CN115443126A - 用于预防或治疗SARS-CoV-2感染的相容性溶质 - Google Patents

Abstract

本发明涉及有机和高水溶性的相容性溶质或溶质混合物优选以可吸入、可口咽给药、可经鼻给药和可静脉给药的组合物形式在由冠状病毒科的ss(+)RNA病毒引起的疾病，优选由SARS‑CoV‑1、SARS‑CoV‑2、MERS‑CoV、HCoV‑HKU1、HCoV‑OC43、HCoV‑NL63和/或HCoV‑229E引起的那些疾病的预防或治疗中的用途。在本发明的意义中特别合适的溶质是四氢嘧啶及其衍生物、Glycoin、甘露糖基甘油酸酯（Firoin）和甘露糖基甘油酰胺（Firoin‑A），它们由于其强大的水结合力，减少病毒结合到移行上皮，例如眼睛，内部上皮，例如肺，和内皮中的宿主细胞的受体上并因此减少或防止病毒的繁殖。根据本发明，通过减少传染性痰液和呼气实现预防，并通过根据本发明的相容性溶质的膜保护性质实现受累组织的治疗和复原。

Description

用于预防或治疗SARS-CoV-2感染的相容性溶质

本发明涉及有机和高水溶性的相容性溶质或溶质混合物优选以可吸入、可口咽给药、可经鼻给药和可静脉给药的组合物形式在由冠状病毒科的ss(+)RNA病毒引起的疾病，优选由SARSCoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-HKLH、HCoV-OC43、HCoV-NL63和/或HCoV-229E.1引起的那些疾病的预防或治疗中的用途。在本发明的意义中特别合适的溶质是四氢嘧啶（Ectoin）及其衍生物、Glycoin、甘露糖基甘油酸酯（Firoin）和甘露糖基甘油酰胺（Mannosylglyceramid）（Firoin-A），它们由于其强大的水结合力，减少病毒结合到移行上皮，例如眼睛，内部上皮，例如肺，和内皮中的宿主细胞的受体上并因此减少或防止病毒的繁殖。根据本发明，通过减少传染性痰液和呼气实现预防，并通过根据本发明的相容性溶质的膜保护性质实现受累组织的治疗和复原。

新型SARS冠状病毒2（SARS-CoV-2）已迅速成为全球挑战。在很短的时间内，传播被宣布为大流行。尽管病程在许多至大多数情况下是轻微的并且仅具有轻微的症状，如不适、发热和可能的咳嗽，该疾病可进展为急性呼吸窘迫综合征（急性呼吸窘迫综合征，ARDS）和严重急性呼吸系统综合征（严重急性呼吸系统综合征，SARS）。死亡率随疾病的严重程度而增加，并在危重症患者中可高达49%。目前，对Sars-CoV-2病毒引起的Covid-19疾病（与“2019冠状病毒病”同义）没有针对性治疗。目前，只能采取支持性措施，因为目前没有针对Covid-19疾病的有效治疗剂，也没有针对SARS-CoV-2病毒的疫苗接种。

在此背景下，本发明的目的是提供用于预防和/或治疗由冠状病毒科的ss(+)RNA病毒引起的疾病，特别是由病毒SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-NL63和/或HCoV-229E引起的病毒感染和/或炎症的化合物、试剂、医疗产品和/或药物。目的是防止或减少上述病毒，特别是SARS-CoV-1、SARS-CoV-2和/或MERS-CoV穿入宿主细胞，其中所述宿主细胞是人类和动物的真核细胞。因此应当提供用于预防和治疗人类和动物的上述疾病的化合物、试剂、医疗产品和/或药物。为了识别这样的化合物，本发明的进一步目的是提供恰好识别适用于治疗和预防上述疾病的化合物的方法。本发明的进一步目的是提供适合日常用于个体预防的医疗产品以及用于治疗受损上皮组织和内皮的独立疗法和补充疗法。因此，进一步的目的是提供合适的制剂和剂型。

令人惊讶地，现在已经发现，如所附实施例和图3-5中所示，相容性溶质，如四氢嘧啶及其衍生物、Glycoin、甘露糖基甘油酸酯（Firoin）或甘露糖基甘油酰胺（Firoin-A）可实现上述目的。

因此，本发明的一个主题是用于预防或治疗由冠状病毒科的ss(+)RNA病毒引起的疾病的相容性溶质或溶质混合物，其中所述至少一种相容性溶质选自有机和高水溶性的，优选生物基的，化合物，优选选自羟基四氢嘧啶（Hydroxyectoin）和四氢嘧啶和衍生物。如果在本文中提到“四氢嘧啶和/或衍生物”或“四氢嘧啶和/或其衍生物”，则包括式I和II的所有化合物。

病毒的一般分类是本领域技术人员已知的。为了对本发明考虑的冠状病毒科的病毒进行分类，将其与小核糖核酸病毒科（Picornavirales目）、腺病毒科（亚目未知）和丝状病毒科（单股反链病毒目）的病毒相区分。小核糖核酸病毒科的病毒包括具有正极性单链RNA基因组的鼻病毒。腺病毒科的病毒包括基于ds-DNA的腺病毒，且丝状病毒科的病毒（其包括埃博拉病毒）也是单链RNA基因组但具有负极性。病毒在本发明的意义内属于冠状病毒科，其分为两个亚科，即正冠状病毒亚科（Coronavirinae）和环曲病毒亚科（Torovirinae）。正冠状病毒亚科分为仅感染哺乳动物的α、β冠状病毒属，感染哺乳动物和鸟类的γ和δ冠状病毒属。

E229和NL63是人类致病性α冠状病毒，而OC43和HKU1以及包含SARS-CoV2的所有新型CoV病毒属于β冠状病毒属。因此，本发明的另一主题是至少一种相容性溶质或溶质混合物，优选四氢嘧啶及其衍生物的用途，其中疾病由β冠状病毒和/或α冠状病毒属的ss(+)RNA病毒引起，并优选由选自SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-NL63和/或HCoV-229E的病毒引起。

四种病毒HCoV-HKlM、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-229E引起鼻炎、结膜炎、咽炎、偶发性喉炎和/或中耳炎，因此主要是上呼吸道疾病。相反，其它病毒可引起更严重的下呼吸道疾病，伴或不伴全身感染和/或炎症。因此在本发明的意义内，特别优选的病毒是ARS-CoV(-1)、SARS-CoV-2和/或MERS-CoV。

上述病毒各自包含结合在病毒包膜中的表面蛋白，其与宿主细胞的特异性表面蛋白相互作用，与它们结合，以最终诱发宿主细胞的感染（Tay等人）。因此，在本发明的一个特定实施方案中，使用至少一种相容性溶质或溶质混合物，优选四氢嘧啶，其中ss(+)RNA病毒与人类细胞（宿主细胞）上的至少一种膜结合蛋白或其组分相互作用并利用这种蛋白或其组分作为受体以结合到该细胞上。在本发明的意义中，所述至少一种溶质作用于作为受体被病毒病原体通过致病性表面蛋白结合的人类细胞的所有表面蛋白。在一个特定实施方案中，ss(+)RNA病毒与选自血管紧张素转化酶2（ACE2）、氨基肽酶N（APN）和/或二肽基肽酶4（DPP4）的受体相互作用。如Fang Li 2020的图1中所示，这些病毒受体与本发明的意义中的病毒的各种蛋白质相互作用。特别地，本发明也涵盖羧肽酶以及除已提到的那些外的其它氨基肽酶和二肽基肽酶。“病毒受体”在本发明的意义内是在它们的宿主细胞上，优选人类细胞上，特别优选移行上皮组织、内部上皮组织和/或内皮的细胞上被本文提到的ss(+)RNA病毒识别为受体的所有膜结合蛋白。

因此，在用于识别本发明的意义内的潜在相容性溶质的下述根据本发明的方法的一个特定实施方案中，根据Fang Li 2016测试相应的组合，以由此识别对各自的病毒分别最合适的相容性溶质，其选自有机和高水溶性的，优选生物基的，化合物，优选羟基四氢嘧啶和四氢嘧啶和衍生物。这些溶质特别优选具有大于或等于7 mol/mol H₂O/溶质的水结合力。

也就是说，本发明的进一步目的是识别用于预防或治疗由冠状病毒科的ss(+)RNA病毒引起的疾病的根据本发明的相容性溶质的方法，其中所述至少一种相容性溶质选自有机和高水溶性的，优选生物基的，化合物。该方法（同义词：生物检定法）包括以下步骤：

