DE69734476T2

DE69734476T2 - Verabreichung von produkten des 5-lipoxygenasestoffwechsels zur steigerung der antimikrobiellen abwehr

Info

Publication number: DE69734476T2
Application number: DE69734476T
Authority: DE
Inventors: Marc Peters-Golden; Theodore Standiford
Original assignee: University of Michigan
Current assignee: University of Michigan
Priority date: 1996-12-03
Filing date: 1997-12-03
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2017-12-04
Also published as: ES2341255T3; EP1037640A4; DE69734476D1; US7696148B1; AU5794298A; DE69739775D1; EP1602375A2; US20050267211A1; WO1998024397A3; DK1037640T3; ATE457730T1; EP1602375A3; AU733567B2; EP1602375B1; CA2278140A1; US5909734A; EP1037640B1; EP1037640A2; WO1998024397A2; ATE307589T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Verwendung von Verbindungen zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von mikrobieller Infektion, und insbesondere die Verwendung von Produkten des 5-Lipoxygenase-Stoffwechselwegs zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von mikrobieller Infektion und bakterieller Pneumonie.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
A. Pulmonale Wirtsabwehr und die Pathogenese der Pneumonie
Angesichts der konstanten Herausforderung des respiratorischen Trakts durch inhalierte oder eingeatmete Mikroben und der schädlichen Folgen einer unbemerkten Infektion ist ein wirksames System zur pulmonalen antimikrobiellen Abwehr offenbar wichtig für die Gesundheit. Mikroben, die den von dem oberen respiratorischen Trakt und den Atemwegen bereit gehaltenen mechanischen Abwehrmechanismen entgehen, erreichen die Alveolen. Hier verteidigt der alveoläre Makrophage gewöhnlich die Sterilität der Schleimhaut, überwacht die Alveolenoberfläche und beseitigt die Organismen durch Phagocytose und intrazelluläres Abtöten. [M. Lohmann-Matthes et al., Eur. Respir. J. 7: 1678–1689 (1994)]. Wenn die Mikrobenbelastung die lokale Clearance-Kapazität der angesiedelten alveolären Makrophagen übersteigt, können die Makrophagen chemotaktische Faktoren gestalten, die zirkulierende Neutrophile zu den Atemwegen rekrutieren und die deren phagocytische und mikrobizide Aktivitäten aktivieren.
Phagocytierende Zellen können zwar selbst Mikroben aufnehmen, jedoch wird die Effizienz dieses Prozesses durch das Vorhandensein verschiedener löslicher Moleküle (Opsonine) gesteigert, die die Organismen beschichten und die ihre Befestigung an Oberflächenrezeptoren auf dem Phagozyt vermitteln. Diese Opsonine umfassen Immunglobulin, sowie Faktoren, die die Mikroben unspezifisch beschichten, wie das Komplementfragment C3b, Surfactant-Protein A und Fibronectin. Die Phagocytose und die intrazelluläre Abtötung werden zudem entsprechend durch eine Vielzahl von Aktivierungsmitteln verstärkt, wie durch koloniestimulierende Faktoren, Chemokine und Lipide. Leider kann die qualitative oder quantitative Störung einer jeden Komponente dieser Verteidigungsmechanismen die bakterielle Clearance und die Prädisposition gegenüber Pneumonie gefährden. [Siehe beispielsweise J. Langermans et al., J. Immunol. Methods 174: 185 – 194 (1994)].
B. Signifikanz der bakteriellen Pneumonie
In Industrienationen ist die Pneumonie mit einer größeren Morbidität und Mortalität verbunden als irgend ein anderer Infektionstyp. Insgesamt ist es die sechsthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten. Bei Erwachsenen über 65 Jahren ist es der vierthäufigste Grund für eine Krankenhauseinweisung. Unter den im Krankenhaus erworbenen Infektionen hat die Pneumonie die zweithäufigste Inzidenz und sie ist meist tödlich.
Bakterien sind die etiologischen Pathogene bei einem erheblichen Anteil der in der Gesellschaft erworbenen Pneumonien und bei einem Großteil der nosokomialen Pneumonien. Häufig sind enterische gramnegative Organismen diejenigen etiologischen Mikroben, welche für beide Pneumonienarten verantwortlich sind. Man nimmt gewöhnlich an, dass gramnegative Pneumonien von einer Mikroaspiration oraler Sekrete herrühren, und sie sind daher besonders wahrscheinlich in Individuen, die eine oropharyngeale Besiedelung mit diesen Organismen aufweisen. Dies ist besonders üblich bei stationären Patienten, insbesondere solchen in Intensivstationen, kommt aber auch bei Alkoholikern, Patienten mit unterliegender systemischer Krankheit oder mit Störungen der Wirtsabwehr, und solchen mit einer chronischen pulmonalen Krankheit vor. [S. Nelson et al., Clin. Chest Med. 16: 1–12 (1995)].
C. Antibiotika-Therapie
Aufgrund der weitverbreiteten Verwendung und der häufigen Über-Verschreibung von antimikrobiellen Mitteln besteht eine steigende Inzidenz von Mikroben, die eine Medikamentenresistenz erlangen. Mit anderen Worten sind Organismen, die gewöhnlich gegenüber einem bestimmten antimikrobiellen Mittel anfällig sind (d.h. gehemmt oder getötet werden), nicht länger anfällig. Dies ist besonders wichtig in Bezug auf die Verwendung von Antibiotika bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen.
Eine erworbene Medikamentenresistenz wird gewöhnlich durch eine Mutation innerhalb des Genoms der Mikrobe oder durch Aufnahme eines Plasmids verursacht. Einer der Hauptmechanismen der Resistenz gegen β-Lactam-Antibiotika, einschließlich Penicillinen, ist die Produktion von β-Lactamasen. Darüber hinaus kann die Resistenz gegen ein Mitglied einer Klasse von Mitteln (bspw. das Aminopenicillin Ampicillin) zur vollständigen Kreuzresistenz gegen andere Mitglieder dieser Klasse führen (beispielsweise das Aminopenicillin Amoxicillin).
Der Antibiotikadruck bei bestimmten Patientenpopulationen (beispielsweise Patienten mit unterliegender systemischer Krankheit oder Störungen der Wirtsabwehr) hat zur Entwicklung von Infektionen mit mehrfach medikamentenresistenten Organismen geführt, deren Ausrottung immer schwieriger wird. Ein Faktor, der zum Antibiotikadruck beiträgt, ist die weitver breitete Verwendung von Antibiotika in der Krankenhausumgebung, insbesondere in Intensivstationen. Tatsächlich sind die Ärzte häufig zur Verwendung von Antibiotikaschemata, die mehrere Mittel umfassen, gezwungen, um solche Infektionen zu bekämpfen, oder zur Verwendung von Breitspektren-Mittel (beispielsweise Primaxin^®, Merck), die gewöhnlich für die schwersten Infektionen reserviert sind.
Man benötigt ein Mittel zur Steigerung der pulmonalen Abwehrfähigkeiten, die entweder keine Antibiotika erfordern, oder die zur Steigerung der Antibiotikabehandlung verwendet werden können. Das Verstärkungsmittel sollte bei der Behandlung und Vorbeugung von bakterieller Pneumonie in solchen Patienten wirksam sein, die besonders anfällig dagegen sind, sollten einen raschen Wirkungsbeginn aufweisen, und sollten keine immunologischen Reaktionen im Empfänger auslösen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Leukotriene sind leistungsfähige Vermittler von Entzündung, die von dem 5-Lipoxygenasepfad des Arachidonsäure-Stoffwechsels hergeleitet sind. Diese Substanzen sind an der Pathogenese von Lungen-Entzündungserkrankungen beteiligt, und neue Pharmakologika, die die Leukotriensynthese oder -wirkungen hemmen, sind seit Neuem zur Behandlung von Asthma verfügbar. Die vorliegende Erfindung, wie sie in den Ansprüchen definiert ist, schlägt die Verwendung von Leukotrienen und anderen Produkten des 5-Lipoxygenasepfades zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Pneumonie und anderen Infektionen des unteren respiratorischen Trakts vor.
Zur Bewertung der Rolle der Leukotriene bei bakterieller Pneumonie haben die Erfinder ein Modell der Klebsiella-Pneumonie bei Knockoutmäusen eingesetzt, die durch gezielte Unterbrechung des 5-Lipoxygenasegens leukotriendefizient gemacht wurden. Die Erfinder fanden, dass die Leukotrienproduk tion in den Lungen infizierter Wildtypmäuse stieg, und dass die leukotriendefizienten Tiere eine reduzierte Bakterien-Clearance und eine gesteigerte Letalität manifestierten. Darüber hinaus zeigten die alveolären Makrophagen aus Knockoutmäusen eine gestörte In-vitro-Phagocytose und gestörtes Abtöten von K. pneumoniae, und dieser funktionelle Defekt in leukotriendefizienten alveolären Makrophagen wurde durch Zugabe exogener Leukotriene, wie LTB₄, bewältigt. Bedeutenderweise bezwang eine intrapulmonale Verabreichung von LTB₄ partiell die In-vitro-Störung der Bakterien-Clearance, die man bei Knockoutmäusen vorfindet.
Die Erfinder haben bestimmt, dass endogene Leukotriene eine wesentliche Rolle bei der Wirtsreaktion gegen pulmonale Infektion spielen. Noch bedeutender vom therapeutischen Standpunkt ist die Entdeckung der Erfinder, dass exogene Leukotriene pharmakologische Wirkungen ausüben, die diese Reaktion verstärken.
Die vorliegende Erfindung schlägt die Verwendung von Stoffwechselprodukten des 5-Lipoxygenasepfades (beispielsweise von Leukotrienen) zur Herstellung eines Medikamentes zur pulmonalen Verabreichung zur Behandlung der übermäßigen Pneumonie oder frühen Pneumonie vor, wobei es einen prädisponierenden Faktor gibt (beispielsweise, Rauchen, Alkoholismus, Diabetes, HIV-Infektion, bekannte Aspiration).
Für eine erfolgreiche Ausübung der vorliegenden Erfindung ist es zwar nicht nötig, dass man den Wirkmechanismus der Produkte versteht, die Verabreichung dieser Produkte, insbesondere die intrapulmonale Verabreichung von Leukotrienen, verstärkt die lokalen endogenen Wirtsabwehrmechanismen und unterstützt die Auslöschung der bakteriellen Infektion während der Antibiotikaverabreichung. Die Produkte haben eine relativ kurze Wirkungsdauer (beispielsweise Stunden), verur sachen keine antikörpervermittelten Immunreaktionen und sind relativ billig.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung von Produkten des 5-Lipoxygenasepfades zur Herstellung eines Medikamentes zur intrapulmonalen Verabreichung zur Behandlung von Pneumonie. Die vorliegende Erfindung schlägt die Verabreichung dieser Produkte über andere Verabreichungswege und zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung anderer Zustände vor. Die Produkte können in einigen Ausführungsformen gleichzeitig mit Antibiotika verabreicht werden. Bei anderen Ausführungsformen werden verschiedene Produkte (beispielsweise LTB₄ und LTC₄) des 5-Lipoxygenasepfades zusammen oder in bestimmten Abständen verabreicht, und zwar mit oder ohne begleitende Verabreichung von Antibiotika.
Die vorliegende Erfindung schlägt die Verwendung einer wirksamen Menge einer therapeutischen Zusammensetzung vor, umfassend ein Produkt des 5-Lipoxygenasepfades, zur Herstellung eines Medikamentes zur pulmonalen Verabreichung zur Behandlung einer mikrobiellen Infektion in einem Wirt, bei dem der Verdacht besteht, dass er diese mikrobielle Infektion hat. Der Wirt kann stark gefährdet sein, dass er eine mikrobielle Infektion entwickelt. Stark gefährdete Wirte sind u.a., aber nicht ausschließlich, Wirte mit dem AIDS-Virus und andere Wirte mit angegriffenem Immunsystem.
Bei einer Ausführungsform ist die mikrobielle Infektion bakterielle Pneumonie. Bei bestimmten Ausführungsformen umfasst das Produkt des 5-Lipoxygenasepfades ein Leukotrien. Umfasst das Produkt des 5-Lipoxygenasepfades ein Leukotrien, ist das Leukotrien in bestimmten Ausführungsformen das Leukotrien B₄ und in anderen Ausführungsformen ein Cysteinylleukotrien (beispielsweise Leukotrien C₄, Leukotrien D₄ und Leukotrien E₄). Bei noch weiteren Ausführungsformen erfolgt die pulmonale Verabreichung durch Aerosolierung der therapeuti schen Zusammensetzung in anderen Ausführungsformen. Darüber hinaus umfassen bestimmte Ausführungsformen zudem die gleichzeitige Verabreichung eines Antibiotikums an den Wirt. Der Wirt ist in einigen Ausführungsformen ein Tier und in anderen ein Mensch.
Die vorliegende Erfindung, wie sie in den Ansprüchen definiert ist, schlägt darüber hinaus die Verwendung einer wirksamen Menge einer therapeutischen Zusammensetzung vor, die ein Leukotrien umfasst, zur Herstellung eines Medikamentes zur pulmonalen Verabreichung zur Behandlung einer bakteriellen Infektion in einem Wirt, bei dem der Verdacht besteht, dass er diese bakterielle Infektion hat.
Bei bestimmten Ausführungsformen ist die bakterielle Infektion eine bakterielle Pneumonie. Das Leukotrien ist in bestimmten Ausführungsformen das Leukotrien B₄ und in anderen Ausführungsformen ein Cysteinylleukotrien, wie Leukotrien C₄, Leukotrien D₄ und Leukotrien E₄. Bei noch weiteren Ausführungsformen erfolgt die pulmonale Verabreichung durch Aerosolierung der therapeutischen Zusammensetzung. Darüber hinaus umfassen bestimmte Ausführungsformen zudem die gleichzeitige Verabreichung eines Antibiotikums an den Wirt. Der Wirt ist in einigen Ausführungsformen ein Tier und in anderen ein Mensch.
Schließlich schlägt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer wirksamen Menge einer therapeutischen Zusammensetzung, umfassend ein Leukotrien, zur Herstellung eines Medikamentes zur pulmonalen Verabreichung zur Behandlung einer bakteriellen Infektion in einem Wirt vor, bei dem der Verdacht besteht, dass er diese Bakterieninfektion hat, wobei die therapeutische Zusammensetzung eine Lösung umfasst, die ein steriles flüssiges Vehikel und ein Leukotrien enthält, das in dem sterilen flüssigen Vehikel gelöst ist.
Bei bestimmten Ausführungsformen ist das Leukotrien das Leukotrien B₄. Bei noch weiteren Ausführungsformen ist das Leukotrien ein Cysteinylleukotrien; wenn das Leukotrien ein Cysteinylleukotrien ist, handelt es sich bei bestimmten Ausführungsformen um das Leukotrien C₄, Leukotrien D₄ oder Leukotrien E₄. Schließlich wird die Lösung in zusätzlichen Ausführungsformen aerosoliert.
Definitionen
Zur Erleichterung des Verständnisses der in der folgenden Offenbarung beschriebenen Erfindung wird nun eine Reihe von Begriffen erklärt.
Der Ausdruck "Produkt des 5-Lipoxygenasepfades" betrifft diejenigen Verbindungen, die aus der enzymatischen Umwandlung von Arachidonsäure durch 5-Lipoxygenase hervorgehen. Die Produkte des 5-Lipoxygenasepfades umfassen 5-Hydroperoxyeicosatetraensäure [5-HPETE] und LTA₄, sowie die davon hergeleiteten Verbindungen. Die Produkte umfassen 5-HETE, das aus 5-HPETE hergestellt wird. Die Produkte beinhalten auch Verbindungen, die aus der Umwandlung von LTA₄ hervorgehen, wie LTB₄, LTC₄, LTE₄ und LTF₄. Darüber hinaus sollen die Produkte Derivate (beispielsweise Verbindungen, die durch strukturelle Modifikation hergestellt werden) von Verbindungen umfassen, die in der Arachidonsäurekaskade hergestellt werden. Die vorliegende Erfindung ist nicht durch die Beschaffenheit der strukturellen Modifikation eingeschränkt; Modifikationen umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, die Bildung einer Doppelbindung zwischen zwei Kohlenstoffatomen und die Addition funktioneller Gruppen wie Hydroxyl- und Carboxy-Einheiten. Weitere Modifikationen, die von der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen werden, umfassen die Substitution verschiedener Aminosäuren für diejenigen, die gewöhnlich vorhanden sind (beispielsweise den Austausch des Glycinrests an LTD₄ mit einer anderen Aminosäure) oder die Bindung zusätzlicher Aminosäuren. Die folgende Tabelle (Tabelle 1) listet verschiedene kommerziell verfügbare Produkte (Cayman) des 5-Lipoxygenasepfades auf. Die vorliegende Erfindung ist natürlich nicht auf die in der Tabelle 1 aufgeführten Verbindungen eingeschränkt.
TABELLE 1
Der Begriff "Leukotrien" ist hier funktionell für solche Verbindungen definiert, die die Antimikrobenabwehr steigern. Der Begriff "Mikrobe" bzw. "mikrobiell" umfasst, ist aber nicht eingeschränkt auf Bakterien, Viren, Parasiten und Pilze.
Der Begriff "Cysteinylleukotrien" betrifft solche Leukotriene, die den Cysteinrest besitzen, der für die Leukotriene C₄, D₄ und E₄ charakteristisch ist.
Der Begriff "Eicosanoid" betrifft Verbindungen, die von essentiellen Fettsäuren mit 20 Kohlenstoffatomen und mit 3, 4 oder 5 Doppelbindungen hergeleitet sind: 8,11,14-Eicosatriensäure (Dihomo-γ-linolensäure), 5,8,11,14-Eicosatetraensäure (Arachidonsäure) und 5,8,11,14,17- Eicosapentaensäure. Die Familien der Leukotriene und Prostaglandine sind Beispiele für Eicosanoide.
