DE69533084T2

DE69533084T2 - Behandlung von antibiotisch-assoziierte-diarrhöe

Info

Publication number: DE69533084T2
Application number: DE69533084T
Authority: DE
Inventors: Louis D. Heerze; Glen D. Armstrong
Original assignee: Synsorb Biotech Inc
Current assignee: Relypsa Inc
Priority date: 1994-02-14
Filing date: 1995-02-09
Publication date: 2005-06-09
Anticipated expiration: 2015-02-10
Also published as: MX197129B; CA2181359C; AU1572795A; US5635606A; CN1131070C; DE69533084D1; CN1140415A; EP0744959B1; AU698275B2; JP4122052B2; MX9603403A; NO963378D0; CA2181359A1; ATE267614T1; JPH09508631A; NO963378L; NZ279180A; KR970701064A; IL112428A0; US5484773A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Behandlung von antibiotikabegleitender Diarrhoe, einschließlich der mit Clostridium difficile einhergehenden Diarrhoe (CDAD) und Pseudomembran-Colitis (PMC). Sie betrifft insbesondere die Neutralisation des mit CDAD einhergehenden C. difficile-Toxins A.
LITERATUR
Die folgenden Literaturstellen sind in der Anmeldung als Zahlen in eckigen Klammer ([]) im entsprechenden Abschnitt der Anmeldung aufgeführt.

1. Bartlett, JG, et al., "Antibiotic-associated pseudomembranous colitis due to toxin-producing clostridia", N. Engl. J. Med. 298: 531–534 (1978).
2. Lyerly, DM, "Epidemiology of Clostridium difficile disease", Clin. Microbiol. News 15: 49–53 (1993).
3. Cozart, JC, et al., "Clostridium difficile diarrhea in patients with AIDS versus non-AIDS controls. Method of treatment and clinical response to treatment", J. Clin. Gastroenterol. 16: 192–4 (1993).
4. Barbut, F, et al., "Comparison of enterotoxin production, cytotoxin production, serogrouping and antimicrobial susceptibilities of Clostridium difficile strains isolated from AIDS and human immunodeficiency virus-negative patients", J. Clin. Microbiol. 31: 740–2 (1993).
5. Krivan, HC, et al., "Cell surface binding site for Clostridium difficile enterotoxin: evidence for a glycoconjugate containing the sequence αGal(1-3)βGal(1-4)βGlcNAc", Infect. Immun., 53: 573–81 (1986).
6. Clark, GF, et al., "Toxin A from Clostridium difficile binds to rabbit erythrocyte glycolipids with terminal αGal(1-3)βGal(1-4)βGlcNAc sequences", Arch. Biochem. Biophys., 257: 217–29 (1987).
7. Tucker, KD, et al., "Toxin A of Clostridium difficile binds to carbohydrate antigens I, X, and Y", Infect. Immun., 59: 73–8 (1991).
8. Krivan, HC, et al., "Purification of Clostridium difficile toxin A by affinity chromatography on immobilized bovine thyroglobulin", Infect. Immun., 55: 1873–7 (1987).
9. Kamiya, S, et al., "Analysis of purity of Clostridium difficile toxin A derived by affinity chromatography on immobilized bovine thyroglobulin", FEMS Microbiol. Lett., 56: 331–6 (1988).
10. Armstrong, GD, et al., "Investigation of shiga-like toxin binding to chemically synthesized oligosaccharide sequences", J. Infect. Dis., 164: 1160–7 (1991).
11. Von Eichel-Streiber, C., et al., "Clostridium difficile toxin A carries a c-terminal repetitive structure homologous to the carbohydrate binding region of streptococcal glycosyltransferases", Gene, 96: 107–13 (1990).
12. Lemieux, RU, et al., "The properties of a 'synthetic' antigen related to the blood-group Lewis A", J. Am. Chem. Soc., 97: 4076–83 (1975).
13. Sullivan, NM, et al., "Purification and characterization of toxin A and B from Clostridium difficile", Infect. Immun., 35: 1032–40 (1983).
14. Finegold, SM, et al., "Therapy directed against Clostridium difficile and its toxins. Complications of therapy". In Rolfe, R. D. et al. (eds) C. difficile: It's Role in Intestinal Disease, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. 341–57 (1988).
15. Bartlett, J G, et al., "Symptomatic relapse after oral vancomycin therapy of antibiotic-associated pseudomembranous colitis", Gastroenterology, 78: 431–4 (1989).
16. Tedesco, FJ, "Pseudomembranous colitis: Pathogenesis and therapy", Med. Clin. North Am., 66: 655–64 (1982).
17. Keighley, MRB, "Antibiotic-associated pseudomembranous colitis: pathogenesis and management", Drugs, 20: 449–56 (1980).
18. Bartlett, JD, "Treatment of antibiotic-associated pseudomembranous colitis", Rev. Infect. Dis., 6, Suppl. 1: 1–55 (1984).
19. Onderdonk, AB, et al., "Comparative effects of clindamycin and clindamycin metabolites in the hamster model for antibiotic-associated colitis", J. Antimicrob. Chem., 8: 383–93 (1981).
20. Triadfilopoulos, G, et al., "Differential effects of Clostridium difficile toxin a and b on rabbit ileum", Gastroenterology, 93: 273–9 (1987).
21. Lemieux, RU, et al., "Glycoside-Ether-Ester Compounds", U.S. Pat. No 4,137,401, ausgegeben am 30. Jan. 1979.
22. Lemieux, R. U., et al., "Artificial Oligosaccharide Antigenic Determinants", U.S. Pat. No. 4,238,473, ausgegeben am 9. Dez. 1980.
23. Lemieux, RU, et al., "Synthesis of 2-Amino-2-Deoxyglycoses and 2-Amino-2-Deoxyglycosides from glycals", U.S. Pat. No. 4,362,720, ausgegeben am 7. Dez. 1982.
24. Cox, D, et al. "A New Synthesis of 4-O-α-D-Galactopyranosyl-D-Galacto-Pyranose", Carbohy. Res., 62: 245–252 (1978).
25. Dahmén, J, et al., "Synthesis of space arm, lipid, and ethyl glycosides of the trisaccharide portion [α-D-Gal-(1-4)-β-D-Gal(1-4)-β-D-Glc] of the blood group p^k antigen: preparation of neoglycoproteins", Carbohydrate Research, 127: 15–25 (1984).
26. Garegg, PJ, et al., "A Synthesis of 8-Methoxycarbonyloct-1-yl O-α-D-Galactopyranosyl-(1→3)-O-β-D-Galactopyranosyl-(1→4)-2-Acetamido-2-Deoxy-β-D-Glucopyranoside", Carbohy. Res., 136: 207–213 (1985).
27. Garegg, PJ, et al., "Synthesis of 6- and 6'-deoxy derivatives of methyl 4-O-α-D-galactopyranosyl-β-D-galactopyranoside for studies of inhibition of pyelonephritogenic fimbriated E. coli adhesion to urinary epithelium-cell surfaces.revreaction., Carbohy. Res., 137: 270–275 (1985).
28. Jacquinet, JC, et al., "Synthesis of Blood-group Substances, Part 11. Synthesis of the Trisaccharide O-α-D-Galactopyranosyl-(1→3)-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranose", J. C. S. Perkin, I: 326–330 (1981).
29. Koike, K, et al., "Total Synthesis of Globotriaosyl-E and Z-Ceramides and Isoglobotriaosyl-E-Ceramide," Carbohydr. Res., 163: 189–208 (1987).
30. Schaubach, R., et al., "Tumor-Associated Antigen Synthesis: Synthesis of the Gal-α-(1→3)-Gal-β-(1→4)-GlCNAc Epitope. A specific Determinant for Metastatic Progression?," Liebigs Ann. Chem., 607–614 (1991).
31. Ratcliffe, RM, et al., "Sialic Acid Glycosides, Antigens, Immunoadsorbents, and Methods for Their Preparation", U.S. Pat. No. 5,079,353, ausgegeben am 7. Jan. 1992.
32. Okamoto, K., et al., "Glycosidation of Sialic Acid," Tetrahedron, 47: 5835–5857 (1990).
33. Abbas, SA, et al., "Tumor-Associated Oligosaccharides I: Synthesis of Sialyl-Lewis^a Antigenic Determinant", Sialic Acids, Proc. Japan-German Symp. Berlin 22–23 (1988).