- 提供具有作为潜在病毒受体的膜结合表面蛋白的细胞系，优选来自表5的细胞系，

- 使所述细胞与可能是本发明意义内的相容性溶质的化合物，优选四氢嘧啶和/或另一种式I和/或II的化合物、甘油基葡糖苷（Glycoin）、甘露糖基甘油酸酯（Firoin）、甘露糖基甘油酰胺（Firoin-A）接触，

- 优选用于不含这些潜在溶质之一的对照的实验混合物，

- 添加包含可测量信号的病毒受体结合域，优选血管紧张素转化酶2（ACE2）、氨基肽酶N（APN）和/或二肽基肽酶4（DPP4）的结合域，优选S1蛋白或根据Fang Li 2016的另一种，

- 培养所述混合物，优选培养足以相互作用和与结合配对物结合的时间，

- 记录在细胞上可测得的信号，优选荧光信号，和

- 测定病毒受体结合域与人膜结合表面蛋白之间的结合减少。

如果与一同进行的对照相比在上述方法中测得来自病毒蛋白的信号减少，则这表明病毒的结合减少。实施例1演示该检定法的功能。在根据本发明的方法中，细胞优选用碘化丙啶培养，以从测量信号中减去膜损伤的细胞，优选死细胞。所述潜在化合物选自有机和高水溶性的，优选生物基的，化合物，其优选具有大于或等于7 mol/mol H₂O/溶质的水结合力。

在本发明意义内的相容性溶质优选使用上述方法筛选。根据本发明的方法可以两种不同的实施方案配置。在第一替代实施方案中，在上游方法中选择具有大于或等于7mol/mol H₂O/溶质的水结合力的相容性溶质，特别通过根据Rouychoudhury等人2011的原子力光谱学测量，然后供入上述生物检定法。在根据本发明的方法的第二替代实施方案中，首先在上述生物检定法中识别潜在溶质，然后根据Rouychoudhury等人2011测定水结合力。在该方法的进一步实施方案和替代方案中，四氢嘧啶作为内标携带，以识别按四氢嘧啶测量的根据本发明的相容性溶质。

根据本发明，优选根据式I和/或II的相容性溶质可具有生物（生物基）来源或也可合成生产。生物基相容性溶质，优选式I和/或II的化合物可使用天然菌株（也参见Costa等人），尤其例如高嗜盐菌（Halomonas elongata）等（表1）或使用转基因微生物，例如谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）以生物技术方式生产。转基因微生物的使用能够生产更大量的根据本发明的相容性溶质。同样地，根据本发明的相容性溶质的合成生产在量和成本方面是有利的。

但是，无论生产途径如何，在本发明的意义中各个相容性溶质的水结合力和对ss(+)RNA病毒与宿主细胞之间的结合，优选是对病毒膜粒或刺突蛋白（优选受体结合域（RBD））与宿主细胞上的病毒受体（优选ACE2、APN和/或DPP4（见上文））之间的结合的减少/干扰效应至关重要。根据本发明的相容性溶质具有大于或等于7 mol/mol H₂O/溶质的水结合力，优选根据Rouychoudhury等人2011测定。

合成生产的相容性溶质，如四氢嘧啶，和通过生物合成制成的四氢嘧啶在最终产品的多个特征上不同。所述特征包括与用于合成生产的化学品的残留物相关的最终产品的纯度、与对映体纯度相关的纯度、气味、颜色（哈森数）和加工成根据本发明的组合物。商业合成生产的四氢嘧啶和生物基四氢嘧啶的对比例显示以下差异：

四氢嘧啶属于式I和II并可作为光学异构体、非对映体、外消旋物、两性离子、阳离子或作为至少两种上述形式的混合物存在。异构体包括式I和式II的化合物的(R,R)-、(R,S)-、(S,S)-和(S,R)-构型，其中S-对映体根据费歇尔投影式对应于L-对映体，且R-对映体对应于D-对映体，例如L-四氢嘧啶等于S-四氢嘧啶，D-四氢嘧啶等于R-四氢嘧啶。

在根据本发明的溶质或溶质混合物的一个优选实施方案中，所述至少一种相容性溶质以纯度大于或等于90%，优选大于或等于95%、大于或等于97%、大于或等于99%，特别优选等于100%的对映体纯形式存在。基于溶质混合物，这意味着两种化合物的混合物具有对映体纯形式的各自化合物并且所选化合物优选没有被异构体污染。

根据本发明的溶质或溶质混合物的对映体纯形式特别优选具有S和/或(S,S)异构体。在一种优选的对映体纯的溶质混合物中，S-四氢嘧啶和(S,S)-羟基四氢嘧啶各自以大于或等于90%、大于或等于95%，优选大于或等于97%、大于或等于99%，特别优选等于100%的纯度存在。这种溶质混合物因此优选各自具有小于或等于10%，小于或等于5%，优选小于或等于3%、小于或等于1%，特别优选等于0%的R-四氢嘧啶或(R,S)-/(S,R)-或(R,R)-羟基四氢嘧啶。

在本发明的一个特定实施方案中，以下外消旋物是优选的：

- S-四氢嘧啶和R-四氢嘧啶，

- (S,S)-羟基四氢嘧啶、(S,R)-羟基四氢嘧啶、(R,S)-羟基四氢嘧啶和(R,R)-羟基四氢嘧啶，或

- S-Homoectoine和R-Homoectoine。

除异构体外，非对映体、外消旋物、两性离子、阳离子和上述化合物的混合物也是本发明的主题。可用羟基衍生物、磺酸衍生物、羧酸衍生物，如酰胺、酯等、羰基、醚、烷氧基和羟基（Dydroxyl）进行衍生化。

在根据本发明的用途的一个特定实施方案中，至少一种相容性溶质选自甘油基葡糖苷（Glycoin）、甘氨酸甜菜碱、甘露糖基甘油酸酯（Firoin）、甘露糖基甘油酰胺（Firoin-A）、式I和/或II的四氢嘧啶及其衍生物和上述化合物的生理相容盐、酰胺和酯，其中

在式I和式II中

R1 = H或烷基，

R2 = H、COOH、COO-烷基或CO-NH-R5，

R3和R4各自彼此独立地为H或OH，

R5 = H、烷基、氨基酸残基、二肽残基或三肽残基

n = 1、2或3，

烷基 = 具有C₁-C₄个碳原子的烷基残基。

根据本发明的同样优选的相容性溶质是选自四氢嘧啶及其衍生物、Glycoin（甘油基葡糖苷）、L-脯氨酸、甘露糖基甘油酸酯、N-乙酰二氨基丁酸（NADA）、三甲胺N-氧化物（TMAO）和/或甘氨酸甜菜碱的化合物。四氢嘧啶的优选衍生物包括S/R-四氢嘧啶、(S,S)/(R,R)-羟基四氢嘧啶、(S,S)/(R,R)-羟基四氢嘧啶和S-Homoectoine和上述化合物的生理相容盐、酰胺和酯。

根据本发明，也使用至少两种上述化合物的溶质混合物，优选包含至少两种式I和/或式II的化合物的溶质混合物。各个式I或II的相容性溶质优选为纯度大于或等于90%的对映体纯形式。在本发明的意义内，式I或式II的化合物的特别优选的溶质混合物含有大于或等于85重量%的S-四氢嘧啶和小于或等于15重量%的(S,S)-羟基四氢嘧啶，基于总含量为100重量%的所有化合物的总和计。

在一个特定实施方案中，根据本发明的相容性溶质是生物基的，其中生物基意味着该化合物具有生物来源。根据本发明的溶质的生物来源包括例如来自藻类、真菌、光养细菌、产甲烷菌、Actinopolyspora halophila、γ变形菌、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsissp.）、Brevibacteria、革兰氏阳性球菌、许多杆菌、藻类、一些杆菌和相关物种（柠檬色动性球菌（Planococcus citreus））、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、盐水球菌属（Salinicoccus sp.）、菌株M96/12b、Sporosarcina halophila、产甲烷菌（ß-谷氨酰胺、Nε-乙酰基-ß-赖氨酸）、Ectothiorhodospira marismortui（CGA）、其它厌氧光养细菌、巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）、苜蓿根瘤菌（Rhizobium meliloti）和许多其它。一些实例概括在下表1中。

本发明意义内的相容性溶质的进一步概要包含在Costa等人1998中。在其中的第122页至第141页中列举的化合物经此作为本发明的一部分并入。其中提到的溶质适用于根据本发明的用途，优选是具有大于或等于7 mol/mol H₂O/溶质的水结合力的那些，优选根据Rouychoudhury等人2011测定。

