DE60128893T2 - Behandlung von pilzinfektion mit polyenen oder beta glucan synthese hemmern kombiniert mit anti-hsp antikörpern - Google Patents

Behandlung von pilzinfektion mit polyenen oder beta glucan synthese hemmern kombiniert mit anti-hsp antikörpern Download PDF

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Description

  • Vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Pilzinfektionen, wobei die Zusammensetzung einen neuen Antikörper oder ein Fragment eines daran anbindenden Antigens enthält.
  • Pilzinfektionen stellen eine bedeutende Ursache der Patientensterblichkeit auf der Intensivstation dar sowie im allgemeineren bei immunsuprimierten und geschwächten Patienten (Gold, J.W.M., 1984, Am. J. Med., 76: 458-463; Klein R.S. et al., 1984, N. Engl. J. Med. 311: 354-357; Burnie, J.P., 1997, Current Anaesthesia & Critical Care 8: 180-183). Die Präsenz und die Persistenz von Pilzinfektionen kann dem selektiven Druck von Breitband-Antimykotika, häufigen verlängerten Patientenaufenthalten in Einrichtungen, wie z.B. Intensivstationen, Problemen bei der Diagnose der Infektionen sowie der geringen Effizienz der bei der Therapie verwendeten Antipilzmittel zuge schrieben werden. Während strikte Hygienekontrolle die Vorbeugung von Pilzinfektionen in Krankenhäusern oder anderen Einrichtungen bewirken kann, bleiben Ausbrüche der Infektionen ein ernsthaftes Problem und müssen angesprochen werden.
  • Systemische Pilzinfektionen, wie z.B. invasive Candidiasis und invasive Aspergillosis können von einer Vielzahl von Pilz-Pathogenen verursacht werden, z.B. die virulente Candida-Spezies C. ablicans, C. tropicalis und C. krusei sowie die weniger virulente Spezies C. parapsilosis und Torulopsis glabrata (wobei letztere in einigen Texten als Candida glabrata bezeichnet wird). Obwohl C. albicans früher das verbreitetste Pilz-Isolat war, das aus Intensivstationen erhalten wurde, zeigten neuere Studien, dass C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis und C. krusei jetzt ungefähr die Hälfte solcher Isolate ausmachen (Pfaller, M.A. et al., 1998, J. Clin. Microbiol. 36: 1886-1889; Pavese, P. et al., 1999, Pathol. Biol. 46: 579-583). Das vermehrte Auftreten von nicht-albicans-Spezies impliziert das Aufkommen von Resistenz von Candida-Spezies gegen konventionelle antifungale Therapie (Walsh, T.J. et al., New Eng. J. Med. 340: 764-771).
  • Die Detektion und Diagnose des für die Infektion verantwortlichen Pilz-Pathogens ist entscheidend für die subsequente Therapie, weil Antimykotika gegen bestimmte Stämme effektiver sein können. GB 22 40 979 und EP 0 406 029 (die hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gänze eingeschlossen werden) offenbaren ein Pilz-Stress-Protein sowie einen darauf spezifischen Antikörper, die bei einem empfindlichen und hoch spezifischen Test zur Detektion von Pilz-Pathogenen verwendet werden können.
  • Üblicherweise wurden C. albicans, C. tropicalis und C. parapsilosis mit dem Anitmykotikum Amphotericin B behandelt, was als der „Gold-Standard" bei systemischer, antifungaler Therapie angesehen wurde (Burnie, J.P., 1997, supra). Unglücklicherweise ist Amphotericin B selbst hoch toxisch und seine Verwendung ging mit Nebenwirkungen, u.a. Schüttelfrost, Fieber, Myalgia oder Thrombophlebitis, einher. Andere Antimykotika beinhalten oral verabreichte Azol-Arzneistoffe (Miconazol, Ketoconazol, Itraconazol, Fluconazol) und 5-Fluorocytosin. Jedoch sind Pilzspezies, wie z.B.
  • C. krusei und T. glabrata, resistent gegen Fluconazol und diese Spezies treten oft bei Patienten auf, bei denen dieses Arzneimittel prophylaktisch verabreicht wurde. Darüberhinaus wurden Fluconazol-resistente Stämme von C. albicans berichtet (Opportunistic Pathogens, 1997, 1: 27-31). Somit bleibt trotz kürzlich gemachter Fortschritte bei therapeutischen Arzneimitteln, wie z.B. Fluconazol, Itraconazol und systemisch liposomal-basierten Varianten von Amphotericin B (Burnie, J.P., 1997, supra) das Bedürfnis an effektiven Arzneimitteln zur Behandlung von Pilzinfektionen akut.
  • Vorliegende Erfindung hebt auf dieses oben beschriebene Bedürfnis ab, indem sie die Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments, das eine signifikante Verbesserung gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Arzneimittel zur Behandlung von humanen oder tierischen Pilzinfektionen darstellt, bereitstellt. Ebenso kann ein neuartiger Antikörper in der Zusammensetzung vorhanden sein. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfasst einen Antikörper, der an ein oder mehrere Epitope eines fungalen Stressproteins anbinden kann, in Kombi nation mit bekannten Antimykotika. Überraschenderweise haben die Erfinder festgestellt, dass die Effizienz von Antimykotika gegen Pilz-Infektionen signifikant erhöht wird, was entweder eine geringere Dosierung zur Behandlung oder eine effizientere Behandlung bei gleicher Dosis erlaubt, und somit die Reduktion von ungewollten Nebenwirkungen erlaubt. Weiterhin erlaubt das erfindungsgemäße Medikament eine effektive Behandlung von Pilzinfektionen, die eine inhärente Resistenz gegenüber dem in der Zusammensetzung enthaltenem Antimykotikum aufweisen.
  • Erfindungsgemäß wird die Verwendung einer Zusammensetzung eines Antikörpers oder eines Fragmentes eines daran anbindenden Antigens, das spezifisch für ein oder mehrere Epitope eines Pilz-Stressproteins ist, sowie ein Wirkstoff gegen Pilze, enthaltend zumindest einen Stoff ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Polyen-Antipilzwirkstoff und einem Echinocandin-Antipilzwirkstoff zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Pilzinfektionen, wobei der Pilz, der besagte Pilzinfektion verursacht, per se resistent gegen besagten Antipilzwirkstoff ist, bereitgestellt.
  • Ebenso wird hierin eine kombinierte Zusammensetzung zur simultanen, separaten oder sequentiellen Verwendung bei der Behandlung von Pilzinfektionen offenbart, enthaltend einen Antikörper oder ein Fragment eines daran anbindenden Antigens, das spezifisch für ein oder mehrere Epitope eines Pilz-Stressproteins ist, sowie ein Wirkstoff gegen Pilze, enthaltend zumindest einen Stoff ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Polyen-Antipilzwirkstoff und einem Echinocandin-Antipilzwirkstoff zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Pilzinfektionen, wobei der Pilz, der besagte Pilzinfektion verursacht, per se resistent gegen besagten Antipilzwirkstoff ist.
  • Der Antikörper kann spezifisch für ein Hitzeschockprotein eines Vertreters der Gattung Candida oder Torulopsis sein (die Gattungen Candida und Torulopsis werden im Allgemeinen für Synonyme gehalten). Im speziellen kann der Antikörper spezifisch für das Hitzeschockprotein, umfassend bsp90 von Candida albicans, wie in GB 22 40 979 und EP 0 406 029 beschrieben, sein. Der Antikörper oder das daran anbindende Antigenfragment kann spezifisch für das Epitop, umfassend die Sequenz von SEQ ID NO:1 sein.
  • Antikörper, ihre Herstellung und Verwendung sind generell bekannt und z.B. in Harlow, E. und Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999 beschrieben.
  • Die Antikörper können durch im Stand der Technik bekannten Standardmethoden erzeugt werden. Beispiele von Antikörpern beinhalten (aber sind nicht beschränkt hierauf) polyclonale, monoclonale, chimerische, Single Chain, Fab-Fragmente, Fragmente, die durch eine Fab-Expressions-Bibliothek erhalten werden und an Antigene bindende Fragmente von Antikörpern.