34. Paulsen, "Advances in Selective Chemical Syntheses of Complex Oligosaccharides", Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 21: 155–173 (1982).
35. Schmidt, "New Methods for the Synthesis of Glycosides and Oligosaccharides--Are There Alternatives to the Koenigs-Knorr Method?" Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 25: 212–235 (1986).
36. Fügedi, P, et al., "Thioglycosides as Glycosylating Agents in Oligosaccharide Synthesis", Glycoconjugate J., 4: 97–108 (1987).
37. Kameyama, A, et al., "Total synthesis of sialyl Lewis X", Carbohydrate Res., 209: c1–c4 (1991).
38. Ekborg, G, et al., "Synthesis of Three Disaccharides for the Preparation of Immunogens bearing Immunodeterminants Known to Occur on Glycoproteins", Carbohydrate Research, 110: 55–67 (1982).
39. Dahmén, J, et al., "2-Bromoethyl glycosides: applications in the synthesis of spacer-arm glycosides," Carbohydrate Research, 118: 292–301 (1983).
40. Rana, SS, et al., "Synthesis of Phenyl-2-Acetamido-2-Deoxy-3-O-α L-Fucopyranosyl-β-D-Glucopyranoside and Related Compounds", Carbohydrate Research, 91: 149–157 (1981).
41. Amvam-Zollo, P, et al., "Streptococcus pneumoniae Type XIV Polysaccharide: Synthesis of a Repeating Branched Tetrasaccharide with Dioxa-Type Spacer-Arms", Carbohydrate Research, 150: 199–212 (1986).
42. Paulsen, H., "Synthese von Oligosaccharid-Determinanten mit Amid-Spacer vom Typ des T-antigens", Carbohydr. Res., 104: 195–219 (1982).
43. Chernyak, AY, et al., "A New Type of Carbohydrate-Containing Synthetic Antigen: Synthesis of Carbohydrate-Containing Polyacrylamide Copolymers having the Specificity of 0:3 and 0:4 Factors of Salmonella", Carbohydrate Research, 128: 269–282 (1984).
44. Fernandez-Santana, V, et al., "Glycosides of Monoallyl Diethylene Glycol. A New type of Spacer group for Synthetic Oligosaccharides", J. Carbohydrate Chemistry, 8(3), 531–537 (1989).
45. Lee, RT, et al., "Synthesis of 3-(2-Aminoethylthio) Propyl-Glycosides", Carbohydrate Research, 37: 193–201 (1974).

Die Offenbarung der vorstehenden Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen sind hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen, und zwar im gleichen Maße als wäre die Sprache jeder einzelnen Veröffentlichung, jedes einzelnen Patents und jeder einzelnen Patentanmeldung speziell und individuell hier enthalten.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der anaerobe Organismus Clostridium difficile ist die Hauptursache der antibiotikabegleitenden bakteriellen Di arrhoe und Pseudomembran-Colitis (PMC) bei vorwiegend älteren Patienten in Hospitälern und Dauer-Pflegeeinrichtungen [1, 2]. Der Organismus kann nicht erfolgreich mit der normalen Mikrobenflora im Colon des Erwachsenen konkurrieren. Wird jedoch die normale Darmflora verändert, bspw. durch Antibiotika-Behandlung, kann C. difficile den Magen in hoher Zahl besiedeln. Die Antibiotika-Therapie ist für 98% sämtlicher Fälle von mit C.-difficile einhergehender Diarrhoe (CDAD) verantwortlich. Jede anfällig machende Bedingung, die die normale Darmflora beeinträchtigt, einschließlich einer beliebigen Bedingung, die eine ausgiebige immunsuppressive Behandlung erfordert, kann ebenfalls zur Entwicklung von CDAD führen. Die neuere Beweislage legt nahe, dass bspw. AIDS-Patienten ebenfalls hochgefährdete Kandidaten für eine Ansteckung mit CDAD sind [3, 4].
C. difficile produziert zwei Exotoxine, Toxin A (ein Enterotoxin) und Toxin B (ein Cytotoxin), die eine wichtige Rolle bei der Verursachung von CDAD zu spielen scheinen. Toxin A ist in erster Linie für die Erkrankung verantwortlich. Es wirkt durch Bindung an Epithelzellen im Darm, was zur Zerstörung dieser Zellen führt, und die Ausscheidung der Flüssigkeit in den Darm verursacht. Die Zerstörung dieser schützenden Epithelzellen durch Toxin A stellt den entscheidenden Schritt dar, der zur Entwicklung von Diarrhoe führt. Sobald die Epithelzellen beschädigt sind, erhält das starke Cytotoxin B Zugang zu den darunter liegenden empfindlichen Geweben, und kann zusätzliche Symptome initiieren.
Man hat gefunden, dass Toxin A eine lektinartige Aktivität aufweist, die eine Bindung an einen Oligosaccharid-Rezeptor auf Epithelzellen ermöglicht. Mehrere Oligosaccharid-Sequenzen wurden als potentielle Rezeptoren für Toxin A identifiziert und beinhalten die folgenden Strukturen [5–7]:
Zudem wurden hochgereinigte Toxin A-Präparate erhalten, wobei Rinder-Thyroglobulin-Affinitäts-Säulen mit endständigen αGal(1-3)βGal(1-4)βGlcNAc-Oligosaccharidsequenzen verwendet wurden [8, 9].
Bei der gängigen Therapie für Patienten, die an CDAD oder PMC leiden, wird das angreifende Medikament entfernt und eine orale Verabreichung der Antibiotika Metronidazol oder Vancomycin unter Flüssigkeitsersatz begonnen [3, 14]. Vancomycin wird nur in bestimmten Situationen verwendet, wenn Patienten die Metronidazol-Behandlung nicht vertragen können oder nicht darauf ansprechen. Vancomycin wird wegen seiner hohen Kosten außerdem nicht routinemäßig verwendet. Diese Form der Therapie ist bei etwa 80% der Patienten, die an CDAD oder PMC leiden, wirksam. Bei etwa 20% der Patienten kehrt die Diarrhoe nach der Unterbrechung der Antibiotika-Behandlung wieder [15]. Bei diesen Individuen rezidivieren die Episoden weiter, bis die normale Darmflora wiederhergestellt ist und die Anzahl der C.-difficile-Organismen reduziert ist. Dies ist ein langsamer Prozess, da Antibiotika, wie Metronidazol, die das Gleichgewicht der normalen Darmflora stören, immer bei Auftreten von Diarrhoe verabreicht werden.
Die einzige andere Behandlung für CDAD und PMC, die die Toxinaktivität aus dem Magendarmtrakt entfernt, beinhaltet die Verwendung von Anionenaustauschharzen, wie Cholestyramin und Colestipol, in Mengen von mehreren Gramm, die in Kombination mit Antibiotika oral gegeben werden. Dieser Ansatz wurde zur Behandlung mild bis schwach kran ker Patienten verwendet, sowie von Patienten, die an multiplen Diarrhoe-Episoden leiden [16, 17]. Diese Form der Therapie erzielte nur einen mäßigen Erfolg bei der Behandlung der Erkrankung [18]. Bei der Verwendung der Harze gibt es neben dem Fehlen der Effizienz der Ionenaustauschharze mehrere andere Nachteile. Ionenaustauschharze binden nicht spezifisch an Toxin A. Sie können somit an die Antibiotika selbst binden, was zu unteroptimalen Antibiotika-Mengen innerhalb des Magens führt. Erhalten Patienten zudem andere Medikationen, die an die Ionenaustauschharze binden, kann es zu reduzierten Medikamentenspiegeln kommen. Ein weiterer Nachteil der Ionenaustauschharze ist der unangenehme Geschmack und Nachgeschmack, die bei der oralen Verabreichung dieser Verbindungen vorkommen.
Zu den Verfahren zur Diagnose auf das Vorhandensein von Toxin A in einer Probe gehört ein Verfahren zur Erfassung von C. difficile in einer Probe, nämlich die Anzucht der Probe. Die Nachteile dieses Verfahrens umfassen die erforderliche Dauer und die Störung durch nicht-pathogene, d. h. nicht-toxinproduzierende C.-difficile-Stämme. Andere Verfahren beinhalten die Verwendung spezifischer Antiseren oder monoklonaler Antikörper. Die US-Patente 4 863 852 und 5 098 826 beschreiben Verfahren zur Erfassung von C. difficile-Toxin A durch die Verwendung von Reagenzien, die biologische Rezeptoren für Toxin A enthalten, einschließlich der αGal(1-3)βGal(1-4)βGlcNAc), X- und Y-Antigen-Oligosaccharid-Sequenzen, die an einen Träger gebunden sind.