表1: 相容性溶质的实例

因此，相容性溶质在本发明的意义内是选自糖类、氨基酸类和多元醇类的化合物，它们的特征在于与水具有高反应性的OH基团和/或氨基和/或酰胺基团。也包括甜菜碱、式I/II的化合物、脯氨酸、羧酰胺、NAc-O、NAc-L和甘露糖基甘油酸酯。

因此，根据本发明的相容性溶质（同义词：溶质）是在一个特定实施方案中具有大于或等于7 mol/mol H₂O/溶质的水结合力的有机和高水溶性的，优选生物基的，化合物。水结合力优选大于或等于7.2、大于或等于7.5、大于或等于7.7、大于或等于8.0、大于或等于8.2、大于或等于8.5、大于或等于8.7、大于或等于9，分别为[mol/mol H₂O/溶质]。对本发明而言，优选溶质是水结合力大于或等于9.0 mol/mol H₂O/溶质的四氢嘧啶。

各个优选的溶质或溶质混合物在本发明的意义内可独自或与其它生理溶液，例如临床使用的各种输液用溶液、NaCl溶液结合使用。

本发明的溶质、优选的四氢嘧啶和/或其衍生物或含有所述至少一种优选溶质的组合物用于预防或治疗包含移行上皮组织和/或内部上皮组织的感染和/或炎症的病毒性疾病。在根据本发明的用途的一个特定实施方案中，病毒性疾病包含内皮的感染和/或炎症。

病毒性疾病在本发明的意义内包括内皮的感染和/或炎症，特别是眼睛、上呼吸道和/或下呼吸道、气管、肺、支气管、支气管树、心脏、心脏内皮、血液淋巴管、脑血管、肾血管、食道、胃粘膜和/或小肠/肠粘膜的内皮的感染和/或炎症。

因此，在本发明的意义内，包括各自由SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-NL63和/或HCoV-229E引起的此类病毒性疾病，其表现出上气道和/或下气道、气管、肺、支气管和/或支气管树的感染和/或炎症。这些疾病的特征和可检测之处在于，上述器官中受累的组织已被病毒感染，因此在这些组织中可以检测到病毒的至少一种组分（病毒RNA）。受累组织在本发明的意义内包括

- 移行上皮组织，包括上气道、口腔、口腔粘膜、牙龈、舌、舌粘膜、鼻腔、鼻旁窦、鼻粘膜、眼、声襞、咽和生殖器和/或

- 内部上皮组织，包括下气道、气管、支气管、支气管树、肺、内部内皮组织、连续内皮，特别是肺和心脏的连续内皮、心脏、血管、淋巴管、食管、胃粘膜和/或小肠/肠粘膜的内皮。

表2: 本发明意义内的上皮组织

上皮组织	外观
		单层鳞状上皮	浆膜，包含胸膜、肺胸膜、心包、睾丸的鞘膜；肺泡上皮、内皮、肺（内皮）、心脏、血管和淋巴管的内皮；舌粘膜（舌下侧）
单层柱状上皮	胃、小肠和大肠的上皮；胃粘膜、肠粘膜
		双层上皮	唾液腺、口腔、泪管
多层柱状上皮	鼻腔、咽（喉）、喉头、气道、支气管树、咽鼓管、尿道
		多层非角化上皮	前角膜上皮（眼）、声襞、口腔、牙龈（牙颈周围的内缘上皮）、咽、食管、肛门、阴道、舌粘膜（舌下侧）；眼结膜（结膜）、角膜
多层角化上皮	表皮（基底层、棘层、颗粒层）、鼻前庭、外耳道、牙龈（口腔的外缘上皮）

治疗和预防在本发明的意义内应该广义地解释并且也包括对被病毒损伤的组织的复原的支持。当疫苗免疫是优先进行的并且要通过根据本发明的组合此外通过使用根据本发明的溶质修复被病毒损伤的组织或预防性地保护组织时，这特别重要。

在根据本发明的用途的一个特定实施方案中，所述至少一种溶质或溶质混合物，优选以根据本发明的组合物形式，用于预防或治疗由上述病毒，优选由SARS-Cov-2引起的呼吸系统疾病。根据本发明的组合物含有至少一种相容性溶质，其选自有机和高水溶性的，优选生物基的，化合物，优选羟基四氢嘧啶和四氢嘧啶和衍生物，并优选具有大于或等于7mol/mol H₂O/溶质的水结合力。

气道的病毒性疾病在本发明的意义内不仅包括内皮感染和/或炎症，也包括肺泡上皮细胞的感染和/或炎症。由ss(+) RNA病毒，优选由SARS-Cov-2引起的病毒性疾病在本发明的意义内包括肺炎、SARS（严重急性呼吸系统综合征）和对上述组织的全器官损伤（organweite）。SARS-Cov-2或COVID-19患者表现出典型症状，如发烧、不适、疲倦和咳嗽。大多数感染SARS-CoV-2的成人或儿童都有轻微的流感样症状。对于一些患者，特别是高危人群的患者而言，这些可迅速进展为急性呼吸窘迫综合征（SARS）、呼吸衰竭、多器官衰竭和甚至死亡。

其它症状包括咳嗽、咳痰、呼吸急促、咽喉痛和头痛。一些患者表现为胃肠道症状，包括腹泻和呕吐。发热和咳嗽是主要症状，而上呼吸道和胃肠道症状少见。

根据本发明的产品特别适用于预防或治疗具有上述上呼吸道和/或下呼吸道症状的患者。特别优选的是可吸入组合物和产品（图6）。同样对于具有咳嗽、咳痰和/或咽痛的患者而言，根据本发明的产品（图6）是优选的，其含有至少一种相容性溶质，其选自有机和高水溶性的，优选生物基的，化合物，优选羟基四氢嘧啶、四氢嘧啶和/或衍生物。这些相容性溶质特别优选具有大于或等于7 mol/mol H₂O/溶质的水结合力。这些产品在此满足两个功能。一方面，它们支持受侵袭组织的复原（见表2）并以这种方式治疗本发明意义内的病毒性疾病。另一方面，由于实现更少传染性痰液和呼气而由此保护环境。

根据本发明的用途的一个特定实施方案是所述至少一种相容性溶质，优选四氢嘧啶和/或其衍生物在如由SARS-Cov-2引起的系统性内皮炎的治疗或预防中的用途。所谓的Covid-19内皮炎的特征在于多器官损伤，特别是心脏、肝和肾的弥漫性内皮炎症。也描述了心血管问题。在这些患者中，发现SARS-CoV-2直接引发血管炎症。其它器官可能表现出感染和/或炎症。

在优选包含在根据本发明的组合物中的所述至少一种相容性溶质或溶质混合物的根据本发明的用途的一个特定实施方案中，所述至少一种相容性溶质，优选四氢嘧啶减少或防止ss(+)RNA病毒的适合结合到人类受体上的病毒蛋白的去折叠和/或开放。根据本发明的ss(+)RNA病毒的病毒蛋白（也称为膜粒）包括根据本发明的病毒的所谓S1刺突蛋白，特别是各自的结合域，其包含HCoV-OC43 S的结构域A、与ACE2受体相互作用的SARS-CoV S的结构域B、HCoV-NL63 S、MERS-CoV S和HCoV-229E S（Tortoricia 2019）。本发明的溶质对膜粒与病毒受体之间的相互作用和结合的干扰效应显示在图3和4中。

病毒在病毒包膜上具有膜粒（刺突蛋白），其中所述膜粒包含形成膜锚定三聚体的糖基化S-蛋白（刺突蛋白，180-220 kDa）。这些部分既携带（S1）受体结合域（RBD）（病毒可通过其对接到细胞）又携带（S2）作为融合蛋白（FP）造成病毒包膜和细胞膜融合的亚基。受体结合域（RBD）包括N端结构域（NTD）和C端结构域（CTD），这两者都可充当受体结合域并结合不同的蛋白质和糖。

SARS-CoV-2刺突蛋白（S蛋白质）在病毒感染和发病机理中起到核心作用。S1识别并结合到宿主受体，S2中的后续构象变化促进病毒包膜与宿主细胞膜之间的融合。感染机制包括步骤：病毒受体结合域与宿主细胞受体结合，然后膜融合，病毒RNA进入宿主细胞，利用宿主细胞的细胞机器使病毒RNA繁殖以及病毒离开宿主细胞。