  • Die Antikörper können in einer Reihe von Wirtstieren, z.B. Ziegen, Kaninchen, Ratten, Mäusen, Menschen und weiteren, erzeugt werden. Sie können durch Injektion mit Hitzeschockprotein der Gattung Candida, z.B. hsp90 aus C. albicans, oder einem Fragment oder Oligopeptid davon, das immunogene Eigenschaften aufweist, immunisiert werden. Je nach Wirtstier-Spezies können verschiedene Hilfsstoffe zur Erhöhung einer Immunantwort verwendet werden. Solche Hilfsstoffe beinhalten, Freund's Mineralgele, wie z.B. Aluminiumhydroxid, und oberflächenaktiven Substanzen, wie z.B. Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanionen, Polypeptide, Ölemulsionen, Schlüsselloch-Hämocyanin von Nacktschnecken und Dinitorphenol, sind aber nicht beschränkt hierauf. Unter den Hilfsstoffen, die bei Menschen verwendet werden, sind BCG (Bacille Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum besonders nützlich.
  • Monoclonale Antikörper zum Hitzeschockprotein aus der Gattung Candida, z.B. hsp90 aus C. albicans oder ein Fragment oder Oliopeptid davon, können durch jede Technik hergestellt werden, die die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur gewährleistet. Diese beinhalten, aber sind nicht limitiert hierauf, die Hybridom-Technik, die humane B-Zellen-Hybridom-Technik und die EBV-Hybridom-Technik (Koehler et al., 1975, Nature, 256: 495-497; Kosbor et al., 1983, Immunol. Today 4: 72; Cote et al., 1983, PNAS USA, 80: 2026-2030; Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., New York, S. 77-96).
  • Zusätzlich können Techniken, die zur Produktion von „chimerischen Antikörpern" entwickelt wurden, das Splicen von Antikörpergenen von Mäusen zu Antikörpergenen von Menschen verwendet werden, um ein Molekül mit angemessener Antigen-Spezifität und biologischer Aktivität zu erhalten (Morrison et al., 1984, PNAS USA, 81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452-454). Alternativ hierzu können Techniken, die zur Produktion von Single Chain-Antikörpern beschrieben wurden, angewendet werden, wobei Verfahren aus dem Stand der Technik verwendet werden, um Candida-Hitzeschock-Protein-spezifische Single Chain-Antikörper herzustellen. Antikörper mit entsprechender Spezifität, aber ausgeprägter idiotypischer Zusammensetzung können durch Chain Shuffling aus zufälligen kombinatorischen Immunoglobulin-Bibliotheken erzeugt werden (Burton, D.R., 1991, PNAS USA, 88: 11120-11123).
  • Antikörper können ebenso durch Induktion der in vivo-Produktion in der Lymphozyten-Population oder durch Überprüfen der rekombinanten Immunoglobulin-Bibliotheken oder Platten durch hoch spezifische Binde-Reagenzien hergestellt werden (Orlandi et al., 1989, PNAS USA, 86: 3833-3837; Winter, G. et al., 1991, Nature, 349: 293-299).
  • An Antigene bindende Fragmente können ebenso erzeugt werden, z.B. die F(ab')2-Fragmente, die durch Pepsin-Verdauung des Antikörper-Moleküls erzeugt werden können, und die Fab-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfid-Brücke des F(ab')2-Fragments erhalten werden können. Als Alternative können Fab-Expressions-Bibliotheken konstruiert werden, um schnelle und leichte Identifikation der monoclonalen Fab-Fragmente mit der gewünschten Spezifität zu gewährleisten (Huse et al., 1989, Science, 256: 1275-1281).
  • Verschiedene Immunoassays können zur Auslese verwendet werden, um die Antikörper mit der gewünschten Spezifität zu identifizieren. Zahlreiche Protokolle zur kompetitiven Anbindung oder immunoradiometrische Assays unter Verwendung von entweder polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers mit festgesetzten Spezifitäten sind aus dem Stand der Technik bekannt. Sol che Immunoassays beinhalten typischerweise die Messung einer Komplex-Bildung zwischen dem Hitzeschockprotein der Gattung Candida, z.B. hsp90 von C. albicans oder eines Fragmentes oder Oligopeptids davon und seinem spezifischen Antikörper. Ein zweiseitiger, monoklonal basierter Immunoassay, bei dem monoklonale Antikörper verwendet werden, der bezüglich zwei nicht-interferierender Candida-Hitzeschock-Proteinepitope ist, kann verwendet werden, jedoch kann auch ein kompetitiver Bindungs-Assays benutzt werden (Maddox et al., 1983, J. Exp. Med., 158: 1211-1216).
  • Der Antikörper kann die Sequenz von SEQ ID NO: 2 beinhalten.
  • Das Polyen-Antimykotikum kann z.B. Amphotericin B, ein Derivat von Amphotericin B oder Nystatin umfassen. Derivate von Amphotericin B beinhalten Formulierungen, wie z.B. AmBisom (erhältlich z.B. von NexStar Pharmaceuticals, Cambridge, UK), Amphotericin-B-Lipidkomplex (Abelcet), eine kolloide Dispersion von Amphotericin B (Amphocil) und eine intralipide Emulsion von Amphotericin B (Burnie, J.P., 1997, supra) und können verwendet werden. Amphotericin B kann in Kombination mit einem anderen Antipilz-Wirkstoff, 5-Fluorocytosin verwendet werden (Burnie, J.P., 1997, supra).
  • Der Echinocandin-Antipilzwirkstoff kann z.B. Anidulafungin (LY303366; Eli Lilly & Co., Indianapolis, USA) sein. Echinocandine sind cyclische Lipopeptide, die die Synthese von β-1,3-Glucan in Pilzen inhibieren (Redding, J.A. et al., 1998, Antimicrob. Agents Chemo. Ther. 42 (3): 1187-1194).
  • Die Pilzinfektionen, die durch die Zusammensetzung oder kombinierte Präparation behandelt werden können, können Mucormycosis, Blastomycosis, Coccidioidomycosis oder Paracoccidioidomycosis sein, oder die Pilzinfektion kann durch einen Organismus, ausgewählt aus der Gruppe Candida, Cryptococcus, Histoplasma, Asperigillus oder Torulopsis verursacht werden. Der Term „Coccodioidomycosis" wird in diesem Zusammenhang auch als „Coccidiomycosis" bezeichnet und auf ähnliche Art und Weise ist der Term „Paracoccidioidomycosis" synonym mit „Paracoccidiomycosis". Die Pilzinfektion ist per se resistent gegen den Antipilzwirkstoff, d.h. Pilzinfektionen, die an sich durch spezifische Wirkstoffe unbehandelbar sind, weil dieser spezifische Antipilzwirkstoff nicht effizient ist, wenn er herkömmlich alleine angewandt wird.
  • Hiermit wird ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Pilzinfektionen des menschlichen oder tierischen Körpers offenbart, die durch die Verwendung einer Zusammensetzung oder einer kombinierten Präparation, wie sie in der vorliegenden Anmeldung beschrieben ist, gekennzeichnet ist. Verfahren zur Herstellung von Medikamenten sind wohl bekannt. Zum Beispiel kann ein Medikament zusätzlich einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff, ein Verdünnungsmittel oder einen Hilfsstoff beinhalten (Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopoeia, 1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA).
  • Ebenso wird ein Verfahren zur Behandlung von Pilzinfektionen des menschlichen oder tierischen Körpers offenbart, umfassend die Verabreichung einer Zusammensetzung oder einer kombinierten Präparation gemäß der vorliegenden Anmeldung an einen Patienten, der dieselbe benötigt. Die exakte Dosierung (d.h. die pharmazeutisch akzeptable Dosis) der Zusammensetzung oder der kombinierten Präparation, die an den Patienten verabreicht werden muss, kann leicht vom Fachmann ermittelt werden, z.B. durch die Verwendung von einfachen Dosis-Antwort-Experimenten. Die Zusammensetzung oder die kombinierte Präparation kann oral verabreicht werden.
  • Weiterhin ist ein Kit offenbart, umfassend einen Antikörper, umfassend die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder ein daran anbindendes Antigen-Bindefragment, das spezifisch auf ein oder mehrere Epitope eines Pilz-Stress-Proteins ist sowie einen Antipilzwirkstoff, umfassend alle aus der Gruppe bestehend aus einem Polyen-Antipilzwirkstoff und einem Echinocandin-Antipilzwirkstoff. Das Kit kann bei der Behandlung von Pilzinfektionen verwendet werden, wobei der Pilz, der die Pilzinfektion verursacht, gegen den Antipilzwirkstoff per se resistent ist.
