DE102020112603A1 - Kompatible Solute zur Prävention oder Behandlung von SARS-CoV-2-Infektionen - Google Patents

Kompatible Solute zur Prävention oder Behandlung von SARS-CoV-2-Infektionen Download PDF

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von organischen und hoch wasserlöslichen kompatiblen Soluten oder eines Solutgemisches, bevorzugt in Form einer inhalierbaren, oropharyngeal, nasal und intravenös verabreichbaren Zusammensetzung, bei der Prävention oder Behandlung von durch ss(+)RNA-Viren der Familie Coronavriridae verursachten Erkrankungen, bevorzugt solcher Erkrankungen, die durch SARS-CoV-1, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 und/oder HCoV-229E verursacht werden. Besonders geeignete Solute im Sinne der Erfindung sind Ectoin und seine Derivate, Glycoin, Mannosylglycerat (Firoin) und Mannosylglyceramid (Firoin-A), die durch ihre starke Wasserbindungskapazität die Bindung der Viren an die Rezeptoren der Wirtszelle im Übergangsepithel, z.B. Auge, im inneren Epithel, z.B. Lunge, und im Endothel reduziert und somit die Vermehrung der Viren reduziert oder verhindert. Erfindungsgemäß wird eine Prävention durch ein vermindert infektiöses Sputum und Atem sowie eine Behandlung und Rehabilitation der betroffenen Gewebe durch die membranschützende Eigenschaften der erfindungsgemäßen kompatiblen Solute ermöglicht.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von organischen und hoch wasserlöslichen kompatiblen Soluten oder eines Solutgemisches, bevorzugt in Form einer inhalierbaren, oropharyngeal, nasal und intravenös verabreichbaren Zusammensetzung, bei der Prävention oder Behandlung von durch ss(+)RNA-Viren der Familie Coronavriridae verursachten Erkrankungen, bevorzugt solcher Erkrankungen, die durch SARS-CoV-1, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 und/oder HCoV-229E verursacht werden. Besonders geeignete Solute im Sinne der Erfindung sind Ectoin und seine Derivate, Glycoin, Mannosylglycerat (Firoin) und Mannosylglyceramid (Firoin-A), , die durch ihre starke Wasserbindungskapazität die Bindung der Viren an die Rezeptoren der Wirtszelle im Übergangsepithel, z.B. Auge, im inneren Epithel, z.B. Lunge, und im Endothel reduziert und somit die Vermehrung der Viren reduziert oder verhindert. Erfindungsgemäß wird eine Prävention durch ein vermindert infektiöses Sputum und Atem sowie eine Behandlung und Rehabilitation der betroffenen Gewebe durch die membranschützende Eigenschaften der erfindungsgemäßen kompatiblen Solute ermöglicht.
  • Das neue SARS-Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) hat sich schnell zu einer globalen Herausforderung entwickelt. Innerhalb kürzester Zeit wurde die Verbreitung zu einer Pandemie erklärt. Obwohl der Krankheitsverlauf in vielen bis zu den meisten Fällen milde verläuft und lediglich leichte Symptome, wie Unwohlsein, Fieber und ggf. Husten aufweist, kann sich die Krankheit zu einem akuten Atemnotsyndrom (acute respiratory distress syndrome, ARDS) und schweren akuten respiratorischen Syndrom (severe acute respiratory syndrome, SARS) entwickeln. Die Sterblichkeitsrate steigt mit der Schwere der Erkrankung und kann bei kritisch kranken Patienten bis zu 49% erreichen. Aktuell gibt es keine zielgerichtete Behandlung der durch das Virus Sars-CoV-2 verursachten Covid-19-Erkrankungen, synonym „Coronavirus-Disease 2019“. Derzeit können nur unterstützende Maßnahmen angewendet werden, da zum jetzigen Zeitpunkt kein effektives Therapeutikum gegen die Covid-19-Erkrankungen und auch keine Impfung gegen das SARS-CoV-2 Virus verfügbar sind.
  • Vor diesem Hintergrund basiert die vorliegende Erfindung auf der Aufgabe eine Verbindung, ein Mittel, ein Medizinprodukt und/oder ein Arzneimittel bereitzustellen, das zur Prävention und/oder Behandlung von Erkrankungen, welche durch ss(+)RNA-Viren der Familie Coronavriridae ausgelöst werden, insbesondere viraler Infektionen und/oder Entzündungen, die durch das Virus SARS-CoV-1, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 und/oder HCoV-229E verursacht werden. Es wird sich die Aufgabe gestellt, das Eindringen der vorgenannten Viren, insbesondere von SARS-CoV-1, SARS-CoV-2 und/oder MERS-CoV, in eine Wirtszelle zu verhindern oder zu reduzieren, wobei Wirtszellen eukaryotische Zellen von Mensch und Tier sind. Damit soll eine Verbindung, ein Mittel, Medizinprodukt und/oder Arzneimittel zur Verwendung bei der Prävention und Behandlung der vorgenannten Erkrankungen bei Mensch und Tier bereitgestellt werden. Um solche Verbindungen zu identifizieren stellt sich die vorliegende Erfindung die weitere Aufgabe ein Verfahren bereitzustellen, welches eben solche Verbindung identifiziert, die zur Behandlung und Prävention der vorgenannten Erkrankungen geeignet sind. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung geeigneter Medizinprodukte zur individuellen Prävention für den täglichen Gebrauch sowie einer isolierten und komplementären Therapie zur Behandlung geschädigter Epithelgewebe und des Endothels. Daher ist es eine weitere Aufgabe geeignete Formulierungen und Darreichungsformen bereitzustellen.
