosis» bezeichnet. In dieser Verwendung sind die genauen Mengen wiederum abhängig vom Gesundheitszustand des Patienten und von seinem Immunitätsgrad, im allgemeinen jedoch im Bereich von 0,1 bis 25 mg pro Kilogramm, insbesondere 0,5 bis 2,5 mg pro Kilogramm.

Einfache oder mehrfache Verabreichungen der Zusammensetzungen können in Dosis und Verabreichungsmustern, nach Wahl des behandelnden Arztes gegeben werden. In jedem Fall sollte die pharmazeutische Formulierung eine genügende Menge der erfmdungsgemässen Antikörper für die wirksame Behandlung des Patienten beinhalten.

Erfmdungsgemässe monoclonale Antikörper-können des weiteren bei einem grossen Bereich von Verwendung in vitro 5 eingesetzt werden. Beispielsweise können die monoclonalen Antikörper für die Charakterisierung von Bakterien, für die Isolierung von spezifischen Bakterienstämmen oder Fragmenten davon für Impfstoff-Zubereitungen und dergleichen verwendet werden.

io Für diagnostische Zwecke können die monoclonalen Antikörper entweder markiert oder unmarkiert sein. Typischerweise ermöglichen die diagnostischen Tests den Nachweis der Bildung eines Komplexes durch die Bildung des monoclonalen Antikörpers mit dem LPS des Organismus. In un-i5 markierter Form finden die Antikörper Verwendung in Agglutinationstests. Zusätzlich können unmarkierte Antikörper in Kombination mit anderen markierten Antikörpern (zweite Antikörper) verwendet werden, welche mit dem monoclonalen Antikörper reagieren, wie Antikörper, welche für 20 humanes Immunoglobulin spezifisch sind. Alternativ können die monoclonalen Antikörper direkt markiert werden. Eine grosse Vielzahl von Markierungsmitteln kann eingesetzt werden, wie Radionuklid, fluoreszierende Stoffe, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzymcofaktoren, Enzyminhibitoren, 25 Liganden, insbesondere Haptene usw. Es sind zahlreiche Im-muno-Assays erhältlich, beispielsweise solche, wie sie in den nachstehenden US-Patentschriften beschrieben sind: 3 817 827; 3 850 752; 3 901 654; 3 935 074; 3 984 533; 3 996 345; 4 034 074 und 4 098 876; auf diese Dokumente 30 wird ausdrücklich Bezug genommen.

Gewöhnlich werden die erfmdungsgemässen monoclonalen Antikörper in Enzym-Immuno-Assays verwendet, wenn die Hauptantikörper oder die zweiten Antikörper von verschiedenen Arten zu einem Enzym konjugiert sind. Wenn 35 eine Probe, wie humanes Blut oder ein Lysat davon, ein oder mehrere Bakterien einer gewissen Gattung oder eines gewissen Serotypes enthalten, mit den Hauptantikörpern kombiniert wird, findet eine Bindung zwischen den Antikörpern und denjenigen Molekülen statt, welche die ausgewählten 40 Epitope zeigen. Solche Zellen können dann von den ungebundenen Reagentien abgetrennt werden und ein zweiter Antikörper (mit einem Enzym markiert) wird zugegeben. Anschliessend wird die Gegenwart des Antikörper-Enzym-konjugates, welches spezifisch an die Zellen gebunden ist, 45 bestimmt. Andere übliche Techniken, die dem Fachmann wohlbekannt sind, können ebenfalls verwendet werden.

Es werden ebenfalls Ausrüstungen für die Verwendung mit den Hauptantikörpern zur Verfügung gestellt, um bakterielle Infektionen oder die Gegenwart eines ausgewählten so Antigens zu bestimmen. Eine Zusammensetzung mit dem erfmdungsgemässen Hauptantikörper wird normalerweise in lyophilisierter Form vorgelegt, entweder allein oder in Konjugation mit zusätzlichen Antikörpern, welche gegen andere gram-negative Bakterien spezifisch sind. Die Antikörper, 55 welche mit einem Markierungsmittel konjugiert oder unkon-jugiert sind, sind in der Ausrüstung mit Puffern, wie mit Tris, Phosphat, Carbonat, usw., Stabilisatoren, Bioziden, inerten Proteinen, wie bovinem Serumalbumin oder dergleichen, enthalten. Im allgemeinen sind diese Materialien in 60 Mengen von weniger als 5 Gew.-% auf Basis des aktiven Antikörpers vorhanden und ungefähr in einer gesamten Menge von etwa 0,01 Gew.-% auf Basis der Antikörperkonzentration. Es ist häufig wünschenswert, ein inertes Streckmittel oder einen Excipienten zur Verdünnung der aktiven 65 Bestandteile zuzufügen, wobei der Excipient 1 bis 99 Gew.-% der gesamten Zusammensetzung ausmachen kann. Falls ein zweiter Antikörper, welcher zur Bindung des monoclonalen Antikörpers fähig ist, verwendet wird, ist dieser norma-

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lerweise in einer zweiten Ampulle vorhanden. Der zweite Antikörper ist typischerweise mit einem Markierungsmittel konjugiert und in analoger Weise, wie die vorher beschriebenen Antikörper-Formulierungen formuliert. Die folgenden experimentellen Daten und Informationen dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung.

Beispiel I

Dieses Beispiel demonstriert Verfahren für die Herstellung von humanen monoclonalen Antikörpern, welche eine Intergenus-Kreuzreaktion gegen Verbindungen der Gattungen Escherichia coli (E. coli), Serratia marcescens (S. marcescens), Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae und Enterobacter aerogenes (E. aerogenes) besitzen. Weiter zeigt dieses Beispiel die Schutzaktivität des genannten Antikörpers in vitro gegen eine lethale Herausforderung von homologen (kreuzreagierenden) E. coli und E. aerogenes-Serotypen.

A. Gewinnung von zweckmässigen humanen Zellen

Zweckmässige humane B-Zellen (Lymphocyten) wurden aus dem peripheren Blut eines Individuums gewonnen, von welchem bekannt war, dass es die Krankheit Mukoviszidose beherbergte. Die mononuklearen Zellen wurden vom peripe-ralen Blut durch Standard-Zentrifugationstechniken auf Fi-coll-Paque (Boyum, A. «Isolation of Mononuclear Cells and Granulocytes From Human Blood», Scand. J. Clin. Lab. In-vest., 21. Suppl 97: 77 — 89, (1968)) und zweimal in Kalzium-Magnesium-freier Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, bevor in 1 ml 90% fötalem bovinem Serum (FBS) und 10% Dimethylsulfoxid suspendiert und bei —196 °C in flüssigem Stickstoff eingefroren wurde.

Zur Transformation der mononuklearen Zellen wurde eine Ampulle, welche 5 x 107 Zellen enthielt, schnell bei 37 °C aufgetaut. Zur Zellsuspension wurden 10 ml Iscove-Medium, welches 15% FBS enthielt zugeführt und bei Zimmertemperatur während 10 Min. bei 250 x g zentrifugiert. Die mononuklearen Zellen wurden von den T-Zellen (Lymphocyten) befreit, wobei das modifizierte «E-Rosetting»-Verfahren verwendet wurden. Kurz gesagt, wurden die Zellen auf eine Konzentration von 1 x 107 Zellen/ml in PBS, welches 20% FBS enthielt bei 4 °C resuspendiert. 1 ml dieser Suspension wurde in ein 17 x 100 mm Polystyrol-Rundbo-denröhrchen gegeben, zu welchem 1 x 109 mit 2-Amino-ethyl-isothiouroniumbromid (AET)-behandelte rote Schafblutkörperchen aus einer 10% (v/v) Lösung in Iscove-Medi-um zugegeben (Madsen, M. und Johnson, H. E., «A Metho-dological Study of E-rosette Formation Using AET Treated Sheep Red Blood Cells», J. Immun. Methods, 27: 61—74 (1979)). Diese Suspension wurde energisch während 5 bis 10 Min. bei 4 °C gemischt und die E-Rosettenzellen wurden mittels Zentrifugation durch Ficoll-Paque während 8 Min. bei 2500 x g bei 4 °C entfernt. E-Rosetten-negative periphere mononukleare Blutzellen (E~PMBC), welche sich an der Grenzschicht vereinigten, wurden einmal in Iscove-Medium gewaschen und in solchem, welches 15% w/v FBS (g/ml), L-Glutamin (2 mM/1), Natriumpyruvat (1 mM/1), Penicillin 100 (IU/ml), Streptomycin (100 (ig/ml), Hypoxanthin (1 x 10~4 M) und Thymidin (1,6 x 10~s M) enthielt, resuspendiert. Dieses Medium wird nachstehend als HAT-Medi-um bezeichnet.

B. Zellgetriebene Transformation von mononuklearen peripheren Blutzellen

Die zellgetriebene Transformation des E~PBMC wurde durchgeführt, indem die E_PBMC mit einer transformierenden Zellinie cokultiviert wurde. Die transformierende Zellinie war eine EBNA-positive humane Lymphoblastoid-Zelli-nie, welche durch Ethylmethansulfonat-Mutagenese von der

GM 1500 Lymphoblastoid-Zellinie abgeleitet wurden. Die Selektion in Gegenwart von 30 ng/ml 6-Thioguanin verleihte den Zellen einen Hypoxanthinguanin-Phosphoriboxyl-Transferasemangel und demzufolge eine HAT-Empfindlich-keit. Die Zellinie wird 1A2-Zellinie genannt und wurde bei der American Type Culture Collection 12 301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20 852 USA (ATCC) am 29. März 1982 mit der Hinterlegungsnummer ATCC-Nr. CRL 8119 hinterlegt. Die 1A2-Zellen wurden in der logarithmischen Wachstumsphase in HAT-Medium suspendiert und mit den E~PBMC in einem Verhältnis von 30 1 A2-Zellen pro E~PBMC kombiniert. Die Zellmischung wurde auf 10 Rundboden-96-Loch-Mikrotiterplatten mit einer Konzentration von 62 000 Zellen/Loch in einem Volumen von 200 nl/Loch aufgetragen und die Kultur wurde bei 37 °C in einer angefeuchteten Atmosphäre, welche 6% CO2 enthielt, inkubiert. Die Kulturen wurden 5 Tage nach der Transformation durch Ersetzen der Hälfte des Überstandes mit frischem HAT-Medium versetzt. Die Löcher wurden jeden zweiten Tag auf einem Inversionsmikroskop nach Zeichen von Zellproliferation untersucht. 10 Tage nach Beschichtung der Zellmischung und nachdem 1A2-Zellen wegen der HAT-Selektion abstarben, wurde eine Beschickung der Löcher mit einer neuen Mediumformulierung vorgenommen, welche identisch mit dem HAT-Medium war, mit der Ausnahme, dass die Aminopterin-Komponente fehlt. 15 Tage nach der Beschichtung, wurde beobachtet, dass 100% der Löcher proliferierende Zellen enthielten und dass in den meisten Löchern die Zellen von genügender Dichte für das entfernen und testen der Überstände auf Anti-E. coli- oder Anti-S. marcescens-Antikörpern war.

C. Nachweis von spezifischen Antikörper-sekretierenden Zellen

Die Überstände wurden einem Screening unterworfen auf die Gegenwart von Anti-E. coli- oder Anti-S. marcescens-Antikörper wobei eine «enzyme-linked immunosorben assay (ELISA)»-Technik verwendet wurde (Engvall, E., «Quantitative Enzyme Immunoassay (ELISA) in Microbio-logy», Med. Biol., 55: 193—200 (1977)). Die Antigenplatten bestanden aus Serien von 96-Loch-Immunlon-2-Mikrotiter-platten, wobei die Löcher eine Mischung, entweder von lebensfähigen E. coli oder S. marcescens-Serotypen aufwiesen, die an den Lochoberflächen mit Poly-L-Lysin (PLL) fixiert waren. Kurz gesagt, wurden 50 jj.1 PLL (1 n.g/ml) in PBS zu jedem Loch während 30 Min. bei Zimmertemperatur (RT) zugegeben. Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen und entweder PBS oder 50 (il einer Bakteriensuspensions-Mischung mit einer O.D.660 = 0,2 zu jedem Loch zugegeben. Die Platten wurden bei 37 °C während 60 Min. inkubiert und dreimal mit Kochsalzlösung/0,02% Tween 20 (Kochsalzlösung/T) gewaschen, um die nicht-gebundenen Bakterien zu entfernen. Zum Screening wurden verschiedene Antigenplatten verwendet:

1. eine Mischung von E. coli-Serotypen 01 (ATCC-Nr. 23 499) und 04 (ATCC-Nr. 12 791);

2. eine Mischung von S. marcescens-Serotypen 07,015, 016 und 018 (sämtliche Referenztyp-Stämme wurden vom «Communicable Disease Center» (CDC), Atlanta, GA erhalten); und

3. eine Mikrotiterplatte ohne Bakterien.

Für das ELISA-Verfahren wurden die Testlöcher zuerst mit 2001 einer Mischung, welche 5% w/v trockene entrahmte Milch, 0,001 % Schaum A und 0,01 % w/v Thimerosal in 500 ml PBS blockiert, um die nicht-spezifische Proteinbindung zu vermeiden. Nach der Inkubation während 1 Std. bei RT, wurden die Platten dreimal mit 200 |xl/Loch mit Kochsalzlösung/T gewaschen. Zu jedem Loch wurde 50 |il einer

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Mischung, welche 0,1% Tween 20 und 0,2 % bovines Serumalbumin in PBS (PTB) enthielt zugegeben. Die Überstände von den Löchern der Kulturplatten wurden in entsprechende Löcher der Antigen- und der Kontrollplatten (50 |il/Loch) abgeklatscht und die Platten wurden bei RT während 30 Min. inkubiert. Die Überstände wurden dann entfernt, die Platten fünfmal mit Kochsalzlösung/T gewaschen und mit 50 jxl biotinyliertem Geissen-Antihuman-Immunoglobulin (Ig) (TAGO 9 303 040 im Verhältnis 1:250 in PTB verdünnt) wurden zu jedem Loch gegeben. Nach 30 Min. Inkubation bei RT wurde das biotinylierte Reagenz entfernt, die Löcher fünfmal mit Kochsalzlösung/T gewaschen und 50 |al eines vorher gebildeten Avidin:biotiny-lierter Meerrettich-Peroxidase-Komplex (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories) zu jedem Loch gegeben. Nach 30 Min. bei RT wurde das Vectastain ABC-Reagenz entfernt und die Löcher wurden fünfmal mit Kochsalzlösung/T gewaschen und es wurden 100 jxl Substrat (0,5 mg/ml Ortho-phenylendiamin-dihydrochlorid in 100 mM Citratpuffer, pH 5,0 plus 0,03% H2O2 in entionisiertem H20, unmittelbar vor der Platierung in gleichem Volumen gemischt) in jedes Loch gegeben. Nach 30 Min. Inkubation im Dunkeln wurden 50 nl 3N H2SO4 in jedes Loch gegeben, um die Reaktion zu stopfen. Die Kulturüberstände, welche Antikörper enthielten, welche mit den bakterienbeschichteten Platten reaktiv waren, wurden durch Messung der Absorption bei 490 nm auf einem Dynatech MR 580-MicroELISA-Lesegerät bestimmt.

Die Kulturüberstände von sechs Transformationen wurden durch die obigen Verfahren analysiert, wobei die Identifikation in einem Loch (7D7) resultierte, welches Aktivität auf den E. coli und S. marcescens-Serotypplatten zeigte, jedoch nicht auf den Kontrollplatten. Es wurde anschliessend durch ELISA mit individuellen E. coli-Serotypen bestimmt, dass dieses Loch Antikörper-reaktiv mit mindestens den folgenden E. coli-Serotypen war: 08 (ATCC-Nr. 23 504) und 075 (ATCC-Nr. 12 798) aber nicht 04 und 06: K2,08 : K8, 09 : K9 oder 022 : K13 (ATCC-Nrn. 12 791,19 138, 23 501, 23 505 bzw. 23 517). Des weiteren enthielt dieses Loch Antikörper-Aktivität mit den S. marcescens-Serotypen 012, 013 und 015, jedoch nicht mit einem der anderen zwanzig bekannten S. marcescens-LPS-Serotypen.

D. Clonen von spezifischen Antikörper-produzierenden Zellen Die Zellen im Loch 7D7 wurden verschiedenen (vier) Clonierungsrunden unterworfen, bis sämtliche clonale Überstände durch das obige ELISA-Verfahren eine positive Reaktion auf E. coli-Serotypen 08 und 075 und auf S. marcescens-Serotypen 012, 013 und 015 ergaben. Es war nie ein Beispiel vorhanden, wenn ein clonaler Überstand Entmischung in seinem Reaktionsmuster zeigte, wonach der Kulturüberstand vom Loch 7D7 eine wahre Intergenus-Kreuz-reaktion mit E. coli und S. marcescens-Serotypen zeigte und nicht mehr als.eine Zellinie umfasste (wovon jede eine individuelle Serotyp-Reaktivität zeigt). Die Zellen wurden durch beschränkte Verdünnung in Rundboden-96-Lochplatten in Abwesenheit von Zubringerzellen geclont. Das Medium bestand aus Iscove-Medium, welches 15% v/v FBS, L-Gluta-min (2 mM/1), Natriumpyruvat (1 mM/1), Penicillin (100IU/ ml) und Streptomycin (100 Hg/ml) enthielt. Die Kulturen wurden alle drei Tage durch Ersetzen der Hälfte des Überstandes mit frischem Medium versorgt. Im allgemein war in den Löchern eine genügende Lymphoblastoid-Zelldichte zwischen 2 und 3 Wochen nach Platierung vorhanden, um die Analyse nach Anti-E. coli- und S. marcescens-Serotypen-Aktivität durchzuführen.