在根据本发明的用途的一个优选实施方案中，优选包含在根据本发明的组合物中的所述至少一种相容性溶质或溶质混合物，优选四氢嘧啶和/或其衍生物减少或防止病毒膜与受攻击的细胞，特别是上皮细胞和/或内皮细胞的膜的融合。在根据本发明的用途的一个特定实施方案中，通过优选包含在根据本发明的组合物中的优选生物基的所述至少一种相容性溶质，优选四氢嘧啶和/或其衍生物减少或防止ss(+)RNA病毒的繁殖，特别是在宿主细胞中的繁殖。

根据本发明的相容性溶质的惊人效果尤其显示在实施例3和图4和5中。可以显著表明，用四氢嘧啶预培养的A549细胞在细胞表面上表现出较少或没有结合的病毒Cov2 S1蛋白。四氢嘧啶的这种清晰而强烈的效果令人惊讶并且可再现。还表明，该效果取决于四氢嘧啶的浓度。因此令人惊讶地表明，取决于它们的浓度，相容性溶质对ss(+) RNA病毒的宿主细胞具有显著保护作用。根据本发明的溶质的这种效果使得本发明意义内的预防和治疗成为可能。

观察到的四氢嘧啶的效果目前基于归因于四氢嘧啶已知的蛋白质和膜稳定作用的理论。据推测，根据本发明的相容性溶质积聚在各自的结合配对物周围，并用水合物层将它们屏蔽。不限于这一理论，但推测，可能积聚在病毒膜粒（刺突蛋白）周围的溶质的水合物层稳定折叠或“闭合”蛋白质的构象，并以这种方式减少或防止刺突蛋白的去折叠或“开放”，并由此减少或防止受体结合域的可达性。因此，Cov2 S1蛋白的受体结合域与宿主细胞的“病毒受体”没有足够接近，以使得不发生结合。

也可在对宿主细胞有效的一面推测类似的效果。在此，根据本发明的溶质，优选四氢嘧啶和/或其衍生物看起来积聚在病毒受体周围。这实现病毒上的受体结合域和宿主细胞上的病毒受体的双重屏蔽，这导致减少这些结合配对物之间的结合。不能排除这同样适用于细胞丝氨酸蛋白酶TMPRS2，其是加工SARS-CoV-2刺突蛋白以引发融合所必需的（Hoffmann等人2020）。

因此，在优选包含在根据本发明的组合物中的至少一种相容性溶质或溶质混合物，优选四氢嘧啶和/或其衍生物的根据本发明的用途的一个特定实施方案中，屏蔽移行上皮、内部上皮组织和/或内皮的膜。

优选地屏蔽根据本发明作为结合结构域的ss(+)-RNA病毒所需的人细胞上的表面结构（病毒受体）。更优选地通过所述至少一种相容性溶质或溶质混合物，优选四氢嘧啶和/或其衍生物屏蔽病毒受体（包含血管紧张素转化酶2（ACE2）、氨基肽酶N（APN）和/或二肽基肽酶4（DPP4））的结合结构域。血管紧张素转化酶2（ACE2）受体在许多器官，包括肺、心脏、肝、肠、眼睛和肾中表达，并在此作为受体被本发明中提到的病毒利用以结合到相应的细胞。

不受制于此，但关于作用机制的一个主题在于，通过屏蔽宿主细胞上的膜结合表面蛋白（病毒利用其作为受体以实现与人细胞的结合）（“病毒受体”），减少或防止病毒的结合和因此细胞的病毒感染。特别地，屏蔽病毒结合所需的“病毒受体”的糖残基。关于作用机制的一个主题在于，通过在宿主细胞上的病毒受体的OH基团与根据本发明的溶质，优选四氢嘧啶之间形成氢桥而实现屏蔽。四氢嘧啶的强水结合力是已知的，因此似乎合理的是，该溶质积聚并因此招募水分子以形成至少一个或多个水合物层。这会导致，由于缺乏结合配对物之间的相互作用，不发生结合，因此最终没有膜融合。基于这一理论，阻止上述步骤将根据本发明导致防止或减少病毒在宿主细胞中的繁殖。由此，将阻止和/或减轻本发明意义内的病毒性疾病的病程，包括移行上皮、内部上皮和内皮的感染和/或炎症。由此治疗SARS-CoV-2感染或防止典型症状爆发。以这种方式，优选治疗或预防Covid-19内皮炎。

因此，在根据本发明的相容性溶质或溶质混合物的用途的一个特定实施方案中，用相容性溶质屏蔽移行上皮、内部上皮组织和/或内皮的膜。

在所述至少一种相容性溶质或溶质混合物，优选四氢嘧啶和/或其衍生物的根据本发明的用途的进一步实施方案中，所述至少一种溶质或溶质混合物与抗病毒化合物、抗炎化合物、白介素阻滞剂、抗炎抗细胞因子、病毒受体抑制剂和/或疫苗联合给药。

上述抗病毒化合物类别包括选自Casirivimab、Imdevimab、Bamlanivimab、Etesevimab、VIR-7831、VIR-7832、托珠单抗、Sarilumab、阿达木单抗、司妥昔单抗（Siltuximab）、BTN162b2（BioNtech/Pfizer）、融合到免疫球蛋白的ACE2-Fc和CR3022的抗体和中和抗体。考虑用于治疗或预防由ss(+)RNA病毒引起的疾病的其它抗细胞因子疗法包括依那西普、英夫利昔单抗、戈利木单抗和培塞利珠单抗。

抗病毒化合物（抗病毒剂）类别包括也用于对抗冠状病毒科的其它病原体（包括SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-NL63和/或HCoV-229E病毒）的抗病毒剂。可与四氢嘧啶和/或衍生物之一联合的已知抗病毒剂选自法匹拉韦、洛匹那韦、利托那韦、阿昔洛韦、更昔洛韦、利巴韦林、Foscavir（膦甲酸）、喷昔洛韦、Alisporivir、瑞德西韦、Molnupiravir（4482/El DD-2801）、伊维菌素、盐酸阿比朵尔（Umifenovir）、奥司他韦、ASC09F和Galidesivir。抗病毒剂优选选自阿昔洛韦、更昔洛韦、利巴韦林、Foscavir（膦甲酸）、瑞德西韦、Molnupiravir（4482/El DD-2801）和伊维菌素。

抗炎化合物类别包括对乙酰氨基酚、布洛芬、免疫球蛋白、IL-1阻滞剂、IL-6抑制剂、肿瘤坏死因子（例如阿达木单抗）。

抑制剂类别包括解旋酶抑制剂、互补抑制剂（类风湿药物）、蛋白酶抑制剂、茚地那韦（Crixivan）、奈非那韦（Viracept）、沙奎那韦（Fortovase）、肾素-血管紧张素系统（RAS）抑制剂、神经氨酸酶抑制剂（SARS病毒）、奥司他韦（Tamiflu）、扎那米韦（Relenza）、逆转录酶抑制剂（SARS病毒）、拉米夫定（Epivir）和齐多夫定（Retrovir）。优选地，四氢嘧啶和/或本文所述的衍生物之一与神经氨酸酶抑制剂或逆转录酶抑制剂、奥司他韦、扎那米韦、拉米夫定和齐多夫定联合。特别优选地，四氢嘧啶和/或本文所述的衍生物之一与神经氨酸酶抑制剂或逆转录酶抑制剂联合。

另一类别包括Janus激酶抑制剂（JKI），其包含巴瑞替尼（Baricitinib）+瑞德西韦、鲁索替尼（Ruxolitinib）、托法替尼和菲达替尼（Fedratinib）。其它JKI是批准制剂奥拉替尼、Peficitinib、乌帕替尼（Upadacitinib）和非戈替尼（Filgotinib）以及尚未批准的制剂Cerdulatinib、来他替尼、Gandotinib、Momelotinib、Pacritinib、阿布昔替尼（Abrocitinib）和Deucravacitinib。另一类别包括Bruton's酪氨酸激酶抑制剂，其包含阿卡替尼（Acalabrutinib）、依鲁替尼和泽布替尼（Zanubrutinib），以及仍在开发的药物Spebrutinib、Fenebrutinib、HM71224、ABBV-105和ONO-4059。

干扰素类别包括干扰素α-2a（Roferon）、干扰素α-2b（Intron A）、干扰素α-nl（Wellferon）、干扰素α-n3（Alferon）、干扰素ß-1a（Rebif）和干扰素ß-1b（Betaferon）。白介素阻滞剂类别（免疫抑制剂/免疫抑制剂）包括地塞米松、氢化可的松、秋水仙素、氟伏沙明、阿那白滞素（白介素(IL)-1抑制剂）和干扰素β。

