ES2251748T3 - Administracion de productos de la ruta metabolica de la 5-lipooxigenasa para potenciar la defensa antimicrobiana. - Google Patents
Administracion de productos de la ruta metabolica de la 5-lipooxigenasa para potenciar la defensa antimicrobiana.Info
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Abstract
Uso de una cantidad eficaz de una composición terapéutica que comprende un producto de la ruta de la 5- lipooxigenasa para la fabricación de un medicamento para la administración pulmonar para el tratamiento de una infección microbiana en un hospedador que se sospecha que padece dicha infección microbiana.
Description
Administración de productos de la ruta metabólica
de la 5-lipooxigenasa para potenciar la defensa
antimicrobiana.
La presente invención se refiere de forma general
al uso de compuestos para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de infección microbiana, y de forma más particular al
uso de productos de la ruta metabólica de la
5-lipooxigenasa para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de infección microbiana y neumonía
bacteriana.
En vista de la exposición constante del aparato
respiratorio a microbios inhalados o aspirados y las perniciosas
consecuencias de la infección sin restricciones, obviamente un
sistema eficaz de defensa pulmonar antimicrobiana es importante
para la salud. Los microbios que eluden las defensas mecánicas que
ofrecen el aparato y las vías respiratorias altas alcanzan los
alvéolos. Aquí, el macrófago alveolar normalmente actúa de defensor
de la esterilidad de la mucosa, patrullando la superficie alveolar y
eliminando los organismos mediante fagocitosis y destrucción
intracelular. [M. Lohmann-Matthes y cols., Eur.
Respir. J. 7: 1678-1689 (1994)]. Si la carga
microbiana excede la capacidad de eliminación local de los
macrófagos alveolares permanentes, los macrófagos pueden producir
factores quimiotácticos que reclutan neutrófilos circulantes a los
espacios de aire y activan sus actividades fagocítica y
microbicida.
Aunque las células fagocíticas son capaces por sí
solas de ingerir microbios, la eficacia del proceso es potenciada
por la presencia de diversas moléculas solubles (opsoninas) que
recubren los organismos y median su unión a receptores
superficiales del fagocito. Estas opsoninas incluyen inmunoglobulina
así como factores que recubren microbios de forma no específica,
tales como el fragmento de complemento C3b, la proteína tensioactiva
A y la fibronectina. Del mismo modo, la fagocitosis y la
destrucción intracelular son aumentadas adicionalmente por una
variedad de agentes activadores que incluyen, factores estimuladores
de colonias, quimioquinas y lípidos. Desafortunadamente, la
deficiencia cualitativa o cuantitativa en cualquier componente de
estas defensas puede poner en peligro la eliminación de bacterias y
predisponer a la neumonía. [Véase, por ejemplo, J Langermans y
cols., J. Immunol. Methods 174: 185-194 (1994)].
En las naciones industrializadas, la neumonía se
asocia con una mayor morbilidad y mortandad que cualquier otro tipo
de infección. En total, es la sexta causa principal de muerte en los
Estados Unidos. En los adultos de más de 65 años de edad, es el
cuarto motivo más común de hospitalización. Entre las infecciones
adquiridas en hospitales, la neumonía es la segunda más común en
incidencia y la más comúnmente mortal.
Las bacterias son los patógenos etiológicos en
una proporción sustancial de las neumonías extrahospitalarias y en
la gran mayoría de las neumonías intrahospitalarias. Con frecuencia,
los organismos Gram negativos entéricos son los microbios
etiológicos responsables de ambos tipos de neumonía. Se cree que las
neumonías por organismos Gram negativos se producen por la
microaspiración de secreciones orales, y por lo tanto es
particularmente probable en individuos que muestran colonización
orofaríngea de estos organismos. Esto es especialmente común en los
pacientes hospitalizados, de forma particular en los ingresados en
unidades de cuidados intensivos, pero también se produce en
alcohólicos, pacientes con enfermedades sistémicas subyacentes o con
deficiencias en las defensas del hospedador y los que padecen
enfermedad pulmonar crónica. [S. Nelson y cols., Clin. Chest Med.
16: 1-12 (1995)].
Debido al uso generalizado y a la frecuente
prescripción excesiva de agentes antimicrobianos, existe una
incidencia cada vez mayor de microbios que adquieren resistencia a
fármacos. En otras palabras, los organismos que habitualmente son
susceptibles (es decir, son inhibidos o destruidos) a un agente
antimicrobiano particular ya no son susceptibles. Esto es
especialmente importante con respecto al uso de antibióticos en el
tratamiento de infecciones bacterianas.
La resistencia adquirida a fármacos habitualmente
está provocada por una mutación en el genoma del microbio o por la
adquisición de un plásmido. Por ejemplo, uno de los principales
mecanismos de resistencia a los antibióticos de
\beta-lactamas, incluidas las penicilinas, es la
producción de \beta-lactamasas. Además, la
resistencia a un miembro de una clase de agentes (por ejemplo, la
aminopenicilina ampicilina) puede producir una resistencia cruzada
completa a otros miembros de esa clase (por ejemplo, la
aminopenicilina amoxicilina).
La presión antibiótica en ciertas poblaciones de
pacientes (por ejemplo, pacientes con enfermedades sistémicas
subyacentes o con deficiencias en las defensas del hospedador) ha
contribuido al desarrollo de infecciones con organismos
multirresistentes, cuya erradicación es cada vez más difícil. Un
factor que contribuye a la presión antibiótica es el uso
generalizado de antibióticos en el entorno hospitalario,
especialmente en las unidades de cuidados intensivos. De hecho, los
médicos frecuentemente se ven forzados a utilizar regímenes de
antibióticos que comprenden agentes múltiples para combatir tales
infecciones o usar agentes de amplio espectro (por ejemplo,
Primaxin®, Merck) que generalmente se reserva para las infecciones
más graves.
Lo que se necesita es un medio para potenciar las
capacidades de defensa pulmonar que o no requiera antibióticos o
que pueda usarse para aumentar el tratamiento antibiótico. El medio
de potenciación debería ser eficaz en el tratamiento y prevención
de neumonía bacteriana en aquellos pacientes que son especialmente
susceptibles a ellas, debería tener un inicio de acción rápido, y
no debería provocar reacciones inmunológicas en el receptor.
Los leucotrienos son mediadores potentes de la
inflamación que se derivan del la ruta metabólica de la
5-lipooxigenasa del metabolismo del ácido
araquidónico. Estas sustancias han sido implicadas en la patogénesis
de enfermedades pulmonares inflamatorias, y recientemente hay
disponibles nuevos agentes farmacológicos que inhiben la síntesis o
las acciones de los leucotrienos para el tratamiento del asma. La
presente invención tal como se define en las reivindicaciones
contempla el uso de leucotrienos y otros productos de la ruta
metabólica de la 5-lipooxigenasa para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de neumonía y
otras infecciones de las vías respiratorias bajas.
Para evaluar el papel de los leucotrienos en la
neumonía bacteriana, los presentes inventores han empleado un
modelo de neumonía por Klebsiella en ratones con genes
inactivados que se habían vuelto deficientes en leucotrienos
mediante la alteración dirigida del gen de
5-lipooxigenasa. Los presentes inventores
encontraron que la producción de leucotrienos aumentaba en los
pulmones de ratones naturales infectados, y que los animales
deficientes en leucotrienos manifestaban una eliminación bacteriana
reducida y una letalidad potenciada. Además, los macrófagos
alveolares de los ratones con el gen inactivado mostraron
fagocitosis y destrucción mermadas de K. pneumoniae in
vitro, y este defecto funcional de los macrófagos alveolares
deficientes en leucotrienos se resolvió mediante la adición de
leucotrienos exógenos tales como LTB_{4}. De forma significativa,
la administración intrapulmonar de LTB_{4} parcialmente resolvió
la deficiencia in vivo para la eliminación de bacterias
observada en los ratones con el gen inactivado.
Los presentes inventores han determinado que los
leucotrienos endógenos desempeñan un papel integral en la respuesta
del hospedador a la infección pulmonar. De forma todavía más
importante desde un punto de vista terapéutico, los presentes
inventores encontraron que los leucotrienos exógenos ejercen
acciones farmacológicas que aumentan esta respuesta.
La presente invención contempla el uso de
productos metabólicos de la ruta de la
5-lipooxigenasa (por ejemplo leucotrienos) para la
fabricación de un medicamento para la administración pulmonar para
el tratamiento de neumonía insuperable o neumonía temprana, cuando
existe un factor de predisposición (por ejemplo tabaquismo,
alcoholismo, diabetes, infección por VIH, aspiración conocida).
Aunque no es necesario comprender el mecanismo
por el que actúan los productos para la práctica con éxito de la
presente invención, la administración de tales productos,
especialmente la administración intrapulmonar de leucotrienos,
aumenta los mecanismos endógenos de defensa local del hospedador y
ayuda a la erradicación de la infección bacteriana durante la
administración de antibióticos. Los productos tienen una duración de
acción relativamente corta (por ejemplo, horas), no provocan
respuestas inmunitarias mediadas por anticuerpos, y son
relativamente económicos.
La presente invención comprende el uso de
productos de la ruta de la 5-lipooxigenasa para la
fabricación de un medicamento para la administración intrapulmonar
para el tratamiento de neumonía. La presente invención contempla la
administración de estos productos mediante otras vías de
administración y para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de otras afecciones. Los productos pueden administrarse
de forma concomitante con antibióticos en algunas realizaciones. En
otras realizaciones, se administran productos diferentes (por
ejemplo, LTB_{4} y LTC_{4}) de la ruta de la
5-lipooxigenasa juntos o a intervalos definidos, con
o sin la administración concomitante de antibióticos.
La presente invención contempla el uso de una
cantidad eficaz de una composición terapéutica que comprende un
producto de la ruta de la 5-lipooxigenasa para la
fabricación de un medicamento para la administración pulmonar para
el tratamiento de una infección microbiana en un hospedador que se
sospecha que padece dicha infección microbiana. Dicho hospedador
puede presentar un riesgo elevado de desarrollar una infección
microbiana. Los hospedadores que presentan riesgo elevado incluyen,
pero sin limitación, hospedadores con el virus del SIDA y otros
hospedadores que están inmunocomprometidos.
En una realización, la infección microbiana es
neumonía bacteriana. En realizaciones particulares, el producto de
la ruta de la 5-lipooxigenasa comprende un
leucotrieno. Cuando el producto de la ruta de la
5-lipooxigenasa comprende un leucotrieno, el
leucotrieno es leucotrieno B_{4} en ciertas realizaciones y un
cisteinil leucotrieno (por ejemplo, leucotrieno C_{4},
leucotrieno D_{4}, y leucotrieno E_{4}) en otras realizaciones.
En otras realizaciones todavía adicionales, la administración
pulmonar es mediante dispersión en aerosol de la composición
terapéutica de otras realizaciones. Además, ciertas realizaciones
adicionalmente implican la administración concomitante de un
antibiótico al hospedador. El hospedador es un animal en algunas
realizaciones y un ser humano en otras.
Además, la presente invención tal como se define
en las reivindicaciones contempla el uso de una cantidad eficaz de
una composición terapéutica que comprende un leucotrieno para la
fabricación de un medicamento para la administración pulmonar para
el tratamiento de una infección bacteriana en un hospedador que se
sospecha que padece dicha infección bacteriana.
En realizaciones particulares, la infección
bacteriana es neumonía bacteriana. El leucotrieno es leucotrieno
B_{4} en ciertas realizaciones y un cisteinil leucotrieno tal como
leucotrieno C_{4}, leucotrieno D_{4}, y leucotrieno E_{4} en
otras realizaciones. En realizaciones todavía adicionales, la
administración pulmonar es mediante dispersión en aerosol de la
composición terapéutica. Además, ciertas realizaciones implican
adicionalmente la administración conjunta de un antibiótico al
hospedador. El hospedador es un animal en algunas realizaciones, y
un ser humano en otras.
Finalmente, la presente invención contempla el
uso de una cantidad eficaz de una composición terapéutica que
comprende un leucotrieno para la fabricación de un medicamento para
la administración pulmonar para el tratamiento de una infección
bacteriana en un hospedador que se sospecha que padece dicha
infección bacteriana, en el que dicha composición terapéutica
comprende una solución que comprende un vehículo líquido estéril y
un leucotrieno disuelto en dicho vehículo líquido estéril.
En realizaciones particulares, el leucotrieno es
leucotrieno B_{4}. En realizaciones todavía adicionales, el
leucotrieno es un cisteinil leucotrieno; cuando el leucotrieno es un
cisteinil leucotrieno, es leucotrieno C_{4}, leucotrieno D_{4},
o leucotrieno E_{4} en realizaciones particulares. Finalmente, la
solución se prepara en forma de aerosol en realizaciones todavía
adicionales.
Para facilitar el entendimiento de la invención
que se expone en la descripción siguiente, a continuación se definen
un número de términos.
La frase "producto de la ruta de la
5-lipooxigenasa" se refiere a aquellos compuestos
que son resultado de la conversión enzimática del ácido
araquidónico por la 5-lipooxigenasa. Productos de la
ruta de la 5-lipooxigenasa incluyen ácido
5-hidroperoxieicosatetraenoico
[5-HPETE] y LTA_{4}, así como compuestos que se
derivan de él. Los productos engloban 5-HETE, que
se produce a partir de 5-HPETE. Los productos
incluyen también compuestos formados a partir de la conversión de
LTA_{4}, tales como LTB_{4}, LTC_{4}, LTE_{4}, y LTF_{4}.
Además, los productos engloban derivados (es decir, compuestos
producidos mediante modificación estructural) de los compuestos que
se producen en la cascada del ácido araquidónico. La presente
invención no está limitada por la naturaleza de la modificación
estructural: las modificaciones incluyen, pero sin limitación, la
formación un enlace doble entre dos átomos de carbono y la adición
de grupos funcionales tales como restos hidroxilo y carboxi.
Modificaciones adicionales contempladas por la presente invención
incluyen la sustitución los aminoácidos normalmente presentes por
aminoácidos diferentes (por ejemplo, la sustitución del residuo de
glicina en LTD_{4} por otro aminoácido) o la unión de aminoácidos
adicionales. La siguiente tabla (Tabla 1) lista diversos productos
disponibles en el mercado (Cayman) de la ruta de la
5-lipooxigenasa. Por supuesto, la presente invención
no se limita a aquellos compuestos que se listan en la Tabla 1.
| Compuesto parental | Compuestos derivados |
| Leucotrieno A_{4} | Éster metílico de leucotrieno A_{4} |
| Leucotrieno B_{4} | |
| Leucotrieno B_{4} | leucotrieno B_{4}-d_{4} |
| leucotrieno B_{4} dimetilamida | |
| 6-trans leucotrieno B_{4} | |
| 6-trans-12-epi leucotrieno B_{4} | |
| 12-epi leucotrieno B_{4} | |
| 18-carboxidinor leucotrieno B_{4} | |
| 20-carboxi leucotrieno B_{4} | |
| 20-hidroxi leucotrieno B_{4} | |
| Leucotrieno B_{5} | |
| Leucotrieno C_{4} | |
| Leucotrieno C_{5} | |
| Leucotrieno D_{4} |
| Compuesto parental | Compuestos derivados |
| Leucotrieno D_{5} | |
| Leucotrieno E_{4} | N-acetil leucotrieno E_{4} |
| 16-carboxi-\Delta^{13}-tetranor leucotrieno E_{4} | |
| N-acetil-16-carboxi-\Delta^{13}-tetranor LTE_{4} | |
| fluoro leucotrieno E_{4} | |
| Leucotrieno E_{5} | |
| Leucotrieno F_{4} | |
| Mezclas de leucotrienos | Mezclas de péptidos y leucotrienos |
| Mezcla de metabolitos de leucotrieno | |
| Compuesto parental | Compuestos derivados |
| Mezcla de leucotrieno | Mezcla de peptido-leucotrieno |
| Mezcla de metabolitos de leucotrieno A_{4} | |
| Mezcla de metabolitos de leucotrieno E_{4} |
El término "leucotrieno" en el presente
documento se define funcionalmente como aquellos compuestos que
provocan potenciación de la defensa antimicrobiana. El término
"microbiano" incluye, pero sin limitación, bacterias, virus,
parásitos, y hongos.
