CN112546196A - 肌动蛋白聚合诱导剂在制备抵抗或抑制肺炎克雷伯氏菌的药物中的应用 - Google Patents

肌动蛋白聚合诱导剂在制备抵抗或抑制肺炎克雷伯氏菌的药物中的应用 Download PDF

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D·查尔斯
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Abstract

肌动蛋白聚合诱导剂在制备抵抗或抑制肺炎克雷伯氏菌的药物中的应用，属于化学药物制备技术领域。为了针对如何抵抗肺炎克雷伯氏菌感染的问题，本发明提供了一种肌动蛋白聚合诱导剂在制备抗肺炎克雷伯氏菌的药物或试剂盒中的应用，经试验证明肌动蛋白聚合诱导剂Jasplakinolide可有效减少肺炎克雷伯氏菌的血液播散，且可延长肺炎克雷伯氏菌感染小鼠的生存期。本发明可用于对抗肺炎克雷伯氏菌感染新药物的筛选。

Description

肌动蛋白聚合诱导剂在制备抵抗或抑制肺炎克雷伯氏菌的药 物中的应用
技术领域
本发明属于化学药物制备技术领域，具体涉及一种肌动蛋白聚合诱导剂在制备抵抗或抑制肺炎克雷伯氏菌的药物中的应用。
背景技术
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)是一种革兰染色阴性、可发酵乳糖、荚膜多糖包覆的无动力需氧粗短杆菌。1875年Edwin Klebs首次在肺炎病人呼吸道中发现了该菌，直到1882年卡尔·弗里德兰德描述了克雷伯氏杆菌，这就是为什么它多年来被称为弗里德兰德杆菌。肺炎克雷伯氏菌对人致病性较强，是重要的条件致病菌和医源性感染菌之一。肺炎克雷伯氏菌是人鼻腔和胃肠道中的正常菌群，一般不会引起疾病，当机体免疫力下降时，例如免疫功能抑制、需要呼吸机和静脉导管等侵入性操作是，肺炎克雷伯氏菌进入身体其他部位时可导致机会性感染，包括尿路感染、肺炎、血液感染(也称为败血症)、伤口或手术部位感染和脑膜炎等。
随着临床上碳青霉烯类的广泛使用，肺炎克雷伯氏菌对其耐药性不断增强。自20世纪 90年代出现以来，其逐渐在世界范围内流行，其预防和控制难度大，病死率高，已成为院内感染患者死亡的独立危险因素。耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯氏菌(Carbapenem-resistant klebsiella pneumoniae，CRKP)的独特之处在于它对碳青霉烯类抗生素具有强大的抵抗力，而碳青霉烯类抗生素不久前被称为“人类抵抗细菌的最后一道防线”。之前出现对其他所有抗生素都耐药的细菌感染时，人们就会拿出碳青霉烯类这个杀手锏。而现在碳青霉烯类对CRKP 也束手无策了。CRKP可分泌能够水解碳青霉烯类抗生素的酶。最可怕的是，CRKP能够把自己的耐药性传递给其他细菌。CRKP接触其他已经多重耐药的细菌后，含耐药基因的DNA 片段就会从CRKP转移到这些细菌的菌体。另一方面，全球对引起的肝脓肿、菌血症、脑膜炎、眼内炎和坏死性筋膜炎等综合征的高毒力肺炎克雷伯氏菌报道越来越多，该综合征已成为一种全球性疾病，该菌致病性强，可感染人体全身尤其是呼吸和泌尿系统，引发肺炎、脑膜炎、肝脓肿和败血症等疾病。近年来，高毒力型CRKP的报道也逐渐增多，这些CRKP菌株同时兼具高毒力，由于这些菌株同时具有高抗药性、高毒力和高传染性的特征，因而被研究人员视为一种新型的、真正超级细菌，甚至可能导致免疫力正常且相对健康的个体出现不可治愈和致命的感染。此外，肺炎克雷伯氏菌可通过内吞作用进入细胞内，抗菌素可直接作用并杀死细胞外的肺炎克雷伯氏菌，而细胞内的细菌可躲避抗菌素的直接作用，增加了抗肺炎克雷伯氏菌感染的难度，因此，需要寻找和筛选新的药物对抗肺炎克雷伯氏菌感染。
发明内容
针对如何抵抗肺炎克雷伯氏菌感染的问题，本发明提供了一种肌动蛋白聚合诱导剂在制备抵抗或抑制肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的药物中的应用。
进一步地限定，所述肌动蛋白聚合诱导剂为Jasplakinolide。
进一步地限定，所述肺炎克雷伯氏菌为肺炎克雷伯氏菌ATCC43816。
有益效果