根据本发明的组合能够进行联合治疗，例如急性治疗以保护仍然完好的组织、支持已被攻击的组织的复原、减少传染性呼气/痰液，各自与使用疫苗的免疫疗法相结合。

四氢嘧啶和本文所述的抗病毒化合物、抗炎化合物、白介素阻滞剂、抗炎抗细胞因子、病毒受体抑制剂和/或疫苗之一的组合可同时、相继或在不同时间进行。因此，联合疗法包含不同化合物或活性成分中的两种，而不限于同时给药。在一个实施方案中，制剂中的各个组合作为本文所述的化合物和四氢嘧啶和/或本文所述的衍生物之一的混合物，或作为单独制剂的组合存在。单独制剂包括所选组合的任何空间分离，以在储存过程中防止四氢嘧啶和所选化合物的混合。

一个实施方案是双室系统的形式的制剂，其中四氢嘧啶和/或本文所述的衍生物之一存在于一个室中，本文所述的化合物之一存在于第二个室中。该双室系统优选在每种情况下都包含可吸入制剂。可吸入制剂因此被理解为适合使用合适的辅助工具以将所述一种/多种活性成分吸收到肺中。这一实施方案特别优选适用于治疗或预防由冠状病毒科的ss(+)RNA病毒，优选SARS-Cov-2引起的疾病的联合疗法，其中该组合作为吸入剂给药于患者（参见例如图5）。该制剂可借助吸入器（PMDI或DPI）或雾化器（机械或电动或气动）经肺部给药。

在联合疗法的范围中，用于吸入的替代实施方案包括根据说明交替施用和吸入的单独室或药筒。适合根据本发明联合治疗的其它给药途径和制剂显示在图5中。因此，联合疗法的其它实施方案包括含有四氢嘧啶和/或本文所述的衍生物之一的吸入剂和本文所述的抗病毒化合物、抗炎化合物、白介素阻滞剂、抗炎抗细胞因子、病毒受体抑制剂和/或疫苗之一的另一制剂。

例如，四氢嘧啶和/或本文所述的衍生物之一可与干扰素β一起作为吸入剂提供。吸入剂可以是所提到的制剂的混合物，或这些分开存在于双室系统或分开的药筒中。在第一种情况下，通过吸入并行或交替地从双室系统中吸入这两种制剂。如果药筒分开，可能必须将药筒交替与合适的辅助工具组合并相应地使用它们。

联合疗法还包括鼻、口腔和/或咽喉喷雾形式的四氢嘧啶和/或本文所述的衍生物之一，和本文所述的化合物之一。

组合的另一实施方案是至少一种根据本发明的溶质或溶质混合物，优选四氢嘧啶与类皮质激素制剂一起使用。这种组合优选用于治疗下气道，尤其是肺的根据本发明的病毒性疾病，特别优选以根据本发明的吸入剂的形式。

在根据本发明的相容性溶质或溶质混合物的用途的另一个实施方案中，优选包含在根据本发明的组合物中的所述至少一种溶质或溶质混合物，优选四氢嘧啶和/或其衍生物用于来自细粉尘污染严重的地区、属于存在严重细粉尘污染的职业群体、有既往血管疾病和/或慢性呼吸道疾病的患者。

特殊患者群体或风险患者（Wang等人2020）是内皮功能减弱的患者，例如糖尿病、心力衰竭、高血压、冠状动脉疾病、心血管损伤、外周血管疾病、脑血管疾病、脑血管功能不全、免疫缺陷和/或慢性阻塞性肺病（COPD）的患者。

考虑到呼吸道的既往疾病，吸烟者和特别暴露于细粉尘污染的人、哮喘患者等也属于风险群体（Zhao等人2020）。特别已经表明，与暴露较低的人相比，病毒在暴露于细粉尘污染的人群中更经常造成严重的感染过程（Xiao Wu等人2020）。

另一主题是用于预防或治疗由冠状病毒科的ss(+)RNA病毒引起的疾病的组合物，其中包括至少一种本发明意义内的相容性溶质或溶质混合物。该组合物优选含有选自甘油基葡糖苷（Glycoin）、甘露糖基甘油酸酯（Firoin）、甘露糖基甘油酰胺（Firoin-A）、四氢嘧啶和式I和/或II的化合物的溶质。四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶和Glycoin特别优选。

在含有至少一种溶质或溶质混合物的根据本发明的组合物的另一个实施方案中，所述至少一种相容性溶质或溶质混合物以基于组合物的总含量计大于或等于0.0001重量%至小于或等于70重量%的比例存在于该组合物中。根据本发明的组合物的另一个实施方案含有大于或等于0.001重量%、大于或等于0.01重量%、大于或等于0.1重量%、大于或等于1.0重量%、大于或等于1.5重量%、大于或等于2.0重量%、大于或等于2.5重量%、大于或等于3.0重量%，在每种情况下小于或等于65重量%、小于或等于60重量%、小于或等于55重量%、小于或等于50重量%、小于或等于45重量%、小于或等于40重量%、小于或等于35重量%、小于或等于30重量%、小于或等于25重量%、小于或等于20重量%。

根据本发明的溶质在该组合物中的优选比例取决于各自的制剂。根据本发明的组合物优选含有基于组合物的总含量计大于或等于0.5重量%至小于或等于15重量%，优选大于或等于0.5重量%至小于或等于10重量%、大于或等于0.5重量%至小于或等于5.0重量%，特别优选大于或等于0.5重量%至小于或等于4.0重量%的比例的至少一种相容性溶质或溶质混合物，优选四氢嘧啶和/或其衍生物。上述范围优选适用于本发明意义内的输液用溶液。

根据本发明的吸入剂溶液的一个实施方案含有大于或等于2重量%至小于或等于25重量%、大于或等于5重量%至小于或等于25重量%，优选大于或等于8重量%至小于或等于22重量%、大于或等于10重量%至小于或等于20重量%，优选大于或等于10重量%至小于或等于18重量%的比例。

在根据本发明的吸入剂溶液的另一实施方案中，使用更低浓度的所述至少一种根据本发明的溶质或溶质混合物，优选四氢嘧啶和/或其衍生物。在这一实施方案中，优选多次施加该内容物，以在较低的浓度下实现与单次施加相当的高剂量。吸入剂应具有的浓度取决于患者的状况、所需的治疗、肺的任选已有损伤和/或可影响吸入过程本身的其它标准，例如患者的年龄和一般体质。

具有较低比例的所述至少一种根据本发明的溶质的吸入剂的使用特别是在与健康的肺相比具有较低吸收能力的已受损肺部的情况下有意义。

根据本发明的吸入剂溶液的另一实施方案因此具有大于或等于0.5重量%至小于或等于20重量%，优选大于或等于1.3重量%至小于或等于18重量%，优选大于或等于2重量%至小于或等于15重量%，特别优选大于或等于3重量%至小于或等于10重量%的比例。

在本发明的用途的一个特定实施方案中，该组合物为

i) 固体形式，包括粉末、颗粒、胶囊、含片和泡腾片，

ii) 液体形式，包括溶液剂、注射液、输液剂和混悬剂，和/或

iii) 作为混合物，包括喷雾剂、气溶胶和吸入剂。

本发明的组合物可以局部（例如向眼睛）、口服、鼻腔、静脉内、吸入、气管内和/或颊内（例如含片）给药。根据本发明的组合物优选口服、气管内或吸入给药。其可以是干吸入剂或气溶胶。溶液剂优选以滴剂或喷雾剂的形式用于口、鼻、咽喉和眼睛。根据所需疗法，组合是非常可能的。

在本发明的组合物用途的一个特定实施方案中，其是作为输液用溶液的液体形式或适合与雾化器和/或呼吸器一起使用的液体形式。

对于最大饱和度的溶质溶液，刚好低于各自溶质的溶解度极限的浓度是优选的。这种高浓度的溶质溶液可用作各自现场制备所需溶液的起始溶液。以这种方式，各个溶液可根据所需给药、患者的状况（既疾病史、年龄等）和/或所需的治疗进行稀释。当不能储存不同浓度的溶液时，这尤其有利。测定四氢嘧啶的最大溶解度为在40℃下大约620 g/L和在25℃下大约550 g/L。

输液用溶液优选在大约体温下施用。平均输液袋的体积为500毫升。基于输液袋的全体积的单次给药，输液用溶液具有4%的最大浓度（等渗），以使身体不会经历渗透压休克。可进行重复给药，但取决于医生的决定。