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Demzufolge wurde in diesem Experiment eine geclonte, transformierte humane Zellinie erhalten, welche kontinuierlich (immortal) ist und einen humanen monoclonalen Antikörper gegen eine Determinante auf der Oberfläche von E. 5 coli- und S. marcescens-Serotypen ausscheidet.

Am 28. Januar 1986 wurde die kontinuierlich transformierte humane Zellinie, welche mit 7D7 bezeichnet wurde, bei der American Type Culture Collection 12 301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20 852 USA, hinterlegt. Sie erhielt die 10 Hinterlegungs-Nr. ATCC CRL 9009.

E. Weitere Charakterisierung der Intergenus-Kreuzreaktivität

Der Antikörper der geclonten 7D7-Zelle wurde auf wei-15 tere Intergenus-Kreuzreaktivität durch eine Modifikation des Standard-Immunoblotting-Verfahrens getestet. Insbesondere wurde eine Kreuzreaktivität zu den Bakterien K. pneumoniae, E. aerogenes und E. cloacae untersucht, indem Bakterien auf eine unterteilte Nitrocellulose-Papierscheibe 20 aufgetragen wurden, die Scheibe, welche die Bakterien enthielten, mit dem genannten Antikörper umgesetzt und die Antikörper-Reaktionen mit alkalischen Phosphatase/Nitro-cellulose-tetrazolium-Enzymsystem entwickelt. 1,0 |xl Bakterien (O.E.660 = 0,4) wurden in jede unterteilte Sektion einer 25 Nitrocellulose-Papierscheibe (Schleicher und Schuell, 37 mm Nitrocellulosescheibe, unterteilt, 0,45 um) aufgetüpfelt. Jede Scheibe kann üblicherweise 60 verschiedene Bakterienproben aufnehmen. Die getüpfelten Scheiben wurden luftgetrocknet, in 25 v/v Isopropanol während 30 Min. fixiert und 30 10 Min. in entfettetem Trockenmilchreagenz blockiert, wie dies für die ELISA-Methode beschrieben ist. Die blockierten Scheiben wurden dreimal während 5 Min. in PBS/Tween 20 gewaschen und wurden in die Deckel von 35 x 10 mm Gewebekultur-Schalen gegeben. Der Antikörper-enthaltende 35 Überstand (1,0 ml) wurde in den Deckel gegeben und bei RT während 60 Min. inkubiert. Anschliessend folgten drei 5 Min.-Waschungen in PBS/Tween 20, wonach während 60 Min. bei Zimmertemperatur 1 : 1000 verdünnte PBS (alkalische Phosphatase, welche mit Geissen-Antihuman-40 Immunoglobulin (TAGO, Burlingame, CA) konjugiert war) zugegeben. Die Scheiben wurden wie oben gewaschen und wurden in 1 —2 ml frisches Substrat eingetaucht, welches folgendennassen hergestellt wurde: 16,5 mg Brom-chlorindolyl-phosphat und 8,5 ml Nitroblau-tetrazolium wurden in 50 ml 45 alkalischem Phosphatasepuffer (0,1 M Tris-HCl, pH 9,5 mit 0,1 M NaCl und 5 mM MgGh) aufgelöst, die Lösung wurde im Dunkeln aufbewahrt und unmittelbar vor Gebrauch filtriert. Nach einer zweckmässigen Farbentwicklung (10 — 15 Min.) wurde die Reaktion abgestoppt, indem die so Scheibe verschiedene Male mit destilliertem Wasser gespült wurde. Die entwickelten Scheiben konnten nach dem Trocknen aufbewahrt werden.

Die Scheiben enthielten 50 K. pneumoniae-Kapseltyp-Referenzstämme, welche von Dr. George Kenney von der 55 University of Washington, Department of Pathology, Seattle, WA und der American Type Culture Collection zur Verfügung gestellt wurden, 4 E. aerogenes-klinische Blutisolate und 6 E. cloacae-klinische Blutisolate (die Blutisolate wurden vom Harborview Hospital, Seattle, WA zur Verfügung 60 gestellt). Die Enterobacter-Isolate wurden typisiert (spezifiziert), indem das API 20E-System mit 23 standardisierten biochemischen Tests verwendet wurde (API Analytab Products, Plainview, NY). Dieses Verfahren identifiziert die Gattung und die Art von gram-negativen Bakterien, jedoch 65 nicht den Serotyp. Demzufolge konnten die Enterobakteri-en, welche von E. coli, S. marcescens und K. pneumoniae nicht als Serotyp identifiziert werden, jedoch nur als Gattung und Art.

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Aus diesen Experimenten wurde gefunden, dass der 7D7-Antikörper eine weitere Intergenus-Kreuzreaktivität besitzt. Dieser Antikörper reagierte mit den folgenden Serotypen:

K. pneumoniae E. coli S. marcescens E. aerogenes

K14,57,60 08,75 012,13. 15 klinisches Isolât

Es wurde demzufolge gefunden, dass der humane monoclonale Antikörper 7D7 eine Intergenus-Kreuzreaktion gegen Bakterien der Art E. coli, S. marcescens, K. pneumoniae, E. aerogenes jedoch nicht gegen E. cloacae besitzt.

F. Charakterisierung der monoclonalen Antikörper

Die Erkenntnis, dass der monoclonale Antikörper mit mehreren verschiedenen Bakteriengattungen kreuzreaktiv ist, lässt den Schluss zu, dass der Antikörper gegen ein geteiltes Protein oder Kohlehydrat gerichtet war. Es hat sich erwiesen, dass diese beiden Molekülarten für Intragenus-Kreuzreaktivitäten in Fragekommen (Mutharia, L. und Hancock, R.E.W., «Characterization of Two Surface-Loca-lized Antigenic Sites on Porin Protein F of Pseudomonas aeruginosa», Canadian Journal of Microbiol., 31: 381 —386 (1985) und Orskov, F. und Orskov, I., «Serotyping of Escherichia Coli» in Methods in Microbiology, Vol. 14, Bergan, T. ed. Academic Press, Orlando, FL, 43 — 112 (1984)).

Die biochemische Charakterisierung der Molekülarten, welche durch den 7D7-Antikörper erkannt werden, wurde durch Immunoblot-Analyse durchgeführt. Kurz geschildert, wurden dabei die Bakterien einer 20 ml Übernacht-Brühen-kultur (für E. coli-, S. marcescens- und E. aerogenes-Seroty-pen) oder von Übernacht-Wachstumsplatten (K. pneumoniae) gewaschen und in 0,1 ml einer Lösung, welche 64 ml 50 mM Tris pH 7,6, 30 ml Glycerin, 0,3 gm Desoxycholat (Natriumsalz), 0,14 ml Beta-Mercaptoethanol und 6 ml entionisiertes Wasser enthielt, extrahiert (Schechter, I. und Block, K., «Solubilization and Purification of trans-Formesy Pyrophosphat-Squalene Synthetase», J. Biol. Chem., 246: 7690-7696 (1971)). Nach 18 Std. Inkubation bei 4 °C wurde die Suspension bei 10 000 x g während 10 Min. zentrifu-giert. Der Überstand wurde entfernt und das Protein wurde unter Verwendung des Bio-Rad-Protein-Assays (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) quantifiziert. Zwischen 100 und 1000 ng Protein (variiert, je nach Bakterienextrakt) von jeder Bakterie wurden einer Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen (Kusecek, B., et al., «Lipopolysaccharide, Capsule and fimriae as Virulen-. ce Factors Among 01, 07,016,018 oder 075 und Kl, K5 oder K100 Escherichia coli», Infection and Immunity, 43: 368 — 379 (1984)). Abgetrennte Molekülarten wurden vom Gen auf eine Nitrocellulose (NCM)-Membrane transferiert, wie anderswo beschrieben (Towbin H., et al., «Electrophore-tic Transfer of Proteins From Polyacrylamide Gels to Nitrocellulose Sheets: Procedure and Some Applications», Proc. Nati. Acad. Sei., 76:4350—4354 (1979)) und der NCM-Blot wurde während 1 Std. in PBS-Tween blockiert (Batteiger, B., et al., «The Use of Tween 20 as a Blocking Agent in the Im-munological Detection of Proteins transferred to Nitrocellulose Membranes», J. Immunol. Meth., 55: 297 — 307 (1982)). Der Blot wurde während 1 Std. bei RT in 10 ml in dem von der 7D7-Linie ausgeschiedenen Kulturüberstand inkubiert. Nach vier 5 Min. Spülungen in PBS-Tween wurde der Blot in Geissen-Antihuman-Ig, welches mit alkalischer Phosphatase konjugiert war, inkubiert und entwickelt, wie dies hier für den Bakterien-Nitrocelluloseplatten-Test beschrieben wurde. Die positiven Reaktionen wurden auf allen Spuren gefunden, welche Desoxycholatextrakte der hier beschriebenen Bakterien enthielten. In diesen Spuren erwies sich, dass der 7D7-Antikörper Molekulareinheiten erkannte, welche einer Serie von Linien mit regelmässigem Abstand entsprachen und auf dem Immunoblot ein leiterartiges Muster darstellten. Dieses Profil war gesamthaft mit demjenigen, welches in der Polyacrylamidgel-elektrophoretischen Analyse für LPS in Gegenwart von SDS gefunden wurde, wobei nachgewiesen wurde, dass das heterogene Grössen-profil, welches durch die Banden dargestellt wurde, auf einer Population von LPS-Molekülen beruhte, welche sich durch Gewichtszunahmen unterschieden, welche der Anzahl von O-antigenischen Oligosaccharid-Seitenketteneinheiten unterschieden, welche pro Molekül vorhanden waren (Pavia, E. T. und Makela, P. H., «Lipopolysaccharide Heterogenei-ty in Salmonella typhimurium Analysed by Sodium Dodecyl Sulfate/Polyacrylamide Gel Electrophoresis», Eur. J. Bio-chem., 107:137—143 (1980) und Goldman, R. C. und Leive, L., «Heterogeneity of Antigenicside-Chain Length in Lipopolysaccharide from Escherichia coli Olli und Salmonella typhimurium LT2», Eur. J. Biochem., 107: 143 — 154 (1980). Diese Daten zeigen an, dass der monoclonale Antikörper 7D7 gegen eine antigenische Determinante gerichtet ist, welche durch LPS-Moleküle geteilt wird, welche an einigen Serotypen von E. coli, S. marcescens, K. pneumoniae und E. aerogenes gefunden wurden.

Zur weiteren Definition der molekularen Natur des Antigens wurden die Desoxycholatextrakte vor ihrer Elektrophorese mit dem proteolytischen Enzym Proteinase K behandelt (Eberling, W., et al., «Proteinase K from Tritirachium album Limber», Eur. J. biochem., 47: 91—97 (1974)). Zur Herstellung einer Probe wurde 10 (xg Proteinase K zu 50 ng einer Proteinprobe gegeben und die Mischung während 60 Min. auf 65 °C erwärmt. Die Proben wurden wie hier beschrieben einer Elektrophorese und einem Immunoblotting unterworfen. Das Immunoblot-Muster, welches nach der Proteinase K-Behandlung erhalten wurde, war identisch mit denjenigen, welches ohne Behandlung erhalten wurde, woraus geschlossen werden konnte, dass das Antigen, welches mit 7D7-Antikörper reaktiv war, von seiner Natur her, kein Protein war.

Zum spezifischen Nachweis, ob der 7D7 mit einem Kohlehydratepitop reagierte, wurden die elektrotransferierten Desoxycholatproben einer milden Periodat-Oxidation unterworfen, bevor das Nitrocellulosepapier mit dem Antikörper umgesetzt wurde. Diese Reaktion bewirkte die Zerstörung der Kohlehydratdeterminanten und demzufolge ihre anschliessende Reaktivität ohne Änderung der Protein- oder Lipidepitope (Woodward, M. P., et al., «Detection of Monoclonal Antibodies Specific for Carbohydrate Epitopes Using Periodate Oxidation», J. of Immunol. Methods, 78: 143 —153 (1985)). Kurz geschildert, wurden nach der Blok-kierung des elektroblottierten Nitrocellulosepapiers, welche die elektrophoresierte Probe enthielt, mit PBS-Tween blok-kiert, wie dies hier beschrieben ist; das Papier wurde mit 50 mM Essigsäure/Natriumacetatpuffer, pH 4,5, gespült. Das Nitrocellulosepapier wurde in 50 mM Periodsäure aufgelöst und in Acetatpuffer während 60 Min. im Dunkeln bei Zimmertemperatur aufgelöst. Das behandelte Papier wurde dreimal in PBS-Tween gespült und mit dem Antikörper, wie hier beschrieben, umgesetzt. Die in dieser Weise behandelten, elektroblottierten Desoxychloratextrakte waren nicht mehr länger mit dem monoclonalen 7D7-Antikörper rekativ. Diese Daten zeigen genau, dass das durch diesen Antikörper erkannte Epitop ein Kohlehydrat darstellt, welches an den LPS-Molekülen der hier beschriebenen Bakterien vorhanden ist.

Der Isotyp des monoclonalen 7D7-Antikörpers, wurde in einem ELISA-Verfahren bestimmt, welches ähnlich ist, wie die oben Spezifitätstests, jedoch mit der Ausnahme, dass

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

672 072

biotinyliertes Geissen-Antihuman-IgG (Gamma-Ketten-spezifisch, TAGO) oder biotinyliertes Geissen-Antihuman-IgM (Mu-Ketten-spezifisch, TAGO) im zweiten Schritt, anstelle des breiter reaktiven biotinyliertem Geissen-Antihu-man-Ig verwendet wurde. Beide Reagenzien wurden in einer Verdünnung von 1: 500 eingesetzt und die Antigenplatte enthielt Pools von PLL-immobilisierten E. coli 08 und 075-Stämmen. Die positive Reaktion des monoclonalen 7D7-Antikörpers mit E. coli-Stämmen wurde nur mit dem Anti-IgM-Reagenz beobachtet, was auf einen IgM-Isotyp für den monoclonalen Antikörper hinwies. Der Fachmann wird erkennen, dass im Fall die obigen Verfahren mehrere Male wiederholt werden und die Isotypen der erhaltenen Interge-nus-kreuzreaktiven monoclonalen Antikörper bestimmt würden, zusätzliche, z. B. IgM- und IgG-Isotypen gefunden würden (Frosch, M., et al., «NZB Mouse System for Production of Monoclonal Antibodies to Weak Bacterial Antigens: Isolation of an IgG Antibody to the Polysaccharide Capsules of Escherichia coli Kl und Grop Meningocci», Proc. Nati. Acad. Sei., 82:1194-1198 (1985)).

G. In vitro-Aktivität

Es wurde die funktionelle in vitro-Aktivität des monoclonalen 7D7-Antikörpers in einem in vitro-Opsonophagocyto-se-Test geprüft, wobei die bakteriozide Aktivität des Antikörpers in Gegenwart und Abwesenheit des humanen Neu-trophils und des humanen Komponents verglichen wurde.

