ES2341255T3 - Administracion de productos de la ruta de la 5-lipoxigenasa para tratar infecciones antimicrobianas. - Google Patents

Abstract

Composición terapéutica que comprende una cantidad eficaz de un producto de la ruta de la 5-lipoxigenasa para su uso como medicamento para la profilaxis o el tratamiento de una infección microbiana en un paciente que tiene un factor predisponente para una infección microbiana, siendo dicho factor predisponente tabaquismo, alcoholismo, diabetes, infección por VIH, virus del SIDA, deficiencia en vitamina D o estar en el periodo neonatal; con la condición de que dicha infección microbiana y dicho factor predisponente no sean ambos una infección por VIH, en la que dicho producto de la ruta de la 5-lipoxigenasa comprende un leucotrieno seleccionado del grupo que consiste en leucotrieno B4, leucotrieno B4-d4, dimetilamida de leucotrieno B4, 6-trans-leucotrieno B4, 6-trans-12-epi-leucotrieno B4, 12-epi-leucotrieno B4, 18-carboxi-dinor-leucotrieno B4, 20-carboxi-leucotrieno B4 y 20-hidroxi-leucotrieno B4.

Description

Administración de productos de la ruta de la 5-lipoxigenasa para tratar infecciones antimicrobianas.

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Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a una composición terapéutica que comprende una cantidad eficaz de un producto de la ruta de la 5-lipoxigenasa para su uso como medicamento para la profilaxis o el tratamiento de una infección microbiana en pacientes que tienen ciertos factores predisponentes para una infección microbiana.

Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno de los Estados Unidos concedido por el Instituto Nacional de Salud (NIH), subvenciones n.^{os} HL 58200, HL 57243, AA 10571, P 50 HL 46487, CA 66180, HL 50057 y HL 47391.

Antecedentes de la invención A. Defensa pulmonar del huésped y la patogenia de la neumonía

En vista de la constante exposición del aparato respiratorio a microbios inhalados o aspirados, y las consecuencias perjudiciales de las infecciones no controladas, obviamente es importante para la salud un sistema eficaz de defensa antimicrobiana pulmonar. Los microbios que eluden las defensas mecánicas ofrecidas por el aparato respiratorio y las vías respiratorias altos alcanzan los alvéolos. En este caso, el macrófago alveolar sirve habitualmente como el defensor de la esterilidad de la mucosa, patrullando la superficie alveolar y eliminando organismos mediante fagocitosis y destrucción intracelular. [M. Lohmann-Matthes et al., Eur. Respir. J. 7:1678-1689 (1994)]. Si la carga microbiana supera la capacidad de eliminación localizada de los macrófagos alveolares residentes, los macrófagos pueden elaborar factores quimiotácticos que reclutan neutrófilos circulantes a los espacios de aire y activan sus actividades fagocíticas y microbicidas.

Aunque las células fagocíticas pueden por sí mismas realizar al ingestión de microbios, la eficacia de este proceso se potencia mediante la presencia de diversas moléculas solubles (opsoninas) que recubren los organismos y median en su unión a los receptores de superficie en el fagocito. Estas opsoninas incluyen inmunoglobulina así como factores que recubren los microbios de manera no específica, tales como el fragmento C3b del complemento, la proteína A del tensioactivo, y la fibronectina. Igualmente, además se aumentan la fagocitosis y la destrucción intracelular mediante una variedad de agentes de activación incluyendo factores estimulantes de colonias, quimiocinas y lípidos. Desafortunadamente, la deficiencia cualitativa o cuantitativa de cualquier componente de estas defensas puede comprometer la eliminación de bacterias y predisponer a neumonía. [Véase, por ejemplo, J. Langermans et al. J. Immunol. Methods 174:185-194 (1994)].

B. Importancia de la neumonía bacteriana

En naciones industrializadas, la neumonía se asocia con una mayor morbimortalidad que cualquier otro tipo de infección. En general, es la sexta causa principal de muerte en los Estados Unidos. En adultos mayores de 65 años de edad, es la cuarta causa más común de hospitalización. Entre las infecciones intrahospitalarias, la neumonía es la segunda más común en incidencia y la más comúnmente mortal.

Las bacterias son patógenos etiológicos en una proporción sustancial de neumonías extrahospitalarias y en la gran mayoría de neumonías hospitalarias. Frecuentemente, los organismos Gram-negativos entéricos son los microbios etiológicos responsables de ambos tipos de neumonía. Generalmente, se cree que las neumonías por organismos Gram-negativos resultan de la microaspiración de secreciones orales, y por tanto son particularmente probables en individuos que muestran colonización bucofaríngea con estos organismos. Esto es especialmente común en pacientes hospitalizados, particularmente aquéllos en las unidades de cuidados intensivos, pero también se produce en alcohólicos, pacientes con enfermedad sistémica subyacente o con deficiencias en la defensa del huésped, y aquéllos con enfermedad pulmonar crónica. [S. Nelson et al., Clin. Chest Med. 16:1 (1995)].

C. Tratamiento con antibióticos

Debido al uso extendido y la frecuente prescripción excesiva de agentes antimicrobianos, existe una incidencia creciente de microbios que adquieren resistencia a los fármacos. En otras palabras, organismos normalmente sensibles (es decir, inhibidos o destruidos) a un agente antimicrobiano particular ya no son sensibles. Esto es especialmente importante con respecto al uso de antibióticos en el tratamiento de infecciones bacterianas.

La resistencia a los fármacos adquirida se produce habitualmente por una mutación dentro del genoma del microbio o por la adquisición de un plásmido. Por ejemplo, uno de los principales mecanismos de resistencia a los antibióticos \beta-lactámicos, incluyendo penicilinas, es la producción de \beta-lactamasas. Además, la resistencia a un miembro de una clase de agentes (por ejemplo, la aminopenicilina ampicilina) puede dar como resultado una completa resistencia cruzada a otros miembros de esa clase (por ejemplo, la aminopenicilina amoxicilina).

La presión antibiótica en ciertas poblaciones de pacientes (por ejemplo, pacientes con enfermedad sistémica subyacente o con deficiencias en la defensa del huésped) ha contribuido al desarrollo de infecciones con organismos resistente a múltiples fármacos, la erradicación de lo cual es cada vez más difícil. Un factor que contribuye a la presión antibiótica es el uso extendido de antibióticos en la práctica hospitalaria, especialmente en las unidades de cuidados intensivos. De hecho, los médicos frecuentemente se ven obligados a utilizar regímenes con antibióticos que comprenden múltiples agentes para combatir tales infecciones o a usar agentes de amplio espectro (por ejemplo, Primaxin®, Merck) generalmente reservados para las infecciones más graves.

Lo que se necesita es un medio para potenciar las capacidades de defensa pulmonar que o bien no requiera antibióticos o bien pueda usarse para aumentar el tratamiento con antibióticos. Los medios de potenciación deben ser eficaces en el tratamiento y la prevención de la neumonía bacteriana en aquellos pacientes que son especialmente sensibles a la misma, deben tener un rápido comienzo de acción y no deben provocar reacciones inmunológicas en el receptor.

Sumario de la invención

Los leucotrienos son potentes mediadores de la inflamación derivados de la ruta de la 5-lipoxigenasa del metabolismo del ácido araquidónico. Estas sustancias se han implicado en la patogenia de enfermedades inflamatorias de pulmón, y se han puesto a disposición recientemente nuevos agentes farmacológicos que inhiben la síntesis o las acciones de los leucotrienos para el tratamiento del asma. La presente invención contempla el uso de leucotrieno B_{4} y derivados según la tabla I, como un coadyuvante en el tratamiento de neumonía y otras infecciones de las vías respiratorias bajas, en pacientes que presentan un factor predisponente.

Con el fin de evaluar el papel de los leucotrienos en la neumonía bacteriana, los presentes inventores han empleado un modelo de neumonía debida a Klebsiella en ratones deficientes que se convirtieron en deficientes en leucotrienos mediante la alteración dirigida del gen de la 5-lipoxigenasa. Los presentes inventores encontraron que se aumentó la producción de leucotrienos en los pulmones de los ratones de tipo natural infectados, y que los animales deficientes en leucotrienos manifestaron una eliminación bacteriana reducida y un aumento de la mortalidad. Además, los macrófagos alveolares de los ratones deficientes mostraron fagocitosis y destrucción deteriorada in vitro de K. pneumoniae, y este defecto funcional en macrófagos alveolares deficientes en leucotrienos se superó mediante la adición de leucotrienos exógenos tales como LTB_{4}. De manera importante, la administración intrapulmonar del LTB_{4} superó parcialmente la deficiencia in vivo en la eliminación bacteriana observada en los ratones deficientes.

Los presentes inventores han determinado que los leucotrienos endógenos desempeñan un papel esencial en la respuesta del huésped a la infección pulmonar. Incluso de manera más importante desde un punto de vista terapéutico, los presentes inventores encontraron que los leucotrienos exógenos ejercen acciones farmacológicas que aumentan esta respuesta.

La presente invención contempla el tratamiento de pacientes con un factor predisponente reconocido (por ejemplo, tabaquismo, alcoholismo, diabetes, infección por VIH, aspiración conocida) para neumonía fulminante, o con neumonía temprana, con administración mediante inhalación o un tubo endotraqueal de productos metabólicos de la ruta de la 5-lipoxigenasa, no siendo ambos de dicha infección microbiana y dicho factor predisponente una infección por VIH, y comprendiendo dicho producto de la ruta de la 5-lipoxigenasa un leucotrieno seleccionado del grupo que consiste en leucotrieno B_{4}, leucotrieno B_{4}-d_{4}, dimetilamida de leucotrieno B_{4}, 6-trans-leucotrieno B_{4}, 6-trans-12-epi-leucotrieno B_{4}, 12-epi-leucotrieno B_{4}, 18-carboxi-dinor-leucotrieno B_{4}, 20-carboxi-leucotrieno B_{4} y 20-hidroxi-leucotrieno B_{4}. Además, la presente invención contempla el uso de los productos de la ruta de la 5-lipoxigenasa para fines profilácticos. Mientras que para la práctica satisfactoria de la presente invención no es necesaria una comprensión del mecanismo mediante el cual actúan los productos, la administración de tales productos, especialmente la administración intrapulmonar de leucotrienos, aumenta los mecanismos de defensa endógenos locales del huésped y ayuda a erradicar la infección bacteriana durante la administración de antibióticos. Los productos tienen una duración de acción relativamente corta (por ejemplo, horas), no provocan respuestas inmunitarias mediadas por anticuerpos, y son relativamente económicos.

La presente invención no se limita a la administración intrapulmonar de los productos de la ruta de la 5-lipoxigenasa para el tratamiento de neumonía. De hecho, la presente invención contempla la administración de estos productos mediante otras vías de administración y para el tratamiento y la prevención de otros estados. Los productos pueden administrarse de manera concomitante con antibióticos en algunas realizaciones. En otras realizaciones, diferentes productos (por ejemplo, LTB_{4}) de la ruta de la 5-lipoxigenasa se administran juntos o a intervalos definidos, con o sin la administración concomitante de antibióticos.

La presente invención contempla una composición terapéutica que comprende una cantidad eficaz de un producto de la ruta de la 5-lipoxigenasa para su uso como medicamento para el tratamiento de una infección microbiana en un paciente que tiene un factor predisponente para una infección microbiana, siendo dicho factor predisponente tabaquismo, alcoholismo, diabetes, infección por VIH, virus del SIDA, deficiencia de vitamina D o estar en el período neonatal;

con la condición de que dicha infección bacteriana y dicho factor predisponente no sean ambos una infección por VIH, y comprendiendo dicho producto de la ruta de la 5-lipoxigenasa un leucotrieno seleccionado del grupo que consiste en leucotrieno B_{4}, leucotrieno B_{4}-d_{4}, dimetilamida de leucotrieno B_{4}, 6-trans-leucotrieno B_{4}, 6-trans-12-epi-leucotrieno B_{4}, 12-epi-leucotrieno B_{4}, 18-carboxi-dinor-leucotrieno B_{4}, 20-carboxi-leucotrieno B_{4} y 20-hidroxi-leucotrieno B_{4}. Además, la presente invención contempla una composición terapéutica que comprende una cantidad eficaz de un producto de la ruta de la 5-lipoxigenasa para su uso como medicamento para la profilaxis de una infección microbiana en un paciente que tiene un factor predisponente para una infección microbiana, siendo dicho factor predisponente tabaquismo, alcoholismo, diabetes, infección por VIH, virus del SIDA, deficiencia de vitamina D o estar en el periodo neonatal;con la condición de que dicha infección microbiana y dicho factor predisponente no sean ambos una infección por VIH, comprendiendo dicho producto de la ruta de la 5-lipoxigenasa un leucotrieno seleccionado del grupo que consiste de leucotrieno B_{4}, leucotrieno B_{4}-d_{4}, dimetilamida de leucotrieno B_{4}, 6-trans-leucotrieno B_{4}, 6-trans-12-epi-leucotrieno B_{4}, 12-epi-leucotrieno B_{4}, 18-carboxi-dinor-leucotrieno B_{4}, 20-carboxi-leucotrieno B_{4} y 20-hidroxi-leucotrieno B_{4}. Tal administración profiláctica se realiza de la manera más frecuente con pacientes que corren un alto riesgo de desarrollar una infección microbiana. Los pacientes que corren un alto riesgo incluyen, pero no se limitan a, pacientes con el virus del SIDA y otros pacientes que son inmunodeficientes.

En una realización, la infección microbiana es neumonía bacteriana. Todavía en realizaciones adicionales, el método de administración comprende administración pulmonar, y la administración pulmonar es mediante aerosolización de la composición terapéutica en otras realizaciones. Además, ciertas realizaciones implican además la administración conjunta de un antibiótico al huésped. El huésped es un animal en algunas realizaciones, y un ser humano en otras.

Además, la presente invención contempla una composición terapéutica para su uso en el tratamiento de una infección bacteriana, que comprende la administración de una cantidad eficaz de la composición terapéutica a un huésped que tiene una infección bacteriana, comprendiendo la composición terapéutica un leucotrieno. En realizaciones particulares, la infección bacteriana es neumonía bacteriana. En ciertas realizaciones, el leucotrieno es leucotrieno B_{4}. Todavía en realizaciones adicionales, el método de administración comprende administración pulmonar, y la administración pulmonar es mediante aerosolización de la composición terapéutica en otras realizaciones. Además, ciertas realizaciones implican además la administración conjunta de un antibiótico al huésped. El huésped es un animal en algunas realizaciones, y un ser humano en otras.

Finalmente, la presente invención contempla una disolución para el tratamiento de una infección microbiana, comprendiendo la disolución un vehículo líquido estéril y un leucotrieno disuelto en el vehículo líquido estéril, estando dicha disolución aerosolizada, y seleccionándose dicho leucotrieno del grupo que consiste en leucotrieno B_{4}, leucotrieno B_{4}-d_{4}, dimetilamida de leucotrieno B_{4}, 6-trans-leucotrieno B_{4}, 6-trans-12-epi-leucotrieno B_{4}, 12-epi-leucotrieno B_{4}, 18-carboxi-dinor-leucotrieno B_{4}, 20-carboxi-leucotrieno B_{4} y 20-hidroxi-leucotrieno B_{4}. En realizaciones particulares, el leucotrieno es leucotrieno B_{4}.

Definiciones

Para facilitar la comprensión de la invención expuesta en la descripción que sigue, a continuación se definen varios términos.