根据本发明的组合物优选用于预防或治疗由冠状病毒科的ss(+)RNA病毒引起的疾病，其中输液剂与吸入剂联合施用。

特别地，有时可自行给药的医疗产品（例如图6）是本发明的主题。众所周知，医护人员特别有风险。这包括医院的医生和护士以及其它设施，如养老院、消防队、幼儿园和学校的工作人员。通过使用根据本发明的鼻喷雾剂、滴眼剂、含片、漱口水和/或口腔喷雾剂，可降低风险。这显著降低飞沫传染的风险并保护护理和治疗他人的人。

如图6中所示，可能的产品，特别是医疗产品，可根据以下应用细分：肺、鼻、嘴/咽喉和眼睛。图6中所示的各应用可与所述至少一种根据本发明的溶质或溶质混合物结合。图6并不代表详尽名单，而只是最常用的产品。根据本发明，这些都适用于预防和治疗由ss(+)RNA病毒引起的疾病。

本发明的另一目的是药盒，其包含

- 至少一种用于吸入的根据本发明的即用型组合物，优选在安瓿或一次性药筒中，和

- 优选用于该组合物的即时和受控给药的装置，特别是通过吸入。

本发明的另一个主题是根据本发明的组合物在用于受控递送组合物的装置中的用途，其中

- 所述装置适用于由所述组合物生成气溶胶，

- 能够经由口腔和/或鼻子吸入所述组合物，

- 确保计量递送液体或干燥组合物的特定喷发（Sprühstoß），

- 确保将液体组合物计量递送到眼睛中，和/或

- 能够将所述组合物在口腔、咽喉和/或鼻腔中进行喷雾。

通过该装置（优选电子控制）优选实现在大于或等于3 μm至小于或等于7 μm的范围内的气溶胶粒度VMD（体积中值直径），因此实现改进的吸入。特别优选的是在大于或等于3.0 μm至小于或等于6.5 µm、大于或等于3.0 µm至小于或等于6.0 µm、大于或等于3.0 µm至小于或等于5.5 µm、大于或等于3.0 µm至小于或等于5.0 µm、大于或等于3.0 µm至小于或等于4.5 µm、大于或等于3.5 µm至小于或等于5.0 µm、大于或等于4.0 µm至小于或等于5.0 µm的范围内的粒度，各自具有+/- 0.005-0.1 µm的标准偏差。

在上述装置的一个实施方案中，递送0.5 mL四氢嘧啶/min的连续速率。这导致由1.3%四氢嘧啶吸入剂溶液递送20 mg/min的四氢嘧啶。

附图描述

图1 从分析中排除死细胞的设门策略。A) FL1显示由细胞结合的SARS-Cov-2 S1的检测产生的绿色荧光。死细胞用碘化丙啶复染。死细胞染色通过FL2轴的位移可见。因此，门R2中的细胞是活细胞。B) 将门R2中的细胞绘制为直方图，并测定这些细胞的平均荧光强度。

图2 使用流式细胞术验证Cov2 S1蛋白与A549细胞的结合。显示活细胞的平均荧光强度。

图3A 与NADA相比较，四氢嘧啶对Cov2 S1蛋白与A549细胞的结合的效果的验证。使用免疫荧光法和随后的流式细胞术测量Cov2 S1蛋白与A549细胞的结合。显示活细胞的平均荧光强度。测量系列，对于1.25%和2.5%，n=2，对于5%，n=1；显示来自这两个测量的平均值。

图3B 描绘四氢嘧啶对Cov2 S1蛋白与A549细胞的结合的影响（如图3A中），其中将浓度范围扩展到0.25%至7.5%四氢嘧啶。显示来自这两个测量的平均值。

图4A 描绘作为相对荧光增加的结果。通过将蛋白质刺激细胞的平均荧光强度除以非蛋白质刺激细胞的强度，计算由Cov2 S1蛋白与细胞表面的结合引起的A549细胞的荧光增加。

图4B将所有实验的数据合并，消除背景荧光并对照Cov2 S1蛋白的浓度绘图。即使将标准偏差计入考虑，四氢嘧啶的抑制作用也是显著的。相比之下，用NADA预培养的细胞与未处理的细胞相当。

图5 该图概括根据本发明的溶质或含有至少一种溶质或溶质混合物，优选四氢嘧啶和/或其衍生物的组合物的所有可能的制剂和应用。仅输液剂未显示在该图中。

参考文献

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以下实施例显示所选相容性溶质的有效性以证实本发明的可行性，但本发明不限于此。

实施例

实施例1: 通过相容性溶质抑制SARS-CoV-2刺突S1蛋白与A549细胞的结合

材料

四氢嘧啶: (4S)-2-甲基-1,4,5,6-四氢嘧啶-4-碳酸，CAS号96702-03-3

NADA: Nγ-乙酰基-L-2,4-二氨基丁酸，产品说明书，CAS号1190-46-1

羟基四氢嘧啶: CAS号165542-15-4

Glycoin: CAS号22160-26-5

甘露糖基甘油酸酯: CAS号164324-35-0

甘氨酸-甜菜碱: CAS号07-43-7

L-脯氨酸: CAS号147-85-3

SARS-CoV-2刺突S1蛋白: trenzyme life science services，Cat. No. P2020-001，Lot No.: 1IPO

方法

使用来自American Type Culture Collection (ATCC)的表达血管紧张素转化酶2（ACE2）的A549细胞（Uhal等人2013）。贴壁细胞在T-75烧瓶中在CO₂培养箱（5%CO₂，37℃）中在含有青霉素和链霉素作为抗生素的含10%FCS的DMEM中常规培养。当烧瓶底部的2/3被细胞覆盖时，它们用细胞消化液（Accutase）分离。

为了进行该检定法，将A549细胞在含10%FCS的DMEM中培养至细胞覆盖，并且在细胞覆盖状态下培养另外4天，在此期间更换细胞培养基。

对于抑制实验，用细胞消化液分离细胞。将各105个细胞转移到样品管中并用不同浓度的相容性溶质预处理（表2）以得到100 µl的最终体积。

在培养30分钟后，将HIS标记的SARS-Cov2-S1蛋白添加每个管中并在翻滚振荡器（Tumble-Shaker）上在450转/分钟和室温下培养另外60分钟。

表3: 相容性溶质+CoV2 S1

通过使用流式细胞术的免疫荧光法进行评估。通过使用CyFlow SL（Sysmex GmbH）流式细胞仪的间接免疫荧光法分析SARS-CoV-2刺突S1蛋白的结合。首先将细胞以300 x g离心5分钟，然后再悬浮在含1.5%胎牛血清和10 mM叠氮化钠的100 µl PBS中。然后将细胞用5 µg/ml指向HIS标签的小鼠抗体（Biolegend）培养30分钟。在洗涤（含1.5%胎牛血清和10mM叠氮化钠的PBS）后，细胞用二抗（20 µg/ml，兔抗小鼠IgG (H+L)，Alexafluor 488标记，Invitrogen）培养20分钟。然后将细胞洗涤一次，并再悬浮在不含叠氮化物/FCS的1 ml PBS中。在测量前不久，加入10 μl 0.5mg/ml碘化丙啶溶液。此后，细胞立即经由50 µm细胞过滤器过滤，然后立即测量。所有步骤在暗处在4℃下进行。

然后通过流式细胞术分析A549细胞的荧光。为此，在活细胞上设置一个区域（可从分析中排除死细胞，因为它们吸收红色碘化丙啶染料），并如图1中所示测定这一区域中的细胞的几何平均相对荧光（MFI）。

实施例2: SARS-Cov2-S1蛋白的结合vs在A549细胞中的浓度的验证

A549细胞在含10%FCS的DMEM中培养至细胞覆盖。此后，每天向细胞供应新鲜细胞培养基。随后，如实施例1中所述用不含极端微生物剂（Extremolyt）的不同浓度的SARS-Cov2-S1蛋白刺激细胞。通过细胞计量术进行分析。

表4: 图2的MFI值. 也给出细胞的荧光强度的以%计的相应变异系数（CV%）。

在未染色（“未染色的A549”）和染色A549对照细胞（“A549对照染色”）的比较中，测量轻微的背景染色。染色的A549对照细胞是未用Cov2 S1蛋白刺激但用Fitc标记抗体处理以便染色的细胞。考虑到这些对照，在用1 µg Cov2 S1刺激细胞后已经可检测到结合的刺突蛋白的信号。通过使用更大量的蛋白质，可检测到增多的蛋白质结合到A549细胞上。