Der Begriff "wirksame Menge" betrifft eine solche Menge eines 5-Lipoxygenaseproduktes, die zur erfolgreichen Durchführung einer bestimmten Funktion erforderlich ist. Allgemein ausgedrückt ist die wirksame Menge eines 5-Lipoxygenaseproduktes diejenige Menge, die die Fähigkeit des Körpers zur Ausrottung einer mikrobiellen Infektion, insbesondere einer Bakterieninfektion, (in einem beliebigen Maße) erhöht oder verbessert. Die wirksame Menge kann von einer Reihe von Faktoren abhängen, einschließlich des Typs der beteiligten Mikrobe, der Schwere der Infektion, des Immunstatus des Individuums, und des Gewichts des Individuums. Leukotrien LTD₄ kann beispielsweise in einer therapeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, die zwischen 0,1 μg und 10 μg enthält.
Der Begriff "therapeutische Zusammensetzung" betrifft eine Zusammensetzung, die ein Produkt des 5-Lipoxygenasepfades (beispielsweise LTB₄ und LTC₄) in einer pharmazeutisch verträglichen Form enthält. Die Eigenschaften der Form hängen von einer Reihe von Faktoren ab, einschließlich des Verabreichungsmodus. Eine Zusammensetzung zur aerosolierten pulmonalen Verabreichung muss beispielsweise derart formuliert sein, dass das Produkt nach der Abgabe an die Lungen pharmakologisch aktiv ist. Die therapeutische Zusammensetzung kann unter anderem Verdünnungsmittel, Hilfsstoffe und Träger umfassen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Produkt des 5-Lipoxygenasepfades in einem sterilen flüssigen Vehikel gelöst. Der Begriff "steriles flüssiges Vehikel" betrifft solche Flüssigkeiten, die sich zur Verabreichung an einen Wirt eignen (beispielsweise pulmonale oder parenterale Verabreichung) und die eine Auflösung des Produktes des 5-Lipoxygenasepfades ermöglichen. Beispiele für sterile flüssige Vehikel umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, sterile normale Kochsalzlösung und verdünnte Konzentrationen von Ethanol.
Der Begriff "Wirt" betrifft Menschen und Tiere.
Der Begriff "Steigerung der mikrobiellen Abwehr" und "Steigerung der bakteriellen Abwehr" betreffen weithin die verbesserte Fähigkeit des Immunsystems eines Individuums auf eine mikrobielle Infektion (beispielsweise bakterielle, parasitische, virale und Pilzinfektion) bzw. speziell eine bakterielle Infektion zu reagieren und diese auszurotten. Die Begriffe umfassen beispielsweise die Stärkung des endogenen Abwehrmechanismus des Individuums. Das Vorhandensein der Steigerung der antimikrobiellen bzw. antibakteriellen Abwehr wird bestimmt, indem man eine Verbindung dem in Tabelle 3 unten beschriebenen Screeningverfahren unterwirft.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Es zeigt/zeigen:
1A ein Schema, welches den Pfad der Leukotriensynthese und die Strukturen der Hauptprodukte des 5-Lipoxygenase-Stoffwechselpfades, veranschaulicht;
1B einen schematischen Überblick, welcher den Pfad der Leukotriensynthese und die Wirkungen der Leukotriene bei der Antimikrobenabwehr veranschaulicht;
2A und B RP-HPLC-Profile radioaktiver Eicosanoide, die durch vormarkierte alveoläre Makrophagen freigesetzt werden, die von Wildtypmäusen (2A) und 5-LO-Knockoutmäusen (2B) erhalten werden;
3 graphisch die Wirkung einer Klebsiella pneumoniae-Provokation auf das Überleben in 5-LO-Knockoutmäusen und Wildtypmäusen;
4 graphisch die Clearance von K. pneumoniae aus der Lunge und Plasma zwei Tage nach der Provokation in 5-LO-Knockout- und Wildtypmäusen;
5 graphisch die phagocytischen und bakteriziden Wirkungen in alveolären Makrophagen aus 5-LO-Knockout- und Wildtypmäusen;
6 graphisch die Wirkung von exogenem LTB₄ auf die bakterielle phagocytische Aktivität in alveolären Makrophagen aus 5-LO-Knockoutmäusen.
7 graphisch die Lungenhomogenatspiegel von LTB₄ und LTC₄ in Wildtypmäusen zwei Tage nach der Provokation mit K. pneumoniae oder Kochsalzlösung;
8 graphisch die Wirkung der K. pneumoniae-Provokation auf die Spülungs-Neutrophilie in 5-LO-Knockout- und Wildtypmäusen;
9 graphisch die Wirkung von exogenen S-LO-Metaboliten auf die bakterielle phagocytische Aktivität in normalen alveolären Makrophagen der Ratte;
10 graphisch die Wirkung der intratrachealen Verabreichung von LTB₄ auf die defiziente Bakterien-Clearance der Lunge in 5-LO-Knockoutmäusen.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist in den Ansprüchen definiert und betrifft im Allgemeinen die Verwendung von Verbindungen zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von mikrobieller Infektion und insbesondere die Verwendung der Produkte des 5-Lipoxygenase-Stoffwechselweges zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von bakterieller Pneumonie. Zur Erleichterung des Verständnisses der vorliegenden Erfindung wird die folgende Beschreibung in die nachstehenden Abschnitte unterteilt: I) Synthese, Wirkungen und pharmakologische Modulation von Leukotrienen; II) Leukotriene und anti mikrobielle Wirtsabwehr; III) 5-LO-Aktivierung bei alveolären Makrophagen und Neutrophilen; IV) Rolle der Leukotriene bei der In-Vivo-Wirtsreaktion; und V) Zusammensetzung und Verabreichung der Verbindungen.
I) Synthese, Wirkungen und pharmakologische Modulation von Leukotrienen
Leukotriene sind oxygenierte Derivate von Arachidonsäure, die vorwiegend durch aus Knochenmark abgeleitete Zellen in Reaktion auf eine Vielzahl von löslichen oder teilchenförmigen Stimuli synthetisiert werden. [E. Goetzl et al., FASEB J. 9: 1051–1058 (1995)]. Arachidonsäure wird zu Beginn aus Membranphospholipiden hydrolysiert, teilweise durch die Wirkungen der cytosolischen Phospholipase A₂ (cLPA₂). Die nächsten beiden Schritte bei der Leukotriensynthese (die anschließende Umwandlung von Arachidonsäure zuerst in 5-Hydroperoxyeicosatetraensäure [5-HPETE] und dann zu LTA₄) werden durch das Enzym 5-Lipoxygenase (5-LO) katalysiert. Dieses Enzym kommt im Cytosol und/oder im Kern ruhender Zellen vor. Ein Verständnis des Wirkmechanismus ist zwar nicht erforderlich, um die vorliegende Erfindung zu praktizieren, jedoch nimmt man an, dass 5-LO bei der Agonistenstimulation in einer Ca²⁺-abhängigen Weise in die Kernhülle transloziert [siehe beispielsweise J. Woods et al., J. Clin. Invest. 95: 2035–2040 (1995)]; hier nimmt man an, dass es Zugang zur freien Arachidonsäure erhält, von freien Kernphospholipiden hydrolysiert wird und von dem integralen Arachidonsäurebindenden Kernhüllprotein, 5-LO-aktivierenden Protein (FLAP), präsentiert wird. 5-HPETE kann in das stabile Produkt, 5-HETE, umgewandelt werden. Das LTA₄ kann enzymatisch in LTB₄ (durch die LTA₄-Hydrolase) oder in LTC₄ (durch die LTC₄-Synthase) umgewandelt werden. LTC₄ wiederum kann enzymatisch in LTD₄ (mit einem gleichzeitigen Anstieg der Bioaktivität), und dann in LTE₄, umgewandelt werden; LTE₄ kann anschließend unter Bildung von LTF₄ modifiziert werden. 1A ist eine Schema, das den Pfad der Leukotriensynthese und die Strukturen der Hauptprodukte des 5-Lipoxygenase-Stoffwechselwegs zeigt; bedeutenderweise hängt die Praxis der vorliegenden Erfindung nicht von der Genauigkeit des in 1A gezeigten Modells ab.
Die zelluläre Leukotriensynthese-Kapazität kann durch Einwirkenlassen einer Reihe biologisch aktiver Substanzen, wie dem Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor, Interferon-γ und dem transformierenden Wachstumsfaktor-β, gesteigert werden. Wie nachstehend eingehender beschrieben, haben alveoläre Makrophagen eine größere Kapazität für den 5-LO-Metabolismus, als Blutmonocyten oder andere Gewebe-Makrophagen [siehe beispielsweise M. Peters-Golden et al., J. Immunol. 144: 263–270 (1990)], und sie produzieren sowohl LTB₄ als auch LTC₄. Neutrophile dagegen produzieren nur LTB₄. Alveoläre Makrophagen und Neutrophile erzeugen beide 5-HETE.
Ein Verständnis ihrer Wirkmechanismen ist zwar nicht erforderlich, um die vorliegende Erfindung auszuüben, die hauptsächlichen biologisch aktiven Leukotriene, LTB₄ und die Cysteinyl- oder Sulfidopeptid-Leukotriene (Leukotriene C₄, D₄ und E₄) wirken wahrscheinlich durch Wechselwirkung mit spezifischen Oberflächenrezeptoren auf den Zielzellen. LTB₄ ist ein leistungsfähiges Neutrophilen-Chemotaxin in vitro, und ist für den Großteil der chemotaktischen Aktivität verantwortlich, die genau durch stimulierte alveoläre Human-Makrophagen in der Kultur ausgearbeitet wird. [T. Martin et al., J. Clin. Invest. 80: 1114–1124 (1989)]. Zudem ergab die bronchoskopische Eingabe von LTB₄ in vivo in die menschliche Lunge einen Neutrophilen-Einstrom. [T. Martin et al., J. Clin. Invest. 80: 1009–1019 (1989)].
Die erfindungsgemäße Praxis hängt zwar nicht von einem genauen Verständnis der Wirkungen der Produkte des 5-LO-Pfades ab, jedoch nimmt man an, dass LTB₄ zahlreiche Leukocytenfunktionen steigert, wie unter Anderem Phagocytose, [T. Demitsu et al., Int. J. Immunopharmac. 11: 801–808 (1989)], Hochregulation der CR3-Moleküle der Zelloberfläche [P. Marder et al., Biochem. Pharmacol. 49: 1683–1690 (1995)], die Sekretion von O₂ ^– und lysosomaler Hydrolasen, Mobilisierung intrazellulärer Ca²⁺-Speicher [C. Serhan et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 107: 1006–1012 (1982)], phospholipaseabhängige Arachidonsäure-Freisetzung [J. Wijkander et al., J. Biol. Chem. 270: 26543–26549 (1995)], Aktivierung von PKC [J. O'Flaherty et al., J. Immunol. 144: 1909–1913 (1990)], die Synthese von Interleukin (IL)-8 [R. Strieter et al., Am. J. Pathol. 141: 397–407 (1992)], und die Aktivierung der natürlichen Killerzellaktivität [R. Bray und Z. Brahmi Z, J. Immunol. 136: 1783–1790 (1986)]. Man nimmt an, dass 5-HETE viele dieser gleichen Wirkungen teilt, jedoch mit weniger Leistungsfähigkeit. Die Cysteinylleukotriene besitzen die Bioaktivität, die vorher als langsam reagierende Substanz identifiziert wurde. Ihre leistungsfähigsten Wirkungen umfassen eine Konstriktion der bronchialen und vaskulären glatten Muskeln und eine Erhöhung der mikrovaskulären Permeabilität. Es wurde auch beschrieben, dass LTD₄ die Makrophagen-FcR-Expression in vitro [J. Rhodes et al., Eur. J. Immunol. 15: 222–227 (1985)], und die Aktin-Polymerisation steigert [M. Peppelenbosch et al., Cell 74: 565–575 (1993)].
Die Freisetzung von LTB₄ aus polymorphonukleären Neutrophilen, induziert durch Aktivatoren, wie dem Calcium-Ionophor A23187, kann durch ein von Lactoferrin hergeleitetes Peptid gefördert werden [W. König et al., US 5,466,669 ]. Dieses Peptid fördert auch die Freisetzung von Histamin aus Mastzellen, induziert durch Aktivatoren, wie α- toxinproduzierende Staphylococcus-aureus-Zellen oder dem Calcium-Ionophor A23187.
Die Inhalation von LTB₄ induziert bekanntlich die Atemwegs-Hyperreaktion bei Hunden [P. M. O'Byrne et al., J. Appl. Physiol. 59: 1941–1946 (1985)]. Zudem steigert inhaliertes LTB₄ die Anzahl der Neutrophilen und die Konzentration von TxB₂, die in der Bronchoalveolarspülungsflüssigkeit gewonnen wurde.
Die Bronchokonstriktor-Leistungsfähigkeit der inhalierten Aerosole von LTD wurde ebenfalls bei Menschen bestimmt [J. Woodrow Weiss et al., J. Americ. Medic. Ass. 249: 2814–2817 (1983)].
Es wurde entdeckt, dass die durch LTD erzeugte Atemwegsobstruktion länger dauerte als die von Histamin, wodurch die Reaktion der asthmatischen allergischen Individuen auf eine Antigen-Inhalation widergespiegelt wurde.
Darüber hinaus induziert die Inhalation von aerosoliertem LTB₄ bekanntlich die pulmonale Neutrophilie in Affen [D. L. Allen et al., J. Pharm. Exp. Therap. 277: 341–349 (1996)]. Zudem regelt aerosoliertes LTB₄ ebenfalls die Expression von CD11b-Rezeptoren auf periphere Blut-Neutrophile hoch. Diese Wirkung kann durch den LTB₄-Rezeptor-Antagonisten LY293111Na signifikant geschwächt werden.
Neben dem nativen LTB₄ wurde eine Reihe von pharmakologisch wirksamen LTB₄-Derivaten syntethisiert [W. Skuballa et al., WO 95/20563].
Ein Verständnis des molekularen Mechanismus der bakteriellen Aufnahme und der Abtötung durch Phagocyten ist zwar nicht erforderlich, um die vorliegende Erfindung auszuüben, jedoch sind die Phagocytenoberflächen-Rezeptoren, die für eine opsonische Phagozytose am wichtigsten sind, diejenigen, die den Fc-Abschnitt von IgG (FcRII und FcRIII) und das C3bi-Fragment des Komplementes (das Integrin CR3, auch bekannt als Mac-1 und CD11b/CD18) erkennen. CR3 vermittelt auch eine nichtopsonische Aufnahme von K. pneumoniae. Eine Folge der Rezeptorligation ist die Freisetzung und der Stoffwechsel von Arachidonsäure. Da CR3 und FcR die Bindung von K. pneumoniae an Phagocyten vermitteln, ist ihre Oberflächenexpression ein relevantes Ziel für die Modulation durch Leukotriene.
1B, ein Schema, zeigt den Pfad der Leukotriensynthese und die Wirkungen der Leukotriene bezüglich der antimikrobiellen Abwehr. Bakterien, wie K. pneumoniae, binden an phagocytische Zellen, wie alveoläre Makrophagen und Neutrophile, und werden phagocytiert. Man nimmt an, dass dies einen Anstieg des intrazellulären Ca²⁺ triggert, was wiederum zu einer Translozierung von PLA₃ und 5-LO zur Kernhülle bewirkt. Wie bereits gezeigt, wird Arachidonsäure aus Phospholipiden hydrolysiert und durch 5-LO verstoffwechselt, was mit FLAP zu LTA4 wechselwirkt. LTA4 wird weiter in die Leukotriene B₄ und C₄ umgewandelt. Dies kann die Zielzellen über Wechselwirkungen mit Rezeptoren auf autokrine oder parakrine Weise beeinträchtigen. Als Ergebnis werden Chemotaxis, bakterielle Phagocytose und bakterielles Abtöten gefördert.
Die Unterbrechung der Synthese oder der Wirkungen der Leukotriene war ein primäres therapeutisches Ziel der Pharmaindustrie. Leistungsfähige und spezifische Verbindungen sind nun verfügbar, die die Leukotriensynthese durch direktes Hemmen von 5-LO oder FLAP hemmen; beide Klassen von Mitteln hemmen die Synthese sämtlicher 5-LO-Produkte. Zudem sind nun auch Verbindungen, die LTB₄ und Cysteinylleukotrien-Rezeptoren spezifisch antagonisieren, verfügbar; im Gegensatz zur vorherigen Klasse bieten diese Mittel die Möglichkeit zur unabhängigen Blockierung der Wirkungen der einzelnen Leukotriene. Vorklinische Untersuchungen schlagen zwar eine Reihe von potentiellen Krankheitszielen vor, jedoch hat Asthma die größte Aufmerksamkeit bei klinischen Studien erhalten.
II) Leukotriene und antimikrobielle Wirtsabwehr
Man nimmt im Allgemeinen an, dass sich die Entzündungskaskaden zum Zwecke der Wirtsabwehr gegen das Eindringen von Mikroben entwickelten. Es ist jedoch noch wenig bekannt über die mögliche Bedeutung endogener Leukotriene bei der Vermittlung der Wirtsreaktion auf Infektion. Die steigende Inzidenz der Immunsuppression und des Entstehens antibiotikaresistenter Mikroben unterstreicht die Bedeutung des Verständnisses der eigenen Wirtsabwehrmechanismen.
Die Sterilität der pulmonalen alveolären Oberfläche steht unter ständigem Angriff durch inhalierte und aspirierte Mikroben. Die effiziente Clearance dieser Pathogene hängt zum Großteil von den eigenen Immunreaktionen ab, die eine mikrobielle Phagocytose und das Abtöten umfassen. Vor der Arbeit der Erfinder haben die Forscher die Produkte des 5-LO-Pfades als potentielle Repräsentatoren einer Klasse von Entzündungs-Vermittlern bei der antimikrobiellen Abwehr weitgehend ignoriert.