  • Der hierin offenbarte Antikörper kann einen diagnostischen Verwendungszweck haben. Somit kann der Antikörper zur diagnostischen Verwendung verwendet werden, um festzustellen, ob das Stressprotein in einem Mikroorganismus vorhanden ist, um zu bestätigen, ob der Wirt eine bestimmte Pilzinfektion, z.B. Mucormycosis, Blastomycosis, Coccidioidomycosis oder Paracoccidioidomycosis oder eine Infektion, die auf einen Organismus ausgewählt aus der Gruppe von Candida, Cryptococcus, Histoplasma, Aspergillus oder Torulopsis zurückzuführen ist, aufweist oder z.B. bei der Diagnose von Pilzabszessen, insbesondere hepatitische Candidiasis und/oder um den Fortschritt der therapeutischen Behandlung solcher Infektionen zu verfolgen. Als diagnostische Methoden dieser Art können im allgemeinen Standardtechniken, z.B. immunologische Me thoden, wie z.B. Enzym-Linked Immunosorbent-Methoden, Radioimmuno-Methoden, Latex-Agglutinations-Methoden oder Immunoblotting-Methoden, verwendet werden.
  • Der hierin offenbarte Antikörper kann mit einem detektierbaren Label markiert werden oder kann mit einem Effektor-Molekül konjugiert werden, z.B. einem Medikament, wie z.B. einem Antipilzwirkstoff, wie z.B. Amphotericin B oder Fluorocytosin, oder einem Toxin, wie z.B. Ricin, oder einem Enzym, unter Verwendung konventioneller Prozeduren, wobei sich die Offenbarung auch auf solche markierte Antikörper oder Antikörper-Konjugate erstreckt.
  • Weiterhin wird hiermit die Verwendung des Antikörpers oder des daran anbindenden Antigenbindefragments bei der Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose einer oder mehrerer Pilzinfektionen offenbart. Das Diagnostikum kann in einem Kit bereitgestellt werden. Das Kit kann Instruktionen für die Verwendung bei der Diagnose einer oder mehrerer Pilzinfektionen beinhalten.
  • Falls gewünscht können Mischungen von Antikörpern zur Diagnose oder Behandlung verwendet werden, z.B. Mischungen von zwei oder mehreren Antikörpern, die verschiedene Epitope eines erfindungsgemäßen Pilzstressproteins erkennen und/oder Mischungen von Antikörpern von verschiedenen Klassen, z.B. Mischungen von IgG- und IgM-Antikörpern, die die gleichen oder verschiedene der erfindungsgemäßen Epitope erkennen.
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beschreibung, die beispielhaft spezielle Ausführungsformen der Zusammensetzung und damit verbundenen experimentellen Vorgehensweise beschreibt, näher erläu tert.
  • Experimenteller Teil
  • Die im nachfolgenden beschriebenen Experimente beschreiben Untersuchungen zum antifungalen Effekt eines Antikörpers gegen ein hsp90-Antigen, das von Candida albicans erhalten wurde und in Kombination mit Antimykotika, wie z.B. Amphotericin B oder Fluconazol verwendet wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass in manchen Fällen die Kombination des Antikörpers und des Antipilzwirkstoffes einen verstärkten antifungalen Effekt hervorruft, verglichen mit der jeweils einzelnen Komponente. Ein überraschend starker synergistischer Effekt konnte für Amphotericin B in Kombination mit Anti-Candida albicans hsp90 Antikörper gegen eine Mehrzahl von gewöhnlich problematischen Pilzpathogenen demonstriert werden. Dieser synergistischer Effekt hat signifikante Auswirkungen auf die klinische Behandlung von Pilzinfektionen. Eine vorläufige klinische Studie mit vier Patienten, die an Candida-Infektionen litten, zeigte die Effektivität der vorliegenden Erfindung an Menschen.
  • Materialien und Methoden
  • Stämme:
  • Die verwendeten Nicht-Aspergillus-Pilzstämme (Tabelle 1) wurden auf Sabouraud's Dextrose Agar-Platten (Oxoid, Basingstoke, UK) aufgetragen und bei 37 °C für 24 h inkubiert. Die Stämme wurden mit dem API 20C-System (BioMerieux, Marcy L'Etoile, Frankreich) identifiziert. Falls erforderlich wurden mikroskopische Untersuchungen der Morphologie des Maismehl-Agars (Oxoid) verwendet, um die Identität zu bestätigen.
  • Isolate von Aspergillus spp (Tabelle 1) wurden auf Sabouraud's Dextrose-Agar (Oxoid, Basingstoke, UK) bei 35 °C für 24 h bebrütet.
  • Tabelle 1
    Figure 00130001
  • Im Falle der Nicht-Aspergillus-Stämme wurden Suspensionen aus individuellen Kolonien (Durchmesser ≥ 1 mm) in 5 ml steriler 0,85 %iger Salzlösung mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen/ml (nachgewiesen durch Zählen mit einem Hämocytometergitter) hergestellt. Für Aspergillusstämme, siehe unten.
  • Antipilzwirkstoffe:
  • Amphotericin B wurde von Sigma (Poole, Dorset) als lyophilisiertes Pulver für intravenöse Administration (Fungizone) erworben. Fluconazol wurde als Lösung für intravenöse Administration (Diflucan) von Pfizer bezogen. Amphotericin B wurde in Dimethylsulphoxid mit einer Konzentration von 1,2 mg/ml gelöst und Fluconazol wurde in 0,85 %iger Salzlösung, also mit einer Konzentration von 1,2 mg/ml gelöst. Die Stammlösungen wurden bei -70 °C bis zur Verwendung aufbewahrt. Abelcet (liposomales Amphotericin B), hergestellt von Bristol-Meyers Squib (USA) und hergestellt gemäß den Richtlinien des Herstellers, wurde in der klinischen Studie verwendet.
  • Antikörper:
  • Die DNA-Sequenz eines schon früher bekannten Antikörpers, der spezifisch auf das hsp90-Epitop von Candida albicans ist, und aus GB 22 40 979 und EP 0 406 029 bekannt ist, wurde genetisch durch Codon-Optimierung zur Expression in Escherichia coli (Operon Technologies Inc., Alameda, CA, USA) modifiziert und in einen E. coli-Expressionsvektor eingefügt. Die Aminosäuresequenz des Anti-hsp90-Antikörpers umfasst gemäß vorliegender Erfindung die Sequenz von SEQ ID NO: 2 (beinhaltet die schweren, leichten und Spacer-Domänen). Der erfindungsgemäße Antikörper erkennt die Epitope umfassend die Sequenz von SEQ ID NO: 1.
  • Der Anti-hsp90-Antikörper wurde in einem Escherichia coli-Wirt exprimiert und dann durch Affinitätschromatograhie und eine Imidazol-Austauschsäule auf 95 %ige Reinheit auf gereinigt. Dabei wurden standardmolekularbiologische Protokolle verwendet (siehe z.B. Harlow & Lane, supra; Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Sambrook, J. & Russell, D., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).
  • Mycograb-Formulierungen (RTM) wurden wie folgt hergestellt: Ein Röhrchen mit 10 mg reinem Anti-hsp90-Antikörper, 150 mg Harnstoff (pharmazeutische Reinheit, Ph Eur) und 174 ml L-Arginin (Ph Eur) wurden in 5 ml Wasser wiederhergestellt.
  • Assay-Medien:
  • RPMI-Medium wurde aus RPMI 1640-Medium (Sigma R7880), ergänzt durch 0,3 g Glutamin pro Liter hergestellt mit 34,6 g Morpholinpropansulfonsäure (MOPS) pro Liter gepuffert und auf pH 7,0 eingestellt.
  • Der Medium-Mikroverdünnungstest:
  • Ausgehend von den zwei Stammlösungen wurden über zweifache Verdünnung (40 bis 0,024 mg/ml für Amphotericin B und 400 bis 0,4 mg/ml für Fluconazol) im RPMI-Medium hergestellt. 100 μl einer Suspension des Inoculums wurden 1:10 verdünnt (äquivalent zu 1 × 103 cfu) und auf die Mikrotiterplatten gegeben. Hierzu wurden 50 μl des Antimykotikums und dann 50 μl des Antikörpers gegeben. Der Antikörper war entweder pur (0,4 mg/ml) oder verdünnt auf 1:10 oder 1:100. Bei Abwesenheit des Antikörpers wurde das Volumen von 50 μl durch RPMI aufgefüllt. Das Gesamtvolumen in jedem Tiegel war 200 μl. Die finalen Konzentrationen des Antikörpers in den Experimenten waren: 100 μg/ml („pur"), 10 μg/ml („1:10-Antikörper") oder 1 μg/ml („1:100-Antikörper").