Demzufolge besteht ein Bedarf an einer Verbindung, die die antibiotikabegleitende Diarrhoe behandelt. Eine bevorzugte Verbindung wird dann nicht invasiv, bspw. oral, verabreicht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt Zusammensetzungen und ihre Verwendung bei der Behandlung antibiotikabegleitender Diarrhoe bereit, welche durch Clostridium difficile verursacht wird.
Bei einem Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung bereit, welche eine Oligosaccharidsequenz aufweist, die über einen kompatiblen Nichtpeptidyl-Linkerarm an einen pharmazeutisch verträglichen festen inerten Träger kovalent gebunden ist, wobei die Oligosaccharidsequenz Toxin A bindet und die Zusammensetzung aus dem Magendarmtrakt ausgeschieden werden kann, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Toxin A-vermittelter Diarrhoe, und wobei die Oligosaccharidsequenz ausgewählt ist aus:
Bei einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Arzneimittel-Zusammensetzung bereit zur Verwendung bei der Behandlung von CDAD und verwandten Zuständen, welche durch To xin A ausgelöst werden, wobei die Zusammensetzung umfasst: eine Oligosaccharidsequenz, die über einen kompatiblen Nichtpeptidyl-Linkerarm an einen pharmazeutisch verträglichen festen inerten Träger kovalent gebunden ist, wobei die Oligosaccharidsequenz Toxin A bindet und sie ausgewählt ist aus:
einen pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei die Zusammensetzung aus dem Magendarmtrakt ausgeschieden werden kann.
Bei einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Oligosaccharidsequenz bereit, welche über einen kompatiblen Nichtpeptidyl-Linkerarm an einen pharmazeutisch verträglichen festen inerten Träger kovalent gebunden ist, zur Verwendung bei der Behandlung von CDAD und verwandten Zuständen, die durch Toxin A ausgelöst werden, wobei die Oligosaccharidsequenz Toxin A bindet und sie ausgewählt ist aus:
Bei einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Kit bereit, umfassend

a) einen Behälter, welcher einen pharmazeutisch verträglichen festen inerten Träger enthält, der aus dem Magendarmtrakt ausgeschieden werden kann und der eine Oligosaccharidsequenz aufweist, die über einen kompatiblen Nichtpeptidyl-Linkerarm kovalent daran gebunden ist, wobei die Oligosaccharidsequenz Toxin A bindet und sie ausgewählt ist aus:
b) eine Messvorrichtung zum Messen des Trägers; und
c) Gebrauchsanweisungen zum Messen des Trägers und zum Mischen desselben mit einem pharmazeutisch verträglichen Exzipienten zur Verabreichung an ein Individuum.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Es zeigt:
1 die Neutralisation einer gereinigten Toxin A-Hämagglutinierungs-Aktivität mit einer Reihe von SYNSORBs, die verschiedene Oligosaccharidsequenzen enthalten. Es stellte sich heraus, dass einige SYNSORBs die Toxin A-Aktivität effizient neutralisierten;
2 die konzentrationsabhängige Neutralisation der Toxin-A-Aktivität mit SYNSORB 52 und 90. Beide SYNSORBs können mehr als etwa 75% der Toxin-A-Aktivität bei einer Konzentration von 20 mg/ml effizient neutralisieren;
3 die Zeitabhängigkeit der Neutralisation der Toxin-A-Aktivität mit SYNSORB 52 und 90 bei einer Konzentration von 20 mg/ml;
4 die Bindungsaffinität mehrerer SYNSORBs für Toxin A. Es stellte sich heraus, dass verschiedene SYNSORBS unterschiedliche Bindungsaffinitäten für das Toxin aufwiesen.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
A. Definitionen
Die nachfolgenden Ausdrücke, wie sie hier verwendet werden, haben die folgenden Bedeutungen:
Der Begriff "antibiotika-begleitende bakterielle Diarrhoe" steht für den Zustand, bei dem eine Antibiotika-Therapie das Gleichgewicht der mikrobiellen Darmflora stört, so dass sich pathogene Organismen, wie Clostridium difficile, vermehren können. Diese Organismen verursachen eine Diarrhoe. Antibiotikabegleitende bakterielle Diarrhoe umfasst solche Zustände, wie eine mit Clostridium diffici le einhergehende Diarrhoe (CDAD) und Pseudomembran-Colitis (PMC).
Der Begriff "biologisch kompatibel" steht für eine chemische Reaktionsträgheit gegenüber menschlichen Geweben oder Körperflüssigkeiten.
Der Begriff "kompatibler Linkerarm" betrifft eine Einheit, die die Oligosaccharid-Struktur vom biologisch kompatiblen festen Träger auf Abstand hält, und die biologisch funktionell ist, wobei eine funktionelle Gruppe an eine reziproke funktionelle Gruppe des Trägers binden kann und die andere funktionelle Gruppe an eine reziproke funktionelle Gruppe der Oligosaccharid-Struktur binden kann. Erfindungsgemäß bevorzugte Linkerarme sind nicht-peptidische Spacer-Arme.
Der Begriff "Pseudomembran-Colitis" (PMC), ebenfalls bekannt als Pseudomembran-Enterocolitis oder Enteritis, betrifft die Entzündung der Schleimhaut des Dünn- und Dickdarms mit der Bildung und dem Hindurchtreten von Pseudomembran-Material (bestehend aus Fibrin, Schleim, nekrotischen Epithelzellen und Leukozyten) im Stuhl.
Der Begriff "fester Träger" betrifft ein inertes festes Material, an das die Oligosaccharid-Sequenzen über einen kompatiblen Linkerarm gebunden sein können. Bei In-vivo-Verwendung ist der feste Träger biologisch kompatibel.
Der Begriff "SYNSORB" betrifft synthetische 8-Methoxycarbonyloctyl-Oligosaccharid-Strukturen, die kovalent an Chromosorb P^TM (Manville Corp., Denver, Colorado) (12) gekoppelt sind, welches ein derivatisiertes Silica-Teilchen ist.
Der Begriff "Toxin A" steht für ein Enterotoxin von Clostridium difficile, das CDAD und verwandte Zustände auslöst. Dieses Toxin hat eine lektinartige Aktivität.
Für die Zwecke der Anmeldung werden sämtliche Zucker mit der Dreibuchstaben-Nomenklatur bezeichnet. Sämtliche Zucker liegen, wenn nicht anders angegeben in der D-Konfiguration vor, außer Fucose, welches in der L-Form vorliegt. Sämtliche Zucker liegen zudem in der Pyranoseform vor.
B. Synthese
Chemische Verfahren zur Synthese von Oligosaccharid-Strukturen lassen sich mittels Verfahren des Standes der Technik bewerkstelligen. Diese Materialien werden mittels geeignet geschützter einzelner Monosaccharide aufgebaut.
Die eingesetzten spezifischen Verfahren sind gewöhnlich an jede zu synthetisierende Einzelstruktur angepasst und optimiert. Die chemische Synthese aller oder eines Teils der Oligosaccharid-Glycoside umfasst zuerst die Bildung einer glykosidischen Bindung an einem anomeren Kohlenstoffatom des reduzierenden Zuckers oder Monosaccharids. Insbesondere wird eine geeignet geschützte Form einer natürlich vorkommenden oder einer chemisch modifizierten Saccharidstruktur (der Glycosyl-Donor) am Anomeriezentrum der reduzierenden Einheit selektiv modifiziert, damit eine Abgangsgruppe eingeführt wird, die Halogenide, Trichloracetimidat, Acetyl, Thioglycosid, usw. umfasst. Der Donor wird dann unter katalytischen Bedingungen des Standes der Technik mit einem Aglycon oder einer geeigneten Form eines Kohlenhydrat-Akzeptors mit einer freien Hydroxylgruppe an der Stelle, an der die glycosidische Bindung erstellt werden soll, umgesetzt. Im Stand der Technik gibt es eine große Anzahl Aglycon-Einheiten, die sich mit der richtigen Konfiguration an das Anomeriezentrum der reduzierenden Einheit binden lassen.
Die im Stand der Technik der Kohlenhydratsynthese bekannte geeignete Verwendung kompatibler Blockierungsgruppen ermöglicht die selektive Modifikation der synthetisierten Strukturen oder die weitere Bindung zusätzlicher Zuckereinheiten oder Zuckerblöcke an die Akzeptorstrukturen.