Die Bakterien wurden hergestellt, entv/eder indem 10 ml einer tryptischen Sojabrühe (TSB) mit 501 einer Übernacht-Brühenkultur (für E. coli, S. marcescens und E. aerogenes) inokuliert wurde oder indem für K. pneumoniae einer Petrischale, welche Worfel-Ferguson-Agar enthielt, gestreift wurde. Für Brühenkulturen wurden die Röhrchen bei 37 °C auf einem Schüttelapparat während 3 Std. inkubiert, wobei nach dieser Zeit 1,5 ml der Kultur während 1 Min. bei 10 000 x g kultiviert wurde und das erhaltene Kulturmedium verworfen wurde und die Kügelchen in 3,5 ml «Hank's balanced sait solution», die 0,1% Gelatine und 5 mM HEPES (HBSS/Gel) enthielt, suspendiert wurden. Für die auf der Agarplatte gezüchteten Bakterien wurden die Kolonien von der Platte in steriles HBSS/Tel abgekratzt. Für die Bakterien, welche unter beiden Bedingungen gezüchtet wurden, wurden die Bakterienkonzentrationen auf 10 x 103 Bakterien/ml eingestellt, indem die O.D.660 gemessen wurde und zweckmässige Verdünnungen vorgenommen wurden (ungefähr 1: 50 000). Die humanen Neutrophile wurden gemäss van Furth und Van Zwet isoliert («In vitro Determination of Phagocytosis and Introcellular Killing by Polymorphonuclear and Mononu-clear Phagocytes», in Handbook of Expérimental Immuno-logy, Vol. 2, D. M. Weir, ed., 2. Auflage, Blackwell Scientific Publifications, Oxford, 36.1—36.24 (1973)) mit verschiedenen Änderungen. Buffy-coats von 10 ml heparinisiertem Blut wurde mit Ficoll-Pacque unterschichtet und zentrifu-giert. Die roten Blutzellen (RBC)-Kügelchen wurden einmal mit RPMI 1640-Medium gewaschen und in einem gleichen Volumen PBS mit einer Temperatur von 37 °C resuspendiert. 3 ml dieser Suspension wurden zu 6 ml 2% Dextran (in 37 =C PBS) gegeben und der Inhalt massig, jedoch gründlich, gemischt. Nach 20 Min. Inkubation bei 37 °C, damit sich die RBS sedimentieren konnten, wurde der Überstand (welcher die Neutrophile enthielt) entfernt, zweimal mit PBS 4CC, einmal in HBSS/Gel gewaschen und in demselben mit einer Konzentration von 5 x 107 Neutrophilen/ml suspendiert. Für die Komplementquelle, welche mit E. coli und S. marcescens verwendet wurde, wurde humanes Serum zweimal mit lebenden Bakterienpools adsorbiert (Bjornson, A. B. und Michael, J. G., «Factors in Human Serum Promoting Phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa I. Interaction of

12

Opsonins with the Bacterium», J. of Inf. Dis., 130Suppl: S119 — S126 (1974), welche den Organismen entsprachen, die in Tests verwendet wurden. Dieses Serum wurde weiterhin mit gekochtem Zymosan (Bjornson, supra) adsorbiert, um s die Serumkomponente Properidin zu entfernen, einem Molekül, welches für die Aktivierung des alternierenden Komplementweges nötig ist.

Es wurden Platten hergestellt, um die Anzahl der über-io lebenden/zerstörten Bakterien zu bestimmen, wobei mit der Erwärmung von 24-Lochplatten auf 37 °C während 3 bis 5 Std. angefangen wurde. Eine 0,4% Lösung Agarose in TSB wurde hergestellt, indem die Mischung während 5 Min. autoclaviert wurde und in einem Wasserbad auf 50 °C abge-i5 kühlt wurde. Etwa 15 Min. vor dem Ende der finalen Inkubationsperiode im Opsonophagocytose-Test wurde die 24-Lochplatte aus dem 37 °C-Inkubator entfernt und auf eine heisse Platte mit einer Temperatur von 42 °C gegeben und 0,4 ml TSB/Agarose in jedes Loch gegeben. Die Platte wurde 20 unmittelbar in den 37 °C-Inkubator zurückgelegt, damit sich die Agarose nie unter 37 °C abkühlen konnte.

Für den Test wurden 25 (0.17D7-Kulturüberstand und 25 |xl eines zweckmässigen Bakterienstammes zweifach in 96-25 Loch-Rundboden-Mikrotiterplatten gegeben und bei RT während 30 Min. inkubiert. Anschliessend folgte die Zugabe von 15 (xl Komplement 15 |il humanen Neutrophilen (5 x 106/ml) und 70 p.1 HBSS/Gel. Die gesamte Oberfläche der Platte wurde mit einem sterilen Baumwollappen abge-30 wischt und ein klebbarer Kunststoffplattenverschluss wurde angebracht, um die gesamte Platte und die zwischen den Löchern liegende Bereiche sicher abzudecken und die Platte wurde bei 37 °C während 1 Std. rotiert. Nach der Inkubation wurde die Platte während 5 Min. bei 100 x g zentrifugiert 35 und der Plattendeckel wurde vorsichtig entfernt und die Plattenoberfläche mit einem sterilen Baumwollappen, welcher in 70% Ethanol getaucht war, getrocknet. 50 (il wurde von jedem Mikrotiterloch éntfernt und zu den individuellen Löchern der 24-Loch-Quantiflkationsplatten, welche schon 40 0,4 ml/Loch von geschmolzener (38 — 40 °C) 0,4% TSB/ Agarose enthielten, gegeben. Diese Platten wurden während 1 Min. in ein Flachbett-Schüttelgerät gegeben und mit 150 Umdrehungen pro Min. laufengelassen und die Agarose Hess man anschliessend 15 Min. bei Zimmertemperatur erstarren. 45 Schliesslich wurde jedes Loch mit 0,4 ml TSB/Agarose überschichtet, wonach eine Ertungsperiode von 15 Min. bei 4 °C folgte, bevor die Platten über Nacht bei 37 °C inkubiert wurden. Nach 18 Std. wurden die Kolonien numeriert und die Daten für jede kolonienbildende Einheit (CFU) für alle Be-50 dingungen aufgenommen.

Die hier verwendeten bakteriellen Serotypen mit Ausnahme von K. pneumoniae wurden nur in Gegenwart von monoclonalen Antikörpern 7D7, einer aktiven Komple-55 mentquelle und humanen Neutrophilen (Tabelle 1) inaktiviert. Bei der Wiederholung des Experimentes mit verschiedenen nicht-7D7-reaktiven bakteriellen Serotypen wurde keine bakterielle Zerstörung beobachtet (Daten nicht angegeben), was auf die Kapazität zur Opsonisierung von Bakte-60 rien und Förderung ihrer Phagocytose hinwies. Da die kombinierten Aktionen von Opsoninen (spezifische Antikörper) und von Polymorpho-nuklearen Leukocyten (Neurophilen), dem primären Organismus für die Immunität gegen diese Bakterienstämme zu sein scheint, führen diese Daten zum 65 Schluss, dass der Antikörper 7D7 nach zweckmässiger Verabreichung einen Schutz gegen die lethalen Herausforderungen mit den hier beschriebenen Bakterien-Serotypen bewirken würden.

13

Tabelle 1

672 072

Bakterien Neurophile Antikörper Komplement % Zerstörung der zu geführten Bakterien

E. coli

+

7D7

_a

0

08 und 075

E. coli

+

6Fllb

+

0

08 und 075

E. coli

—

7D7

+

0

08 und 075

E. coli

+

7D7

+

85%

08 und 075

S. marcescens

+

7D7

—

0

012 und 015

S. marcescens

+

6F11

+

0

012 und 015

S. marcescens

—

7D7

+

0

012 und 015

S. marcescens

+

7D7

+

85%

012 und 015

E. aerogenes

+

7D7

—

0

Isolate (2)

E. aerogenes

+

6F11

+

0

Isolate (2)

E. aerogenes

—

7D7

+

0

Isolate (2)

E. aerogenes

+

7D7

+

85%

Isolate (2)

a (—) = Hitze-inaktiviertes (56 °C während 30 Min.) humanes Komplement.

b(6Fll) = Kulturüberstand, welcher einen humanen monoclonalen IgM-Antikörper gegen Pseudomonas aeruginosa Fisher-Typ 2 enthält.

35

Überstand wurde verworfen. Das Gel wurde vor der Verwendung einmal mit 0,1 M Acetat/Kochsalzlösungpuffer (6,8 g Natriumacetat-trihydrat und 14,6 g NaCl wurden in 500 ml destilliertem Wasser, welches 2,9 ml Eisessig enthielt, 40 aufgelöst, pH 4,0), zweimal in Kupplungspuffer und zweimal in PBS gewaschen. Das Gel wurde in eine Pharmacia C10/10-Säule gegossen und bis zum Gebrauch bei 4 °C aufbewahrt.

Zur Reinigung des Immunoglobulins wurden 0,5 ml des 45 Salz-fraktionierten Materials mit PBS bis zu einem Volumen von 2 ml verdünnt und in die Affinitäts-Säule gegeben. Im Anschluss an die Probeneingabe wurde die Säule mit PBS, pH 8,0 gewaschen, bis die Absorptionsanzeige zeigte, dass kein weiteres Protein durchfloss. Der verbundene Antikör-50 per wurde mit 2 M MgCl in PBS gewaschen, das Protein wurde in jeder Fraktion bei O.D.280 gemessen und die Spitzenfraktionen wurden gepoolt. Die Antikörper-enthaltenden Fraktionen wurden auf einer Sephadex-G-25 entsalzt und nötigenfalls durch Mikrokonzentrations-Zentrifugierung 55 konzentriert (Centricon 30, Amicon Corp., Danver MA) bis zu 1 —2 mg/ml. Das erhaltene Präparat wurde durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Silbernitrat-Färbung der Proteine getestet (Morrissey, J. H., «Silver Stain for Proteins in Polyacrylamide Gels: A Modified Procedure with 60 Enhanced Uniform Sentitivity», Anal. Biochem., (1981) 117: 307—310) und auf Antikörper-Aktivität wie hier beschrieben durch ELISA.

Für jede Bakterienherausforderung wurden weibliche 65 Outbred-Swiss-Webster-Mäuse mit einem Gewicht von 20 bis 22 g in drei Gruppen von je zehn Mäusen aufgeteilt. Ein repräsentatives Experiment wurde folgendermassen durchgeführt:

H. In vivo-Aktivität

Zum Test der obigen Hypothese wurde der Schutz mit 7D7-Antikörpern bei Tieren studiert, wobei mindestens ein Organismus der hier beschriebenen E. coli und E. aerogenes-Arten verwendet wurde. Der 7D7-Antikörper und der negative Kontrollantikörper (6F11, humaner IgM monoclonaler Antikörper, welcher gegen Pseudomonas aeruginosa Fisher-Immunotyp 2 spezifisch ist) wurden zuerst in den Kulturüberständen konzentriert, indem mit festem Ammoniumsulfat ausgefällt wurde (50% Endkonzentration) (Good, A. J. et al., «Purification of Immunoglobulins and Their Fragments» in Selected Methods in Cellular Immunology, Mis-hell, B. B. and Shiigi, S. M., eds., W. H. Freeman and Company, San Francisco, CA (1980) 279—286). Das präcipierte Material wurde in sterilem Wasser rekonstituiert und extensiv gegen PBS dialysiert.

Der IgM-Antikörper im Ammoniumsulfatsalz-Präcipitat wurde durch Affinitäts-Chromatographie an einem monoclonalen Mäuse-Antihuman-IgM-Antikörper an einer Affinitätssäule gereinigt. Zur Herstellung der Säule wurde 1 g entwässerte Cyanbromid-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia) mit 15 ml eiskalter 1 mM HCl in destilliertem Wasser gemischt. Das hydratisierte Gel wurde in 30 ml Kupplungspuffer (0,1 M Carbonat (NaHC03) in 0,5 M NaCl, pH 8,2) gewaschen, zu einem feuchten Kuchen abgepresst und mit dem Ammoniumsalz-Präzipitat in 1 —3 ml Kupplungspuffer kombiniert. Die Gelsuspension wurde durch Schwenken während 2 Std. bei Zimmertemperatur gemischt und anschliessend bei 200 x g während 5 Min. zentrifugiert. Zur Blockierung von noch vorhandenen reaktiven Stellen wurde der Überstand entfernt, 10 ml 1 M Ethanolamin zum Gel zugesetzt und das Mischen wie oben fortgesetzt. Die Suspension wurde mit 200 x g während 5 Min. zentrifugiert und der

672 072

14

Gruppe Bakterien Antikörper

A E. coli 08 7D7

B E. coli 08 6F11

C S. marcescens 014 7D7

Jede mit Antikörpern zur behandelnde Gruppe wurde intravenös mit 200 nl sterilem PBS, welches 25 |xg gereinigte Antikörper enthielt, eingespritzt. Zwei Stunden später wurden alle Tiere intraperitoneal mit 300 jj.1 lebenden Bakterien herausgefordert. Sie erhielten 3 LD50 des entsprechenden Bakterienstammes. Die Bakteriensuspension wurde aus einer Brühenkultur in der logarithmischen Phase hergestellt, wobei die Bakterien zentrifugiert, zweimal in PBS gewaschen und in einer zweckmässigen Konzentration PBS resuspendiert wurden. Die Tiere wurden während einer Periode von 5 Tagen beobachtet. 24 bis 48 Std. nach der Herausforderung waren sämtliche Tiere der Gruppe B (irrelevanter Antikörper) und der C (irrelevanter Organismus) tot. Im Gegensatz dazu waren diejenigen Tiere, welche den 7D7-Antikörper erhielten (Gruppe A) alle lebend und ohne Symptome.

Das Tierversuchmodell wurde zur Demonstration des therapeutischen Effektes des 7D7 gegen die bakterielle Herausforderung mit den drei genannten Gattungen verwendet. Eine Zusammenfassung der Daten ist in der Tabelle 2 dargestellt:

Tabelle 2

Herausfordernde Überlebende/ Heraus- % ÜberBakterien Antikörper forderung lebende

E. coli 08 7D7 10/10 100

E. coli 08 6Flla 0/10 0

S. marcescens 014b 7D7 0/10 0

a der 6F11-Antikörper ist spezifisch auf Pseudomonas aeruginosa

Fisher-Immunotyp 2 und dient als Negativkontroll-Antikörper. b S. marcescens 014 ist mit dem 7D7-Antikörper nicht reaktiv und dient als nicht-spezifischer Kontrollorganismus.

Tabelle 2a

% Überlebende'

Tag

Antikörper

0

1

2

3

4

6F11

12

2

2

1

1

7D7

12

10

6

4

4

c Die LD50-Bestimmung und die Schlitzstudien wurden mit Mäusen durchgeführt, welche durch Injektion mit Cyclophosphamid folgen-dermassen neutropenisch gemacht wurden: Tag 0 -150 mg/kg, Tag 2-50 mg/kg. Am Tag 4 erhielten die Mäuse Antikörper und Bakterien wie beschrieben.

Diese Daten demonstrieren, dass der humane monoclonale Antikôrpçr 7D7 fähig ist, Mäuse vor lethalen Herausforderungen mit Bakterien zu schützen, welche zu drei unterschiedlichen gram-negativen Bakterienarten gehören. Da 7D7 mit einem Kohlehydratepitop, welches am LPS vorhanden ist, reaktiv ist, jedoch die LPS-Moleküle am K. pneumoniae weniger zugänglich sind (Orskov, I. und Orskov, F., «Serotyping of Klebsiella» in Methods in Microbiology, Vol. 14, Bergan, T., Ed., Academic Press, Orlando, Fl (1984) 143 —146) war ein Schutz gegen K. pneumoniae-Infektionen durch den Antikörper 7D7 nicht ersichtlich. Die Daten sind nicht angegeben. Dessen ungeachtet verleihte der Intergenus kreuzreaktive humane monoclonale Antikörper 7D7 mit 25 g des gereinigten Antikörpers einen Schutz gegen Infektionen, welche zu den gram-negativen Bakterienarten E. coli und E. aerogenes gehören.

Beispiel II

5 Das Beispiel II demonstriert Verfahren für die Herstellung und Selektion von humanen, monoclonalen Antikörper, welche eine Intergenus Kreuzreaktivität gegen Mitglieder der Arten Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae und Enterobacter aerogenes besitzen. Weiter demonstriert 10 dieses Beispiel, die in vitro-Aktivität vom genannten Antikörper gegen die homologen S. marcescens-, K. pneumoniae- und E. aerogenes-Serotypen. Das Verfahren gemäss Beispiel I (im wesentlichen wie dies in den Teilen A bis G beschrieben ist) wurde wiederholt, um einen humanen mono-15 clonalen Antikörper herzustellen, welcher gegen Infektionen, welche durch die hier beschriebenen Bakterien verursacht werden, kreuzreaktiv ist, mit der Ausnahme, dass es erforderlich war, spezifische Änderungen für die Charakterisierung und für den Nachweis des in diesem Beispiel beschrie-20 benen Antikörper erforderlich war. Im folgenden sind die Änderungen im Testverfahren und die durch den monoclonalen Antikörper erhaltenen Resultate angegeben.

1. Der Kulturüberstand von sechs Transformationen wurde durch das obige Verfahren analysiert, wobei die Iden-

25 tifikation eines Loches (4F10) eine Aktivität gegen die S. marcescens-Serotypenplatte, jedoch nicht gegen die E. coli oder die Kontrollplatte ergab. In einem anschliessenden ELISA mit dem individuellen S. marcescens-Serotypen wurde bestimmt, dass dieses Loch einen Antikörper enthielt, 30 welcher mit den S. marcescens-Serotypen 015 und 018 reaktiv war, jedoch nicht mit einem der anderen 20 bekannten S. marcescens-LPS-Serotypen.

Am 28. Januar 1986 wurde die kontinuierliche transformierte humane Zellinie mit der Identifikation 4F10 bei der 35 American Type Culture Collection, Rockville, MD 20 852 USA eingereicht. Sie erhielt die Hinterlegungsnummer ATCC-Nr. CRL 9007.

2. Ein Antikörper von geclonten Zellinie 4F10 wurde auf weitere Intergenus-Kreuzreaktivität durch eine Modifikati-

40 on der Standard-Immunoblottingtechnik durchgeführt. Spezifisch wurde hierzu die Kreuzreaktivität gegen die Bakterien K. pneumoniae, E. aerogenes und E. cloacae untersucht, indem die Bakterien auf eine unterteilte Nitrocellulose-Papier-scheibe aufgetragen wurde, diese Papierscheibe, welche die 45 Bakterien enthielt, mit dem genannten Antikörper umgesetzt wurden und die Antikörper-Reaktionen mit einem alkalischen Phosphatase/Nitroblau-T etrazolium-Enzymsystem entwickelt wurden.