El término "cisteinil leucotrieno" se
refiere a aquellos leucotrienos que poseen el residuo de cisteína
característico de los leucotrienos C_{4}, D_{4}, y E_{4}.
El término "eicosanoide" se refiere a
compuestos derivados de ácidos grasos esenciales de 20 carbonos, que
contienen tres, cuatro o cinco enlaces dobles: ácido
8,11,14-eicosatrienoico (ácido
dihomo-\gamma-linolénico), ácido
5,8,11,14-eicosatetraenoico (ácido araquidónico), y
ácido 5,8,11,14,17-eicosapentaenoico. Las familias
de leucotrienos y prostaglandinas son ejemplos de eicosanoides.
El término "cantidad eficaz" se refiere a
aquella cantidad de un producto de 5-lipooxigenasa
que es necesaria para realizar una función particular con éxito. De
forma general, la cantidad eficaz de un producto de
5-lipooxigenasa será aquella cantidad que potencia o
mejora (en cualquier grado) la capacidad del cuerpo de erradicar una
infección microbiana, especialmente una infección bacteriana. La
cantidad eficaz puede depender de un número de factores, que
incluyen el tipo de microbio implicado, la gravedad de la infección,
el estado inmunitario del individuo y el peso del individuo. A modo
de ejemplo, puede administrarse el leucotrieno LTD_{4} en una
composición terapéutica que contenga entre 0,1 \mug y 10
\mug.
El término "composición terapéutica" se
refiere a una composición que comprende un producto de la ruta de la
5-lipooxigenasa (por ejemplo, LTB_{4} y LTC_{4})
en una forma farmacéuticamente aceptable. Las características de la
forma dependerán de un número de factores, incluido el modo de
administración. Por ejemplo, una composición para la administración
pulmonar en forma de aerosol debe formularse de tal forma que el
producto sea farmacéuticamente activo tras la administración a los
pulmones. La composición terapéutica puede contener diluyentes,
adyuvantes y excipientes, entre otras cosas. En una realización
preferida; el producto de la ruta de la
5-lipooxigenasa se disuelve en un vehículo líquido
estéril. El término "vehículo líquido estéril" se refiere a
aquellos líquidos que son adecuados para la administración a un
hospedador (por ejemplo, administración pulmonar o parenteral) y
permiten la disolución del producto de la ruta de la
5-lipooxigenasa. Ejemplos de vehículos líquidos
estériles incluyen, pero sin limitación, solución salina normal
estéril y concentraciones diluidas de etanol.
El término "hospedador" se refiere a seres
humanos y animales.
Los términos "potenciar la defensa
microbiana" y "potenciar la defensa bacteriana" se refieren
de forma amplia a la capacidad mejorada del sistema inmunitario de
un sujeto para responder y erradicar una infección microbiana (por
ejemplo, una infección bacteriana, parasítica, vírica y fúngica) y
de forma específica una infección bacteriana, respectivamente. Los
términos incluyen, por ejemplo, aumento de los mecanismos de defensa
endógenos del sujeto. La presencia de la potenciación de la defensa
antimicrobiana/antibacteriana se determina sometiendo un compuesto
al procedimiento de selección que se describe en la Tabla 3 más
adelante.
La Fig. 1A es un esquema que representa la ruta
de la síntesis de leucotrienos y las estructuras de los productos
principales de la ruta metabólica de la
5-lipooxigenasa.
La Fig. 1B es un resumen esquemático que
representa la ruta de la síntesis de leucotrienos y las acciones de
los leucotrienos relevantes para la defensa antimicrobiana.
Las Figs. 2A y B representan perfiles de
RP-HPLC de eicosanoides radioactivos liberados por
macrófagos previamente marcados obtenidos de ratones de naturales
(Fig. 2A) y ratones con el gen 5-LO inactivado (Fig.
2B).
La Fig. 3 representa gráficamente el efecto de la
exposición a Klebsiella pneumoniae sobre a supervivencia en
ratones con el gen 5-LO inactivado y ratones
naturales.
La Fig. 4 representa de forma gráfica la
eliminación de K. pneumoniae de los pulmones y el plasma dos
días después de la exposición en ratones con el gen
5-LO inactivado y naturales.
La Fig. 5 representa de forma gráfica las
actividades fagocítica y bactericida en macrófagos alveolares de
ratones con el gen 5-LO inactivado y naturales.
La Fig. 6 representa de forma gráfica el efecto
de LTB_{4} exógeno sobre la actividad fagocítica de bacterias en
macrófagos alveolares de ratones con el gen 5-LO
inactivado.
La Fig. 7 representa de forma gráfica los niveles
de LTB_{4} y LTC_{4} en homogeneizado pulmonar en ratones
naturales dos días después de la exposición a K. pneumoniae o
a solución salina.
La Fig. 8 representa de forma gráfica el efecto
de la exposición a K. pneumoniae sobre la neutrofilia en el
lavado ratones con el gen 5-LO inactivado y
naturales.
La Fig. 9 representa de forma gráfica el efecto
de metabolitos de 5-LO exógenos sobre la actividad
fagocítica de bacterias en macrófagos alveolares de ratas
normales.
La Fig. 10 representa de forma gráfica el efecto
de la administración intratraqueal de LTB_{4} sobre la
eliminación defectuosa de bacterias en el pulmón de ratones con el
gen 5-LO inactivado.
La presente invención se define en las
reivindicaciones y se refiere de forma general al uso de compuestos
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de
infección microbiana y de forma más particular al uso de productos
de la ruta de la 5-lipooxigenasa para la fabricación
de un medicamento para el tratamiento de neumonía bacteriana. Para
facilitar el entendimiento de la presente invención, la descripción
a continuación se divide en las siguientes secciones: I) Síntesis,
acciones, y modulación farmacológica de leucotrienos; II)
Leucotrienos y defensa antimicrobiana del hospedador; III)
Activación de 5-LO en macrófagos alveolares y
neutrófilos; IV) Papel de los leucotrienos en la respuesta del
hospedador in vivo; y V) Composición y administración de
compuestos.
Los leucotrienos son derivados oxigenados del
ácido araquidónico sintetizados principalmente por células derivadas
de la médula ósea en respuesta a una variedad de estímulos de
partículas o sustancias solubles. [E. Goetzl y cols., FASEB J 9:
1051-1058 (1995)]. El ácido araquidónico
inicialmente es hidrolizado a partir de fosfolípidos de membrana, en
parte mediante las acciones de fosfolipasa citosólica A_{2}
(cPLA_{2}). Las dos etapas siguientes de la síntesis de los
leucotrienos (la conversión secuencial del ácido araquidónico
primero en ácido 5-hidroperoxieicosatetraenoico
[5-HPETE] y después en LTA_{4}) son catalizadas
por la enzima 5-lipooxigenasa
(5-LO). Esta enzima resides en el citosol y/o el
núcleo de las células en reposo. Aunque no es necesario entender su
mecanismo de acción para practicar la presente invención, cuando se
produce la estimulación por agonistas, se cree que
5-LO se transloca, de forma dependiente de
Ca^{2+}, a la membrana nuclear [véase, por ejemplo, J. Woods y
cols., J. Clin. Invest. 95: 2035-2040 (1995)]; aquí
se cree que accede al ácido araquidónico libre, hidrolizado a
partir de fosfolípidos de la membrana nuclear y presentado por la
proteína de unión del ácido araquidónico de la membrana nuclear
integral, la proteína activadora de 5-LO (FLAP),
5-HPETE, puede convertirse en el producto estable,
5-HETE. El LTA_{4} puede convertirse
enzimáticamente en LTB_{4} (mediante LTA_{4} hidrolasa) o en
LTC_{4} (mediante LTC_{4} sintasa). A su vez, LTC_{4} puede
convertirse enzimáticamente en LTD_{4} (con un aumento
concomitante de la bioactividad) y después en LTE_{4}; LTE_{4}
puede modificarse subsiguientemente formando LTF_{4}. La Fig. 1A
es una representación esquemática de la ruta de la síntesis de
leucotrienos y las estructuras de los principales productos de la
ruta de la 5-lipooxigenasa; de forma significativa,
la práctica de la presente invención no depende de la exactitud del
modelo que se representa en la Fig. 1A.
La capacidad de las células de sintetizar
leucotrienos puede potenciarse mediante la exposición a un número de
sustancias biológicamente activas, tales como factor estimulador de
colonias de macrófagos granulocíticos,
interferón-\gamma, y factor de crecimiento
transformador-\beta. Tal como se describe en más
detalle más adelante, los macrófagos alveolares tienen una capacidad
mayor para metabolizar 5-LO que los monocitos
sanguíneos u otros macrófagos tisulares [véase, por ejemplo, M.
Peters-Golden y cols., J. Immunol. 144:
263-270 (1990)], y producen tanto LTB_{4} como
LTC_{4}. Los neutrófilos, por el contrario, sólo producen
LTB_{4}. Los macrófagos alveolares y los neutrófilos ambos
producen 5-HETE.
Aunque no es necesario entender su mecanismo de
acción para practicar la presente invención, se cree que los
leucotrienos bioactivos principales, LTB_{4} y los cisteinil o
sulfidopeptido leucotrienos (leucotrienos C_{4}, D_{4} y
E_{4}), actúan mediante interacciones con receptores superficiales
específicos de células diana. LTB_{4} es una quimiotaxina de
neutrófilos potente in vitro, y es responsable de la mayoría
de la actividad quimiotáctica elaborada de forma aguda por los
macrófagos alveolares humanos en cultivo. [T. Martin y cols., J.
Clin. Invest. 80: 1114-1124 (1989)]. Además, la
instilación broncoscópica in vivo de LTB_{4} en pulmones
humanos provocó un influjo de neutrófilos. [T. Martin y cols. J.
Clin. Invest. 80: 1009-1019 (1989)].
Aunque la práctica de la presente invención no
depende de un entendimiento preciso de los efectos de los productos
de la ruta de 5-LO, se cree que LTB_{4} potencia
numerosas funciones de los leucocitos, incluida la fagocitosis, [T.
Demitsu y cols., Int. J. Immunopharmac. 11: 801-808
(1989)], regulación por aumento de las moléculas CR3 de la
superficie molecular [P. Marder y cols., Biochem. Pharmacol. 49:
1683-1690 (1995)], la secreción de O_{2}- e
hidrolasas lisosómicas, movilización de almacenes intracelulares de
Ca^{2+} [C. Serhan y cols., Biochem. Biophys. Res. Commun. 107:
1006-1012 (1982)], liberación de ácido araquidónico
dependiente de fosfolipasas (J. Wijkander y cols., J. Biol. Chem.
270: 26543-26549 (1995)], activación de PKC [J. O.,
Flaherty y cols., J. Immunol. 144:1909-1913
(1990)], la síntesis de interleuquina (IL)-8 [R.
Strieter y cols., Am. J. Pathol. 141: 397-407
(1992)], y la activación de la actividad natural de los linfocitos
citolíticos [R. Bray y Z. Brahmi Z, J. Immunol. 136:
1783-1790 (1986)]. Se cree que
5-HETE comparte muchas de estas mismas acciones,
pero con menor potencia. Los cisteinil leucotrienos poseen la
bioactividad que anteriormente se ha identificado como sustancia de
reacción lenta. Sus acciones más potentes incluyen la constricción
del músculo liso bronquial y vascular y el aumento de la
permeabilidad microvascular. También se ha reseñado que LTD_{4}
aumenta la expresión de FcR de los macrófagos in vitro [J.
Rhodes y cols., Eur. J. Immunol. 15: 222-227
(1985)], y la polimerización de la actina [M. Peppelenbosch y
cols., Cell 74: 565-575 (1993)].
La liberación de LTB_{4} por los neutrófilos
polimorfonucleares inducida por activadores tales como el ionóforo
del calcio A23187 puede ser promovida por un péptido derivado de
lactoferrina [W. König y cols., documento US 5.466.669]. Este
péptido también promueve la liberación de histamina por los
mastocitos inducida por activadores tales como células de
Staphylococcus aureus que producen toxina \alpha o el
ionóforo de calcio A23187.
Se sabe que la inhalación de LTB_{4} induce
hiperreactividad de las vías respiratorias en perros [P.M. O’Byrne
y cols., J. Appl. Physiol. 59:1941-1946 (1985)].
Además, LTB_{4} inhalado aumenta el número de neutrófilos y la
concentración de TxB_{2} recuperada en fluido de lavado
broncoalveolar.
La potencia broncoconstrictora de aerosoles
inhalados de LTD ha sido evaluada también en seres humanos [J.
Woodrow Weiss y cols., J. Americ. Medic. Ass. 249:
2814-2817 (1983)].
Se encontró que la obstrucción de las vías
respiratorias producida por LTD duraba más tiempo que la de la
histamina, reflejando así la respuesta de los individuos alérgicos
asmáticos a la inhalación de antígenos.
Además, se sabe que la inhalación de LTB_{4} en
aerosol induce neutrofilia pulmonar en monos [D.L. Allen y cols.,
J. Pharm. Exp. Therap. 277: 341-349 (1996)]. Además,
LTB_{4} en aerosol también regula por aumento la expresión de los
receptores CD11b en los neutrófilos de sangre periférica. Este
efecto puede ser atenuado significativamente por el antagonista de
los receptores de LTB_{4} LY293111Na.
Además de LTB_{4} natural, se ha sintetizado un
abanico de derivados de LTB_{4} farmacológicamente activos [W.
Skuballa y cols., documento WO 95/20563].
Aunque no es necesario entender los mecanismos
moleculares de la ingestión y destrucción de las bacterias por los
fagotitos para practicar la presente invención, los receptores de la
superficie de los fagocitos que son fundamentales para la
fagocitosis opsónica eficiente son aquellos que reconocen la porción
Fc de la IgG (FcRII y FcRIII) y el fragmento C3bl de complemento
(la integrina CR3, también conocida como as Mac-1 y
CD11b/CD18). CR3 también actúa de mediador en la ingestión no
opsónica de K. pneumoniae. Una consecuencia de la unión de
los receptores es la liberación y metabolismo del ácido
araquidónico. Debido a que CR3 y FcR median la unión de K.
pneumoniae a los fagocitos, su expresión en la superficie son
dianas relevantes para la modulación por leucotrienos.
La Fig. 1B una representación esquemática de la
ruta de la síntesis de los leucotrienos y las acciones de los
leucotrienos relevantes para la defensa antimicrobiana. Las
bacterias, tales como K. pneumoniae, se unen a las células
fagocíticas tales como los macrófagos alveolares y los neutrófilos y
son fagocitados. Se cree que esto desencadena un aumento del
Ca^{2+} intracelular que a su vez produce la translocación de
cPLA_{2} y 5-LO a la membrana nuclear. Tal como se
ha indicado anteriormente, el ácido araquidónico es hidrolizado a
partir de fosfolípidos y es metabolizado por 5-LO
que interactúa con FLAP produciendo LTA_{4}. LTA_{4} se
convierte posteriormente en los leucotrienos B_{4} y C_{4}.
Estos pueden afectar a las células diana mediante interacciones con
receptores, de una forma autocrina o paracrina. Como resultado, se
estimulan la quimiotaxia, la fagocitosis de bacterias y la
destrucción de bacterias.
La interrupción de la síntesis o de las acciones
de los leucotrienos ha sido una diana terapéutica principal de la
industria farmacéutica. Actualmente hay disponibles compuestos
potentes y específicos que inhiben la síntesis de los leucotrienos
inhibiendo directamente o 5-LO o FLAP; ambas clases
de agentes inhiben la síntesis de todos los productos de
5-LO. Además, también hay disponibles compuestos que
actúan como agonistas específicos de los receptores de LTB_{4} y
de los cisteinil leucotrienos; al contrario que la clase anterior,
estos agentes ofrecen la capacidad de bloquear las acciones de
leucotrienos individuales de forma independiente. Aunque los
estudios preclínicos sugieren una variedad de potenciales dianas de
enfermedades, el asma ha recibido la mayor atención en los estudios
clíni-
cos.
cos.