Nach der Bildung der glycosidischen Bindung lässt sich das Saccharid-Glycosid verwenden, damit man eine oder mehrere zusätzliche Saccharid-Einheit(en) ankoppelt oder an ausgewählten Stellen chemisch modifiziert oder nach herkömmlicher Entfernung von Schutzgruppen bei einer Enzymsynthese verwendet. Die chemische Kopplung einer natürlich vorkommenden oder chemisch modifizierten Saccharid-Einheit an das Saccharid-Glycosid erfolgt durch Einsatz einer in der Literatur gut beschriebenen gängigen Chemie [21–37].
Die festen Träger, an die die erfindungsgemäßen Oligosaccharid-Strukturen gebunden sind, können die Form von Platten oder Teilchen haben. Im Stand der Technik gibt es eine große Anzahl biologisch kompatibler fester Trägermaterialien. Beispiele hierfür umfassen Silica, synthetische Silikate, wie poröses Glas, biogene Silikate, wie Diatomeenerde, silikathaltige Mineralien, wie Kaolinit, und synthetische Polymere, wie Polystyrol, Polypropylen und Polysaccharide. Die festen Träger haben vorzugsweise eine Teilchengröße von etwa 10 bis 500 Mikron für die Verwendung in vivo. Insbesondere sind Teilchengrößen von 100 bis 200 Mikron bevorzugt.
Die Oligosaccharid-Struktur(en) ist bzw. sind an den festen Träger kovalent gebunden oder nicht-kovalent (passiv) adsorbiert. Die kovalente Bindung kann über eine Reaktion zwischen funktionellen Gruppen auf dem Träger und dem kompatiblen Linkerarm der Oligosaccharid-Struktur erfolgen. Man hat unerwarteterweise entdeckt, dass die Bindung der Oligosaccharid-Struktur an den biologisch kompatiblen festen Träger über einen kompatiblen Linkerarm ein Produkt bereitstellt, das ungeachtet des festen Trägers, Toxin effizient beseitigt. Verbindungseinheiten, die bei der indirekten Bindung verwendet werden, sind vorzugsweise organische biologisch funktionelle Moleküle geeigneter Länge (mit mindestens einem Kohlenstoffatom), die einfach die Oligosaccharid-Struktur von der Oberfläche des festen Trägers auf Abstand halten.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden vorzugsweise dargestellt durch die Formel: (OLIGOSACCHARID-Y-R)_n-FESTER TRÄGER, wobei OLIGOSACCHARID eine Oligosaccharid-Gruppe mit mindestens 2 Zuckereinheiten darstellt, die an Toxin A bindet, Y ein Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatom ist, R ein Aglycon-Linkerarm mit mindestens 1 Kohlenstoffatom ist, FESTER TRÄGER die vorstehend definierte Bedeutung hat und n eine ganze Zahl größer oder gleich 1 ist. Oligosaccharid-Sequenzen mit etwa 2 bis 10 Saccharid-Einheiten können verwendet werden. Sequenzen mit etwa 3 bis 5 Saccharid-Einheiten sind bevorzugt.
Im Stand der Technik gibt es viele Aglycon-Linkerarme. Es gibt bspw. einen Linkerarm mit einer para-Nitrophenylgruppe (d. h. -OC₆H₄pNO₂) [38]. Während der Synthese wird zum geeigneten Zeitpunkt die Nitrogruppe zur Aminogruppe reduziert, die als N-Trifluoracetamidogruppe geschützt werden kann. Vor dem Koppeln an einen Träger wird die Trifluoracetamidogruppe entfernt, wodurch die Aminogruppe zugänglich wird.
Es gibt einen schwefelhaltigen Linkerarm [39]. Der Linkerarm stammt insbesondere von einer 2-Bromethylgruppe, die in einer Substitutionsreaktion mit Thionukleophilen Linkerarme ergibt, die eine Anzahl terminaler funktioneller Gruppe besitzen, wie -OCH₂CH₂SCH₂CO₂CH₃ und -OCH₂CH₂SC₆H₄-pNH₂. Diese endständigen funktionellen Gruppen ermöglichen die Reaktion mit komplementären funktionellen Gruppen am festen Träger, wodurch eine kovalente Bindung an den festen Träger erzeugt wird. Diese Reaktionen sind im Stand der Technik bekannt.
Ein 6-Trifluoracetamido-hexyl-Linkerarm (-O-(CH₂)₆-NHCOCF₃) ist offenbart worden [40], wobei die Trifluoracetamido-Schutzgruppe entfernt werden kann, wodurch die zum Koppeln verwendete primäre Aminogruppe freigelegt wird.
Andere Beispiele bekannter Linkerarme umfassen den 7-Methoxycarbonyl-3,6-dioxaheptyl-Linkerarm [41] (-OCH₂CH₂)₂OCH₂CO₂CH₃); 2-(4-Methoxycarbonylbutancarboxamido)ethyl [42] (-OCH₂CH₂NHC(O)(CH₂)₄CO₂CH₃); den Allyl-Linkerarm [43] (-OCH₂CH=CH₂), der durch Radikal-Copolymerisation mit einem geeigneten Monomer zu Copolymeren führt; andere Al lyl-Linkerarme [44] sind bekannt [O(CH₂CH₂O)₂CH₂CH=CH₂]. Allyl-Linkerarme können zudem in Gegenwart von 2-Aminoethanthiol [45] derivatisiert werden, damit ein Linkerarm -OCH₂CH₂CH₂SCH₂CH₂NH₂ erhalten wird. Es gibt ebenfalls weitere geeignete Linkerarme [21–23, 25, 26].
Der jeweils zur kovalenten Bindung der Oligosaccharid-Gruppe an den festen Träger eingesetzte Linkerarm ist nicht entscheidend.
Der Aglycon-Linkerarm ist vorzugsweise eine hydrophobe Gruppe und am stärksten bevorzugt eine hydrophobe Gruppe, ausgewählt aus
-(CH₂)₅OCH₂CH₂CH₂- und -(CH₂)₈CH₂O-.
Erfindungsgemäß wurde entdeckt, dass sich synthetische Oligosaccharid-Sequenzen, die kovalent an einen biologisch kompatiblen festen Träger gebunden sind, bspw. Chromosorb P^TM (SYNSORB), zur Bindung von Toxin A verwenden lassen. Diese Zusammensetzungen eignen sich zur Behandlung von CDAD und PMC. SYNSORB ist besonders bevorzugt für diese Zusammensetzungen, da es nicht toxisch ist und gegenüber mechanischer und chemischer Ablagerung beständig ist. In Untersuchungen mit Ratten (einem allgemein akzeptierten Modell für vorklinische Studien, da sie die menschliche Reaktion anzeigen können) gelangen SYNSORBs unbeeinträchtigt durch den Magendarmtrakt der Ratte. Sie werden vollständig und rasch nach oraler Gabe ausgeschieden (99% ausgeschieden in 72 Std.).
Die hohe Dichte der Oligosaccharid-Einheiten an SYNSORB eignet sich besonders zur Bindung von Toxin A, da das Toxin vermutlich mehrere Oligosaccharid-Bindungsstellen besitzt [11].
Nicht-peptidische Linkerarme eignen sich vorzugsweise als erfindungsgemäße kompatible Linkerarme. Die Verwendung von Glycopeptiden ist nicht wünschenswert, da diese einige, oft verschiedene Oligosaccharide enthalten, die an das gleiche Protein gebunden sind. Glycopeptide sind in großen Mengen schwierig erhältlich und verlangen eine teure und aufwändige Reinigung. Die Verwendung von BSA- oder HSA-Konjugaten ist nicht gewünscht, bspw. aufgrund der fraglichen Stabilität im Magendarmtrakt bei oraler Gabe.
Die kovalente Bindung einer Oligosaccharidgruppe mit einer Toxin-A-Bindungseinheit über einen nicht-peptidischen Spacerarm an einen inerten festen Träger ermöglicht eine effiziente Bindung und Entfernung von Toxin A aus einer auf das Vorhandensein von Toxin A zu analysierenden Probe oder aus dem Darm eines Patienten, der an CDAD leidet. Wird das Oligosaccharid mit diesem gebundenen kompatiblen Linkerarm (in einer nicht-derivatisierten Form) synthetisiert, lassen sich hochreine Zusammensetzungen erhalten, die dann an verschiedene feste Träger gekoppelt werden können.
C. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die erfindungsgemäßen Verfahren werden erzielt, indem pharmazeutische Zusammensetzungen verwendet werden, die eine oder mehrere Oligosaccharidstrukturen umfassen, welche an einen festen Träger gebundenes Toxin A binden.
Bei der Verwendung zur bevorzugten oralen Verabreichung lassen sich diese Zusammensetzungen auf verschiedene Weisen formulieren. Sie sind vorzugsweise in einer flüssigen oder halbflüssigen Form. Zusammensetzungen, welche einen flüssigen pharmazeutisch inerten Träger umfassen, wie Wasser, sind zur oralen Verabreichung vorgesehen. Andere pharmazeutisch kompatible Flüssigkeiten oder fließfähige Festkörper können ebenfalls verwendet werden. Die Verwendung dieser Flüssigkeiten und fließfähigen Feststoffe ist dem Fachmann geläufig.
Zusammensetzungen, die sich mit halbfesten Nahrungsmitteln, wie Apfelsauce, Eiscreme oder Pudding, mischen lassen, sind ebenfalls geeignet. Formulierungen, wie SYNSORBs, die keinen schlechten Geschmack oder Nachgeschmack aufweisen, sind bevorzugt. Zur Verabreichung der Zusammensetzung direkt in den Magen lässt sich auch ein Nasogastrahl-Rohr verwenden.
Feste Zusammensetzungen können ebenfalls verwendet werden. Sie lassen sich gegebenenfalls und bei Bedarf in Formulierungen verwenden, die einen pharmazeutisch inerten Träger enthalten, einschließlich herkömmlicher fester Träger, wie Lactose, Stärke, Dextrin oder Magnesiumstearat, die geeigneterweise in Tabletten- oder Kapselform dargereicht werden. SYNSORB selbst lässt sich ohne Zugabe inerter pharmazeutischer Träger insbesondere zur Verwendung in Kapselform verwenden.
Die Dosen werden so ausgewählt, dass das Toxin A aus dem Darm des betroffenen Patienten neutralisiert und eliminiert wird. Geeignete Dosen reichen von etwa 0,25 bis 1,25 μMol Oligosaccharid/kg Körpergewicht/Tag, vorzugsweise etwa 0,5 bis 1,0 μMol Oligosaccharid/kg Körpergewicht/Tag. Bei der Verwendung von SYNSORB-Zusammensetzungen bedeutet dies etwa 0,5 bis 1,0 g SYNSORB/kg Körpergewicht/Tag, was eine SYNSORB-Konzentration im Darm von etwa 20 mg/ml ergibt. Die Verabreichung erfolgt 3- oder 4-mal täglich für einen Zeitraum von 1 Woche oder solange, bis die klinischen Symptome verschwunden sind. Die Höhe der Dosis und der Verabreichungsplan variieren je nach der verwendeten Oligosaccharid-Struktur und solchen Faktoren, wie Alter und Zustand der betroffenen Person. Die optimale Dauer für eine vollständige Entfernung der Toxin A-Aktivität beträgt etwa 1 Std. bei 37°C, wobei eine SYNSORB-Konzentration von 20 mg in 1 ml Probe verwendet wird.
Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Oligosaccharid-haltigen Zusammensetzungen während eines Zeitraums von bis zu sieben Tagen eignet sich zur Behandlung von CDAD und PMC.
Wie bereits vorher erörtert ist die orale Verabreichung bevorzugt, jedoch sind die Formulierungen ebenfalls für andere Verabreichungswege vorgesehen, bspw. zur rektalen Verabreichung. Der Nutzen dieser Formulierungen kann von der jeweils verwendeten Zusammensetzung und der jeweiligen behandelten Person abhängen. Diese Formulierungen können einen flüssigen Träger enthalten, der ölig, wäss rig, emulgiert sein kann oder bestimmte Lösungsmittel enthalten kann, die sich für den Verabreichungsweg eignen.
Die Zusammensetzungen lassen sich in Einheitsdosierungsform oder in Mehrfach- oder Unter-Einheitsdosen formulieren. Für die vorher beschriebenen erwarteten Dosen sollten oral verabreichte flüssige Zusammensetzungen vorzugsweise etwa 1 μMol Oligosaccharid/ml enthalten.
D. Verfahren
Das C. difficile-Toxin A lässt sich durch bestimmte Oligosaccharid-Sequenzen, die das Toxin binden, neutralisieren. Es hat sich herausgestellt, dass insbesondere synthetische Oligosaccharide, die über kompatible nicht-peptidische Linkerarme an feste Träger kovalent gebunden sind, Toxin A effizient neutralisieren. Beispiele für diese Zusammensetzungen sind bestimmte SYNSORBs, die an Toxin A binden und dessen Aktivität neutralisieren.
Es wurde untersucht, wie gut verschiedene, über einen 8-Methoxylcarbonyloctyl-(MCO)-Spacerarm an Chromosorb P gebundene Oligosaccharid-Sequenzen Toxin A neutralisieren können. Die untersuchten Strukturen, auch SYNSORBs genannt, sind in Tabelle 1 gezeigt. Wie in den 1 und 4 gezeigt, variierten die untersuchten SYNSORBs hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Neutralisation um mindestens etwa 50% der Toxin A-Aktivität.
Die an die erfindungsgemäß geeigneten festen Träger gebundenen Oligosaccharid-Sequenzen umfassen diejenigen, die Toxin A binden. Die Bindungsaffinität eines Oligosaccharids an Toxin A ist leicht durch einen einfachen In-vitro-Test bestimmbar, wie bspw. in Beispiel 4 unten beschrieben. Für erfindungsgemäße Zwecke sind an feste Träger gebundene Oligosaccharid-Sequenzen, die Toxin A binden, solche Zusammensetzungen, die die Endtiter von Hämagglutinationstests um mindestens 50% reduzieren.
Bestimmte der vorstehend beschriebenen SYNSORBs wurden dann zur Untersuchung dieser Oligosaccharid-Zusammensetzungen auf die Fähigkeit zur Neutralisation von Toxin A in menschlichen Stuhlproben verwendet.
Die Bindung Shiga-artiger Toxine (SLTs) an chemisch synthetisierte Oligosaccharidsequenzen wurde untersucht [10].
SLTs sind eine Gruppe von Cytotoxinen, die aus zwei Teilen bestehen: einer A-Untereinheit und einem B-Oligomer. Das B-Oligomer ist der bindende Anteil des Toxins, der die Bindung an Wirtszellrezeptoren ermöglicht. Die SLT-Toxine binden an Glycolipid-Rezeptoren, die die αGal(1-4)β-Gal-Determinante enthalten. Die A-Untereinheit hat eine enzymatische Aktivität (N-Glycosidase), die die ribosomale 28S-RNA in Säugetierzellen depuriniert. Aufgrund dieser enzymatischen Aktivität kann die toxininfizierte Zelle keine Proteinsynthese mehr durchführen.
Die Stellen für die SLT-Wirkung sind Endothelzellen in den Nieren und in mesenterialen Gefäßen. Die SLTs könen einen Schaden verursachen, der zu Nierenversagen und zu Hämoglobin im Urin führen kann. Die SLTs verursachen das Hämolyse-Urämie-Syndrom und sind auch zum Teil an der Pathogenese der hämorrhagischen Colitis (Blut-Diarrhoe) beteiligt.
Toxin A ist dagegen ein Enterotoxin, das Flüssigkeits-Sekretion, Beschädigung der Schleimhaut und Darmentzündung hervorruft. Es dient als chemischer Lockstoff für menschliche Neutrophile. Toxin A ist ein einzelnes Protein. Es aktiviert die Cytokine in Monocyten und bewirkt deren Freisetzung. Diese Entzündungseffekte spielen eine wichtige Rolle bei der Induktion der Blinddarmentzündung, die bei der Pseudomembran-Colitis auftritt.
Toxin A scheint an einen Glycoprotein-Rezeptor zu binden, dessen Struktur noch bestimmt werden muss. Der Wirkungsmechanismus ist noch nicht ganz verstanden. Toxin A tritt jedoch in die Zellen wahrscheinlich über eine Rezeptor-vermittelte Endocytose ein und beeinflusst das Aktin-Cytoskelett der Zelle. Der Toxin-A-Rezeptor bindet wahrscheinlich an ein guaninregulatorisches Protein. Toxin A ist der erste Schritt bei der Erzeugung von CDAD und PMC.