肌动蛋白聚合诱导剂Jasplakinolide可有效减少肺炎克雷伯氏菌的血液播散，且可延长肺炎克雷伯氏菌感染小鼠的生存期。本发明可用于对抗肺炎克雷伯氏菌感染新药物的筛选。
附图说明
图1肺上皮细胞单层模型的完整性评估，横坐标为取样时间，纵坐标为酚红穿透率；
图2体外肺炎克雷伯氏菌穿透肺上皮细胞单层模型的检测，横坐标为取样时间，纵坐标为每毫升中的含菌数；
图3细胞松弛素D和秋水碱素对肺上皮细胞对肺炎克雷伯氏菌的内吞的抑制，横坐标为不同处理组，纵坐标为内吞细胞数；
图4细胞松弛素D和秋水碱素对肺炎克雷伯氏菌穿过肺上皮细胞层的影响，横坐标为不同取样时间，纵坐标为每毫升细胞液的含菌数；
图5不同处理对肺炎克雷伯氏菌的血液播散的影响，横坐标为不同组织，纵坐标为每毫升细胞液的含菌数；
图6小鼠生存曲线，横坐标为小鼠死亡时间，纵坐标为小鼠生存率。
具体实施方式
本发明所用的细胞、试验动物、菌株均为本领域已知常见的试验材料，所用的试剂也可通过购买获得，其中Jasplakinolide购自Tocris公司，Cat：2792，细胞松弛素D(Cytochalasin D)购买自Sigma公司，Cat：C8273、Latrunculin A购买自Tocris公司，Cat：3973。其余如无特殊说明均可通过商业化途径购买获得。
实施例1.Jasplakinolide对肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的抑制作用。
(一)肺上皮细胞单层模型的建立和评估：培养肺上皮细胞A549至对数生长期，计数细胞，接种106细胞至孔直径为3μm的Transwell 12孔板小室(Corning Costar)，下层加不含酚红指示剂的DMEM培养基，设立两组，一组不接种细胞(Blank)，一组接种细胞(Control)，每组设立3个复孔，第二天用PBS清清洗涤细胞三次，将小室转移至一新的小孔内，下层加1ml不含酚红指示剂的DMEM培养基，上层加1ml含酚红的DMEM培养基，分别于不同时间点(0、15min、30min、1h、2h及4h)取上层和下层培养基各100ml，分别转移至96孔板，在560nm波长的酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，下层吸光值/(下层吸光值+上层吸光值)为纵坐标绘制曲线，观察两组之间酚红穿过小室的差异，从图1可看出，空白组(无上皮细胞覆盖)穿过小室的酚红随着时间而增加，而建立的模型 (上皮细胞覆盖)穿过小室的酚红随着时间无变化，从而评估肺上皮细胞单层模型的完整性(见图1)。
体外肺炎克雷伯氏菌穿透肺上皮细胞单层模型的检测：接种106肺上皮细胞A549至 Transwell 12孔板小室，建立肺上皮细胞单层模型，方法同前。第二天利用PBS轻轻洗涤细胞两次，放入新的孔内，下层加入1ml DMEM培养基(Themofisher公司)，上层加入1ml无抗生素的培养基(含107cfu肺炎克雷伯氏菌ATCC43816)，按照15min、30min、1h、2h及4h的时间点取下层培养基，经过适当的稀释后，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个细菌生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，统计菌落数量，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出每毫升中的含菌数(见图2)。
(二)肺上皮细胞对肺炎克雷伯氏菌的内吞作用：接种5×105肺上皮细胞A549至24孔板内，第二天加入不同终浓度的Cytochalasin D(细胞松弛素D)(100μM、10μM和1μM) 和Colchicine(秋水碱素)(100μM、10μM和1μM)处理细胞半小时后，用PBS轻轻洗涤细胞两次，按照MOI＝10加入5×106cfu肺炎克雷伯氏菌ATCC43816感染2小后，弃去培养基并用PBS轻轻洗涤细胞两次，加入100μg/ml的庆大霉素孵育1小时，杀灭细胞外肺炎克雷伯氏菌后，弃去培养基并用PBS轻轻洗涤细胞三次，加入200μl裂解液(0.25％TritonX100)裂解15分钟后，经过适当的稀释后，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个细菌生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，统计菌落数量，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出每毫升中的含菌数，可见细胞松弛素D和秋水碱素均能抑制肺上皮细胞对肺炎克雷伯氏菌的内吞作用(见图3)。