Die Erfinder haben entdeckt, dass exogen verabreichte Produkte des 5-LO-Pfades im Allgemeinen und Leukotriene im Besonderen mit einer Reihe von möglichen Vorteilen als Hilfsmittel bei der Behandlung von Pneumonie einhergehen. Die Erfinder haben spezifisch bestimmt, dass diese Produkte einen raschen Wirkungsbeginn aufweisen, und sie vermuten, dass diese Produkte keine immunologischen Reaktionen beim Empfänger auslösen. Diese Produkte stellen darüber hinaus eine relativ preiswerte Therapie dar, die unabhängig von Antibiotika oder als Hilfstherapie für Antibiotika bei der Behandlung von Pneumonie verwendet werden kann. Bestimmte Patientenpopulationen (beispielsweise Patienten mit AIDS, Diabetes, Raucher, Neugeborene und Patienten, die an Alkoholismus und Mangelernährung leiden) mit schwerer Pneumonie würden von der Steige rung der endogenen Wirtsabwehrmechanismen über die vernünftige Verabreichung von beispielsweise Leukotrienen an die Lungen profitieren.
Ein genaues Verständnis der Wirkungen der Leukotriene auf die antimikrobielle Wirtsabwehr ist zur Ausführung der vorliegenden Erfindung zwar nicht erforderlich, jedoch nimmt man an, dass bestimmte allgemeine Wirkungen eintreten. Zuerst müssen endogene Leukotriene an den Infektionsstellen zugegen sein, damit sie an der antimikrobiellen Abwehr teilnehmen, und erhöhte (im Vergleich zu den Kontrollen) Spiegel von LTB₄ wurden in der Bronchoalveolarspülungsflüssigkeit (BALF) und im Lungengewebe von mit Pseudomonas aeruginosa infizierten Ratten [A. Buret et al., Infect. Immun. 61: 671–679 (1993)] sowie der Bronchoalveolarspülungsflüssigkeit von Patienten mit bakterieller Pneumonie [H. Hopkins et al., Chest 95: 1021–1027 (1989)] gemessen. Wie nachstehend eingehender beschrieben haben die Erfinder ebenfalls hohe Spiegel sowohl von LTB₄ als auch von LTC₄ in Lungenhomogenaten von Mäusen mit Klebsiella-Pneumonie gemessen. Klebsiella pneumoniae ist die klassische Ursache für gramnegative Pneumonie und es wurde beschrieben, dass es für 18 bis 64% der in der Gesellschaft erworbenen und 30% der nosokomialen gramnegativen Pneumonien verantwortlich ist [L. Crane und A. Lerner, In: Respiratory Infections: Diagnosis and Management (J. Pennington, Hrsg.) (Raven Press, New York), S. 227–250 (1983)].
Zweitens steigern exogen zugefügte Leukotriene die mikrobielle Phagocytose und/oder das Abtöten. Wie vorstehend beschrieben fördert die Zugabe von LTB₄ die Neutrophilen-Chemotaxis sowie die Phagocytose von Teilchen, Signaltransduktion und Sekretion von Oxidationsmitteln und lysosomalen Enzymen, von denen man jeweils erwartet, dass sie die bakterielle Clearance erleichtern. Tatsächlich steigerte LTB₄ die In-vitro-Phagocytose und das Abtöten von P. aeruginosa und Salmonella typhimurium durch peritoneale Makropagen [T. Demitsu et al., Int. J. Immunpharmac. 11: 801–808 (1989)], und das In-vitro-Abtöten von Schistosoma mansoni durch Neutrophile [R. Mogbel et al., Clin. Exp. Immunol. 52: 519–527 (1983)]; die intraperitoneale Injektion von LTB₄ steigerte auch die In-vivo-Clearance von S. typhimurium, das auf dem gleichen Weg verabreicht wurde [T. Demitsu et al., Int. J. Immunopharmac, 11: 801–808 (1989)]. Vor der vorliegenden Erfindung nimmt man jedoch an, dass die intrapulmonale Verabreichung von Leukotrienen und anderer Produkte des 5-LO-Pfades vorher für die therapeutische Verwendung nicht beschrieben wurde.
Drittens steigert die Reduktion der endogenen Leukotriensynthese die Anfälligkeit gegenüber Infektion. Phagocytose, Degranulation und Stickoxid-Produktion werden Berichten zufolge durch relativ spezifische Inhibitoren von 5-LO gehemmt, was eine für endogene Leukotriene in diesen Funktionen tolerante Rolle anzeigt. Interessanterweise geht eine Anzahl von durch eine Prädisposition gegenüber pulmonalen Infektionen gekennzeichneten Situationen mit einer reduzierten In-vitro-Kapazität alveolärer Makrophagen zur Synthese von Leukotrienen einher; diese umfassen sowohl Humanleiden (HIV-Infektion und Rauchen) sowie Tiermodelle (Protein-Kalorien-Fehlernährung, Vitamin-D-Mangel und den Neugeborenen-Zeitraum). Eine ähnliche Assoziation wurde für periphere Blut-Leukocyten aus Patienten mit Diabetes mellitus beobachtet. Dies steigert die Möglichkeit, dass ein Defekt beim 5-LO-Metabolismus den multiplen Defekten bei der Leukozyten-Funktion unterliegt, die bei schlecht eingestellten Diabetikern dargelegt wurde. Die klinische Verwendung von Anti-Leukotrien-Mitteln bei Asthma ging nicht mit einem Anstieg respiratorischer Infektionen einher. Diese Untersuchungen erfolgten jedoch im allgemeinen kurzfristig (d.h. mehrere Wo chen oder Monate) und junge, ansonsten gesunde Asthmatiker sind keine Patientenpopulation, von der man erwartet, dass sie für solche Infektionen prädisponiert ist.
III) 5-LO-Aktivierung bei alveolären Makrophagen und Neutrophilen
Es wurde gezeigt, dass alveoläre Makrophagen eine größere Kapazität für die Leukotriensynthese als periphere Blutmonocyten oder andere Gewebemakrophagen haben. Dies ist die Situation bei der Reaktion gegen lösliche (Ionophor A23187) und teilchenförmige (Zymosan) Agonisten, und für Zellen von Menschen [M. Balter et al., J. Immunol. 142: 602–608 (1989)] sowie Ratten [M. Peters-Golden et al., J. Immunol. 144: 263–270 (1990) (Daten nicht gezeigt). Wie vorstehend im Abschnitt Experimente beschrieben umfasst das Profil der Eicosanoide, die durch stimulierte alveoläre Makrophagen aus der Maus freigesetzt werden, zum Großteil 5-LO-Metabolite (siehe 2A).
Die Erfinder haben ebenfalls gezeigt, dass Neutrophile, die an Entzündungsstellen rekrutiert wurden, eine erhöhte Leukotrien-Synthesekapazität und eine Verschiebung der intrazellulären 5-LO-Verteilung aufweisen. Die Erfinder haben die Leukotriensynthese-Kapazität und die intrazelluläre Verteilung von 5-LO in Ratten-Neutrophilen, isoliert aus dem peripheren Blut oder aus der peritonealen Spülflüssigkeit, 4 Std. nach der Glycogen-Eingabe, miteinander verglichen. Angeregte Neutrophile wiesen eine 5fach größere maximale Kapazität für die LTB₄-Synthese in Reaktion auf A23187 als Blut-Neutrophile auf, die parallel untersucht wurden (Daten nicht gezeigt). Zudem wiesen die beiden Zellpopulationen auffallend unterschiedliche Verteilungen von 5-LO im Ruhezustand auf. Wie vorher für Human-Blut-Neutrophile gezeigt [T. G. Brock et al., J. Biol. Chem. 269: 22059–22066 (1994)] enthielten die ru henden Neutrophile aus Rattenblut 5-LO ausschließlich im Cytosol. Die ruhenden angeregten Neutrophile enthielten dagegen einen erheblichen Anteil ihres 5-LO im Kern; bei der darauffolgenden Ionophoren-Aktivierung zeigten sowohl Blut- als auch die angeregten Neutrophilenpopulationen eine 5-LO-Translokation zur Kernhülle (Daten nicht gezeigt).
Neben den vorstehend beschriebenen Befunden mit den ins Peritoneum rekrutierten Neutrophilen haben die Erfinder auch eine überwiegende intranukleäre Lokalisation von 5-LO in Neutrophilen beobachtet, die in den alveolären Raum rekrutiert wurden, wie es in Ratten bewiesen wurde, die 2 Tage nach der intratrachealen Verabreichung von Bleomycin untersucht wurden. Dies kann sowohl durch Immunfluoreszenz-Mikroskopieanalyse von Spülungszellen als auch durch immunhistochemische Färbung von Lungenschnitten gezeigt werden (Daten nicht gezeigt). Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass bei dem Rekrutierungsprozess aus dem Blutstrom zu diversen anatomischen Entzündungsstellen Neutrophile i) cytosolisches 5-LO in den Zellkern importieren und ii) ihre maximale Kapazität für die Leukotrienerzeugung hochregulieren. Bei diesen beiden Betrachtungen ähneln die rekrutierten Neutrophile alveolären Makrophagen.
Bedeutenderweise ist es bekannt, dass es in alveolären Makrophagen aus Menschen oder Tieren, die für pulmonale Infektionen prädisponiert sind, eine reduzierte Leukotrien-Synthesekapazität gibt. Die Erfinder haben die 5-LO-Stoffwechselkapazität alveolärer Makrophagen untersucht, die aus verschiedenen Zuständen von Mensch oder Tier isoliert wurden, von denen bekannt war, dass sie mit einer gesteigerten Anfälligkeit gegenüber pulmonalen Infektionen einhergingen. Diese Zustände umfassten kontrollierte Studien an menschlichen Rauchern [M. Balter et al., J. Lab. Clin. Med. 114: 662–673 (1989)], menschlichen Individuen, die mit dem Human-Immunschwäche-Virus (CD4-Zahl kleiner als 200) infiziert waren [M. Coffey et al., J. Immunol. 157: 393–399 (1996)], Vitamin-D-defizienten Ratten [M. J. Coffey et al., Prostaglandins 48: 313–329 (1994)], neugeborenen Kälbern und mit Alkohol gefütterten Mäusen. In sämtlichen Fällen hatten die Individuen kein Anzeichen für bakterielle Lungeninfektionen zum Zeitpunkt der Untersuchung. In all diesen Fällen war die In-vitro-Kapazität der alveolären Makrophagen für Leukotriensynthese verglichen mit den Kontrollspiegeln um 60 bis 90% reduziert. Diese Befunde zeigen, dass die Verabreichung exogener Leukotriene den Wirtsabwehrmechanismus bei Patienten, die gegenüber Infektionen des unteren respiratorischen Traktes anfällig sind, steigern sollte.
IV) Rolle der Leukotriene bei der In-Vivo-Wirtsreaktion
Die Entwicklung leukotriendefizienter Mäuse durch gezielte Disruption des 5-LO-Gens stellt ein wichtiges Werkzeug zur Bewertung endogen erzeugter Leukotriene dar. [J. Goulet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 12852–12856 (1994); X. Chen et al., Nature 372: 172–182 (1994)]. Diese Knockoutmäuse haben Berichten zufolge eine reduzierte Fähigkeit zur Rekrutierung von Neutrophilen in den meisten Entzündungsmodellen. Die Erfinder untersuchten kommerziell erhältliche 5-LO-Knockoutmäuse, um weiter zu zeigen, dass eine gestörte endogene Leukotrien-Syntesekapazität ursächlich mit einer gestörten antimikrobiellen Abwehr der Lunge einhergeht.
Die Erfinder verwendeten aus verschiedenen Gründen Klebsiella pneumoniae als erregendes Pathogen zur Induktion von Pneumonie. Zuerst ist es wie zuvor erörtert bei der Pneumonie von großer klinischer Bedeutung. Zudem löst es eine lebhafte Entzündungsreaktion bei Mäusen aus. [A. McColm et al., J. Antimicrob. Chemother. 18: 599–608 (1986)]. Drittens wurde das K. pneumoniae-Modell der Maus ausgiebig durch einen der Mit-Erfinder charakterisiert. Bei den nachstehend beschriebenen Experimenten wurde die intratracheale (i.t.) Injektion statt der Aerosolierung verwendet, da sie eher dem Bolus von Organismen ähnelt, der die distale Lunge über Mikroaspiration erreicht. Nach der intratrachealen Provokation von CD-1-Mäusen mit 103 CFU K. pneumoniae, weist der Neutrophilen-Einstrom bei 48 Std. ein Maximum auf, und die meisten Tiere starben an Tag 5. Zudem steigen die Lungenhomogenatspiegel verschiedener Cytokine und haben nach 48 Std. auch ein Maximum; diese umfassen den Tumornekrosefaktor (TNF), Makrophagen-Entzündungsprotein-2 (MIP-2), Makrophagen-Entzündungsprotein 1α (MIP-1α), IL-12 und IL-10.
Zur Anwendung dieses Modells der Pneumonie bei 5-LO-Knockoutmäusen identifizierten die Erfinder zuerst ein Inoculum von Organismen, das für den Wildtyp-Hintergrundstamm, 129/SvEv, geeignet war. Dieser Mäusestamm stellte sich gegenüber der Klebsiella-Pneumonie als anfälliger als der CD-1-Stamm heraus. Speziell bestimmten vorhergehende Untersuchungen, dass etwa 50% Mortalität in den Wildtyp-Tieren mit einem bakteriellen Inoculum von nur 50 CFU auftrat, was zeigt, dass die 129/SvEv-Mäuse wesentlich anfälliger gegenüber einer Klebsiella-Pneumonie als der CD-1-Stamm waren. [M. Greenberger et al., J. Immunol. 155: 722 (1995)]. Die Voraussetzung eines geringen bakteriellen Inoculums macht dies zu einem relevanten experimentellen Modell für eine gramnegative Pneumonie bei Menschen, von dem man im Allgemeinen annimmt, dass sie von einer Mikroaspiration von oropharyngealem Inhalt herrührt, der eine relativ kleine Anzahl von Organismen enthält.
Die vorliegende Erfindung nutzt zwar ein K. pneumoniae-Modell der Maus, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf die Verstärkung der Behandlung von Infektionen eingeschränkt, die durch diesen Organismus verursacht werden. Tatsächlich schlägt die vorliegende Erfindung die Verabreichung von Produkten des 5-LO-Stoffwechselweges, insbesondere LTB₄ und LTC₄, und zwar unabhängig und als Hilfsstoff (beispielsweise mit Antibiotika) zur Behandlung von Pneumonie und anderen Infektionen des respiratorischen Traktes vor, die durch eine Palette von Organismen verursacht werden. Die Tabelle 2 listet einige der häufigsten bakteriellen Pathogene auf, die die in der Gesellschaft erworbene und im Krankenhaus erworbene Pneumonie verursachen. Man geht davon aus, dass die Verwendung von Produkten des 5-LO-Stoffwechselweges zur Herstellung eines Medikamentes zur pulmonalen Verabreichung zur Behandlung von Infektionen, die durch diese Organismen verursacht werden, für die Patienten von Vorteil ist.
TABELLE 2
Die vorliegende Erfindung schlägt die Verwendung von Produkten des 5-LO-Stoffwechselweges zur Herstellung eines Medikamentes zur pulmonalen Verabreichung zur Behandlung anderer Infektionen vor, die pulmonale Manifestationen haben. Wie bereits erwähnt schlägt die vorliegende Erfindung darüber hinaus die Verwendung der Produkte zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines breiten Bereiches mikrobiel ler Infektionen neben bakteriellen Infektionen vor, einschließlich Infektionen, die durch Parasiten [R. Mogbel et al., Clip. Exp. Immunol. 52: 519 – 527 (1983)], Viren und Pilze hervorgerufen werden. Die vorliegende Erfindung schlägt darüber hinaus die Verwendung der Produkte zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung systemischer Infektionen vor; es sollte hervorgehoben werden, dass eine systemische Verabreichung vorsichtig durchgeführt wird, da die Leukotriene bekanntlich Hypotonie hervor rufen.
Die vorliegende Erfindung schlägt zwar darüber hinaus die pulmonale In-vivo-Verabreichung von Leukotrienen und anderen 5-LO-Produkten zur Steigerung der Abwehr gegen Bakterien in leukotriendefizienten Wirten vor, jedoch schlägt die vorliegende Erfindung ebenfalls die In-vivo-Verabreichung an Patienten vor, die nicht leukotriendefizient sind; tatsächlich wird eine solche Verwendung durch die Tatsache unterstützt, dass eine In-vitro-Inkubation mit exogenen Leukotrienen die Phagocytose und das Abtöten durch normale Makrophagen steigert.
Bemerkenswerterweise täuscht die zukünftige Verwendung von Anti-Leukotrien-Medikamenten in Menschen wahrscheinlich die Leukotriendefizienz vor, die bei der 5-LO-Gendisruption bei Mäusen beobachtet wurde. Bei bestimmten Individuen, die andere Immunsuppressiva erhalten, oder die gesteigerte Anzahlen von Bakterien in ihren unteren respiratorischen Trakten aufweisen, kann die Verwendung dieser Medikamente eine pulmonale antimikrobielle Wirtsabwehr beeinträchtigen. Demzufolge können diese Individuen ebenfalls von der Verabreichung der Produkte des 5-LO-Pfades profitieren, der zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen wurde; natürlich können bestimmte Dosierungspläne und -Programme garantiert werden, wenn diese Mittel gleichzeitig bei Patienten verwendet werden, die Anti-Leukotrien-Medikamente nehmen.
Wie bereits ebenfalls erwähnt schlägt die vorliegende Erfindung die Verwendung verschiedener Produkte des 5-Lipoxygenase-Stoffwechselwegs zur Steigerung der Bakterienabwehr vor. Das in der Tabelle 3 offenbarte umfassende Screeningverfahren kann zur Bewertung dieser Produkte (wie derjenigen Verbindungen, die vorher in Tabelle 1 aufgelistet sind) verwendet werden, sowie für Derivate oder Analoga dieser Produkte, die effizient sein können. Die Leukotriene B₄ und C₄ sind besonders wirksam bei der Steigerung der bakteriellen Abwehr, und dieses Screening ist besonders geeignet für Verbindungen, die mit diesen Leukotrienen verwandt sind. Es wird bei jeder Bestimmung auf ein bestimmtes Beispiel Bezug genommen; die angezeigten Beispiele stellen eine eingehende Beschreibung bereit, wie die Bestimmung durchgeführt werden soll.