La frase "producto de la ruta de la 5-lipoxigenasa" se refiere a aquellos compuestos que resultan de la conversión enzimática del ácido araquidónico mediante la 5-lipoxigenasa. Los productos de la ruta de la 5-lipoxigenasa incluyen ácido 5-hidroxiperoxieicosatetraenoico [5-HPETE] y LTA_{4}, así como compuestos derivados de los mismos. Los productos abarcan 5-HETE, que se produce a partir de 5-HPETE. Los productos incluyen también compuestos formados a partir de la conversión de LTA_{4}, tales como LTB_{4}, LTC_{4}, LTE_{4} y LTF_{4}. Además, se pretende que los productos abarquen derivados (es decir, compuestos producidos mediante modificación estructural) de los compuestos producidos en la cascada del ácido araquidónico. La siguiente tabla (tabla 1) enumera diversos productos comercialmente disponibles (Cayman) en la ruta de la 5-lipoxigenasa.

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TABLA 1

1

2

El término "leucotrieno" se define en el presente documento como aquellos compuestos que provocan una potenciación de la defensa antimicrobiana. El término "microbiano" incluye, pero no se limita a, bacterias, virus, parásitos y hongos.

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El término "cisteinil-leucotrieno" se refiere a aquellos leucotrienos que tienen el residuo de cisteína característico de los leucotrienos C_{4}, D_{4} y E_{4}.

El término "eicosanoide" se refiere a compuestos derivados de ácidos grasos esenciales de 20 átomos de carbonos que contienen tres, cuatro o cinco dobles enlaces: ácido 8,11,14-eicosatrienoico (ácido dihomo-\gamma-linolénico), ácido 5,8,11,14-eicosatetraenoico (ácido araquidónico), y ácido 5,8,11,14,17-eicosapentaenoico. Las familias de leucotrienos y prostaglandinas son ejemplos de eicosanoides.

La expresión "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de un producto de 5-lipoxigenasa que se requiere para realizar de manera satisfactoria una función particular. En términos generales, la cantidad eficaz de un producto de 5-lipoxigenasa será aquella cantidad que potencie o mejore (en cualquier grado) la capacidad del organismo para erradicar una infección microbiana, especialmente una infección bacteriana. La cantidad eficaz puede depender de varios factores, incluyendo el tipo de microbio implicado, la gravedad de la infección, el estado inmunológico del individuo, y el peso del individuo. A modo de ejemplo, puede administrarse leucotrieno LTD_{4} en una composición terapéutica que contiene entre 0,1 \mug y 10 \mug.

La expresión "composición terapéutica" se refiere a una composición que comprende un producto de la ruta de la 5-lipoxigenasa (por ejemplo, LTB_{4} y LTC_{4}) en una forma farmacéuticamente aceptable. Las características de la forma dependerán de varios factores, incluyendo el modo de administración. Por ejemplo, una composición para administración pulmonar aerosolizada debe formularse de modo que el producto sea farmacológicamente activo tras el suministro a los pulmones. La composición terapéutica puede contener diluyentes, adyuvantes y excipientes, entre otras cosas. En una realización preferida, se disuelve el producto de la ruta de la 5-lipoxigenasa en un vehículo líquido estéril. La expresión "vehículo líquido estéril" se refiere a aquellos líquidos que son adecuados para su administración a un huésped (por ejemplo, administración parenteral o pulmonar) y permiten la disolución del producto de la ruta de la 5-lipoxigenasa. Ejemplos de vehículos líquidos estériles incluyen, pero no se limitan a, solución salina normal estéril y concentraciones diluidas de etanol.

El término "huésped" se refiere a seres humanos y animales.

Las expresiones "potenciación de la defensa microbiana" y "potenciación de la defensa bacteriana" se refieren ampliamente a la capacidad mejorada del sistema inmunitario de un sujeto para responder a y erradicar una infección microbiana (por ejemplo, una infección bacteriana, parasitaria, viral y fúngica) y específicamente una infección bacteriana, respectivamente. Las expresiones incluyen, por ejemplo, el aumento de los mecanismos de defensa endógenos del sujeto. Se determina la presencia del aumento de la defensa antimicrobiana/antibacteriana sometiendo un compuesto al procedimiento de selección descrito a continuación en la tabla 3.

Descripción de los dibujos

La figura 1A es una representación esquemática de la ruta de síntesis de leucotrienos y las estructuras de los productos principales de la ruta metabólica de la 5-lipoxigenasa.

La figura 1B es una visión general esquemática que representa la ruta de síntesis de leucotrienos y las acciones de leucotrienos relevantes para la defensa antimicrobiana.

Las figuras 2A y B representan los perfiles de RP-HPLC de eicosanoides radiactivos liberados por macrófagos alveolares marcados previamente obtenidos de ratones de tipo natural (figura 2A) y ratones deficientes en 5-LO (figura 2B).

La figura 3 representa gráficamente el efecto de la exposición a Klebsiella pneumoniae sobre la supervivencia en ratones deficientes en 5-LO y ratones de tipo natural.

La figura 4 representa gráficamente la eliminación de K. pneumoniae del plumón y el plasma dos días después de la exposición en ratones deficientes en 5-LO y de tipo natural.

La figura 5 representa gráficamente las actividades fagocíticas y bactericidas en macrófagos alveolares de ratones deficientes en 5-LO y de tipo natural.

La figura 6 representa gráficamente el efecto del LTB_{4} exógeno sobre la actividad fagocítica bacteriana en macrófagos alveolares de ratones deficientes en 5-LO.

La figura 7 representa gráficamente los niveles de LTB_{4} y LTC_{4} en homogeneizado de pulmón en ratones de tipo natural dos días después de la exposición o bien con K. pneumoniae o bien con solución salina.

La figura 8 representa gráficamente el efecto de la exposición a K. pneumoniae en la neutrofilia del lavado en ratones deficientes en 5-LO y de tipo natural.

La figura 9 representa gráficamente el efecto de metabolitos de 5-LO exógenos sobre la actividad fagocítica bacteriana en macrófagos alveolares de ratas normales.

La figura 10 representa gráficamente el efecto de la administración intratraqueal de LTB_{4} sobre la eliminación bacteriana defectuosa del pulmón en ratones deficientes en 5-LO.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere en general a la administración de productos de la ruta de la 5-lipoxigenasa, comprendiendo dicho producto de la ruta de la 5-lipoxigenasa un leucotrieno seleccionado del grupo que consiste en leucotrieno B_{4}, leucotrieno B_{4}-d_{4}, dimetilamida de leucotrieno B_{4}, 6-trans-leucotrieno B_{4}, 6-trans-12-epi-leucotrieno B_{4}, 12-epi-leucotrieno B_{4}, 18-carboxi-dinor-leucotrieno B_{4}, 20-carboxi-leucotrieno B_{4} y 20-hidroxi-leucotrieno B_{4} para potenciar la defensa microbiana, y más particularmente a la administración de los productos de la ruta metabólica de la 5-lipoxigenasa para potenciar la defensa bacteriana y para tratar y prevenir la neumonía bacteriana. Para facilitar una comprensión de la presente invención, la descripción que sigue se divide en las siguientes secciones: I) Síntesis, acciones y modulación farmacológica de leucotrienos; II) Leucotrienos y defensa antimicrobiana del huésped; III) Activación de la 5-LO en macrófagos alveolares y neutrófilos; IV) Papel de los leucotrienos en la respuesta del huésped in vivo; y V) Composición y administración de los compuestos.

I. Síntesis, acciones y modulación farmacológica de leucotrienos

Los leucotrienos son derivados oxigenados de ácido araquidónico sintetizados principalmente por las células derivadas de la médula ósea en respuesta a una variedad de estímulos solubles o particulados. [E. Göetzl et al., FASEB J 9:1051-1058 (1995)]. Inicialmente, se hidroliza el ácido araquidónico a partir de los fosfolípidos de membrana, en parte por las acciones de la fosfolipasa A_{2} citosólica (cPLA_{2}). Las dos etapas siguientes en la síntesis de leucotrienos (la conversión secuencial de ácido araquidónico primero a ácido 5-hidroxiperoxieicosatetraenoico [5-HPETE] y luego a LTA_{4}) se catalizan mediante la enzima 5-lipoxigenasa (5-LO). Esta enzima reside dentro del citosol y/o núcleo de células en reposo. Aunque no se requiere una comprensión de su mecanismo de acción con el fin de poner en práctica la presente invención, tras la estimulación agonista, se cree que la 5-LO se traslada en una manera dependiente de Ca^{2+} a la envuelta nuclear [véase, por ejemplo, J. Woods et al., J. Clin. Invest. 95:2035-2040 (1995)]; en este caso se cree ganar acceso al ácido araquidónico libre, hidrolizado a partir de los fosfolípidos de la envuelta nuclear y presentado por la proteína de unión a ácido araquidónico de la envuelta nuclear integral, proteína de activación de 5-LO (FLAP). El 5-HPETE puede convertirse en el producto estable, 5-HETE. El LTA_{4} puede convertirse enzimáticamente en LTB_{4} (mediante la hidrolasa de LTA_{4}) o en LTC4 (mediante la sintasa de LTC_{4}). A su vez, el LTC_{4} puede convertirse enzimáticamente en LTD_{4} (con un aumento concomitante en la bioactividad) y luego en LTE_{4}; LTE_{4} puede modificarse posteriormente para formar LTF_{4}. La figura 1A es una representación esquemática de la ruta de síntesis de leucotrienos y las estructuras de los productos principales de la ruta metabólica de la 5-lipoxigenasa; de manera importante, la práctica de la presente invención no depende de la precisión del modelo representado en la figura 1A.

La capacidad sintética de leucotrienos celulares puede potenciarse mediante la exposición a varias sustancias biológicamente activas, tales como factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, interferón-\gamma, y factor de crecimiento transformante-\beta. Tal como se describe a continuación en más detalle, los macrófagos alveolares tienen una mayor capacidad para el metabolismo de la 5-LO que los monocitos sanguíneos u otros macrófagos tisulares [Véase, por ejemplo, M. Peters-Golden et al., J. Immunol. 144:263-270 (1990)], y producen tanto LTB_{4} como LTC_{4}. En cambio, los neutrófilos producen sólo LTB_{4}. Los macrófagos alveolares y los neutrófilos producen ambos 5-HETE.

Aunque no se requiere una comprensión de su mecanismo con el fin de poner en práctica la presente invención, se cree que los leucotrienos bioactivos del principio, LTB_{4} y cisteinil- o sulfidopéptido-leucotrienos (leucotrienos C_{4}, D_{4} y E_{4}) actúan interaccionando con los receptores de superficie específicos sobre las células diana. El LTB_{4} es una potente quimotaxina para neutrófilos in vitro, representando la mayor parte de la actividad quimiotáctica elaborada plenamente por los macrófagos alveolares humanos estimulados en cultivo. [T. Martin et al., J. Clin. Invest. 80:1114-1124 (1989)]. Además, la instilación broncoscópica in vivo de LTB_{4} en pulmones humanos dio como resultado un flujo de entrada de neutrófilos. [T. Martin et al., J. Clin. Invest. 80:1009:1019 (1989)].

Aunque la práctica de la presente invención no depende de una comprensión precisa de los efectos de los productos de la ruta de la 5-LO, se cree que LTB_{4} potencia numerosas funciones de los leucocitos, incluyendo la fagocitosis [T. Demitsu et al., Int. J. Immunopharmac. 11:801-808 (1989)], la regulación por incremento de las moléculas CR3 de la superficie celular [P. Marder et al., Biochem. Pharmacol. 49:1683-1690 (1995)], la secreción de O_{2}^{-} e hidrolasas lisosómicas, la movilización de reservas de Ca^{2+} intracelular [C. Serhan et al., Biochem. Biophys. Res. Commun, 107:1006-1012 (1982)], la liberación de ácido araquidónico dependiente de fosfolipasa [J. Wijkander et al., J. Biol. Chem. 270:26543-26549 (1995)], la activación de PKC [J. O'Flaherty et al., J. Immunol. 144:1909-1913 (1990)], la síntesis de interleucina (IL)-8 [R. Strieter et al., Am. J. Pathol. 141:397-407 (1992)], y la activación de la actividad de linfocitos citolíticos naturales [R. Bray y Z. Brahmi Z, J. Immunol. 136: 1783-1790 (1986)]. Se cree que 5-HETE comparte muchas de estas mismas acciones, pero con menor potencia. Los cisteinil-leucotrienos presentan la bioactividad identificada anteriormente como sustancia de reacción lenta. Sus acciones más potentes incluyen la constricción de músculo liso vascular y bronquial y el aumento de la permeabilidad microvascular. También se ha notificado que el LTD_{4} aumenta la expresión de FcR en macrófagos in vitro [J. Rhodes et al., Eur. J. Immunol. 15:222-227 (1985)] y la polimerización de actina [M. Peppenlenbosch et al., Cell 74:565-575 (1993)].

Aunque no se requiere una comprensión de los mecanismos moleculares de la ingestión y destrucción bacteriana por fagocitos con el fin de poner en práctica la presente invención, los receptores de superficie de los fagotitos, que son más críticos para una fagocitosis opsónica eficaz, son aquéllos que reconocen la parte Fc de IgG (FcRII y FcRIII) y el fragmento C3bi del complemento (la integrina CR3, también conocida cono Mac-1 y CD11b/CD18). CR3 también media en la ingestión no opsónica de K. pneumoniae. Una consecuencia de la ligación del receptor es la liberación y el metabolismo del ácido araquidónico. Debido a que CR3 y FcR median en la unión de K. pneumoniae a fagocitos, su expresión en superficie son dianas relevantes para la modulación mediante leucotrienos.

La figura 1B es una representación esquemática de la ruta de síntesis de leucotrienos y de las acciones de los leucotrienos relevantes para la defensa antimicrobiana. Las bacterias, tales como K. pneumoniae, se unen a células fagocíticas tales como macrófagos alveolares y neutrófilos y se fagocitan. Se cree que esto desencadena un aumento en el Ca^{2+} intracelular, lo que a su vez da como resultado el traslado de cPLA_{2} y 5-LO a la envuelta nuclear. Tal como se indicó anteriormente, el ácido araquidónico se hidroliza a partir de fosfolípidos y se metaboliza mediante la 5-LO, interaccionando con FLAP, para dar LTA_{4}. LTA_{4} se convierte adicionalmente en leucotrienos B_{4} y C_{4}. Esto puede afectar a las células diana, mediante interacciones con sus receptores, o bien de manera autocrina o bien de manera paracrina. Como resultado, se promueven la quimiotaxis, la fagocitosis bacteriana y la destrucción bacteriana.

La interrupción de la síntesis o las acciones de los leucotrienos ha sido un objetivo terapéutico primordial de la industria farmacéutica. En la actualidad están disponibles compuestos potentes y específicos que inhiben la síntesis de leucotrienos inhibiendo directamente o bien 5-LO o bien FLAP; ambas clases de agentes inhiben la síntesis de todos los productos de la 5-LO. Además, también están disponibles compuestos que antagonizan específicamente los receptores de LTB_{4} y cisteinil-leucotrienos; a diferencia de la primera clase, estos agentes ofrecen la capacidad de bloquear las acciones de leucotrienos individuales de manera independiente. Aunque estudios preclínicos sugieren una variedad de posibles objetivos de enfermedades, el asma ha recibido la mayor atención en los estudios clínicos.

II. Leucotrienos y defensa antimicrobiana del huésped

Generalmente se supone que las cascadas inflamatorias han evolucionado para el fin de defensa del huésped contra la invasión bacteriana. Sin embargo, se conoce poco acerca de la posible importancia de los leucotrienos endógenos en la mediación en la respuesta del huésped a la infección. La incidencia creciente de inmunosupresión y la aparición de microbios resistentes a antibióticos subrayan la importancia de la comprensión de los mecanismos innatos de defensa del huésped.

La esterilidad de la superficie alveolar pulmonar sufre constantes ataques de microbios inhalados y aspirados. La eliminación eficaz de estos patógenos depende en gran parte de las respuestas inmunitarias innatas que implican la fagocitosis y la destrucción microbiana. Antes del trabajo de los presentes inventores, los investigadores han ignorado en gran parte los productos de la ruta de la 5-LO como una clase potencialmente representante de mediadores inflamatorios en la defensa antimicrobiana.