Aus diesen Experimenten wurde gefunden, dass der so 4F10-Antikörper eine weitere Intergenus-Kreuzreaktivität aufwies. Dieser Antikörper reagierte mit den folgenden Serotypen:

K. pneumoniae S. marcescens E. aerogenes

K3,12,29,31,68,72 015,18 Klinische

Isolate

Demzufolge besass der humane monoclonale Antikörper 60 4F10 eine Intergenus-Kreuzreaktivität gegen die Bakterien, welche zum Spezies S. marcescens, K. pneumoniae und E. aerogenes gehörten.

3. Unter Verwendung der Immunoblotting-Technik wurden positive Reaktionen auf allen Spuren festgestellt, welche es Desoxycholat-Extrakte der oben beschriebenen Bakterien enthielten. In diesen Spuren erschien der Antikörper 4F10 als breites Band von Komponenten oder als Serie von Molekülteilen mit regelmässigem Abstand, welche ein leiterartiges

15

Muster ergaben. Dieses Profil war vollständig mit demjenigen, welches in den Polyacrylgel-Elektrophoresen-Analysen von Kohlehydratresten festgestellt worden war und zeigte entweder eine extensive Molekulargewichts-Heterogenität aufgrund von sich häufig wiederholenden spezifischen Zuk- s kersequenzen oder LPS-Molekülen, welche sich durch Gewichtszunahmen unterschieden, welche der Anzahl von Einheiten von O-antigenischen Oligosaccharid-Seitenketten pro Molekül unterschieden (Vimr, E. R., et al., «Use of Proca-ryotic-Derived Probes to Identify Poly (Sialic Acid) in Neo- 10 natal Neuronal Membranes», Proc. Nati. Acad. Sei., (1983) 81:1971 —1975; und Holden, K. G., et al., «Gel Electropho-resis of Mucous Glycoproteins, I. Effect of Gel Porosity», Biochemistry (1971) 10: 3105—3109). Diese Daten zeigen,

dass der monoclonale Antikörper 4F10 gegen eine antigeni- is sehe Determinante gerichtet ist, welche durch die Kohlehydratmoleküle geteilt wird, welche auf einigen Serotypen von S. marcescens, K. pneumoniae und E. aerogenes gefunden werden.

Die Immunoblotting-Muster, welche nach der Proteinase 20 K-Behandlung beobachtet wurden, waren identisch mit denjenigen Mustern, welche ohne Behandlung vorhanden waren, woraus gefolgert werden kann, dass das Antigen, welches mit dem 4F10-Antikörper reaktiv ist, von seiner Natur her, kein Protein ist. 25

Für spezifische Angaben, ob 4F10 mit Kohlehydratepi-topen reagiert, wurde die Elektro-transferierte Desoxycho-latprobe einer milden Periodat-Oxidation unterworfen, bevor das Nitrocellulosepapier mit dem Antikörper umgesetzt wurde. Die Elektroblotting-Desoxycholatextrakte, welche 30 auf diese Weise behandelt wurden, waren nicht mehr mit dem 4F10 monoclonalen Antikörper reaktiv. Diese Daten deuten stark daraufhin, dass das Epitop, welches durch die672 072

sen Antikörper erkannt wird, ein Kohlehydratrest darstellt, welcher an Molekülen vorhanden ist, die zu den obengenannten Bakterien gehören.

4. Der Isotyp des monoclonalen Antikörpers 4F10 wurde in ähnlicher Weise, wie dies für die Spezifitätstest in Beispiel I durch ein ELISA-Verfahren durchgeführt wurde, mit der Ausnahme, dass die Antigenplatte einen Pool von PLL-immobilisierten S. marcescens 015 und 018-Serotypen enthielt. Die positive Reaktion des monoclonalen Antikörpers 4F10 mit den S. marcescens-Serotypen wurde nur mit dem Antigen-IgM-Reagenz beobachtet, was demonstrierte, dass der monoclonale Antikörper vom IgM-Isotyp war. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass wenn dass Verfahren, nach diesem Beispiel mehrere Male wiederholt wird und die erhaltenen Isotypen von Intergenus-Kreuzreaktiven monoclonalen Antikörpern bestimmt werden, man zusätzliche Isotypen finden kann, z. B. IgM und IgG-Isotypen.

5. Die in vitro-funktionelle Aktivität des monoclonalen Antikörpers 4F10 wurde in einem Opsono-phagocytischen Test geprüft, wobei die bakteriozide Aktivität des Antikörpers in Gegenwart oder Abwesenheit von sowohl humanen Neutrophilen, wie auch humanen Komplementen verglichen wurde. Die hier verwendeten bakteriellen Serotypen wurden nur in Gegenwart des monoclonalen Antikörpers 4F10, einer aktiven Komplementquelle und humanen Neutrophilen (Tabelle 3) inaktiviert. Bei der Wiederholung dieses Versuches mit verschiedenen nicht-4F10-reaktiven bakteriellen Serotypen, konnte keine bakterielle Zerstörung festgestellt werden (die Daten sind nicht angegeben) was die funktionelle Spezifität des monoclonalen Antikörpers 4F10 und seine Kapazität zur Opsononisierung von Bakterien und für die Förderung ihrer Phagocytose demonstriert.

Tabelle 3

Bakterien Neutrophile Antikörper Komplement % Zerstörung der ein gesetzten Antikörper

S. marcescens

+

7D7

a

0

018 und 015

S. marcescens

+

6Fllb

+

0

018 und 015

S. marcescens

—

7D7

+

0

018 und 015

S. marcescens

+

7D7

+

85%

018 und 015

K. pneumoniae

+

7D7

—

0

K3 und K12

K. pneumoniae

+

6F11

+

0

K3 und K12

K. pneumoniae

—

7D7

+

0

K3 und K12

K. pneumoniae

+

7D7

+

60%

K3und Kl 2

E. aerogenes

+

7D7

—

0

Isolate (2)

E. aerogenes

+

6F11

+

0

Isolate (2)

E. aerogenes

—

7D7

+

0

Isolate (2)

E. aerogenes

+

7D7

+

85%

Isolate (2)

a (—) = Wärme-inaktiviertes (56 :C während 30 Min.) humanes Komplement.

b (6F11) = Kulturüherstand, der einen IgM-humanen monoclonalen Antikörper gegen Pseudomonas aeruginosa Fisher-Typ 2 enthält.

672 072

Beispiel III

Das Beispiel III demonstriert Verfahren für die Herstellung von humanen monoclonalen Antikörpern, welche sowohl mit dem Escherichia coli kapsulärer Typ Kl und Neisseria meningitidis (N. meningitidis) Gruppe B Polysaccharid und im übrigen eine protektive Aktivität des genannten Antikörpers in vivo gegen eine lethale Herausforderung von homologen E. coli und N. meningitidis-Bakterienarten zeigt.

Das Verfahren gemäss Beispiel I (im wesentlichen beschrieben in den Teilen A bis G) wurde wiederholt zur Herstellung eines humanen monoclonalen Antikörper, welcher kreuzprotektiv gegen Infektionen war, welche durch die hier beschriebenen Bakterien verursacht wurden, mit der Ausnahme, dass es erforderlich war, spezifische Änderungen durchzuführen, um den in diesem Beispiel beschriebenen Antikörper zu charakterisieren und zu testen. Im folgenden sind die Änderungen im Testverfahren und die erhaltenen Resultate mit den hier beschriebenen Antikörpern angegeben.

1. Die Kulturüberstände von 5 Transformationen wurden durch die obigen Methoden analysiert, wobei die Identifikation von 4 Löchern (5D4,2C10,9B10 und 8A8) mit enthaltener anti-E. coli-Spezifität auf der E. coli-Serotypplatte, jedoch nicht auf der S. marcescens oder der Kontrollplatte resultierte. In anschliessenden ELISA-Verfahren, die wie angegeben durchgeführt wurden, wurde an individuellen E. coli-Serotypen gefunden, dass diese Löcher eine Antikörper-Reaktivität aufweisen, mindestens mit den E. coli-Serotypen: 01 (ATCC 23 499), 07 : Kl (ATCC 12 792), 016 : Kl (ATCC 23 511) und 050 (CDC 1113-83), aber nicht 04 (ATCC

12 792), 06 : K2 (ATCC 19 138), 08 : K8 (ATCC 23 501), 09 : K9 (ATCC 23 505) oder 022 : K13 (ATCC 23 517). Wegen der besseren Durchführbarkeit während dem Clonie-rungsverfahren und der verbesserten Antikörperproduktion wurde der monoclonale Antikörper 9B10 für die weiteren Analysen ausgewählt.

Am 28. Januar 1986 wurde eine kontinuierliche transformierte humane Zellinie mit der Identifikation 9B10 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD 20 852 USA hinterlegt. Sie erhielt die Hinterlegungsnummer ATCC-Nr. CRL 9006.

2. Die Erkenntnis, dass die monoclonalen Antikörper von jedem Clon mit verschiedenen Gruppen von E. coli O-Antigen-Serotypen reagierten, zeigte an, dass diese Antikörper, gegen eine bakterielle Oberflächenstruktur gerichtet waren, welche diesen Serotypen gemeinsam war. Es wurden verschiedene Wege verwendet, um die diesen E. coli-Serotypen gemeinsame Oberflächenstruktur zu definieren. Wie erwähnt, besitzen zwei (07 : Kl und 016 : Kl) der vier E. coli-Serotypen, welche durch den 9B10-Antikörper identifiziert werden, den kapsulären Serotyp Kl während die anderen beiden (01 und 050) nicht auf ihren K-Antigen-Serotyp bestimmt wurden. Es wurde demzufolge die Möglichkeit verfolgt, dass der Antikörper 9B10 Reaktivität mit dem Antigen Kl aufwies und dass die E. coli, welche die O-Antigen-Serotypen aufwiesen, ebenfalls den kapsulären Serotypen Kl besassen. Zum Nachweis ihrer Gegenwart besitzen andere den Vorteil der Thermolabilität der Kl-Kapsel. Das Erwärmen des Kl-positiven E. coli-Serotypen in einem kochenden Wasserbad bei 100 °C während 60 Min. entfernt anschliessend die Fähigkeit dieser Stämme, mit dem Anti-Kl-Serum zu reagieren und erhöht ihre Fähigkeit mit Anti-O-Antigenseren zu reagieren (Orskov, F. und Orskov, K., «Serotyping of Escherichia coli,» in Methods in Microbiology, Vol. 14, T. Bergan, ed., Academic Press, London (1984), Seiten 44—105). Die reziproken Effekte beruhen sehr wahrscheinlich auf der Entfernung der Kapsel und der verbesserten Zugänglichkeit des Antikörpers für die Lipopolysaccha-

16

rid-Moleküle (LPS). Die E. coli-Kl-positiven Serotypen (07 und 016) und die als nicht-K 1-typisierten Sero typen (01 und 050) wurden wie oben beschrieben erwärmt und mit dem 9B10-Antikörper und dem LPS-Serotyp (spezifischen hete-5 rologen Serum) (Difco Bacto-E. coli Typing Reagents) im ELISA-Verfahren umgesetzt. Die wärmebehandelten Organismen verloren alle Aktivität gegenüber dem Antikörper 9B10 und erhöhten ihre Aktivität mit ihrem homologen LPS-Serotypen-spezifischen Serum und während die nicht-io behandelten Organismen (Kontrollen) stark mit 9B10-Kulturüberständen reaktiv blieben und schwach mit den entsprechenden LPS-Serotypen-spezifischen Antigenen reaktiv waren.

Das Polysaccharid (Kohlehydrat) aus Neisseria meningi-15 tidis Gruppe B-Bakterien (ein Homopolymer aus Sialsäure, Alpha 2, 8-gebundener Poly-N-acetyl-neuraminsäure) wurde chemisch und antigenisch als homogen mit dem E. coli Kl Polysaccharid nachgewiesen (Grados, O. und Ewing, W. H. «Antigenic Relationship between Escherichia coli und Neis-20 seria meningitidis» J. Immunol. (1973) 110: 262 — 268). Diese Daten führen zum Schluss, dass wenn der monoclonale Antikörper 9B10 Spezifität für die E. coli-Kl-Kapsel aufweist, dann sollte der Antikörper Spezifität für das N. meningiti-dis-Gruppe B-Polysaccharid aufweisen und weiter sollte die-25 ser monoclonale Antikörper, welcher Spezifität mit dem Gruppen B-Polysaccharid von N. meningitidis aufweist, ebenfalls Reaktivität mit den E. coli-Stämmen welche die Kl-Kapsel besitzen, aufweisen. Es wurden zwei Verfahrensweisen verwendet, welche 1. die Fähigkeit der Antikörper 30 9B10 testeten mit N. meningitidis zu reagieren und 2. auf die Fähigkeit eines Antikörpers gegen N. meningitidis-Gruppe B-Polysaccharid mit den vier E. coli-9B10-reaktiven Sero typen zu reagieren.

Hochgereinigte Polysaccharide der Gruppe B (Conaught 35 Laboratories, Toronto, Canada) und lebensfähige N. meningitidis-Gruppe B-Bakterien wurden mit dem Antikörper 9B10 in einem ELISA wie angegeben, umgesetzt. Der monoclonale Antikörper 9B10 mit beiden Antigen-Präparaten stark. Zum Beweis der Umkehrspezifität wurde eine kom-40 merziell erhältlich N. meningitidis Gruppe B-Meningitis-Ausrüstung verwendet («Directagen» Direct Antigen Detection System, Hyson, Westcott und Dunnig, Baltimore, MD), welches Latexkugeln verwendet, welche mit einem monoclonalen Mäuseantikörper gegen die Polysaccharide der Grup-45 pe B beschichtet waren, verwendet. Bei Agglutinationsversuchen, wobei die 9B10-positiven E. coli-Serotypen verwendet wurden, wurde für alle vier Serotypen eine starke Reaktivität mit den Antikörper-beschichteten Kügelchen beobachtet. Die E. coli-Serotypen, welche als Kl-Antigen-negativ be-50 kannt sind wurden ebenfalls in diesem Testsystem getestet, wobei das Resultat ebenfalls negativ war. Zusammen geben diese Daten an, dass der monoclonale Antikörper 9B10 eine Reaktivität mit der E. coli-Kl-Kapsel und dem typenspezifischen Kohlehydrat auf N. meningitidis Gruppe B besitzt. 55 Weiter wurden diese Versuche ebenfalls mit intakten lebensfähigen Bakterien durchgeführt und es kann gefolgert werden, dass der monoclonale Antikörper 9B10 spezifisch auf einen Teil der extern exponierten Region des Polysialin-Säuremoleküls ist.

60 3. Der Isotyp des monoclonalen Antikörpers 9B10 wurde in einem ELISA-Verfahren bestimmt, welches ähnlich ist, wie die Spezifitäts-Test, welche in Beispiel I beschrieben wurden, jedoch mit der Ausnahme, dass die Antigenplatte einen Pool von PLL-immobilisierten E. coli-Kl-positiven 65 Serotypen enthielt. Die positive Reaktion des monoclonalen Antikörpers 9B10 mit dem Kl-positiven E. coli-Serotypen wurde nur mit dem Anti-IgM-Reagenz beobachtet, was auf einen IgM-Isotyp für den monoclonalen Antikörper hinwies.

17

672 072

Es ist für den Fachmann ersichtlich, dass wenn das Verfahren dieses Beispiels mehrere Male wiederholt wird und die so erhaltenen Isotypen der Kl-spezifischen monoclonalen Antikörpern bestimmt werden, zusätzliche Isotypen gefunden werden können, IgM- und IgG-Isotypen.

4. Es wurde die in vitro-funktionelle Aktivität des monoclonalen Antikörpers 9B10 in einem opsonophagocytischen Test geprüft, wobei die bakteriozide Aktivität des Antikörpers in Gegenwart und Abwesenheit von sowohl humanem neurophilem, wie auch humanem Komplement verglichen wurde.

Die Kl-positiven E. coli-Serotypen wurden nur in Gegenwart des monoclonalen Antikörpers 9B10, einer aktiven Komplementquelle und humanen Neutrophilen inaktiviert (Tabelle 4). Bei der Wiederholung dieses Versuches mit verschiedenen Kl-negativen E. coli-Serotypen konnte kein bakterieller Zerstörungstest beobachtet werden (die Daten sind nicht angegeben) was demzufolge die Kl-Spezifität des monoclonalen Antikörpers 9B10 und seine Kapazität zur Opso-5 nosierung von Bakterien und die Förderung ihrer Phagocytose demonstriert. Da die kombinierte Wirkung der Opsonine (spezifische Antikörper) und der polymorphonuklearen Leukocyten (Neutrophile) der primäre Mechanismus für die Immunität von Kl-positiven E. coli-Serotypen zu sein io scheint, führen diese Daten zum Schluss, dass der Antikörper 9B10 nach zweckmässiger Verabreichung einen Schutz gegen eine lethale Herausforderung mit irgendeinem E. coli-Kl-eingekapselten Serotypen bewirken würde, ungeachtet seines O-Antigen-Serotyps.