TABELLE 3
Wie durch diese Auflistung von experimentellen Verfahrensabfolgen und die Beschreibung der Verfahren selbst veranschaulicht, ermöglicht eine durchdachte Betrachtung, dass eine jede Verbindung (beispielsweise "Verbindung X") zur erfindungsgemäßen Verwendung untersucht werden kann. Tatsächlich wurden diese Screening-Verfahren wie eingehend im Abschnitt Experimente beschrieben in den mit LTB₄ durchgeführten Experimenten durchgeführt.
V) Zusammensetzung und Verabreichung der Verbindungen
Die vorliegende Erfindung schlägt die Verwendung therapeutischer Zusammensetzungen von Produkten des 5-LO-Stoffwechselwegs vor, die auf der Basis vorstehend beschriebenen Screenings als effizient ausgewiesen sind. Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung durch die jeweilige Beschaffenheit des therapeutischen Präparates eingeschränkt wird. Diese Zusammensetzungen können beispielsweise zusammen mit einer physiologisch tolerierbaren Flüssigkeit (beispielsweise Kochsalzlösung), Gel oder Trägern oder Vehikeln, Verdünnungsmitteln, Hilfsstoffen und Trägern, wie pharmazeutische Grade von Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat, und dergleichen und Kombinationen davon bereitgestellt werden. Diese Zusammensetzungen enthalten gewöhnlich 1 bis 95%, vorzugsweise 2 bis 70%, Wirkstoff. Zudem können die Zusammensetzungen wenn gewünscht geringere Mengen von Hilfsstoffen enthalten, wie Netzmittel oder Emulgatoren, Stabilisatoren oder pH-Wert-Puffermittel oder Konservierungsmittel. Allgemein ausgedrückt hängt die Beschaffenheit der Zusammensetzung vom Verabreichungsverfahren ab.
Diese therapeutischen Präparate können für veterinärische Zwecke an Säugetiere, wie Haustiere, verabreicht werden und zur klinischen Verwendung bei Menschen auf ähnliche Weise wie andere Therapeutika. Im Allgemeinen variiert die zur therapeutischen Effizienz erforderliche Dosis je nach der Verwendungsart und dem Verabreichungsweg sowie den detaillierten Anforderungen der einzelnen Wirte und der beteiligten Organismen.
Ein bevorzugter Verabreichungsweg umfasst die Verabreichung an die Lunge. Patienten, die so krank sind, dass sie künstlich beatmet werden müssen, können eine Behandlung mit pharmakologischen Mitteln erhalten, die über die Endotrachealröhre verabreicht werden, die an das Beatmungsgerät angeschlossen ist. Alternativ kann die intrapulmonale Abgabe pharmakologischer Mittel an Patienten, die keine künstliche Beatmung benötigen, über eine Aerosolierung durchgeführt werden. Alternativ kann das Mittel über ein Bronchoskop an die Lunge verabreicht werden. Die Therapeutika können natürlich auf ihre Effizienz über andere Verabreichungswege, einschließlich der parenteralen Verabreichung, untersucht werden. Ist jedoch die Infektionsstelle die Lunge, minimiert die zielgerichtete Abgabe von Medikamenten dorthin wahrscheinlich die Nebenwirkungen und die systemischen Folgen.
Zu dem besitzen die erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verbindungen Eigenschaften als Therapeutika gegenüber anderen Mitteln wie Polypeptide. Die Produkte des 5-LO-Stoffwechselweges, die durch die vorliegende Erfindung vorgeschlagen wurden, haben einen schnellen Wirkungsbeginn (gewöhnlich innerhalb 1 Std.) und eine kurze Wirkungsdauer (gewöhnlich weniger als 12 Std.); diese Eigenschaften ermöglichen einen wesentlichen Grad der Kontrolle gegenüber biologischen Wirkungen. Zudem reduziert ihre kurze Wirkungsdauer die Möglichkeit, dass die Verabreichung von Leukotrienen und verwandten Mitteln nachteilig eine allzu überschwängliche Entzündungsreaktion stimuliert. Darüber hinaus können die kommerziell erhältlichen Leukotrien-Rezeptor-Antagonisten (beispielsweise der Cysteinylantagonist Accolate^® (Zafirkulast) Zeneca) verabreicht werden, um die Entstehung einer solchen Entzündungsreaktion zu verhindern.
Wie vorstehend erwähnt gehen die Produkte des 5-LO-Stoffwechselweges, die durch die vorliegende Erfindung vorge schlagen wurden, mit zusätzlichen Eigenschaften einher. Die Lipidprodukte lösen beispielsweise keine immunologischen Reaktionen aus, wie es bei Polypeptidmitteln der Fall ist. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind relativ billig, was sie als Hilfsstoff zur Infektionsbehandlung ideal macht.
Die erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verbindungen schaffen eine Maßnahme zur Steigerung der pulmonalen Abwehreigenschaften. Sie sind besonders wirksam bei der Behandlung und der Vorbeugung der bakteriellen Pneumonie bei solchen Patienten, die für diesen Zustand prädisponiert sind. Natürlich schlägt die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Verbindungen bei der Behandlung und Vorbeugung anderer Infektionen und Beschwerden, allein oder in Kombination mit anderen Produkten des 5-LO-Pfades oder antimikrobiellen Mittel vor.
EXPERIMENTE
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen und Aspekte der vorliegenden Erfindung, und sie sollen deren Schutzbereich nicht einschränken.
In der folgenden experimentellen Offenbarung gelten die nachstehenden Abkürzungen: M (molar); mM (millimolar); μM (mikromolar); N (normal); mol (Mole); mmol (Millimole); μmol (Mikromole); nmol (Nanomole); pmol (Picomole); g (Gramm); mg (Milligramm); μg (Mikrogramm); 1 (Liter); ml (Milliliter); μl (Mikroliter); cm (Centimeter); mm (Millimeter); μm (Mikrometers); nm (Nanometer); min. (Minuten); s und sec. (Sekunden); OD (Außendurchmesser); °C (Grad Celsius); v/v (Volumen/Volumen); AM (alveolärer Makrophage); BAL (Bronchoalveolarspülung); BALF (Bronchoalveolarspülungsflüssigkeit): cPLA₂ (cytosolische Phospholipase A₂); CFU (koloniebildende Einheit); 5-LO (5-Lipoxygenase); FLAP (5-LO-aktivierendes Protein); AA (Arachidonsäure); LT (Leukotrien); LTB₄ (Leukotrien B₄); LTC₄ (Leukotrien C₄); LTB₄R (LTB₄-Rezeptor); cys-LTR (Cysteinylleukotrienrezeptor); CR₃ (Komplementrezeptor 3); FcR (Rezeptor für den Fc-Abschnitt von Ig); MPO (Myeloperoxidase); PKC (Proteinkinase C); MAPK (Mitogen aktivierte Proteinkinase); O₂ ^– (Superoxid); NO (Stickoxid); PM (peritoneale Makrophagen); PMN (polymorphonukleäre Leukocyten); KO (Knockout); WT (Wildtyp); TNF (Tumornekrosefaktor); JE (das Maus-Homologon des Chemotaxis-Peptid-1 aus Monocyten); IL (Interleukin); HBSS (Hank's ausgeglichene Salzlösung); RP-HPLC (Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie); SE (Standardfehler); SEM (mittlerer Standardfehler); Abacus (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA); Abbott (Abbott Laboratories, North Chicago, IL); ATCC (American Type Culture Collection: Rockville, MD); Baxter (McGaw Park, IL); Biogenics (Napa, CA); Cayman (Cayman Chemical; Ann Arbor, MI); Coulter (Coulter Corp., Miami, FL); Difco (Detroit, MI); Fisher Scientific. Pittsburg, PA); Gibco (Gibco BRL; Gaithersburg, MD); Jackson (The Jackson Laboratory; Bar Harbor, ME); Merck (Rahway, NJ); Molecular Probes (Eugene, OR); Nunc (Naperville, IL); PharMingen (San Diego, CA); Pierce (Rockford, IL); Pfizer (Pfizer Inc., New York, NY); Vector (Vector Laboratories, Burlingame, CA); und Waters (Waters Corp., Milford, MA); Zeneca (Zeneca Pharmaceuticals. Wilmington, DE).
Die folgenden allgemeinen Verfahren wurden wenn nicht anders angegeben in den Beispielen verwendet.
Tiere
Mäuse mit der zielgerichteten Disruption ihres 5-LO-Gens (ALOX5, bezeichnet KO) und ihre Wildtyp-Stamm-Kontrollen (129/SvEv, bezeichnet WT) wurden vom Jackson-Laboratorium erhalten.
K. pneumoniae-Beimpfung
Der K. pneumoniae-Stamm 43816, Serotyp 2, erhalten von der ATCC (Zugriffs-Nr. 29939) wurde in tryptischer Sojabrühe (Difco) für 18 Std. bei 37°C gezüchtet. Die Präparation und die intratracheale Verabreichung von K. pneumoniae wurden durchgeführt, wie von M. Schneemann et al. [J. Infect. Dis. 167: 1358–1363 (1993)] beschrieben. Die Bakterienkonzentration wurde bestimmt durch Messen der Extinktion bei 600 nm und Bezugnahme auf eine Standard-Kurve der Extinktionen gegen bekannte Standard-CFUs. Die Bakterien wurden dann durch Zentrifugation für 30 min. bei 10000 U/min pelletiert, 2× in Kochsalzlöung gewaschen und in der gewünschten Konzentration in Kochsalzlösung resuspendiert.
Nach einer geeigneten Verdünnung der Bakterien in endotoxinfreier Kochsalzlösung wurden die Tiere mit Natriumpentobarbital (etwa 0,2 ml, verdünnt 1:7 in Kochsalzlösung intraperitoneal) betäubt, und die Trachea wurde über einen kleinen Mittellinien-Schnitt freigelegt. Ein 30 μl Inoculum mit 50 CFU K. pneumoniae oder Kochsalzlösung wurde über eine sterile 26 Gauge-Nadel verabreicht, und die Haut wurde mit einer chirurgischen Klammer geschlossen. Zur Präparation von K. pneumoniae-spezifischem Serum werden die Wildtypmäuse ähnlich betäubt und intratracheal (mit 25 CFU Bakterien) beimpft; die Tiere werden 2 Wochen später orbital geblutet, und das Serum wird erhalten.
Bestimmung von Plasma- und Lungen-CFU
Plasma- und Lungen-CFU wurden wie von M. Schneemann et al. [J. Infect. Dis. 167: 1358–1363 (1993)] beschrieben, bestimmt. Kurz gesagt wurden in 3 ml steriler Kochsalzlösung homogenisierte Lungen und bei Euthanasie gesammeltes Plasma auf Eis untergebracht, und es wurden 1:10 serielle Verdünnungen erstellt. Zehn μl jeder Verdünnung wurden auf Bluta garplatten auf Sojabasis (Difco) plattiert, 18 Std. bei 37°C inkubiert, und die Kolonien wurden gezählt.
Präparation und Analysen von Lungenhomogenaten
30 und 48 Std. nach der Beimpfung wurden die Mäuse betäubt und das Blut wurde durch orbitales Ausbluten gesammelt. Die Mäuse wurden dann über cervicale Dislokation getötet, und Voll-Lungen wurden zur Bestimmung der Cytokin-Spiegel, Myeloperoxidase-Aktivität (MPO) und Leukotrien-Spiegel geerntet. Für Cytokin- und Leukotrien-Analysen wurden die Lungen in 2 ml Puffer mit 0,5% Triton X-100, 150 mM NaCl, 15 mM Tris-HCl, 1mM CaCl₂ und 1 mM MgCl₂ homogenisiert. Die Homogenate wurden dann für 10 min. bei 1500 × g zentrifugiert, und die Überstände durch einen 1,2 μm Spritzenfilter filtriert, und sofort bei –20°C eingefroren. TNF, Makrophagen-Entzündungsprotein-1α, Makrophagen-Entzündungsprotein-2, Maus-JE, und IL-12 wurden jeweils mit einer Modifikation eines Doppelliganden-Verfahrens, wie von M. Schneemann et al. [J. Infekt. Dis. 167: 1358–1363 (1993)] beschrieben, quantifiziert. Für die Bestimmung der Leukotrien-Spiegel in Lungenhomogenaten, wurden die Proben auf C₁₈-Sep-Pak^®-Kartuschen^® (Waters) zur Entfernung von potentiell kreuzreaktiven Materialien extrahiert, und bis zur Trockne unter N₂ eingedampft. [J. Wilborn et al., J. Clin. Invest. 97: 1827 (1996)]. Ein analoges Verfahren wird mit der bronchoalveolaren Spülungsflüssigkeit verwendet.
Die Proben wurden in Testpuffer resuspendiert und LTB₄- und LTC₄-Spiegel wurden gemäß den Herstellerangaben mittels Enzym-Immunassay-Kits, erhalten von Cayman Chemical, bestimmt. Die MPO-Aktivität, ein Index für den Neutrophilen-Einstrom, wurde in Lungenhomogenaten, wie von M. Greenberger et al. [J. Immunol. 155: 722 (1995)] beschrieben, quantifiziert. Kurz gesagt wurden die Lungen in 2 ml Puffer mit 50 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 6,0, mit 5% Hexadecyltrimethylammoniumbromid und 5 mM EDTA homogenisiert. Das Homogenat wurde mit Ultraschall behandelt und zentrifugiert, und der Überstand wurde 1:15 mit Testpuffer (86 mM monobasisches Natriumphosphat, 12 mM dibasisches Natriumphosphat, 0,0005% [v/v] H₂O₂ und 0,167 mg/ml o-Dianisidinhydrochlorid) gemischt, und bei 490 nm (Beckman DU-64) abgelesen. Die MPO-Einheiten wurden als Änderung der Extinktion über die Zeit berechnet. Der Proteingehalt der Homogenate wird mit einer Mikrotiterplattenmodifikation (Pierce Biochemical) des Bradford-Verfahrens mit Rinderserumalbumin als Standard bestimmt.
Lungenspülung
Die Trachea wurde durch einen 0,5 cm Einschnitt freigelegt, und mit einem Polyethylenkatheter mit 1,7 mm OD intubiert. Die Bronchoalveolarspülung wurde durch Einträufelung von 1 ml-Aliquots phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 5 mM EDTA durchgeführt. Etwa 4 ml Spülungsflüssigkeit wurden je Maus wiedererlangt, und die Gesamtzellzahlen und differentielle Zellzahlen wurden aus Cytospins an jeder Probe bestimmt.
Alveoläre Makrophagenkultur und Funktionstests Für Tests der bakteriellen Phagocytose und Abtötung wurden alveoläre Makrophagen aus Zellen der Bronchoalveolarspülung gereinigt, durch Anheften für 1 Std. in HBSS gereinigt und in Monolayer-Kultur untersucht. Anhaftende Zellen wurden mit 5% K. pneumoniae-spezifischem Immunserum (als Quelle für Komplement- und spezifische opsonierende Antikörper) für 5 min. bei 37°C vor den Tests vorinkubiert. Die Phagocytose wurde untersucht durch Inkubieren von 10⁵ alveolären Makrophagen mit 10⁶ K. pneumoniae in jeder Vertiefung einer Labtek^®-Platte mit 8 Vertiefungen (Nunc) für 1 Std. bei 37°C; in einigen Fällen wurde exogenes LTB₄ (Cayman) gleichzeitig mit den Bakterien hinzugefügt. Die Überstände wurden abgesaugt, und die Zellen wurden dreimal mit HBSS gewaschen. Die Objektträger wurden dann an der Luft trocknen gelassen, es erfolgte eine Diff-Quick^® (Difco)-Färbung, und 200 Zellen pro Vertiefung wurden gezählt, um die Anzahl der intrazellulären K. pneumoniae und den Prozentsatz an alveolären Makrophagen, die Bakterien enthielten, zu bestimmen. Der Phagocytose-Index wurde als mittlerer Prozentsatz der alveolären Makrophagen berechnet, die Bakterien enthalten, multipliziert mit der mittleren Anzahl Bakterien pro alveolärem Makrophage.
Die bakterielle Aktivität wurde getestet durch Inkubation der gleichen Zahlen alveolärer Makrophagen und Organismen, wie oben eingehend beschrieben, für 1 Std. bei 37°C, jedoch in 35 mm-Gewebekulturschalen. Die Überstände wurden entfernt, und die Zellen wurden dann mit HBSS gewaschen und durch Zugabe von 1 ml kaltem sterilem Wasser lysiert, mit einem Gummispatel abgeschabt, und 10 min. auf Eis inkubiert. Ein ml 2× HBSS wurde zu jeder Platte gegeben, und die Lysate wurden auf Blutagarplatten seriell verdünnt. Die Platten wurden 18 Std. bei 37°C inkubiert und die Kolonien gezählt. Der Prozentsatz der Abtötung der intrazellulären Bakterien wurde durch die folgende Formel berechnet: 100 – (Anzahl der bakteriellen CFU/ml alveoläres Makrophagenlysat, dividiert durch die Gesamtzahl der intrazellulären Bakterien), wobei die intrazelluläre K. pneumoniae-Gesamtzahl das Produkt der Gesamtzahl der alveolären Makrophagen x Prozentsatz der alveolären Makrophagen, die Bakterien enthalten, x die mittlere Anzahl an Bakterien pro alveolärem Makrophage, ist.