De forma general se asume que las cascadas
inflamatorias han evolucionado con el fin de defender al hospedador
contra la invasión microbiana. Sin embargo se conoce poco sobre la
posible importancia de los leucotrienos endógenos en la mediación
de la respuesta del hospedador a la infección. La incidencia cada
vez mayor de la inmunosupresión y la aparición de microbios
resistentes a los antibióticos subrayan la importancia de comprender
los mecanismos innatos de defensa del hospedador.
La esterilidad de la superficie de los alvéolos
pulmonares está siendo agredida constantemente por microbios
inhalados y aspirados. La eliminación eficaz de estos patógenos
depende en gran medida de las respuestas inmunitarias innatas que
implican fagocitosis y destrucción de microbios. Con anterioridad al
trabajo de los presentes inventores, los investigadores han
ignorado en gran medida los productos de la ruta de
5-LO como una clase potencial de mediadores
inflamatorios de la defensa antimicrobiana.
Los presentes inventores han encontrado que
productos de la ruta de 5-LO en general, y los
leucotrienos en particular administrados de forma exógena, se
asocian a un número de posibles ventajas como agentes adyuvantes en
el tratamiento de la neumonía. Específicamente los inventores han
determinado que estos productos muestran un inicio rápido de la
acción y creen que estos productos no provocan respuestas
inmunológicas en el receptor. Además, tales productos representan
un tratamiento relativamente económico que puede usarse de forma
independiente de los antibióticos o como tratamiento adyuvante de
los antibióticos en el tratamiento de la neumonía. Poblaciones de
pacientes particulares (por ejemplo, pacientes con SIDA, diabetes,
fumadores, neonatos, y pacientes que padecen alcoholismo y
malnutrición) con neumonía grave se beneficiarían del aumento de los
mecanismos endógenos de defensa del hospedador a través de la
administración racional, por ejemplo, de leucotrienos a los
pulmones.
Aunque no es necesario entender de forma precisa
los efectos de los leucotrienos sobre la defensa antimicrobiana del
hospedador para practicar la presente invención, se cree que se
producen ciertos efectos generales. Primero, los leucotrienos
endógenos deben estar presentes en los sitios de infección para
participar en la defensa antimicrobiana) y se han medido niveles
aumentados (comparados con controles) de LTB_{4} en fluido de
lavado broncoalveolar (BALF) y tejido pulmonar de ratas infectadas
con Pseudomonas aeruginosa [A. Buret y cols., Infect. Immun.
61: 671-679 (1993)] así como en el fluido de lavado
broncoalveolar de pacientes con neumonía bacteriana [H. Hopkins y
cols., Chest 95: 1021-1027 (1989)]. Tal como se
describe con más detalle más adelante, los presentes inventores
también han medido niveles altos tanto de LTB_{4} como de
LTC_{4} en homogeneizados de pulmón de ratones con neumonía por
Klebsiella. La Klebsiella pneumoniae es la causa
clásica de neumonía por organismos Gram negativos y se ha reseñado
que es responsable del 18-64% de las neumonías por
organismos Gram negativos extrahospitalarias y del 30% de las
intrahospitalarias. [L. Crane y A. Lerner, En: Respiratory
Infections: Diagnosis and Management (J. Pennington, ed.) (Raven
Press. New York), páginas 227-250 (1983)].
Segundo, los leucotrienos añadidos de forma
exógena potencian la fagocitosis y/o destrucción microbianas. Tal
como se describe anteriormente, la adición de LTB_{4} promueve la
quimiotaxia así como la fagocitosis de partículas, la transducción
de señales, y la secreción de oxidantes y enzimas lisosómicas – todo
lo cual sería de esperar que facilitara la eliminación de
bacterias. De hecho, LTB_{4} potenció la fagocitosis y la
destrucción in vitro de P. aeruginosa y Salmonella
typhimurium por los macrófagos peritoneales. [T. Demitsu y
cols., Int. J. Immunopharmac. 11: 801-808 (1989)], y
la destrucción in vitro de Schistosoma mansoni por
los neutrófilos [R. Moqbel y cols., Clin. Exp. Immunol. 52:
519-527 (1983)]; la inyección intraperitoneal de
LTB_{4} también potenció la eliminación in vivo de S.
typhimurium administrada por la misma vía [T. Demitsu y cols.,
Int. J. Immunopharmac. 11: 801-808 (1989)]. Sin
embargo se cree que, antes de la presente invención, no se había
reseñado la administración intrapulmonar de leucotrienos y otros
productos de la ruta de 5-LO para uso
terapéutico.
Tercero, la reducción de la síntesis endógena de
los leucotrienos aumenta la susceptibilidad a la infección. Se ha
reseñado que la fagocitosis, desgranulación y producción de óxido
nítrico son inhibidas por inhibidores relativamente específicos de
5-LO, lo que indica un papel permisivo de los
leucotrienos endógenos en estas funciones. De forma interesante,
numerosas situaciones caracterizadas por la predisposición a
infecciones pulmonares están asociadas a una capacidad reducida de
los macrófagos alveolares de sintetizar leucotrienos in
vitro; éstas incluyen tanto afecciones en seres humanos
(infección por VIH y tabaquismo) como modelos animales
(malnutrición proteínica y calórica, deficiencia de vitamina D, y el
periodo neonatal). Se ha observado una asociación similar para los
leucocitos de sangre periférica de pacientes con diabetes mellitus.
Esto plantea la posibilidad de que un defecto del metabolismo de
5-LO pudiera subyacer los defectos múltiples de las
funciones de los leucocitos que se han demostrado en diabéticos con
control deficiente. El uso clínico de agentes antileucotrienos en
el asma no se ha asociado a un aumento de las infecciones
respiratorias. Sin embargo, estos estudios generalmente han sido a
corto plazo (es decir, varias semanas o meses), y los asmáticos
jóvenes y que por lo demás están sanos no son una población de
pacientes que se esperaría que estuvieran predispuestos a tales
infecciones.
Se ha demostrado que los macrófagos alveolares
poseen una mayor capacidad de sintetizar leucotrienos que los
monocitos de sangre periférica u otros macrófagos tisulares. Estas
es la situación en respuesta tanto a agonistas solubles (ionóforo
A23187) y de partículas (zymosan), y para células humanas [M. Balter
y cols., J. Immunol. 142: 602-608 (1989)] así como
ratas [M. Peters-Golden y cols., J. Immunol. 144:
263-270 (1990)] (no se muestran los datos). Además,
tal como se describe en más detalle en la sección experimental, el
perfil de los eicosanoides liberados por macrófagos alveolares
murinos estimulados está compuesto igualmente en gran medida por
metabolitos de 5-LO (véase la Fig. 2A).
Los presentes inventores también han demostrado
que los neutrófilos reclutados a los sitios de inflamación muestran
una capacidad aumentada de síntesis de leucotrienos y un
desplazamiento de la distribución del 5-LO
intracelular. De hecho, los presentes inventores han comparado la
capacidad de síntesis de los leucotrienos y la distribución
intracelular de 5-LO en neutrófilos de rata aislados
en sangre periférica o en fluido de lavado peritoneal 4 horas
después de instilación de glucógeno. Los neutrófilos provocados
exhibían una capacidad máxima 5 veces mayor para la síntesis de
LTB_{4} en respuesta a A23187 que los neutrófilos sanguíneos
estudiados en paralelo (no se muestran los datos). Además, las dos
poblaciones de células exhibían distribuciones intracelulares de
5-LO impresionantemente diferentes en estado de
reposo. Tal como se ha demostrado anteriormente para los
neutrófilos sanguíneos humanos [T.G. Brock y cols., J. Biol. Chem.
269: 22059-22066 (1994)], los neutrófilos en reposo
de sangre de rata contenían 5-LO exclusivamente en
el citosol. Por el contrario, los neutrófilos provocados en reposo
contenían una proporción sustancial de su 5-LO en el
núcleo: tras la subsiguiente activación con ionóforos, tanto las
poblaciones de neutrófilos sanguíneos como provocados mostraron
translocación de 5-LO a la membrana nuclear (no se
muestran datos).
Además de los hallazgos que se describen
anteriormente, con los neutrófilos que son reclutados al peritoneo,
los presentes inventores también han observado una localización
intranuclear predominante de 5-LO en los neutrófilos
reclutados al espacio alveolar, tal como se evidencia en ratas
estudiadas 2 días después de la administración intratraqueal de
bleomicina. Esto puede demostrarse tanto mediante análisis
microscópico de inmunofluorescencia de células de lavado y mediante
tinción inmunohistoquímica de cortes de pulmón (no se muestran
datos). En conjunto, estos resultados sugieren que, en el proceso
de reclutamiento desde el torrente sanguíneo a diversos sitios
anatómicos de inflamación, los neutrófilos i) importan
5-LO citosólica al núcleo celular y ii) regulan por
aumento su capacidad máxima de generación de leucotrienos. En estos
dos aspectos, los neutrófilos reclutados se parecen a los
macrófagos alveolares.
De forma significativa, es sabido que existe una
capacidad reducida de síntesis de leucotrienos en los macrófagos
alveolares de seres humanos o animales predispuestos a infecciones
pulmonares. Los presentes inventores han examinado la capacidad
metabólica de 5-LO de macrófagos alveolares aislados
de diversas afecciones humanas o animales que se sabe están
asociadas a una susceptibilidad aumentada a infecciones pulmonares.
Estas afecciones incluían estudios controlados con sujetos humanos
que fumaban [M. Balter y cols., J. Lab. Clin. Med. 114:
662-673 (1989)], sujetos humanos infectados con el
virus de inmunodeficiencia humano (recuentos de CD4 inferiores a
200) [M. Coffey y cols., J. Immunol. 157: 393-399
(1996)], ratas deficientes en vitamina D [M.J. Coffey y cols.,
Prostaglandins 48:313-329 (1994)], terneros recién
nacidos y ratones a los que se administraba alcohol. En todos los
casos, los sujetos no mostraban indicios de infecciones pulmonares
bacterianas en el momento del estudio. En cada una de estas
circunstancias, la capacidad in vitro de los macrófagos
alveolares de sintetizar leucotrienos estaba reducida en un
60-90% comparada con los niveles de los controles.
Estos hallazgos indican que la administración de leucotrienos
exógenos debería potenciar los mecanismos de defensa del hospedador
en pacientes susceptibles a infecciones de las vías respiratorias
bajas.
El desarrollo de ratones deficientes en
leucotrienos mediante alteración dirigida del gen
5-LO representa una herramienta importante para
evaluar el papel de los leucotrienos generados de forma endógena.
[J. Goulet y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:
12852-12856 (1994); X. Chen y cols., Nature 372:
179-182 (1994)]. Se ha encontrado que estos ratones
con genes inactivados presentan una capacidad reducida de reclutar
neutrófilos en la mayoría de los modelos de inflamación. Los
presentes inventores analizaron ratones con el gen
5-LO inactivado para demostrar además que la
capacidad deficiente de síntesis de leucotrienos endógenos está
causalmente relacionada con la defensa antimicrobiana deficiente
del pulmón.
Los presentes inventores usaron Klebsiella
pneumoniae como patógeno causante para inducir la neumonía por
varias razones. Primero, tal como se ha descrito anteriormente, es
de gran relevancia clínica en la neumonía. Segundo, provoca una
respuesta inflamatoria enérgica en ratones. [A. McColm y cols., J.
Antimicrob. Chemother. 18: 599-608 (1986)].
Tercero, el modelo murino de K. pneumoniae ha sido
caracterizado de forma extensa por uno de los coinventores. En los
experimentos que se describen más adelante, se utilizó la inyección
intratraqueal (i.t.) en lugar de aerosol porque se parece más al
bolo de organismos que alcanza el pulmón distal por microaspiración.
Tras la exposición intratraqueal de ratones CD-1 a
10^{3} UFC de K. pneumoniae, el influjo de neutrófilos es
máximo a las 48 horas y la mayoría de los animales han muerto para
el día 5. Además, aumentan los niveles en homogeneizados de pulmón
de diversas citoquinas y también son máximas a las 48 horas; éstas
incluyen factor de necrosis tumoral (TNF), proteína inflamatoria de
macrófagos 2 (MIP-2), proteína inflamatoria de
macrófagos 1\alpha (MIP-1\alpha),
IL-12 e IL-10.
Para aplicar este modelo de neumonía a ratones
con el gen 5-LO inactivado, los presentes inventores
primero identificaron un inóculo de organismos que era apropiado
para la cepa natural antecedente, 129/SvEv. Esta cepa de ratones
demostró ser incluso más susceptible a la Klebsiella
pneumoniae que la cepa CD-1. Específicamente,
estudios anteriores determinaron que en los animales naturales se
producía una mortandad de aproximadamente el 50% con un inóculo de
bacterias de sólo 50 UFC, lo que indica que los ratones 129/SvEv
eran sustancialmente más susceptibles Klebsiella pneumoniae
que la cepa CD-1. [M. Greenberger y cols., J.
Immunol. 155: 722 (1995)]. La necesidad de un inoculo bacteriano
reducido hace que este sea un modelo experimental relevante para la
neumonía por organismos Gram negativos en seres humanos, que
generalmente se cree que es producida por la microaspiración del
contenido orofaríngeo que contiene números relativamente pequeños de
organismos.
Aunque la presente invención utiliza un modelo
murino de K. pneumoniae, la presente invención no se limita
a aumentar el tratamiento de infecciones provocadas por ese
organismo. De hecho, la presente invención contempla la
administración de productos de la ruta metabólica de
5-LO, en particular LTB_{4} y LTC_{4},
independientemente y como adyuvante (por ejemplo, de los
antibióticos) del tratamiento de la neumonía y otras infecciones
del aparato respiratorio provocadas por una panoplia de organismos.
La Tabla 2 recoge algunos de los patógenos bacterianos más comunes
que provocan neumonía extrahospitalaria e intrahospitalaria. Se
contempla que el uso de productos de la ruta metabólica de
5-LO para la fabricación de un medicamento para la
administración pulmonar para el tratamiento de infecciones
provocadas por estos organismos será beneficioso para los
pacientes.
| Tipo de neumonía | Tipo de patógeno |
| Extrahospitalaria | Más frecuente: |
| \hskip0.5cm Streptococcus penumoniae | |
| \hskip0.5cm Haemophilus influenzae | |
| \hskip0.5cm Mycoplasma pneumoniae | |
| Menos frecuente: | |
| \hskip0.5cm Staphylococcus aureus | |
| \hskip0.5cm Legionella sp. | |
| \hskip0.5cm Bacilos gram negativos (alcohólicos) | |
| Aspiración: | |
| \hskip0.5cm Anaerobios bucales (por ejemplo, Peptococci spp.) | |
| Intrahospitalaria | Más frecuente: |
| \hskip0.5cm Enterobacterias (por ejemplo, Klebsiella spp., E. coli) | |
| \hskip0.5cm Pseudomonas aeruginosa | |
| \hskip0.5cm Staphylococcus aureus | |
| Aspiración: | |
| \hskip0.5cm Anaerobios bucales |
La presente invención contempla el uso de
productos de la ruta metabólica de la 5-LO para la
fabricación de un medicamento para la administración pulmonar para
el tratamiento de otras infecciones que presentan manifestaciones
pulmonares. Además, tal como se ha hecho alusión anteriormente, la
presente invención contempla el uso de los productos para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de un amplio
abanico de infecciones microbianas además de las infecciones
bacterianas, que incluyen infecciones provocadas por parásitos [R.
Moqbel y cols. Clip. Exp. Immunol. 52: 519-527
(1983)], virus, y hongos. Además, la presente invención contempla
el uso de los productos para la fabricación de un medicamento para
el tratamiento de infecciones sistémicas; debería recalcarse que la
administración sistémica debería realizarse con precaución, ya que
se sabe que los leucotrienos provocan hipotensión.
Además, aunque la presente invención contempla la
administración pulmonar in vivo de leucotrienos y otros
productos de 5-LO para aumentar las defensas contra
bacterias en hospedadores deficientes en leucotrienos, la presente
invención también contempla la administración in vivo a
pacientes que no son deficientes en leucotrienos; de hecho, tal uso
está apoyado por el hecho de que la incubación in vitro con
leucotrienos exógenos aumenta la fagocitosis y la destrucción por
los macrófagos normales.