15

Tabelle 4

Bakterien

Neutrophile

Antikörper

Komplement

% Zerstörung der zugeführten Bakterien

E. coli

+

9B10

a

0

01:K1 und 018:K1

E. coli

+

6Fllb

+

0

01:K1 und 018:K1

E. coli

—

9B10

+

0

01:K1 und018:Kl

E. coli

+

9B10

+

99%

01:K1 und 018:K1

N. meningitidis

+

9B10

—

0

Gruppe B

N. meningitidis

+

6F11

+

0

Gruppe B

N. meningitidis

—

9B10

+

0

Gruppe B

N. meningitidis

+

9B10

+

99%

Gruppe B

a (—) = Wärme-inaktiviertes (56 °C während 30 Min.) humanes Komplement.

b (6F11) = Kulturüberstand enthaltend einen humanen monoclonalen Antikörper IgM gegen Pseudomonas aeruginosa Fisher-Typ 2.

5. Zur Prüfung der obigen Hypothese wurden Schutzwirkungsstudien an Tieren durchgeführt, wobei der Antikörper 9B10 und verschiedene Kl-positive und Kl-negative E. coli-Serotypen und ebenso N. meningitidis Gruppe B-Serotyp (Stamm H313, erhalten von Dr. Carl Frasch, Laboratory of Bacterial Polysaccharides, Office of Biologics, Food and Drug Administration, Bethesda, MD) verwendet wurden.

Für jede Bakterienherausforderung wurden weibliche ausgewachsene Swiss-Webster-Mäuse mit einem Gewicht von 20 bis 22 g in drei Gruppen von je 10 Mäusen aufgeteilt. Ein repräsentatives Experiment wurde folgendermassen durchgeführt:

Gruppe

Bakterien

Antikörper

A B C

E. coli Kl E. coli Kl E. coli K2

9B10 6F11 9B10

Jeder Antikörper-empfangenden Gruppe wurde intravenös 200 jo.1 steriles PBS, welches 25 |ig gereinigter Antikörper enthielt, injiziert. 2 Std. später wurden alle Tiere intraperitoneal mit 300 (xl lebenden Bakterien, die 3 LD5o ihres entsprechenden bakteriellen Stammes enthielten. Die Bakteriensuspension wurde aus einer Kulturbrühe in logarithmischer

Wachstumsphase hergestellt, wovon die Bakterien zentrifu-45 giert, zweimal in PBS gewaschen und in einer zweckmässigen Konzentration in PBS resuspendiert wurden. Die Tiere während einer Periode von 5 Tagen beobachtet. 24 bis 48 Std. nach der Herausforderung waren sämtliche Tiere der Gruppe B (irrelevanter Antikörper) und der Gruppe C (irrelevan-50 ter Organismus) tot. Im Gegensatz dazu waren diejenigen Tiere, welche den 9B10-Antikörper erhalten hatten (Gruppe A), alle lebend und symptomfrei. Dieses Modell des Schutzes von Tieren diente zur Demonstration des therapeutischen Effektes des Antikörpers 9B10 gegen bakterielle Herausfor-55 derung mit Organismen, welche zu den zwei hier genannten Arten gehörten. Eine Zusammenfassung dieser Daten ist in Tabelle 5 dargestellt.

Tabelle 5

60

Bakterien- Antikörper Überlebende/ % Über

Herausforderung Herausforderung lebende

E. coli Kl 9B10 10/10

65 E. coli Kl 6Flla 0/10

E. coli K2b 9B10 0/10 N. meningitidis

Gruppe B 9B10 5/5

100% 0% 0%

100%

672 072

Tabelle 5 (Fortsetzung)

Bakterien- Antikörper Überlebende/ % Über

Herausforderung Herausforderung lebende

N. meningitidis

Gruppe B 6F11 0/5 0%

E. coli K2 9B10 0/5 0%

' Der 6F11-Antikörper ist spezifisch gegen Pseudomonas aeruginosa

Fisher-Immunotyp 2 und dient als negativer Kontrollantikörper. b E. coli K2 ist mit dem Antikörper 9B10 nicht reaktiv und dient als nicht-spezifischer Kontroll-Organismus.

Diese Daten demonstrieren, dass der humane monoclonale Antikörper 9B10 fähig ist, Mäuse von lethalen Herausforderungen mit Bakterien, welche zu zwei verschiedenen gram-negativen Bakterienarten gehören, zu schützen. Der Intergenus-kreuzreaktive Antikörper war fähig, einen passiven Schutz gegen Infektionen zu verleihen, welche durch Organismen, die den gram-negativen Bakterienarten E. coli und N. meningitidis Gruppe B angehörten.

Beispiel IV

Das Beispiel IV demonstriert Verfahren für die Herstellung eines humanen monoclonalen Antikörpers, welcher eine Intergenus-Kreuzreaktivität gegen Mitglieder der Art Escherichia coli (E. coli), Enterobacter cloacae (E. cloacae) und Gruppe B Streptococcus besitzen. Weiter demonstriert dieses Beispiel einen Antikörper, welcher kreuzreaktiv mit den Arten ist, welche zu den zwei Hauptbakterien-Abteilungen gehören; gram-negative (E. coli und E. cloacae) und gram-positive (Gruppe B Streptococcus). Weiter demonstriert dieses Beispiel noch die protektive in vivo-Aktivität des genannten Antikörpers gegen eine lethale Herausforderung von homologen E. coli- und Gruppe B Streptococcus-Serotypen. Das Verfahren gemäss Anspruch 1 (im wesentlichen die Teile A bis G), wurde zur Herstellung eines humanen monoclonalen Antikörpers mit Kreuzreaktivität gegen Infektionen, welche durch die hier genannten Bakterien verursacht werden, wiederholt, mit der Ausnahme, dass es nötig war, spezifische Änderungen zur Charakterisierung und zum Testen der in diesem Beispiel beschriebenen Antikörper vorzunehmen. Nachstehend sind die Änderungen im Testverfahren und in den mit den beschriebenen Antikörpern erhaltenen Resultaten angegeben.

1. Die Überstände wurden einem Screening auf die Gegenwart von Anti-Gruppe B Streptococcus-Antikörpern unterworfen, wobei eine «enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)» Technik wie sie in Beispiel I beschrieben ist, verwendet wurden. Die Antigen-Platten bestanden aus einer Serie von Flachboden-96-Loch-Immunolon 2-Mikrotiterplat-ten, wobei die Löchermischungen von Gruppen B-Streptokokken des Kapseltyps enthielten, welche an den Oberflächen der Löcher mit Poly-L-Lysin (PLL) befestigt waren. Verschiedene der im Screening-Verfahren verwendete Anti-gen-Platten enthièlten:

1. eine Mischung von Gruppen B-Streptococcus-Typen Ia (ATCC-Nr. 12 400), Ib (ATCC-Nr. 12 401, Ic (ATCC-Nr. 27 591)

2. eine Mischung der Typen II (ATCC-Nr. 12 973) und III (klinisches Isolât, welches von Dr. C. Wilson, Children's Orthopédie Hospital, Department Infectious Disease, Seattle, WA, zur Verfügung gestellt wurde);

3. eine Mikrotiterplatte ohne Bakterien.

Die Kulturüberstände von zwei Transformationen wurden durch die obigen Verfahren analysiert, wobei eine Identifikation eines Loches (4B9) resultierte, welches eine Aktivi18

tät mit beiden Gruppen B-Streptococcus-Bestimmungsplat-ten, jedoch nicht mit der Kontrollplatte aufwies. In nachfolgenden ELISAs mit individuellen Gruppen B-Streptococcus-Typen wurde ermittelt, dass dieses Loch eine Antikörper-5 Reaktivität mit allen fünf Stämmen der Referenztypen aufwies.

Demzufolge wurde durch dieses Experiment, eine geclon-te, transformierte humane Zellinie erhalten, welche kontinuierlich (immortal) ist und einen humanen monoclonalen An-io tikörper zu einer Determinante an der Oberfläche der Grup-■ pen B-Streptococcus-Typen ausscheidet.

Am 28. Januar 1986 wurde die kontinuierlich transformierte humane Zellinie mit der Bezeichnung 4B9 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD 20 852 15 USA hinterlegt. Sie erhielt die ATCC-Nr. CRL 9008.

2. Antikörper von der geclonten Zellinie 4B9 wurden auf Kreuzreaktivität gegen gram-negative und gram-positive Bakterien getestet, wobei eine Modifikation der Standard-Immunoblotting-Technik verwendet wurde. Spezifisch wur-

20 de die Kreuzreaktivität gegen die Bakterien E. coli, K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes, E. cloacae, Hemophilus influenzae und Staphylococcus aureus untersucht, indem die Bakterien auf eine aufgeteilte Nitrocellulose-Papierscheibe aufgetüpfelt wurden, die auf der Scheibe enthaltenen Bak-25 terien mit dem genannten Antikörper umgesetzt und die An-tikörper-Reaktionen durch Behandlung mit einem alkalischen Phosphatase/Nitroblau-tetrazolium-Enzymsystem (wie in Beispiel I beschrieben) entwickelt wurden.

Aus diesen Versuchen wurde beobachtet, dass der Anti-30 körper 4B9 eine Kreuzreaktivität mit besonderen gramnegativen Bakterienarten besass. Dieser Antikörper reagierte mit den E. coli-LPS-Serotypen 04,07,018 und 025 und mit den E. cloacae klinischen Isolaten. Demzufolge besitzt der monoclonale humane Antikörper 4B9 eine Intergenus-35 Kreuzreaktion zwischen den gram-negativen und den grampositiven Bakterien der Arten E. coli, E. cloacae und Gruppen B-Streptococcus.

3. Die Erkenntnis, das der monoclonale Antikörper mit mehreren verschiedenen Bakteriengattungen, welche sowohl

40 zu den gram-positiven wie auch gram-negativen bakteriellen Abteilungen gehörten, aufwies, führte zum Schluss, dass der Antikörper gegen ein geteiltes Protein oder Kohlehydrat gerichtet war. Die biochemische Charakterisierung der durch den Antikörper 4B9 erkannten Mokekülarten, wurde durch 45 Immunoblotting-Analysen durchgeführt. Zur Analyse der gram-negativen Gattungen wurden gewaschene Bakterien in Desoxycholat extrahiert, wie in Beispiel I beschrieben. Für die gram-positiven Bakterien wurden 1,01 Bakterien, welche 6 Std. in modifizierter Todd-Hewitt-Brühe (Difco, Todd-50 Hewitt-Brühe, welche 2,8 gm/L wasserfreies Natriumphosphat enthielt, pH 7,8) bei 37 °C gezüchtet wurden, durch Zentrifugation geerntet und dreimal in PBS gewaschen. Die Bakterien wurden in 85 ml Protoplastenmedium (40% Saccharose w/v in 0,03 M Kaliumphosphatpuffer, pH 6,8, mit 55 10 mM MgCl2) resuspendiert und die Suspension wurde während 10 Min. auf 37 °C erwärmt. Es wurden etwa 3000 Einheiten Mutanolysin (SIGMA) zur Mischung gegeben und bei 37 °C während 90 Min. identifiziert werden, bis die O.D.660 der Suspension auf mehr als 90% reduziert war, ge-60 schüttelt. Das verdaute Material wurde bei 2000 x g während 15 Min. bei Zimmertemperatur zentrifugiert und der Überstand wurde gegen PBS während 48 Std. dialysiert (Young, M. K. und Mattingly, S. J., «Biosynthesis of Cell Wall Peptidoglycan and Polysaccharide Antigens by Proto-65 plasts of Type III Group B Streptococcus», J. Bact., (1983) 154: 211 —220). Das Dialysat wurde durch positive Druckdialyse durch einen PM-10-Filter (Amicon Corp., Canvers, MA) zehnfach konzentriert.

19 672 072

Kohlehydrate, welche an Weizenkeim-Agglutinin gefunden wurden, wurden durch Affinitäts-Chromatographie auf einer Weizenkeim-Lectin-Sepharose 6MB-Säule (SIGMA)

gereinigt. Das hier gebundene Pepton wurde von der Säule mit 10 ml 0,1 M N-Acetylglucosamin eluiert und das Eluat wurde gegen destilliertes Wasser bei 4 :C dialysiert. Das Af-finitäts-gereinigte Eluat wurde durch Lyophilisation getrocknet und es wurde das Trockengewicht des resultierenden Materiales erhalten (Gray, B. M., et al., «Interaction of Group B Streptococcal Type-Specific Polysaccharides with Wheat Germ Agglutinin and Other Lectins» J. of Immunol.

Meth., (1984) 72; 269—277). Es wurden positive Reaktionen auf allen Spuren festgestellt, welche Desoxycholat-Extrakte der hier beschriebenen Bakterien enthielten. In diesen Spuren mit den Extrakten von gram-negativen Bakterien, erkannte der Antikörper 4B9 eine Serie von regelmässigen angeordneten Molekülarten, welche auf den Immunoblot ein leiterartiges Muster zeigten. Dieses Profil war vollständig konsistent mit den beobachteten Resultaten in der SDS-Polyacrylgel-elektrophoretischen Analyse des LPS, was zeigte, dass das heterogene Grössenprofil der Banden auf einer Population von LPS-Molekülen beruhte, welche sich zur Gewichtszunahmen unterschieden, welche der Anzahl der O-antigenischen Seitenketteneinheiten pro Molekül unterschieden (Pavia, E. T. und Makela, P. H., supra und Goldman,

R. D. und Leive, L., supra). In diesen Spuren, welche die Extrakte des Gruppen B-Streptococcus-Types enthielten,

schien der Antikörper 4B9 die auf einem breiten Band vorhandenen Komponenten zu erkennen. Dieses Profil war konsistent mit den Ergebnissen der Polyacrylamidgel-Elek-trophorese-Analyse von Kohlehydratresten mit einer extensiven Molekulargewichts-Heterogenität und einer sich häufig wiederholenden spezifischen Zuckersequenz (Vmir, E. R.

et al., supra und Holden, K. G., supra). Diese Daten geben an, dass der monoclonale Antikörper 4B9 gegen eine antigenische Determinante gerichtet ist, welche durch Moleküle geteilt wird, welche auf einigen Serotypen von E. coli, E.

cloacae und Gruppen B-Streptococcus gefunden werden.

Zur weiteren Definition der molekularen Natur des Antigens wurden die Desoxycholat-Extrakte vor ihrer Elektrophorese mit dem proteolytischen Enzym Proteinase K behandelt (Eberling, W., supra). Die Immunoblotting-Muster,

welche nach der Proteinase K-Behandlung beobachtet wurden, waren identisch mit denjenigen, welche ohne Behandlung vorlagen, wonach das mit den 4B9-Antikörpern reaktive Antigen kein Protein darstellte.

Tabelle 6

Bakterien Neutrophile Antikörper Komplement % Zerstörung der zu geführten Bakterien

E. coli

~h

4B9

a

0

018 und 025

E. coli

+

6Fllb

+

0

018 und 025

E. coli

—

4B9

+

0

018 und 025

E. coli

+

4B9

+

85%

018 und 025

E. cloacae

+

4B9

—

0

Isolate

E. cloacae

+

6F11

+

0

Isolate

E. cloacae

—

4B9

+

0

Isolate

E. cloacae

+

4B9

+

85%

Isolate

Für die spezifische Feststellung, ob 4B9 mit einem Kohlehydratepitop reagierte, wurden die elektrotransferierten Desoxycholat- und Weizenkeimagglutin-Affinitäts-gereinig-ten Proben einer milden Periodat-Oxidation unterworfen, s bevor das Nitrocellulosepapier mit dem Antikörper zur Reaktion gebracht wurde (vgl. Beispiel I). Die einem Elektro-blotting unterworfenen Desoxycholat-Extrakte, welche auf diese Weise behandelt wurden, waren nicht mehr mit dem monoclonalen Antikörper 4B9 reaktiv. Diese Daten zeigen io auf starke Weise, dass das durch diesen Antikörper erkannte Epitop ein Kohlehydratrest ist, welcher in Molekülen vorhanden ist, welche sich auf den hier beschriebenen gramnegativen und gram-positiven Bakterien befinden.

4. Der Isotyp des monoclonalen Antikörpers 4B9 wurde 15 in ähnlicher Weise, wie bei den obigen Tests, in einem ELISA-Verfahren bestimmt, mit der Ausnahme, dass die Anti-genplatte einen Pool von Gruppen B-Streptococcus-Typen II und III enthielten. Es wurde eine positive Reaktion des monoclonalen Antikörpers 4B9 mit den Gruppen B-Strepto-

20 coccus-Stämmen nur mit dem Anti-IgM-Reagenz beobachtet, was einen IgM-Isotyp für den monoclonalen Antikörper demonstrierte.

5. Die funktionelle in vitro-Aktivität des monoclonalen 25 Antikörper 4B9 wurde in einem Opso-phagocytischen Test geprüft und mit der bakterioziden Aktivität des Antikörpers in Gegenwart und Abwesenheit von humanen Neutrophilen und humanem Komplement verglichen.