Vorhergehende Untersuchungen, die die Oligosaccharid-Bindungsspezifität von Toxin A definieren, haben mehrere Struktur-Voraussetzungen für die Toxinbindung identifiziert [5–7]. Oligosaccharide, die mit den an den Typ-2-Kern (βGal(1-4)βGlcNAc) gebundenen αGal(1-3)βGal-Sequenzen enden, sind für die Bindung wichtig. Toxin A erkennt auch Oligosaccharide mit Fucose, welches an das 2-Hydroxyl von Galactose oder 3-Hydroxyl von N-Acetylglucosamin des Typ-2-Kerns gebunden ist. Die für die Toxin-Neutralisation ausgewählten SYNSORBs beinhalten Kohlenhydrate, die diese Struktureigenschaften sowie andere Oligosaccharide beinhalten, welche Typ-6-(βGal(1-4)βGlc) und Typ-1-(βGal(1-3)βGlcNac)-Kernstrukturen umfassen. Zusätzliche SYNSORBs, die für Bindungsuntersuchungen ausgewählt wurden, enthalten Oligosaccharid-Sequenzen, von denen vorher gezeigt wurde, dass sie an Toxin A binden.
Das Ausmaß der Toxin-Neutralisation an SYNSORB wurde bestimmt, indem die Überstände auf die Reduktion der Endtiter in Hämagglutinationstests im Vergleich mit Kontrollen ohne jegliches zugefügtes SYNSORB unersucht wurden. Die Ergebnisse sind in der 1 gezeigt. Solche SYNSORBs, die X-, Y- und αGal(1-3)βGal(1-4)βGlcNAc-Oligosaccharidsequenzen besitzen (SYNSORBs 51, 52 und 115), entfernten die Toxin A-Aktivität effizient um 75, 88 bzw. 88%. Zwei andere SYNSORBs, die Oligosaccharidsequenzen enthielten, die vorher nicht an Toxin A banden (SYNSORBs 9 und 90), waren bei der Neutralisation der Toxin A-Aktivität ebenso effizient. Die SYNSORBs 2, 5, 104, 105 und 134 neutralisierten etwa 50% der Toxin A-Aktivität. Das Kontroll-SYNSORB (ASA), das nur den MCO-Spacerarm enthielt, neutralisierte die Toxin-A-Aktivität nur leicht.
Die Fähigkeit zur Neutralisation von LT ist den Ergebnissen zufolge direkt mit den Oligosaccharid-Sequenzen korreliert, die an den inerten Träger gebunden sind. Die Ergebnisse in der 1 zeigen die Bedeutung der αGal(1-3)βGal-Bindung für Hochaffinitäts-Toxin-Bindung. Befunden zufolge weisen Oligosaccharidsequenzen, die eine β(1-4)-Bindung zwischen Galaktose und entweder N-Acetylglucosamin (Typ-2-Kern) oder Glucose (Typ 6) besitzen, Hochaffinitäts-Toxinbindung auf. Es stellte sich zudem heraus, dass Toxin A Oligosaccharidsequenzen bindet, bei denen Fucose an das 2-Hydroxyl nur von Galactose gebunden ist.
Die in den 1 und 4 dargestellten Ergebnisse zeigen eine Reduktion der Endtiter aus Hämagglutinationstests. Ähnliche Ergebnisse wurden in Gewebekulturtests mit Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO) erhalten. Diese Untersuchungen zeigten, dass die CHO-Zellen verglichen mit den Kontrollen eine Reduktion der Endverdünnung aufwiesen, wenn SYNSORB zu gereinigten Toxin A-Präparaten gegeben wurde.
Mehrere verschiedene Oligosaccharidsequenzen, die über kompatible Linkerarme an feste Träger gebunden sind, können die Toxin A-Aktivität neutralisieren. Diese und andere Sequenzen, die ebenfalls Toxin A binden, lassen sich zur Behandlung von CDAD und PMC einsetzen. Die optimale Dauer für eine vollständige Entfernung der Toxin A-Aktivität betrug etwa 1 Std. bei 37°C, wobei eine SYNSORB-Konzentration von 20 mg in 1 ml Probe verwendet wurde. Da jedes Gramm SYNSORB etwa 0,25 bis 1,0 μMol Oligosaccharid enthält, reicht die als tägliche Dosis zu verabreichende Gesamtmenge Oligosaccharid von 7,5 bis 30 μMol, wobei ein Darmvolumen von 4 Litern angenommen wird.
Die Verwendbarkeit von Oligosaccharidsequenzen, die zur Behandlung von CDAD und PMC über einen kompatiblen Linkerarm an einen festen Träger gebunden sind, wurde ebenfalls durch die Fähigkeit der SYNSORB-Zusammensetzungen zur Neutralisation von Toxin A in menschlichen Stuhlproben veranschaulicht. Diese Tests an menschlichen Proben sagen die In-vivo-Ergebnisse vorher, da es im Wesentlichen keine Änderungen der Zusammensetzung oder chemischen Änderungen zwischen den In-vitro-Bedingungen dieses Tests und den In-vivo-Bedingungen gibt. Die Testbedingungen entsprachen fast den tatsächlichen Bedingungen, die im menschlichen Darm vorherrschen. Der Fachmann bestätigt, dass dieser Test geeignet mit der Gebräuchlichkeit beim Mensch korreliert.
Die in der Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass SYNSORB 52 die Toxin A-Aktivität in menschlichen Stuhlproben effizient neutralisiert. Gewöhnlich wurden größere Mengen Toxin in wässrigem Stuhl effizient neutralisiert. Das Toxin in festen Stuhlproben, die nur niedrige Mengen Toxin enthielten, wurde weniger effizient neutralisiert.
Die Behandlung von CDAD oder PMC kann erfolgen durch orale Verabreichung von Zusammensetzungen, die Oligosaccharidsequenzen enthalten, welche über einen kompatiblen Linkerarm (bspw. SYNSORBs) kovalent an einen festen Träger gebunden sind. SYNSORB gelangt bspw. unbeschädigt durch den Magen von Ratten. Es kommt dann im Darmtrakt mit Toxin A zusammen. Eine anschließende Eliminierung des intakten SYNSORB mit daran gebundenem Toxin A eliminiert Toxin A aus dem Patienten.
Oligosaccharidsequenzen, die über kompatible Linkerarme an einen festen Träger, bspw. SYNSORBs, kovalent gebunden sind, eignen sich zur Behandlung von Individuen, die an multiplen Diarrhoe-Episoden leiden. Beim anfänglichen Wiederauftreten von Diarrhoe werden die Patienten mit SYNSORB behandelt, so dass das Toxin A aus dem Darm entfernt wird. Die Entfernung von Toxin A verhindert die anfängliche Beschädigung der Darmwand, was zur Verhinderung oder Reduktion von Diarrhoe führt. Es braucht keine weitere Behandlung mit Antibiotika mehr zu erfolgen, so dass sich die normale Darm-Mikroflora im Magen wieder aufbauen kann. Der Vorteil einer solchen Behandlung ist, dass sie die Wiederbesiedelung des Darmtrakts durch die normale Mikroflora nicht beeinträchtigt. Die Behandlung bis zur Beendigung der Diarrhoe ermöglicht eine vollständige Genesung.
Neben ihrem Nutzen bei Patienten, die an rezidivierender Diarrhoe leiden, kann die Behandlung mit Oligosaccharidsequenzen, die kovalent über kompatible Linker-Arme an feste Träger, gebunden sind, bspw. SYNSORBs, zur Behandlung sämtlicher Individuen verwendet werden, die an CDAD oder PMC leiden oder für deren Entwicklung anfällig sind. Die Verwendung von SYNSORB in Kombination mit einer Antibiotikatherapie ermöglicht eine effizientere Reduktion der Diarrhoe, was zu einer rascheren Genesung führt.
Ein Hauptaspekt der Erfindung ist die rasche effiziente Bindung der physiologischen Konzentration von in biologischen Proben vorhandenem Toxin A, wodurch eine Untersuchung auf die Anwesenheit und/oder Menge von Toxin A in diesen Proben ermöglicht wird. Die biologische Probe ist gewöhnlich eine Stuhlprobe. Die Probe kann mittels Standard-Extraktions-Methoden extrahiert und präpariert werden. Die Probe oder der Extrakt wird dann mit den toxinbindenden Oligosaccharidsequenzen zusammengebracht, die über einen kompatiblen Linkerarm kovalent an feste Träger gebunden sind, und zwar unter Bedingungen, bei denen jegliches Toxin A in der Probe absorbiert wird.