  • Überraschend wurde nun festgestellt, dass kompatible Solute, wie Ectoin und seine Derivate Glycoin, Mannosylglycerat (Firoin) oder Mannosylglyceramid (Firoin-A) die vorstehenden Aufgaben lösen können, wie es in den beiliegenden Beispielen und 3-5 gezeigt wurde.
  • Daher ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein kompatibles Solut oder Solutgemisch zur Verwendung bei der Prävention oder Behandlung von durch ss(+)RNA-Viren der Familie Coronavriridae verursachten Erkrankungen, worin das mindestens ein kompatibles Solut aus organischen und hoch wasserlöslichen, vorzugsweise biobasierten, Verbindungen, bevorzugt aus Hydroxyectoin und Ectoin und den Derivaten, ausgewählt wird. Wenn in der vorliegenden „Ectoin und/oder den Derivaten“ oder „Ectoin und/oder seinen Derivaten“ genannt sind, so sind damit alle Verbindungen der Formel I und II umfasst.
  • Die allgemeine Klassifizierung der Viren ist dem Fachmann bekannt. Zur Einordnung der durch die vorliegende Erfindung berücksichtigten Viren der Familie Coronaviridae werden diese von den Viren der Familie Picornaviridae (Ordnung Picornavirales), der Familie Adenoviridae (Unrterordnung unbekannt) und der Familie Filoviridae (Ordnung Mononegavirales) abgegrenzt. Viren der Familie Picornaviridae umfassen Rhinoviren, die Einzelstrang-RNA-Genom positiver Polarität aufweisen. Viren der Familie Adenoviridae umfassen Adenoviren, die auf ds-DNA basieren und Viren der Familie Filoviridae, zu denen z. B. das Ebola-Virus gehört sind ebenfalls Einzelstrang-RNA-Genom aber mit negativer Polarität. Viren im Sinne dieser Erfindung gehören der Familie Coronaviridae an, die in zwei Subfamilien Coronavirinae und Torovirinae unterteilt wird. Coronavirinae werden in die Gattungen der Alpha-, Betacoronaviren, die nur Säugetiere infizieren, Gamma- und Deltacoronaviren, welche beide Säugetiere und Vögel infizieren, unterteilt.
  • E229 und NL63 sind humanpathogene Alphacoronaviren, während OC43 und HKU1 und alle neuen CoVs Viren umfassend das SARS-CoV2 der Gattung der Betacoronavirus angehören. Daher ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung mindestens eines kompatiblen Soluts oder Solutgemisches, bevorzugt von Ectoin und seiner Derivate, worin die Erkrankung durch ein ss(+)RNA-Virus der Gattung Betacoronavirus und/oder Alphacoronavirus ausgelöst wird und bevorzugt durch ein Virus ausgewählt aus SARS-CoV-1, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 und/oder HCoV-229E.
  • Die vier Viren HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 und HCoV-229E verursachen Rhinitis, Konjunktivitis, Pharyngitis, gelegentlich eine Laryngitis und/oder eine Mittelohrentzündung und damit hauptsächlich Erkrankungen der oberen Atemwege. Dagegen können die übrigen Viren, schwerwiegendere Erkrankungen der unteren Atemwege mit oder ohne systemischen Infektionen und/oder Entzündungen verursachen. Daher sind im Sinne der Erfindung besonders bevorzugte Viren ARS-CoV(-1), SARS-CoV-2 und/oder MERS-CoV.