Die hier verwendeten Bakterienstämme wurden nur in 30 Gegenwart des monoclonalen Antikörpers 4B9, einer aktiven Komplementquelle und humanen Neutrophilen inaktiviert (Tabelle 6). Bei der Wiederholung des Experimentes mit verschiedenen nicht mit 4B9-reaktiven bakteriellen Serotypen konnte keine Bakterienzerstörung beobachtet werden 35 (die Daten sind nicht angegeben), was die funktionelle Spezifität des monoclonalen Antikörper 4B9 und seine Fähigkeit, Bakterien zu opsonisieren und ihre Phagocytose zu fördern, demonstrierte. Da die kombinierten Wirkungen der Opsonine (spezifische Antikörper) und der polymorphonuklearen 40 Leukocyten (Neutrophile) der primäre Mechanismus für die Immunität dieser Bakterienstämme darstellen, kann aus diesen Daten geschlossen werden, dass der Antikörper 4B9 nach seiner zweckmässigen Verabreichung gegen die lethalen Herausforderungen mit den beschriebenen Bakterienstäm-45 men einen Schutz bewirken würde.

672 072

20

Tabelle 6 (Fortsetzung)

Bakterien Neutrophile Antikörper Komplement % Zerstörung der zu geführten Bakterien

Gruppe B-Strep.

+

4B9

—

0

Typen Ia und III

Gruppe B-Strep.

+

6F11

+

0

Typen Ia und III

Gruppe B-Strep.

—

4B9

+

0

Typen Ia und III

Gruppe B-Strep.

+

4B9

+

85%

Typen Ia und III

a (—) = Hitze-inaktiviertes (56 ~C während 30 Min.) humanes Komplement.

b (6F11) = Kulturüberstand, welcher einen humanen monoclonalen IgM-Antikörper gegen Pseudomonas aeruginosa Fisher-Typ 2 enthält.

6. Zum Test der obigen Hypothese wurden Schutzstudien an Tieren durchgeführt, wobei der Antikörper 4B9 und mindestens ein Organismus von jeder hier beschriebenen Gattung verwendet wurden.

Von jeder gram-negativen Bakterienherausforderung wurden weibliche, ausgewachsene Swiss-Webster-Mäuse mit einem Gewicht von 20 bis 22 g in drei Gruppen von 10 Mäusen aufgeteilt. Ein repräsentativer Versuch wurde folgender-massen durchgeführt:

Gruppe Bakterien Antikörper

A E. coli 018 4B9

B E. coli 018 6F11

C S. marcescens 014 4B9

Jeder Antikörper-erhaltenden Gruppe wurden intravenös 200 |il steriles PBS, welches 25 ng gereinigter Antikörper enthielt, eingespritzt. 2 Std. später wurden alle Tiere intraperitoneal mit 300 nl lebenden Bakterien, die 3 LD50 des entsprechenden Bakterienstammes enthielten, herausgefordert. Die bakterielle Suspension wurde aus einer Brühenkultur in der logarithmischen Wachstumsphase hergestellt, aus welcher die Bakterien zentrifugiert, zweimal in PBS gewaschen und in der zweckmässigen Konzentration PBS resuspendiert wurden. Die Tiere wurden während einer Zeitdauer von 5 Tagen beobachtet. 24 bis 48 Std. nach der Herausforderung waren alle Tiere B (irrelevanter Antikörper) und der Gruppe C (irrelevanter Organismus) tot. Im Gegensatz dazu waren alle Tiere, welche den Antikörper 4B9 (Gruppe A) erhielten, lebend und symptomfrei.

Für die Schutzstudien an der Gruppe B mit Streptococcus wurde ein neonatales Rattenmodell verwendet. Neugeborene Sprague-Dawley-Ratten (zusammen mit ihren Müttern), die weniger als 48 Std. alt waren, erhielten Antikörper und Bakterien, im wesentlichen in gleicher Weise, wie dies vorher für die Mäuse beschrieben wurde. Die primären Unterschiede waren die folgenden:

1. sowohl die Antikörper, wie auch die bakterielle Herausforderung wurden intraperitoneal injiziert und

2. die Grösse des Inokulums wurde auf 201 reduziert.

Diese Tierschutzmodelle wurden verwendet, um den therapeutischen Effekt der Antikörper 4B9 gegen bakterielle Herausforderung mit den drei Arten der hier beschriebenen Organismen zu demonstrieren. Eine Zusammenfassung dieser Daten ist in der Tabelle 7 dargestellt.

Tabelle 7

Herausforderung

Antikörper

Überlebende/

% Über

Bakterien

Herausforderung lebende

E. coli 025

4B9

10/10

100

E. coli 025

6Flla

0/10

0

S. marcescens 014b

4B9

0/10

0

Gruppe B

4B9

10/10

100

Streptococcus

Ia+III Gruppe B

6F11

0/10

0

Streptococcus

Ia+III

S. marcescens 014

9B10

0/10

0

a der 6F11-Antikörper ist spezifisch gegen Pseudomonas aeruginosa 35 Fisher-Immunotyp 2 und dient als negativer Kontrollantikörper. b S. marcescens 014 ist nicht mit dem 7D7-Antikörper reaktiv und dient als nicht-spezifischer Kontroll-Organismus.

Diese Daten demonstrieren, dass der humane monoclo-40 naie Antikörper 4B9 fähig ist, Mäuse und Ratten von letha-len Herausforderungen mit Bakteriengattungen, welche sowohl zu den gram-negativen wie auch den gram-positiven bakteriellen Abteilungen gehören zu schützen. Die Interge-nus-kreuzreaktiven, humanen monoclonalen Antikörper 45 4B9 waren fähig, einen Schutz mit 25 ng gereinigtem Antikörper die Infektion durch die Organismen, welche zu den gram-negativen Bakteriengattungen E. coli und die grampositiven Bakterien, welche zu Gruppen B-Streptococcus gehören, zu gewährleisten.

50

Beispiel V

Das Beispiel V demonstriert Verfahren für die Herstellung und Selektion von humanen monoclonalen Antikörper, welche eine Intergenus-Kreuzreaktion gegen Mitglieder der 55 Gattungen Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae und Enterobacter aerogenes besitzen. Weiter demonstrieren diese Beispiele eine opsonische in vitro-Aktivität der genannten Antikörper gegen homologe S. marcescens, K. pneumoniae-und E. aerogenes-Serotypen. Das Verfahren gemäss Beispiel 6o I (im wesentlichen, wie dies in den Teilen A bis G beschrieben ist) wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass es erforderlich war, spezifische Änderungen bei der Charakterisierung und beim Testen der hier beschriebenen Antikörper vorzunehmen. Nachstehend sind die Änderungen im Test-65 verfahren und die mit den hier beschriebenen monoclonalen Antikörpern erhaltenen Resultate beschrieben.

1. Die Kulturüberstände von vier Transformationen wurden durch das obige Verfahren, analysiert, wobei ein

21

672 072

Loch (7E10) identifiziert wurde, welches eine Bindungsaktivität gegen mindestens eine der vier K. pneumoniae-Platten aufwies, welche die Kapsel-Serotypen 1,2, 3,4, 6, 8,9,19, 20,21,24, 27, 31,43,44 und 55, jedoch mit der Kontrollplatte keine Aktivität zeigte (keine Bakterien). Der Antikörper s der Zellinie 7E10 wurde zur Bestimmung von weiterer Intergenus-Kreuzreaktivität mittels einer geänderten Standard-Immunoblotting-Technik getestet. Spezifisch wurde die Kreuzreaktivität gegen die Bakterien K. pneumoniae, E. aerogenes, S. marcescens, E. coli und P. aeruginosa getestet, io indem die Bakterien auf eine aufgeteilte Nitrocellulose-Papierscheibe getüpfelt wurden, die Scheibe, welche die Bakterien enthielt, mit dem Antikörper zur Reaktion gebracht und die Antikörper-Reaktionen durch Behandlung mit einem alkalischen Phosphatase/Nitroblau-tetrazolium- 15 Enzymsystem entwickelt wurden. Aus diesen Experimenten war ersichtlich, dass der 7E10-Antikörper weitere Interge-nus-Kreuzreaktivität besass. Dieser Antikörper reagierte mit den folgenden Arten und Serotypen:

20

K. pneumoniae S. marcescens E. aerogenes

K2,8,11,12, 13,21 04,12 Klinische

26,29,30,33,42, Isolate

68, 69

Demzufolge besitzt der humane monoclonale Antikörper 7E10 eine Intergenus-Kreuzreaktivität gegen Bakterien der Gattungen K. pneumoniae, S. marcescens und E. aerogenes. 30

2. Der Isotyp des monoclonalen Antikörpers 7E10 wurde in einem ELISA-Verfahren bestimmt, welches ähnlich war, wie die Spezifitätstest, welche in Beispiel I beschrieben sind, jedoch mit der Ausnahme, dass die Antigenplatte einen Pool von PLL (Poly-L-Lysin)-immobilisierten K. pneumoniae K8 und Kl 1-Serotypen enthielt. Es konnte eine positiv-Reakti-on des monoclonalen Antikörper 7E10 mit den K. pneumo-niae-Serotypen nur mit dem Anti-IgM-Reagenz beobachtet werden, was einen IgM-Isotyp für den monoclonalen Antikörper demonstrierte. Es ist offensichtlich für den Fachmann, dass bei mehreren Wiederholungen dieses Beispiels und bei der Bestimmung der erhaltenen Isotypen von Inter-genus-Kreuzreaktiven monoclonalen Antikörpern man zusätzliche Isotypen finden könnte, z. B. IgM und IgG-Isoty-pen.

3. Die funktionelle in vitro-Aktivität des monoclonalen Antikörpers 7E10 wurde in einem Opsono-phagocytischen Test geprüft, worin die bakteriozide Aktivität des Antikörpers in Gegenwart und Abwesenheit von humanen Neutrophilen und humanem Komplement verglichen wurde. Die hier verwendeten bakteriellen Serotypen werden nur in Gegenwart des monoclonalen Antikörper 7E10, einer aktiven Komplementquelle und humanen Neutrophilen inaktiviert (Tabelle 8). Bei der Wiederholung dieses Versuches mit Serotypen, welche mit dem Antikörper 7E10 nicht reaktiv waren, konnte keine bakterielle Zerstörung festgestellt werden (die Daten sind nicht angegeben). Diese Experimente demonstrieren die funktionelle Spezifität des monoclonalen Antikörpers 7E10 ebenso wie seine Fähigkeit, Bakterien zu opso-nisieren und ihre Phagocytose zu fördern.

Tabelle 8

Bakterien

Neutrophile

Antikörper

Komplement

% Zerstörung der zugeführten Bakterien

S. marcescens

+

7E10

a

0

012

S. marcescens

+

6Fllb

+

0

012

S. marcescens

—

7E10

+

0

012

S. marcescens

+

7E10

+

86%

012

K. pneumoniae

+

7E10

—

0

K8 und Kll

K. pneumoniae

+

6F11

+

0

K8 und Kll

K. pneumoniae

—

7E10

+

0

K8 und Kll

K. pneumoniae

+

7E10

+

94%

K8 und Kll

E.aerogenes

+

7E10

—

0

Isolât

E.aerogenes

+

6F11

+

0

Isolât

E.aerogenes

—

7E10

+

0

Isolât

E. aerogenes

+

7E10

+

60%

und b = vergleiche die Filssnoten der Tabelle 3.

Beispiel VI

Das Beispiel VI demonstriert Verfahren für die Herstellung und Selektion eines humanen monoclonalen Antikörpers, der eine Intergenus-Kreuzreaktion gegen Mitglieder der Gattungen Serratia marcescens und Klebsiella pneumoniae. Weiter demonstriert dieses Beispiel in vitro die opsonische Aktivität des genannten Antikörpers gegen homologe 65 S. marcescens und K. pneumoniae Serotypen. Das Verfahren gemäss Beispiel I (im wesentlichen wie es in den Teilen A bis G beschrieben ist) wurde wiederholt jedoch mit der Ausnahme, dass es erforderlich war, spezifische Änderungen bei

672072

22

der Charakterisierung und beim Testen der in diesem Beispiel beschriebenen Antikörper vorzunehmen. Im folgenden sind die Änderungen in den Testverfahren und die mit dem hier beschriebenen Antikörper erhaltenen Resultate beschrieben:

1. Die Kulturüberstände von vier Transformationen wurden durch das obige Verfahren analysiert, wobei ein Loch (8C9) identifiziert wurde, worin Bindungs-Aktivität mit mindestens vier K. pneumoniae-Serotypenplatten festgestellt wurde, welche folgende Kapsel-Serotypen enthielten: 1, 2,3,4, 6, 8,9,19,20,21,24,27,31,43,44 und 55, jedoch keine Aktivität mit den Kontrollplatten zeigten (keine Bakterien). Der Antikörper der Zellinie 8C9 wurde auf weitere Intergenus-Kreuzreaktivität durch eine Modifikation der Standard-Immunoblotting-Technik getestet. Spezifische Kreuzreaktivität gegen die Bakterien K. pneumoniae, S. marcescens, E. coli und P. aeruginosa wurde festgestellt, indem die Bakterien auf eine aufgeteilte Nitrocellulose-Papier-scheibe aufgetüpfelt wurden, die Scheibe, welche die Bakterien enthielt, mit dem genannten Antikörper umgesetzt und der Antikörper durch Behandlung mit einem alkalischen Phosphatase/Nitroblau-tetrazolium-Enzymsystem umgesetzt wurde. Aus diesen Experimenten wurde beobachtet, dass der Antikörper 8C9 weitere Intergenus-Kreuzreaktivi-tät besass. Dieser Antikörper reagierte mit den folgenden Spezies und Serotypen:

K. pneumoniae

S. marcescens

K5, 6,7,14,27, 36, 55,64

03

Demzufolge besitzt der humane monoclonale Antikörper 8C9 eine Intergenus-Kreuzreaktion gegen Bakterien, welche zu den Gattungen K. pneumoniae und S. marcescens gehören.

2. Der Isotyp des monoclonalen Antikörpers 8C9 wurde in einem ELISA-Verfahren in ähnlicher Weise, wie die in Beispiel I beschriebenen Spezifitätstest durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, dass die Antigenplatte einen Pool von PLL-immobilisierten K. pneumoniae K14- und K27-Seroty-pen enthielt. Es wurde eine positive Reaktion des monoclo-nalen Antikörpers 8C9 mit den K. pneumoniae-Serotypen nur mit dem Anti-IgM-Reagenz beobachtet, was für den monoclonalen Antikörper den IgM-Isotyp demonstriert. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass wenn das Verfahren gemäss diesem Beispiel mehrere Male wiederholt wird und die so erhaltenen Isotypen der Intergenus-kreuzreakti-ven monoclonalen Antikörper bestimmt werden, man zusätzliche Isotypen finden könnte, z. B. IgM- und IgG-Isoty-pen.

3. Die funktionelle in vitro-Aktivität des monoclonalen 2o Antikörpers wurde an einem opsonophagocytischen Test geprüft, worin die bakteriozide Aktivität des Antikörpers in Gegenwart und in Abwesenheit von humanen Neutrophilen und ebenso von humanem Komplement verglichen wurde. Die hier verwendeten bakteriellen Serotypen wurden nur in

25 Gegenwart des monoclonalen Antikörper 8C9, einer aktiven Komplementquelle und humanen Neutrophilen inaktiviert (Tabelle 9). Bei der Wiederholung dieses Versuches mit Serotypen, welche mit dem Antikörper 8C9 nicht reaktiv sind, konnte keine bakterielle Zerstörung beobachtet werden (die 3o Daten sind nicht angegeben). Diese Versuche demonstrieren die funktionelle Spezifität des monoclonalen Antikörper 8C9, ebenso wie seine Kapazität, Bakterien zu opsonieren und ihre Phagocytose zu fördern.

Tabelle 9

Bakterien

Neutrophile

Antikörper

Komplement

% Zerstörung der zugeführten Bakterien

S. marcescens 03

S. marcescens 03

S. marcescens 03

S. marcescens 03

K. pneumoniae K14 und 27 K. pneumoniae K14 und 27 K. pneumoniae K14 und 27 K. pneumoniae

+ + + + + +

8C9

6Fllb

8C9

8C9

8C9

6F11

8C9

8C9

a

0

+

0

+

0

+

70%

-

0

+

0

+

0

+

93%

a und b = vgl. die Fussnoten in Tabelle 3.

Beispiel VII

Das Beispiel VII demonstriert Verfahren für die Herstellung und Selektion eines humanen monoclonalen Antikörpers, welcher eine Intergenus-Kreuzreaktivität gegen Mitglieder der Gattungen Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes und Enterobacter cloacae aufweist. Überdies demonstriert dieses Beispiel die opsonische Aktivität in vitro des genannten Antikörper gegen homologe S. marcescens-, K. pneumoniae-, E. aerogenes- und E. cloacae-Serotypen. Das Verfahren gemäss Beispiel I (im wesentlichen wie es in den Teilen A bis G beschrieben ist)

wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, dass es erforderlich war, spezifische Änderungen zum Charakterisieren 60 und Testen der in diesem Beispiel beschriebenen Antikörpern vorzunehmen. Im folgenden sind die Änderungen im Testverfahren und die mit dem hier beschriebenen monoclonalen Antikörper erhaltenen Resultate beschrieben.