Digno de mención, el uso futuro de fármacos
antileucotrienos en seres humanos es probable que imite la
deficiencia de leucotrienos que se observa con la alteración del
gen 5-LO en ratones. En ciertos individuos que toman
otros agentes inmunosupresores o que tienen números crecientes de
bacterias en las vías respiratorias bajas, el uso de tales fármacos
puede poner en peligro la defensa pulmonar antimicrobiana del
hospedador. Como resultado, estos individuos también pueden
beneficiarse de la administración de productos de la ruta de
5-LO que se contemplan para usar con la presente
invención; por supuesto, pueden estar justificados pautas y
posologías de administración particulares cuando estos agentes se
usan de forma concomitante en pacientes que toman fármacos
antileucotrienos.
Tal como se ha hecho alusión anteriormente, la
presente invención contempla el uso de diversos productos de la
ruta metabólica de la 5-lipooxigenasa para potenciar
la defensa contra bacterias. El procedimiento de selección completo
que se describe en la Tabla 3 puede usarse para evaluar esos
productos (tales como los compuestos que se presentan anteriormente
en la Tabla 1), así como derivados o análogos de tales productos,
que puedan ser eficaces. Los leucotrienos B_{4} y C_{4} son
particularmente eficaces para potenciar la defensa antibacteriana y
esta selección es especialmente apropiada para los compuestos
relacionados con esos leucotrienos. Con cada determinación se
proporcionan referencias a un ejemplo particular; los ejemplos que
se indican proporcionan una descripción detallada de cómo debe
realizarse la determinación.
| Etapa | Determinación | Conclusión |
| I | \begin{minipage}[t]{70mm} Medir in vitro la actividad de los compuestos sobre las actividades fagocítica y bactericida de los macrófagos alveolares (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3).\end{minipage} | \begin{minipage}[t]{60mm} Pasar a la Etapa II con aquellos compuestos que aumenten las actividades fagocítica y bactericida.\end{minipage} |
| II | \begin{minipage}[t]{70mm} Determinar in vivo el efecto de los compuestos sobre la eliminación de bacterias después de 48 horas midiendo las UFC en homogeneizado de pulmón (véase, por ejemplo, el Ejemplo 2).\end{minipage} | \begin{minipage}[t]{60mm} Pasar a la Etapa III con aquellos compuestos que aumenten la eliminación.\end{minipage} |
| III | \begin{minipage}[t]{70mm} Determinar in vivo el efecto de los compuestos por diferentes vías de administración y administrados en momentos diferentes después de la exposición a las bacterias (véase, por ejemplo, el Ejemplo 10).\end{minipage} | \begin{minipage}[t]{60mm} Pasar a la Etapa IV con aquellos compuestos que muestren eficacia tras la administración al menos por una vía.\end{minipage} |
| IV | \begin{minipage}[t]{70mm} Verificar los hallazgos de la Etapa III examinando la supervivencia de los animales\end{minipage} | Considerar ensayos clínicos. |
Tal como se ilustra mediante este esquema de la
secuencia de procedimientos experimentales y la descripción de los
procedimientos en sí, la consideración cuidadosa permite evaluar
cualquier compuesto (por ejemplo, el "Compuesto X") para usar
con la presente invención. De hecho, tal como se describe en detalle
en la sección experimental, estos procedimientos de selección se
han empleado en los experimentos realizados con LTB_{4}.
La presente invención contempla el uso de las
composiciones terapéuticas de productos de la ruta metabólica de
5-LO que se indica que son eficaces basándose en la
aplicación de la selección que se describe anteriormente. No se
pretende que la presente invención esté limitada por la naturaleza
particular de la preparación terapéutica. Por ejemplo, tales
composiciones pueden proporcionarse junto con un líquido
fisiológicamente tolerable (por ejemplo, solución salina), gel o
transportadores o vehículos, diluyentes, adyuvantes y excipientes,
tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón,
estearato magnésico, sacarina sódica, celulosa, carbonato magnésico
y similares y sus combinaciones. Estas composiciones habitualmente
contienen 1%-95% de ingrediente activo, preferiblemente 2%-70%.
Además, si se desea, las composiciones pueden contener cantidades
menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o
emulsionantes, agentes estabilizantes o tamponadores del pH o
conservantes. En general, la naturaleza de la composición dependerá
del procedimiento administración.
Estas preparaciones terapéuticas pueden
administrarse a mamíferos para uso veterinario, tal como con
animales domésticos, y para uso clínico en seres humanos de forma
similar a otros agentes terapéuticos. En general, la dosis
necesaria para la eficacia terapéutica variará dependiendo del tipo
de uso y modo de administración, así como de los requisitos
particulares de los individuos hospedadores y del organismo
implicado.
Un modo de administración preferido comprende la
administración al pulmón. Los pacientes que están lo suficientemente
enfermos como para necesitar respiración mecánica pueden recibir
tratamiento con agentes farmacológicos administrados mediante un
tubo endotraqueal que se conecta al respirador. De forma
alternativa, la administración intrapulmonar de agentes
farmacológicos a pacientes que no necesiten respiración mecánica
puede lograrse mediante aerosoles. De forma alternativa, el agente
puede administrarse al pulmón a través de un broncoscopio. Por
supuesto, pueden investigarse los agentes terapéuticos para
determinar su eficacia mediante otras vías de administración, que
incluyen la administración parenteral. Sin embargo, cuando el sitio
de la infección es el pulmón, dirigir allí la administración del
fármaco es probable que minimice los efectos secundarios y las
consecuencias sistémicas.
Además, los compuestos que contempla la presente
invención poseen atributos como agentes terapéuticos comparados con
otros agentes tales como los polipéptidos. Por ejemplo, los
productos de la ruta metabólica de 5-LO que se
contemplan en la presente invención tienen un inicio de acción
rápido (generalmente en 1 hora) y una duración de acción corta
(generalmente menos de 12 horas); estos atributos permiten un grado
de control sustancial de los efectos biológicos. Además, su corta
duración de acción reduce la posibilidad de que la administración
de leucotrienos y agentes relacionados pueda estimular de forma
adversa una respuesta inflamatoria demasiado profusa. Además,
pueden administrarse antagonistas de los receptores de leucotrienos
disponibles comercialmente (por ejemplo, el antagonista de
cisteinilo Accolate® (zafirlukast) Zeneca) para prevenir que se
produzca una reacción inflamatoria de ese tipo.
Tal como se ha hecho alusión anteriormente, los
productos de la ruta metabólica de 5-LO que
contempla la presente invención se asocian a atributos adicionales.
Por ejemplo, los productos lipídicos no provocan reacciones
inmunológicas tales como las que provocan los agentes
polipeptídicos. Además, los compuestos de la presente invención son
relativamente económicos, haciendo que sean ideales como adyuvantes
para el tratamiento de infecciones.
Los compuestos que contempla la presente
invención proporcionan un medio de potenciar las capacidades de
defensa pulmonar. Son especialmente eficaces en el tratamiento y
prevención de neumonía bacteriana en aquellos pacientes que están
predispuestos a esa afección. Por supuesto, la presente invención
contempla el uso de los compuestos en el tratamiento y prevención
de otras infecciones y enfermedades, solo o combinados, por ejemplo,
con otros productos de la ruta de 5-LO o agentes
antimicrobianos.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar
ciertas realizaciones y aspectos preferidos de la presente invención
y no deben interpretarse como limitantes de su alcance.
En la descripción experimental a continuación,
son de aplicación las siguientes abreviaturas: M (Molar): mM
(milimolar); \muM (micromolar); N (Normal); mol (moles); mmol
(milimoles); \mumol (micromoles); nmol (nanomoles); pmol
(picomoles); g (gramos): mg (miligramos); \mug (microgramos); l
(litros); ml (mililitros); \mul (microlitos); cm (centímetros); mm
(milímetros); \mum (micrómetros); nm (manómetros); min (minutos);
s y seg. (segundos); DE (diámetro exterior); ºC (grados
centígrados); v/v (volumen/volumen); MA (macrófago alveolar); BAL
(lavado broncoalveolar); BALF (fluido de lavado broncoalveolar);
cPLA, (fosfolipasa citosólica A_{2}); UFC (unidades formadoras de
colonias); 5-LO (5-lipooxigenasa);
FLAP (proteína activadora de 5-LO); AA (ácido
araquidónico); LT (leucotrienos); LTB_{4} (leucotrieno B_{4});
LTC_{4} (Leucotrieno C_{4}); LTB_{4}R (receptores de
LTB_{4}); cis-LTR (receptor de cisteinil
leucotrieno); CR_{3} (receptor de complemento 3); FcR (receptor
para la porción Fc de Ig); MPO (mieloperoxidasa); PKC (proteína
quinasa C); MAPK (proteína quinasa activada por mitógenos);
O_{2}^{-} (superóxido); NO (óxido nítrico); PM (macrófagos
peritoneales); PMN (leucocitos polimorfonucleares); KO (inactivado);
WT (natural); TNF (factor de necrosis tumoral); JE (el homólogo
murino del péptido quimiotáctico de monocitos 1); IL
(interleuquina); HBSS (solución salina equilibrada de Hank);
RP-HPLC (cromatografía líquida de alta presión de
fase inversa); ET (error típico); ETM (error típico de la media);
Abacus (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA); Abbott (Abbott
Laboratories, North Chicago, IL); ATCC (American Type Culture
Collection, Rockville, MD); Baxter (McGaw Park, IL); Biogenics
(Napa, CA); Cayman (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI); Coulter
(Coulter Corp., Miami, FL); Difco (Detroit, MI); Fisher Scientific,
(Pittsburg, PA); Gibco (Gibco BRL; Gaithersburg, MD); Jackson (The
Jackson Laboratory; Bar Harbor, ME); Merck (Rahway, NJ); Molecular
Probes (Eugene, OR); Nunc (Naperville, IL); PharMingen (San Diego,
CA); Pierce (Rockford, IL); Pfizer (Pfizer Inc., New York, NY);
Vector (Vector Laboratorios, Burlingame, CA); y Waters (Waters
Corp., Milford, MA); Zeneca (Zeneca Pharmaceuticals, Wilmington,
DE).
Los siguientes Procedimientos generales se usaron
en los ejemplos siguientes a no ser que se indique lo contrario.
Se obtuvieron ratones con la alteración dirigida
de su gen 5-LO (ALOX 5, denominados KO) y sus
controles de cepa natural (129/SvEv, denominados WT) de The Jackson
laboratory.
Se cultivó K. pneumoniae cepa 43816,
serotipo 2 obtenida de la ATCC (n.º de acceso 29939) en caldo de
triptona y soja (Difco) durante 18 horas a 37ºC. La preparación y la
administración intratraqueal de K. pneumoniae se realizaron
tal como describen M. Schneemann y cols. [J. Infect. Dis. 167:
1358-1363 (1993)]. La concentración bacteriana se
determinó midiendo la absorbancia a 600 nm y comparando con una
curva patrón de absorbancias en función de UFC patrones conocidas.
Las bacterias se sedimentaron después por centrifugación durante 30
min a 10,000 rpm, se lavaron 2 veces en solución salina, y se
volvieron a suspender a la concentración deseada en solución
salina.
Después de diluir las bacterias de forma
apropiada en solución salina sin endotoxinas, los animales se
anestesiaron con pentobarbital sódico (aproximadamente 0,2 ml
diluidos 1:7 en solución salina por vía intraperitoneal) y la
tráquea se expuso mediante una incisión pequeña en la línea media.
Se administró un inóculo de 30 \mul que contenía 50 UFC de K.
pneumoniae o solución salina mediante una aguja de calibre 26
estéril y la piel se cerró con una grapa quirúrgica. Para la
preparación de suero específico de K. pneumoniae, se
anestesian ratones naturales de forma similar y se inoculan por vía
intratraqueal (con 25 UFC de bacterias); los animales se desangran
orbitariamente 2 semanas después y se obtiene el suero.
Las UFC en plasma y pulmón se determinaron tal
como describen M. Schneemann y cols. [J. Infect. Dis. 167:
1358-1363 (1993)]. En resumen, los pulmones
homogeneizados en 3 ml de solución salina estéril y plasma se
recolectaron después de sacrificarlos, se introdujeron en hielo y se
realizaron diluciones seriadas de 1:10. Se plaquearon 10 \mul de
cada dilución en placas de agar con sangre y base de soja (Difco).
Se incubaron durante 18 horas a 37ºC, y se numeraron las
colonias.
A las 30 y 48 horas después de la inoculación, se
anestesiaron los ratones y se recolectó la sangre mediante
desangramiento orbitario. Después los ratones se sacrificaron
mediante luxación cervical y los pulmones enteros se recolectaron
para determinar los niveles de citoquinas, la actividad de
mieloperoxidasa (MPO), y los niveles de leucotrienos. Para los
análisis de citoquinas y leucotrienos, los pulmones se
homogeneizaron en 2 ml de tampón que contenía Triton
X-100 al 0,5%, NaCl 150 mM, Tris-HCl
15 mM, CaCl_{2} 1 mM, y MgCl_{2} 1 mM. Después los
homogeneizados se centrifugaron a 1500 x g durante 10 minutos y los
sobrenadantes se filtraron a través de un filtro de jeringuilla de
1,2 \mum y se congelaron inmediatamente a -20ºC. Se cuantificaron
cada uno de TNF, proteína inflamatoria de
macrófagos-1\alpha, proteína inflamatoria de
macrófagos-2, JE murino e IL-12
usando una modificación de un procedimiento de doble ligando tal
como describen M. Schneemann y cols. [J. Infect. Dis. 167:
1358-1363 (1993)]. Para determinar los niveles de
leucotrienos en homogeneizados de pulmón, se extrajeron muestras en
cartuchos C_{18} de Sep-Pak® (Waters) eliminando
materiales que potencialmente pueden presentar reacción cruzada y
se evaporaron a sequedad en atmósfera de N_{2}. [J. Wilborn y
cols., J. Clin. Invest. 97: 1827 (1996)]. Con el fluido de lavado
broncoalveolar se usa un procedimiento análogo.
Se volvieron a suspender muestras en tampón de
ensayo y se determinaron los niveles de LTB_{4} y LTC_{4} de
acuerdo con las instrucciones del fabricante usando kits de
inmunoensayo enzimático obtenidos de Cayman Chemical. Se cuantificó
la actividad de MPO, un índice del influjo de neutrófilos en
homogeneizados de pulmón tal como describe M. Greenberger y cols.
[J. Immunol. 155: 722 (1995)]. En resumen, se homogeneizaron los
pulmones en 2 ml de tampón que contenía fosfato potásico 50 mM, a pH
6,0, con bromuro de hexadeciltrimetilamonio al 5% y EDTA 5 mM. El
homogeneizado se sometió a ultrasonidos y se centrifugó y el
sobrenadante se mezcló 1:15 con tampón de ensayo (fosfato sódico
monobásico 86 mM, fosfato sódico dibásico 12 mM, H_{2}O_{2} al
0,0005% [v/v], y 0,167 mg/ml de clorhidrato de
o-dianisidina) y se leyó a 490 nm (Beckman
DU-64). Las unidades de MPO se calcularon en
términos del cambio en absorbancia en función del tiempo. El
contenido en proteína de los homogeneizados se determinó usando una
modificación del procedimiento de Bradford con placas de
microvaloración (Pierce Biochemical) usando albúmina de suero bovino
como patrón.
La tráquea se expuso mediante una incisión de 0,5
cm y se intubó usando un catéter de polietileno con DE de 1,7 mm.
El lavado broncoalveolar se realizó instilando alícuotas de 1 ml de
solución salina tamponada con fosfato que contenía EDTA 5 mM. Se
consiguieron aproximadamente 4 ml de fluido de lavado por ratón, y
en número total de células y los recuentos de células diferenciales
se determinaron a partir de citocentrifugados de cada muestra.