Toxin A kann direkt auf der Oberfläche des Oligosaccharid-haltigen Trägers mit einem geeigneten Nachweissystem gemessen werden. Es können bspw. radioaktive, biotinylierte oder fluoreszenzmarkierte, monoklonale oder polyklonale Antikörper, die spezifisch für Toxin A sind, zur Bestimmung der an den Träger gebundenen Menge an Toxin A verwendet werden. Im Stand der Technik gibt es viele Protokolle zur Erfassung der Bildung spezifischer Bindungskomplexe, die zu Standard-Immuntest-Methoden analog sind.
E. Beispiele
Die folgenden Verfahren wurden zur Durchführung der nachstehenden Beispiele verwendet.
1. Toxin-A-Reinigung
Toxin A wurde aus einem toxinproduzierenden C. difficile-Stamm (ATCC 43255, VPI-Stamm 10463) mittels leichter Modifikationen des Verfahrens von Sullivan et al. [13] isoliert.
C. difficile wurde 72 Std. bei 37°C in 2,3 Liter Gehirn-Herz-Infusionsbrühe (BHIB) in anaeroben Gefäßen gezüchtet. Die Rohkultur wurde 20 min bei 5000 × g zentrifugiert, um die Bakterien zu sedimentieren. Der resultieren de Kulturüberstand wurde sorgfältig entfernt, und festes Ammoniumsulfat (897 g) wurde dazu gefügt, so dass eine 60%ige Sättigung erhalten wurde. Der Kulturüberstand wurde über Nacht bei 4°C gerührt und dann 30 min bei 10000 × g zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde in einer minimalen Menge Puffer A (50 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,5) gelöst, gegen 2–4-Liter-Wechsel Puffer A dialysiert und durch Ultrazentrifugation mit einer YM 100 (Ausschlussgrenze Molekulargewicht 100000) konzentriert.
Die konzentrierte toxinhaltige Lösung wurde auf eine mit Puffer A äquilibrierte DEAE-A25-Säule (2,5 × 20 cm) aufgetragen. Nach dem Waschen des Ionenaustauschharzes mit Puffer A zur Entfernung von nicht-haftendem Protein wurde die Säule mit einem abgestuften Salzgradient entwickelt, indem sie mit Puffer A gewaschen wurde, der steigende Mengen NaCl im Bereich von 0,1 bis 0,4 M enthielt. Die Toxin-A-Aktivität wurde mit Puffer A, der 0,25 M NaCl enthielt, von der Säule eluiert, wohingegen die Toxin B-Aktivität mit 0,4 M NaCl-Puffer A entfernt wurde.
Die Gesamtreinheit und Menge an Toxin aus jeder Fraktion wurden bestimmt durch Messen der Protein-Konzentration, sowie durch Verwendung eines cytotoxischen Endpunktes mittels Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO). Die Menge an Toxin-A-Aktivität wurde ebenfalls durch Messen der Hämagglutinierungsaktivität mittels Kaninchen-Erythrocyten bestimmt. Der Toxin-B-Fraktion fehlte die Toxin A-Aktivität, wie bestimmt durch die Unfähigkeit der Toxin-B-haltigen Fraktion zur Hämagglutinierung der Kaninchen-Ertythrocyten.
2. Hämagglutinationstests mittels Kaninchen-Erythrocyten
Frische Kaninchen-Erythrocyten wurden einmal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und bei einer Konzentration von 4% (Vol./Vol.) in kaltem PBS gewaschen. Serielle 2fach-Verdünnungen (50 μl) Toxin-A-haltiger Lösungen wurden in kaltem PBS in U-förmigen Mikrotitervertiefungen hergestellt. Ein gleiches Volumen (50 μl) Kaninchen-Erythrocyten wurde dann in jede Vertie fung gegeben, und die Mikrotiterplatte wurde leicht gemischt. Nach der Inkubation der Platte für 4 Std. bei 4°C wurde der Hämagglutinationstest optisch bestimmt.
3. Test der Toxin-A-Aktivität mit Ovarzellen des chinesischen Hamsters
Die cytotoxische Aktivität von Toxin A wurde durch Verwendung von Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO) gemessen, die in Hams F12-Medium, das mit 10% fötalem Rinderseumalbumin supplementiert war, in einer Atmosphäre von 5% CO₂ bei 37°C gehalten wurden.
Die zu untersuchenden Toxin A-Proben wurden in Hams-Medium 1 : 10 verdünnt und durch 0,22 Mikron Spritzenfilter steril filtriert. Die zu untersuchenden Proben wurden seriell 5fach in Medium verdünnt, und 100 μl jeder Verdünnung wurde zu Vertiefungen mit konfluenten CHO-Zell-Monolayern gegeben, dann 24 Std. bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ inkubiert. Jede Probe wurde doppelt analysiert.
Die cytotoxischen Wirkungen waren nach 24 Std. Inkubation durch Vergleich von Vertiefungen mit Kontrollen, die kein Toxin A enthielten, leicht sichtbar. Nach 24 Std. wurden die Zellen mit 95% Methanol fixiert und mit Giemsa-Farbe gefärbt. Die prozentuale Neutralisation in diesen Neutralisationsuntersuchungen wurde durch Vergleich der Endverdünnungen der Proben mit und ohne SYNSORB bestimmt.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung dieser Erfindung und sollen keinesfalls den Rahmen der Erfindung einschränken.
Beispiel 1
Untersuchung Oligosaccharid-haltiger fester Träger auf die Fähigkeit zur Neutralisation der Toxin-A-Aktivität
Eine Lösung, die gereinigtes Toxin A enthielt, und wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde (0,5 ml), wurde zu verschiedenen SYNSORBs gegeben, die verschiedene Oligosaccharidsequenzen enthielten, welche über einen MCO-kompatiblen Linkerarm kovalent an einen festen Träger ge bunden waren. Die verwendete Menge SYNSORB reichte von 10,1 bis 17,5 mg. Die Proben wurden in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen hergestellt, welche 2 Std. in einem Überkopfschüttler inkubiert wurden.
Nach der Inkubation ließ man das SYNSORB am Boden der Röhrchen absetzen, und die Überstände wurden sorgfältig entfernt. Serielle zweifache Verdünnungen der Überstände wurden hergestellt, und der Hämagglutinationsendpunkt wurde wie vorstehend beschrieben bestimmt.
Das Ausmaß der Reduktion am Endpunkt in Anwesenheit von SYNSORB wurde durch Vergleich des Endpunkts mit dem von Kontrollen bestimmt, bei denen kein SYNSORB zugegeben wurde. Eine weitere Kontrolle verwendete SYNSORB (ASA), das nur den MCO-(hydrophob, 8 Kohlenstoffatome) Spacerarm enthielt.
Die Ergebnisse in der 1 zeigen, dass mehrere Oligosaccharid-Strukturen die Toxin A-Aktivität effektiv neutralisieren.
Beispiel 2
Bestimmung der optimalen Bindungsbedingungen mit den SYNSORBs 52 und 90
Die Menge der SYNSORBs 52 und 90, die für eine maximale Toxin A-Neutralisation erforderlich war, wurde durch Zugabe von 1 ml einer gereinigten Toxin A-Lösung zu vorgewogenen Mengen jedes SYNSORBs in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen bestimmt. Die SYNSORB-52-Proben wurden mit 12,8-, 21,6- und 43,3 mg-Mengen SYNSORB 52 getestet; die Synsorb 90-Proben wurden mit 12,9, 19,2 und 42,3 mg Mengen SYNSORB 90 getestet. Die Proben wurden 2 Std. bei 37°C auf einem Überkopfschüttler inkubiert. Die Kontrollproben, die nur Toxin-A-Lösung enthielten, wurden ebenfalls untersucht.
Das Ausmaß der Neutralisation in jeder Probe wurde bestimmt durch Vergleich der Endtiter der Hämagglutinationstests aus Proben mit und ohne SYNSORB. Die Ergebnisse in 2 zeigen, dass etwa 20 mg jedes untersuchten SYNSORB mindestens 75% Toxin A in 1 ml Toxin A-Lösung neutralisieren konnte.