  • Die Platten wurden bei 37 °C über Nacht inkubiert und die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) durch das untere Konzentration-Inhibitions-Wachstum definiert.
  • Koloniezählungen wurden für die Tiegel durchgeführt, bei denen ein visueller Rückgang des Pilzwachstums beobachtet wurde. Die Ergebnisse wurden als Koloniebildende Einheiten pro ml Medium (cfu/ml) dargestellt.
  • Aspergillus-Studien:
  • Isolate von Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus und Aspergillus niger wurden im RPMI 1640 Medium hergestellt. Die Suspensionen wurden so hergestellt, dass ein finales Inoculum von 2 × 104 Konodien pro ml erhalten wurde; diese wurden in 100 μl Aliquoten in Mikrotiterplatten mit flachem Boden dispensiert. Eine doppelt verdünnte Serie von Amphotericin B mit 250 mg/ml bis 0,75 mg/ml wurde hergestellt und in die jeweiligen Tiegel dispensiert. Mycograb wurde zu jedem der Tiegel bis zu einer finalen Konzentration von 100 μg/ml im Puffer der Formulierung zugegeben. Ebenso wurde für jedes Isolat eine Kontrollreihe hergestellt, die nur Formulierungs-Puffer enthielt. Die Platten wurden dann bei 35 °C/200 rpm für 48 h inkubiert und die MIC-Werte für jedes Isolat durch Anwesenheit oder Abwesenheit von Zellwachstum bestimmt.
  • Tier-Synergie:
  • 30 CD1-Mäusen (wobei jede ungefähr 25 g wog) wurden 100 μl des C. albicans Outbreak-Stamms (äquivalent zu 1,5 × 107 cfu) injiziert und die Mäuse nach 2 h in drei Gruppen aufgeteilt und:
    • (A) der Gruppe 1-100 μl einer 10 mM Ammoniumacetat (AAT; pH 9) gefolgt von 100 μl Amphotericin B äquivalent zu 0,6 μg/kg in einer 5 eigen (w/v) Glucoselösung;
    • (B) der Gruppe 2-100 μl einer 10 mM AAT (pH 9) Lösung, enthaltend 500 μg Anti-hsp90-Antikörper, gefolgt von 100 μl Amphotericin B, äquivalent zu 0,6 mg/kg in einer 5 %igen (w/v) Glucoselösung; und
    • (C) der Gruppe 3-100 μl einer 10 mM AAT (pH 9) Lösung, enthaltend 50 μm Anti-hsp90-Antikörper gefolgt von 100 μl Amphotericin B, äquivalent zu 0,6 mg/kg in einer 5 %igen (w/v) Glucoselösung injiziert.
  • Nach 48 h wurden die Tiere getötet und eine Zählung der Pilzzellen des Leber-, des Milz- und des Nierengewebes auf Sabouraud's-Platten durchgeführt.
  • Klinische Studie:
  • Am Central Manchester Health Care Trust Hospital und am Wythenshawe Hospital, beide in Manchester, UK, wird eine Open-Label-Sicherheits- und pharmakokinetische Studie des Anti-hsp90-Antikörpers (in Form von Mycograb; siehe oben) unter Beteiligung von vier Patienten, die an Candida-Infektionen erkrankt waren, durchgeführt. Die Patienten wurden auf Anzeichen von Sepsis, die auf Candida zurückzuführen sind, untersucht, inklusive: Positive C. albicans-Kulturen von multiplen oder tiefgelegenen Lokalisationen; erhöhte oder schwankende Temperatur (Pyrexia); eine hohe Pulsrate (Tachycardie) und eine hohe Anzahl weißer Blutkörperchen („WBC").
  • Anschließend an die herkömmliche Behandlung mit Abelcet (liposomales Amphotericin B) und/oder Fluconazol wurden den Patienten verschiedene Dosen von Mycograb, inklusive einer optionalen Testdosis (0,1 mg/kg) und einer therapeutischen Dosis oder therapeutischen Dosen von 1 mg/kg verabreicht. Die Patienten wurden auf klinisch und im Labor nachweisbare Anzeichen der Infektion hin beobachtet (wobei die untersuchten Laborparameter die Blutchemie, Hämatologie und Blutgerinnungsfaktoren beinhalteten), ebenso wurden die Serum- und Urinlevels von Mycograb untersucht.
  • Ergebnisse
  • Die in vitro-Experimente, die den Effekt der Kombination eines Anti-Candida albicans hsp90-Antikörpers („Antikörper") und Antipilzwirkstoffen untersuchten, sind in den Tabellen 2 bis 18 dargestellt. Ergebnisse aus Tierversuchen sind in Tabelle 19 dargestellt.
  • In vitro-Experimente:
  • Zusammensetzungen enthaltend Antikörper und Fluconazol:
  • Tabelle 2 zeigt die minimalen inhibitorischen Konzentrationen (MICs) von Fluconazol gegen die im Test verwendeten Pilzpathogene bei An- oder Abwesenheit des Anti-C. albicans hps90-Antikörpers in verschiedenen Verdünnungen, wie dies über dem Mediums-Mikroverdünnungstest berechnet wurde. Bei Anwesenheit des puren Antikörpers und des 1:10 verdünnten Antikörpers wurde die MIC für den Outbreak-Stamm von C. albicans um das Vierfache reduziert (1,56 μg/ml auf 0,39 μg/ml Fluconazol), wobei eine 100fache Verdünnung des Antikörpers in einer zweifachen Reduktion der Fluconazol MIC resultierte.
  • Beim Fluconazol-resistenten Stamm von C. albicans und C. krusei wurde in der Anwesenheit von purem Antikörper eine leichte Reduktion der Fluconazol MIC beobachtet. Bei einer Verdünnung von 1:10 und 1:100 hatte der Antikörper jedoch keinen Effekt auf die Fluconazol MIC dieser Stämme im Vergleich zur Abwesenheit des Antikörpers.
  • Für die übrigen Pilzstämme, d.h. C. tropicalis, C. parapsilosis und T. glabrata hatte der Anti-C. ablicans hsp90-Antikörper keinen erkennbaren Effekt auf die Fluconazol-MICs.
  • Tabelle 2: Fluconazol-MICs
    Figure 00190001
  • Für jeden der in Tabelle 2 angegebenen Pilz-Stämme wurden weitere Experimente zur Quantifizierung der Anzahl von Zellkolonien, die die verschiedenen Fluconazol-Konzentrationen mit verschiedenen Verdünnungen des Anti-C. albicans hsp90-Antikörpers überlebten, vorgenommen.
  • Bei den untersuchten Fluconazol-Konzentrationen wurde die Überlebensrate von C. albicans (Outbreak-Stamm) durch Addition von purem Antikörper oder 100fach verdünntem Antikörper nicht reduziert (Tabelle 3).
  • Tabelle 3: Kolonienanzahl in cfu/ml für C. albicans (Outbreak-Stamm) in Abhängigkeit von Fluconazol
    Figure 00200001
  • Beim Fluconazol-resistenten Stamm von C. albicans wurde eine zweifache Reduktion der Überlebensrate der Kolonien bei 12,5 μg/ml Fluconazol in Anwesenheit des puren Antikörpers beobachtet (Tabelle 4). Eine leichte Reduktion der Überlebensrate dieses Stammes wurde bei geringeren Konzentrationen von Fluconazol in der Anwesenheit des puren Antikörpers festgestellt, jedoch war kein Effekt bei einer 1:100 Verdünnung des Antikörpers wahrnehmbar.
  • Tabelle 4: Kolonienanzahl (in cfu/ml) des Fluconazolresistenten Stammes von C. albicans in Abhängigkeit von Fluconazol
    Figure 00210001
    • (Kontrolle 2,6 × 107 cfu/ml)
  • Der pure oder verdünnte Antikörper hatte keinen signifikanten fungiziden Effekt gegen C. krusei bei den untersuchten Fluconazol-Konzentrationen (Tabelle 5). Tabelle 5: Anzahl Kolonien in cfu/ml für C. krusei in Abhängigkeit von Fluconazol
    Figure 00210002
    • (Kontrolle 1 × 107 cfu/ml)
  • Für C. tropicalis konnte bei den untersuchten Fluconalz-Konzentrationen in der Abwesenheit oder Anwesen heit des Antikörpers kein merklicher Effekt beobachtet werden (Tabelle 6).