Para ensayos de fagocitosis y destrucción
bacterianas, se purificaron macrófagos alveolares a partir de
células de lavado broncoalveolar mediante adherencia durante 1 hora
en HBSS y se estudiaron en cultivo monocapa. Las células adherentes
se incubaron previamente con suero inmunitario específico de K.
pneumoniae al 5% (como fuente tanto de complemento como de
anticuerpo de opsonización específico) durante 5 minutos a 37ºC
antes de los ensayos. La fagocitosis se estudió incubando 10^{5}
macrófagos alveolares con 10^{6} K. pneumoniae en cada
pocillo de una placa de 8 pocillos Labtek® (Nunc) durante 1 hora a
37ºC; en algunos experimentos se añadió LTB_{4} exógeno (Cayman)
de forma concomitante a las bacterias. Los sobrenadantes se
aspiraron y las células se lavaron 3 veces con HBSS. Después los
cortes se dejaron secar al aire, se realizó una tinción con
Diff-Quik® (Difco), y se contaron 200 células por
pocillo para determinar el número de K. pneumoniae
intracelular y el porcentaje de macrófagos alveolares que contenían
bacterias. El índice de fagocitosis se calculó en términos del
porcentaje medio de macrófagos alveolares que contenían bacterias
multiplicado por el número medio de bacterias por macrófago
alveolar.
La actividad bactericida se ensayó incubando
durante 1 hora a 37ºC los mismos números de macrófagos alveolares y
organismos que se detallan anteriormente, pero en placas de cultivo
tisular de 35 mm. Se retiraron los sobrenadantes y después las
células se lavaron con HBSS y se lisaron añadiendo 1 ml de agua
estéril fría, rascando con un rascador de goma e incubando en hielo
durante 10 minutos. Se añadió 1 ml de 2x HBSS a cada placa y se
realizaron diluciones seriadas en placas de agar con sangre. Las
placas se incubaron durante 18 horas a 37ºC y se contaron las
colonias. Se calculó la destrucción porcentual de bacterias
intracelulares mediante la siguiente fórmula: 100 - (número de UFC
de bacterias/ml de lisado de macrófagos alveolares dividido entre el
número total de bacterias intracelulares), donde las K.
pneumoniae intracelulares totales son el producto del número
total de macrófagos alveolares por el porcentaje de macrófagos
alveolares que contenía bacterias por el número medio de bacterias
por macrófago alveolar.
Para obtener neutrófilos provocados peritoneales,
se inyecta glucógeno al 5% en PBS por vía intraperitoneal a los
ratones y se realiza un lavado peritoneal 5 horas después. Se
obtienen aproximadamente 3 x 10^{6} células de cada animal, de
las cuales aproximadamente 85-90% son neutrófilos.
Del mismo modo estas células se cultivan para estudios funcionales.
Se realizan ensayos de fagocitosis y bactericidas tal como se
describe anteriormente.
El lavado pulmonar de los animales expuestos a
K. pneumoniae produce una mezcla de macrófagos alveolares y
neutrófilos; se encuentran en una relación de aproximadamente 1:1 a
los 2 días de la inoculación, pero es probable que la relación
varíe con el tiempo. Para determinar la secreción constitutiva de
leucotrienos procedentes de estas células, las células de lavado
broncoalveolar mezcladas se cultivan (5 x 10^{5} células/pocillo)
tal como se describe anteriormente para las poblaciones purificadas;
la relación entre macrófagos alveolares y neutrófilos en las
monocapas adherentes se determinan mediante tinción directa con
Diff-Quik® de las monocapas tras eliminar el medio.
En todos los casos en los que se cuantifican los niveles de
leucotrienos en el medio de cultivo, los valores se expresan por
\mug de proteína celular. El medio de cultivo es medio 199
(Gibco).
Se suspenden dosis de inhibidor de
5-LO (A-79175; Abbott), antagonista
de los receptores de LTB_{4} (CP-105.696;
Pfizer), y antagonista de los receptores de cisteinil leucotrienos
(MK-571; Merck Research Laboratories) en
metilcelulosa y se administran una vez al día por vía oral a ratones
no anestesiados usando una aguja de cebado de calibre 22.
Se diluyeron soluciones madre en etanol de
LTB_{4}, LTC_{4}, y 5-HETE (Cayman Chemical) en
solución salina y se usó un volumen de 10 \mul para inyección
intratraqueal. Para la nebulización, se usa un tamaño de partícula
< 3 \mum y una cámara de exposición sólo para la nariz.
Se tiñen cortes de pulmón así como
citocentrifugados de lavados broncoalveolares para determinar
5-LO para identificar la frecuencia y los tipos de
células que muestran localización de la enzima en la membrana
nuclear (un patrón "activado"). [J. Wilborn y cols., J. Clin.
lnvest. 97: 1827-1836 (1996)]. En resumen, los
especimenes se fijan en paraformaldehído al 4%, se embeben en
parafina y se obtienen secciones de 3 \mum de grosor y se montan
en portaobjetos Superfrost/PLUS® (Fisher Scientific). La parafina se
elimina con Americlear® (Baxter) y se rehidrata el tejido. Para
reducir la unión no específica, el tejido se incuba con Power Block®
(Biogenics) seguido de suero de cabra normal al 25%.
Los cortes y los citocentrifugados se incuban a
4ºC durante 24 horas con antisuero de conejo contra
5-LO humana (Merck Frosst Canada) o suero de conejo
no inmunitario a 1:1000 en suero de cabra normal al 25% en PBS. Este
anticuerpo también reconoce 5-LO de ratón y murino.
Después se aplica suero de cabra contra IgG de conejo (1:600)
durante 30 minutos y se detecta el anticuerpo primario usando
sustrato de peroxidasa True-Blue® con tinción de
contraste Contrast Red® (ambos de KPL Laboratories). La proporción
de las células con tinción positiva que exhibían un patrón activado
se determina a partir de recuentos de 20 campos con magnificación.
Las células con tinción positiva para 5-LO (la
mayoría de las cuales se espera que sean o bien macrófagos o
neutrófilos) se clasifican dependiendo del tipo celular en base a
la morfología. Si es necesario distinguir los macrófagos alveolares
y los neutrófilos, se realiza una tinción dual. La tinción
específica de tipo celular se logra bien con un segundo primario
(por ejemplo, anticuerpo contra neutrófilos) o mediante tinción
histoquímica (por ejemplo, para esterasa no específica o MPO). La
segunda proteína se detecta mediante Vector Red® (Vector) que
contrasta con la tinción True-Blue® para
5-LO.
La expresión de CR3 y FcR se cuantifica tanto en
macrófagos alveolares como en neutrófilos mediante tinción con
anticuerpos monoclonales contra ratón conjugados con FITC con
análisis subsiguiente mediante citometría de flujo. [L. Laichalk y
cols., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 658: 1-7
(1996)]. Los anticuerpos monoclonales conjugados con FITC
(PharMingen) incluyen IgG_{1} contra CR3, IgG_{1} contra
FcRII/FcRIII, y un control de isotipo contra IgG_{1}. Las
incubaciones experimentales se realizan en suspensión. Se tiñen 5 x
10^{5} células con 1 \mug de anticuerpo monoclonal durante 30
minutos en hielo, se lavan, se fijan en paraformaldehído al 2% en
PBS, y se almacenan a 4ºC en la oscuridad hasta que se analizan. Las
muestras se analizan en un citómetro de flujo EPICS C con el
software que lo acompaña (Coulter Corp.) disponible en la Flow
Cytometry Core Facility de la Universidad de Michigan, examinando
al menos 20.000 eventos por muestra. Después de corregir la tinción
considerando la IgG de control, se determinan tanto el porcentaje de
células con tinción positiva como la intensidad media de la
fluorescencia.
La ingestión de partículas o de bacterias unidas
requiere una reordenación del citoesqueleto, que incluye la
polimerización local de la actina. La actina polimerizada
(F-actina) se analiza tiñendo con
rodamina-faloidina (Molecular Probes) con una
dilución de 1:300. La localización intracelular de
F-actina se evalúa mediante microscopia
inmunofluorescente. Las células sobre cubreobjetos se fijan con
formalina y se permeabilizan en acetona. [T.G. Brock y cols., J.
Biol Chem. 269: 22059-22066 (1994)]. Tras la
incubación con faloidina durante 1 hora, las células se examinan
con un microscopio Nikon Labophot 2 equipado para epifluorescencia.
Para cuantificar el contenido celular total de
F-actina, las células se permeabilizan con Triton
X-100 al 0,1% y se incuban con
rodamina-faloidina y se analizan por citometría de
flujo. [R. Crowell y cols., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 12:
190-195 (1995)].
Las células adherentes de ratones con genes
inactivados o naturales se marcan previamente incubando durante 15
minutos con 5 \mug/ml de naranja de acridina (Molecular Probes).
Las células se lavan, se incuban previamente con suero inmunitario
específico, y después se incuban durante hasta 2 horas con K.
pneumoniae solas o en presencia de leucotrienos exógenos. Las
células se examinan mediante microscopia immunofluorescente. Se
cuentan doscientas células por cada condición y se registra el
porcentaje de células que muestran fusión así como el número total
de figuras de fusión.
La producción de superóxido por
0,5-1,0 x 10^{5} células adherentes incubadas con
0,5-1,0 x 10^{7} de K. pneumoniae o
miristato acetato de forbol 100 nM se evalúa a partir de la
reducción inhibible mediante superóxido dismutasa de ferricitocromo
C [L. Laichalk y cols., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 658:
1-7 (1996)]. El ensayo se realiza en placas de 96
pocillos y se lee a 550 nm. La generación de NO se determina
cuantificando el nitrito, su metabolito, en un medio de cultivo
suplementado con L-arginina de 10^{6} células
incubadas durante 2 horas con bacterias. [M. Schneemann y cols., J.
Infect. Dis. 167: 1358-1363 (1993)]. El medio se
centrifuga eliminando las bacterias, y se añade sobrenadante a
reactivo de Griess (clorhidrato de
N-1-naftiletilendiamina al 0,05%,
sulfanilamida al 0,5%, ácido fosfórico al 2,5%) y se incuba en
placas de 96 pocillos durante 10 minutos; la absorbancia se lee a
570/630 nm. La enzima lisosómica
\beta-glucuronidasa se cuantifica en el medio y
en los lisados celulares [W. Hsueh y cols., Exp. Lung Res. 13:
385-399 (1987)] usando el reactivo
4-metilumbeliferil-\beta-D-glucurónido
trihidratado; la fluorescencia se lee a 375/455.
Los datos se analizaron usando el paquete
estadístico The Statview II® (Abacus Concepts). Las comparaciones
de los datos de supervivencia se realizaron usando el análisis de
Chi cuadrado. Todos los otros datos se expresan en términos de la
media \pm ETM. Las comparaciones entre los medios de tratamiento
se realizaron usando una prueba de Student bilateral o la prueba de
suma de rangos de Wilcoxen, según fuera apropiado (es decir,
dependiendo de si los datos son paramétricos o no paramétricos).
Para las comparaciones de los datos medios de tres o más grupos
experimentales, se usa la prueba ANOVA y la subsiguiente aplicación
de la prueba de Newman-Keuls. El criterio de
significación era p \leq 0,05.
Se sabe que la instilación intratraqueal de K.
pneumoniae en ratones provoca una neumonía reproducible
caracterizada por inflamación pulmonar aguda que, dependiendo del
inóculo, o bien se resuelve o produce la muerte. [G. Rosen y cols.,
FASEB J. 9: 200-209 (1995)]. Para evaluar el papel
de los productos de 5-LO en la defensa pulmonar del
hospedador, este ejemplo compara la supervivencia de ratones con el
gen 5-LO inactivado y de ratones naturales.
Las Figs. 2A y B representan perfiles de
RP-HPLC de eicosanoides radioactivos liberados por
macrófagos alveolares previamente marcados obtenidos de ratones
naturales (Fig. 2A) y de ratones con el gen 5-LO
inactivado (Fig. 2B). Los perfiles se obtuvieron marcando
previamente 10^{6} macrófagos alveolares toda la noche con
[^{3}H]ácido araquidónico. Los macrófagos alveolares después se
lavaron y se estimularon durante 30 minutos con A23187 1 \muM. El
medio se sometió a extracción de lípidos y los eicosanoides
radiomarcados se separaron mediante HPLC de fase inversa. Los picos
se identificaron basándose en la elución concomitante con patrones
auténticos. Comparadas con las células de animales naturales de
control (Fig. 2A), los macrófagos alveolares de los animales KO no
producían leucotrienos o 5-HETE, tal como se
esperaba. Además, no existe producción aumentada de prostaglandinas
a partir de una posible "derivación" del ácido araquidónico.
Esto indica que cualquier reducción de la defensa antimicrobiana en
estos animales es probablemente atribuible a su deficiencia de
leucotrienos proinflamatorios, en lugar de a una sobreproducción de
prostaglandina E2 antiinflamatoria,
Para este experimento, se inocularon 50 UFC de
bacterias a ratones con el gen 5-LO inactivado y
ratones naturales de la misma cepa (129/SvEv) (diez animales por
grupo) por vía intratraqueal, y se controló supervivencia durante
un periodo de 12 días. La Fig. 3 representa de forma gráfica el
efecto de la exposición a K. pneumoniae sobre la
supervivencia en ratones con el gen 5-LO inactivado
(círculos negros) y ratones naturales (cuadrados blancos)
(*p<0,05 comparado con WT). Como indican los resultados de la
Fig. 3, la administración de 50 UFC de bacterias produjo una
mortandad del 60% en los ratones naturales en 8 días, sin muertes
subsiguientes después de eso. Por el contrario, todos los ratones
con el gen inactivado murieron en respuesta a esta misma exposición,
y todas las muertes se produjeron para el día 10. Además, las
muertes en el grupo con el gen inactivado se produjeron antes que
en los animales naturales.
Estos resultados indican que los productos
metabólicos de 5-LO desempeñan un papel importante
en la respuesta de protección del hospedador en este modelo de
neumonía. Las curvas de supervivencia de la Fig. 3 que divergen ya
a partir del día 2 indica la importancia de los eventos tempranos
tras la exposición a las bacterias.
Tal como se describe en el ejemplo precedente,
los eventos tempranos tras la exposición a las bacterias (es decir,
aproximadamente dos días después de la exposición) son importantes.
Este ejemplo explora adicionalmente esos resultados evaluando los
valores de UFC en homogeneizado de pulmón y plasma 30 y 48 horas
después de la administración de K. pneumoniae.
Se inocularon 50 UFC a ratones con el gen
inactivado y a ratones naturales por vía intratraqueal, y se
determinaron los valores de UFC en homogeneizado de pulmón y plasma
48 horas después. La Fig. 4 representa de forma gráfica la
eliminación de K. pneumoniae de pulmón y plasma después de la
exposición en ratones con el gen 5-LO inactivado
(barras sombreadas con cruces) y ratones naturales (barras lisas)
(las barras representan la media \pm ET; n = 5-19
animales: *p<0,05 comparado con WT). Tal como indican los datos
de la Fig. 4, las UFC medias en pulmón así como en plasma eran casi
dos unidades logarítmicas mayores en los ratones con el gen
inactivado que en los ratones naturales 48 horas después de la
exposición. Además, la proporción de animales con el gen inactivado
que desarrollaron bacteremia en este punto (15/19) era
significativamente mayor que en los ratones naturales (10/19). En
un grupo adicional de animales estudiados 30 horas después de la
exposición, el 66% de los ratones con el gen inactivado padecían
bacteremia (UFC medias en plasma de 1,06 x 10^{5}), aunque
ningún ratón natural presentaba bacterias en plasma en este momento
(no se muestran datos).
Estos datos confirman la importancia de un
sistema intacto de generación de leucotrienos para la contención
temprana de una exposición pulmonar a K. pneumoniae.
Los experimentos de este ejemplo evalúan la
capacidad de los macrófagos alveolares en sí, la primera línea de
defensa celular, de fagocitar y destruir K. pneumoniae in
vitro y el efecto de la administración de leucotrienos exógenos
sobre las funciones antibacterianas de los macrófagos alveolares
in vitro.