Die Dauer der Inkubation, die zur optimalen Neutralisation erforderlich war, wurde bestimmt durch Inkubieren von Mikrozentrifugenröhrchen, die 1 ml gereinigte Toxin A-Lösung und 20 mg SYNSORB 52 oder SYNSORB 90 enthielt. Die Proben wurden 10, 20, 40, 80 oder 160 min bei 37°C in einem Überkopfschüttler inkubiert.
Das Ausmaß der Neutralisation in jedem Inkubationszeitraum wurde wie vorstehend beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse in 3 zeigen, dass etwa 1 Std. Inkubation (zwischen 40 und 80 min) zu einer effizienten Neutralisation von Toxin A führte.
Beispiel 3
Neutralisation der Toxin A-Aktivität in Toxin-positiven menschlichen Stuhlproben
Toxin A-positive menschliche Stuhlproben wurden vom Mikrobiologie-Labor des Hospitals der University of Alberta erhalten. 1 ml jeder Stuhlprobe wurde in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen untergebracht, 20 mg SYNSORB 52 (mit 50 μl PBS vorbefeuchtet) wurde zugegeben, und die Röhrchen wurden 4 Std bei 37°C in einem Überkopfschüttler inkubiert. Kontroll-Stuhlproben ohne SYNSORB wurden ebenfalls gleichzeitig getestet. Nach der Inkubation wurden die Stuhlproben 10 min bei 14000 U/min in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge zentrifugiert. Die erhaltenen Überstände wurden sorgfältig entfernt und in saubere Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Die Menge an Toxin A in jeder Probe wurde durch Verwendung des PREMIER^TM C. difficile-Toxin-A-Nachweis-Kits (Meridian Diagnostics, Cincinnati, OH) bestimmt. Die prozentuale Neutralisation wurde durch Messen der Reduktion der Extinktion bei 450 nm relativ zu individuellen Kontrollproben ohne zugefügtes SYNSORB bestimmt.
Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, dass Synsorb 52 die Toxin A-Aktivität in menschlichen biologischen Proben neutralisieren konnte.
Beispiel 4
Bestimmung der Bindungsaffinität
Zur Bestimmung der Bindungsaffinität verschiedener SYNSORBs an Toxin A, wurde jedes SYNSORB mit Toxin A wie in Beispiel 1 beschrieben kombiniert. Die Endtiter aus den Hämagglutinationstests mit Kaninchen-Erythrocyten wurden wie zuvor beschrieben bestimmt. SYNSORBS, die die Toxin-A-Aktivität effizienter neutralisierten, besaßen Oligosaccharidstrukturen, die mit höheren Affinitäten an Toxin A banden. Solche SYNSORBs, die die Titer um mehr als 50% reduzierten, wurden als Toxin A-bindend angesehen.
Die Ergebnisse in der 4 zeigen, dass einige SYNSORBS (SYNSORB 52 und 68) Toxin A durch diese Eigenschaften binden, wohingegen andere (SYNSORBS 34 und 89) Toxin A nicht zu binden scheinen.
Die Modifikation der vorstehend beschriebenen Durchführungsweisen verschiedener Ausführungsformen werden dem Fachmann nach den Lehren dieser Erfindung, wie sie hier offenbart sind, ersichtlich. Die beschriebenen Beispiele sind nicht einschränkend, sondern bloß als Beispiele für diese Erfindung aufzufassen, deren Rahmen durch die nachstehenden Ansprüche begrenzt wird. Tabelle 1. Die in den Toxin-A-Neutralisationsuntersuchungen eingesetzten SYNSORBs
Tabelle 2. Neutralisation der Toxin A-Aktivität in Stuhlproben mit SYNSORB 52

^450 mittlere prozentuale Neutralisation

++++ > 1,5 77 ± 12% (n = 5)

+++ 1,1–1,4 63% (n = 1)

++ 0,6–1,0 66 ± 18% (n = 3)

+ 0,1–0,4 32 ± 22% (n = 3)

Claims

Verwendung einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, welche eine Oligosaccharidsequenz aufweist, die über einen kompatiblen Nichtpeptidyl-Linkerarm an einen pharmazeutisch verträglichen festen inerten Träger kovalent gebunden ist, wobei die Oligosaccharidsequenz Toxin A bindet und die Zusammensetzung aus dem Magendarmtrakt ausgeschieden werden kann, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Toxin A-vermittelter Diarrhoe, und wobei die Oligosaccharidsequenz ausgewählt ist aus:
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Oligosaccharidsequenz 2 bis 10 Saccharideinheiten hat.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Oligosaccharidsequenz 3 bis 5 Saccharideinheiten hat.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die über einen kompatiblen Nichtpeptidyl-Linkerarm an einen pharmazeutisch verträglichen festen inerten Träger kovalent gebundene Oligosaccharidsequenz ausgewählt ist aus den in Tabelle 1 aufgeführten SYNSORB-Nummern 2, 5, 9, 51, 52, 68, 90, 104, 105, 115 und 134.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Linkerarm -(CH₂)₈C(O)- ist.
Arzneimittel-Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung von CDAD und verwandten Zuständen, die durch Toxin A ausgelöst werden, wobei die Zusammensetzung umfasst: a) eine Oligosaccharidsequenz, die über einen kompatiblen Nichtpeptidyl-Linkerarm an einen pharmazeutisch verträglichen festen inerten Träger kovalent gebunden ist, wobei die Oligosaccharidsequenz Toxin A bindet und sie ausgewählt ist aus:
b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei die Zusammensetzung aus dem Magendarmtrakt ausgeschieden werden kann.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die Oligosaccharidsequenz 2 bis 10 Saccharideinheiten hat.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die Oligosaccharidsequenz 3 bis 5 Saccharideinheiten hat.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die über einen kompatiblen Nichtpeptidyl-Linkerarm an den pharmazeutisch verträglichen festen inerten Träger kovalent gebundene Oligosaccharidsequenz ausgewählt ist aus den in Tabelle 1 aufgeführten SYNSORBs 2, 5, 9, 51, 52, 68, 90, 104, 105, 115 und 134.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei der Linkerarm -(CH₂)₈C(O)- ist.
Oligosaccharidsequenz, die über einen kompatiblen Nichtpeptidyl-Linkerarm an einen pharmazeutisch verträglichen festen inerten Träger kovalent gebunden ist, zur Verwendung bei der Behandlung von CDAD und verwandten Zuständen, die durch Toxin A ausgelöst werden, wobei die Oligosaccharidsequenz Toxin A bindet und sie ausgewählt ist aus:
Oligosaccharidsequenz, die über einen kompatiblen Nichtpeptidyl-Linkerarm an einen pharmazeutisch verträglichen festen inerten Träger kovalent gebunden ist, nach Anspruch 11, wobei die Oligosaccharidsequenz 2 bis 10 Saccharideinheiten hat.
Oligosaccharidsequenz, die über einen kompatiblen Nichtpeptidyl-Linkerarm an einen pharmazeutisch verträglichen festen inerten Träger kovalent gebunden ist, nach Anspruch 11, wobei die Oligosaccharidsequenz 3 bis 5 Saccharideinheiten hat.
Oligosaccharidsequenz, die über einen kompatiblen Nichtpeptidyl-Linkerarm an einen pharmazeutisch verträglichen festen inerten Träger kovalent gebunden ist, nach Anspruch 11, wobei die Oligosaccharidsequenz ausgewählt ist aus den in der Tabelle 1 aufgeführten SYNSORBs 2, 5, 9, 51, 52, 68, 90, 104, 105, 115 und 134.
Oligosaccharidsequenz, die über einen kompatiblen Nichtpeptidyl-Linkerarm an einen pharmazeutisch verträglichen festen inerten Träger kovalent gebunden ist, nach Anspruch 11, wobei der Linkerarm -(CH₂)₈C(O)- ist.
Kit, umfassend: a) einen Behälter, welcher einen pharmazeutisch verträglichen festen inerten Träger enthält, der aus dem Magendarmtrakt ausgeschieden werden kann und der eine Oligosaccharidsequenz aufweist, die über einen kompatiblen Nichtpeptidyl-Linkerarm kovalent daran gebunden ist, wobei die Oligosaccharidsequenz Toxin A bindet und sie ausgewählt ist aus:
b) Messvorrichtung zum Messen des Trägers; und c) Gebrauchsanweisungen zum Messen des Trägers und zum Mischen desselben mit einem pharmazeutisch verträglichen Exzipienten zur Verabreichung an ein Individuum.