Los presentes inventores han encontrado que los productos administrados de manera exógena de la ruta de la 5-LO, en general, y en particular leucotrienos, se asocian con varias posibles ventajas como agentes coadyuvantes en el tratamiento de neumonía. Específicamente, los inventores han determinado que estos productos presentan un rápido comienzo de acción y creen que estos productos no provocan respuestas inmunológicas en el receptor. Además, tales productos representan un tratamiento relativamente económico que puede usarse independiente de los antibióticos o como tratamiento coadyuvante para los antibióticos en el tratamiento de neumonía. Poblaciones particulares de pacientes (por ejemplo, pacientes con SIDA, diabetes, fumadores, neonatos y pacientes que padecen alcoholismo y desnutrición) con neumonía grave se beneficiarían del aumento de los mecanismos de defensa endógenos del huésped mediante la administración racional de, por ejemplo, leucotrienos a los pulmones.

Aunque no se requiere una comprensión precisa de los efectos de los leucotrienos en la defensa antimicrobiana del huésped para poner en práctica la presente invención, se cree que se producen ciertos efectos generales. En primer lugar, los leucotrienos endógenos deben estar presentes en los sitios de la infección con el fin de participar en la defensa antimicrobiana, y se ha medido el aumento (en relación a los controles) de los niveles de LTB_{4} en fluido de lavado broncoalveolar (BALF) y tejido de pulmón de ratas infectadas con Pseudomonas aeruginosa [A. Buret et al., Infect. Immun. 61:671-679 (1993)] así como fluido de lavado broncoalveolar de pacientes con neumonía bacteriana [H. Hopkins et al., Chest 95: 1021-1027 (1989)]. Tal como se describe en mayor detalle a continuación, los presentes inventores también han medido los altos niveles de tanto LTB_{4} como LTC_{4} en homogeneizados de pulmón de ratones con neumonía debida a Klebsiella. Klebsiella pneumoniae es la causa clásica de neumonía debida a bacterias Gram-negativas y se ha notificado que representa del 18-64% de neumonías extrahospitalarias y el 30% de neumonías hospitalarias debidas a bacterias Gram-negativas. [L. Crane y A. Lerner, En: Respiratory Infections: Diagnosis and Management (J. Pennington. ed.) (Raven Press, Nueva York), págs. 227-250 (1983)].

En segundo lugar, los leucotrienos añadidos de manera exógena potencian la fagocitosis y/o la destrucción microbiana. Tal como se describió anteriormente, la adición de LTB_{4} promueve la quimiotaxis de neutrófilos así como la fagocitosis de partículas, traducción de señales y secreción de enzimas lisosómicas y oxidantes - de lo que todo se esperaría para facilitar la eliminación bacteriana. De hecho, LTB_{4} potenciaba la fagocitosis y la destrucción in vitro de P. aeruginosa y Salmonella typhimurium por los macrófagos peritoneales [T. Demitsu et al., Int. J. Immunopharmac. 11:801-808 (1989)], y la destrucción in vitro de Schistosoma mansoni por neutrófilos [R. Moqbel et al., Clin. Exp. Immunol. 52:519-527 (1983)]; la inyección intraperitoneal de LTB_{4} también potenciaba la eliminación in vivo de S. typhimurium administrada por la misma vía [T. Demitsu et al., Int. J. Immunopharmac. 11-801-808 (1989)]. Sin embargo, antes de la presente invención, se cree que no se han notificado anteriormente la administración intrapulmonar de leucotrienos y otros productos de la ruta de la 5-LO para su uso terapéutico.

En tercer lugar, la reducción de la síntesis de leucotrienos endógenos aumenta la susceptibilidad a la infección. Se ha notificado que la fagocitosis, la desgranulación y la producción de óxido nítrico se inhiben mediante inhibidores de la 5-LO relativamente específicos, indicando un papel permisivo para los leucotrienos endógenos en estas funciones. De manera interesante, varias situaciones caracterizadas por una predisposición a las infecciones pulmonares se asocian con una capacidad in vitro reducida de los macrófagos alveolares para sintetizar leucotrienos; éstos incluyen tanto estados en seres humanos (infección por VIH y tabaquismo) así como en modelos animales (desnutrición proteico-calórica, deficiencia de vitamina D, y el periodo neonatal). Se ha observado una asociación similar para los leucocitos de sangre periférica de pacientes con diabetes mellitus. Esto plantea la posibilidad de que podría subyacer un defecto en el metabolismo de la 5-LO tras los múltiples defectos en la función de los leucocitos que se han demostrado en diabéticos escasamente controlados. El uso clínico de los agentes anti-leucotrienos en el asma no se ha asociado con un aumento en infecciones respiratorias. Sin embargo, estos estudios han sido generalmente a corto plazo (es decir, varias semanas o meses), y los asmáticos jóvenes, por lo demás sanos, no son una población de pacientes que se esperaría que estuvieran predispuestos a tales infecciones.

III. Activación de 5-LO en macrófagos alveolares y neutrófilos

Se ha demostrado que los macrófagos alveolares tienen una mayor capacidad para la síntesis de leucotrienos que los monocitos de sangre periférica u otros macrófagos de tejido. Ésta es la situación en respuesta tanto a agonistas solubles (ionóforo A23187) como a particulados (zimosano) y para células de seres humanos [M. Balter et al., J. Immunol. 142:602-608 (1989)] así como ratas [M. Peters-Golden et al., J. Immunol. 144:263-270 (1990)] (datos no mostrados). Además, tal como se describe de manera adicional en la sección experimental, el perfil de eicosanoides liberados por los macrófagos alveolares murinos estimulados está comprendido asimismo en gran parte por metabolitos de la 5-LO (véase la figura 2A).

Los presentes inventores han demostrado también que los neutrófilos reclutados a los sitios de inflamación presentan un aumento de la capacidad de síntesis de leucotrienos y un cambio en la distribución de la 5-LO intracelular. De hecho, los presentes inventores han comparado la capacidad de síntesis de leucotrienos y la distribución intracelular de la 5-LO en neutrófilos de rata aislados de sangre periférica o de líquido de lavado peritoneal 4 horas después de la instilación con glucógeno. Los neutrófilos inducidos presentaron una capacidad máxima 5-veces mayor para la síntesis de LTB_{4} en respuesta a A23187 que los neutrófilos sanguíneos estudiados en paralelo (datos no mostrados). Además, las dos poblaciones de células presentaron distribuciones celulares de la 5-LO sorprendentemente diferentes en el estado en reposo. Tal como se demostró anteriormente para los neutrófilos sanguíneos humanos [T. G. Brock et al., J. Biol. Chem, 269:22059-22066 (1994)]; los neutrófilos sanguíneos de rata en reposo contenían exclusivamente 5-LO en el citosol. Por el contrario, los neutrófilos inducidos en reposo contenían una proporción sustancial de su 5-LO dentro del núcleo; tras su posterior activación con ionóforo, tanto las poblaciones de neutrófilos sanguíneos como inducidos mostraron el traslado de la 5-LO a la envuelta nuclear (datos no mostrados).

Además de los hallazgos, descritos anteriormente, con los neutrófilos reclutados al peritoneo, los presentes inventores han observado también una ubicación intranuclear predominante de la 5-LO en neutrófilos reclutados al espacio alveolar, tal como se evidencia en ratas estudiadas 2 días tras la administración intratraqueal de bleomicina. Esto puede demostrarse tanto mediante análisis microscópico de inmunofluorescencia de células de lavado como mediante tinción inmunohistoquímica de secciones de pulmón (datos no mostrados). En total, estos resultados sugieren que, en el proceso de reclutamiento desde el torrente circulatorio hacia diversos sitios anatómicos de la inflamación, los neutrófilos i) importan 5-LO citosólica hacia el núcleo celular y ii) regulan por incremento su capacidad máxima para la generación de leucotrienos. En estos dos sentidos, los neutrófilos reclutados se asemejan a los macrófagos alveolares.

De manera importante, se conoce que existe una capacidad de síntesis de leucotrienos reducida en macrófagos alveolares de seres humanos o animales predispuestos a infecciones pulmonares. Los presentes inventores han examinado la capacidad metabólica de la 5-LO de macrófagos alveolares aislados de diversos estados de seres humanos o animales que se sabe que están asociados con un aumento de la sensibilidad a infecciones pulmonares. Estos estados incluían los estudios controlados con sujetos humanos que fuman [M. Balter et al., J. Lab. Clin. Med. 114:662-673 (1989)], sujetos humanos infectados con el virus de inmunodeficiencia humana (recuento de CD4 inferior a 200) [M. Coffey et al., J. Immunol. 157:393-399 (1996)], ratas deficientes en vitamina D [M. J. Coffey et al., Prostangladins 48:313-329 (1994)], terneros recién nacidos, y ratones alimentados con alcohol. En todos los casos, los sujetos no presentaban ninguna evidencia de infecciones bacterianas de pulmón en el momento del estudio. En cada una de estas circunstancias, la capacidad in vitro de los macrófagos alveolares para la síntesis de leucotrienos se redujo en un 60-90% en comparación con los niveles control. Estos hallazgos indican que la administración de leucotrienos exógenos debe potenciar el mecanismo de defensa del huésped en pacientes sensibles a infecciones de las vías respiratorias bajas.

IV. Papel de leucotrienos en la respuesta del huésped in vivo

El desarrollo de los ratones deficientes en leucotrienos mediante la alteración dirigida del gen de la 5-LO representa una herramienta importante para evaluar el papel de los leucotrienos generados de manera endógena. [J. Goulet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12852-12856 (1994); X. Chen et al., Nature 372:179-182 (1994)]. Se ha encontrado que estos ratones deficientes tienen una capacidad reducida para reclutar neutrófilos en la mayoría de los modelos de inflamación. Los presentes inventores sometieron a prueba los ratones deficientes en 5-LO comercialmente disponibles para mostrar adicionalmente que la capacidad de síntesis de leucotrienos endógenos deteriorada está relacionada, de manera causal, con la defensa antimicrobiana deteriorada del pulmón.

Por diferentes motivos, los presentes inventores usaron Klebsiella pneumoniae como patógeno causal para inducir neumonía. En primer lugar, tal como se trató anteriormente, es de gran relevancia clínica en neumonía. En segundo lugar, provoca una respuesta inflamatoria rápida en ratones. [A. McColm et al., J. Antimicrob. Chemother. 18:599-608 (1986)]. En tercer lugar, se ha caracterizado extensamente el modelo de K. pneumoniae murino por uno de los co-inventores. En los experimentos descritos a continuación, se utilizó inyección intratraqueal (i.t.) en vez de la aerosolización porque se asemeja más al bolo de organismos que alcanza el pulmón distal mediante microaspiración. Tras la exposición intratraqueal de ratones CD-1 con 10^{3} UFC de K. pneumoniae, el flujo de entrada de neutrófilos alcanza un pico a las 48 horas y la mayoría de los animales han muerto antes del día 5. Además, aumentaron los niveles en homogeneizado de pulmón de varias citocinas y también alcanzaron un pico a las 48 horas; éstos incluyen el factor de necrosis tumoral (TNF), la proteína inflamatoria de macrófago-2 (MIP-2), proteína inflamatoria de macrófago-1\alpha (MIP-1\alpha), IL-12 e IL-10.

Con el fin de aplicar este modelo de neumonía a ratones deficientes en 5-LO, los presentes inventores identificaron en primer lugar un inóculo de organismos que era apropiado para la cepa de referencia de tipo natural, 129/SvEv. Esta cepa de ratones demostró ser incluso más sensible a Klebsiella pneumoniae que la cepa CD-1. Específicamente, estudios anteriores determinaron que se produjo una mortalidad de aproximadamente el 50% en los animales de tipo natural con un inóculo bacteriano de sólo 50 UFC, indicando que los ratones 129/SvEv eran sustancialmente más sensibles a neumonía por Klebsiella que la cepa CD-1. [M. Greenberger et al., J. Immunol. 155:722 (1995)]. El requisito para un bajo inóculo bacteriano hace de esto un modelo experimental relevante para neumonía debida a bacterias Gram-negativas en seres humanos, que generalmente se cree que resulta de la microaspiración del contenido bucofaríngeo que contiene pequeños números de organismos.

Aunque la presente invención utiliza un modelo de a K. pneumoniae murina, la presente invención no se limita a aumentar el tratamiento de infecciones provocadas por ese organismo. De hecho, la presente invención contempla la administración de productos de la ruta metabólica de la 5-LO, en la que dicho producto de la ruta de la 5-lipoxigenasa comprende un leucotrieno seleccionado del grupo que consiste en leucotrieno B_{4}, leucotrieno B_{4}-d_{4}, dimetilamida de leucotrieno B_{4}, 6-trans-leucotrieno B_{4}, 6-trans-12-epi-leucotrieno B_{4}, 12-epi-leucotrieno B_{4}, 18-carboxi-dinor-leucotrieno B_{4}, 20-carboxi-leucotrieno B_{4} y 20-hidroxi-leucotrieno B_{4}, particularmente LTB_{4}, de manera independiente y como coadyuvante (por ejemplo, con antibióticos) para el tratamiento de neumonía y otras infecciones del aparato respiratorio provocadas por una colección de organismos. La tabla 2 enumera algunos de los patógenos bacterianos más comunes que provocan neumonía extrahospitalaria y neumonía intrahospitalaria. Se contempla que los pacientes con infecciones producidas por estos organismos se beneficiarán de la administración de los productos de la ruta metabólica de la 5-LO.

TABLA 2

3

La presente invención no se limita al aumento del tratamiento de la neumonía. De hecho, la presente invención contempla la administración de productos de la ruta metabólica de la 5-LO como terapia en el tratamiento de otras infecciones que tienen manifestaciones pulmonares. Además, tal como se mencionó anteriormente, la presente invención contempla la administración de los productos para el tratamiento y la profilaxis de un amplio espectro de infecciones microbianas además de infecciones bacterianas, incluyendo infecciones producidas por parásitos [R. Moqbel et al., Clin. Exp. Immunol. 52:519-527 (1983)], virus y hongos. Además, la presente invención contempla el aumento del tratamiento de infecciones sistémicas; debe señalarse que la administración sistémica debe realizarse con mucha cautela, dado que se sabe que los leucotrienos provocan hipotensión.

Ha de mencionarse que es probable que el futuro uso de fármacos anti-leucotrienos en seres humanos imite la deficiencia en leucotrienos observada con la alteración del gen de la 5-LO en ratones. En ciertos individuos que están tomando otros agentes inmunosupresores o que tienen un aumento en los números de bacterias en sus vías respiratorias bajas, el uso de tales fármacos puede comprometer la defensa antimicrobiana pulmonar del huésped. Como resultado, estos individuos también pueden beneficiarse de la administración de productos de la ruta de la 5-LO contemplada para su uso con la presente invención; por supuesto, pueden garantizarse programas y regímenes de dosificación particulares cuando se usan estos agentes de manera concomitante con pacientes que toman fármacos anti-leucotrienos.

Tal como se mencionó anteriormente, la presente invención contempla el uso de diversos productos de la ruta metabólica de la 5-lipoxigenasa con el fin de potenciar la defensa bacteriana. Puede usarse el procedimiento de selección completo expuesto en la tabla 3 para evaluar aquellos productos (tales como los compuestos presentados anteriormente en la tabla 1), así como derivados o análogos de tales productos, que pueden ser eficaces. Los leucotrienos B_{4} y C_{4} son particularmente eficaces para potenciar la defensa bacteriana, y esta selección es especialmente apropiada para los compuestos relacionados con aquellos leucotrienos. Con cada determinación se hace referencia a un ejemplo particular; los ejemplos indicados proporcionan una descripción detallada de cómo ha de llevarse a cabo la determinación.