Los macrófagos alveolares se purificaron mediante
adherencia de células de lavado broncoalveolar procedentes de
animales con el gen inactivado y naturales no infectados, y se
preincubaron durante 5 minutos con suero inmunitario específico de
K. pneumoniae al 5% (como fuente tanto de complemento como de
anticuerpo de opsonización específico) antes de los ensayos. Los
macrófagos alveolares cultivados de los dos grupos de ratones se
incubaron en presencia de suero específico con K. pneumoniae
durante 1 hora y después se lavaron, después de lo cual o se
tiñeron monocapas con Diff-Quik (Difco) y se
enumeraron los organismos intracelulares o se lisaron y se
determinaron las UFC bacterianas en los lisados tras el cultivo toda
la noche. El índice de fagocitosis y la destrucción intracelular se
calcularon tal como se detalla anteriormente en los Procedimientos
generales.
La Fig. 5 representa de forma gráfica las
actividades fagocítica y bactericida en macrófagos alveolares
aislados de ratones con el gen 5-LO inactivado
(barras sombreadas con cruces) y ratones naturales (barras lisas):
en La Fig. 5. cada valor representa la media \pm ETM de 6
cultivos replicados (*p<0,05 comparado con WT). Tal como indican
los datos de la Fig. 5, los macrófagos alveolares de ratones con el
gen 5-LO inactivado demostraron descensos
significativos en su capacidad tanto de ingerir como de destruir
K. pneumoniae comparados con las células de ratones
naturales. Dado que la destrucción de microbios depende de su
ingestión previa, la magnitud de la deficiencia en macrófagos
alveolares de la defensa del hospedador en los animales con el gen
inactivado refleja el producto aritmético de estas dos deficiencias
individuales y supone una reducción de hasta aproximadamente 60% de
la reducción en la destrucción de microbios en las condiciones
empleadas. Aunque anteriormente se ha reseñado que LTB_{4}
potencia la destrucción de bacterias Gram negativas por los
macrófagos in vitro y la eliminación de bacterias in
vivo [T. Demitsu y cols., Int. J. Immunopharmac. 11:
801-808 (1989)], los datos que se describen
anteriormente indican un papel importante para los productos de
5-LO endógenos en estos mismos procesos in
vivo e in vitro.
Se realizaron experimentos adicionales para
determinar si la fagocitosis defectuosa de K. pneumoniae en
macrófagos alveolares de animales con el gen 5-LO
inactivado podrían resolverse mediante la adición de LTB_{4}
exógeno. Se seleccionó este leucotrieno particular porque, tal como
se ha indicado anteriormente, sus propiedades de activación de
leucotrienos están bien caracterizadas.
Macrófagos alveolares cultivados procedentes de
ratones con el gen inactivado se incubaron en presencia de suero
específico durante 1 hora con K. pneumoniae solas o en
presencia de dosis variables de LTB_{4}. Se calculó el índice de
fagocitosis tal como se describe en los Procedimientos generales. La
Fig. 6 representa de forma gráfica el efecto de LTB_{4} exógeno
(nada, 0,1 nM, y 5 nM de LTB_{4} añadido) sobre la actividad
fagocítica de bacterias en macrófagos alveolares de ratones KO para
5-LO; cada valor representa la media de cultivos
triplicados. Tal como se muestra en la Fig. 6, LTB_{4} potenció el
índice de fagocitosis de forma dependiente de la dosis de LTB_{4}
en macrófagos alveolares con el gen inactivado, con un índice
aproximadamente tres veces el nivel inicial a una concentración de
5 nM. Aunque no es necesario para practicar la presente invención,
se cree que los neutrófilos manifiestan defectos de función
similares en la fagocitosis y destrucción que podrían contribuir a
la sensibilidad a la neumonía bacteriana que se observa en ratones
con el gen inactivado in vivo.
También se examinaron los efectos de LTB_{4}
exógeno sobre la fagocitosis por los neutrófilos de ratones con el
gen 5-LO inactivado. Se obtuvieron neutrófilos
provocados con glucógeno de la cavidad peritoneal de ratones con el
gen inactivado, y se evaluó la fagocitosis de K. pneumoniae
durante un periodo de tiempo de una hora en presencia y ausencia de
LTB_{4} exógeno (1 nM); en estas circunstancias, el índice de
fagocitosis era de 27 \pm 8 y 45 \pm 4, respectivamente (no se
muestran datos). Estos resultados con LTB_{4} exógeno son
importantes en varios aspectos. Primero, indican que el defecto de
fagocitosis de estas células está realmente relacionado con la
deficiencia de 5-LO, y que no es coincidencia.
Segundo, el hecho de que la adición de leucotrieno exógeno fuera
capaz de superar la falta de 5-LO indica que el
defecto de la función de estas células estaba relacionado de forma
causal con su deficiencia de leucotrienos endógenos; este hallazgo
es contrario a los hallazgos de otros investigadores que
encontraron que los defectos en la función de los leucocitos
provocados por inhibidores de 5-LO no podía
superarse mediante la adición de leucotrienos exógenos. [Véase, por
ejemplo, N. Hubbard y K. Erickson. Mol. Immunol. 160:
115-122 (1995)]. Tercero, la rapidez de la
potenciación de la capacidad de fagocitosis producida por la
adición de leucotrieno exógeno indica que este efecto puede
reproducirse mediante la administración pulmonar de este lípido
in vivo; dicho aumento rápido en la eliminación de bacterias
ha sido observado tras la inyección de LTB_{4} en el peritoneo
in vivo. [T. Demitsu y cols., Int. J. Immunopharmac. 11:
801-808 (1989)].
Este ejemplo evalúa los mecanismos responsables
de la susceptibilidad potenciada de los ratones con el gen
5-LO inactivado a la neumonía por Klebsiella.
Por supuesto, debe entenderse que no es necesario entender los
mecanismos para practicar la presente invención.
Se inyectaron 50 UFC de bacterias (Klebsiella
pneumoniae) o diluyente salino solo por vía intratraqueal a
ratones naturales. Dos días después, se recolectaron los pulmones y
se homogeneizaron. Los homogeneizados se sometieron a extracción
lipídica y se cuantificaron los leucotrienos inmunorreactivos
B_{4} y C_{4}. La Fig. 7 representa gráficamente los niveles en
homogeneizado de pulmón de LTB_{4} (barras sombreadas) y
LTC_{4} (barras lisas) después de la exposición o a K.
pneumoniae o a solución salina (los valores representan la
media \pm ETM; n = 5 animales; *p<0,05 comparado con solución
salina).
Tal como ilustran los resultados de la Fig. 7
tanto los niveles de leucotrieno B_{4} como C_{4} estaban
elevados en los homogeneizados de pulmón de ratones naturales 48
horas después de la exposición a las bacterias comparados con
solución salina. Debido a que LTB_{4} es una quimiotaxina potente
para los neutrófilos en los ratones y el reclutamiento de
neutrófilos se considera un componente esencial de la eliminación de
bacterias, la presencia de niveles altos de LTB_{4} en los
pulmones de animales naturales expuestos a bacterias indica que la
susceptibilidad potenciada a la neumonía en los animales con el gen
inactivado podría reflejar una capacidad reducida de reclutar
neutrófilos al órgano infectado. Para evaluar esa posibilidad, se
realizaron recuentos directos de neutrófilos de lavado
broncoalveolar de citocentrifugados (Fig. 8) y la actividad de MPO
en homogeneizado de pulmón se evaluó espectofotométricamente (no se
muestra) [M. Greenberger y cols., J. Immunol. 155:
722-729 (1995)]. Se inocularon 50 UFC de bacterias o
diluyente salino solo a ratones con el gen inactivado y naturales
por vía intratraqueal. Dos días después se realizó un lavado
pulmonar y se determinó el recuento total de neutrófilos. La Fig. 8
representa gráficamente el efecto de la exposición a K.
pneumoniae sobre la neutrofilia en lavados de ratones con el
gen 5-LO inactivado (barras sombreadas con cruces) y
naturales (barras lisas) (los valores representan la media \pm
ETM; n = 3-12 animales; *p<0,05 comparado con
solución salina: ND: no detectados).
Ambas técnicas indican que se produjo un grado
significativo de influjo de neutrófilos a las 48 horas en los
pulmones naturales expuestos a bacterias comparados con los
expuestos a solución salina. Sorprendentemente, sin embargo, los
ratones con el gen inactivado no mostraban un influjo menor de
neutrófilos tras la exposición a bacterias que los ratones
naturales.
Aunque no es necesario el mecanismo preciso para
practicar la presente invención, se realizaron experimentos para
determinar si la capacidad intacta para el reclutamiento de
neutrófilos en este modelo murino refleja un aumento compensatorio
de los animales con el gen inactivado para generar señales
quimiotácticas tales como quimioquinas. Una evaluación de los
niveles antigénicos de MIP-1\alpha,
MIP-2, y JE (el homólogo murino del péptido
quimiotáctico de monocitos -1) en homogeneizados de pulmones
expuestos a Klebsiella en este momento (es decir, 48 horas
después de la exposición) no mostró diferencias significativas entre
los ratones con el gen inactivado y los naturales (no se muestran
datos). De forma alternativa, aunque no es necesario entender el
mecanismo para practicar la presente invención, es posible que los
animales con el gen inactivado puedan mostrar una generación
aumentada de los componentes del complemento o una capacidad de
respuesta aumentada a las quimioquinas o a las quimiotaxinas
bacterianas.
Aunque no son directamente quimiotácticos, se ha
demostrado que tanto IL-12 como TNF desempeñan
papeles de protección críticos en este modelo de neumonía murina.
Además, la producción de TNF es potenciada por los leucotrienos en
algunos sistemas experimentales. Para examinar la posibilidad de que
la susceptibilidad potenciada de los ratones con el gen inactivado
a la exposición a las bacterias pudiera estar relacionada con una
capacidad deficiente de generar cualquiera de estas citoquinas, se
analizaron homogeneizados de pulmón 48 horas después de la
exposición a las bacterias. De nuevo, no se encontraron diferencias
significativas en los niveles antigénicos de IL-12
ni de TNF entre los ratones con el gen inactivado y los naturales
infectados (no se muestran datos). De este modo, la letalidad
aumentada de la neumonía en los ratones con el gen
5-LO inactivado no refleja una capacidad disminuida
de producir estas citoquinas proinflamatorias.
Tal como se menciona anteriormente, LTB_{4}
exógeno aumentó el índice de fagocitosis de los macrófagos
alveolares con el gen 5-LO inactivado en
aproximadamente el 300%, más de lo que hubiera sido necesario para
lograr únicamente el nivel de control que manifiestan las células
naturales (un aumento de aproximadamente el 50%). Ese resultado
indica que el leucotrieno está mostrando un efecto farmacológico.
Los experimentos de este ejemplo evalúan adicionalmente los efectos
de LTB_{4} exógeno sobre la capacidad fagocítica de los macrófagos
alveolares normales y examinan los efectos de otros productos de
5-LO además de LTB_{4}.
Los macrófagos alveolares de ratas Wistar se
adhirieron y después se incubaron durante 1 hora con K.
pneumoniae solas o en presencia de 1 nM de varios metabolitos de
5-LO (LTB_{4}, LTC_{4}, y
5-HETE). El índice de fagocitosis se determinó
subsiguientemente tal como se describe anteriormente en los
Procedimientos generales.
La Fig. 9 representa de forma gráfica el efecto
de los metabolitos de 5-LO exógenos sobre la
actividad fagocítica de bacterias en macrófagos alveolares de ratas
normales. Cada valor de la Fig. 9 representa la media \pm ETM de 4
cultivos replicados. Tal como indican los datos, LTB_{4} provocó
un aumento de aproximadamente 6 veces el índice de fagocitosis en
macrófagos alveolares de ratas normales. El metabolito
5-HETE presentaba un efecto similar, aunque menos
pronunciado. Es interesante que, LTC_{4} aumentaba la fagocitosis
en un grado similar a LTB_{4}. Aunque se ha observado que los
cisteinil leucotrienos tal como LTC_{4} regulan por aumento la
expresión de FcR en la superficie de macrófagos, la capacidad
fagocítica aumentada no se había observado anteriormente. Estos
resultados indican que los leucotrienos exógenos como grupo parecen
poseer un marcado efecto farmacológico sobre la función de los
macrófagos alveolares normales.
También se realizó un experimento relacionado
para determinar si la capacidad de LTB_{4} exógeno de potenciar la
fagocitosis de bacterias es mediada por su interacción con los
receptores de LTB_{4}. Este experimento se basaba en el hecho de
que el tratamiento previo con LTB_{4} desensibiliza las células en
su subsiguiente capacidad de respuesta a LTB_{4}; aunque no es
necesario entender el mecanismo de este efecto para practicar la
presente invención, se cree que la desensibilización se produce
regulando por disminución la expresión o acoplamiento de los
receptores. Para este experimento, las células se trataron
previamente con LTB_{4} (1 nM) durante 1 hora, se lavaron y se
incubaron con bacterias más LTB_{4}.
Los resultados, que se representan gráficamente
mediante la barra con la leyenda
"LTB_{4}\rightarrowLTB_{4}" en la Fig. 9, indican que el
tratamiento previo con LTB_{4} anuló casi completamente la
capacidad de esta misma dosis de LTB_{4} (1 nM) de aumentar la
fagocitosis de K. pneumoniae cuando se añadía de forma
simultánea a las bacterias. Los hallazgos indican que los receptores
de LTB_{4} están implicados en la potenciación de la fagocitosis
de los macrófagos alveolares inducida por LTB_{4}.
Debido a que se observó que los ratones con el
gen 5-LO inactivado presentaban una eliminación
pulmonar reducida de K. pneumoniae in vivo, y que los
leucotrienos exógenos eran capaces de superar el defecto fagocítico
observado in vitro en los macrófagos alveolares de ratones
con el gen inactivado, se realizó un experimento para evaluar el
efecto de la administración intrapulmonar de leucotrienos sobre la
eliminación de bacterias in vivo.
Se administró LTB_{4} junto con el inóculo
intratraqueal de K. pneumoniae (50 UFC). Se eligió una dosis
de 6 ng de LTB_{4} por vía intratraqueal por animal por dos
razones. Primera, otros investigadores previamente habían encontrado
que esta dosis y esta vía producían un influjo enérgico de
neutrófilos 6 horas después de la administración en ratones. [N.
Ahmed y cols., Am J. Respir. Crit. Care Med. 153:
1141-1147 (1996)]. Segundo, los presentes inventores
previamente encontraron (véase la Fig 5) que podían medirse
aproximadamente 7 ng de LTB_{4} total en el homogeneizado de un
par de pulmones de los ratones naturales expuestos a
Klebsiella. Se expusieron tres grupos de animales por vía
intratraqueal a bacterias (n = 4 animales por grupo): i) ratones
naturales, ii) ratones con el gen 5-LO inactivado, y
iii) ratones con el gen 5-LO inactivado tratados de
forma concomitante con LTB_{4}. Después de 24 horas desde la
inoculación bacteriana, se recolectaron los pulmones y se
determinaron las UFC en el homogeneizado de pulmón.
La Fig. 10 representa de forma gráfica el efecto
de la administración intratraqueal de LTB_{4} sobre la eliminación
defectuosa de bacterias del pulmón en ratones con el gen
5-LO inactivado (cada valor representa la media
\pm ETM). Los datos que se muestran en la Fig. 10 confirman el
hallazgo anterior (Fig. 4) de que los ratones con el gen inactivado
tenían aproximadamente 100 veces más organismos en sus pulmones que
los animales naturales: obsérvese que las UFC totales en este
experimento eran menos porque el análisis se realizaba a las 24
horas de la inoculación en lugar de a las 48 horas. De forma
significativa, la única dosis intratraqueal de LTB_{4}
administrada de forma concomitante al inóculo bacteriano redujo la
UFC pulmonar en aproximadamente 10 veces en los ratones con el gen
inactivado. Los resultados indican que el LTB_{4} exógeno es capaz
de aumentar la eliminación pulmonar de K. pneumoniae en
estos ratones deficientes en leucotrienos. Además, indican que los
leucotrienos deberían ser agentes terapéuticos eficaces en el
entorno de la neumonía por organismos Gram negativos.