  • Tabelle 6: Anzahl Kolonien in cfu/ml für C. tropicalis in Abhängigkeit von Fluconazol
    Figure 00220001
    • (Kontrolle 1,6 × 106 cfu/ml)
  • Tabelle 7 zeigt, dass die Anwesenheit oder Abwesenheit des Antikörpers einen Effekt auf die Überlebensrate von T. glabrata-Kolonien bei jeder der untersuchten Fluconazol-Konzentrationen hatte.
  • Tabelle 7: Anzahl Kolonien in cfu/ml für T. glabrata in Abhängigkeit von Fluconazol
    Figure 00220002
    • (Kontrolle 4,3 × 107 cfu/ml)
  • Die Anwesenheit oder Abwesenheit des Antikörpers hatte keinen beachtenswerten Effekt auf die Überlebensrate von C. parapsilosis-Kolonien bei Fluconazol-Konzentrationen, wie sie in Tabelle 8 angegeben sind.
  • Tabelle 8: Anzahl Kolonien in cfu/ml für C. parapsilosis in Abhängigkeit von Fluconazol
    Figure 00230001
    • (Kontrolle 1 × 107 cfu/ml)
  • Zusammensetzungen mit Antikörper und Amphotericin B: Tabelle 9 zeigt die minimalen inhibitorischen Konzentrationen (MICs) von Amphotericin B gegen die untersuchten Pilz-Pathogene in An- oder Abwesenheit des Anti-C. albicans hsp90-Antikörpers bei verschiedenen Verdünnungen, wie dies durch den Mediums-Mikroverdünnungstest berechnet wurde.
  • Im Gegensatz zu den für Fluconazol erhaltenen Ergebnissen (siehe Tabelle 2 bis 8 oben) zeigten alle hier untersuchten Stämme einen zumindest vierfachen Abfall der MIC von Amphotericin B, wenn unverdünnter Antikörper zum Inkubations-Medium zugegeben wurde (Tabel le 9). Zudem wurde bei allen untersuchten Stämmen ein zumindest zweifacher Abfall der Amphotericin B MIC beobachtet, sogar wenn der 100fach verdünnte Antikörper zum Inkubationsmedium zugegeben wurde (finale Antikörperkonzentration: 1 μg/ml).
  • Der signifikanteste Effekt bei der Reduktion der MIC von Amphotericin B einer Zusammensetzung enthaltend Antikörper und Amphotericin B wurde beim Fluconazolresistenten Stamm von C. albicans beobachtet. Der pure Antikörper führte zu einer 10fachen Reduktion der Amphotericin B MIC und sogar eine 100fach verdünnte Antikörperlösung reduzierte die Amphotericin B MIC um ungefähr 25 % (Tabelle 9).
  • Tabelle 9: MICs für Amphotericin B
    Figure 00240001
  • Für jeden der in Tabelle 9 aufgeführten Pilzstämme wurden detaillierte Experimente zur Quantifizierung der Anzahl von Zellkolonien, die die verschiedenen Amphotericin B-Konzentrationen bei verschiedenen Verdünnungen des Anti-C. albicans hsp90-Antikörpers überlebten, durchgeführt.
  • Tabelle 10 zeigt die Überlebensrate für den Outbreak-Stamm von C. albicans, der mit Amphotericin B in An- oder Abwesenheit des Antikörpers inkubiert wurde.
  • Durch den Antikörper wurde bei allen untersuchten Amphotericin-Konzentrationen ein dramatischer Rückgang (zumindest 10fach) bei der Anzahl der überlebenden Kolonien bewirkt. Zum Beispiel bei 0,78 μg/ml Amphotericin B betrug die Überlebensrate von C. albicans (Outbreak-Stamm) bei Anwesenheit der 100fach verdünnten Antikörpers 0,2 % verglichen mit der Überlebensrate des Stamms ohne Antikörper. Der inhibitorische Effekt des 100fach verdünnten Antikörpers bei 0,078 mg/ml Amphotericin B war äquivalent zur Überlebensrate dieses Stamms bei 0,156 μg/ml Amphotericin B (ohne Antikörper). Somit ist sogar ein sehr verdünnter Antikörper in der Lage, eine Reduktion der benötigten Amphotericin B-Menge zu bewirken, um eine spezifische Sterblichkeitsrate bei diesem Stamm zu erzielen.
  • Tabelle 10: Anzahl Kolonien in cfu/ml für den Outbreak-Stamm von C. albicans in Abhängigkeit von Amphotericin B
    Figure 00260001
    • (Kontrolle 1 × 107 cfu/ml)
  • Tabelle 11 zeigt die Überlebensrate von C. albicans-Kolonien (Fluconazol-resistenter Stamm) bei verschiedenen Konzentrationen von Amphotericin B und verschiedenen Antikörperverdünnungen. Es konnte kein erkennbarer Effekt des Antikörpers oder Amphotericin B bei niedrigen Konzentrationen des Antipilz-Wirkstoffes beobachtet werden. Bei Annäherung des Amphotericin B-Levels an die MIC des Antipilzwirkstoffes (siehe Tabelle 9, oben) konnte jedoch ein bemerkenswerter Effekt des Antikörpers auf die Überlebensrate der Kolonie beobachtet werden. Zum Beispiel bei 0,078 μg/ml Amphotericin B bewirkte der 100fach verdünnte Antikörper eine Überlebensrate dieses Stammes von 0,1 % verglichen mit der Überlebensrate der Abwesenheit des Antikörpers.
  • Tabelle 11: Anzahl Kolonien in cfu/ml für den Flucozanol-resistenten Stamm von C. albicans in Abhängigkeit von Amphotericin B
    Figure 00270001
    • (Kontrolle 1,6 × 107 cfu/ml)
  • Die Überlebensraten von C. krusei in der Anwesenheit von Amphotericin B und verschiedenen Mengen des Antikörpers sind in Tabelle 12 dargestellt. Der Antikörper kann als sehr effektiv gegen diesen Stamm bei den untersuchten höheren Konzentrationen von Amphotericin B angesehen werden. Sogar bei 100facher Verdünnung betrug die Anzahl von nachgewiesenen C. krusei-Kolonien in der Anwesenheit von 0,312 μg/ml Amphotericin B im Vergleich mit den überlebenden Kolonien ohne Antikörper 0,01 %.
  • Tabelle 12: Anzahl Kolonien in cfu/ml für C. krusei in Abhängigkeit von Amphotericin B
    Figure 00280001
    • (Kontrolle 1 × 107 cfu/ml)
  • Bei allen untersuchten Konzentrationen von Amphotericin B (in einem Bereich von 0,019 bis 0,156 μg/ml) wurde gezeigt, dass der Antikörper effizient bei der Reduktion der Überlebensrate des Stamms C. tropicalis besitzt (Tabelle 13). Der Effekt wurde bei höheren Antikörper und Amphotericin B-Konzentrationen verstärkt. Tabelle 13: Anzahl Kolonien in cfu/ml für C. tropicalis in Abhängigkeit von Amphotericin B
    Figure 00280002
    • (Kontrolle 1,6 × 106 cfu/ml)
  • Tabelle 14 zeigt die Überlebensrate für T. glabrata in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von Amphotericin B und Antikörper. Es konnte gezeigt werden, dass der Antikörper hoch effizient bei der Inhibierung des Wachstums von T. glabrata bei allen untersuchten Amphotericin B-Konzentrationen ist. Zum Beispiel wurde bei 100facher Verdünnung des Antikörpers das Wachstum dieses Stammes zu 99,2 % bei 0,009 μg/ml Amphotericin B zu 99,99 % bei 0,019 μg/ml Amphotericin B und zu 99,91 % bei 0,039 μg/ml Amphotericin B inhibiert.
  • Tabelle 14: Anzahl Kolonien in cfu/ml für T. glabrata in Abhängigkeit von Amphotericin B
    Figure 00290001
    • (Kontrolle 1 × 107 cfu/ml)
  • Die Überlebensrate des Pilzstammes C. parapsilosis bei verschiedenen Leveln des Antikörpers und Amphotericin B ist in Tabelle 15 dargestellt. Es wurde beobachtet, dass der pure Antikörper eine Reduktion der Überlebensrate dieses Stammes bei allen untersuchten Leveln von Amphotericin B bewirkt. Bei niedrigeren Konzentrationen des Antikörpers war der Effekt weniger stark ausgeprägt als bei den anderen untersuchten Stämmen.