Neutrophilen-Kultur und funktionelle Tests
Zur Gewinnung peritonealer angeregter Neutrophile wurden die Mäuse intraperitoneal mit 5% Glycogen in PBS beimpft, und die Peritonealspülung wurde 5 Std. später durchgeführt. Etwa 3 × 10⁶ Zellen wurden aus jedem Tier erhalten, von denen etwa 85 bis 90% Neutrophile sind. Diese Zellen werden für Funktionsuntersuchungen entsprechend in Kultur überführt. Die Phagocytose- und Bakterizidtests werden wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
Die Lungenspülung von mit K. pneumoniae provozierten Tieren ergab ein Gemisch von alveolären Makrophagen und Neutrophilen; sie werden in einem Verhältnis von etwa 1:1 2 Tage nach der Beimpfung gefunden, jedoch variiert das Verhältnis wahrscheinlich mit der Zeit. Zur Bestimmung der konstitutiven Sekretion von Leukotrienen durch diese Zellen, werden gemischte Bronchoalveolarspülungszellen in Kultur (5 × 10³ Zellen/Vertiefung) wie vorstehend für gereinigte Populationen beschrieben untergebracht; das Verhältnis der alveolären Makrophagen:Neutrophil in anhaftenden Monolayern wird bestimmt durch direktes Diff-Quick^®--Färben der Monolayer nach der Entfernung des Mediums bestimmt. In allen Fällen, wo die Leukotrienspiegel in Kulturmedium quantifiziert wurden, werden die Werte je μg Zellprotein ausgedrückt. Das Kulturmedium ist Medium 199 (Gibco).
In-Vivo-Verabreichung von Anti-Leukotrien-Medikamenten und Leukotrienen
Dosen von 5-LO-Inhibitor (A-79175; Abbott), LTB₄-Rezeptor-Antagonist (CP-105, 696: Pfizer) und Cysteinylleukotrienrezeptorantagonist (MK-571; Merck Research Laboratorien) werden in Methylcellulose suspendiert und einmal täglich oral an unbetäubte Mäuse mit einer 22 Gauge-Sondenfütterungsnadel verabreicht.
Ethanolische Stammlösungen von LTB₄, LTC₄ und 5-HETE (Cayman Chemical) wurden in Kochsalzlösung verdünnt und ein 10 μl-Volumen zur intratrachealen Injektion verwendet. Zur Bestäubung wurde eine Teilchengröße < 3 μm und eine Expositionskammer nur für die Nase verwendet.
Immunhistochemische Färbung auf 5-LO
Lungenschnitte, sowie Bronchoalveolarspülungs-Cytospins werden auf 5-LO gefärbt, um die Häufigkeit und die Typen der Zellen zu identifizieren, die eine Lokalisation von Enzym in die Kernhülle (ein "aktiviertes" Muster) aufweisen. [J. Wilborn et al., J. Clin. Invest. 97: 1827–1836 (1996)]. Kurz gesagt werden Proben in 4% Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und 3 μm dicke Schnitte werden ausgeschnitten und auf Superfrost/PLUS^®-Objektträgern (Fisher Scientific) befestigt. Paraffin wird mit Americlear^® (Baxter) entfernt und das Gewebe wird rehydratisiert. Zur Reduktion der nichtspezifischen Bindung wird das Gewebe mit Power Block^® (Biogenics), gefolgt von 25% normalem Ziegenserum, inkubiert.
Schnitte und Cytospins werden für 24 Std. bei 4°C mit entweder Kaninchen-anti-Mensch-5-LO-Antiserum (Merck Frost Canada) oder nichtimmunem Kaninchenserum bei 1:1000 in 25% normalem Ziegenserum in PBS inkubiert. Dieser Antikörper erkennt auch die Maus und Maus-5-LO. Ziege-anti-Kaninchen-IgG (1:600) wird dann für 30 min. angewendet, und primärer Antikörper wird mit True-Blue^®-Peroxidasesubstrat mit Contrast Red^®-Gegenfärbung (beide von KPL Laboratories) erfasst. Der Anteil der positiv gefärbten Zellen, die ein aktiviertes Muster aufweisen, wird aus den Zählungen von 20 Hochleistungsfeldern bestimmt. Die Zellen, die positiv auf 5-LO gefärbt wurden (von denen die meisten wahrscheinlich entweder Makrophagen oder Neutrophile sind) werden auf der Basis der Morphologie in Bezug auf den Zelltyp klassifiziert. Muss man alveoläre Makrophagen und Neutrophile unterscheiden, erfolgt eine doppelte Färbung. Eine zelltypspezifische Färbung erfolgt entweder mit einem zweiten primären (beispielsweise an ti-neutrophilen Antikörper) oder über histochemisches Färben (beispielsweise auf nichtspezifische Esterase oder MPO). Das zweite Protein wird durch Vector Red^® (Vector) erfasst, das die True-Blue^®-Färbung auf 5-LO kontrastiert.
Zelloberflächen-Expression von CR3 und FcR-Rezeptoren
Die Expression von CR3 und FcR wird in alveolären Makrophagen und in Neutrophilen durch Färben mit FITC-konjugierten monoklonalen anti-Maus-Antikörpern mit anschließender Analyse durch Durchflusscytometrie quantifiziert. [L. Laichalk et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 658: 1–7 (1996)]. Die FITC-konjugierten monoklonalen Antikörper (Phar-Mingen) umfassen anti-CR3-IgG₁, anti-FcRII/FcRIII-IgG₁ und eine anti-IgG₁-Isotypkontrolle. Experimentelle Inkubationen erfolgen in Suspension. Fünf × 10⁵ Zellen werden mit 1 μg monoklonalem Antikörper für 30 min auf Eis gefärbt, gewaschen, in 2% Paraformaldehyd fixiert und bei 4°C im Dunkeln bis zur Analyse aufbewahrt. Die Proben werden auf einem EPICS C-Durchflusscytometer mit der dazu gehörigen Software (Coulter Corp.), erhältlich an der University of Michigan Flow Cytometry Core Facility, analysiert, wobei mindestens 20000 Ereignisse pro Probe untersucht wurden. Nach der Korrektur auf die Färbung durch Kontroll-IgG, werden der Prozentsatz der positiv gefärbten Zellen und die mittlere Fluoreszenzintensität bestimmt.
Analyse der Aktin-Polymerisation
Der Einschluss anhaftender Teilchen oder Bakterien erfordert eine Cytoskelett-Umordnung, einschließlich einer lokalen Aktin-Polymerisation. Polymerisiertes Aktin (F-Aktin) wird analysiert durch Färben mit Rhodamin-Phalloidin (Molecular Probes) bei einer 1:300 Verdünnung. Die intrazelluläre Lokalisation von F-Aktin wird durch Immunfluoreszenz- Mikroskopie bestimmt. Die Zellen auf Deckgläschen werden mit Formalin fixiert und in Aceton permeabel gemacht. [T. G. Brock et al., J. Biol. Chem. 269: 22059–22066 (1994)]. Nach der Inkubation mit Phalloidin für 1 Std. werden die Zellen mit einem Nikon Labophot 2-Mikroskop untersucht, das zur Epifluoreszenz ausgestattet ist. Zur Quantifizierung des zellulären Gesamtgehaltes an F-Aktin werden die Zellen mit 0,1% Triton X-100 permeabel gemacht und mit Rhodamin-Phalloidin inkubiert und durch Durchflusszytometrie analysiert. [R. Crowell et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 12: 190 – 195 (1995)].
Bestimmung der Phagosomen-Lysosomen-Fusion
Anhaftende Zellen von Knockout- oder Wildtypmäusen werden durch Inkubation für 15 min. mit 5 μg/ml Akridin-Orange (Molecular Probes) vormarkiert. Die Zellen werden gewaschen, mit spezifischem Immunserum vorinkubiert, und dann bis zu 2 Std. mit K. pneumoniae allein oder in Gegenwart von exogenen Leukotrienen inkubiert. Die Zellen werden durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie untersucht. 200 Zellen pro Zustand werden gezählt, und der Prozentsatz an Zellen, die Fusion zeigen, sowie die Gesamtzahl der Fusionsfiguren werden aufgezeichnet.
Assays auf O₂ ^–, NO und β-Glucuronidase
Die Superoxid-Produktion durch 0,5–1,0 × 10⁶ anhaftende Zellen, inkubiert mit 0,5–1,0 × 10⁷ K. pneumoniae oder 100 nM Phorbolmyristatacetat wird aus der Superoxiddismutaseinhibierbaren Reduktion von Ferricytochrom C bestimmt. [L. Laichalk et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 658: 1–7 (1996)]. Der Test erfolgt in Platten mit 96 Vertiefungen, und es wird bei 550 nm abgelesen. Die NO-Entstehung wird durch Quantifizieren von Nitrit, seines Metabolits, in L-Argininangereichertem Kulturmedium von 10⁶ Zellen, inkubiert für 2 Std. mit Bakterien, bestimmt. [M. Schneemann et al., J. In fect. Dis. 167: 1358–1363 (1993)]. Das Medium wird zur Entfernung der Bakterien zentrifugiert, und die Überstände werden zu Griess-Reagenz (0,05% N-1-Naphthylethylendiamindihydrochlorid, 0,5% Sulfanilamid, 2,5% Phosphorsäure) gegeben, und in Platten mit 96 Vertiefungen für 10 min. inkubiert; die Extinktion wird bei 570/630 nm abgelesen. Das lysosomale Enzym β-Glucuronidase wird in Medium und Zelllysaten quantifiziert [W. Hsueh et al., Exp. Lung Res. 13: 385–399 (1987)], wobei das Reagenz 4-Methylumbelliferyl β-D-Glucuronidtrihydrat verwendet wird; die Fluoreszenz wird bei 374/455 nm gelesen.
Statistische Analyse
Die Daten wurden mit dem The Statview II^®-Statistik-Pack (Abacus Concepts) analysiert. Die Vergleiche für Überlebensdaten wurden mit der Chi-Quadrat-Analyse durchgeführt. Sämtliche andere Daten werden als Mittelwert ± SEM angegeben. Die Vergleiche zwischen den Behandlungsmaßnahmen erfolgten bei Bedarf (d.h. je nachdem ob die Daten parametrisch oder nicht-parametrisch sind) mit einem zweigabeligen Student-t-Test oder dem Wilcoxon Rank-Summentest. Für Vergleiche der Mittelwertdaten aus drei oder mehreren Experimentegruppen wird ANOVA oder eine anschließende Anwendung des Newman-Keuls-Test verwendet. Das Kriterium für Signifikanz war p ≤ 0,05.
BEISPIEL 1
Überleben nach der intratrachealen Klebsiella-Provokation in 5-LO-Knockoutmäusen und Wildtypmäusen
Die intratracheale Eingabe von K. pneumoniae in Mäuse verursacht bekanntlich eine reproduzierbare Pneumonie, die durch akute pulmonale Entzündung charakterisiert ist, die sich je nach dem Inoculum entweder auflöst oder zum Tode führt. [G. Rosen et al., FASEB J. 9: 200–209 (1995)]. Zur Bestimmung der Rolle von 5-LO-Produkten bei der pulmonalen Wirtsabwehr vergleicht diese Beispiel das Überleben von 5-LO-Knockout- und Wiltypmäusen.
Profile der Eicosanoide
Die 2A und B veranschaulichen RP-HPLC-Profile radioaktiver Eicosanoide, die durch vormarkierte alveoläre Makrophagen freigesetzt wurden, welche aus Wildtypmäusen (2A) und 5-LO-Knockoutmäusen (2B) erhalten wurden. Die Profile wurde erhalten durch Vormarkieren von 10⁶ alveolären Makrophagen über Nacht mit [³H]-Arachidonsäure. Die alveolären Makrophagen wurden dann gewaschen und für 30 min. mit 1 μm A23187 stimuliert. Das Medium wurde einer Lipid-Extraktion unterworfen, und die radioaktiv markierten Eicosanoide wurden durch Umkehrphasen-HPLC getrennt. Die Peaks wurden auf der Basis der Co-Elution mit authentischen Standards identifiziert. Verglichen mit Zellen aus Wildtyp-Kontrolltieren (2A) produzierten die alveolären Makrophagen aus KO-Tieren erwartungsgemäß keine Leukotriene oder 5-HETE. Darüber hinaus gab es keine gesteigerte Prostaglandinproduktion aus einem möglichen "Shunting" der Arachidonsäure. Dies zeigt, dass jegliche Reduktion der antimikrobiellen Abwehr in diesen Tieren wahrscheinlich auf ihre Defizienz der proinflammatorischen Leukotriene statt einer Überproduktion des antiinflammatorischen Prostaglandins E₂ zurückzuführen ist.
Maus-Überleben
Für dieses Experiment wurden 5-LO-Knockoutmäuse und zum gleichen Stamm gehörende (129/SvEv) Wildtypmäuse (10 Tiere je Gruppe) intratracheal mit 50 CFU Bakterien angeimpft, und das Überleben wurde über einen 12-Tages-Zeitraum überwacht. Die 3 zeigt graphisch die Auswirkung der K. pneumoniae- Provokation auf das Überleben in 5-LO-Knockoutmäusen (ausgefüllte Kreise) und Wildtypmäusen (offene Quadrate) (*p < 0,05 vs. WT). Den Ergebnissen der 3 zufolge führte die Verabreichung von 50 CFU Bakterien zu einer 60%igen Mortalität bei Wildtypmäusen innerhalb von 8 Tagen ohne anschließende Todesereignisse danach. Sämtliche Knockoutmäuse starben jedoch in Reaktion auf die gleiche Provokation, wobei sämtliche Todesereignisse bis zu Tag 10 eintraten. Die Todesereignisse in der Knockout-Gruppe erfolgten darüber hinaus früher als bei den Wildtyptieren.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Stoffwechselprodukte von 5-LO eine wichtige Rolle bei der schützenden Wirtsreaktion in diesem Pneumoniemodell spielen. Die Bedeutung der frühen Ereignisse nach der bakteriellen Provokation wird durch die Tatsache angegeben, dass die Überlebenskurven in 3 schon an Tag 2 divergieren.
BEISPIEL 2
Bakterien-Clearance nach intratrachealer Klebsiella-Provokation in 5-LO-Knockoutmäusen und Wildtypmäusen.
Wie im vorhergehenden Beispiel gezeigt sind die frühen Ereignisse nach der Bakterien-Provokation (d.h. etwa 2 Tage nach der Provokation) wichtig. Dieses Beispiel erklärt weiter diese Ergebnisse durch Bestimmung der Lungenhomogenat- und Plasma-CFUs 30 und 48 Std. nach der K. pneumoniae-Verabreichung.
Knockoutmäuse und Wildtypmäuse werden mit 50 CFU intratracheal beimpft, und die Lungenhomogenat-Spiegel und Plasma-CFU-Werte werden 48 Std. später bestimmt. Die 4 zeigt graphisch die Clearance von K. pneumoniae aus Lunge und Plasma nach der Provokation in 5-LO-Knockoutmäusen (schraffierte Balken) und Wildtypmäusen (ausgefüllte Balken) (die Balken veranschaulichen Mittelwerte ± SE; n = 5 bis 19 Tiere; *p < 0,05 vs. WT). Wie durch die Daten in 4 gezeigt, waren die mittleren Lunge- als auch Plasma-CFUs 48 Std. nach der Provokation fast zwei log größer in Knockoutmäusen als in Wildtypmäusen. Darüber hinaus war der Anteil der Knockout-Tiere, die zu diesem Zeitpunkt eine Bakteremie (15/19) entwickelten, signifikant größer als bei Wildtypmäusen (10/19). Bei einer zusätzlichen Gruppe von Tieren, die 30 Std. nach der Provokation untersucht wurden, waren 66% der Knockoutmäuse bakteremisch (mittlere Plasma-CFU 1,06 × 10⁵), wohingegen keine Wildtypmäuse zu diesem Zeitpunkt Bakterien in ihrem Plasma hatten (Daten nicht gezeigt).
Diese Daten bestätigen die Bedeutung eines intakten Leukotrien-erzeugenden Systems zur frühen Eindämmung einer pul-monalen Provokation mit K. pneumoniae.
BEISPIEL 3
Wirkung der Leukotrien-Defizienz und exogenen Leukotriene auf die alveolären Makrophagen-Antibakterien-Funktionen in vitro
Die Experimente dieses Beispiels bestimmen die Fähigkeit der alveolären Makrophagen selbst, der ersten Reihe der Zellabwehr, zur Phagocytose und Abtötung von K. pneumoniae in vitro und die Wirkung der Verabreichung exogener Leukotriene auf die antibakteriellen Funktionen alveolärer Makrophagen in vitro.
Phagocytose- und Bakterizid-Wirkungen alveolärer Makrophagen aus 5-LO-Knockout- und Wildtypmäusen
Alveoläre Makrophagen wurden durch Anheften der Bronchoalveolar-Spülungszellen gereinigt, die aus nicht infizierten Knockout- und Wildtyptieren gespült wurden, und für 5 min. mit 5% K. pneumoniae-spezifischem Immunserum (als Quelle für Komplement- und spezifische opsonierende Antikörper) vor den Tests vorinkubiert. Gezüchtete alveoläre Makrophagen aus je der Mäusegruppe wurden in Gegenwart von spezifischem Serum mit K. pneumoniae für 1 Std. inkubiert und dann gewaschen, wonach die Monolayer entweder mit Diff. Quik (Difco) gefärbt wurden und die intrazelluläre Organismen ausgezählt wurden, oder lysiert wurden und bakterielle CFUs in Lysaten nach einer Übernachtkultur bestimmt wurden. Der Phagocytose-Index und das intrazelluläre Abtöten wurden wie vorstehend eingehend in den allgemeinen Methoden beschrieben berechnet.