  • Jedes der vorstehenden Viren umfasst ein in der Virushülle gebundenes Oberflächenprotein, das mit spezifischen Oberflächenproteinen der Wirtszellen interagiert, an diese bindet, wodurch letztendlich die Infektion der Wirtzelle induziert wird (Tay et al.). Daher wird in einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mindestens ein kompatibles Solut oder ein Solutgemisch, bevorzugt Ectoin, verwendet, worin das ss(+)RNA-Virus mit mindestens einem membrangebundenen Protein oder Bestandteil davon auf humanen Zellen (Wirtzellen) interagiert und dieses Protein oder den Bestandteil davon als Rezeptor zur Bindung an die Zelle nutzt. Im Sinne der Erfindung wirkt das mindestens eine Solut auf alle Oberflächenproteine humaner Zellen, welche von viralen Pathogenen als Rezeptoren durch pathogene Oberflächenproteine gebunden werden. In einer besonderen Ausführungsform interagiert das ss(+)RNA-Virus mit einem Rezeptor ausgewählt aus Angiotensin-konvertierendem Enzym 2 (ACE2), Aminopeptidase N (APN) und/oder Dipeptidylpeptidase 4 (DPP4). Diese viralen Rezeptoren interagieren mit verschiedenen Proteinen der Viren im Sinne der Erfindung, wie in 1 von Fang Li 2020 gezeigt. Insbesondere werden Carboxypeptidasen sowie andere Aminopeptidasen und Dipeptidylpeptidase als die bereits genannten ebenfalls von der vorliegenden Erfindung erfasst. „Virale Rezeptoren“ im Sinne der Erfindung sind alle membrangebundene Proteine, welche durch die hier genannten ss(+)RNA-Viren als Rezeptoren auf ihren Wirtszellen erkannt werden, vorzugsweise auf humanen Zellen, besonders bevorzugt auf Zellen der Übergangsepithelgewebe, der inneren Epithelgewebe und/oder des Endothels.
  • Daher wird in einer besonderen Ausführungsform des nachstehenden erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifikation potentieller kompatibler Solute im Sinne der Erfindung, die entsprechenden Kombinationen nach Fang Li 2016 getestet, um auf diese Weise das jeweils am besten geeignete kompatible Solut für das jeweilige Virus zu identifizieren, welches aus organischen und hoch wasserlöslichen, vorzugsweise biobasierten, Verbindungen, bevorzugt aus Hydroxyectoin und Ectoin und den Derivaten, ausgewählt wird. Besonders bevorzugt haben diese Solute eine Wasserbindungskapazität von größer gleich 7 mol/mol H2O/Solut.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist nämlich ein Verfahren zur Identifikation eines erfindungsgemäßen kompatiblen Soluts zur Verwendung bei der Prävention oder Behandlung von durch ss(+)RNA-Viren der Familie Coronavriridae verursachten Erkrankungen, worin das mindestens eine kompatible Solut aus organischen und hoch wasserlöslichen, vorzugsweise biobasierten, Verbindungen ausgewählt wird. Das Verfahren (synonym: biologischer Assay) umfasst folgende Schritte:
    • - Bereitstellen einer Zelllinie, welche membranständige Oberflächenproteine als potentiell virale Rezeptoren aufweist, bevorzugt eine Zelllinie aus Tabelle 5,
    • - In Kontakt bringen der Zellen mit einer Verbindung, welche potentiell ein kompatibles Solut im Sinne der Erfindung ist, bevorzugt Ectoin und/oder eine andere Verbindung der Formel I und/oder II, Glycerylglucosid (Glycoin), Mannosylglycerat (Firoin), Mannosylglycramid (Firoin-A),
    • - vorzugsweise ein Versuchsansatz zur Kontrolle ohne eines der potentiellen Solute,
    • - Hinzufügen einer viralen Rezeptorbindungsdomäne, welche ein messbares Signal umfasst, vorzugsweise eine Bindungsdomäne des Angiotensin-konvertierenden Enzyms 2 (ACE2), der Aminopeptidase N (APN) und/oder Dipeptidylpeptidase 4 (DPP4), bevorzugt das S1 Protein oder ein anderes nach Fang Li 2016,
    • - Inkubation des Ansatzes, bevorzugt für eine ausreichende Dauer zur Interaktion und Bindung der Bindungspartner
    • - Aufzeichnen des an der Zelle messbaren Signals, vorzugsweise eines Fluoreszenzsisgnals, und
    • - Ermittlung einer reduzierten Bindung zwischen der viralen Rezeptorbindungsdomäne und dem humanen membranständigen Oberflächenprotein.
  • Wird in dem vorgenannten Verfahren im Vergleich zur mitgeführten Kontrolle eine Reduzierung des von dem viralen Protein ausgehenden Signals gemessen, so deutet dies auf eine reduzierte Bindung des Virus hin. Beispiel 1 beweist die Funktionalität des Assays. Vorzugsweise werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren die Zellen mit Propidiumiodid inkubiert, sodass membrangeschädigte, vorzugsweise tote Zellen, vom Messsignal abgezogen werden. Die potentiellen Verbindungen werden aus organischen und hoch wasserlöslichen, vorzugsweise biobasierten, Verbindungen ausgewählt, die vorzugsweise eine Wasserbindungskapazität von größer gleich 7 mol/mol H2O/Solut haben.