TABLA 3

4

Tal como se ilustra mediante este esquema de la secuencia de procedimientos experimentales y la descripción de los propios procedimientos, la consideración cuidadosa permite que se evalúe cualquier compuesto (por ejemplo, "compuesto X") para su uso con la presente invención. De hecho, tal como se describe en detalle en la sección experimental, se han empleado estos procedimientos de selección en los experimentos realizados con LTB_{4}.

V. Composición y administración de compuestos

La presente invención contempla el uso de composiciones terapéuticas de productos de la ruta metabólica de la 5-LO que se indican que son eficaces basándose en la aplicación de la selección descrita anteriormente. No se pretende que la presente invención se limite por la naturaleza particular de la preparación terapéutica. Por ejemplo, tales composiciones pueden proporcionarse junto con líquidos fisiológicamente tolerables (por ejemplo, solución salina), gel o portadores o vehículos, diluyentes, adyuvantes y excipientes, tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, y simulares, y combinaciones de los mismos. Estas composiciones contienen normalmente del 1%-95% de principio activo, preferiblemente del 2-70%. Además, si se desea, las composiciones pueden contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o agentes emulsionantes, agentes estabilizantes o de tamponamiento de pH o conservantes. En términos generales, la naturaleza de la composición dependerá del método de administración.

Estas preparaciones terapéuticas pueden administrarse a mamíferos para su uso veterinario, tal como con animales domésticos, y su uso clínico en seres humanos de una manera similar a otros agentes terapéuticos. En general, la dosificación requerida para la eficacia terapéutica variará según el tipo de uso y el modo de administración, así como los requisitos particularizados de los huéspedes individuales y el organismo implicado.

Un modo de administración preferido comprende la administración al pulmón. Los pacientes que están suficientemente enfermos como para requerir ventilación mecánica, pueden recibir tratamiento con agentes farmacológicos administrados mediante el tubo endotraqueal que se conecta al ventilador. Alternativamente, el suministro intrapulmonar de los agentes farmacológicos a los pacientes que no requieren ventilación mecánica puede lograrse mediante aerosolización. Alternativamente, el agente puede administrarse al pulmón mediante un broncoscopio. Por supuesto, los agentes terapéuticos pueden investigarse para determinar su eficacia mediante otras vías de administración, incluyendo administración parenteral. Sin embargo, cuando el sitio de infección es el pulmón, es probable que dirigir el suministro del fármaco hacia el mismo minimice los efectos secundarios y las consecuencias sistémicas.

Además, los compuestos contemplados por la presente invención tienen atributos como agentes terapéuticos con respecto a otros agentes como polipéptidos. Por ejemplo, los productos de la ruta metabólica de la 5-LO contemplados por la presente invención tienen un rápido comienzo de acción (generalmente en el plazo de 1 hora) y una corta duración de acción (generalmente menos de 12 horas); estos atributos permiten un grado sustancial de control sobre los efectos biológicos. Además, su corta duración de acción reduce la posibilidad de que la administración de leucotrienos y agentes relacionados pueda estimular de manera adversa una respuesta inflamatoria desbordante en exceso. Además, los antagonistas del receptor de leucotrienos comercialmente disponibles (por ejemplo, pueden administrarse antagonistas de cisteinil Accolate® (Zafirlukast) de Zeneca) para impedir además que se produzca una reacción inflamatoria de este tipo.

Tal como se mencionó anteriormente, los productos de la ruta metabólica de la 5-LO contemplados por la presente invención, están asociados con atributos adicionales. Por ejemplo, los productos lipídicos no provocan reacciones inmunológicas como lo hacen los agentes polipeptídicos. Además, los compuestos de la presente invención son relativamente económicos, haciéndolos ideales como coadyuvante para el tratamiento de infecciones.

Los compuestos contemplados por la presente invención proporcionan un medio para potenciar las capacidades de defensa pulmonar. Éstas son específicamente eficaces en el tratamiento y la prevención de neumonía bacteriana en aquellos pacientes que están predispuestos a este estado. Por supuesto, la presente invención contempla el uso de los compuestos en el tratamiento y la prevención de otras infecciones y enfermedades, solos o en combinación con, por ejemplo, otros productos de la ruta de la 5-LO o agentes antimicrobianos.

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Sección experimental

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar ciertas realizaciones y aspectos preferidos de la presente invención y no deben interpretarse como limitativos del alcance de la misma.

En la descripción experimental que sigue, se aplican las siguientes abreviaturas: M (molar); mM (milimolar); \muM (micromolar); N (normal); mol (moles); mmol (milimoles); \mumol (micromoles); nmol (nanomoles); pmol (picomoles); g (gramos); mg (miligramos); \mug (microgramos); l (litros); ml (mililitros); \mul (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); \mum (micrómetros); nm (nanómetros); min. (minutos); s y seg. (segundos); DE (diámetro externo); ºC (grados centígrados); v/v (volumen/volumen); MA (macrófago alveolar); LBA (lavado broncoalveolar); LFBA (líquido de lavado broncoalveolar); cPLA_{2} (fosfolipasa A_{2} citosólica); UFC (unidad formadora de colonia); 5-LO (5-lipoxigenasa); FLAP (proteína activadora de 5-LO); AA (ácido araquidónico); LT (leucotrieno); LTB_{4} (leucotrieno B_{4}); LTC_{4} (leucotrieno C_{4}); LTB_{4}R (receptor de LTB_{4}); cys-LTR (receptor de cisteinil-leucotrieno); CR3 (receptor de complemento-3); FcR (receptor para la parte Fc de Ig); MPO (mieloperoxidasa); PKC (proteína cinasa C); MAPK (proteína cinasa activada por mitógeno); O_{2}^{-} (superóxido); NO (óxido nítrico); MP (macrófagos peritoneales); leucocitos polimorfonucleares (PMN); KO ("knockout", deficiente); WT ("wild type", de tipo natural); TNF (factor de necrosis tumoral); JE (el homólogo murino del péptido quimiotáctico de monocitos-1); IL (interleucina); HBBS (solución salina equilibrada de Hank); RP-HPLC (cromatografía de líquidos de alta resolución en fase inversa); EE (error estándar); EEM (error estándar de la media); Abacus (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA); Abbot (Abbott Laboratories, North Chicago, IL); ATCC (Colección americana de cultivos tipo; Rockville, MD); Baxter (McGaw Park. IL); Biogenics (Napa, CA); Cayman (Cayman Chemical; Ann Arbor, MI); Coulter (Coulter Corp., Miami, FL); Difco (Detroit MI); Fisher Scientific. Pittsburg, PA); Gibco (Gibco BRL; Gaithersburg, MD); Jackson (The Jackson Laboratory; Bar Harbor, ME); Merck (Rahway, NJ); Molecular Probes (Eugene, OR); Nunc (Naperville, IL); PharMingen (San Diego, CA); Pierce (Rockford, IL); Pfizer (Pfizer Inc., Nueva York, NY); Vector (Vector Laboratories, Burlingame, CA); y Waters (Waters Corp., Milford, MA); Zeneca (Zeneca Pharmaceuticals, Wilmington, DE).

Se usaron los siguientes métodos generales en los ejemplos que siguen a menos que se indique lo contrario.

Animales

Se obtuvieron ratones con alteración dirigida de su gen de 5-LO (ALOX 5, designado como KO) y sus controles de cepa de tipo natural (129/SvEv, designada como WT) de The Jackson Laboratory.

Inoculación de K. pneumoniae

Se cultivo la cepa de K. pneumoniae 43816, serotipo 2 obtenida de la ATCC (N.º de registro 29939) en caldo de soja tríptica (Difco) durante 18 horas a 37ºC. La preparación y administración intratraqueal de K. pneumoniae se llevó a cabo tal como se describe por M. Scheneemann et al. [J. Infect. Dis. 167:1358-1363 (1993)]. Se determinó la concentración bacteriana midiendo la absorbancia a 600 nm y haciendo referencia a una curva patrón de absorbancias frente a UFC patrón conocidas. Entonces se sedimentaron las bacterias mediante centrifugación durante 30 min. a 10.000 rpm, se lavaron dos veces en solución salina y se resuspendieron a la concentración deseada en solución salina.

Tras diluir apropiadamente las bacterias en solución salina libre de endotoxinas, se anestesiaron los animales con pentobarbital de sodio (aproximadamente 0,2 ml diluidos 1:7 en solución salina, por vía intraperitoneal) y se expuso la traquea mediante una pequeña incisión en la línea media. Se administró un inóculo de 30 \mul que contenía 50 UFC de K. pneumoniae o solución salina mediante una aguja estéril de calibre 26 y se cerró la piel con una grapa quirúrgica. Para la preparación de suero específico de K. pneumoniae, se anestesian ratones de tipo natural de manera similar y se inoculan por vía intratraqueal (con 25 UFC de bacterias); se sangran los animales por vía orbital dos semanas más tarde y se obtiene el suero.

Determinación de UFC en plasma y pulmón

Se determinaron las UFC en plasma y pulmón tal como se describe por M. Scheneemann et al. [J. Infest. Dis. 167:1358-1363 (1993)]. En resumen, se colocaron en hielo los pulmones homogeneizados en 3 ml de solución salina estéril y el plasma recogido en el sacrificio, y se prepararon diluciones en serie 1:10. Se sembraron en placa diez \mul de cada dilución en placas de agar sangre con base de soja (Difco), se incubaron durante 18 horas a 37ºC y se contaron las colonias.

Preparación y análisis de homogeneizados de pulmón

A las 30 y 48 horas tras la inoculación, se anestesiaron ratones y se recogió sangre mediante exsanguinación orbital. Entonces se sacrificaron los ratones mediante dislocación cervical y se recogieron los pulmones completos para la determinación de los niveles de citocinas, la actividad mieloperoxidasa (MPO) y los niveles de leucotrienos. Para el análisis de citocinas y leucotrienos, se homogenizaron los pulmones en 2 ml de tampón que contenía tritón X-100 al 0,5%, NaCl 150 mM, tris-HCl 15 mM, CaCl_{2} 1 mM y MgCl_{2} 1 mM. Entonces se centrifugaron los homogeneizados a 1500 x g durante 10 minutos y se filtraron los sobrenadantes a través de un filtro de jeringa de 1,2 \mum e inmediatamente se congelaron a -20ºC. Se cuantificaron cada uno de TNF, proteína inflamatoria de macrófagos-1\alpha, proteína inflamatoria de macrófagos-2, JE murino e IL-12, usando una modificación de un método de doble ligando tal como se describe por M. Schneemann et al. [J. Infec. Dis. 167:1358-1363 (1993)]. Para la determinación de los niveles de leucotrienos en homogeneizados de pulmón, se extrajeron las muestras en cartuchos Sep-Pak® C_{18} (Waters) para eliminar materiales que pueden reaccionar de manera cruzada, y se evaporaron a sequedad en atmósfera de N_{2}. [J. Wilborn et al., J. Clin. Invest. 97:1827 (1996)]. Se usa un procedimiento análogo con líquido de lavado broncoalveolar.

Se resuspendieron las muestras en tampón de ensayo y se determinaron los niveles de LTB_{4} y LTC_{4} según las instrucciones del fabricante usando kits de inmunoensayo enzimático obtenidos de Cayman Chemical. Se cuantificó la actividad MPO, un índice del flujo de entrada de neutrófilos, en homogeneizados de pulmón tal como se describe por M. Greenberger et al. [J. Inmunol. 155:722 (1995)]. En resumen, se homogenizaron los pulmones en 2 ml de tampón que contenía fosfato de potasio 50 mM, pH 6,0, con bromuro de hexadeciltrimetilamonio al 5% y EDTA 5 mM. Se sonicó y centrifugó el homogeneizado y se mezcló el sobrenadante 1:15 con tampón de ensayo (fosfato monobásico de sodio 86 mM, fosfato dibásico de sodio 12 mM, H_{2}O_{2} al 0,0005% [v/v] y clorhidrato de o-dianisidina 0,167 mg/ml) y se leyó a 490 nm (Beckman DU-64). Se calcularon las unidades de MPO como el cambio de absorbancia con el tiempo. Se determinó el contenido en proteína de los homogeneizados usando una modificación de la placa de microtitulación (Pierce Biochemical) del método de Bradford usando albúmina sérica bovina como patrón.

Lavado de pulmón

Se expuso la traquea a través de una incisión de 0,5 cm y se intubó usando un catéter de polietileno de DE de 1,7 mm. Se realizó el lavado broncoalveolar mediante instilación de alícuotas de 1 ml de solución salina tamponada con fosfato que contenía EDTA 5 mM. Se recuperaron aproximadamente 4 ml de líquido de lavado por ratón, y se determinaron los números de células totales y los recuentos de células diferenciales a partir de citocentrifugados de cada muestra.

Cultivo de macrófagos alveolares y ensayos funcionales

Para los ensayos de destrucción y fagocitosis bacteriana, se purificaron macrófagos alveolares a partir de células de lavado broncoalveolar mediante adherencia durante 1 hora en HBSS y se estudiaron en cultivo en monocapa. Se preincubaron las células adherentes con suero inmunitario específico de K. pneumoniae al 5% (como fuente tanto de complemento como de anticuerpo opsonizante específico) durante 5 minutos a 37ºC antes de los ensayos. Se estudió la fagocitosis incubando 10^{5} macrófagos alveolares con 10^{6} K. pneumoniae en cada pocillo de una placa Labtek® (Nunc) de 8 pocillos durante 1 hora a 37ºC; en algunos experimentos, se añadió LTB_{4} exógeno (Cayman) de manera concomitante con las bacterias. Se aspiraron los sobrenadantes y se lavaron las células 3 veces con HBSS. Entonces, se dejaron secar los portaobjetos al aire, se realizó una tinción con Diff-Quik® (Difco) y se contaron 200 células por pocillo para determinar el número de K. pneumoniae intracelulares y el porcentaje de macrófagos alveolares que contenían bacterias. Se calculó el índice fagocítico como el porcentaje medio de macrófagos alveolares que contenían bacterias multiplicado por el número medio de bacterias por macrófago alveolar.

Se sometió a ensayo la actividad bactericida incubando durante 1 hora a 37ºC el mismo número de macrófagos alveolares y organismos tal como se detalló anteriormente, pero en placas de cultivo de tejidos de 35 mm. Se eliminaron los sobrenadantes y entonces se lavaron las células con HBSS y se lisaron añadiendo 1 ml de agua estéril fría, raspando con varilla de vidrio con punta de caucho, e incubando en hielo durante 10 minutos. Se añadió un ml de 2x HBSS a cada placa y se diluyeron en serie los lisados en placas de agar sangre. Se incubaron las placas durante 18 horas a 37ºC y se realizaron recuentos de colonias. Se calculó el porcentaje de destrucción de bacterias intracelulares mediante la siguiente fórmula: 100 - (número de UFC bacterianas/ml de lisado de macrófagos alveolares dividido entre el número total de bacterias intracelulares), en la que K. pneumoniae intracelular total es el producto del número total de macrófagos alveolares x el porcentaje de macrófagos alveolares que contienen bacterias x el número medio de bacterias por macrófago alveolar.

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Cultivo de neutrófilos y ensayos funcionales

Para obtener neutrófilos inducidos en el peritoneo, se les inyecta a ratones por vía intraperitoneal glucógeno al 5% en PBS y se realiza el lavado peritoneal 5 horas más tarde. Se obtienen aproximadamente 3 x 10^{6} células de cada animal, aproximadamente el 85-90% de las cuales son neutrófilos. Estas células se ponen asimismo en cultivo para estudios funcionales. Se realizan ensayos fagocíticos y bactericidas tal como se describió anteriormente.