  • Tabelle 15: Anzahl Kolonien in cfu/ml für C. parapsilosis in Abhängigkeit von Amphotericin B
    Figure 00300001
    • (Kontrolle 1 × 107 cfu/ml)
  • Zusammensetzung mit Antikörper aber ohne Antipilzwirkstoff:
  • In einem weiteren Experiment wurde der Effekt verschiedener Konzentrationen des Anti-C. albicans hsp90-Antikörpers allein (ohne Pilzwirkstoff) auf die verschiedenen Pilzstämme (wie in den Tabellen 2 bis 15 verwendet, siehe oben) untersucht. Die in Tabelle 16 dargestellten Resultate machen deutlich, dass bei den meisten der verwendeten Stämme der Antikörper selbst keinen Effekt auf ihre Überlebensrate besitzt. Eine kleine Minderung der Überlebensrate, die auf den Antikörper alleine zurückzuführen ist, konnte bei den Stämmen T. glabrata, C. tropicalis und C. parapsilo sis jedoch beobachtet werden.
  • Tabelle 16: Effekt des Antikörpers alleine gegen Pilzwachstum (dargestellt in cfu/ml)
    Figure 00310001
  • Experimente mit Aspergillus spp:
  • Die MIC von Aspergillus fumigatus in Abhängigkeit von Amphotericin B betrug 2,5 μg/ml. Mit Zugabe von Mycograb veränderte sich die MIC auf 0,125 μg/ml (zweifache Abnahme). Die MIC von Aspergillus flavus gegenüber Amphotericin B betrug 2,5 μg/ml. Mit der Zugabe von 100 μg/ml Mycograb veränderte sich die MIC auf 0,125 μg/ml (zweifache Abnahme). Die MIC von Aspergillus niger gegenüber Amphotericin B betrug 2,5 μg/ml. Durch Zugabe von 100 μg/ml Mycograb nahm die MIC auf 0,125 μg/ml ab (zweifache Abnahme).
  • Zusammenfassung der in vitro-Ergebnisse:
  • Die in Tabelle 2 bis 16 dargestellten Resultate legen nahe, dass während der Anti-C. albicans hsp90-Antikörper alleine in der Lage war, das Wachstum bestimmter Pilzstämme zu unterbinden, eine überraschend hohe Rate an antifungaler Aktivität gegen alle unter suchten Stämme beobachtet werden konnte, wenn der Antikörper in Kombination mit Amphotericin B verwendet wurde. Dieser überraschende Effekt zwischen dem Antikörper und Amphotericin B wird nicht bei anderen untersuchten Pilzwirkstoffen beobachtet: Fluconazol in Kombination mit dem Antikörper ergab kein signifikantes und potentiell nützliches Ergebnis.
  • Unter Verwendung einer vierfachen Differenz der Verbesserung der MIC als Ausschlussbedingung legen die Daten in Tabelle 2 nahe, dass Fluconazol, kombiniert mit puren Antikörper (finale Konzentration 100 μg/ml) oder eine 10fache Verdünnung des Antikörpers (finale Konzentration 10 μg/ml) nur gegen den Outbreak-Stamm von C. albicans effektiv ist. Unter Verwendung des gleichen Kriteriums kann jedoch aus Tabelle 9 geschlossen werden, dass Amphotericin B, kombiniert mit purem Antikörper oder einer 10fachen Verdünnung des Antikörpers effektiv gegen alle getesteten Pilzstämme war. Daher kann darauf geschlossen werden, dass eine starke Synergie zwischen Amphotericin B und dem Anti-C. albicans hsp90-Antikörper besteht, wie durch die Verbesserung der MIC gemessen wurde.
  • Bei den Experimenten, bei denen die Pilzkolonien nach verschiedenen antifungalen und Antikörperbehandlungen quantifiziert wurden (siehe Tabellen 3 bis 8 und 10 bis 15, oben), kann eine andere Ausschlussbedingung, die über einen „Two-Log-Drop" (Abfall um das 100fache) der überlebenden Kolonien definiert ist, verwendet werden, um potentiell nützliche Kombinationen von Behandlungen abzuschätzen.
  • Eine Zusammenfassung der Ergebnisse für Fluconazol in Kombination mit dem Anti-C. albicans hsp90-Antikörper ist in Tabelle 17 dargestellt. Hier wird die nied rigste Konzentration von Fluconazol, die in dem gewünschten Effekt resultiert (oder die höchste Konzentration, die in dem Experiment verwendet wurde) gezeigt, zusammen mit der Indikation des Ausschlusskriteriums eines zumindest 100fachen Abfalls in der Pilzüberlebensrate, die erreicht wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass nur der Fluconazol-resistente Stamm von C. albicans bei Kombination mit Fluconazol und purem Antikörper einen signifikanten Effekt aufwiesen.
  • Tabelle 17: Zusammenfassung der in vitro-Ergebnisse für Fluconazol
    Figure 00330001
    • (+ zeigt an, dass das Ausschlusskriterium erfüllt ist; – zeigt an, dass das Ausschlusskriterium nicht erfüllt ist; das Ausschlusskriterium ist eine zumindest 100fache Reduktion der Kolonienanzahl)
  • Die Zusammenfassung der Resultate für Amphotericin B in Kombination mit dem Anti-C. albicans hsp90-Antikörper ist in Tabelle 18 dargestellt. Hieraus ist ersichtlich, dass das Ausschlusskriterium (100fache Reduktion des Wachstums der Pilzkolonien) mit purem Antikörper für alle untersuchten Pilzstämme sowie mit einer 10fachen Verdünnung des Antikörpers für C. albicans (Outbreak-Stamm und Fluconazol-resistenter Stamm), C. krusei und T. glabrata sowie mit einer 100fachen Verdünnung des Antikörpers für C. albicans (Outbreak-Stamm) und T. glabrata erfüllt ist.
  • Es ist erwähnenswert, dass die Synergie zwischen Amphotericin B und dem Antikörper nicht nur bei den Fluconazol-sensitiven Stämmen von C. albicans, sondern auch bei Fluconazol-resistenten Stämmen von C. albicans und Pilzen, wie z.B. Candida krusei und T. glabrata, die intrinsisch resistent über Fluconazolen sind, beobachtet werden konnte.
  • Tabelle 18: Zusammenfassung der in vitro-Ergebnisse für Amphotericin B
    Figure 00340001
    • (+ zeigt an, dass das Ausschlusskriterium erfüllt ist; – zeigt an, dass das Ausschlusskriterium nicht erfüllt ist; das Ausschlusskriterium ist eine zumindest 100fache Reduktion der Kolonienanzahl)
  • Die Resultate mit Aspergillus spp zeigen, dass eine Synergie zwischen Amphotericin B und Mycograb in vitro gegen den gemeinen Aspergillus spp besteht.
  • (2) Tierexperimente:
  • Mit dem Outbreak-Stamm von mit Candida albicans infizierte Mäuse wurden mit Amphotericin B allein (Gruppe 1), Amphotericin B und 500 μg Anti-hsp90-Antikörper (Gruppe 2) und Amphotericin B und 50 μg Anti-hsp90-Antikörper (Gruppe 3) behandelt. Pilz-Kolonie-Zählungen für verschiedene Gewebearten der Mäuse nach einem Behandlungszeitraum von 48 h sind in Tabelle 19 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Tiere, die mit Amphotericin B und 500 μg Antikörper (Gruppe 2) behandelt wurden, eine signifikante Reduktion (zumindest eine Größenordnung) bei der Anzahl der Pilzkulturen im Vergleich zu Tieren, die mit Amphotericin B allein behandelt wurden (Gruppe 1) zeigten. Tiere, die mit Amphotericin B und 50 μg Antikörper (Gruppe 3) behandelt wurden, zeigten ebenso eine verminderte Anzahl von Pilzkulturen im Vergleich zu den Tieren, die mit Amphotericin B allein behandelt wurden (Gruppe 1). Daher bekräftigen die in vivo-Daten die in vitro-Daten und bestätigen die Synergie zwischen dem Anti-hsp90-Antikörper und dem Antimykotikum Amphotericin B zur Behandlung von Pilzinfektionen.
  • Tabelle 19: Kolonienanzahl von C. albicans (Outbreak-Stamm) in Gewebearten der behandelten Mäusegruppen
    Figure 00360001
  • (3) Klinische Studie:
  • Vier Patienten mit Beweisanzeichen einer Candida-Infektion, die nicht auf herkömmliche antifungale Behandlung ansprach, wurden mit einer kombinierten Verabreichung von Antimykotika und Anti-hsp90-Antikörper in der Form von Mycograb (siehe oben) behandelt und ihr Zustand beobachtet.