  • Bevorzugt werden kompatible Solute im Sinne der Erfindung mit dem vorstehenden Verfahren gescreent. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in zwei verschiedenen Ausführungsformen ausgestaltet sein. In einer ersten Alternative einer Ausführungsformen werden in einem vorgeschalteten Verfahren kompatible Solute mit einer Wasserbindungskapazität von größer gleich 7 mol/mol H2O/Solut ausgewählt, insbesondere gemessen mittels Atomkraftspektroskopie nach Rouychoudhury et al 2011 und anschließend dem oben beschriebenen biologischen Assay zugeführt. In einer zweiten Alternative einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden potentielle Solute zunächst in dem vorgenannten biologischen Assay identifiziert und anschließend die Wasserbindungskapazität nach Rouychoudhury et al 2011 ermittelt. In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens sowie der Alternativen wird Ectoin als interner Standard mitgeführt, um erfindungsgemäße kompatible Solute gemessen an Ectoin zu identifizieren.
  • Ein erfindungsgemäßes kompatibles Solut, vorzugsweise gemäß Formel I und/oder II, kann biologischen (biobasierten) Ursprung haben oder auch synthetisch hergestellt sein. Biobasierte kompatible Solute, vorzugsweise Verbindungen der Formel I und/oder II, können unter Einsatz von natürlichen Stämmen (siehe auch Costa et al), z. B. Halomonas elongata u. a. (Tabelle 1), oder unter Einsatz genetisch modifizierter Mikroorganismen, z. B Corynebacterium glutamicum, biotechnologisch hergestellt werden. Die Verwendung von genetisch modifizierten Mikroorganismen ermöglicht die Herstellung größerer Mengen erfindungsgemäßer kompatibler Solute. Ebenso ist die synthetische Herstellung erfindungsgemäßer kompatibler Solute in Bezug auf die Menge und Kosten vorteilhaft.
  • Unabhängig von dem Herstellungsweg sind jedoch im Sinne der Erfindung die Wasserbindungskapazität und die reduzierende/störende Wirkung des jeweiligen kompatiblen Soluts auf die Bindung zwischen ss(+)RNA-Viren und Wirtszellen wesentlich, bevorzugt auf die Bindung zwischen den viralen Peplomeren oder Spike Proteinen, vorzugsweise den Rezeptorbindungsdomänen (RBD), und den viralen Rezeptoren auf der Wirtszelle, vorzugsweise ACE2, APN und/oder DPP4 (siehe oben). Erfindungsgemäße kompatible Solute weisen eine Wasserbindungskapazität von größer gleich 7 mol/mol H2O/Solut auf, bevorzugt ermittelt nach Rouychoudhury et al 2011.
  • Synthetisch hergestellte kompatible Solute, wie Ectoine, und mittels Biosynthese hergestellte Ectoine unterscheiden sich in mehreren Merkmale des Endproduktes. Die Merkmale umfassen die Reinheit des Endproduktes in Bezug auf Reststoffe der zur synthetischen Herstellung eingesetzten Chemikalien, die Reinheit in Bezug auf die Enantiomer-Reinheit, Geruch, Färbung (Hazenzahl) und Verarbeitung zu einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung. Ein Vergleichsbeispiel eines kommerziell synthetisch hergestellten Ectoins und eines biobasierten Ectoins zeigt folgende Unterschiede:
    Biotechnisches Ectoin Synthetisches Ectoin
    Ectoingehalt [%] 98,68 96,89
    Hazenzahl (2%) 2 1
    optischer Drehwert 141 abweichend
    pH (2%) 6,76 6,62
    Methanolgehalt [ppm] 135 n/a
    Hydroxyectoin [%] 1,33 n/a
    DABAs 2,4-diaminobytteric acid n/a n/a
    Sonstige Auffälligkeiten keine „Synthetischer“ Geruch; unlöslicher Rückstand in der Ectoin-Lösung für die Methanolbestimmung
  • Ectoine fallen unter die Formel I und II und können als optische Isomere, Diastereomere, Racemate, Zwitterionen, Kationen oder als ein Gemisch aus mindestens zwei der vorgenannten Formen vorliegen. Isomere umfassen (R,R)-, (R,S)-, (S,S)- und (S, R)-Konfigurationen der Verbindungen der Formel I und der Formel II, wobei ein S-Enantiomer gemäß der Fischer-Projektion dem L-Enantiomer entspricht und ein R- Enantiomer dem D- Enantiomer z.B. L-Ectoin gleich S-Ectoin, D-Ectoin gleich. R-Ectoin
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Soluts oder Solutgemisches liegt das mindestens eine kompatible Solut in Enantiomer reiner Form mit einer Reinheit von größer gleich 90 % vor, vorzugsweise größer gleich 95 %, größer gleich 97 %, größer gleich 99 %, besondere bevorzugt gleich 100 %. Auf das Solutgemisch bezogen, bedeutet das, dass das Gemisch von zwei Verbindungen, die jeweilige Verbindungen in Enantiomer reiner Form aufweist und vorzugsweise keine Verunreinigung der ausgewählten Verbindungen durch das Isomer aufweist.