Los ejemplos que se describen anteriormente que
emplean la exposición intratraqueal a Klebsiella en ratones
con el gen 5-LO inactivado demuestran que la enzima
desempeña un papel in vivo en la defensa pulmonar
antibacteriana del hospedador. Los experimentos de este ejemplo
están dirigidos a establecer los papeles y mecanismos de acción de
los productos de 5-LO en la respuesta del hospedador
a K. pneumoniae usando ratones con el gen inactivado así como
ratones tratados con agentes farmacológicos que inhiben la síntesis
o las acciones de los leucotrienos. Más específicamente, los
experimentos de este ejemplo están dirigidos a discernir el papel
LTB_{4} comparado con los cisteinil leucotrienos comparando los
efectos de una variedad de agentes farmacológicos, incluidos los
que tienen como diana ambas clases de leucotrienos (inhibidor de
5-LO), los que tienen como diana únicamente
LTB_{4} (antagonista de los receptores de LTB_{4}), y los que
tienen como diana únicamente los cisteinil leucotrienos
(antagonistas de los receptores de cisteinil leucotrienos).
En los experimentos de este ejemplo se usa el
modelo murino que implica la exposición intratraqueal de ratones a
50 UFC de K. pneumoniae. Para interferir farmacológicamente
en la síntesis o en la acción de los leucotrienos, se tratan
ratones naturales con diversos agentes de acción prolongada (que se
describen más adelante) por vía oral (cebado), con administración
diaria que comienza la mañana del día antes de la administración de
las bacterias. En todos los casos, se ha establecido la
especificidad de los agentes a usar, y la selección de las dosis y
las posologías está orientada por experiencias publicadas en los
roedores. Basándose en experimentos preliminares de respuesta en
función de la dosis empleando tres dosis por agente y n = 4 animales
por dosis, se determina una única dosis de eficacia máxima de cada
fármaco a partir de evaluaciones realizadas a las 24 de la
iniciación del tratamiento.
Los agentes específicos y los intervalos de dosis
preliminares que se analizan incluyen los siguientes: i) el
inhibidor de 5-LO A-79175 (Abbott)
en una dosis de 1-3 mg/kg; éste es un inhibidor
enzimático competitivo que es un congénere de Zileuton® más potente
y con acción más prolongada con eficacia demostrada en ratones como
agente oral una vez al día; ii) el antagonista de LTB_{4}
CP-105.696 (Pfizer) en una dosis de
1-10 mg/kg; este compuesto ha inhibido la artritis
inducida por colágeno en ratones cuando se administra en una dosis
oral de una vez al día; y iii) el antagonista de LTD_{4}
MK-571 (Merck) en una dosis de 0,1-1
mg/kg: este compuesto ha inhibido de forma eficaz la
broncoconstricción inducida por antígenos cuando se administra por
vía oral a ratas.
Una vez se ha definido la dosis óptima de cada
agente, se realizan experimentos de supervivencia y eliminación de
bacterias por separado, donde cada uno implica la exposición a K.
pneumoniae de los siguientes cinco grupos de ratones (n = 10
por grupo): i) ratones naturales tratados con vehículo; ii) ratones
naturales tratados con el inhibidor de 5-LO; iii)
ratones naturales tratados con el antagonista de LTB_{4}; iv)
ratones naturales tratados con el antagonista del cisteinil
leucotrieno; y v) ratones con el gen 5-LO inactivado
tratados con vehículo. La eficacia in vivo se evalúa
mediante los siguientes criterios. La inhibición de
5-LO se evalúa cuantificando la producción pulmonar
de LTB_{4} (cuantificada en fluido de lavado pulmonar) tras la
instilación intratraqueal del ionóforo A23187 en animales tratados
con fármacos. [W. Smith y cols., J. Pharmacol. Exp. Ther. 275:
1332-1338 (1995)]. El antagonismo de LTB_{4} se
evalúa cuantificando la regulación por aumento estimulada por
LTB_{4} ex vivo de la expresión de CR3 por neutrófilos en
sangre entera obtenida a partir de animales tratados con fármacos.
El antagonismo de los receptores de cisteinil leucotrienos se
evalúa cuantificando la extravasación de tinte azul de Evans tras la
administración intradérmica de LTD_{4}, [J. Drazen y cols., Proc.
Natl. Acad. Sci USA 77: 4354-4358 (1980)].
La supervivencia de los animales se controla
hasta la muerte o hasta el día 14. Para la eliminación de bacterias,
se determinan las UFC de bacterias en homogeneizados de pulmón
completos y en plasma obtenidos de animales sacrificados tanto 1
día como 3 días después de la exposición a Klebsiella.
Finalmente, el influjo de neutrófilos a los pulmones se evalúa
inicialmente mediante la actividad de MPO en homogeneizados de
pulmón completos de los mismos animales que se usan para las
determinaciones de las UFC anteriormente; si los ensayos de MPO
sugieren que el tratamiento activo con fármacos produce una
reducción del influjo de neutrófilos, se realiza un experimento
adicional (dado que el lavado y la homogenización no pueden
realizarse en el mismo animal) en el que se verifica tal efecto
mediante recuentos de células procedentes de lavado broncoalveolar
y de las diferencias entre los animales tratados con fármaco y los
animales tratados con vehículo.
Obsérvese que la determinación de la contribución
relativa a la defensa del hospedador de LTB_{4} comparado con
LTC_{4} sintetizados endógenamnete permite i) diseñar estudios
terapéuticos empleando la administración de leucotrienos exógenos y
ii) evaluar posibles riesgos de susceptibilidad a la infección, por
ejemplo, de inhibidores de 5-LO (que inhiben la
síntesis de LTB_{4} y cisteinil leucotrienos en paralelo) y de
antagonistas de los receptores de cisteinil leucotrienos (que
inhiben selectivamente las acciones de los cisteinil leucotrienos
sin afectar a las de LTB_{4}).
Si la inhibición directa de 5-LO
perjudica a la supervivencia y la eliminación de bacterias en este
modelo murino de neumonía de forma similar a la deficiencia de
5-LO se evalúan los papeles relativos de LTB_{4}
endógeno comparados con los cisteinil leucotrienos mediante la
aplicación de antagonistas de los receptores que selectivamente
bloquean las acciones de estos dos grupos de mediatores. Aunque
LTB_{4} es el metabolito de 5-LO implicado de
forma más general en las reacciones inflamatorias dependientes de
leucocitos, los datos de fagocitosis generados anteriormente
sugieren que los cisteinil leucotrienos pueden tener efectos de
potenciación comparables. A la inversa, si los agentes
antileucotrienos no reproducen los efectos de la deficiencia del
gen 5-LO, esto sugerirá que 5-LO
potencia la defensa antibacteriana mediante un mecanismo
independiente de su actividad catalítica. Si los
inhibidores/antagonistas farmacológicos sí perjudican la defensa del
hospedador, se realiza una determinación de si el mecanismo
relevante es independiente de la deficiencia de reclutar neutrófilos
al pulmón. Finalmente, se considera la posibilidad de que el
tratamiento antileucotrienos aumente la respuesta del hospedador a
la neumonía por Klebsiella (es decir, los leucotrienos tanto
potencian como perjudican la respuesta del hospedador). De hecho,
los resultados que indiquen que cada una de estos efectos opuestos
predomina en fases diferentes de la respuesta pueden justificar el
uso de agentes farmacológicos empleados en intervalos
específicos.
Los experimentos que se describen en los ejemplos
anteriores (véase, por ejemplo, la Fig. 3) indicaban que tanto
LTB_{4} como LTC_{4} están presentes en niveles elevados en los
homogeneizados de pulmón 48 horas después de la exposición a las
bacterias. Los experimentos de este ejemplo están dirigidos a
determinar qué leucotrienos se producen en el pulmón en momentos
diferentes tras la exposición a K. pneumoniae y qué tipos
celulares son los responsables. El objetivo experimental inicial es
cuantificar los leucotrienos en homogeneizados de pulmón y en
fluido de lavado broncoalveolar de ratones en diversos momentos
después de la exposición a Klebsiella. Basándose en estos
datos, se seleccionan tiempos para los estudios adicionales
diseñados para determinar las fuentes celulares de leucotrienos
mediante i) tinción inmunohistoquímica para identificar las células
que muestran una distribución intracelular de 5-LO
asociada a la activación enzimática, y ii) medición de la producción
constitutiva de leucotrienos mediante células aisladas de pulmones
con neumonía.
Inicialmente, se inocula a ratones naturales
129/SvEv por vía intratraqueal o con solución salina o con 50 UFC de
K. pneumoniae, y se recolectan los pulmones 8 horas y 1, 2,
3, 5, y 7 días después de la inoculación. Para cada uno de estos
tiempos tras la inoculación de solución salina o bacterias, se
preparan homogeneizados de pulmón completo (n = 5 animales por
grupo) y se cuantifican tanto LTB_{4} como LTC_{4} en los
homogeneizados mediante inmunoensayo. En otros animales (n = 3), se
preparan cortes de pulmón para la inmunohistoquímica (véase más
adelante). En paralelo, se realiza un experimento idéntico en el que
se realiza el lavado pulmonar; en cada tiempo (n = 5 animales por
grupo), se preparan citocentrifugados de lavados broncoalveolares y
se determinan los niveles de leucotrienos en el fluido de los
lavados sin células. Se correlacionan los niveles de LTB_{4} y
LTC_{4} en fluido de lavado y en los homogeneizados de pulmón
entre sí y con el grado de influjo de neutrófilos (evaluado a
partir de la actividad de MPO en los homogeneizados y recuentos
celulares y diferencias entre los citocentrifugados de fluidos de
lavados broncoalveolares).
Las fuentes celulares de la producción de
leucotrienos en el pulmón se determinan a las 8 horas, 1 día, y 3
días y otros tiempos identificados mediante los análisis cinéticos
anteriores que indican niveles máximos de los leucotrienos B_{4}
o C_{4}. La tinción inmunohistoquímica para 5-LO
se realiza en cortes de pulmón junto con preparaciones de
citocentrifugados de lavados broncoalveolares de ratones expuestos a
Klebsiella y a solución salina para determinar si son los
macrófagos alveolares, los neutrófilos, o ambos tipos celulares los
que demuestran una distribución intracelular de 5-LO
característica de la activación enzimática (es decir, tinción
concentrada en la membrana nuclear). La determinación de la
activación de 5-LO en el tejido pulmonar in
situ mediante este procedimiento tiene la ventaja de que no es
necesario aislar o cultivar las células, lo que evita
preocupaciones sobre los artefactos potenciales que pueden
introducirse mediante esos procedimientos. Es digno de mención que
esta estrategia ha sido utilizada en la fibrosis pulmonar idiopática
para demostrar que los macrófagos alveolares aislados mediante
lavado broncoalveolar procedente de pacientes con fibrosis pulmonar
idiopática presentan una superproducción constitutiva de
leucotrienos cuando se introducen en cultivo, incluso en ausencia
de un agonista exógeno. [J. Wilborn y cols., J. Clin. Invest. 97:
1827-1836 (1996)].
Tal como se describe anteriormente, existe una
superproducción de leucotrienos en el tejido pulmonar 2 días
después de la exposición a las bacterias. Para determinar si las
células broncoalveolares de los animales inoculados con bacterias
continúan elaborando leucotrienos después de introducirse en cultivo
de una forma que refleja su generación anterior in vivo, se
obtienen células de lavado broncoalveolar no fraccionado (10^{6}
células) en los tiempos que se mencionan anteriormente, se plaquean
en placas de cultivo, y se evalúa la producción acumulativa de
leucotrienos B_{4} y C_{4} mediante inmunoensayo del medio de
cultivo tras el cultivo toda la noche (aproximadamente 16 horas);
se estudian las células de lavado broncoalveolar de animales de
control para comparar (n = 5 animales por tratamiento y por tiempo).
Tras el cultivo toda la noche, se determinan las diferencias entre
las células adherentes mediante tinción de Wright y esterasa.
Obsérvese que el estudio de poblaciones de
células mezcladas no debería crear dificultades a la hora de
atribuir la generación de leucotrienos a un tipo celular particular
a las 8 horas porque existe una populación de macrófagos alveolares
relativamente pura en ese momento. Además, los macrófagos alveolares
y los neutrófilos sintetizan perfiles especiales de productos de
leucotrienos; de ese modo, los macrófagos alveolares producen
primordialmente LTC_{4} (Fig. 2A) aunque los neutrófilos
sintetizan primordialmente LTB_{4}.
Cuando se interpreta de forma conjunta con los
datos inmunohistoquímicos, el perfil de los leucotrienos elaborados
por las células cultivadas de lavado broncoalveolar proporciona
indicios fehacientes de la implicación de cada tipo celular.
Finalmente, el estudio de células mezcladas de lavado permite que se
produzcan las potenciales interacciones entre neutrófilos y
macrófagos alveolares en la síntesis de leucotrienos, tal como
tienen lugar inevitablemente in vivo.
El conocimiento de la cinética de la producción
endógena de LTB_{4} comparada con LTC_{4} es útil en diversos
aspectos importantes. Primero, proporciona directrices en el diseño
de experimentos "terapéuticos" (que se describen más adelante)
que implican la administración pulmonar de leucotrienos exógenos.
Segundo, la determinación de las contribuciones de los macrófagos
alveolares y los neutrófilos como fuentes de producción de estos
mediadores proporciona información básica sobre la biología de la
respuesta del hospedador. Finalmente, el conocimiento de las
fuentes celulares apropiadas de leucotrienos en el entorno de la
neumonía bacteriana tiene potencial utilidad en el diagnóstico
porque la documentación de la producción deficiente de leucotrienos
puede ayudar a identificar a los pacientes que pueden ser
candidatos al suplemento con leucotrienos pulmonares exógenos para
aumentar la inmunidad innata.
Los experimentos de este ejemplo elucidan los
mecanismos moleculares por los que los metabolitos específicos de
5-LO potencian la fagocitosis y destrucción. De
forma más específica, los experimentos de este ejemplo implican
añadir diferentes lípidos a macrófagos alveolares y neutrófilos
provocados obtenidos tanto de ratones con el gen
5-LO inactivado y como de ratones naturales para
comparar la magnitud de los efectos y mecanismos de acción para
diferentes productos de 5-LO en ambos tipos
celulares. Estos experimentos proporcionan un medio para i) evaluar
adicionalmente la utilidad terapéutica de los leucotrienos, y ii)
evaluar la utilidad de marcadores moleculares y/o bioquímicos
particulares como criterios de valoración a examinar en los estudios
de tratamientos con leucotrienos in vivo que se describen
más adelante en el Ejemplo 10.
Tal como se describe en detalle más adelante, los
experimentos iniciales caracterizan los efectos de la incubación
in vitro con productos de 5-LO exógenos sobre
los criterios de valoración brutos de fagocitosis y destrucción de
K. pneumoniae. Aunque no es necesario entender los mecanismos
moleculares para practicar la presente invención, dado que los
mecanismos moleculares que median la fagocitosis y la destrucción de
bacterias son bastante similares en los neutrófilos y los
macrófagos y existen indicios fehacientes que implican papeles de
la ruta de 5-LO en funciones de ambos tipos
celulares, se realizan estudios tanto en los macrófagos alveolares
como en los neutrófilos peritoneales provocados por glucógeno de
ratones (la pureza de ambas poblaciones supera el 90%). Es digno de
mención que se ha demostrado que el reclutamiento de neutrófilos al
peritoneo tras la provocación con glucógeno no es deficiente en
ratones con el gen 5-LO inactivado. [X. Chen y
cols., Nature 372: 179-182 (1994)]. Se estudian los
neutrófilos provocados en lugar de los neutrófilos de sangre
periférica debido a la posibilidad de que el proceso de
reclutamiento y/o la permanencia en un medio inflamatorio en sí
altere el fenotipo celular. Además, se estudian células obtenidas
tanto de ratones naturales como de ratones con el gen
inactivado.