  • Bei Patient 1 wurde primär eine akute Pankreatitis diagnostiziert, außerdem hatte der Patient ein postoperatives, akutes, progressives Lungenversagen bei Erwachsenen (postoperative adult respiratory distress Syndrome (ARDS)) und benötigte künstliche Beatmung. C. albicans wurde in vitro aus einer Vielzahl von Lokalitäten, inklusive pankreatischem Bett gezüchtet. Der Patient hatte eine sehr hohe Anzahl weißer Blutkörperchen (WBC) (87,4), obwohl diese sehr schwankte und nicht alleine auf die Sepsis zurückzuführen gewesen sein dürfte. Es wurde mit einer Abelcet-Behandlung mit 3 mg/kg begonnen.
  • Fünf Tage nach Beginn der Abelcet-Behandlung wurde dem Patienten 1 eine erste Testdosis von Mycograb bei 0,1 mg/kg verabreicht (Tag 1). Am dritten Tag wurde dem Patienten eine klinische Dosis von Mycograb mit 1 mg/kg verabreicht. Aufgrund verschiedener Faktoren, z.B. einer Verschlechterung der Thrombozytenzahl, die seit mindestens vier Tagen niedrig war, wurden die Abelcet- und Mycograb-Behandlungen am Tag nach Verabreichung der klinischen Dosis von Mycograb ausgesetzt. Jedoch wuchs in Patient 1 sechs Tage später (Tag 9) C. albicans in der Asziteflüssigkeit wieder nach, so dass wieder Fluconazol (400 mg) verabreicht wurde. Am folgenden Tag (Tag 10) wurden dem Patienten die finalen zwei klinischen Dosen von Mycograb mit 1 mg/kg per Dosis verabreicht.
  • Obwohl Patient 1 über sieben Tage mit Abelcet behandelt wurde, bevor der Patient die klinische Dosis Mycograb am dritten Tag erhielt, wuchs C. albicans immer noch im Tracheostoma des Patienten und der Patient litt an Tachycardie. Die kombinierte Behandlung mit Abelcet und Mycograb am Tag 3 bedingte einen 5-tätigen Zeitraum, in welchem C. albicans nicht wuchs. Keine auf Mycograb zurückzuführenden Änderungen in der Blutchemie, Hämatologie und Gerinnungsfaktoren wurden während der Behandlung mit Mycograb festgestellt. Die Behandlung des erneuten Auftretens mit Fluconazol und Mycograb (zwei Dosen am Tag 10) waren weniger erfolgreich, wie dies aus den in vitro-Synergie-Resultaten (siehe z.B. Tabellen 2 und 17) hätte erwartet werden können, jedoch erholte sich der Patient schließlich von der Candidosis.
  • Die Serumlevel von Mycograb in Patient 1 zu verschiedenen Zeitintervallen nach der Administration von Mycograb-Dosen sind in Tabelle 20 dargestellt. Die Testdosis am Tag 1 ergab keinen messbaren Serum-Level. Die 1,0 mg/kg Dosis am Tag 3 und Tag 10 ergaben detektierbare Serum-Level und diese Level wurden verglichen mit denen, bei denen Synergieeffekte zwi schen Amphotericin B in vitro demonstriert werden konnte (siehe Tabellen 9 und 18). Im Anschluss an die zweite Dosis am Tag 10 wurden die Level von Mycograb verbessert, wobei in gewissem Ausmaß Gewebeakkumulation im Anschluss an die erste Dosis indiziert wurde. Bei der 1,0 mg/ml Dosis konnte Mycograb im Urin nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).
  • Tabelle 20: Serumlevel (in μg/ml) von Mycograb bei Patient 1
    Figure 00380001
  • Bei Patient 2 wurde eine kleine Darmabschnürung, die auf Adhäsionen zurückzuführen waren, diagnostiziert, litt an ARDS und benötigte künstliche Beatmung.
  • C. albicans wurde aus multiplen Lokalitäten inklusive der Aszitesflüssigkeit gezüchtet, wobei die Infektion mit einer schwankenden Temperatur (35,8 bis 38,2 °C), erhöhter WBC (11,4) und gelegentlicher Tachycardie (auf 110) einherging. Eine Behandlung des Patienten mit Abelcet von 3 mg/kg wurde begonnen.
  • Vier Tage nach Beginn der Behandlung mit Abelcet behielt Patient 2 immer noch eine schwankende Temperatur, erhöhte WBC und gelegentliche Tachycardie bei. Dem Patienten wurde eine Testdosis von Mycograb zu 0,1 mg/kg verabreicht (Tag 1). Am folgenden Tag wurde dem Patienten eine klinische Dosis von 1 mg/kg Mycograb verabreicht (Tag 2). Die letzte Dosis von Abelcet wurde zur Vervollständigung eines fünftägigen Behandlungsprogramms ebenso an Tag 2 verabreicht. Zwei Tage später (Tag 4) erhielt der Patient die finalen zwei klinischen Dosen von Mycograb.
  • Der Patient tolerierte das Mycograb gut. Die klinischen Dosen von Mycograb am Tag 2 gingen mit einer fallenden und sich stabilisierenden Temperatur (38,2 bis 36,7 °C am Tag 2 nach Erhalt der klinischen Dosis bei 36,7 bis 37,4 °C während Tag 3 bleibend) und einer fallenden WBC (von 11,9 auf 9,6) einher. Am Tag 4 machte der Patient einen klinisch besseren Eindruck und C. albicans vermehrte sich nicht mehr in der Aszitesflüssigkeit, Blutkulturen oder Urin. Keine auf Mycograb zurückzuführenden Veränderungen in der Blutchemie, Hämatologie oder Gerinnungsfaktoren konnten während der Behandlung beobachtet werden. Die anschließende Besserung wurde durch einen Vorfall einer bakteriellen Sepsis erschwert, die jedoch auf Antibiotika ansprach, so dass der Patient sich vollständig erholte.
  • Die Serumlevel von Mycograb bei Patient 2 zu verschiedenen Zeitintervallen nach der Administration von Mycograb-Dosen sind in Tabelle 21 dargestellt. Die Testdosis am Tag 1 ergab keinen messbaren Serum-Level. Die 1,0 mg/kg Dosis am Tag 2 ergab detektier bare Serum-Level und diese Level wurden mit denen verglichen, bei denen Synergieeffekte zwischen Amphotericin B in vitro demonstriert werden konnten (siehe Tabellen 9 und 18). Bei der 1,0 mg/ml Dosis konnte Mycograb im Urin nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).
  • Tabelle 21: Serumlevel (in μg/ml) von Mycograb bei Patient 2
    Figure 00400001
  • Patient 3 war an Pankreatitis mit einer 6-wöchigen Geschichte erkrankt, die zu einer 80 eigen Pankreatektomie führte. Der Patient hatte leicht erhöhte LFT-Werte (Leberfunktionstest), die wahrscheinlich auf Alkoholabusus zurückzuführen waren und war ein MRSA-Träger (Methicillin-resistentes Staphylococcus aureus). C. albicans wurde aus multiplen Lokalitäten gezüchtet, der Patient wurde intravenös mit Flucona zol behandelt. 12 Tage später, nachdem der Patient nicht auf Fluconazol ansprach, wurde der Patient mit 300 mg Abelcet alternativ behandelt. Drei Tage später war der Patient immer noch pyrexial (38,5 °C) und C. albicans vermehrte sich immer noch an einer Vielzahl von Lokalitäten (in den Drainagen des Abdomens und gastroskopischen Röhrchen), daher wurde eine klinische Dosis 1 mg/kg Mycograb (Tag 1) zusätzlich zum Abelcet verabreicht.
  • Am gleichen Tag der Gabe der Mycograb-Dosis erlitt Patient 3 einen akuten Vorfall eines Gram-negativ-Typs eines septischen Schocks (hohe Temperatur von 39,5 °C, hypotensiv) der vermutlich auf Pseudomonas aeruginosa zurückzuführen ist, die sich im Anschluss in seiner pakreatischen Drainage vermehrten, obwohl sich ebenso Enterococcus faecalis in seinen Blutkulturen vermehrten. Nach diesem Vorfall wurden keine weiteren Mycograb-Dosierungen verabreicht. Im nachfolgenden sprach der Patient auf antibiotische Therapie an (Vancomycin und Ceftazidim).