Die 5 veranschaulicht graphisch die Phagocytose- und Bakterizid-Wirkungen in alveolären Makrophagen, die aus 5-LO-Knockoutmäusen (schraffierte Balken) und Wildtypmäusen (ausgefüllte Balken) isoliert wurden; in 5 veranschaulicht jeder Wert den Mittelwert ± SEM von 6 Wiederholungskulturen (*p < 0,05 vs. WT). Den Daten der 5 zufolge zeigten die alveolären Makrophagen aus 5-LO-Knockoutmäusen signifikante Reduzierungen ihrer Fähigkeiten zur Aufnahme und Abtötung von K. pneumoniae im Vergleich zu Zellen aus Wildtypmäusen. Da das Abtöten der Mikroben von ihrer vorhergegangenen Aufnahme abhängt, spiegelt die Größe des Defekts der Wirtsabwehr in alveolären Makrophagen aus Knockoutmäusen das arithmetische Produkt dieser beiden einzelnen Defekte wider und beläuft sich auf etwa 60% Reduktion des Mikrobentötens unter den eingesetzten Bedingungen. Es wurde zwar zuvor berichtet, dass exogenes LTB₄ das Abtöten gramnegativer Bakterien durch Makrophagen in vitro und die Bakterien-Clearance in vivo steigert [T. Demitsu et al., Int. J. Immunopharmac. 11: 801–808 (1989)], jedoch zeigen die vorstehend offenbarten Daten eine wichtige Rolle für die endogenen 5-LO-Produkte bei diesen gleichen Prozessen in vivo und in vitro.
Auswirkung von exogenem LTB₄ auf die bakterielle Phagocytose-Aktivität alveolärer Makrophagen aus 5-LO-Knockout- und Wildtypmäusen
Weitere Experimente wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob die defekte Phagocytose von K. pneumoniae in alveolären Makrophagen aus 5-LO-Knockout-Tieren durch die Zugabe von exogenem LTB₄ bewältigt werden konnte. Dieses bestimmte Leukotrien wurde ausgewählt, weil wie vorher angezeigt, seine 1eukocytenaktivierenden Eigenschaften gut charakterisiert wurden.
Gezüchtete alveoläre Makrophagen aus Knockoutmäusen wurden in Gegenwart von spezifischem Serum für 1 Std. mit K. pneumoniae allein oder in Anwesenheit verschiedener Dosen von LTB₄ inkubiert. Der Phagocytose-Index wurde wie in den allgemeinen Methoden beschrieben berechnet. Die 6 veranschaulicht graphisch die Wirkung von LTB₄ (kein, 0,1 nM und 5 nM zugefügtes LTB₄) auf die bakterielle Phagocytose-Aktivität in alveolären Makrophagen aus 5-LO-KO-Mäusen; jeder Wert veranschaulicht den Mittelwert aus dreifachen Kulturen. Der 6 zufolge steigerte LTB₄ dosisabhängig den Phagocytose-Index in alveolären Knockout-Makrophagen mit einem Index, der etwa dreimal so hoch ist, wie die Grundlinie bei einer Konzentration von 5 mM. Es ist zwar zur Ausführung der Erfindung nicht erforderlich, jedoch nimmt man an, dass die Neutrophilen ähnliche funktionelle Defekte bei der Phagocytose und beim Abtöten manifestieren, was zur Empfindlichkeit gegenüber bakterieller Pneumonie beitragen könnte, die man bei Knockoutmäusen in vivo beobachtet.
Die Wirkungen von exogenem LTB₄ auf die Phagocytose durch Neutrophile aus 5-LO-Knockoutmäusen wurde ebenfalls untersucht. Durch Glycogen angeregte Neutrophile wurden aus der Peritonealhöhle von Knockoutmäusen erhalten, und die Phagocytose von K. pneumoniae über einen Zeitraum von 1 Std. wurde in Gegenwart und Abwesenheit von exogenem LTB₄ (1 nM) bewertet; unter diesen Umständen war der Phagocytose-Index 27 ± 8 bzw. 45 ± 4 (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse mit exo genem LTB₄ sind in mehreren Punkten wichtig. Erstens zeigen sie, dass der Phagocytose-Defekt in diesen Zellen tatsächlich mit der Defizienz von 5-LO einher geht, und es ist nicht koinzindiert. Zweitens, zeigt die Tatsache, dass die Zugabe von exogenem Leukotrien das Fehlen von 5-LO kompensieren konnte, dass der funktionelle Defekt in diesen Zellen kausal mit ihrer endogenen Leukotriendefizienz zusammenhängt; dieser Befund steht den Befunden anderer Forscher entgegen, die entdeckten, dass funktionelle Defekte in Leukocyten, die durch 5-LO-Inhibitoren verursacht wurden, nicht durch Zugabe exogener Leukotriene kompensiert werden konnte. [Siehe beispielsweise N. Hubbard und K. Erickson, Mol. Immunol. 160: 115–122 (1995)]. Drittens zeigt die Schnelligkeit der Steigerung der Phagocytose-Kapazität, die durch Zugabe von exogenem Leukotrien hervorgerufen wurde, dass diese Wirkung durch pulmonale Gabe dieses Lipids in vivo reproduziert werden kann; ein solcher rascher Anstieg der Bakterien-Clearance wurde bei der Injektion von LTB₄ in das Peritoneum in vivo beobachtet. [T. Demitsu et al., Int. J. Immunopharmac. 11: 801–808 (1989)].
BEISPIEL 4
Entzündungszellen und Vermittler nach intratrachealer Klebsiella-Provokation in 5-LO-Knockout- und Wildtypmäusen
Dieses Beispiel bewertet die Mechanismen, die für eine gesteigerte Anfälligkeit der Knockoutmäuse gegen eine Klebsiella-Pneumonie verantwortlich sind. Natürlich ist es selbstverständlich, dass ein Verständnis des Mechanismus nicht erforderlich ist, um die vorliegende Erfindung auszuüben.
Wildtypmäusen wurde intratracheal entweder 50 CFU Bakterien (Klebsiella pneumoniae) oder nur Kochsalz-Verdünnungslösung injiziert. Zwei Tage später wurden die Lungen geerntet und homogenisiert. Die Homogenate wurden einer Lipidextraktion unterworfen, und die immunreaktiven Leukotriene B₄ und C₄ wurden quantifiziert. Die 7 zeigt graphisch Lungenhomogenatspiegel von LTB₄ (schraffierte Balken) und LTC₄ (ausgefüllte Balken) nach der Provokation mit entweder K. pneumoniae oder Kochsalzlösung (Werte veranschaulichen Mittelwert ± SEM; n = 5 Tiere; *p < 0,05 vs. Kochsalzlösung).
Den Ergebnissen der 7 zufolge waren die B₄- und C₄-Spiegel in den Lungenhomogenaten der Wildtypmäuse 48 Std. nach der Provokation mit Bakterien verglichen mit Kochsalzlösung erhöht. Da LTB₄ ein leistungsfähiges Neutrophilen-Chemotaxin in Mäusen ist und die Neutrophilen-Rekrutierung als wesentliche Komponente der bakteriellen Clearance angesehen wird, zeigt das Vorhandensein hoher LTB₄-Spiegel in Lungen von mit Bakterien provozierten Wildtyptieren, dass die gesteigerte Anfälligkeit gegenüber Pneumonie in Knockouttieren eine reduzierte Kapazität zur Rekrutierung von Neutrophilen zum infizierten Organ widerspiegelt. Zur Bewertung dieser Möglichkeit wurden direkte Zählungen der Neutrophile der Bronchoalveolarspülung von Cytospins (8) vorgenommen, und die Lungenhomogenat-MPO-Aktivität wurde spektralphotometrisch untersucht (nicht gezeigt) [M. Greenberger et al., J. Immunol. 155: 722–729 (1995)]. Knockout- und Wildtypmäuse wurden intratracheal entweder mit 50 CFU Bakterien oder nur Kochsalz-Verdünnungslösung beimpft. Zwei Tage später wurde eine Lungenspülung durchgeführt, und die Gesamt-Neutrophilenzahl wurde bestimmt. 8 zeigt graphisch die Wirkung der K. pneumoniae-Provokation auf die Spülungs-Neutrophilie in 5-LO-Knockout- (schraffierte Balken) und Wildtypmäusen (ausgefüllte Balken) (die Werte stellen Mittelwert ± SEM dar; n = 3 bis 12 Tiere; *p < 0,05 vs. Kochsalzlösung; ND, nicht erfasst).
Beide Techniken zeigten, dass ein signifikanter Grad von Neutrophileneinstrom nach 48 Std. in den mit Bakterien provozierten verglichen mit den mit Kochsalzlösung provozierten Wildtyp-Lungen auftrat. Überraschend zeigten die Knockoutmäuse keinen geringeren Neutrophilen-Einstrom nach der Bakterien-Provokation als die Wildtypmäuse.
Der genaue Mechanismus ist zwar zur Ausübung der Erfindung nicht erforderlich, jedoch wurden Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob die intakte Kapazität für die Neutrophilen-Rekrutierung in diesem Maus-Modell einen kompensatorischen Anstieg in Knockout-Tieren zur Erzeugung von alternativen chemotaktischen Signalen, wie Chemokinen, widerspiegelt. Eine Bewertung der Spiegel von antigenem MIP-1α, MIP-2 und JE (dem Maus-Homologon des Monocyten-Chemotaxis-Peptid-1) in Homogenaten von mit Klebsiella provozierten Lungen zum gleichen Zeitpunkt (d.h. 48 Std. nach der Provokation) offenbarte keine signifikanten Unterschiede zwischen Knockout- und Wildtypmäusen (Daten nicht gezeigt). Ein Verständnis des Mechanismus ist zwar zur Ausübung der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich, jedoch ist es alternativ möglich, dass die Knockouttiere eine gesteigerte Erzeugung von Komplement-Komponenten oder eine erhöhte Reaktionsfähigkeit gegenüber Chemokinen oder Bakterien-Chemotaxine aufweisen können.
IL-12 und TNF sind zwar nicht direkt chemotaktisch, jedoch wurde gezeigt, dass sie entscheidende Schutzrollen in diesem Modell der Maus-Pneumonie spielen. Zudem wird die TNF-Produktion durch Leukotriene in einigen Experimentsystemen vervielfacht. Zur Untersuchung der Möglichkeit, dass die gesteigerte Anfälligkeit von Knockoutmäusen gegenüber einer bakteriellen Provokation eine gestörte Fähigkeit zur Erzeugung eines dieser Cytokine betreffen könnte, wurden die Lungenhomogenate 48 Std. nach der bakteriellen Provokation ana lysiert. Wiederum wurden keine signifikanten Unterschiede in antigenen IL-12- oder TNF-Spiegeln zwischen infizierten Knockout- und Wildtypmäusen gefunden (Daten nicht gezeigt). Somit spiegelt die gesteigerte Letalität von Pneumonie in 5-LO-Knockoutmäusen keine verringerte Kapazität zur Produktion dieser proinflammatorischen Cytokine wider.
BEISPIEL 5
Wirkung von exogenen Leukotrienen auf die antibakteriellen Funktionen der alveolären Makrophagen in vitro
Wie bereits beschrieben erhöhte exogenes LTB₄ den Phagocytose-Index von 5-LO-Knockout-Alveolen-Makrophagen um etwa 300, mehr als es nötig ist, um lediglich den Kontrollspiegel zu halten, der von den Wildtypzellen manifestiert wird (etwa 50% Anstieg). Das Ergebnis zeigt, dass das Leukotrien eine pharmakologische Wirkung aufweist. Die Experimente dieses Beispiels bewerten zudem die Wirkungen von exogenem LTB₄ auf die Phagocytose-Kapazität normaler alveolärer Makrophagen und untersuchen die Wirkungen anderer 5-LO-Produkte neben LTB₄.
Alveoläre Makrophagen von Wistarratten wurden angeheftet und dann für 1 Std. mit K. pneumoniae allein oder in Gegenwart von 1 nM mehrerer 5-LO-Metabolite (LTB₄, LTC₄ und 5-HETE) inkubiert. Der Phagocytose-Index wurde anschließend wie vorstehend in den allgemeinen Methoden beschrieben bestimmt.
Die 9 zeigt graphisch die Wirkung der exogenen 5-LO-Metabolite auf die bakterielle Phagocytose-Aktivität in normalen alveolären Makrophagen der Ratte. Jeder Wert in 9 veranschaulicht den Mittelwert ± SEM von 4 wiederholten Kulturen. Wie die Daten zeigen, evozierte LTB₄ einen etwa 6fachen Anstieg des Phagocytose-Index bei normalen alveolären Makrophagen der Ratte. Der Metabolit 5-HETE hatte eine ähnliche, jedoch weniger ausgeprägte Wirkung. Interessanterweise steigerte LTC₄ die Phagocytose bis zu einem ähnlichen Grad wie LTB₄. Es wurde zwar beobachtet, dass Cysteinylleukotriene wie LTC₄ die Oberflächen-FcR-Expression in Makrophagen hochreguliert, jedoch wurde eine gesteigerte Phagocytose-Kapazität bisher nicht beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die exogenen Leukotriene als Gruppe eine ausgeprägte pharmakologische Wirkung auf die normale alveoläre Makrophagen-Funktion haben.
Ein verwandtes Experiment wurde ebenfalls durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Fähigkeit von exogenem LTB₄ zur Steigerung der bakteriellen Phagocytose durch seine Wechselwirkung mit LTB₄-Rezeptoren vermittelt wird. Dieses Experiment beruhte auf der Tatsache, dass die Vorbehandlung mit LTB₄ Zellen zu einer anschließenden LTB₄-Reaktionsfähigkeit desensibilisiert; obwohl ein Verständnis des Mechanismus dieser Wirkung nicht erforderlich ist, um die vorliegende Erfindung auszuüben, nimmt man an, dass die Desensibilisierung durch ein Herunterregulieren der Rezeptorexpression oder Kopplung erfolgt. Für dieses Experiment wurden die Zellen mit LTB₄ (1 nM) für 1 Std. vorinkubiert, gewaschen und mit Bakterien plus LTB₄ inkubiert.
Die Ergebnisse, die in 9 graphisch durch den mit "LTB₄ → LTB₄" beschrifteten Balken veranschaulicht werden, zeigen, dass die Vorbehandlung mit LTB₄ fast vollständig die Fähigkeit dieser gleichen LTB₄-Dosis (1 nM) außer Kraft setzte, die Phagocytose von K. pneumoniae zu steigern, wenn es gleichzeitig mit den Bakterien zugefügt wurde. Diese Befunde zeigen, dass die LTB₄-Rezeptoren an der Steigerung der durch LTB₄ induzierten alveolären Makrophagen-Phagocytose beteiligt sind.
BEISPIEL 6
Wirkung der intratrachealen LTB₄-Verabreichung auf die pulmonale Bakterien-Clearance durch Knockoutmäuse
Da es sich herausstellte, dass 5-LO-Knockoutmäuse eine reduzierte pulmonale Clearance von K. pneumoniae in vivo zeigten und exogene Leukotriene den In-vitro-Phagocytosedefekt, der in alveolären Makrophagen aus Knockoutmäusen beobachtet wird, bewältigten, erfolgte ein Experiment, um die Wirkung der intrapulmonalen Verabreichung von Leukotrien auf die Bakterien-Clearance in vivo zu bewerten.
LTB₄ wurde zusammen mit dem intratrachealen Inoculum von K. pneumoniae (50 CFU) verabreicht. Eine intratracheale Dosis von 6 ng LTB₄ je Tier wurde aus zwei Gründen gewählt. Erstens fanden andere Forscher zuvor, dass diese Dosis und dieser Weg zu einem lebhaften Neutrophilen-Einstrom 6 Std. nach der Verabreichung an Mäusen führte. [N. Ahmed et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153: 1141–1147 (1996)]. Zweitens fanden die Erfinder zuvor (siehe 5), dass etwa 7 ng gesamt-LTB₄ in dem Homogenat eines Lungenpaars von mit Klebsiella provozierten Wildtypmäusen gemessen werden konnte. Drei Gruppen von Tieren wurden intratracheal mit Bakterien provoziert (n = 4 Tiere je Gruppe): i) Wildtypmäuse, ii) 5-LO-Knockoutmäuse, und iii) 5-LO-Knockoutmäuse, die gleichzeitig mit LTB₄ behandelt wurden. Nach 24 Std. Bakterienbeimpfung wurden die Lungen geerntet, und die CFUs im Lungenhomogenat wurden bestimmt.
Die 10 zeigt graphisch die Wirkung der intratrachealen Verabreichung von LTB₄ auf die defekte Bakterien-Clearance der Lunge in 5-LO-Knockoutmäusen (jeder Wert veranschaulicht den Mittelwert ± SEM). Die in der 10 gezeigten Daten bestätigen den vorherigen Befund (4), dass Knockoutmäuse 100mal mehr Organismen in ihren Lungen hatten als Wildtyp-Tiere; man beachte, dass die absoluten CFUs in diesem Experiment niedriger waren, weil die Analyse 24 Std. nach dem Animpfen statt nach 48 Std. erfolgte. Bedeutenderweise reduzierte die einzige intratracheale Dosis von LTB₄, die gleichzeitig mit dem Bakterien-Inoculum verabreicht wurde, die Lungen-CFU etwa 10fach in Knockoutmäusen. Die Ergebnisse zeigen, dass exogenes LTB₄ die pulmonale Clearance von K. pneumoniae in diesen leukotriendefizienten Mäusen steigern kann. Darüber hinaus zeigen sie, dass Leukotriene effiziente Therapeutika im Milieu der gramnegativen Pneumonie sein sollten.
BEISPIEL 7
Die Rollen und Wirkmechanismen der 5-LO-Produkte in der Wirtsreaktion auf K. pneumoniae
Die vorstehend beschriebenen Beispiele, die eine intratracheale Klebsiella-Provokation in 5-LO-Knockoutmäusen einsetzen, zeigen, dass das Enzym in vivo eine Rolle bei der pulmonalen antibakteriellen Wirtsabwehr spielt. Die Experimente dieses Beispiels betreffen die Sicherstellung der Rollen und Wirkmechanismen der 5-LO-Produkte bei der Wirtsreaktion gegen K. pneumoniae mittels Knockoutmäusen sowie Mäusen, die mit pharmakologischen Mitteln behandelt wurden, die die Leukotrien-Synthese oder -Wirkungen hemmen. Insbesondere betreffen die Experimente dieses Beispiels die Unterscheidung der Rolle von LTB₄ vs. Cysteinylleukotrienen durch Vergleich der Wirkungen einer Reihe pharmakologischer Mittel, einschließlich denen, die beide Klassen von Leukotrienen (5-LO-Inhibitor) anzielen, denen, die nur LTB₄ (LTB₄-Rezeptor-Antagonist) anzielen, und denen die nur Cysteinylleukotriene (Cysteinylleukotrien-Rezeptor-Antagonisten) anzielen.