  • Enantiomer reine Formen des erfindungsgemäßen Soluts oder Solutgemisches weisen besonders bevorzugt S- und/oder (S,S)-Isomere auf. In einem bevorzugten Enantiomer reinen Solutgemisch liegen S-Ectoin und (S,S)-Hydroxyectoin jeweils mit einer Reinheit größer gleich 90 % vor, größer gleich 95 %, vorzugsweise größer gleich 97 %, größer gleich 99 %, besondere bevorzugt gleich 100 %. Somit weist dieses Solutgemisch bevorzugt jeweils kleiner gleich 10 % kleiner gleich 5 %, vorzugsweise kleiner gleich 3 %, kleiner gleich 1 %, besonders bevorzugt gleich 0 % R-Ectoin oder (R,S)-/(S,R)- oder (R,R)-Hydroxyectoin auf.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung sind folgende Racemate bevorzugt:
    • - S-Ectoin und R-Ectoin,
    • - (S,S)-Hydroxyectoin, (S,R)-Hydroxyectoin, (R,S)-Hydroxyectoin und (R,R)-Hydroxyectoin, oder
    • - S-Homoectoin und R-Homoectoin.
  • Neben Isomere sind Diastereomere, Racemate, Zwitterionen, Kationen und Gemisch der vorgenannten Verbindungen ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Derivatisierungen können mit Hydroxy-, Sulfsonäsure-, Carboxysäurederivate, wie Amide, Ester usw., Carbonyl, Ether, Alkoxy- und Dydroxylgruppen erfolgen.
  • In einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung wird mindestens ein kompatibles Solut ausgewählt aus Glycerylglucosid (Glycoin), Glycin-Betain, Mannosylglycerat (Firoin), Mannosylglycramid (Firoin-A), Ectoin und seinen Derivaten der Formel I und/oder II sowie den physiologisch verträglichen Salzen, Amiden und Estern der vorgenannten Verbindungen, wobei
    Figure DE102020112603A1_0001
    Figure DE102020112603A1_0002
    • R1 =
    H oder Alkyl,
    R2 =
    H, COOH, COO-Alkyl oder CO-NH-R5,
    R3 und R4
    jeweils unabhängig voneinander H oder OH,
    R5 =
    H, Alkyl, ein Aminosäurerest, Dipeptidrest oder Tripeptidrest
    n =
    1, 2 oder 3,
    Alkyl =
    einen Alkylrest mit C1-C4 Kohlenstoffatomenbedeuten.
  • Ebenso bevorzugte kompatible Solute im Sinne der Erfindung sind Verbindungen aus der Gruppe umfassend Ectoin und Derivate davon, Glycoin (Glyceryl Glucoside), L-Prolin, Mannosylglycerate, N-Acetyl-Diaminobuttersäure (NADA), trimethylamine N-oxide (TMAO) und/oder Glycin-Betaine. Bevorzugte Derivate von Ectoin umfassen S/R-Ectoin, (S,S)/(R,R)-Hydroxyectoin, (S,S)/(R,R)-Hydroxyectoin und S-Homoectoin, sowie die physiologisch verträglichen Salze, Amide und Ester der vorgenannten Verbindungen.
  • Im Sinne der Erfindung wird ebenfalls ein Solutgemisch aus mindestens zwei der vorgenannten Verbindungen verwendet, bevorzugt ein Solutgemisch umfassend mindestens zwei Verbindungen nach Formel I und/oder nach Formel II. Bevorzugt liegt das jeweilige kompatible Solut nach Formel I oder II in Enantiomer reinen Form mit einer Reinheit größer gleich 90 % vor. Ein besonders bevorzugtes Solutgemisch im Sinne der Erfindung aus Verbindungen der Formel I oder II enthält, bezogen auf die Summe aller Verbindungen mit einem Gesamtgehalt von 100 Gew.-%, größer gleich 85 Gew.-% S-Ectoin und kleiner gleich 15 Gew.-% (S,S)-Hydroxyectoin.
  • In einer besonderen Ausführungsform sind erfindungsgemäße kompatible Solute biobasiert, wobei biobasiert so zu verstehen ist, dass die Verbindung einen biologischen Ursprung hat. Biologische Quellen erfindungsgemäßer Solute umfassen z.B. aus Algen, Pilzen, phototrophen Bakterien, methanogene Bakterien, Actinopolyspora halophila, Gammaproteobakterien, Nocardiopsis sp., Brevibacteria, grampositive Kokken, viele Bacillen, Algen, einige Bacillen und verwandte Arten (Planococcus citreus), Staphylococcus epidermidis, Salinicoccus sp., Stamm M96/12b, Sporosarcina halophila, methanogene Bakterien (β-Glutamin, Nε-Acetyl-β-lysin), Ectothiorhodospira marismortui (CGA), andere anoxigene phototrophe Bakterien, Azospirillum brasilense, Rhizobium meliloti und viele mehr. Einige Beispiele sind in der nachstehenden Tabelle 1 zusammengefasst.