  • Wegen dieser bakteriellen Komplikationen war es schwierig, den Einfluss der einzelnen Dosis Mycograb auf Patient 3 zu bewerten. Es wurde jedoch festgestellt, dass C. albicans sich über einen Zeitraum von 48 h nachdem die Dosis verabreicht wurde nicht mehr vermehrte (z.B. aus seiner gastrosomischen Röhre und den Wundabflüssen) und er an Tag 2 und Tag 3 apyrexial wurde. Keine auf Mycograb zurückzuführenden Veränderungen der Laborparameter (Blutchemie, Hämatologie und Gerinnungsfaktoren) wurden beobachtet. An Tag 4 hatte der Patient ein erneutes Auftreten von C. albicans während er immer noch mit Abelcet behandelt wurde, jedoch konnte eine volle Genesung im Nachfolgenden erreicht werden.
  • Die Serumlevel von Mycograb bei Patient 3 zu verschiedenen Zeitintervallen nach der Administration von Mycograb-Dosen sind in Tabelle 22 dargestellt.
  • Die Testdosis am Tag 1 ergab keinen messbaren Serum-Level. Die 1,0 mg/kg Dosis am Tag 2 ergab detektierbare Serum-Level und diese Level wurden mit denen verglichen, bei denen Synergieeffekte zwischen Amphotericin B in vitro demonstriert werden konnte (siehe Tabellen 9 und 18). Bei der 1,0 mg/ml Dosis konnte Mycograb im Urin nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Tabelle 22: Serumlevel (in μg/ml) von Mycograb bei Patient 3
    Tag 1
    Zeit (h) 1,0 mg/kg bd
    0 0
    0,5 2,5
    1, 0 1, 5
    2,0 1,2
    4,0 0,1
    6,0 0
    8, 0 0
    12, 0 0
    24,0 0
    48,0 0
  • Bei Patient 4 wurde ein C. albicans-Empyem diagnostiziert, obwohl der Patient ursprünglich mit einem Lungenabszess, der durch Streptococcus milleri (isoliert aus Blutkulturen) verursacht wurde, auf die Intensivstation eingewiesen wurde. C. albicans wurde aus Pro ben von bronchialen Spülungen (rechte und linke Lunge) gezüchtet und drei und vier Tage später aus zwei Proben eines Empyemfluids. Am nächsten Tag wurde die Behandlung mit Abelcet (5 mg/kg) begonnen. Fünf Tage nach Beginn der Abelcet-Behandlung wurde in gewissem Ausmaß eine Verschlechterung des klinischen Zustands beobachtet und am folgenden Morgen (Tag 1) konnte dies mit einer hohen WBC (15,7) und C. albicans, das aus einer intercostalen Drainageflüssigkeit gezüchtet wurde, assoziiert werden.
  • Patient 4 wurde Mycograb (1 mg/kg) um 8:30 h und 20:30 h an Tag 1 verabreicht. Abgesehen von einem zeitweisen Anstieg der Körpertemperatur in der Nacht von Tag 1 verbesserte sich der klinische Zustand des Patienten. C. albicans konnte nicht aus einer Probe eines Empyem-Fluids von Tag 3 kultiviert werden und der Zustand des Patienten verbesserte sich schrittweise.
  • Patient 4 tolerierte Mycograb gut. Keine auf Mycograb zurückzuführenden Veränderungen der Laborparameter (Blutchemie, Hämatologie und Gerinnungsfaktoren) konnten beobachtet werden. Somit wuchsen sechs Tage nach Beginn der Abelcet-Behandlung in dem Patienten immer noch C. albicans aus einer Hüftdrainage und seine WBC war hoch (15,7, bevor die erste Mycograb-Dosis verabreicht wurde, jedoch konnte hiernach eine stetige Verbesserung und ein Stopp des Wachstums von C. albicans beobachtet werden.
  • Die Serumlevel von Mycograb bei Patient 4 zu verschiedenen Zeitintervallen nach der Administration von Mycograb-Dosen sind in Tabelle 23 dargestellt. Die 1,0 mg/kg Dosis am Tag 1 ergab detektierbare Serum-Level und diese Level wurden verglichen mit de nen, bei denen Synergieeffekte zwischen Amphotericin B in vitro demonstriert werden konnte (siehe Tabellen 9 und 18). Im Anschluss an die zweite Dosis am Tag 1 wurden die Level von Mycograb verbessert, wobei in gewissem Ausmaß Gewebeakkumulation im Anschluss an die erste Dosis indiziert wurde. Bei der 1,0 mg/ml Dosis konnte Mycograb im Urin nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).
  • Tabelle 23: Serumlevel (in μg/ml) von Mycograb bei Patient 4
    Figure 00440001
  • Schlussfolgerungen
  • Die hier präsentierten Daten zeigen klar auf, dass ein Synergismus zwischen dem Anti-Candida hsp90-Antikörper und dem Antimykotikum Amphotericin B existiert, der eine verstärkte antifungale Aktivität ge gen eine breite Varietät von pathologisch wichtigen Pilzstämmen bedingt. Diese Resultate erlauben die Verwendung einer neuen, hoch effizienten Zusammensetzung zur Behandlung von menschlichen oder tierischen Pilzinfektionen sowie einen neuen Antikörper, der in die Zusammensetzung mit aufgenommen werden kann. Vorliegende Erfindung erlaubt entweder niedrigere Dosierungen bei der Behandlung oder eine effizientere Behandlung bei gleichen Dosierungen, wodurch unerwünschte Nebenwirkungen reduziert werden können.
  • Klinische Implikationen der vorliegenden Erfindung beinhalten: (i) die Produktion einer synergistischen Kombination von Amphotericin B und Anti-hsp90-Antikörper bei der Behandlung von verbreiteten Pilzinfektionen sollte die Behandlung der Wahl werden. Dies würde zu einer Reduktion der Sterblichkeit und der Morbidität dieser Infektionen führen. Die hier vorgestellten Resultate der vorläufigen klinischen Studie bestätigen die Effizienz der vorliegenden Erfindung im Vergleich mit existierenden Methoden der Behandlung; (ii) Amphotericin B ist ein Toxin, insbesondere ein nephrotoxisches Arzneimittel. Der von der Erfindung bereitgestellte Synergismus hat zur Folge, dass eine niedrigere Dosis von Amphotericin B verwendet werden kann bei gleichzeitigem Erhalt der Effizienz und begleitender Reduktion der Toxizität; und (iii) der toxizitätseinsparende Effekt des Antihsp90-Antikörpers würde die Erkundung der klinischen Effizienz höhere Dosierungen von Amphotericin B erlauben und darüberhinaus zu einem verbesserten klinischen Resultat beitragen.
  • SEQUENCE LISTING
    Figure 00460001
  • Figure 00470001

Claims (10)

  1. Verwendung einer Zusammensetzung eines Antikörpers oder eines Fragmentes eines daran anbindenden Antigens, das spezifisch für ein oder mehrere Epitope eines Pilz-Stressproteins ist, sowie ein Wirkstoff gegen Pilze, enthaltend zumindest einen Stoff. ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Polyen-Antipilzwirkstoff und einem Echinocandin-Antipilzwirkstoff zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Pilzinfektionen, wobei der Pilz, der besagte Pilzinfektion verursacht, per se resistent gegen besagten Antipilzwirkstoff ist.
  2. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der besagte Antikörper spezifisch für ein Hitzeschockprotein eines Vertreters der Gattungen Candida oder Torulopsis ist.
  3. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei besagtes Hitzeschockprotein bsp90 von Candida albicans umfasst.
  4. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der besagte Antikörper oder das daran anbindende Antigen-Fragment spezifisch für das Epitop, umfassend die Sequenz von SEQ ID NO:1, ist.
  5. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei der besagte Antikörper die Sequenz gemäß SEQ ID NO:2 umfasst.
  6. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der besagte Polyen-Antipilzwirkstoff Amphotericin B oder ein Derivat von Amphotericin B umfasst.
  7. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der besagte Echinocandin-Antipilzwirkstoff Anidulafungin (LY303366) umfasst.
  8. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die besagte Pilzinfektion mindestens eine, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mucormycosis, Blastomycosis, Coccidioidomycosis oder Paracoccidioidomycosis ist, oder besagte Pilzinfektion durch zumindest einen Organismus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Candida, Cryptococcus, Histoplasma, Aspergillus oder Torulopsis verursacht wird.
  9. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 oder 5, wobei der besagte Antikörper oder das daran anbindende Antigen-Fragment mit einer detektierbaren Markierung versehen ist.
  10. Verwendung nach einem der Ansprüche 4, 5 oder 9, wobei das besagte Antigen oder das daran anbindende Antigen-Fragment mit einem Effektormolekül konjugiert ist.
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