因此，借助这种检定法，可检测结合结构域（如Cov2 S1）与表达ACE的细胞（如A549）的浓度依赖性结合，并可检查物质抑制Cov2 S1与A549细胞的结合的效果。

该检定法可以修改形式通过使用下面提到的细胞系来进行。表达血管紧张素转化酶2（ACE2）、氨基肽酶N（APN）和/或二肽基肽酶4（DPP4）的每个细胞系都是适用于根据本发明的检定法的细胞系。下列细胞系的详细性质尤其可在蛋白质图谱（Proteinatlas）：https://www.proteinatlas.org/ENSG0000013Q234-ACE2/cell中查阅并且是本领域技术人员已知的。

表5: 表达ACE受体的细胞系

在该检定法中优选包括检测细胞表面上的受体表达的合适抗体。在含至少10%FCS的DMEM中培养对ACE具有低mRNA表达的细胞系。Hep 2G细胞具有ACE的RNA高表达。HUVEC细胞表达ACE2并使用内皮细胞生长试剂盒（Endothelial Cell Growth Kit）（ATCC）在血管细胞基础培养基（Vascular Cell Basal Medium）中培养。作为对照，包括没有表达ACE受体的MRC5细胞。此外，Hoffmann等人2020证明这些细胞没有被SARS CoV2感染。因此，MRC5细胞代表对所用结合检定法的特异性的优异对照。MRC5细胞在含10% FCS的DMEM中培养。

已用于ACE抑制试验的HUVEC细胞系（Don等人）特别适用于提供目前讨论的潜在Covid-19内皮炎的证据和根据本发明的相容性溶质，如四氢嘧啶的积极效果。

在结合实验中，上述细胞系用表6中所示的CoV2 S1浓度培养。

实施例3: 四氢嘧啶对SARS-Cov2-S1蛋白与A549细胞的结合的影响

表6: 相容性溶质+CoV2 S1

为了研究四氢嘧啶对Cov2 S1蛋白与A549细胞的结合是否具有影响，用不同浓度的根据本发明的溶质，如四氢嘧啶检查分离的细胞。为此，细胞用各自的溶质预培养，然后用不同浓度的Cov2 S1蛋白处理（见实施例1和2）。

在n = 1的这一“概念验证”实验中，在2.5%四氢嘧啶存在下已经可以测量到与A549细胞结合的Cov2 S1蛋白的较低荧光（数据未显示）。这表明在四氢嘧啶存在下Cov2 S1蛋白与A549细胞的结合减少。与四氢嘧啶相比，对于NADA没有发现对Cov2 S1和A549细胞之间的结合的影响。实验混合物[1.25/2.5% NADA + 5 µg Cov2 S1 + A549]和[5 µg Cov2S1 + A549]都表现出相同的平均荧光（参见图2和3）。因此，NADA似乎不影响病毒与宿主细胞的结合。

为了验证该实验，重复1.25%和2.5%的浓度，也检查5%的各自溶质。结果显示在表7中。

表7: 图4的MFI值. 也给出细胞的荧光强度的以%计的相应变异系数（CV%）。

在5%四氢嘧啶的情况下，可表现出对Cov2 S1蛋白与A549细胞的结合的完全抑制。相比之下，用NADA无法实现抑制。在此，在1.25%、2.5%或5% NADA存在下的平均荧光如同不含相容性溶质的实验混合物的平均荧光那样增加（参见图2）。用表3中所列的浓度重复使用NADA和四氢嘧啶的实验。证实了NADA对Cov2 S1蛋白与A549细胞的结合没有影响（数据未显示），而四氢嘧啶反复具有显著效果（图3b）。总结了进行的所有实验，以测定该效果的显著性。减去A549细胞的背景荧光，并对照Cov2 S1蛋白结合浓度绘制特异性值（图4b）。可以证实，四氢嘧啶对A549细胞具有显著效果并抑制Cov2 S1蛋白的结合。显著性计算：

Mann Whitney检验
		P值	0,0286
精确或近似P值	精确
		P值概要	*
显著不同(P < 0.05)	是
		单尾或双尾P值	双尾
四氢嘧啶%、NADA 5%列中的秩和	10、26
		Mann-Whitney U	0
中位数之间的差异
		四氢嘧啶5%列的中位数	0.3050、n=4
NADA 5%列的中位数	1.820、n=4
		差异: 实际	1.515
差异: Hodges-Lehmann	1.505

实施例4: Glycoin和四氢嘧啶对SARS-Cov2-S1-蛋白的结合的影响

用细胞系HUVEC、HEK293、RPMI-8226和Hep G2（表5）进行类似于实施例3的实验。作为相容性溶质，测试不同浓度的四氢嘧啶和Glycoin（表3）。

实施例5: Glycoin、甘露糖基甘油酸酯、羟基四氢嘧啶和四氢嘧啶对SARS-Cov2-S1蛋白的结合的影响

用细胞系HUVEC、HEK293、RPMI-8226和Hep G2（表5）进行类似于实施例3的实验，其中细胞没有用四氢嘧啶预培养，但四氢嘧啶或Glycoin和Cov2 S1蛋白同时施用。作为溶质，测试不同浓度的四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶、甘露糖基甘油酸酯和Glycoin（表3）。

作为进一步混合物，Cov2 S1蛋白用四氢嘧啶或Glyocin预培养，然后用根据表3的不同浓度下的预培养混合物[Cov2 S1蛋白 + 四氢嘧啶]培养细胞。预培养[Cov2 S1蛋白 +四氢嘧啶]各自在室温下进行5分钟、10分钟和30分钟。然后类似于实施例3进行分析。用细胞系HUVEC、HEK293、RPMI-8226和Hep G2（表5）进行实验。

实施例6: 相对荧光增加的计算

为了使这些实验可比较，通过将细胞的平均荧光强度除以背景染色的平均荧光强度，计算由Cov2 S1蛋白与细胞表面的结合引起的A549细胞的荧光增加。为了测定背景染色，细胞在不存在Cov2 S1的情况下用抗体染色。结果显示在图5中。

可以看出，在不存在相容性溶质的情况下，在将Cov2 S1蛋白添加到A549细胞中时检测到浓度依赖性的平均荧光增加（荧光倍数）。四氢嘧啶在1.25%下已表现出积极效果并抑制Cov2 S1蛋白与A549细胞的结合，而NADA在相同浓度下无法表现出显著效果。四氢嘧啶的效果随浓度增加而增加，并在5%四氢嘧啶下实现结合的完全抑制。相比之下，用5%NADA表现出低的结合抑制。

实施例7: 用于测定相容性溶质对膜稳定性的影响的原子力光谱学

基于Roychoudhury等人的方法，使用原子力显微术进行方法以检测病毒膜结合蛋白，特别是膜粒与人膜结合表面蛋白之间的结合。该方法基于以下步骤。

待测试的结合结构域或整个蛋白质结合到表面上。在此，该表面可以是表达受体如ACE2、APN和/或DPP4的膜和甚至整个细胞。测试至少两种不同的混合物，一个混合物在缓冲液（300 mM KCl和20 mM Tris，pH 7.8）中含有人类病毒受体与相容性溶质（四氢嘧啶1M），且一个混合物在缓冲液中含有人类病毒受体而无溶质。在下一步骤中，向装置（来自Asylum Research的AFM装置，Olympus OMCL TR400氮化硅悬臂，弹簧常数为20 pN/nm）的原子可引导臂（atomar führbaren Arms）的针尖（AFM针尖）配备病毒受体结合域，优选S1，或整个蛋白质，优选SARS-CoV-2。该蛋白质具有HIS标签。然后将该针尖靠近结合的样品（含/不含溶质的病毒受体）并逐渐接触。在靠近的过程中以及在移除结合蛋白的过程中，测定牛顿力vs潜在结合配对物（在此为ACE2和S1）之间的距离，并记录为力曲线（400 nm/s的收回速度）。

与无溶质相比，含溶质的实验混合物的所测的力能够得出关于膜结合蛋白，如ACE2与潜在结合配对物，如SARS-CoV-2蛋白之间的分子相互作用的结论，以及如Roychoudhury等人已经对四氢嘧啶描述的关于该溶质对膜结合蛋白的屏蔽作用的陈述。该方法适用于测试所有相容性溶质。