De forma específica, se incuban conjuntamente
10^{5} células durante 1 hora con bacterias y lípidos en presencia
de suero inmunitario al 5% y se evalúa el índice de fagocitosis y
la actividad bactericida tal como se describe anteriormente en
Procedimientos generales. En cada experimento, se incluye un control
con vehículo. Los metabolitos de 5-LO exógenos a
estudiar (todos a 10^{-11}-10^{-7}M) son i)
LTB_{4}, ii) LTC_{4}; y iii) 5-HETE. También se
evalúan combinaciones de estos lípidos.
Para los productos de 5-LO que
tienen efectos de estimulación sobre la fagocitosis o la
destrucción, se analiza también la capacidad de los antagonistas de
receptores específicos (que se describen en el Ejemplo 7) de
invalidar estos efectos. Todos los estudios se realizan tanto con
neutrófilos como con macrófagos alveolares para asegurarse de que
se identifican los casos en los que un compuesto dado ejerce efectos
diferentes sobre la fagocitosis en los dos tipos celulares y ejerce
efectos similares (aunque mediados por mecanismos diferentes) en los
dos tipos celulares. Una vez se ha identificado un mecanismo
molecular para un efecto sobre la fagocitosis (por ejemplo,
mediante LTB_{4}), se examina la capacidad del compuesto opuesto
(es decir, el antagonista de los receptores de LTB_{4}) de
modular el mismo evento molecular de forma contraria.
Los criterios de valoración de los mecanismos
para el estudio son los siguientes: i) expresión en la superficie
de los receptores necesarios para la unión/ingestión de K.
pneumoniae (evaluada mediante citometría de flujo), incluidos
FcRII/FcRlII y CR3; ii) ensamblaje de microfilamenteos de actina
(evaluado mediante tinción inmunofluorescente y citometría de
flujo), necesario para la ingestión de partículas; y iii) fusión de
fagosomas y lisosomas (evaluado mediante tinción con naranja de
acridina), necesaria para poner el microbio en contacto con el
arsenal bactericida. Los Procedimientos generales describen los
procedimientos para cada una de estas evaluaciones.
Los mecanismos bactericidas se examinan de forma
similar a la que se describe para la fagocitosis. De nuevo, aunque
no es necesario entender los mecanismos moleculares para practicar
la presente invención, se realizan los experimentos subsiguientes
para abordar el/los mecanismo(s) molecular(es) que son
responsables de los metabolitos de 5-LO que
aumentan la destrucción de K. pneumoniae. Además, se evaluó
la capacidad de los antagonistas de bloquear los efectos positivos
de los lípidos en estos eventos de los mecanismos, y se estudian
tanto los macrófagos alveolares como los neutrófilos provocados. Se
examinan tres mecanismos bactericidas (tal como se describe en la
sección de Procedimientos generales). Primero, se evalúa la
generación extracelular de O_{2}^{-} mediante la reducción
inhibible mediante superóxido dismutasa de ferricitocromo C [L.
Laichalk y cols., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 658:
1-7 (1996)]. Debido a que las bacterias pueden no
representar un estímulo lo suficientemente fuerte para la
liberación extracelular de metabolitos de oxígeno, también se
evalúan los efectos de los leucotrienos sobre este criterio de
valoración usando miristato acetato de forbol como estímulo para la
producción de O_{2}^{-}. Segundo, se determina la producción de
NO cuantificando nitritos en medio de cultivo usando reactivo de
Griess. Tercero, se determina la liberación de una enzima
lisosómica, \beta-glucuronidasa, por
espectrofotometría [W. Hsueh y cols., Exp. Lung Res. 13:
385-399 (1987)].
Tras la caracterización de los efectos de los
leucotrienos exógenos sobre estos mecanismos moleculares en células
con el gen inactivado y en células naturales, se determina si el
antagonismo específico de estos mismos leucotrienos producidos de
forma endógena tiene los mismos efectos. Como en el Ejemplo 7, se
usan el antagonista de LTB_{4} CP-105.696 y el
antagonista de cisteinil leucotrienos MK-571 (ambos
a 10^{-9}-10^{-6} M). Se añaden a células
naturales antes de la adición de K. pneumoniae y después se
evalúan la fagocitosis, destrucción y los mecanismos moleculares
relevantes tal como se describe anteriormente.
Si se demuestra que LTB_{4} y LTC_{4} ejercen
sus efectos mediante mecanismos diferentes, la combinación de los
dos podría activar funciones antibacterianas de una forma que fuera
aditiva o sinérgica. Tal descubrimiento tiene implicaciones
importantes para el posible uso terapéutico de los leucotrienos en
los estudios in vivo que se describen en el Ejemplo 10.
Los datos obtenidos a partir de los ejemplos
precedentes proporcionan, entre otras cosas, información sobre el
momento de la respuesta del hospedador en el que es más crítica la
presencia de leucotrienos particulares. Los experimentos de este
ejemplo usan esa información para analizar racionalmente la eficacia
in vivo de los leucotrienos exógenos bien de uno en uno o
combinados, administrados por vías diferentes.
Los experimentos iniciales de este ejemplo
implican animales cuya capacidad endógena de generar leucotrienos
es deficiente debido a la alteración del gen 5-LO.
Los subsiguientes experimentos analizan la eficacia de la
administración intrapulmonar de leucotrienos en ratones naturales.
Finalmente, además de los criterios de valoración clínicamente
relevantes de la eliminación de bacterias y la supervivencia, los
experimentos de este ejemplo investigan la utilidad de obtener el
perfil de una consecuencia molecular de la acción de los
leucotrienos (por ejemplo, la expresión de CR3) en células de lavado
como sustituto posible para predecir la eliminación bacteriana y la
supervivencia disminuidas (sin leucotrienos exógenos) o potenciadas
(con leucotrienos exógenos).
Debido a los datos descritos anteriormente (véase
la Fig. 10) y debido a que es de esperar que los animales
deficientes en leucotrienos manifiesten el mayor incremento en la
defensa antimicrobiana por la administración de leucotrienos
exógenos, se usan ratones con el gen 5-LO inactivado
para la primera serie de estudios. Se administran 50 UFC de K.
pneumoniae por vía intratraqueal junto con LTB_{4} en dosis
que varían entre 1 y 20 ng por animal (6 ng era la dosis que se
utilizaba en el experimento que corresponde a la Fig. 10) a ratones
con el gen inactivado; también se analiza un intervalo de dosis
similar de LTC_{4}. Se determinan las UFC bacterianas en pulmón y
en plasma el día 1, y los resultados de estos experimentos se usan
para determinar las dosis óptimas de LTB_{4} y LTC_{4}
administrados de forma concomitante. Después, se evalúan
definitivamente los efectos sobre la eliminación de bacterias in
vivo a partir de las UFC en pulmón y plasma 1 y 3 días después
de la inoculación usando n = 10 animales con el gen inactivado para
cada tiempo de evaluación por grupo de tratamiento, de la forma
siguiente: i) control con vehículo (solo bacterias) se evalúa a 1
día; ii) control con vehículo se evalúa a los 3 días; iii)
LTB_{4} se evalúa a 1 día; iv) LTB_{4} se evalúa a los 3 días;
v) LTC_{4} se evalúa a 1 día; vi) LTC_{4} se evalúa a los 3
días; vii) LTB_{4} + LTC_{4} se evalúan a 1 día; y viii)
LTB_{4} + LTC_{4} se evalúan a los 3 días. Para comparaciones
posteriores, se inoculan animales naturales con bacterias solas en
ambos tiempos (grupos ix) y x)). Debido a que las combinaciones de
dosis óptimas de LTC_{4} y LTB_{4} pueden ser excesivamente
proinflamatorias, para el tratamiento combinado de ese tipo puede
ser necesario reducir proporcionalmente la dosis de cada agente.
El/los régimen/regímenes de tratamiento que
proporcione(n) la mejora mayor en la eliminación de las
bacterias se utiliza(n) después en un experimento de
supervivencia. De nuevo, se inoculan 50 UFC de K. pneumoniae
solas o junto con dosis óptimas de LTB_{4}, LTC_{4}, o ambos
leucotrienos a ratones con el gen 5-LO inactivado
(n = 10 animales por grupo); se controla la supervivencia durante 14
días. Ratones naturales inoculados solo con bacterias sirven como
otro grupo de comparación.
Dado que los experimentos anteriores indican que
los efectos de una dosis intratraqueal de leucotrienos son de
inicio rápido (por ejemplo, en 1 hora) pero de duración
relativamente corta (por ejemplo, menos de 12 horas), entonces la
administración de leucotrieno(s) junto con el inóculo de
bacterias debería aumentar el potencial de eliminación de bacterias
de los macrófagos alveolares. De forma alternativa, la
administración de leucotrieno(s) en un momento posterior se
asocia a otros méritos potenciales. Por ejemplo, podría lograrse la
activación de los neutrófilos reclutados si el compuesto activo se
dispensa aproximadamente a los 1-3 días después de
la inoculación. Además, un régimen eficaz después de la inoculación
es más fácilmente aplicable al tratamiento de neumonía insuperable
por organismos Gram negativos en pacientes.
En vista de lo anterior, se realizan experimentos
para definir los tiempos óptimos (1, 2, y 3 días después de la
exposición a Klebsiella) para la administración "tardía"
de LTB_{4} y LTC_{4}. Estos se llevan a cabo en ratones con el
gen inactivado y la eliminación de bacterias (UFC en pulmón y
plasma) se evalúa el día 4; los animales tratados con leucotrienos
se comparan después con los controles sin leucotrienos (vehículo).
Tras la determinación del mejor tiempo "tardío", se determinan
las UFC en pulmón y plasma 1 día después de en los siguientes
grupos: i) bacterias solas, ii) bacterias + LTB_{4}, iii)
bacterias + LTC_{4}, y iv) bacterias + LTB_{4} + LTC_{4} (n =
10 animales por grupo). Para comparaciones adicionales, se estudian
animales naturales inoculados solo con bacterias. Tal como se
describe para el régimen de tratamiento simultáneo, se estudia el
régimen de tratamiento simultáneo tardío óptimo en ratones con el
gen inactivado en un estudio de supervivencia de 14 días, con
ratones con el gen 5-LO inactivado y ratones
naturales tratados con vehículo que sirven como grupos de
comparación.
La administración repetida o prolongada de
leucotrienos puede aumentar las defensas antibacterianas del
hospedador en un grado mayor que la administración temprana o
tardía sola. Como resultado, se realizan dos regímenes adicionales.
Para estos dos regímenes alternativos, se utilizan ratones con el
gen 5-LO inactivado y se realizan experimentos de
eliminación de bacterias primero y subsiguientemente se analizan
regímenes óptimos en experimentos de supervivencia más largos. El
primer régimen implica la administración temprana (por ejemplo, con
la inoculación) y tardía (por ejemplo, el día 2). El metabolito de
5-LO temprano y tardío pueden elegirse de forma
independiente el uno del otro; en otras palabras, puede utilizarse
LTB_{4} para una dosis y LTC_{4} para la otra dosis. El segundo
régimen implica la administración continua de leucotrieno(s)
mediante aerosol. Para asegurar la administración limitada al
aparato respiratorio y para ser capaz de cuantificar la dosis
administrada de forma precisa, se nebulizan los leucotrienos y se
administran a los ratones mediante una cámara de exposición sólo
para la nariz. La selección del metabolito y el intervalo de
tratamiento (por ejemplo, días 1-3) se basa en los
resultados de los experimentos de administración de una sola
vez.
Los experimentos que se describen anteriormente
relativos a los ratones deficientes en leucotrienos se aplican a
ratones naturales expuestos a K. pneumoniae. Los ratones
naturales 129/SvEv son más susceptibles a la neumonía por
Klebsiella que muchas otras cepas, aunque no tan susceptibles
como los ratones con el gen 5-LO inactivado. Estos
ratones naturales pueden, por lo tanto ser más representativos de
los pacientes susceptibles a la neumonía por agentes Gram negativos
que los animales deficientes en leucotrienos. Por lo tanto, la
estrategia óptima de tratamiento con leucotrienos que se define a
partir de los estudios en ratones con el gen inactivado se usa en
ratones naturales, con criterios de valoración similares de
eliminación bacteriana y de supervivencia.
Los experimentos que se describen en este ejemplo
indican los efectos de la administración en aerosol e intratraqueal
sobre la eliminación de bacterias y la supervivencia después de la
exposición a Klebsiella tanto en ratones naturales como con
el gen 5-LO inactivado. Estos experimentos sirven
para proporcionar información respecto a la administración in
vivo de leucotrienos exógenos. Los estudios descritos implican
el tratamiento con leucotrienos B_{4} y C_{4}; estos se
seleccionaron debido a sus acciones conocidas y su potencia. Sin
embargo, la presente invención contempla el uso de otros productos
de 5-LO, incluidos 5-HETE y
lipoxinas.
Debe entenderse que la invención no se limita a
los detalles exactos de operación o a compuestos, composiciones,
métodos o procedimientos exactos que se muestran y se describen, ya
que para una persona de experiencia en la técnica serán aparentes
modificaciones y equivalentes.
Claims (24)
1. Uso de una cantidad eficaz de una composición
terapéutica que comprende un producto de la ruta de la
5-lipooxigenasa para la fabricación de un
medicamento para la administración pulmonar para el tratamiento de
una infección microbiana en un hospedador que se sospecha que padece
dicha infección microbiana.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que
dicha infección microbiana es neumonía bacteriana.
3. El uso de la reivindicación 1, en el que
dicho producto de la ruta de la 5-lipooxigenasa
comprende un leucotrieno.
4. El uso de la reivindicación 3, en el que
dicho leucotrieno es leucotrieno B_{4}.
5. El uso de la reivindicación 3, en el que
dicho leucotrieno en un cisteinil leucotrieno.
6. El uso de la reivindicación 5, en el que
dicho cisteinil leucotrieno se selecciona del grupo que consiste en
leucotrieno C_{4}, leucotrieno D_{4} y leucotrieno E_{4}.
7. El uso de la reivindicación 1, en el que
dicha administración pulmonar es mediante dispersión en aerosol de
dicha composición terapéutica.
8. El uso de la reivindicación 1, que además
comprende la administración conjunta de un antibiótico a dicho
hospedador.
9. El uso de la reivindicación 1, en el que
dicho hospedador es un animal.
10. El uso de la reivindicación 1, en el que
dicho hospedador es un ser humano.
11. Uso de una cantidad eficaz de una
composición terapéutica que comprende un leucotrieno para la
fabricación de un medicamento para la administración pulmonar para
el tratamiento de una infección bacteriana en un hospedador que se
sospecha que padece dicha infección bacteriana.
12. El uso de la reivindicación 11, en el que
dicha infección bacteriana es neumonía bacteriana.
13. El uso de la reivindicación 11, en el que
dicho leucotrieno es leucotrieno B_{4}.
14. El uso de la reivindicación 11, en el que
dicho leucotrieno es un cisteinil leucotrieno.
15. El uso de la reivindicación 14, en el que
dicho cisteinil leucotrieno se selecciona del grupo que consiste en
leucotrieno C_{4}, leucotrieno D_{4} y leucotrieno E_{4}.
16. El uso de la reivindicación 11, en el que
dicha administración pulmonar es mediante dispersión en aerosol de
dicha composición terapéutica.
17. El uso de la reivindicación 11, que además
comprende la administración conjunta de un antibiótico a dicho
hospedador.
18. El uso de la reivindicación 11, en el que
dicho hospedador es un animal.
19. El uso de la reivindicación 11, en el que
dicho hospedador es un ser humano.
20. El uso de la reivindicación 11, en el que
dicha composición terapéutica comprende una solución que comprende
un vehículo líquido estéril y un leucotrieno disuelto en dicho
vehículo líquido estéril.
21. El uso de la reivindicación 20, en el que
dicho leucotrieno es leucotrieno B_{4}.
22. El uso de la reivindicación 20, en el que
dicho leucotrieno es un cisteinil leucotrieno.
23. El uso de la reivindicación 22, en el que
dicho cisteinil leucotrieno se selecciona del grupo que consiste en
leucotrieno C_{4}, leucotrieno D_{4} y leucotrieno E_{4}.
24. El uso de la reivindicación 20, en el que
dicha solución está en forma de aerosol.
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