Das Mausmodell, das die intratracheale Provokation von Mäusen mit 50 CFU K. pneumoniae beinhaltet, wird bei den Experimenten dieses Beispiels eingesetzt. Zur pharmakologischen Wechselwirkung mit der Leukotrien-Synthese oder -Wirkung werden Wildtypmäuse mit verschiedenen anhaltend wirkenden Mitteln (nachstehend offenbart) durch den oralen Weg (Sondenfüt terung) behandelt, wobei die tägliche Dosierung am Morgen des Tages vor der Verabreichung der Bakterien begann. In sämtlichen Fällen wurde die Spezifität der zu verwendenden Mittel etabliert, und die Auswahl der Dosen und die Dosierungsschemata werden durch die veröffentlichte Erfahrung bei Nagetieren geführt. Auf der Basis der vorhergegangenen Dosis-Reaktions-Experimente, die drei Dosen pro Mittel und n = 4 Tieren pro Dosis einsetzen, wird eine einzelne maximal effiziente Dosis jedes Medikamentes aufgrund von Bestimmungen bestimmt, die 24 Std. nach dem Start der Behandlung erfolgten.
Die spezifischen Mittel und vorläufigen Dosisbereiche, die getestet wurden, umfassen folgendes: i) den 5-LO-Inhibitor A-79175 (Abbott) in einer Dosis von 1 bis 3 mg/kg; dies ist ein kompetitiver Enzyminhibitor, der ein kompetitiver Inhibitor ist, der ein leistungsfähigerer und länger wirkender Verwandter von Zileuton^® mit einer bewiesenen Effizienz in Mäusen als orales Mittel für die einmal täglich erfolgende Verabreichung; ii) den LTB₄-Antagonist CP-105,696 (Pfizer) in einer Dosis von 1 bis 10 mg/kg; diese Verbindung hat die kollageninduzierte Arthritis in Mäusen gehemmt, wenn es in einer einmal täglichen Dosis verabreicht wurde; und iii) den LTD₄-Antagonist MK-571 (Merck) in einer Dosis von 0,1 bis 1 mg/kg; diese Verbindung hat die antigen-induzierte Bronchokonstriktion bei der oralen Verabreichung an Ratten effizient gehemmt.
Sobald die optimale Dosis jedes Mittels definiert ist, werden Überleben und bakterielle Clearance-Experimente gesondert durchgeführt, wobei jeweils eine K. pneumoniae-Provokation der folgenden fünf Gruppen von Mäusen (n = 10 pro Gruppe) beteiligt ist: i) Wildtypmäuse, die mit Vehikel behandelt wurden; ii) Wildtypmäuse, die mit dem 5-LO-Inhibitor behandelt wurden; iii) Wildtypmäuse, die mit dem LTB₄-Antagonisten behandelt wurden; iv) Wildtypmäuse, die mit dem Cysteinylleukotrien-Antagonisten behandelt wurden; und v) 5-LO-Knockoutmäuse, die mit Vehikel behandelt wurden. Die In-vivo-Effizienz wird durch die folgenden Kriterien beurteilt. 5-LO-Hemmung wird durch Quantifizieren der pulmonalen Produktion von LTB₄ (quantifiziert in Lungenspülungsflüssigkeit) nach der intratrachealen Eingabe des Ionophors A23187 in den mit Medikamenten behandelten Tieren bewertet [W. Smith et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 275: 1332–1338 (1995)]. Der LTB₄-Antagonismus wird durch Quantifizieren der ex vivo mit LTB₄ stimulierten Hochregulation der CR3-Expression auf Neutrophilen in Vollblut aus medikamentenbehandelten Tieren bestimmt. Cysteinylleukotrien-Rezeptor-Antagonsimus wird bestimmt durch Quantifizieren des Evans-Blue-Farbstoff-Austritts nach der intradermalen Verabreichung von LTD₄. [J. Drazen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4354–4358 (1980)].
Das Tierüberleben wird bis zum Tod oder bis Tag 14 überwacht. Für die bakterielle Clearance wird die bakterielle CFU in Voll-Lungenhomogenaten und Plasma, erhalten aus Tieren, die an Tag 1 und 3 nach der Klebsiella-Provokation getötet wurden, bestimmt. Schließlich wird der Lungen-Neutrophilen-Einstrom zu Beginn durch die MPO-Aktivität der Voll-Lungenhomogenate aus den gleichen Tieren bestimmt, die für die vorstehenden CFU-Bestimmungen verwendet wurden; legen die MPO-Tests nahe, dass die aktive Medikamenten-Behandlung zu einer Reduktion des Neutrophileneinstroms führt, wird ein zusätzliches Experiment durchgeführt (da die Spülung und die Homogenisation nicht im gleichen Tier durchgeführt werden können), wobei eine solche Wirkung durch bronchoalveoläre Spülzell-Zahlen und Unterschiede der mit Medikament vs. Vehikel behandelten Tiere verifiziert wird.
Man beachte, dass die Bestimmung des relativen Beitrags zur Wirtsabwehr des endogen synthetisiertem LTB₄ vs. LTC₄ folgendes ermöglicht, nämlich: i) das Design der therapeutischen Untersuchungen, die eine Verabreichung exogener Leukotriene einsetzen, und ii) die Bestimmung möglicher Risiken für die Infektionsanfälligkeit von beispielsweise 5-LO-Inhibitoren (die die Synthese von LTB₄ und Cysteinylleukotrienen parallel hemmen) und Cysteinylleukotrien-Rezeptor-Antagonisten (die die Wirkungen der Cysteinylleukotriene selektiv hemmen, ohne diejenigen von LTB₄ zu beeinträchtigen).
Wenn die direkte Hemmung von 5-LO das Überleben und die Bakterien-Clearance in diesem Maus-Pneumonie-Modell auf ähnliche Weise wie die 5-LO-Defizienz hemmt, werden die relativen Rollen von endogenem LTB₄ vs. Cysteinylleukotrienen durch die Anwendung von Rezeptorantagonisten bestimmt, die die Wirkungen dieser beiden Gruppen von Mediatoren selektiv blockieren. LTB₄ ist zwar der 5-LO-Metabolit, der am häufigsten an leukocytenabhängigen Entzündungsreaktionen beteiligt ist, jedoch legen vorher erzeugte Phagocytose-Daten nahe, dass Cysteinylleukotriene vergleichbare Verstärkungseffekte haben. Reproduzieren die Anti-Leukotrien-Mittel nicht die Wirkungen der 5-LO-Gendefizienz, liegt dagegen nahe, dass 5-LO die antibakterielle Abwehr durch einen Mechanismus verstärkt, der von seiner katalytischen Aktivität unabhängig ist. Beeinträchtigen pharmakologische Inhibitoren/Antagonisten die Wirtsabwehr, erfolgt eine Bestimmung, ob der relevante Mechanismus von der Störung der Neutrophilen-Rekrutierung zur Lunge unabhängig ist. Schließlich wird die Möglichkeit erwogen, dass die Anti-Leukotrien-Therapie die Wirtsreaktion auf eine Klebsiella-Pneumonie verstärkt (d.h. die Leukotriene steigern und stören die Wirtsreaktion). Tatsächlich können Ergebnisse, die anzeigen, dass jeder dieser entgegengesetzten Effekte in verschiedenen Phasen der Reaktion überwiegt, die Verwendung der pharmakologischen Mittel garantieren, die in bestimmten Intervallen eingesetzt werden.
BEISPIEL 8
Kinetiken, Profil und Zellquellen der Leukotriene, produziert in der Maus-Lunge im Verlauf der Klebsiella-Pneumonie
Die in den vorherigen Beispielen beschriebenen Experimente (siehe beispielsweise 3) zeigten, dass sowohl LTB₄ als auch LTC₄ 48 Std. nach der bakteriellen Provokation in hohen Spiegeln in Lungenhomogenaten zugegen sind. Die Experimente in diesem Beispiel betreffen die Bestimmung, welche Leukotriene in der Lunge zu verschiedenen Zeitpunkten nach der K. pneumoniae-Provokation produziert werden, und welche Zelltypen verantwortlich sind. Die anfängliche experimentelle Aufgabe ist die Quantifizierung der Leukotriene in Lungenhomogenaten und Bronchoalveolarspülflüssigkeit aus Mäusen zu bestimmten Zeitpunkten nach der Klebsiella-Provokation. Auf der Basis dieser Daten werden Zeitpunkte für weitere Studien ausgewählt, die so ausgelegt sind, dass die Zellquellen der Leukortiene bestimmt werden durch i) immunhistochemische Färbung zur Identifikation von Zellen, die eine intrazelluläre Verteilung von 5-LO, zusammen mit einer Enzymaktivierung aufweisen, und ii) Messen der konstitutiven Leukotrien-Produktion durch Zellen, die aus pneumonischen Lungen isoliert wurden.
Zu Beginn wurden 129/SvEv-Wildtypmäuse intratracheal entweder mit Kochsalzlösung oder mit 50 CFU K. pneumoniae beimpft, und die Lungen werden 8 Std. und 1, 2, 3, 5 und 7 Tage nach dem Animpfen geerntet. Für jeden dieser Zeitpunkte nach der Kochsalzlösung- oder Bakterien-Beimpfung werden Voll-Lungenhomogenate präpariert (n = 5 Tiere je Gruppe) und sowohl LTB₄ als auch LTC₄ werden in den Homogenaten durch Immunoassay bestimmt. In anderen Tieren (n = 3), werden Lungenschnitte für die Immunhistochemie angefertigt (siehe unten). Parallel wird ein identisches Experiment durchgeführt, bei dem die Lungenspülung durchgeführt wird; bei jedem Zeitpunkt (n = 5 Tiere je Gruppe) werden Bronchoalveolarspülungs-Cytospins erstellt, und die Spiegel der Leukotriene werden in zellfreier Spülungsflüssigkeit bestimmt. Die Spiegel von LTB₄ und LTC₄ in Spülflüssigkeit und in Lungenhomogenaten werden miteinander und mit dem Grad des Neutrophileneinstrom (bestimmt aus der MPO-Aktivität in Homogenaten und Zellzahlen und Differentialen aus den Cytospins der Bronchoalveolarspülungsflüssigkeit) korreliert.
Die zellulären Quellen der Leukotrienproduktion in der Lunge wird nach 8 Std., 1 Tag und 3 Tagen bestimmt, und andere Zeitpunkte, die durch die vorstehenden Kinetikassays identifiziert wurden, zeigen maximale Spiegel der Leukotriene B₄ oder C₄. Die immunhistochemische Färbung auf 5-LO erfolgt an Lungenschnitten zusammen mit den Bronchoalveolasspülungs-Cytospin-Präparaten aus Mäusen die mit Klebsiella und Kochsalzlösung provoziert wurden, um zu bestimmen, ob die alveolären Makrophagen, Neutrophile oder beide Zelltypen eine intrazelluläre Verteilung von 5-LO zeigen, die für eine Enzymaktivierung charakteristisch ist (d.h. die Färbung konzentrierte sich an der Kernhülle). Die Bestimmung der 5-LO-Aktivierung in Lungengewebe in situ durch dieses Verfahren hat den Vorteil, dass es keine Zellisolation oder Kultur erfordert, so dass Bedenken über potentielle Artefakte, die durch diese Verfahren eingeschleppt werden könnten, umgangen werden. Man beachte, dass dieser Ansatz bei der idiopathischen pulmonalen Fibrose verwendet wurde, um zu zeigen, dass alveoläre Makrophagen, die durch Bronchoalveolarspülung aus Patienten mit idiopathischer pulmonaler Fibrose isoliert wurden, sogar bei Fehlen eines exogenen Agonisten konstitutiv Leukotriene überproduzieren, wenn sie in Kultur untergebracht wurden. [J. Wilborn et al., J. Clin. Invest. 97: 1827–1836 (1996)].
Wie vorstehend beschrieben besteht eine Überproduktion von Leukotrienen in Lungengewebe bei 2 Tagen nach der bakteriellen Provokation. Zur Bestimmung, ob die Bronchoalveolarzellen aus bakterienbeimpften Tieren weiterhin Leukotriene erzeugen, nachdem sie derart in Kultur gebracht wurden, die ihrer vorherige Generation in vivo widerspiegelt, werden unfraktionierte Bronchoalveolarspülungszellen (10⁶ Zellen) zu den vorstehend genannten Zeitpunkten erhalten, in Kulturschalen plattiert, und die kumulative Produktion der Leukotriene B₄ und C₄ wird durch Immuntest von Kulturmedium nach Übernachtkultur (etwa 16 Std.) bestimmt; Bronchoalveolarspülungszellen aus Kontrolltieren werden zum Vergleich untersucht (n = 5 Tiere je Behandlung je Zeitpunkt). Nach der Übernachtkultur werden Unterschiede der haftenden Zellen durch Wright's und durch Esterasefärbung bestimmt.
Man beachte, dass die Untersuchung gemischter Zellpopulationen keine Schwierigkeiten bei der Zuordnung der Leukotrienerzeugung zu einem bestimmten Zelltyp bei dem 8 Std.-Zeitpunkt aufwerfen sollte, weil zu diesem Zeitpunkt eine relativ reine Population alveolärer Makrophagen besteht. Zudem synthetisieren alveoläre Makrophagen und Neutrophile einzigartige Profile der Leukotrienprodukte; somit produzieren alveoläre Makrophagen in erster Linie LTC₄ (2A), wohingegen Neutrophile in erster Linie LTB₄ synthetisieren. Die Leukotrien-Profile, die von kultivierten Bronchoalveolarspülungszellen erzeugt werden, schaffen, wenn sie in Zusammenhang mit den immunhistochemischen Daten interpretiert werden, einen starken Beweis für die Beteiligung jedes Zelltyps. Schließlich ermöglicht die Untersuchung gemischter Spülungszellen, dass potentielle Neutrophilen-Alveolen-Makrophagen-Wechselwirkungen bei der Leukotriensynthese stattfinden, wie sie es unweigerlich in vivo durchführen.
Das Wissen um die Kinetiken der endogenen Produktion von LTB₄ vs. LTC₄ ist in mehreren wichtigen Gesichtspunkten hilfreich. Erstens liefert es eine Anleitung beim Erstellen der "therapeutischen" Experimente (nachstehend beschrieben), wobei die pulmonale Verabreichung exogener Leukotriene beteiligt ist. Zweitens liefert die Bestimmung der Beiträge alveolärer Makrophagen und Neutrophile als Quellen für die Produktion dieser Vermittler eine grundlegende Information über die Biologie der Wirtsreaktion. Schließlich hat das Wissen um die geeigneten Zellquellen der Leukotriene in dem Milieu der bakteriellen Pneumonie dahingehend einen potentiellen diagnostischen Nutzen, dass die Dokumentation der defizienten Leukotrienproduktion dabei helfen kann, Patienten zu identifizieren, die Kandidaten für eine exogene pulmonale Leukotrien-Supplementation sind, damit die innere Immunität gesteigert wird.
BEISPIEL 9
Molekularer Mechanismus, durch den spezifische 5-LO-Produkte die Phagocytose und das Abtöten von K. pneumoniae in alveolären Makrophagen und Neutrophilen steigern
Die Experimente dieses Beispiels klären die molekularen Mechanismen auf, durch die spezifische 5-LO-Metabolite die Phagocytose und das Abtöten steigern. Insbesondere umfassen die Experimente dieses Beispiels die Zugabe verschiedener Lipide zu alveolären Makrophagen und angeregten Neutrophilen, die sowohl aus Knockoutmäusen als auch aus Wildtypmäusen erhalten wurden, um die Größe der Auswirkungen und Wirkmechanismen für verschiedene 5-LO-Produkte in beiden Zelltypen zu vergleichen. Diese Experimente liefern eine Maßnahme für i) eine weitere Bewertung des therapeutischen Nutzens der Leukotriene, und ii) eine Bewertung des Nutzens der jeweiligen molekularen und/oder biochemischen Marker als Endpunkte, die in den nachstehend in Beispiel 10 beschriebenen In-vivo-Leukotrien-Behandlungsstudien untersucht werden sollen.
Wie nachstehend eingehend beschrieben charakterisieren einleitende Experimente die Wirkungen der In-vitro-Inkubation mit exogenen 5-LO-Produkten auf die rohen Endpunkte der Phagocytose und das Abtöten von K. pneumoniae. Ein Verständnis der molekularen Mechanismen ist zwar nicht erforderlich, um die vorliegende Erfindung auszuüben, weil die molekularen Mechanismen, die die bakterielle Phagocytose und das Abtöten vermitteln, in Neutrophilen und Makrophagen ziemlich ähnlich sind, und es einen starken Beweis gibt, der Rollen für den 5-LO-Pfad bei Funktionen beider Zelltypen impliziert, jedoch werden Untersuchungen in alveolären Makrophagen und glycogenangeregten peritonealen Neutrophilen aus Mäusen (die Reinheit beider Populationen übersteigt 90%) durchgeführt. Man beachte, dass es gezeigt wurde, dass die Rekrutierung der Neutrophilen zum Peritoneum nach der Glycogen-Anregung nicht in 5-LO-Knockoutmäusen gestört ist. [X. Chen et al., Nature 372: 179–182 (1994)]. Angeregte Neutrophile werden anstelle peripherer Blutneutrophile untersucht, und zwar wegen der Möglichkeit, dass der Prozess der Rekrutierung und/oder das Verweilen in einem Entzündungsmilieu selbst den zellulären Phänotyp verändert. Zudem werden Zellen, die sowohl aus Wildtyp- als auch aus Knockoutmäusen erhalten wurden, untersucht.