用以下组合作为实例进行原子力光谱学

四氢嘧啶–刺突S1蛋白

羟基四氢嘧啶–刺突S1蛋白

Glycoin–刺突S1蛋白

甘露糖基甘油酸酯–刺突S1蛋白

实施例8: 本发明意义内的溶质的制剂的实例

A-1) 含溶质的吸入剂溶液13%

在本发明的意义内吸入剂的目标是用四氢嘧啶水合物的薄层尽可能好地和大面积地润湿肺表面。使用来自Hahn等人和Roychoudhury等人的数据计算理论上最大和完全润湿的肺。

水合四氢嘧啶的面积：3.5e10^-10 m *3.5e10^-10 m * 3.14 = 3.85e10^-19 m²（圆公式）。四氢嘧啶与水分子的距离 = 0.35 nm

假设这等于半径且肺的表面积 = 100 - 150 m²，计算出需要2.6e10²⁰个四氢嘧啶分子才能完全占据该面积以实现单层水合物层。对于两个水合物层，需要5.2e10²⁰个四氢嘧啶分子。

应该指出，上述计算适用于相当小的肺，并且面积可高达1.5倍。0.35 nm的水合四氢嘧啶的假定半径是可能的最紧密的状态。密度较低的状态（r = 0.8 nm）需要较少的四氢嘧啶。因此，当前的计算仅被视为指示性的，在个例中应当任选适配患者的体型和/或年龄。

四氢嘧啶分子量: 142.16 g/mol

1 mol = 6.022e10²³个粒子

四氢嘧啶的量 = 5.2e10²⁰ / (6.022e10²³ x mol-1) = 0.864e10^-3 mol = 0.123g四氢嘧啶

对于13%溶液（130 g/l）而言将为0.00094 l或0.94 mL

因此需要有效到达肺部的1 - 1.5 mL剂量的含13%溶质的吸入剂溶液，以使四氢嘧啶在理论上均匀地分布在肺中。该测得的浓度基于单次施用的假设。

A-2) 含溶质的吸入剂溶液3.9%

由含有3.9%溶质的吸入剂溶液开始，需要施用3次（例如分布于全天），才实现与13%溶液相当的剂量。

A) 输液用溶液4%

0.9%的等渗NaCl溶液具有286 mOsmol/kg H₂O的渗透活性。2%四氢嘧啶溶液具有147 mOsmol/kg H₂O的同渗容摩（Osmolarität）。等渗四氢嘧啶溶液因此具有3.89%的浓度。

等渗的输液用溶液是优选的，以免刺激或损伤组织。因此，等渗的四氢嘧啶输液用溶液含有3.89%四氢嘧啶。另一种组合是与适用于输液的NaCl溶液组合的四氢嘧啶输液用溶液。这种产物含有与适配的四氢嘧啶溶液组合的少量NaCl，以在整体上得到等渗的四氢嘧啶-NaCl输液用溶液。

对于本发明意义内的其它溶质，相应的输液用溶液可根据它们的同渗容摩进行计算。

*根据同渗容摩测定或++适配生理相容溶液。

大鼠中四氢嘧啶/kg的经静脉药代动力学研究

在经静脉药代动力学研究中，在大鼠中使用100 mg/kg的量的四氢嘧啶。口服毒性数据指示2000 mg/kg体重/天的NOAL。口服的四氢嘧啶（1000 mg/kg）在大鼠中导致99 µg/ml的血浆浓度。

Claims (21)

1.用于预防或治疗由冠状病毒科的ss(+)RNA病毒引起的疾病的相容性溶质或溶质混合物，其中所述至少一种相容性溶质选自高水溶性有机化合物。

2.根据权利要求1使用的相容性溶质或溶质混合物，其中所述至少一种溶质具有大于或等于7 mol/mol H₂O/溶质的水结合力。

3.根据权利要求1或2使用的相容性溶质或溶质混合物，其中所述至少一种溶质选自甘油基葡糖苷（Glycoin）、甘氨酸甜菜碱、甘露糖基甘油酸酯（Firoin）、甘露糖基甘油酰胺（Firoin-A）、式I和/或II的四氢嘧啶及其衍生物和上述化合物的生理相容盐、酰胺和酯，其中在式I和式II中

R1 = H或烷基，

R2 = H、COOH、COO-烷基或CO-NH-R5，

R3和R4各自彼此独立地为H或OH，

R5 = H、烷基、氨基酸残基、二肽残基或三肽残基

n = 1、2或3，

烷基 = 具有C₁-C₄个碳原子的烷基。

4.根据权利要求1至3任一项使用的相容性溶质或溶质混合物，其中所述疾病由β冠状病毒和/或α冠状病毒属的ss(+)RNA病毒引起。

5.根据权利要求1至4任一项使用的相容性溶质或溶质混合物，其中所述疾病由选自SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-NL63和/或HCoV-229E的ss(+)RNA病毒引起。

6.根据权利要求1至5任一项使用的相容性溶质或溶质混合物，其中所述病毒性疾病包含移行上皮组织和/或内部上皮组织的感染和/或炎症。

7.根据权利要求1至6任一项使用的相容性溶质或溶质混合物，其中所述病毒性疾病包含内皮的感染和/或炎症。

8.根据权利要求1至7任一项使用的相容性溶质或溶质混合物，其中ss(+)RNA病毒与人类细胞上的至少一种膜结合蛋白或其组分相互作用并利用这种蛋白或其组分作为受体以结合到细胞上。

9.根据权利要求1至8任一项使用的相容性溶质或溶质混合物，其中ss(+)RNA病毒与选自血管紧张素转化酶2（ACE2）、氨基肽酶N（APN）和/或二肽基肽酶4（DPP4）的受体相互作用。

10.根据权利要求1至9任一项使用的相容性溶质或溶质混合物，其中所述至少一种相容性溶质减少或防止ss(+)RNA病毒的适合结合到人类受体上的病毒蛋白的去折叠和/或开放。

11.根据权利要求1至10任一项使用的相容性溶质或溶质混合物，其中减少或防止ss(+)RNA病毒的繁殖。

12.根据权利要求1至11任一项使用的相容性溶质或溶质混合物，其中所述至少一种相容性溶质屏蔽移行上皮、内部上皮组织和/或内皮的膜。

13.根据权利要求1至12任一项使用的相容性溶质或溶质混合物，其中所述至少一种溶质与抗病毒化合物、抗炎化合物、白介素阻滞剂、抗炎抗细胞因子、病毒受体抑制剂和/或疫苗联合给药。

14.根据权利要求1至13任一项使用的相容性溶质或溶质混合物，其中所述至少一种溶质用于来自细粉尘污染严重的地区、属于存在严重细粉尘污染的职业群体、有既往血管疾病和/或慢性呼吸道疾病的患者。

15.组合物，其含有至少一种根据权利要求1至14任一项使用的溶质或溶质混合物，其中所述至少一种相容性溶质或溶质混合物以基于组合物的总含量计大于或等于0.0001重量%至小于或等于70重量%的比例存在于所述组合物中。

16.根据权利要求15使用的组合物，其为

i) 固体形式，包括粉末、颗粒、胶囊、含片和泡腾片，

ii) 液体形式，包括溶液剂、注射液、输液剂和混悬剂，和/或

iii) 作为混合物，包括喷雾剂、气溶胶和吸入剂。

17.根据权利要求15或16使用的组合物，其是作为输液用溶液的液体形式或适合与雾化器和/或呼吸器一起使用的液体形式。

18.根据权利要求15至17任一项使用的组合物，其中在由冠状病毒科的ss(+)RNA病毒引起的疾病的预防或治疗中，输液剂与吸入剂联合施用。

19.药盒，其包含

- 至少一种用于吸入的根据权利要求15至18任一项的即用型组合物，和

- 用于施用所述组合物的装置。

20.在用于受控递送组合物的装置中使用的根据权利要求15至18任一项的组合物，其中

- 所述装置适用于生成所述组合物的气溶胶，

- 能够经由口腔和/或鼻子吸入所述组合物，

- 确保计量递送液体或干燥组合物的特定喷发，

- 确保将液体组合物计量递送到眼睛中，和/或

- 能够将所述组合物在口腔、咽喉和/或鼻腔中进行喷雾。

21.识别根据权利要求1至14任一项的相容性溶质的方法，其包括步骤

- 提供具有作为潜在病毒受体的膜结合表面蛋白的细胞系，

- 使所述细胞与可能是根据权利要求1至14任一项的相容性溶质的化合物接触，

- 添加包含可测量信号的病毒受体结合域，

- 培养所述混合物，

- 记录在细胞上可测得的信号，和

- 测定病毒受体结合域与人膜结合表面蛋白之间的结合减少。

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