1. Die Kulturüberstände von vier Transformationen 65 wurden durch das obige Verfahren analysiert, wobei ein Loch (1E4) identifiziert wurde, welches eine Bindungsaktivität mit mindestens einem der vier K. pneumoniae-Serotyp-platten aufwies, welche die folgenden Kapsel-Serotypen ent

23

672 072

hielten: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9,19,20,21, 24, 27, 31,43,44 und 55, jedoch nicht auf der Kontrollplatte (keine Bakterien). Der Antikörper von der Zellinie 1E4 wurde auf weitere Interge-nus-Kreuzreaktivität durch eine Modifikation der Standard-Immunoblot-Technik geprüft. Spezifisch wurde die Kreuz-Reaktivität zu den Bakterien K. pneumoniae, E. aerogenes, S. marcescens, E. coli, E. cloacae und P. aeruginosa ermittelt, indem Bakterien auf eine aufgeteilte Nitrocellulose-Papierscheibe aufgetüpfelt wurden, die Scheibe, welche die Bakterien enthielt, mit dem genannten Antikörper umgesetzt und die Antikörperreaktionen entwickelt wurden, durch Behandlung mit einem alkalischen Phosphatase-Nitroblau-tetrazolium-Enzymsystem.

Aus diesen Experimenten wurde gefunden, dass der Antikörper 1E4 eine weitere Intergenus-Kreuzreaktivität aufwies. Dieser Antikörper reagierte mit den folgenden Arten und Serotypen:

K. pneumoniae S. marcescens E. aerogenes E. cloacae

Kl, 3, 8,9,13, OL5 15,29,31,33, 36, 68, 69

Klin. Isolate Klin. Isolate

Demzufolge besass der humane monoclonale Antikörper 1E4 eine Intergenus-Kreuzreaktivität mit Bakterien, welche zu den Arten K. pneumoniae, S. marcescens, E. cloacae und E. aerogenes gehören.

2. Der Isotyp des monoclonalen Antikörpers 1E4 wurde in einem ELISA-Verfahren bestimmt, welches ähnlich, wie die in Beispiel I beschriebenen Spezifitätstest ist, jedoch mit der Ausnahme, dass die Antigenplatte einen Pool von PLL-5 immobilisierten K. pneumoniae K3- und K8-Serotypen enthielt. Die positive Reaktion des monoclonalen Antikörpers 1E4 mit den K. pneumoniae-Serotypen wurde nur mit dem Anti-IgM-Reagenz beobachtet, was für den monoclonalen Antikörper einen IgM-Serotyp anzeigt. Es ist für den Fach-lo mann offensichtlich, dass wenn das Verfahren dieses Beispiels mehrere Male wiederholt wird und die erhaltenen Isotypen von Intergenus-kreuzreaktiven monoclonalen Antikörpern bestimmt werden, dass man weitere zusätzliche Isotypen finden kann, z. B. IgM- und IgG-Isotypen. i5 3. Die funktionelle in vitro-Aktivität des monoclonalen Antikörpers 1E4 wurde in einem opsonophagocytischen Test geprüft, wobei die bakteriozide Aktivität des Antikörpers in Gegenwart und Abwesenheit von humanen Neutrophilen und humanem Komplement verglichen wurde. Die 20 hier verwendeten bakteriellen Serotypen wurden nur in Gegenwart des monoclonalen Antikörpers 1E4, einer aktiven Komplementquelle und von humanem Neutrophilen inaktiviert (Tabelle 10). Bei der Wiederholung dieses Experimentes mit Serotypen, welche mit dem Antikörper 1E4 nicht reaktiv 25 waren, konnte keine bakterielle Zerstörung beobachtet werden (die Daten sind nicht angegeben). Diese Experimente zeigten die funktionelle Spezifität des monoclonalen Antikörpers 1E4 und ebenso seine Fähigkeit, Bakterien zu opso-nieren und ihre Phagocytose zu fördern.

Tabelle 10

Bakterien

Neutrophile

Antikörper

Komplement

% Zerstörung der zugeführten Bakterien

S. marcescens

+

1E4

a

0

015

S. marcescens

+

6Fllb

+

0

015

S. marcescens

—

1E4

+

0

015

S. marcescens

+

1E4

+

86%

015

1

K. pneumoniae

+

1E4

—

0

K3 und 29

K. pneumoniae

+

6F11

+

0

K3 und 29

K. pneumoniae

—

1E4

+

0

K3 und 29

K. pneumoniae

+

1E4

+

80%

K3 und 29

E. aerogenes

+

1E4

—

0

Isolât (2)

E. aerogenes

+

6F11

+

0

Isolât (2)

E. aerogenes

—

1E4

+

0

Isolât (2)

E. aerogenes

+

1E4

+

80%

Isolât (2)

E. cloacae

+

1E4

—

0

Isolât

E. cloacae

+

6F11

+

0

Isolât

E. cloacae

—

1E4

+

0

Isolât

E. cloacae

+

1E4

+

80%

a und b = vgl. Fussnoten der Tabelle 3.

672 072

24

Beispiel Vili

Das Beispiel VIII demonstriert Verfahren für die Herstellung und Selektion eines humanen monoclonalen Antikörpers, welcher eine Intergenus-Kreuzreaktivität gegen Mitglieder der Gattungen Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes und Pseudomonas aeruginosa. Überdies demonstriert dieses Beispiel die opsonische in vitro-Aktivität des genannten Antikörpers gegen homologe S. marcescens, K. pneumoniae, E. aerogenes und P. aerugi-nosa-Serotypen. Das Verfahren gemäss Beispiel I (im wesentlichen wie es in den Teilen A bis G beschrieben ist) wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, dass es erforderlich war, spezifische Änderungen bei der Charakterisierung und bei den Tests des in diesem Beispiel erhaltenen Antikörpers vorzunehmen. Im folgenden sind die Änderungen in den Testverfahren und die mit dem hier beschriebenen Antikörper erhaltenen Resultate beschrieben.

1. Kulturüberstände von vier Transformationen wurden durch das obige Verfahren analysiert, wobei die Identifikation eines Loches (9D1) resultierte, welches eine Bindungsaktivität mit mindestens einem der vier K. pneumoniae-Serotypplatten aufwies, wobei folgende Kapsel-Serotypen enthalten waren: 1,2, 3,4,6, 8, 9,19,20,24, 27, 31,43,44 und 55, jedoch nicht auf der Kontrollplatte (keine Bakterien). Der Antikörper vor der 9D1 Zellinie wurde auf weitere Intergenus-Kreuzreaktivität getestet, indem die Standard-Immunoblot-Technik modifiziert wurde. Es wurde spezifisch eine Kreuz-Reaktivität zu den Bakterien K. pneumoniae, E. aerogenes, S. marcescens, E. coli und P. aeruginosa festgestellt, indem die Bakterien auf eine aufgeteile Nitrocellulose-Papierscheibe aufgetüpfelt wurde, die Scheibe, welche die Bakterien enthielt, mit dem genannten Antikörper zur Reaktion gebracht und die Antikörper-Reaktivität mit einem alkalischen Phosphatase/Nitroblau-tetrazolium-Enzymsystem entwickelt wurde.

Aus diesen Experimenten wurde beobachtet, dass der Antikörper 9D1 eine weitere Intergenus-Kreuzreaktivität besitzt. Dieser Antikörper reagierte mit den folgenden Arten und Serotypen:

K. pneumoniae S. marcescens E. aerogenes P. aeruginosa

E9,13,15 29, 33

03,9,15.18 Klin. Isolate F6

Demzufolge besass der humane monoclonale Antikörper 9D1 eine Intergenus-Kreuzreaktion zu Bakterien, welche zur... Gattung K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes und P. io aeruginosae gehören.

2. Der Isotyp des monoclonalen Antikörpers 9D1 wurde in einem ELISA-Verfahren bestimmt, welches ähnlich ist, wie die in Beispiel I beschriebenen Selektivitäts-Tests, jedoch mit der Ausnahme, dass die Antigenplatte einen Pool von 15 PLL-immobilisierten K. pneumoniae K13-Serotypen enthielt. Die positive Reaktion des monoclonalen Antikörpers 9D1 mit den K. pneumoniae-Serotypen wurde nur mit dem Anti-IgM-Reagenz beobachtet, was für den monoclonalen Antikörper den IgM-Isotyp anzeigte. Es ist für den Fach-20 mann offensichtlich, dass wenn das in diesem Beispiel beschriebene Verfahren mehrere Male wiederholt wird und die Isotypen der so erhaltenen Intergenus-kreuzreaktiven monoclonalen Antikörper bestimmt werden, dass man zusätzliche Isotypen finden könnte, z. B. IgM- und IgG-Isotypen. 25 3. Die funktionelle in vitro-Aktivität des monoclonalen Antikörpers 9D1 wurde in einem opsonophagocytischen Test geprüft, wobei die bakteriozide Aktivität des Antikörpers in Gegenwart und in Abwesenheit von humanen Neutrophilen und humanem Komplement verglichen wurde. Die 30 hier verwendeten bakteriellen Serotypen wurden nur in Gegenwart des monoclonalen Antikörpers 9D1, einer aktiven Komplementquelle und von humanen Neutrophilen inaktiviert (Tabelle 11). Bei der Wiederholung dieses Versuches mit Serotypen, welche mit dem Antikörper 9D1 nicht reaktiv 35 sind, konnte keine bakterielle Zerstörung beobachtet werden (die Daten sind nicht angegeben). Diese Experimente demonstrieren die funktionelle Spezifität des monoclonalen Antikörpers 9D1 ebenso wie seine Kapazität Bakterien zu opsonieren und ihre Phagocytose zu fördern.

Tabelle 11

Bakterien

Neutrophile

Antikörper

Komplement

% Zerstörung der zugeführten Bakterien

S. marcescens

+

9D1

a

0

03

S. marcescens

+

6F11"

+

0

03

S. marcescens

—

9D1

+

0

03

S. marcescens

+

9D1

+

87%

03

K. pneumoniae

+

9D1

—

0

K13

K. pneumoniae

+

6F11

+

0

K13

K. pneumoniae

—

9D1

+

0

K13

K. pneumoniae

+

9D1

+

50%

K13

E. aerogenes

+

9D1

—

0

Isolate (2)

E.aerogenes

+

6F11

+

0

Isolate (2)

E. aerogenes

—

9D1

+

0

Isolate (2)

E. aerogenes

+

9D1

+

0

Isolate (2)

25

Tabelle 11 (Fortsetzung)

672 072

Bakterien Neutrophile Antikörper Komplement % Zerstörung der zu geführten Bakterien

P. aeruginosa F6

+

9D1

—

0

P. aeruginosa F6

+

6F11

+

0

P. aeruginosa F6

—

9D1

+

0

P. aeruginosa

+

9D1

+

75%

a und b = vgl. Fussnoten der Tabelle 3.

Beispiel IX

Das Beispiel IX demonstriert Verfahren für die Herstellung eines humanen monoclonalen Antikörpers, welcher eine Intergenus-Kreuzreaktivität gegen die Mitglieder Arten Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli und Serratia marcescens aufweist. Überdies demonstriert dieses Beispiel die protektive in vivo-Aktivität des genannten Antikörpers gegen eine lethale Herausforderung von homologen P. aeruginosa, E. coli, und S. marcescens-Serotypen. Das Verfahren gemäss Beispiel I (im wesentlichen wie dies in den Teilen A bis G beschrieben ist) wurde wiederholt, um einen humanen monoclonalen Antikörper herzustellen, welcher Kreuz-protektiv gegen Infektionen ist, welche durch Bakterien verursacht werden, welche an ihn gebunden werden. Spezifische Änderungen am Verfahren von Beispiel I waren bei der Charakterisierung und bei den Tests des in diesem Beispiel beschriebenen Antikörpers erforderlich. Die Änderungen in den Testverfahren und die mit dem monoclonalen Antikörper erhaltenen Resultate sind nachstehend beschrieben.

1. Die Überstände wurden auf die Gegenwart von Anti-p. aeruginosa-Antikörper getestet, wobei eine ELISA-Tech-nik, wie sie in Beispiel I beschrieben ist, verwendet wurde. Die Antigenplatte bestand aus einer Flachboden-96-Loch-Immunolon-2-Mikrotiterplatte (Dynatech, Alexandria, VA), wobei ihre Löcher eine Mischung von Poly-L-Lysin (PLL)-immunisierten Bakterien enthielten, welche zu sieben P. ae-ruginosa-Fisherreferenzstämmen gehören (Fisher, M. W., et al., J. of Bacteriology, (1969), 98: 835-836, ATCC-Nrn. 27312-27318).

Die Kulturüberstände einer Transformation wurden durch das obige Verfahren analysiert und resultieren in der Identifikation eines Loches, welches eine Aktivität mit der P. aeruginosa-Platte zeigte, jedoch nicht mit der PLL-Kontroll-platte. Sie wurde in mehreren anschliessenden ELISA mit den siebzehn individuellen P. aeruginosa-Serotypen, welche zum «International Antigenic Typing Scheme» gehören, getestet (IATS, ATCC-Nrn. 33 348 — 3364), wobei ein Hauptloch 9C3 Antikörper enthielt, welche an den IATS-Serotyp 1 gebunden wurden (Lium P. V., Int. J. Syst. Bacteriol. (1983), 33: 356-264).

Demzufolge wurde aus diesem Versuch eine geclonte transformierte humane Zellinie erhalten, welche kontinuierlich (immortal) ist und einen einzigen humanen monoclonalen Antikörper ausscheidet, welcher sich an eine Determinante an der Oberfläche von P. aeruginosa-IATS-Typ 1 bindet.

Am 22. Oktober 1986 wurde die kontinuierliche transformierte humane Zellinie mit der Identifikation 9C3 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD 20 852 USA eingereicht. Sie erhielt die Hinterlegungsnummer ATCC CRI 9239.

2. Antikörper der geclonten 9C3-Zellinie wurden ebenfalls auf Kreuz-Reaktivität mit gram-negativen und grampositiven Bakterien getestet, indem die Standard-Immuno-

2o blotting-Technik eine Änderung erfuhr. Spezifisch wurde die Kreuzreaktivität mit den Bakterien E. coli, K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes, E. cloacae, Hemophilus influenzae und Staphylococcus aureus ermittelt, indem die Bakterien auf eine unterteilte Nitrocellulose-Papierscheibe aufge-25 tüpfelt wurden, die Scheibe, welche die Bakterien enthielt, mit dem 9C3-Antikörper zur Reaktion gebracht und die Antikörper-Reaktionen durch ein alkalisches Phosphatase/ Nitroblau-tetrazolium-Enzymsystem visualisiert wurde (wie in Beispiel I beschrieben). Aus diesen Experimenten wurde 30 beobachtet, dass sich der Antikörper 9C3 an den E. coli-Serotyp 06 und an die S. marcescens-Serotypen 012 und 014 bannt. Demzufolge besitzt der humane, monoclonale Antikörper 9C3 eine Intergenus-Kreuzreaktivität unter den gram-negativen Bakterien, welche zu den spezifischen Sero-35 typen der Arten E. coli, S. marcescens und P. aeruginosa gehören.

3. Die Erkenntnis, dass der monoclonale Antikörper mit mehreren verschiedenen Bakteriengattungen eine Kreuzreaktion einging führte zum Schluss, dass der Antikörper sich

40 an eine geteilte antigenische Determinante binden könnte. Die biochemische Charakterisierung der durch den 9C3-Antikörper erkannten Molekülarten wurde durch eine Im-munoblotting-Analyse, wie sie in Beispiel I beschrieben ist, durchgeführt. Es wurden Reaktionen in Desoxycholat-45 Extrakten der reaktiven Serotypen von P. aeruginosa und E. coli festgestellt, jedoch nicht bei S. marcescens. Obschon nicht klar ist, weshalb der 9C3-Antikörper mit dem S. mar-cescens-Präparat unreaktiv ist, ist es möglich, dass der Antikörper ein konformes Epitop erkennt, welches bei den Zube-50 reitungsbehandlungen zerstört wurden. Bei den E. coli- und P- aeruginosa-Bakterienextrakten wurde festgestellt, dass der Antikörper 9C3 eine Serie von Moleküleinheiten mit regelmässigem Abstand erkannte, welche ein leiterartiges Muster auf den Immunoblots ergaben. Dieses Profil war voll-55 ständig mit den Ergebnissen konsistent, welche durch die Polyacrylgel-Elektrophoresen-Analyse von PLS in Gegenwart von SDS erhalten wurden, wobei gezeigt wurde, dass das heterogene Grössenprofil, welches durch die beiden Banden gezeigt wurde, auf einer Population von LPS-Molekülen 60 beruhte, welche sich durch Gewichtszunahmen unterschieden, die den O-antigenischen Oligosaccharid-Seitenketten-Einheiten äquivalent waren, welche an den Molekülen vorhanden waren (Pavia, E. T. und Makela, P. H. supra und Goldman, R. D. und Leive, L., supra).