El lavado pulmonar de animales expuestos a K. pneumoniae produjo una mezcla de neutrófilos y macrófagos alveolares; se encontraron en una razón de aproximadamente 1:1 a los 2 días tras la inoculación, aunque es probable que la razón varíe con el tiempo. Para determinar la secreción constitutiva de leucotrienos por estas células, se ponen en cultivo células de lavado broncoalveolar mezcladas (5 x 10^{3} células/pocillos) tal como se describió anteriormente para poblaciones purificadas; se determina la razón de neutrófilos:macrófagos alveolares en monocapas adherentes mediante tinción con Diff-Quik® directa de las monocapas tras la eliminación del medio. En todos los casos en los que se cuantifican los niveles de leucotrienos en cultivo, se expresan los valores por \mug de proteína celular. El medio de cultivo es medio 199 (Gibco).

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Administración in vivo de leucotrienos y fármacos anti-leucotrienos

Se suspenden en metilcelulosa las dosis del inhibidor de la 5-LO (A-79175; Abbott), del antagonista del receptor de LTB_{4} (CP-105.696; Pfizer) y del antagonista del receptor de cisteinil-leucotrieno (MK-571; Merck Research Laboratories) y se administran una vez al día por vía oral a ratones sin anestesiar usando una aguja de sonda nasogástrica de calibre 22.

Se diluyeron las disoluciones madre etanólicas de LTB_{4}, LTC_{4} y 5-HETE (Cayman Chemical) en solución salina y se usó un volumen de 10 \mul para la inyección intratraqueal. Para la nebulización, se utiliza un tamaño de partícula < 3 \mum y una cámara de exposición sólo para la nariz.

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Tinción inmunohistoquímica para 5-LO

Se tiñen secciones de pulmón así como citocentrifugados de lavado broncoalveolar para 5-LO con el fin de identificar la frecuencia y los tipos de células que presentan localización de la enzima en la envuelta nuclear (un patrón "activado"). [J. Wilborn et al., J. Clin. Invest. 97:1827-1836 (1996)]. En resumen, se fijan las muestras en paraformaldehído al 4%, se incrustan en parafina y se cortan secciones de 3 \mum de espesor y se montan sobre portaobjetos Superfrost/PLUS® (Fischer Scientific). Se extrae la parafina con Americlear® (Baxter) y se rehidrata el tejido. Para reducir la unión no específica, se incuba el tejido con Power Block® (Biogenics) seguido de suero normal de cabra al 25%.

Se incuban las secciones y los citocentrifugados a 4ºC durante 24 horas con o bien antisuero de conejo anti-5-LO humano (Merck Frost Canadá) o bien suero de conejo no inmunitario a 1:1000 en suero normal de cabra al 25% en PBS. Este anticuerpo reconoce también la 5-LO murina y de ratón. Entonces, se aplica anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo (1:600) durante 30 minutos y se detecta el anticuerpo primario usando sustrato de peroxidasa True-Blue® con contratinción de Contrast Red® (ambos de KPL Laboratories). Se determina la proporción de células teñidas positivamente que presentan un patrón activado a partir de recuentos de 20 campos de gran aumento. Las células que se tiñeron positivamente para 5-LO (se espera que la mayoría de ellas sean o bien macrófagos o bien neutrófilos) se clasifican respecto al tipo de célula basándose en su morfología. Si es necesario para distinguir entre neutrófilos y macrófagos alveolares, se realiza doble tinción. Se consigue una tinción específica del tipo de célula o bien con un segundo anticuerpo primario (por ejemplo, anticuerpo anti-neutrófilo) o bien mediante tinción histoquímica (por ejemplo, para MPO o estearasa no específica). La segunda proteína se detecta mediante Vector Red® para contrastar con la tinción con True-Blue® para 5-LO.

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Expresión en la superficie celular de CR3 y receptores FcR

Se cuantifica la expresión de CR3 y FcR tanto en macrófagos alveolares como en neutrófilos mediante tinción con anticuerpos monoclonales anti-ratón conjugados con FITC con posterior análisis mediante citometría de flujo. [L. Laichalk et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 658:1-7 (1996)]. Los anticuerpos monoclonales conjugados con FITC (PharMingen) incluyen IgG_{1} anti-CR3, IgG_{1} anti-FcRII/FcRIII y un control de isotipo anti-IgG_{1}. Se llevan a cabo incubaciones experimentales en suspensión. Se tiñen 5 x 10^{5} células con 1 \mug de anticuerpo monoclonal durante 30 minutos en hielo, se lavan, se fijan en paraformaldehído al 2% en PBS y se almacenan a 4ºC en la oscuridad hasta que se analicen. Se analizan las muestras en un citómetro de flujo EPICS C con el software adjunto (Coulter Corp.) disponible en la Flow Cytometry Core Facility de la Universidad de Michigan, examinando al menos 20.000 acontecimientos por muestra. Tras la corrección para la tinción mediante la IgG de control, se determinan tanto el porcentaje de células teñidas positivamente como la intensidad de fluorescencia media.

Análisis de la polimerización de actina

La internalización ("engulfment") de las partículas unidas o bacterias requiere un reordenamiento del citoesqueleto, incluyendo la polimerización de la actina local. Se analiza la actina polimerizada (F-actina) mediante tinción con rodamina-faloidina (Molecular Probes) a una dilución 1:300. Se evalúa la localización intracelular de la F-actina mediante microscopía de inmunofluorescencia. Se fijan las células sobre cubreobjetos con formalina y se permeabilizan con acetona. [T.G.Brock et al., J. Biol. Chem. 269:22059-22066 (1994)]. Tras la incubación con faloidina durante 1 hora, se examinan las células con un microscopio Labophot 2 de Nikon equipado para epifluorescencia. Para cuantificar el contenido celular total en F-actina, se permeabilizan las células con tritón X-100 al 0,1% y se incuban con rodamina-faloidina y se analizan mediante citometría de flujo. [R. Crowell et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 12: 190-195 (1995)].

Evaluación de la fusión de fagosomas-lisosomas

Se marcan previamente las células adherentes de los ratones deficientes o de tipo natural mediante incubación durante 15 minutos con naranja de acridina 5 \mug/ml (Molecular Probes). Se lavan las células, se preincuban con suero inmunitario específico y entonces se incuban durante hasta 2 horas con K. pneumoniae sola o en presencia de leucotrienos exógenos. Se examinan las células mediante microscopía de inmunofluorescencia. Se cuentan doscientas células por estado, y se registra el porcentaje de células que muestran fusión así como el número total de cifras de fusión.

Ensayos para O_{2}^{-}, NO y \beta-glucuronidasa

Se evalúa la producción de superóxido por 0,5 - 1,0 x 10^{6} células adherentes incubadas con 0,5 - 1,0 x 10^{7} K. pneumoniae o acetato-miristato de forbol 100 nM a partir de la reducción de ferricitocromo C que puede inhibirse por la superóxido dismutasa. [L. Laichalk et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 658:1-7 (1996)]. El ensayo se realiza en placas de 96 pocillos, y se lee a 550 nm. Se determina la generación de NO cuantificando el nitrito, su metabolito, en medio de cultivo complementado con L-arginina de 10^{6} células incubadas durante 2 horas con bacterias [M. Schneemann et al., J. Infect. Dis. 167:1358-1363 (1993)]. Se centrifuga el medio para eliminar las bacterias y se añade a los sobrenadantes reactivo de Griess (diclorhidrato de N-1-naftiletilendiamina al 0,05%, sulfanilamida al 0,5%, ácido fosfórico al 2,5%) y se incuban en placas de 96 pocillos durante 10 minutos; se lee la absorbancia a 570/630 nm. Se cuantifica la enzima lisosómica \beta-glucuronidasa en el medio y los lisados celulares [W. Hsueh et al., Exp. Lung Res. 13:385-399 (1987)] usando el reactivo trihidrato de 4-metilumbeliferil-\beta-D-glucurónido; se lee la fluorescencia a 375/455.

Análisis estadístico

Se analizaron los datos usando el paquete estadístico Statview II® (Abacus Concepts). Se realizaron las comparaciones para los datos de supervivencia usando el análisis de la chi-cuadrado. Todos los demás datos se expresaron como media \pm EEM. Se llevaron a cabo las comparaciones entre las medias de tratamiento usando una prueba de t de Student bilateral o la prueba de suma de rangos de Wilcoxon, según sea apropiado (es decir, dependiendo de si los datos son paramétricos o no paramétricos). Para las comparaciones de datos medios de tres o más grupos experimentales, se usa ANOVA y la posterior aplicación de la prueba de Newman-Keuls. El criterio de significancia fue p \leq 0,05.

Ejemplo 1 Supervivencia tras la exposición intratraqueal a Klebsiella en ratones deficientes en 5-LO y ratones de tipo natural

Se sabe que la instilación intratraqueal de K. pneumoniae en ratones provoca una neumonía reproducible caracterizada por inflamación pulmonar aguda que, dependiendo del inóculo, o bien se resuelve o bien da como resultado la muerte. [G. Rosen et al., FASEB J. 9:200-209 (1995)]. Para evaluar el papel de los productos de la 5-LO en la defensa pulmonar del huésped, este ejemplo compara la supervivencia de ratones deficientes en 5-LO y ratones de tipo natural.

Perfiles de eicosanoides

Las figuras 2A y B representan los perfiles de RP-HPLC de eicosanoides radioactivos liberados por macrófagos alveolares marcados previamente obtenidos de ratones de tipo natural (figura 2A) y de ratones deficientes en 5-LO (figura 2B). Se obtuvieron los perfiles marcando previamente 10^{6} macrófagos alveolares durante la noche con ácido [^{3}H]araquidónico. Entonces se lavaron los macrófagos alveolares y se estimularon durante 30 minutos con A23187 1 \muM. Se sometió el medio a extracción de lípidos y se separaron los eicosanoides radiomarcados mediante HPLC en fase inversa. Se identificaron los picos basándose en la coelución con patrones auténticos. En comparación con células de animales control de tipo natural (figura 2A), los macrófagos alveolares de animales KO no produjeron leucotrienos o 5-HETE, tal como se esperaba. Además, no hubo aumento de la producción de prostaglandinas a partir de una posible "derivación" del ácido araquidónico. Esto indica que cualquier reducción en la defensa antimicrobiana en estos animales puede atribuirse probablemente a su deficiencia en leucotrienos proinflamatorios, en vez de a una sobreproducción de prostaglandina E_{2} antiinflamatoria.

Supervivencia de ratones

Para este experimento, se inocularon por vía intratraqueal ratones deficientes en 5-LO y ratones de tipo natural de cepa coincidente (129/SvEv) (diez animales por grupo) con 50 UFC de bacterias y se monitorizó la supervivencia a lo largo de un periodo de 12 días. La figura 3 representa gráficamente el efecto de la exposición a K. pneumoniae sobre la supervivencia de ratones deficientes en 5-LO (círculos negros) y ratones de tipo natural (cuadrados en blanco) (*p<0,05 frente a WT). Tal como indican los resultados en la figura 3, la administración de 50 UFC de bacterias condujo a un 60% de mortalidad en ratones de tipo natural en el plazo de 8 días, sin posteriores muertes después. Por el contrario, todos los ratones deficientes murieron en respuesta a esta misma exposición, produciéndose todas las muertes para el día 10. Además, las muertes en el grupo deficiente se produjeron antes que en los animales de tipo natural.

Estos resultados indican que los productos metabólicos de la 5-LO desempeñan un papel importante en la respuesta protectora del huésped en este modelo de neumonía. La importancia de los acontecimientos tempranos tras la exposición bacteriana viene indicada por el hecho de que las curvas de supervivencia en la figura 3 divergen ya en el día 2.

Ejemplo 2 Eliminación de bacterias tras la exposición intratraqueal a Klebsiella en ratones deficientes en 5-LO y ratones de tipo natural

Tal como se expuso en el ejemplo anterior, son importantes los acontecimientos tempranos tras la exposición bacteriana (es decir, aproximadamente dos días tras la exposición). Este ejemplo explora además esos resultados evaluando las UCF en plasma y homogeneizado de pulmón a las 30 y 48 horas tras la administración de K. pneumoniae.

Se inocularon ratones deficientes y ratones de tipo natural con 50 UFC por vía intratraqueal, y se determinaron los niveles de homogeneizado de pulmón y los valores de UFC en plasma 48 horas más tarde. La figura 4 representa gráficamente la eliminación de K. pneumoniae del pulmón y el plasma tras la exposición en ratones deficientes en 5-LO (barras con doble rayado) y ratones de tipo natural (barras negras) (las barras representan la media \pm EE; n = 5-19 animales; *p<0,05 frente a WT). Tal como se indica mediante los datos en la figura 4, la media de las UFC en pulmón así como en plasma fueron casi dos logaritmos mayores en ratones deficientes que en ratones de tipo natural a las 48 horas tras la exposición. Además, la proporción de animales deficientes que desarrollaron bacteriemia en este punto de tiempo (15/19) fue significativamente mayor que la de ratones de tipo natural (10/19). En un grupo adicional de animales estudiados a las 30 horas tras la exposición, el 66% de los ratones deficientes eran bacteriémicos (UFC en plasma promedio de 1,06 x 10^{5}), mientras que los ratones de tipo natural no tenían bacterias en su plasma en este punto de tiempo (datos no mostrados).

Estos datos confirman la importancia de un sistema de generación de leucotrienos intacto para la contención temprana de una exposición pulmonar con K. pneumoniae.

Ejemplo 3 Efecto de la deficiencia en leucotrienos y leucotrienos exógenos sobre las funciones antibacterianas de macrófagos alveolares in vitro

Los experimentos de este ejemplo evalúan la capacidad de los propios macrófagos alveolares, la primera línea de defensa celular, para fagocitar y destruir K. pneumoniae in vitro y el efecto de la administración de leucotrienos exógenos sobre las funciones antibacterianas de macrófagos alveolares in vitro.

Actividades fagocíticas y bactericidas de macrófagos alveolares de ratones deficientes en 5-LO y ratones de tipo natural

Se purificaron los macrófagos alveolares mediante adherencia de células de lavado broncoalveolar lavadas de animales de tipo natural y deficientes no infectados, y se preincubaron durante 5 minutos con suero inmunitario específico de K. pneumoniae al 5% (como fuente tanto de complemento como de anticuerpo opsonizante específico) antes de los ensayos. Se incubaron los macrófagos alveolares cultivados de cualquier grupo de ratones en presencia de suero específico con K. pneumoniae durante 1 hora y luego se lavaron, tras lo cual o bien se tiñeron las monocapas con Diff-Quik (Difco) y se contaron los organismos intracelulares, o bien se lisaron y se determinaron las UFC bacterianas en los lisados tras el cultivo durante la noche. Se calcularon el índice fagocítico y la destrucción intracelular tal como se detalló anteriormente en los métodos generales.

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La figura 5 representa gráficamente las actividades fagocíticas y bactericidas en macrófagos alveolares aislados de ratones deficientes en 5-LO (barras con doble rayado) y ratones de tipo natural (barras negras); en la figura 5, cada valor representa la media \pm EEM de 6 cultivos por duplicado (*p<0,05 frente a WT). Tal como se indica mediante los datos de la figura 5, los macrófagos alveolares de ratones deficientes en 5-LO demostraron una disminución significativa en sus capacidades tanto para ingerir como para destruir K. pneumoniae en comparación con células de ratones de tipo natural. Dado que la destrucción de microbios depende de su ingestión previa, la magnitud del defecto de la defensa del huésped en los macrófagos alveolares de animales deficientes refleja el producto aritmético de estos dos defectos individuales y equivale a aproximadamente un 60% de reducción en la destrucción microbiana en las condiciones empleadas. Aunque anteriormente se ha notificado que el LTB_{4} exógeno potencia la destrucción de bacterias Gram-negativas por macrófagos in vitro y la eliminación bacteriana in vivo [T. Demitsu et al., Int. J. Immunopharmac. 11:801-808 (1989)], los datos expuestos anteriormente indican un papel importante de los productos endógenos de la 5-LO en estos mismos procedimientos in vivo e in vitro.