Spezifisch werden 10⁵ Zellen für 1 Std. mit Bakterien und Lipiden in Anwesenheit von 5% Immunserum gemeinsam inkubiert, und der Phagocytose-Index und die Bakterizid-Aktivität werden wie vorstehend unter Allgemeine Verfahren beschrieben bestimmt. In jedem Experiment ist eine Vehikel-Kontrolle enthalten. Die zu untersuchenden exogenen 5-LO-Metabolite (jeweils 10^–11 bis 10^–7 M) sind i) LTB₄, ii) LTC₄; und iii) 5-HETE. Kombinationen dieser Lipide werden ebenfalls bewertet.
Für 5-LO-Produkte, die stimulatorische Wirkungen auf die Phagocytose oder das Abtöten haben, wird die Fähigkeit spezifischer Rezeptorantagonisten (in Beispiel 7 beschrieben) zur Aufhebung dieser Wirkungen ebenfalls untersucht. Sämtliche Untersuchungen werden sowohl mit Neutrophilen als auch mit alveolären Makrophagen durchgeführt, um zu gewährleisten, dass Fälle, in denen eine gegebene Verbindung verschiedene Wirkungen auf die Phagocytose in den beiden Zelltypen ausübt und ähnliche Wirkungen (obgleich durch verschiedene Mechanismen vermittelt) in den beiden Zelltypen ausübt, identifiziert werden. Sobald ein molekularer Mechanismus für eine Wirkung auf die Phagocytose identifiziert ist (beispielsweise durch LTB₄) wird die Fähigkeit der entgegenwirkenden Verbindung (d.h. der LTB₄-Rezeptor-Antagonist) zur Modulation dieses gleichen molekularen Ereignisses in entgegengesetzter Weise untersucht.
Die mechanistischen Endpunkte zur Untersuchung sind wie folgt: i) Oberflächenexpression von Rezeptoren, die zur Bindung/Aufnahme von K. pneumoniae (bestimmt durch Durchflusscytometrie), einschließlich FcRII/FcRIII und CR3 nötig sind; ii) Aktin-Mikrofilament-Zusammenbau (bestimmt durch Immunfluoreszenz-Färbung und Durchflusscytometrie), der für eine Teilchenaufnahme nötig ist; und iii) Phagosomen-Lysosomen-Fusion (bestimmt durch Acridin-Orange-Färbung), die zum Zusammenbringen mit dem Bakterien-Arsenal nötig ist. Das Kapitel Allgemeine Verfahren beschreibt die Verfahren für jede dieser Bestimmungen.
Bakterizide Mechanismen werden auf ähnliche Weise wie für die Phagocytose beschrieben durchgeführt. Wiederum ist zwar kein Verständnis der molekularen Mechanismen erforderlich, um die vorliegende Erfindung auszuüben, jedoch werden anschließend Experimente durchgeführt, um den oder die molekularen Mechanismen zu behandeln, die für die 5-LO-Metabolite verantwortlich sind, die das Abtöten von K. pneumoniae steigern. Darüber hinaus wird die Fähigkeit der Antagonisten zum Blockieren der positiven Wirkungen der Lipide auf diese mechanistischen Ereignisse bewertet, und die alveolären Makrophagen und angeregten Neutrophile werden jeweils untersucht. Drei bakterielle Mechanismen werden untersucht (wie beschrieben im Abschnitt Allgemeine Verfahren). Zuerst wird die extrazelluläre Erzeugung von O₂ ^– durch die Superoxiddismutase-hemmbare Reduktion von Ferricytochrom C bestimmt. [L. Laichalk et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 658: 1–7 (1996)]. Da Bakterien keinen hinreichend starken Stimulus für die extrazelluläre Freisetzung der Sauerstoffmetabolite darstellen, werden die Wirkungen der Leukotriene auf diesen Endpunkt ebenfalls mittels Phorbolmyristat-Acetat als Stimulus für die O₂ ^–Produktion bestimmt. Zweitens wird die Produktion von NO durch Quantifizieren von Nitrit im Kulturmedium bestimmt, wobei das Griess-Reagenz verwendet wird. Drittens wird die Freisetzung eines lysosomalen Enzyms, β-Glucuronidase spektralphotometrisch bestimmt [W. Hsueh et al., Exp. Lung Res. 13: 385–399 (1987)].
Nach der Charakterisierung der Wirkungen exogener Leukotriene auf diese molekularen Mechanismen in Knockout- sowie Wildtyp-Zellen wird bestimmt, ob spezifische Antagonismen dieser gleichen endogen produzierten Leukotriene die gleichen Wirkungen hatten. Wie in Beispiel 7 werden die LTB₄-Antagonisten CP-105,696 und der Cysteinylleukotrien-Antagonist MK-571 (jeweils 10^–9 bis 10^–6 M) verwendet. Sie werden vor der Zugabe von K. pneumoniae zu den Wildtyp-Zellen gegeben, und die Phagocytose, das Abtöten und relevante molekulare Mechanismen werden dann wie vorstehend beschrieben bewertet.
Wenn es gezeigt wird, dass LTB₄ und LTC₄ ihre Wirkungen über verschiedene Mechanismen ausüben, dann könnte die Kombi nation der beiden die antibakterielle Funktionen auf eine Weise aktivieren, die additiv oder synergistisch ist. Ein solcher Befund hat wichtige Implikationen für die mögliche therapeutische Verwendung von Leukotrienen in den in Beispiel 10 beschriebenen In-vivo-Studien.
BEISPIEL 10
Wirkungen aerosolierter oder intratrachealer Leukotriene nach der Klebsiella-Provokation auf die bakterielle Clearance und das Überleben in Wildtyp- und 5-LO-Knockoutmäusen.
Die Daten, die aus den vorhergehenden Beispielen erhalten wurden, liefern u.a. Information in Bezug auf den Zeitpunkt in der Wirtsreaktion, bei dem die Anwesenheit bestimmter Leukotriene am kritischsten ist. Die Experimente dieses Beispiels nutzen diese Information zur rationalen Untersuchung der In-vivo-Effizienz exogener Leukotriene, die entweder allein oder in Kombiation über verschiedene Wege verabreicht werden.
Die anfänglichen Experimente dieses Beispiels umfassen Tiere, deren endogene Kapazität für die Leukotrien-Erzeugung wegen der 5-LO-Gendisruption gestört ist. Anschließende Experimente untersuchen die Effizienz der intrapulmonalen Leukotrienverabreichung in Wildtypmäusen. Schließlich untersuchen die Experimente dieses Beispiels neben den klinisch relevanten Endpunkten der bakteriellen Clearance und des Überlebens den Nutzen der Profilerstellung einer molekularen Folge der Leukotrien-Wirkung (beispielsweise CR3-Expression) auf gespülte Zellen als möglichen Ersatz für die Vorhersage einer verminderten (ohne exogene Leukotriene) oder gesteigerten (mit exogenen Leukotrienen) bakteriellen Clearance und Überleben.
"Frühe" Verabreichung von Leukotrienen
Da man erwartet, dass die vorher beschriebenen Daten (siehe 10) und die leukotriendefizienten Tiere den größten Anstieg der antimikrobiellen Abwehr bei der Verabreichung exogener Leukotriene manifestieren, werden 5-LO-Knockoutmäuse für die ersten Reihen der Untersuchungen verwendet. Knockoutmäusen werden 50 CFU K. pneumoniae intratracheal zusammen mit LTB₄ in Dosen im Bereich von 1 bis 20 ng pro Tier (6 ng war diejenige Dosis, die in dem Experiment entsprechend 10 verwendet wurde) gegeben; ein ähnlicher Dosisbereich von LTC₄ wird ebenfalls untersucht. Die bakteriellen CFUs von Lunge und Plasma werden nach 1 Tag bestimmt, und die Ergebnisse dieser Experimente werden zur Bestimmung der optimalen Dosen der gleichzeitig verabreichten LTB₄ und LTC₄ verwendet. Anschließend werden die Wirkungen auf die In-vivo-Bakterien-Clearance definitiv aus Lungen- und Plasma-CFUs 1 Tag und 3 Tage nach der Beimpfung bestimmt; mit 10 Knockout-Tieren für jeden Bestimmungszeitpunkt je Behandlungsgruppe wie folgt: i) Vehikelkontrolle (nur Bakterien) wird an 1 Tag bestimmt; ii) Vehikelkontrolle wird an 3 Tagen bestimmt; iii) LTB₄ wird an 1 Tag bestimmt; iv) LTB₄ wird an 3 Tagen bestimmt; v) LTC₄ wird an 1 Tag bestimmt; vi) LTC₄ wird an 3 Tagen bestimmt; vii) LTB₄ + LTC₄ werden an 1 Tag bestimmt; und viii) LTB₄ + LTC₄ werden an 3 Tagen bestimmt. Für einen weiteren Vergleich werden Wildtyp-Tiere, die nur mit Bakterien beimpft waren, an beiden Zeitpunkten untersucht (Gruppen ix) und x)). Weil sich die Kombinationen der optimalen Dosen von LTC₄ und LTB₄ als übermäßig proinflammatorisch erweisen könnten, kann eine solche Kombinationstherapie erfordern, dass die Dosen jedes Mittels reduziert werden können.
Das oder die Behandlungsschemata, die die größte Verbesserung der bakteriellen Clearance ergeben, werden dann in einem Überlebensexperiment verwendet. Wiederum werden Knockoutmäuse (n = 10 Tiere pro Gruppe) mit 50 CFU K. pneumoniae al lein oder zusammen mit optimalen Dosen LTB₄, LTC₄ oder beiden Leukotrienen beimpft; die Überlebensfähigkeit wird über 14 Tage überwacht. Wildtypmäuse, die nur mit Bakterien beimpft wurden, dienen als weitere Vergleichsgruppe.
"Späte" Verabreichung von Leukotrienen
Da die vorherigen Experimente zeigen, dass die Wirkungen einer intratrachealen Dosis von Leukotrien rasch eingestellt werden (beispielsweise innerhalb 1 Std.), jedoch relativ kurzlebig sind (beispielsweise weniger als 12 Std.), sollte dann die Verabreichung von Leukotrien(en) zusammen mit dem Bakterien-Inoculum das bakterielle Clearance-Potential des alveolären Makrophagen steigern. Alternativ geht die Verabreichung von dem oder den Leukotrienen an einem späteren Zeitpunkt mit anderen potentiellen Vorteilen einher. Beispielsweise kann die Aktivierung der rekrutierten Neutrophile bewerkstelligt werden, wenn der Wirkstoff etwa 1 bis 3 Tage nach der Beimpfung abgegeben wird. Darüber hinaus ist ein effizientes Schema nach der Beimpfung leichter bei der Behandlung einer übermäßigen gramnegativen Pneumonie in Patienten anwendbar.
Angesichts des Vorstehenden werden Experimente durchgeführt, um die optimalen Zeitpunkte (1, 2 und 3 Tage nach der Klebsiella-Provokation) für eine "späte" Verabreichung von LTB4 und LTC4 zu bestimmen. Diese werden in Knockoutmäusen durchgeführt, und die bakterielle Clearance (Lungen- und Plasma-CFUs) werden an Tag 4 bestimmt; mit Leukotrien behandelte Tiere werden dann mit Kontrollen verglichen, die nicht mit Leukotrien (Vehikel) behandelt wurden. Nach der Bestimmung des besten "späten" Zeitpunktes werden Lungen- und Plasma-CFUs 1 Tag danach in den folgenden Gruppen bestimmt: i) Bakterien allein, ii) Bakterien + LTB₄, iii) Bakterien + LTC₄ und iv) Bakterien + LTB₄ + LTC₄ (n = 10 Tiere pro Gruppe). Für einen weiteren Vergleich werden Wildtyp-Tiere, die nur mit Bakterien beimpft wurden, untersucht. Wie für das simultane Behandlungsschema beschrieben, wird das optimale späte Behandlungsschema als nächstes in Knockoutmäusen in einer 14-Tages-Überlebensstudie untersucht, wobei die mit Vehikel behandelten Knockoutmäuse und Wildtypmäuse als Vergleichsgruppen dienen.
Simultane "frühe" und "späte" Verabreichung von Leukotrienen
Eine wiederholte oder ausgedehnte Verabreichung von Leukotrienen kann die antibakterielle Wirtsabwehr in höherem Maße steigern als entweder die frühe oder späte Verabreichung allein. Demnach werden zwei zusätzliche Behandlungspläne durchgeführt. Für diese beiden alternativen Behandlungspläne werden 5-LO-Knockoutmäuse verwendet, und die bakteriellen Clearance-Experimente werden zuerst durchgeführt, und die optimalen Behandlungspläne werden anschließend in längeren Überlebensexperimenten durchgeführt. Der erste Behandlungsplan umfasst die frühe (d.h. mit Beimpfung) und die späte (beispielsweise an Tag 2) Verabreichung. Die frühen und späten 5-LO-Metaboliten können unabhängig voneinander ausgewählt werden; mit anderen Worten kann LTB₄ für eine Dosis und LTC4 für die andere Dosis verwendet werden. Die zweite Behandlungsplan umfasst eine kontinuierliche Verabreichung von Leukotrien(en) durch Aerosol. Zur Gewährleistung, dass die Dosierung auf den repiratorischen Trakt eingeschränkt ist, und zur genauen Quantifizierung der verabreichten Dosis werden die Leukotriene zerstäubt und Mäusen in einer Expositionskammer nur für die Nase verabreicht. Die Auswahl des Metaboliten und das Behandlungsfenster (beispielsweise die Tage 1 bis 3) beruhen auf den Ergebnissen von den Dosierungsexperimenten, die nur zu einem Zeitpunkt durchgeführt wurde.
Anwendung bei Wildtypmäusen, die mit K. pneumoniae provoziert wurden.
Die vorstehend in Bezug auf Leukotrien-defiziente Mäuse offenbarten Experimente werden auf Wildtypmäuse angewendet, die mit K. pneumoniae provoziert wurden. 129/SvEv-Wildtypmäuse sind anfälliger gegenüber Klebsiella-Pneumonie als viele andere Stämme, jedoch nicht so anfällig wie 5-LO-Knockoutmäuse. Diese Wildtypmäuse können daher eher Patienten veranschaulichen, die für eine Gramnegativ-Pneumonie anfällig sind, als die Leukotrien-defizienten Tiere. Daher wird die optimale Leukotrien-Behandlungsstrategie, die aus Untersuchungen an Knockoutmäusen definiert wurde, bei Wildtypmäusen verwendet, mit ähnlichen Endpunkten der bakteriellen Clearance und des Überlebens.
Die in diesem Beispiel offenbarten Experimente zeigen die Wirkungen aerosolierter und intratrachealer Verabreichung der Post-Klebsiella-Provokation auf die bakterielle Clearance und das Überleben in Wildtypmäusen und Knockoutmäusen. Diese Experimente dienen der Bereitstellung von Information in Bezug auf die In-vivo-Verabreichung exogener Leukotriene. Die beschriebenen Untersuchungen beinhalten die Behandlung mit Leukotrienen B4 und C4; diese wurden aufgrund ihrer bekannten Wirkungen und ihrer Leistungsfähigkeit ausgewählt. Die Verwendung anderer 5-LO-Produkte, einschließlich 5-HETE und Lipoxine, wird durch die vorliegende Erfindung vorgeschlagen.
Die Erfindung ist selbstverständlich nicht auf die genauen Einzelheiten des gezeigten und beschriebenen Vorgehens oder die genauen Verbindungen, die Zusammensetzung, Methoden oder Verfahren eingeschränkt, da Modifikationen und Äquivalente dem Fachmann geläufig sind.

Claims

Verwendung einer wirksamen Menge einer ein Produkt des 5-Lipoxygenasepfades enthaltenden therapeutischen Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur pulmonalen Verabreichung zur Behandlung einer mikrobiellen Infektion in einem Wirt, bei dem der Verdacht besteht, dass er diese mikrobielle Infektion hat.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei der mikrobiellen Infektion um bakterielle Pneumonie handelt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Produkt des 5-Lipoxygenasepfades ein Leukotrien enthält.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei es sich bei dem Leukotrien um Leukotrien B₄ handelt.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei es sich bei dem Leukotrien um ein Cysteinylleukotrien handelt.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Cysteinylleukotrien aus der aus Leukotrien C₄, Leukotrien D₄ und Leukotrien E₄ bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die pulmonale Verabreichung durch Aerosolieren der therapeutischen Zusammensetzung erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 1, bei dem man dem Wirt weiterhin auch ein Antibiotikum verabreicht.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Wirt um ein Tier handelt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Wirt um einen Menschen handelt.
Verwendung einer wirksamen Menge einer ein Leukotrien enthaltenden therapeutischen Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur pulmonalen Verabreichung zur Behandlung einer bakteriellen Infektion in einem Wirt, bei dem der Verdacht besteht, dass er diese bakterielle Infektion hat.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei es sich bei der bakteriellen Infektion um bakterielle Pneumonie handelt.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei es sich bei dem Leukotrien um Leukotrien B₄ handelt.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei es sich bei dem Leukotrien um ein Cysteinylleukotrien handelt.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Cysteinylleukotrien aus der aus Leukotrien C₄, Leukotrien D₄ und Leukotrien E₄ bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die pulmonale Verabreichung durch Aerosolieren der therapeutischen Zusammensetzung erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 11, bei dem man dem Wirt weiterhin auch ein Antibiotikum verabreicht.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei es sich bei dem Wirt um ein Tier handelt.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei es sich bei dem Wirt um einen Menschen handelt.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die therapeutische Zusammensetzung eine Lösung enthält, die ein steriles flüssiges Vehikel und ein in dem sterilen flüssigen Vehikel gelöstes Leukotrien enthält.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei es sich bei dem Leukotrien um Leukotrien B₄ handelt.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei es sich bei dem Leukotrien um Cysteinylleukotrien handelt.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei das Cysteinylleukotrien aus der aus Leukotrien C₄, Leukotrien D₄ und Leukotrien E₄ bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei die Lösung aerosoliert ist.