Um die molekulare Natur des Antigens weiter zu definieren, wurden die Desoxycholat-Extrakte vor ihrer Elektrophorese mit dem proteolytischen Enzym Proteinase K behandelt (Eberling, W., supra). Die nach der Behandlung mit

65

672 072

26

Proteinase K erhaltenen Immunoblotting-Muster waren identisch mit denjenigen Mustern, welche ohne Behandlung erhalten wurden und lassen demzufolge den Schluss zu, dass das mit dem Antikörper 9C3 reaktive Antigen kein Protein war.

4. Der Isotyp des monoclonalen Antikörpers 9C3 wurde in einem ELISA-Verfahren bestimmt, welches ähnlich war, wie die Spezifitätstests, welche oben beschrieben sind, jedoch mit der Ausnahme, dass die Antigenplatte PLL-immobili-sierte P. aeruginosa-Fisher-Serotyp 4-Bakterien enthielt. Die positive Reaktion des monoclonalen Antikörper 9C3 mit dem P. aeruginosa-Stamm wurde nur mit dem Anti-IgM-Reagenz beobachtet, was für den monoclonalen Antikörpern IgM-Isotyp demonstrierte.

5. Die funktionelle in vitro-Aktivität des monoclonalen Antikörpers 9C3 wurde in einem opsonophagocytischen Test geprüft, wobei die bakteriozide Aktivität des Antikörpers in Gegenwart und Abwesenheit von humanen Neutrophilen und humanem Komplement verglichen wurde.

Die hier verwendeten Bakterienstämme wurden nur in Gegenwart des monoclonalen Antikörpers 9C3, einer akti-5 ven Komplementquelle und humanen Neutrophilen abgetötet (Tabelle 12). Bei der Wiederholung dieses Versuches mit verschiedenen nicht mit 9C3 reaktiven bakteriellen Serotypen, konnte keine bakterielle Zerstörung beobachtet werden, was demzufolge die funktionelle Spezifität des monoclonalen io Antikörpers 9C3 und seine Kapazität zur Opsonierung von Bakterien und Förderung ihrer Phagocytose zeigt. Da die kombinierte Wirkung der Opsonine (spezifische Antikörper) und der polymorphonuklearen Leukocyten (Neutrophilen) den primären Mechanismus für die Immunität dieser Bakte-i5 rienstämme zu sein scheint, zeigen diese Daten, dass der Antikörper 9C3 nach einer zweckmässigen Verabreichung einen Schutz gegen lethale Herausforderungen mit den hier beschriebenen Bakterienstämmen bewirken könnte.

Tabelle 12

Bakterien

Neutrophile

Antikörper

Komplement

% Zerstörung der zugeführten Bakterien

E. coli 06

+

9C3

_(a)

0

E. coli 06

+

6F11 W

+

0

E. coli 06

—

9C3

+

0

E. coli 06

+

9C3

+

98%

S. marcescens 014

+

9C3

—

0

S. marcescens 014

+

6F11

+

0

S. marcescens 014

—

9C3

+

0

S. marcescens 014

+

9C3

+

94%

P. aeruginosa Fisher 4

+

9C3

0

P. aeruginosa Fisher 4

+

6F11

+

0

P. aeruginosa Fisher 4

9C3

+

0

P. aeruginosa

+

9C3

+

79%

(3) — = Wärme-inaktiviertes (56 °C während 30 Min.) humanes Komplement.

® 6F11 = Kulturüberstand, welcher einen humanen monoclonalen IgM-Antikörper gegen Pseudomonas aeruginosa-

Fisher-Typ 2 enthält.

6. Zum Test der proteolytischen Charakteristika der 9C3-Antikörper wurden Schutzstudien an Tieren durchgeführt, mit mindestens einem Organismus der hier beschriebenen Gattungen. Als Schutzversuche mit P. aeruginosa-Fisher 4 und S. marcescens 014 wurde das Mäuse-Verbrennungsmodell verwendet. Für jede bakterielle Herausforderung wurden weibliche, nicht-degenierte Swiss-Webster-Mäuse verwendet, mit einem Gewicht von 22 bis 25 g und in drei Gruppen von 7 bis 8 Mäusen aufgeteilt. Ein beispielhafter Versuch wurde wie folgt durchgeführt:

Gruppe

Bakterien

Antikörper

A B C

P. aeruginosa F4 9C3

P. aeruginosa F4 6F11

P. aeruginosa F2 9C3

Am Tag vor dem Experiment wurde jede Maus zur Entfernung aller Haare auf dem Rücken (Verbrennungsstelle) rasiert und mit einem Enthaarungsmittel behandelt. Am Versuchstag erhielt jedes Tier in jeden Schenkel 0,1 ml einer anästesierenden Kochsalzlösung, welche 0,7 ml 0,85% NaCl, 0,2 ml Xylazin (20 mg/ml) und 0,1 ml Ketamin (100 mg/ml) enthielt, in solcher Weise, dass die Dosis pro Maus 20 mg/kg Zylazin und 180 mg/kg Ketamin betrug. Den anästesierten

Mäusen wurden auf 10% der gesamten Körperoberfläche 45 eine Verbrennung dritten Grades mit einer Gasflamme verursacht. Unmittelbar nach der Wundbeibringung wurde den Mäusen unter der Brandwunde 0,4 ml Antikörper-enthalten-de Kulturflüssigkeit mit einer Temperatur von 4 °C injiziert, welche mit 5—10 LD50 der Bakterien gemischt war. Die bak-50 terielle Suspension wurde aus einer Brühenkultur in logarithmischer Wachstumsphase hergestellt, aus welcher die Bakterien zentrifugiert, zweimal in PBS gewaschen und in einer zweckmässigen Konzentration von PBS resuspendiert wurden. Die Tiere wurden während einer Periode von 10 Ta-55 gen beobachtet. Drei bis fünf Tage nach der Herausforderung waren alle Tiere der Gruppe B (irrelevanter Antikörper) und der Gruppe C (irrelevanter Organismus) tot. Im Gegensatz dazu waren alle Tiere, welche den Antikörper 9C3 (Gruppe A) erhalten hatten, lebend und symptomfrei 6o (vgl. Tabelle 13).

Für die E. coli 06-Schutzstudien wurden gesunde Swiss-Webster-Mäuse (20 bis 22 g) in drei Gruppen von 10 Mäusen geteilt. Jeder Antikörper erhaltenden Gruppe wurden intravenös 200 nl steriles PBS eingespritzt, welches 25 ng des 65 gereinigten Antikörpers enthielt. 2 Std. später wurden alle Tiere intraperitoneal mit 300 jj.1 lebenden Bakterien (welche 3 LD50 des entsprechenden Bakterienstammes enthielten) herausgefordert (Resultate siehe Tabelle 13).

27

Tabelle 13

672 072

Versuch Herausforderungsbakterien Antikörper Überlebende Heraus- % Überlebende forderung

1

P. aeruginosa F4

9C3

6/7

86%

P. aeruginosa F4

6Fllta)

0/7

0

P. aeruginosa F2(b)

9C3

0/7

0

2

E. coli 06

9C3

6/10

60%

E. coli 06

6F11

0/10

0

3

S. marcescens 014

9C3

8/8

100%

S. marcescens 014

6F11

0/8

0

(a) Der Antikörper 6F11 ist spezifisch gegen Pseudomonas aeruginosa Fisher-Immunotyp 2 und dient als Antikörper für die Negativ-Kontrolle.

(b' P. aeruginosa F2 ist nicht reaktiv mit dem Antikörper 9C3 und dient als nicht spezifischer Kontrollorganismus.

Diese Daten demonstrieren, dass der humane monoclonale Antikörper 9C3 fähig ist, Mäuse von lethalen Herausforderungen mit Bakterien, welche zu drei gram-negativen Gattungen gehören zu schützen. Der Intergenus-kreuzreak-tive humane monoclonale Antikörper 9C3 war fähig, mit Antikörper-erhaltenem Kulturüberstand oder mit gereinigtem Antikörper einen Schutz zu verleihen gegen Infektionen durch Organismen, welche zu den gram-negativen Gattungen E. coli, S. marcescens und P. aeruginosa gehören. Vom Vorhergehenden ist ersichtlich, dass die erfmdungsgemässen Zellinien Zusammensetzungen von humanen monoclonalen Antikörpern und Fragmenten davon zur Verfügung stellen,

welche kreuzreaktiv sind für und kreuzprotektiv gegen verschiedene bakterielle Spezies sind, sowohl gram-negative wie 20 auch gram-positive. Dies erlaubt leichter prophylaktische und therapeutische Zusammensetzungen zu entwickeln, welche wirksam gegen nosocomiale und neonatale Infektionen sein können, wie sie von den meisten, wenn nicht von allen Bakteriengattungen verursacht werden. Zur Kombination 25 der Antikörper ist es möglich, einen breiten Schutz gegen einen grossen Teil, in der Regel weniger als alle, der klinisch signifikanten Infektionen. Zusätzlich stellen die Zellinien Antikörper zur Verfügung, welche in Immunoassays und anderen wohlbekannten Verfahren Anwendung finden.

35

40

45

50

55

60

Claims (17)

1. 672 072

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche nützlich ist für die prophylaktische und/oder therapeutische Behandlung von bakteriellen Infektionen, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine prophylaktisch oder therapeutisch wirksame Menge von mehreren humanen monoclonalen Antikörpern aufweist und mit mindestens zwei bakteriellen Arten von mindestens zwei Gattungen reaktiv ist, wobei mindestens einer der genannten Antikörper oder ein Bindungsfragment davon fähig ist, spezifisch mit einem Nicht-Kern-Kohlehydratepitop, welches durch Serotypen von zwei verschiedenen Arten geteilt wird, zu reagieren.
2. 2. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der genannten Antikörper oder ein Bindungsfragment davon mit Serotypen von Arten von mindestens drei bakteriellen Arten und Gattungen reagiert.
3. 3. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der Bakterienarten gram-positiv und eine zweite gram-negativ ist.
4. 4. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei der genannten Antikörper gegen eine Infektion protektiv sind, welche durch Bakterien verursacht wird, welche zu mindestens zwei verschiedenen Gattungen gehören.
5. 5. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, welche für die prophylaktische und/oder therapeutische Behandlung von bakteriellen Infektionen nützlich ist, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine prophylaktische oder therapeutische Menge von mindestens zwei humanen, monoclonalen Antikörpern oder Bindungsfragmente davon enthält, wobei jeder Antikörper spezifisch mit einem Nicht-Kern-Kohlehydratepitop, welches durch Serotypen von zwei oder mehr bakteriellen Arten oder von verschiedenen Gattungen geteilt wird und mit mehreren Serotypen von mindestens einer Art reagiert, wobei die genannte Art Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa und Streptococcus agalactiae, Gruppe B umfasst.
6. 6. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens einen humanen monoclonalen Antikörper enthält, welcher mit mindestens einer der folgenden bakteriellen Artenkombinationen reagiert:

   a) E. coli, S. marcescens und E. aerogenes;

   b) E. coli und N. meningitidis;

   c) E. coli, E. cloacae und Streptococcus agalactiae Gruppe B;

   d) K. pneumoniae, S. marcescens und E. aerogenes;

   e) K. pneumoniae und S. marcescens;

   f) K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes und E. cloacae;

   g) K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes und P. aeruginosa; oder h) E. coli, S. marcescens und P. aeruginosa.
7. 7. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1—6, enthaltend einen physiologisch annehmbaren Träger.
8. 8. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, welche für die prophylaktische und/oder therapeutische Behandlung von neonataler Sepsis oder Meningitis nützlich ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung eine prophylaktisch oder therapeutische Menge von mindestens zwei humanen monoclonalen Antikörpern oder Bindungsfragmente davon enthält, wobei jeder der Antikörper spezifisch mit einem Nicht-Kern-Kohlehydratepitop reagiert, welches durch Serotypen von zwei oder mehr bakteriellen

   2

   Arten von verschiedenen Gattungen geteilt wird, wobei die genannten Arten Escherichia coli Kl, Neisseria meningitidis Gruppe B, Hemophilus influenzae Typ B und Streptococcus agalactiae Gruppe B umfassen.

   s 9. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, welche für die prophylaktische und/oder therapeutische Behandlung einer vorbestimmten Anzahl von Bakterienarten nützlich ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung eine prophylaktisch oder therapeutisch wirksa-lo me Menge von zwei oder mehr humanen, monoclonalen Antikörpern oder Bindungsfragmenten davon enthält, wobei die Antikörper fähig sind, mit allen von mindestens vier der bakteriellen Arten zu reagieren und einen verträglichen Träger enthält.

   15 10. Verfahren für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, welche nützlich ist für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung von bakteriellen Infektionen, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere humane, monoclonale Antikörper, kombiniert werden, 20 wobei die genannte Zusammensetzung mit mindestens zwei bakteriellen Arten von mindestens zwei Gattungen reagiert, wobei mindestens einer der monoclonalen Antikörper oder ein Bindungsfragment davon fähig ist, spezifisch mit einem Nicht-Kern-Kohlehydratepitop, welches durch Serotypen 25 von zwei verschiedenen Spezien geteilt wird, eine Reaktion einzugehen.
9. 11. Verfahren nach Anspruch 10 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäss Anspruch 8, welche für die prophylaktische und/oder therapeutische Be-

   30 handlung von neonataler Sepsis oder Meningitis nützlich ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die Kombination einer prophylaktischen oder therapeutischen Menge von mindestens zwei humanen, monoclonalen Antikörpern oder Bindungsfragmenten davon, umfasst, wobei jeder der ge-35 nannten Antikörper spezifisch mit einem Nicht-Kern-Kohle-hydratepitop reagiert, welches durch Serotypen von zwei oder mehr bakteriellen Arten von verschiedenen Gattungen geteilt wird, wobei die bakteriellen Arten E. coli Kl, Neisseria meningitidis, Hemophilus influenzae und Streptococcus 40 agalactiae Gruppe B umfasst.
10. 12. Unsterbliche Zellinie, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen humanen, monoclonalen Antikörper oder ein Bindungsfragment davon ausscheidet, welcher spezifisch mit einem Epitop kreuzreaktiv ist, welches einen zugänglichen

    45 Nicht-Kern-Kohlehydratrest aufweist, welcher bei mindestens zwei Serotypen von verschiedenen Arten von verschiedenen bakteriellen Gattungen vorhanden ist.
11. 13. Zellinie gemäss Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die bakterielle Art mindestens zwei der Arten so Escherichia coli, Serratia marcescens, Neisseria meningitidis, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa und Streptococcus agalactiae Gruppe B enthält.
12. 14. Zellinie gemäss Anspruch 13, dadurch gekennzeich-55 net, dass sie die Hinterlegungsnummern ATCC No. CRL

    9006, CRL 9007, CRL 9008, CRL 9009 und CRL 9239 aufweisen.
13. 15. Humaner, monoclonaler Antikörper oder Bindungsfragment davon, dadurch gekennzeichnet, dass er fähig ist,

    6o ein Kohlehydratepitop zu binden, welches mit einem monoclonalen Antikörper reaktiv ist, welcher durch eine Zellinie gemäss Anspruch 14 produziert wird.
14. 16. Diagnostische Ausrüstung für die Verwendung beim Nachweis der Gegenwart von mindestens zwei Mitgliedern

    65 von Arten von verschiedenen Bakteriengattungen, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausrüstung eine monoclonale Antikörperzusammensetzung, welche mindestens einen monoclonalen Antikörper aufweist, enthält, worin der Antikörper

    mit einer Nicht-Kern-Kohlehydratdeterminanten, reagiert, welche von mindestens zwei Mitgliedern von verschiedenen Bakterienarten geteilt wird und eine Markierung, welche ein nachweisbares Signal kovalent an den Antikörper bindet oder an einen zweiten Antikörper bindet, welcher mit dem genannten monoclonalen Antikörper reaktiv ist, enthält.
15. 17. Verfahren zur Herstellung eines humanen monoclonalen Antikörpers, welcher spezifisch kreuzreaktiv mit einem Nicht-Kern-Kohlehydratepitop ist, welches mindestens an zwei Serotypen von mindestens zwei Arten von verschiedenen Bakteriengattungen vorhanden ist, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zellinie nach einem der Ansprüche 12,13 oder 14 gezüchtet wird und die Antikörper gewonnen werden.
16. 18. Verfahren zur Herstellung von humanen monoclonalen Antikörpern, welche fähig sind, ein Nicht-Kern-Kohlehydratepitop zu binden, welches durch Serotypen von zwei verschiedenen bakteriellen Arten geteilt wird, dadurch gekennzeichnet, dass von einem Individuum B-Zellen isoliert werden, die B-Zellen zur Bildung einer Vielzahl von Anti-körper-produzierenden Clonen immortalisiert werden, dass die erhaltenen Clone für die Herstellung eines Antikörpers, welcher spezifisch für Nicht-Kern-Kohlehydratepitope von mindestens zwei Bakterienarten ist, einem Screening unterworfen werden und dass die erhaltenen ausgewählten Clone, die unsterbliche Zellinien gemäss Anspruch 12 darstellen, kultiviert und der dabei produzierte monoclonale Antikörper geerntet wird.
17. 19. Verfahren gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die B-Zellen durch EBV-Transformation immortalisiert werden.