  • Eine weitere Zusammenfassung kompatibler Solute im Sinne der Erfindung enthält Costa et al 1998. Die dort ab Seite 122 bis Seite 141 aufgeführten Verbindungen werden hiermit als Bestandteil der vorliegenden Erfindung eingebunden. Die dort genannten Solute sind zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet, bevorzugt solche mit einer Wasserbindungskapazität von größer gleich 7 mol/mol H2O/Solut, bevorzugt ermittelt nach Rouychoudhury et al 2011.
  • Tabelle 1: Beispiel kompatibler Solute
    Solut Abkürzung Ursprung
    Polyole
    Arabitol, Arabinitol Saccharomyces rouxii, Asteromyces cruciatus
    Dimannosyl-di-myo-inositol-1,1'(3,3')-phosphat DMIP Thermococcus spp., Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana
    Di-myo-Inositol-1,1'-phosphat DIP Pyrococcus woesei, Methanococcus igneus, Pyrococcus furio-sus, Thermococcus litoralis
    Diglycerinphosphat DGP Archaeoglobus fulgidus
    Zucker
    Firoin A, Mannosylglyceramid, Mannosylglycerinsäureamid MGA Rhodotermus marinus
    Firoin, Mannosylglycerat, Mannosylglycerinsäure MG Rhodotermus marinus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Dehalococcoides ethenogenes, Thermus thermophilus, Rubrobacter xylanophilus, Petrotoga miotherma, Palaeococ-cus ferrophilus, Petrotoga miotherma
    Glyceryl Glucoside Glycoin Myrothamnus flabellifolia, Cyanobakterien, Mikroalge Spirulina.
    Trehalose, Mykose Pflanzen, Pilze, Insekten, Bakterien, Thermus thermophilus
    Aminosäuren
    Dimethylpropionat, Pivalinsäure Algen, Pflanzen
    (S)-2-Methyl-3,4,5,6-tetrahydropyrimidin-4-carbonsäure S-Ectoin Ectothiorhodospira halochloris, Halomonas elongata, Marinococcus halophilus, Brevibacterium linens, Halomonas SPC1, Volcaniella eurihalina, Deleya Salina, Bacillus pantothenticus, Bacillus halophilus, Salibacillus salexigens Vibrio costicola und Streptomyces parvulust
    (4S,5S)-5-Hydroxy-2-methyl-1,4,5,6-tetra-hydropyrimidin-4-carbonsäure Hydroxyectoin
    γ-NAc-DABA, γ-N-Acetyl-2,4-di-aminobuttersäure, 2(S)-4-Acet-amido-2-aminobutansäure, 2(S)-4-Acetamido-2-aminobuttersäu-re, γ-N-Acetyl-2,4-diaminobutan-säure, γ-N-Acetyl-2,4-diaminobuttersäure, γ-N-Acetyldiaminobutansäure, γ-N-Acetyldiaminobuttersäure, N-Acetyldiaminobuttersäure NADA Ectoinsynthese
    β-Galactopyranosyl-5-hydroxylysin GAL-HYL Thermococcus litoralis, Archaea
    α-NAc-DABA, α-N-Acetyl-2,4-diaminobuttersäure, 2(S)-2-Acet-amido-4-aminobutansäure, 2(S)-2-Acetamido-4-aminobuttersäu-re, α-N-Acetyl-2,4-diaminobutansäure, α-N-Acetyl-2,4-diamino-buttersäure, α-N-Acetyldiamino-butansäure, α-N-Acetyldiamino-buttersäure, N-Acetyldiamino-buttersäure Euphorbia pulcherrima
  • Daher sind kompatible Solute im Sinne der Erfindung, Verbindungen aus den Klassen von Zuckern, Aminosäuren und Polyolen, welche durch OH-Gruppen und/oder Amino-und/oder Amid-Gruppen gekennzeichnet sind, welche eine hohe Reaktivität mit Wasser aufweisen. Dazu gehören ebenfalls Betaine, Verbindungen der Formel I/II, Prolin, Carboxamide, NAc-O, NAc-L und Mannosylglycerat.
  • Somit ist ein erfindungsgemäßes kompatibles Solut (synonym: Solut) eine organische und hoch wasserlösliche, vorzugsweise biobasierte, Verbindung, welche in einer besonderen Ausführungsform eine Wasserbindungskapazität von größer gleich 7 mol/mol H2O/Solut aufweist. Bevorzugt beträgt die Wasserbindungskapazität größer gleich 7,2, größer gleich 7,5, größer gleich 7,7, größer gleich 8,0, größer gleich 8,2, größer gleich 8,5, größer gleich 8,7, größer gleich 9 jeweils als [mol/mol H2O/Solut]. Das bevorzugte Solut im Sinne der Erfindung ist Ectoin mit einer Wasserbindungskapazität größer gleich 9,0 mol/mol H2O/Solut.
  • Das jeweils bevorzugte Solut oder Solutgemisch im Sinne der Erfindung kann allein oder in Kombination mit anderen physiologischen Lösungen eingesetzt werden, z.B. verschiedene in der Klinik eingesetzte Infusionslösungen, NaCI-Lösungen.