Efecto de LTB_{4} exógeno sobre la actividad fagocítica bacteriana de macrófagos alveolares de ratones deficientes en 5-LO y ratones de tipo natural

Se realizaron experimentos adicionales para determinar si podía superarse la fagocitosis defectuosa de K. pneumoniae en macrófagos alveolares de animales deficientes en 5-LO mediante la adición de LTB_{4} exógeno. Se seleccionó este leucotrieno particular porque, tal como se indicó anteriormente, sus propiedades de activación de leucocitos se han caracterizado bien.

Se incubaron macrófagos alveolares de ratones deficientes en presencia de suero específico durante 1 hora con K. pneumoniae sola o en presencia de dosis variables de LTB_{4}. Se calculó el índice fagocítico tal como se describió en los métodos generales. La figura 6 representa gráficamente el efecto de LTB_{4} exógeno (nada, 0,1 nM, y 0,5 nM de LTB_{4} añadido) sobre la actividad fagocítica bacteriana en macrófagos alveolares de ratones deficientes en 5-LO; cada valor representa la media de cultivos por triplicado. Tal como se muestra en la figura 6, LTB_{4} potenció de manera dependiente de la dosis el índice fagocítico en macrófagos alveolares deficientes, con un índice de aproximadamente tres veces el nivel inicial a una concentración de 5 nM. Aunque no se requiere con el fin de poner en práctica la presente invención, se cree que los neutrófilos manifiestan defectos funcionales similares en la fagocitosis y destrucción que podrían contribuir a la sensibilidad a la neumonía bacteriana observada en ratones deficientes in vivo.

También se examinaron los efectos de LTB_{4} exógeno en la fagocitosis por neutrófilos de ratones deficientes en 5-LO. Se obtuvieron neutrófilos inducidos con glucógeno de la cavidad peritoneal de ratones deficientes, y se evaluó la fagocitosis de K. pneumoniae a lo largo de un periodo de tiempo de una hora en presencia y ausencia de LTB_{4} exógeno (1 nM); en estas circunstancias, el índice fagocítico fue de 27 \pm 8 y 45 \pm 4, respectivamente (datos no mostrados). Estos resultados con LTB_{4} exógeno son importantes en varios aspectos. En primer lugar, indican que el defecto fagocítico en estas células está relacionado realmente con la deficiencia en 5-LO, y no es casual. En segundo lugar, el hecho de que la adición de leucotrieno exógeno pudo superar la carencia en 5-LO indica que el defecto funcional en estas células estaba relacionado de manera causal con su deficiencia en leucotrienos endógenos; este hallazgo es contrario a los hallazgos de otros investigadores que encontraron que los defectos funcionales en leucocitos provocados por inhibidores de la 5-LO no pudieron superarse mediante la adición de leucotrienos exógenos. [Véase, por ejemplo, N. Hubbard y K. Erickson. Mol. Immunol. 160:115-122 (1995)]. En tercer lugar, la rapidez de la potenciación de la capacidad fagocítica producida por la adición de leucotrienos exógenos indica que este efecto podría reproducirse mediante el suministro pulmonar de este lípido in vivo; se ha observado un aumento rápido de este tipo en la eliminación bacteriana tras la inyección de LTB_{4} en el peritoneo in vivo [T. Demitsu et al. Int. J. Immunopharmac. 11:801-808 (1989)].

Ejemplo 4 Células y mediadores inflamatorios tras la exposición intratraqueal a Klebsiella en ratones deficientes en 5-LO y ratones de tipo natural

Este ejemplo evalúa los mecanismos responsables del aumento de la sensibilidad de ratones deficientes a neumonía debida a Klebsiella. En efecto, debe entenderse que no se requiere una comprensión de los mecanismos con el fin de poner en práctica la presente invención.

Se inyectaron a ratones de tipo natural por vía intratraqueal o bien 50 UFC de bacterias (Klebsiella pneumoniae) o bien solución salina sola. Dos días más tarde, se recogieron los pulmones y se homogenizaron. Se sometieron los homogeneizados a extracción de lípidos y se cuantificaron los leucotrienos B_{4} y C_{4} inmunorreactivos. La figura 7 representa gráficamente los niveles de LTB_{4} (barras con doble rayado) y LTC_{4} (barras negras) en homogeneizado de pulmón tras la exposición con o bien K. pneumoniae o bien solución salina (los valores representan la media \pm EEM; n = 5 animales; *p<0,05 frente a solución salina).

Tal como ilustran los resultados en la figura 7, los niveles tanto de leucotrieno B_{4} como C_{4} estuvieron elevados en los homogeneizados de pulmón de ratones de tipo natural 48 horas tras la exposición con bacterias en comparación con solución salina. Dado que LTB_{4} es una potente quimiotaxina de neutrófilos en ratones y se considera el reclutamiento de neutrófilos como un componente esencial de la eliminación bacteriana, la presencia de altos niveles de LTB_{4} en los pulmones de animales de tipo natural expuestos a bacterias indica que el aumento de la sensibilidad a contraer neumonía en animales deficientes podría reflejar una capacidad reducida para reclutar neutrófilos al órgano infectado. Con el fin de evaluar esta posibilidad, se realizaron recuentos directos de neutrófilos de lavado broncoalveolar de citocentrifugados (figura 8) y se sometió a ensayo de manera espectrofotométrica la actividad MPO del homogeneizado de pulmón (datos no mostrados) [M. Greenberger et al., J. Immunol. 155:722-729 (1995)]. Se inocularon ratones deficientes y ratones de tipo natural por vía intratraqueal con o bien 50 UFC de bacterias o bien solución salina sola. Dos días más tarde, se realizó el lavado de pulmón y se determinó el recuento de neutrófilos totales. La figura 8 representa gráficamente el efecto de la exposición a K. pneumoniae en la neutrofilia del lavado en ratones deficientes en 5-LO (barras con doble rayado) y ratones de tipo natural (barras negras) (los valores representan la media \pm EEM; n = 3-12 animales; *p<0,05 frente a solución salina; ND, no detectado).

Ambas técnicas indicaron que se produjo un grado significativo de flujo de entrada de neutrófilos a las 48 horas en los pulmones de tipo natural expuestos a bacterias en comparación con los pulmones de tipo natural expuestos a solución salina. Sin embargo, de manera sorprendente, los ratones deficientes no presentaron menor flujo de entrada de neutrófilos tras la exposición bacteriana que los ratones de tipo natural.

Aunque no se requiere el mecanismo preciso para poner en práctica la presente invención, se realizaron experimentos para determinar si la capacidad intacta para reclutar neutrófilos en este modelo murino refleja un aumento compensatorio en los animales deficientes para generar señales quimiotácticas alternativas tales como quimiocinas. Una evaluación de los niveles de MIP-1\alpha, MIP-2 y JE (el homólogo murino del péptido quimiotáctico de monocitos-1) antigénicos en homogeneizados de pulmones expuestos a Klebsiella en este mismo punto de tiempo (es decir, 48 horas tras la exposición) no dio a conocer diferencias significativas entre ratones deficientes y de tipo natural (datos no mostrados). Alternativamente, aunque no se requiere una comprensión del mecanismo con el fin de poner en práctica la presente invención, es posible que los animales deficientes puedan presentar un aumento de la generación de componentes del complemento o una mayor capacidad de respuesta a quimiocinas o quimiotaxinas bacterianas.

Aunque no son directamente quimiotácticos, se ha demostrado que tanto IL-12 como TNF desempeñan papeles protectores críticos en este modelo de neumonía murina. Además, la producción de TNF se potencia mediante los leucotrienos en algunos sistemas experimentales. Para examinar la posibilidad de que la sensibilidad potenciada de los ratones deficientes a la exposición bacteriana pueda estar relacionada con un deterioro de la capacidad para generar cualquiera de esta citocinas, se analizaron homogeneizados de pulmón 48 horas tras la exposición bacteriana. De nuevo, no se encontraron diferencias significativas en los niveles de IL-12 o TNF antigénicos entre ratones de tipo natural y deficientes infectados (datos no mostrados). Por tanto, el aumento de la letalidad de la neumonía en ratones deficientes en 5-LO no refleja la capacidad disminuida para producir estas citocinas proinflamatorias.

Ejemplo 5 Efecto de leucotrienos exógenos sobre las funciones antibacterianas de macrófagos alveolares in vitro

Tal como se notificó anteriormente, el LTB_{4} exógeno aumentó el índice fagocítico de macrófagos alveolares deficientes en 5-LO en aproximadamente el 300%, más de lo que sería necesario para simplemente alcanzar el nivel de control manifestado por las células de tipo natural (aproximadamente el 50% de aumento). Este resultado indica que el leucotrieno está presentando un efecto farmacológico. Los experimentos de este ejemplo evalúan además los efectos de LTB_{4} exógeno sobre la capacidad fagocítica de macrófagos alveolares normales y examinan los efectos de otros productos de la 5-LO además de LTB_{4}.

Se adhirieron macrófagos alveolares de ratas Wistar y entonces se incubaron durante 1 hora con K. pneumoniae sola o en presencia de 1 nM de varios metabolitos de la 5-LO (LTB_{4}, LTC_{4} y 5-HETE). Posteriormente se determinó el índice fagocítico tal como se describió anteriormente en los métodos generales.

La figura 9 representa gráficamente el efecto de los metabolitos de la 5-LO exógenos sobre la actividad fagocítica bacteriana en macrófagos alveolares de rata normales. Cada valor en la figura 9 representa la media \pm EEM de 4 cultivos por duplicado. Tal como los datos indican, LTB_{4} provocó un aumento de aproximadamente 6 veces en el índice fagocítico en macrófagos alveolares de rata normales. El metabolito 5-HETE tuvo un efecto similar, aunque menos pronunciado. De manera interesante, LTC_{4} aumentó la fagocitosis en un grado similar a LTB_{4}. Aunque se ha observado que los cisteinil-leucotrienos como LTC_{4} regulan por incremento la expresión de FcR de superficie en macrófagos, anteriormente no se ha observado el aumento de la capacidad fagocítica. Estos resultados indican que los leucotrienos exógenos como grupo parecen tener un marcado efecto farmacológico sobre la función de macrófagos alveolares normales.

También se realizó un experimento relacionado para determinar si la capacidad de LTB_{4} para potenciar la fagocitosis bacteriana está mediada mediante su interacción con receptores de LTB_{4}. Este experimento se basó en el hecho de que el pretratamiento con LTB_{4} desensibiliza las células frente a una posterior receptividad para LTB_{4}; aunque no se requiere una comprensión del mecanismo de este efecto para poner en práctica la presente invención, se cree que la desensibilización se produce mediante regulación por disminución de la expresión o acoplamiento del receptor. Para este experimento se pretrataron células con LTB_{4} (1 nM) durante 1 hora, se lavaron y se incubaron con bacterias más LTB_{4}.

Los resultados, representados gráficamente mediante la barra marcada "LTB_{4} \rightarrow LTB_{4}" en la figura 9, indican que el pretratamiento con LTB_{4} suprimió casi completamente la capacidad de esta misma dosis de LTB_{4} (1 nM) de aumentar la fagocitosis de K. pneumoniae cuando se añade de manera simultánea con bacterias. Los hallazgos indican que los receptores de LTB_{4} están implicados en la potenciación de la fagocitosis de macrófagos alveolares inducida por LTB_{4}.

Ejemplo 6 Efecto de la administración intratraqueal de LTB_{4} sobre la eliminación bacteriana pulmonar en ratones deficientes

Dado que se encontró que los ratones deficientes en 5-LO mostraban una eliminación pulmonar reducida de K. pneumoniae in vivo, y los leucotrienos exógenos pudieron superar el defecto fagocítico in vitro observado en macrófagos alveolares de ratones deficientes, se realizó un experimento para evaluar el efecto de la administración intrapulmonar de leucotrieno sobre la eliminación bacteriana in vivo.

Se administró LTB_{4} junto con el inóculo intratraqueal de K. pneumoniae (50 UFC). Se eligió una dosis de 6 ng de LTB_{4} por vía intratraqueal por animal por dos razones. En primer lugar, anteriormente otros investigadores encontraron que esta dosis y vía dieron como resultado un flujo de entrada rápido de neutrófilos 6 horas tras la administración en ratones. [N. Ahmed et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153:1141-1147 (1996)]. En segundo lugar, los presentes inventores encontraron anteriormente (véase figura 5) que podían medirse aproximadamente 7 ng de LTB_{4} total en el homogeneizado de un par de pulmones de ratones de tipo natural expuestos a Klebsiella. Se expusieron tres grupos de animales por vía intratraqueal con bacterias (n = 4 animales por grupo): i) ratones de tipo natural, ii) ratones deficientes en 5-LO e iii) ratones deficientes en 5-LO tratados de manera concomitante con LTB_{4}. Tras 24 horas de inoculación bacteriana, se recogieron los pulmones y se determinaron las UFC en homogeneizado de pulmón.

La figura 10 representa gráficamente el efecto de la administración intratraqueal de LTB_{4} sobre la eliminación bacteriana defectuosa del pulmón en ratones deficientes en 5-LO (cada valor representa la media \pm EEM). Los datos mostrados en la figura 10 confirman el hallazgo anterior (figura 4) de que los ratones deficientes tuvieron aproximadamente 100 veces más organismos en sus pulmones que los animales de tipo natural: debe observarse que las UFC absolutas en este experimento fueron menos porque se realizó el análisis a las 24 horas tras la inoculación en vez de a las 48 horas. De manera importante, la única dosis intratraqueal de LTB_{4} administrada de manera concomitante con el inóculo bacteriano redujo las UFC en el pulmón aproximadamente 10 veces en ratones deficientes. Los resultados indican que LTB_{4} exógeno puede aumentar la eliminación pulmonar de K. pneumoniae en estos ratones deficientes en leucotrienos. Además, indican que los leucotrienos deben ser agentes terapéuticos eficaces en el entorno de la neumonía debida a bacterias Gram-negativas.

Ejemplo 7 Los papeles y mecanismos de acción de los productos de la 5-LO en la respuesta del huésped a K. pneumoniae

Los ejemplos descritos anteriormente que emplean la exposición a Klebsiella intratraqueal en ratones deficientes en 5-LO demuestran que la enzima desempeña un papel in vivo en la defensa antibacteriana pulmonar del huésped. Los experimentos de este ejemplo se dirigen a determinar los papeles y mecanismos de acción de los productos de la 5-LO en la respuesta del huésped a K. pneumoniae usando ratones deficientes así como ratones tratados con agentes farmacológicos que inhiben la síntesis o las acciones de los leucotrienos. Más específicamente, los experimentos de este ejemplo se dirigen a distinguir el papel de LTB_{4} frente a cisteinil-leucotrienos comparando los efectos de una variedad de agentes farmacológicos, incluyendo aquellos que seleccionan como diana ambas clases de leucotrienos (inhibidor de la 5-LO), aquellos que sólo seleccionan como diana LTB_{4} (antagonista del receptor de LTB_{4}) y aquellos que seleccionan como diana sólo cisteinil-leucotrienos (antagonistas del receptor de cisteinil-leucotrienos).

En los experimentos de este ejemplo se utiliza el modelo murino que implica la exposición intratraqueal de ratones con 50 UFC de K. pneumoniae. Con el fin de interferir farmacológicamente con la síntesis o acción de leucotrienos, se trataron ratones de tipo natural con diversos agentes de acción prolongada (expuestos a continuación) por vía oral (sonda nasogástrica), con dosificaciones diarias que comenzaban la mañana del día anterior a la administración de bacterias. En todos los casos, se ha establecido la especificidad de los agentes que van a usarse, y se guía la selección de la dosis y los regímenes de dosificación mediante la experiencia publicada en roedores. Basándose en experimentos de dosis-respuesta preliminares que emplean tres dosis por agente y n = 4 animales por dosis, se determinó una dosis eficaz máxima única de cada fármaco a partir de valoraciones realizadas a las 24 horas tras el inicio del tratamiento.