(三)抑制肌动蛋白聚合可促进肺炎克雷伯氏菌穿过肺上皮细胞层：接种106肺上皮细胞A549至Transwell 12孔板小室，建立肺上皮细胞单层模型，方法同前。第二天分别加入终浓度1μM的细胞松弛素D和秋水碱素处理细胞半小时后，用PBS轻轻洗涤细胞两次，按照MOI＝10在上层加入培养基(含107cfu肺炎克雷伯氏菌ATCC43816)，按照30min、2h及4h 的时间点取下层培养基，经过适当的稀释后，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个细菌生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，统计菌落数量，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出每毫升中的含菌数，可见秋水碱素对肺炎克雷伯氏菌穿过肺上皮细胞层无效，细胞松弛素D可促进肺炎克雷伯氏菌穿过肺上皮细胞层，细胞松弛素D是肌动蛋白聚合的抑制剂(见图4，图中***p<0.001、**P<0.01、*P<0.05、ns表示没有统计学意义)。
(四)肌动蛋白聚合在肺炎克雷伯氏菌血行播散中的作用：利用肺炎克雷伯氏菌ATCC43816，通过手术方法感染6-8周龄雄性C57/BL6小鼠，方法同前，实验分组为对照组(含DMSO的PBS)、肌动蛋白聚合诱导剂组(Jasplakinolide)、肌动蛋白聚合抑制剂组(细胞松弛素D Cytochalasin D组、Latrunculin A)，按照Jasplakinolide(0.1mg/kg)、Cytochalasin D(2mg/kg)、Latrunculin A(0.05mg/kg)的剂量每天腹腔注射一次，2天后处死小鼠，分别取血液、肺泡灌洗液、肺脏、肝脏和脾脏等标本，加入1ml PBS后用研磨器研磨，按不同比例稀释后，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，统计菌落数量，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出每毫升中的含菌数，可见肌动蛋白聚合抑制剂组可增加肺炎克雷伯氏菌的血液播散，而肌动蛋白聚合诱导剂组可减少肺炎克雷伯氏菌的血液播散，见图5。
(五)动物体内实验证实促进肌动蛋白聚合可延长肺炎克雷伯氏菌感染小鼠的生存期：将24只6-8周龄雄性C57/BL6小鼠分为两组，麻醉小鼠，通过手术方法向支气管内注入5000 cfu肺炎克雷伯氏菌(100ul PBS中)，待小鼠苏醒后通过腹腔注射肌动蛋白聚合诱导Jasplakinolide，剂量为0.1mg/kg，频次为每天给药1次，对照组每天腹腔注射相同体积PBS(含DMSO)，每天测量小鼠体重并记录小鼠死亡时间，绘制生存曲线，具体见图6。

Claims (3)

1.肌动蛋白聚合诱导剂在制备抵抗或抑制肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肌动蛋白聚合诱导剂为Jasplakinolide。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肺炎克雷伯氏菌为肺炎克雷伯氏菌ATCC43816。
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US5909734A (en) * 1996-12-03 1999-06-08 Regents Of The University Of Michigan Administration of products of the 5-lipoxygenase metabolic pathway to enhance antimicrobial defense
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