  • Die erfindungsgemäßen Solute, bevorzugte Ectoin und/oder seine Derivate oder eine Zusammensetzung enthalten das mindestens eine bevorzugte Solut, werden bei der Prävention oder Behandlung von viralen Erkrankungen verwendet, welche eine Infektion und/oder Entzündung der Übergangsepithelgewebe und/oder inneren Epithelgewebe umfassen. In einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung umfasst die virale Erkrankung eine Infektion und/oder Entzündung des Endothels.
  • Virale Erkrankung im Sinne der Erfindung umfassen eine Infektion und/oder Entzündung des Endothels, insbesondere des Endothels des Auges, der oberen und/oder unteren Atemwege, der Luftröhre, der Lunge, der Bronchien, des Bronchialbaums, des Herzen, des Endothel von Herz-, Blut-Lymphgefäßen, Hirngefäßen, Nierengefäßen, Speiseröhre, Magenschleimhaut und/oder Dünn-/Darmschleimhaut.
  • Daher sind im Sinne der Erfindung solche viralen Erkrankungen umfasst, jeweils ausgelöst durch SARS-CoV-1, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 und/oder HCoV-229E, die eine Infektion und/oder Entzündung der oberen und/oder unteren Atemwege, der Luftröhre, der Lunge, der Bronchien und/oder des Bronchialbaum zeigen. Diese Erkrankungen sind dadurch charakterisiert und nachweisbar, dass die in den vorgenannten Organen betroffenen Gewebe durch das Virus infiziert wurden und somit mindestens ein Bestandteil (virale RNA) des Virus in diesen Geweben nachweisbar ist. Betroffene Gewebe im Sinne der Erfindung umfassen
    • - Übergangsepithelgewebe umfassend obere Atemwege, Mundhöhle, Mundschleimhaut, Zahnfleisch, Zunge, Zungenschleimhaut, Nasenhöhle, Nasennebenhöhlen, Nasenschleimhaut, Auge, Stimmlappen, Rachen und Genitalien und/oder
    • - innere Epithelgewebe umfassend untere Atemwege, Luftröhre, Bronchien, Bronchialbaum, Lungen, inneres Endothelgewebe, kontinuierliches Endothel, insbesondere kontinuierliches Endothel von Lunge und Herz, Endothel von Herz-, Blut-Lymphgefäßen, Speiseröhre, Magenschleimhaut und/oder Dünn-/Darmschleimhaut.
  • Tabelle 2: Epithelgewebe im Sinne der Erfindung
    Epithelgewebe Vorkommen
    Einschichtiges Plattenepithel Seröse Häute umfassend Pleura, Lungenfell, Herzbeutel, Scheidenhaut des Hodens; Alveolenepithel, Endothel, Lunge (Endothel), Endothel von Herz, Blut- und Lymphgefäßen; Zungenschleimhaut (Zungenunterseite)
    Einschichtiges hochprismatisches Epithel Epithel von Magen, Dünn- und Dickdarm; Magenschleimhaut, Darmschleimhaut
    Zweireihiges Epithel Speicheldrüse, Mundhöhle, Tränenkanal
    Mehrreihiges hochprismatisches Epithel Nasenhöhle, Schlund (Rachen), Kehlkopf, Atemwege, Bronchialbaum, Ohrtrompete, Harnröhre,
    Mehrschichtiges unverhorntes Epithel Vorderes Hornhautepithel (Auge), Stimmfalte, Mundhöhle, Zahnfleisch (innere Saumepithel, das den Zahnhals umschließt), Rachen, Speiseröhre, After, Vagina, Zungenschleimhaut (Zungenoberseite); Bindehaut (Konjunktiva) des Auges, Kornea
    Mehrschichtiges verhorntes Epithel Epidermis (Stratum basale, Stratum spinosum, Stratum granulosum), Nasenvorhof, äußerer Gehörgang, Zahnfleisch (äußeres Saumepithel zur Mundhöhle),
  • Behandlung und Prävention im Sinne der Erfindung ist weit auszulegen und umfasst ebenfalls die Unterstützung der Rehabilitierung von durch das Virus beschädigtem Gewebe. Dies ist insbesondere dann relevant, wenn vorrangig eine Immunisierung durch Vakzine erfolgt und durch eine erfindungsgemäße Kombination zusätzlich durch Verwendung eines erfindungsgemäßen Soluts die Rehabilitierung des durch das Virus beschädigten Gewebes erfolgen soll oder aber präventiv das Gewebe geschützt werden.
  • In einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung wird das mindestens eine Solut oder Solutgemisch, bevorzugt in Form einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, bei der Prävention oder Behandlung von durch die vorgenannten Viren, bevorzugt durch SARS-Cov-2, verursachten Erkrankungen der Atemwege eingesetzt. Erfindungsgemäße Zusammensetzungen enthalten mindestens ein kompatibles Solut, das aus organischen und hoch wasserlöslichen, vorzugsweise biobasierten, Verbindungen, bevorzugt aus Hydroxyectoin und Ectoin und den Derivaten, ausgewählt wird und vorzugsweise eine Wasserbindungskapazität von größer gleich 7 mol/mol H2O/Solut haben.