Los agentes específicos y los intervalos de dosis preliminares que se someten a prueba incluyen los siguientes: i) el inhibidor de la 5-LO A-79175 (Abbot) en una dosis de 1-3 mg/kg; éste es un inhibidor enzimático competitivo que es un congénere más potente y de acción más prolongada de Zileuton® con eficacia demostrada en ratones así como un agente oral de una vez al día; ii) el antagonista de LTB_{4} CP-105.696 (Pfizer) en una dosis de 1-10 mg/kg; este compuesto ha inhibido la artritis inducida por colágeno en ratones cuando se administró en una dosis oral de una vez al día; y iii) el antagonista de LTD4 MK-571 (Merck) en una dosis de 0,1-1 mg/kg; este compuesto ha inhibido eficazmente la broncoconstricción inducida por antígenos cuando se administró por vía oral a ratas.

Una vez que se define la dosis óptima de cada agente, se realizan experimentos de supervivencia y eliminación bacteriana por separado, que implican cada uno la exposición a K. pneumoniae de los siguientes cinco grupos de ratones (n = 10 por grupo): i) ratones de tipo natural tratados con vehículo; ii) ratones de tipo natural tratados con el inhibidor de la 5-LO; iii) ratones de tipo natural tratados con el antagonista de LTB_{4}; iv) ratones de tipo natural tratados con el antagonista de cisteinil-leucotrieno; y v) ratones deficientes en 5-LO tratados con vehículo. Se juzga la eficacia in vivo mediante los siguientes criterios. Se evalúa la inhibición de la 5-LO cuantificando la producción pulmonar de LTB_{4} (cuantificado en líquido de lavado de pulmón) tras la instilación intratraqueal de ionóforo A23187 en animales tratados con fármaco. [W. Smith et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 275:1332-1338]. Se evalúa el antagonismo de LTB_{4} cuantificando la regulación por incremento de la expresión de CR3 estimulada por LTB_{4} ex vivo en neutrófilos de sangre completa obtenida de animales tratados con fármacos. Se evalúa el antagonismo del receptor de cisteinil-leucotrienos cuantificando la extravasación del colorante azul de Evans tras la administración intradérmica de LTD_{4}. [J. Drazen et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 77:4354-4358 (1980)].

Se monitoriza la supervivencia animal hasta la muerte o hasta el día 14. Para la eliminación bacteriana, se determinan las UFC bacterianas en homogeneizados de pulmón completo y plasma obtenidos de animales sacrificados tanto en el día 1 como en el día 3 tras la exposición a Klebsiella. Finalmente, se evalúa inicialmente el flujo de entrada de neutrófilos al pulmón mediante la actividad MPO de homogeneizados de pulmón completo de los mismos animales usados para las determinaciones de UFC anteriores; si los ensayos de MPO sugieren que el tratamiento con fármaco activo da como resultado una reducción en el flujo de entrada de neutrófilos, se lleva a cabo un experimento adicional (dado que el lavado y la homogenización no pueden realizarse en el mismo animal) en el que se verifica un efecto de este tipo mediante recuentos de células de lavado broncoalveolar y diferenciales en los animales tratados con vehículo frente a los tratados con fármaco.

Debe observarse que la determinación de la contribución relativa a la defensa del huésped de LTB_{4} sintetizado de manera endógena frente a LTC_{4} permite i) el diseño de estudios terapéuticos empleando la administración de leucotrienos exógenos y ii) la valoración de posibles riesgos para la sensibilidad a la infección de, por ejemplo, inhibidores de la 5-LO (que inhiben la síntesis de LTB_{4} y cisteinil-leucotrienos en paralelo) y antagonistas de receptores de cisteinil-leucotrienos (que inhiben selectivamente las acciones de cisteinil-leucotrienos sin afectar a las de LTB_{4}).

Si la inhibición directa de 5-LO deteriora la eliminación bacteriana y la supervivencia en este modelo de neumonía murina de una manera similar a la deficiencia en 5-LO, se evalúan los papeles relativos de LTB_{4} endógeno frente a cisteinil-leucotrienos mediante la aplicación de antagonistas de receptores que bloquean selectivamente las acciones de estos dos grupos de mediadores. Aunque LTB_{4} es el metabolito de la 5-LO generalmente más implicado en las reacciones inflamatorias dependientes de leucocitos, los datos de fagocitosis anteriormente generados sugieren que los cisteinil-leucotrienos podrían tener efectos de potenciación comparables. Por el contrario, si los agentes antileucotrienos no reproducen los efectos de la deficiencia génica en 5-LO, sugeriría que 5-LO potencia la defensa antibacteriana mediante un mecanismo independientes de su actividad catalítica. Si los antagonistas/inhibidores farmacológicos alteran la defensa del huésped, se realiza una determinación en cuanto a si el mecanismo relevante es independiente del deterioro del reclutamiento de neutrófilos a los pulmones. Finalmente, se considera la posibilidad de que la terapia antileucotrienos aumente la respuesta del huésped a la neumonía debida a Klebsiella (es decir, los leucotrienos tanto potencian como deterioran la respuesta del huésped). De hecho, los resultados que indican que cada uno de estos efectos opuestos predomina en diferentes fases de la respuesta pueden garantizar el uso de los agentes farmacológicos empleados a intervalos específicos.

Ejemplo 8 La cinética, el perfil y las fuentes celulares de leucotrienos producidos en el pulmón murino durante el transcurso de la neumonía debida a Klebsiella

Los experimentos descritos en ejemplos anteriores (véase, por ejemplo, la figura 3) indicaron que tanto LTB_{4} como LTC_{4} están presentes en altos niveles en homogenizados de pulmón 48 horas tras la exposición bacteriana. Los experimentos en este ejemplo se dirigen a determinar qué leucotrienos se producen en el pulmón a diferentes puntos de tiempo tras la exposición a K. pneumoniae y qué tipos de células son responsables. El objetivo experimental inicial es cuantificar los leucotrienos en homogeneizados de pulmón y líquido de lavado broncoalveolar de ratones a diversos puntos de tiempo tras la exposición a Klebsiella. Basándose en estos datos, se seleccionan puntos de tiempo para estudios adicionales diseñados para determinar las fuentes celulares de leucotrienos mediante i) tinción inmunohistoquímica con el fin de identificar células que presentan una distribución intracelular de 5-LO asociada con la activación enzimática y ii) medición de la producción constitutiva de leucotrienos mediante células aisladas de pulmones neumónicos.

Inicialmente, se inoculan ratones de tipo natural 129/SvEv por vía intratraqueal con o bien solución salina o bien 50 UFC de K. pneumoniae, y se recogen los pulmones a las 8 horas y a los 1, 2, 3, 5 y 7 días tras la inoculación. Para cada uno de estos puntos de tiempo tras la inoculación de solución salina o bacterias, se preparan homogeneizados de pulmón completo (n = 5 animales por grupo) y se cuantifican tanto LTB_{4} como LTC_{4} en los homogeneizados mediante inmunoensayo. En otros animales (n = 3), se preparan secciones de pulmón para inmunohistoquímica (véase a continuación). En paralelo, se lleva a cabo un experimento idéntico en el que se realiza lavado de pulmón; en cada punto de tiempo (n = 5 animales por grupo), se preparan citocentrifugados de lavado broncoalveolar y se determinan los niveles de leucotrienos en líquido de lavado libre de células. Los niveles de LTB_{4} y LTC_{4} en líquido de lavado y en homogeneizados de pulmón se correlacionan entre sí y con el grado de flujo de entrada de neutrófilos (evaluados a partir de la actividad MPO en homogeneizados y recuentos celulares y diferenciales de citocentrifugados de líquido de lavado broncoalveolar).

Se determinan las fuentes celulares de producción de leucotrienos en el pulmón en los puntos de tiempo de 8 horas, 1 día y 3 días y otros puntos de tiempo identificados mediante el análisis cinético anterior que indicaba los niveles máximos de leucotrienos B_{4} ó C_{4}. Se realiza la tinción inmunohistoquímica para 5-LO sobre secciones de pulmón junto con preparaciones de citocentrifugado de lavado broncoalveolar de ratones expuestos tanto a Klebsiella como a solución salina con el fin de determinar si es que los macrófagos alveolares, neutrófilos o ambos tipos de células demuestran una distribución intracelular de 5-LO característica de la activación enzimática (es decir, tinción concentrada en la envuelta nuclear). La determinación de la activación de 5-LO en tejido pulmonar in situ mediante este método tiene la ventaja de que no requiere aislamiento o cultivo celular, obviando problemas sobre los posibles artefactos que podrían introducirse mediante esos procedimientos. De importancia, se ha usado este enfoque en fibrosis pulmonar idiopática para demostrar que los macrófagos alveolares aislados mediante el lavado broncoalveolar de pacientes con fibrosis pulmonar idiopática sobreproducen de manera constitutiva leucotrienos cuando se ponen en cultivo, incluso en ausencia de un agonista exógeno. [J. Wilborn et al., J. Clin. Invest. 97:1827-1836 (1996)].

Tal como se describió anteriormente, existe sobreproducción de leucotrienos en tejido pulmonar a los 2 días tras la exposición bacteriana. Con el fin de determinar si las células broncoalveolares de animales inoculados con bacterias continúan elaborando leucotrienos tras ponerse en cultivo de una manera que refleje su anterior generación in vivo, se obtienen células de lavado broncoalveolar no fraccionado (10^{6} células) en los puntos de tiempo mencionados anteriormente, se ponen en placas de cultivo y se evalúa la producción acumulativa de leucotrienos B_{4} y C_{4} mediante inmunoensayo del medio de cultivo tras cultivo durante la noche (aproximadamente 16 horas); para comparar se estudian células de lavado broncoalveolar de animales control (n = 5 animales por tratamiento por punto de tiempo). Tras el cultivo durante la noche, se determinan los diferenciales de células adherentes mediante tinción de Wright y de estearasa.

Debe observarse que estudiar poblaciones de células mezcladas no debe crear dificultad en la atribución de la generación de leucotrienos a un tipo de célula particular en el punto de tiempo de 8 horas porque existe una población relativamente pura de macrófagos alveolares a la vez. Además, los macrófagos alveolares y neutrófilos sintetizan perfiles únicos de productos de leucotrienos; por tanto, los macrófagos alveolares producen principalmente LTC_{4} (figura 2A) mientras que los neutrófilos sintetizan principalmente LTB_{4}. Cuando se interpreta junto con los datos inmunohistoquímicos, el perfil de leucotrienos elaborados mediante células de lavado broncoalveolar cultivadas proporciona una fuerte evidencia de la implicación de cada tipo de célula. Finalmente, el estudio de células de lavado mezcladas permite que tengan lugar posibles interacciones de macrófagos alveolares-neutrófilos en la síntesis de leucotrienos, tal como hacen inevitablemente in vivo.

El conocimiento de la cinética de la producción endógena de LTB_{4} frente a LTC_{4} es útil en varios aspectos importantes. En primer lugar, proporciona una guía en el diseño de los experimentos "terapéuticos" (descritos a continuación) que implican la administración pulmonar de leucotrienos exógenos. En segundo lugar, la determinación de las contribuciones de macrófagos alveolares y neutrófilos como fuentes para la producción de estos mediadores proporciona información básica acerca de la biología de la respuesta del huésped. Finalmente, el conocimiento de las fuentes celulares apropiadas de leucotrienos en el entorno de la neumonía bacteriana tiene una posible utilidad de diagnóstico porque la documentación de una producción de leucotrienos deficiente puede ayudar a identificar pacientes que pueden ser candidatos para la complementación con leucotrienos pulmonares exógenos con el fin de aumentar la inmunidad innata.

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Ejemplo 9 Los mecanismos moleculares mediante los cuales los productos de la 5-LO específicos aumentan la fagocitosis y destrucción de K. pneumoniae en macrófagos alveolares y neutrófilos

Los experimentos de este ejemplo aclaran los mecanismos moleculares mediante los cuales los metabolitos de la 5-LO específicos potencian la fagocitosis y la destrucción. Más específicamente, los experimentos de este ejemplo, implican añadir diferentes lípidos a macrófagos alveolares y neutrófilos inducidos obtenidos tanto de ratones deficientes como de tipo natural con el fin de comparar la magnitud de los efectos y mecanismos de acción para diferentes productos de la 5-LO en ambos tipos de células. Estos experimentos proporcionan un medio de i) evaluar adicionalmente la utilidad terapéutica de los leucotrienos, y ii) evaluar la utilidad de moléculas particulares y/o marcadores bioquímicos como criterios de evaluación que van a examinarse en los estudios de tratamiento con leucotrienos in vivo descritos a continuación en el ejemplo 10.

Tal como se describe en detalle a continuación en el presente documento, los experimentos iniciales caracterizan los efectos de la incubación in vitro con productos de la 5-LO exógenos sobre los criterios de evaluación brutos de fagocitosis y destrucción de K. pneumoniae. Aunque no se requiere una comprensión de los mecanismos moleculares con el fin de poner en práctica la presente invención, dado que los mecanismos moleculares que median en la fagocitosis y destrucción bacterianas son bastante similares en neutrófilos y macrófagos y existe una fuerte evidencia que implica los papeles de la ruta de la 5-LO en funciones de ambos tipos de células, se realizaron estudios tanto en macrófagos alveolares como en neutrófilos peritoneales inducidos con glucógeno de ratones (la pureza de ambas poblaciones supera el 90%). De importancia, se ha demostrado que el reclutamiento de neutrófilos al peritoneo tras la inducción con glucógeno no se ve deteriorada en los ratones deficientes en 5-LO. [X. Chen et al., Nature 372:179-182 (1994)]. Se estudian los neutrófilos inducidos en vez de los neutrófilos de sangre periférica debido a la posibilidad de que el proceso de reclutamiento y/o residencia en un entorno inflamatorio por sí mismo altere el fenotipo celular. Además, se estudiaron células obtenidas tanto de ratones de tipo natural como deficientes.

Específicamente, se incubaron conjuntamente 10^{5} células durante 1 hora con bacterias y lípidos en presencia de suero inmunitario al 5%, se evalúo el índice fagocítico y la actividad bactericida tal como se describió anteriormente en los métodos generales. En cada experimento, se incluye un control de vehículo. Los metabolitos de 5-LO exógeno que van a estudiarse (todos a 10^{-11} - 10^{-7} M) son i) LTB_{4}, ii) LTC_{4}; y iii) 5-HETE. También se evalúan combinaciones de estos lípidos.

Para los productos de 5-LO que tienen efectos estimulantes sobre la fagocitosis o destrucción, también se somete a prueba la capacidad de antagonistas de receptor específicos (descritos en el ejemplo 7) para suprimir estos efectos. Se llevan a cabo todos los estudios tanto con neutrófilos como macrófagos alveolares con el fin de garantizar que se identifiquen los casos en los que un compuesto dado ejerce diferentes efectos sobre la fagocitosis en dos tipos de células y ejerce efectos similares (aunque mediados por diferentes mecanismos) en los dos tipos de células identificados. Una vez que se identifica un mecanismo molecular para un efecto sobre la fagocitosis (por ejemplo, mediante LTB_{4}), se examina la capacidad del compuesto opuesto (es decir, el antagonista del receptor de LTB_{4}) para modular el mismo acontecimiento molecular de una manera opuesta.

Los criterios de evaluación mecanísticos para el estudio son los siguientes: i) expresión en superficie de receptores necesarios para la unión/ingestión de K. pneumoniae (evaluada mediante citometría de flujo), incluyendo FcRII/FcRIII y CR3; ii) ensamblaje de microfilamentos de actina (evaluado mediante tinción de inmunofluorescencia y citometría de flujo), necesaria para la internalización de partículas; y iii) fusión fagosoma-lisosoma (evaluada mediante tinción con naranja de acridina), necesaria para poner en contacto los microbios con el arsenal bactericida. Los métodos generales describen los procedimientos para cada una de estas evaluaciones.

Se examinan los mecanismos bactericidas de una manera similar a la descrita para la fagocitosis. De nuevo, aunque no se requiere una comprensión de los mecanismos moleculares con el fin de poner en práctica la presente invención, se realizaron experimentos posteriores para abordar el/los mecanismo(s) molecular(es) que es/son responsable(s) de que los metabolitos de la 5-LO aumenten la destrucción de K. pneumoniae. Además, se evalúa la capacidad de los antagonistas para bloquear los efectos positivos de los lípidos sobre estos acontecimientos mecanísticos, y se estudian tanto macrófagos alveolares como neutrófilos inducidos. Se examinan tres mecanismos bactericidas (tal como se describe en la sección de métodos generales). En primer lugar, se evalúa la generación extracelular de O_{2}^{-} mediante la reducción de ferricitocromo C que puede inhibirse por la superóxido dismutasa. [L. Laichalk et al., FEMS Immunol. Med. Microbial. 658:1-7 (1996)]. Dado que las bacterias no pueden representar un estímulo suficientemente fuerte para liberar de manera extracelular metabolitos de oxígeno, también se evalúan los efectos de los leucotrienos en este criterio de evaluación usando acetato-miristato de forbol como estímulo para la producción de O_{2}^{-}. En segundo lugar, se determina la producción de NO cuantificando el nitrito en el medio de cultivo usando el reactivo de Griess. En tercer lugar, se determina espectrofotométricamente la liberación de una enzima lisosómica, \beta-glucuronidasa. [W. Hsueh et al., Exp. Lung Res. 13:385-399 (1987)].

Tras la caracterización de los efectos de leucotrienos exógenos sobre estos mecanismos moleculares en células deficientes así como de tipo natural, se determina si el antagonismo específico de estos mismos leucotrienos producidos de manera endógena tiene los mismos efectos. Como en el ejemplo 7, se usan el antagonista de LTB_{4} CP-105.696 y el antagonista de cisteinil-leucotrienos MK-571 (ambos a 10^{-9} - 10^{-6} M). Estos se añaden a las células de tipo natural antes de añadir K. pneumoniae, y entonces se evalúan la fagocitosis, la destrucción y los mecanismos moleculares relevantes tal como se describió anteriormente.

Si se demuestra que LTB_{4} y LTC_{4} ejercen sus efectos mediante diferentes mecanismos, la combinación de los dos podría activar funciones antibacterianas de una manera que es aditiva o sinérgica. Un hallazgo de este tipo tiene importantes implicaciones para un posible uso terapéutico de leucotrienos en los estudios in vivo descritos en el ejemplo 10.

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Ejemplo 10 Los efectos de leucotrienos aerosolizados o intratraqueales tras exposición a Klebsiella sobre la eliminación y supervivencia bacterianas tanto en ratones de tipo natural como deficientes en 5-LO

Los datos obtenidos de los ejemplos anteriores proporcionan, entre otras cosas, información referente al punto de tiempo en la respuesta del huésped a la cual es más crítica la presencia de leucotrienos particulares. Los experimentos de este ejemplo usan esa información para someter a prueba racionalmente la eficacia in vivo de leucotrienos exógenos, o bien individualmente o bien en combinación, administrados por diferentes vías.

Los experimentos iniciales de este ejemplo implican animales cuyas capacidades endógenas para la generación de leucotrienos están deterioradas debido a la alteración del gen de la 5-LO. Los experimentos posteriores someten a prueba la eficacia de la administración intrapulmonar de leucotrienos en ratones de tipo natural. Finalmente, además de los criterios de evaluación clínicamente relevantes de la eliminación y supervivencia bacterianas, los experimentos de este ejemplo investigan la utilidad de obtener el perfil de una consecuencia molecular de la acción de leucotrienos (por ejemplo, expresión de CR3) en células lavadas como posible sustituto para predecir la disminución (sin leucotrienos exógenos) o la potenciación (con leucotrienos exógenos) de la eliminación y supervivencia bacterianas.

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Administración "temprana" de leucotrienos

Debido a los datos anteriormente descritos (véase la figura 10) y dado que se espera que los animales deficientes en leucotrienos manifiesten el mayor aumento en la defensa antimicrobiana a partir de la administración de leucotrienos exógenos, se usaron ratones deficientes en 5-LO para la primera serie de estudios. Se administran a los ratones deficientes 50 UFC de K. pneumoniae por vía intratraqueal junto con LTB_{4} en dosis que oscilan desde 1-20 ng por animal (6 ng fue la dosis utilizada en el experimento correspondiente a la figura 10); también se somete a prueba un intervalo de dosis similar de LTC_{4}. Se determinan las UFC bacterianas en plasma y pulmones en el día 1, y los resultados de estos experimentos se usan para determinar las dosis óptimas de administración de manera concomitante de LTB_{4} y LTC_{4}. A continuación, se evalúan de manera definitiva los efectos sobre la eliminación bacteriana in vivo a partir de las UFC en plasma y pulmones tanto los días 1 como 3 tras la inoculación, usando n = 10 animales deficientes para cada punto de tiempo de evaluación por grupo de tratamiento, tal como sigue: i) se evalúa el control de vehículo (sólo bacterias) en el día 1, ii) se evalúa el control de vehículo a los 3 días, iii) se evalúa LTB_{4} en el día 1; iv) se evalúa LTB_{4} a los 3 días; v) se evalúa LTC_{4} en el día 1; vi) se evalúa LTC_{4} a los 3 días; vii) se evalúa LTB_{4} + LTC_{4} en el día 1; viii) se evalúa LTB_{4} + LTC_{4} a los 3 días. Para comparación adicional, se estudian los animales de tipo natural inoculados con bacterias solas en ambos puntos de tiempo (grupos ix) y x)). Dado que las combinaciones de dosis óptimas de LTC_{4} y LTB_{4} podrían resultar excesivamente proinflamatorias, tal terapia de combinación puede requerir que las dosis de cada agente se reduzcan a escala.

Entonces se utiliza en un experimento de supervivencia el/los régimen/regímenes de tratamiento(s) que produce(n) la mayor mejora en la eliminación bacteriana. Una vez más, se inoculan ratones deficientes (n =10 animales por grupo) con 50 UFC de K. pneumoniae sola o junto con dosis óptimas de LTB_{4}, LTC_{4} o ambos leucotrienos; se monitoriza la supervivencia a lo largo de 14 días. Los ratones de tipo natural inoculados con bacterias solas sirvieron como otro grupo de comparación.

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Administración "tardía" de leucotrienos

Dado que los experimentos previos indican que los efectos de una dosis intratraqueal de leucotrieno son rápidos en su comienzo (por ejemplo, en el plazo de 1 hora) pero de vida relativamente corta (por ejemplo, menos de 12 horas), entonces la administración de leucotrieno(s) junto con el inóculo bacteriano debe aumentar el potencial de eliminación bacteriana del macrófago alveolar. Alternativamente, la administración de leucotrieno(s) en un punto de tiempo más tardío se asocia con otras posibles ventajas. Por ejemplo, la activación de los neutrófilos reclutados podría conseguirse si el compuesto activo se dispensa aproximadamente a los 1-3 días tras la inoculación. Además, un régimen de post-inoculación eficaz puede aplicarse más fácilmente al tratamiento de neumonía fulminante debida a bacterias Gram-negativas en pacientes.

En vista de lo anterior, se realizaron experimentos para definir los puntos de tiempo óptimos (1, 2 y 3 días tras la exposición a Klebsiella) para la administración "tardía" de LTB_{4} y LTC_{4}. Estos se llevan a cabo en ratones deficientes y se evalúan la eliminación bacteriana (las UFC en pulmón y plasma) en el día 4; entonces se comparan los animales tratados con leucotrienos con los controles (vehículo) sin leucotrieno. Tras la determinación del mejor punto de tiempo "tardío", se determinan las UFC en pulmón y plasma un día después de eso en los siguiente grupos: i) bacteria solas, ii) bacterias + LTB_{4}, iii) bacterias + LTC_{4} y iv) bacterias + LTB_{4} + LTC_{4} (n = 10 animales por grupo). Para comparación adicional, se estudian los animales de tipo natural inoculados con bacterias solas. Tal como se describe para el régimen de tratamiento simultáneo, a continuación se somete a prueba el régimen de tratamiento tardío óptimo en ratones deficientes en un estudio de supervivencia de 14 días, sirviendo los ratones deficientes tratados con vehículo y los ratones de tipo natural como grupos de comparación.

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Administración "temprana" y "tardía" simultánea de leucotrienos

La administración repetida o prolongada de leucotrienos puede aumentar la defensa antibacteriana del huésped en un mayor grado que o bien la administración temprana o bien la tardía solas. Como resultado, se realizan dos regímenes adicionales. Para ambos de estos regímenes alternativos, se utilizan ratones deficientes en 5-LO, y se llevan a cabo en primer lugar experimentos de eliminación bacteriana y posteriormente se someten a prueba los regímenes óptimos en experimentos de supervivencia más largos. El primer régimen supone la administración temprana (por ejemplo, con la inoculación) y tardía (por ejemplo, día 2). El metabolito de la 5-LO temprano y tardío puede seleccionarse independientemente entre sí; en otra palabras, puede utilizarse LTB_{4} para una dosis y LTC_{4} para otra dosis. El segundo régimen supone la administración continua de leucotrieno(s) mediante aerosol. Para garantizar que la dosificación se limite a las vías respiratorias y que pueda cuantificarse de manera precisa la dosis administrada, se nebulizan los leucotrienos y se administran a los ratones mediante una cámara de exposición sólo para la nariz. La selección del metabolito y la ventana de tratamiento (por ejemplo, días 1-3) se basa en los resultados de los experimentos de dosificación de una vez.

Aplicación a ratones de tipo natural expuestos a K. pneumoniae

Se aplicaron los experimentos expuestos anteriormente referentes a ratones deficientes en leucotrienos a ratones de tipo natural expuestos a K. pneumoniae. Los ratones de tipo natural 129/SvEV son más sensibles a neumonía debida a Klebsiella que muchas otras cepas, aunque no son tan sensibles como los ratones deficientes en 5-LO. Por tanto, estos ratones de tipo natural pueden ser más estrechamente representativos de pacientes sensibles a neumonía debida a bacterias Gram-negativas que los animales deficientes en leucotrienos. Por tanto, se usa la estrategia de tratamiento con leucotrienos óptima definida a partir de estudios en ratones deficientes en ratones de tipo natural, con criterios de evaluación similares de eliminación y supervivencia bacterianas.

Los experimentos dados a conocer en este ejemplo indican los efectos de la administración intratraqueal y aerosolizada tras la exposición a Klebsiella sobre la eliminación y la supervivencia bacterianas tanto en ratones de tipo natural como deficientes en 5-LO. Estos experimentos sirven para proporcionar información referente a la administración in vivo de leucotrienos exógenos. Los estudios descritos implican el tratamiento con leucotrienos B_{4} y C_{4}; se seleccionaron estos debido a su potencia y sus acciones conocidas. Sin embargo, en la presente invención se contempla el uso de otros productos de la 5-LO, incluyendo 5-HETE y lipoxinas.

Claims (21)

1. Composición terapéutica que comprende una cantidad eficaz de un producto de la ruta de la 5-lipoxigenasa para su uso como medicamento para la profilaxis o el tratamiento de una infección microbiana en un paciente que tiene un factor predisponente para una infección microbiana, siendo dicho factor predisponente tabaquismo, alcoholismo, diabetes, infección por VIH, virus del SIDA, deficiencia en vitamina D o estar en el periodo neonatal;

con la condición de que dicha infección microbiana y dicho factor predisponente no sean ambos una infección por VIH, en la que dicho producto de la ruta de la 5-lipoxigenasa comprende un leucotrieno seleccionado del grupo que consiste en leucotrieno B_{4}, leucotrieno B_{4}-d_{4}, dimetilamida de leucotrieno B_{4}, 6-trans-leucotrieno B_{4}, 6-trans-12-epi-leucotrieno B_{4}, 12-epi-leucotrieno B_{4}, 18-carboxi-dinor-leucotrieno B_{4}, 20-carboxi-leucotrieno B_{4} y 20-hidroxi-leucotrieno B_{4}.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que dicho paciente se caracteriza por tener un factor predisponente seleccionado del grupo que consiste en tabaquismo, alcoholismo y diabetes.

3. Composición según la reivindicación 1, en la que a dicho paciente que tiene un factor predisponente se le ha diagnosticado una infección por VIH.

4. Composición según la reivindicación 1, en la que dicho producto de la ruta de la 5-lipoxigenasa comprende un leucotrieno seleccionado del grupo que consiste en leucotrieno B_{4} y 20-hidroxi-leucotrieno B_{4}.

5. Composición según la reivindicación 4, en la que dicho leucotrieno es leucotrieno B_{4}.

6. Composición según la reivindicación 1, en la que dicha administración comprende administración pulmonar.

7. Composición según la reivindicación 6, en la que dicha administración pulmonar es mediante aerosolización de dicha composición terapéutica.

8. Composición según la reivindicación 1, en la que dicha profilaxis o dicho tratamiento comprende además la administración conjunta de un antibiótico a dicho paciente.

9. Composición según la reivindicación 1, en la que dicho paciente es un animal.

10. Composición según la reivindicación 1, en la que dicho paciente es un ser humano.

11. Composición según la reivindicación 1, en la que dicha infección microbiana es una infección bacteriana.

12. Composición según la reivindicación 11, en la que dicho paciente se caracteriza por tener un factor predisponente seleccionado del grupo que consiste en tabaquismo, alcoholismo y diabetes.

13. Composición según la reivindicación 11, en la que a dicho paciente se le ha diagnosticado una infección por VIH.

14. Composición según la reivindicación 11, en la que dicho producto de la ruta de la 5-lipoxigenasa comprende un leucotrieno seleccionado del grupo que consiste en leucotrieno B_{4} y 20-hidroxi-leucotrieno B_{4}.

15. Composición según la reivindicación 14, en la que dicho leucotrieno es leucotrieno B_{4}.

16. Composición según la reivindicación 11, en la que dicha administración comprende administración pulmonar.

17. Composición según la reivindicación 16, en la que dicha administración pulmonar es mediante aerosolización de dicha composición terapéutica.

18. Composición según la reivindicación 11, que comprende además la administración conjunta de un antibiótico a dicho paciente.

19. Composición según la reivindicación 11, en la que dicho paciente es un animal.

20. Composición según la reivindicación 11, en la que dicho paciente es un ser humano.

21. Disolución para su uso en el tratamiento de una infección microbiana, comprendiendo dicha disolución un vehículo líquido estéril y un producto de la ruta de la 5-lipoxigenasa disuelto en dicho vehículo líquido estéril, estando dicha disolución aerosolizada, y comprendiendo dicho producto de la ruta de la 5-lipoxigenasa un leucotrieno seleccionado del grupo que consiste en leucotrieno B_{4}, leucotrieno B_{4}-d_{4}, dimetilamida de leucotrieno B_{4}, 6-trans-leucotrieno B_{4}, 6-trans-12-epi-leucotrieno B_{4}, 12-epi-leucotrieno B_{4}, 18-carboxi-dinor-leucotrieno B_{4}, 20-carboxi-leucotrieno B_{4} y 20-hidroxi-leucotrieno B_{4}.