  • Virale Erkrankungen der Atemwege im Sinne der Erfindung umfassen nicht nur endotheliale Infektionen und/oder Entzündungen, sondern auch Infektionen und/oder Entzündungen der Alveolarepithelzellen. Virale Erkrankungen im Sinne der Erfindung, die durch ss(+)-RNA-Viren, bevorzugt durch das SARS-Cov-2, verursacht werden, umfassen Pneumonie, SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) und organweite Schädigungen der vorgenannten Gewebe. SARS-Cov-2 bzw. COVID-19-Patienten weisen typische Symptome auf, wie Fieber, Unwohlsein, Müdigkeit und Husten. Die meisten Erwachsenen oder Kinder, die mit SARS-CoV-2 infiziert sind, haben leichte grippeähnliche Symptome. Diese können sich bei einigen Patienten, insbesondere bei Patienten der Risikogruppen, schnell zu einem akuten Atemnotsyndrom (SARS), Atemversagen, Versagen mehrerer Organe und sogar Tod führen.
  • Weitere Symptome sind Husten, Sputumproduktion, Atemnot, Halsschmerzen und Kopfschmerzen. Einige Patienten zeigen gastrointestinale Symptome mit Durchfall und Erbrechen auf. Fieber und Husten sind die dominierenden Symptome, während Symptome der oberen Atemwege und des Magen-Darm-Trakts selten waren.
  • Bei Patienten mit den vorgenannten Symptomen der oberen und/oder unteren Atemwege sind die erfindungsgemäßen Produkte zur Prävention oder Behandlung besonders gut geeignet. Besonders bevorzugt sind inhalierbare Zusammensetzung und Produkte (6). Ebenso bei Patienten mit Husten, Sputumproduktion und/oder Halsschmerzen sind die erfindungsgemäßen Produkte (6) bevorzugt, welche mindestens ein kompatibles Solut enthalten, welches aus organischen und hoch wasserlöslichen, vorzugsweise biobasierten, Verbindungen, bevorzugt aus Hydroxyectoin, Ectoin und/oder den Derivaten, ausgewählt wird. Besonders bevorzugt haben diese kompatiblen Solute eine Wasserbindungskapazität von größer gleich 7 mol/mol H2O/Solut.Diese Produkte erfüllen dabei zwei Funktionen. Zum einen unterstützen sie die Rehabilitation der angegriffenen Gewebe (siehe Tabelle 2) und behandelt auf diese Weise die virale Erkrankung im Sinne der Erfindung. Zum anderen wird dadurch ein Schutz des Umfelds erzielt, da ein geringer infektiöser Sputum und Atem erzielt wird.
  • Eine besondere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung ist der Einsatz des mindestens einen kompatiblen Soluts, bevorzugt Ectoin und/oder seine Derivate, bei der Behandlung oder Prävention einer systemischen Endothelliitis, wie sie durch das SARS-Cov-2 verursacht wird. Die sogenannten Covid-19-Endotheliitis ist durch mehrfache Organschädigung gekennzeichnet und insbesondere durch diffuse endotheliale Entzündungen in Herz, Leber und Niere. Herzkreislaufprobleme werden ebenso beschrieben. Bei diesen Patienten wird festgestellt, dass SARS-CoV-2 direkt Entzündungen in den Gefäßen auslöst. Weitere Organe können Infektionen und/oder Entzündungen aufweisen.
  • In einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung des mindestens einen kompatiblen Soluts oder Solutgemisches, bevorzugt enthaltend in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, reduziert oder verhindert das mindestens eine kompatibles Solut, bevorzugt Ectoin, das Entfalten und/oder Öffnen des zur Bindung an den humanen Rezeptor geeigneten viralen Proteins des ss(+)RNA-Virus. Zu den viralen Proteinen, auch Peplomere genannt, der erfindungsgemäßen ss(+)RNA-Viren, gehören die sogenannten S1 Spike Proteine der erfindungsgemäßen Viren und insbesondere die jeweiligen Bindungsdomänen umfassend Domäne A von HCoV-OC43 S, Domäne B von SARS-CoV S, welcher mit dem ACE2-Rezeptor interagiert, HCoV-NL63 S, MERS-CoV S und HCoV-229E S (Tortoricia 2019). Die störende Wirkung der erfindungsgemäßen Solute auf die Interaktion und Bindung zwischen den Peplomeren und den viralen Rezeptoren ist in 3 und 4 gezeigt.
  • Die Viren weisen die Peplomere (Spike Proteine) auf der Virushülle auf, wobei das Peplomer ein glykosylierten S-Protein (Spikes-Protein, 180 bis 220 kDa) umfasst, das ein membranverankertes Trimer bildet. Diese Anteile tragen sowohl (S1) die Rezeptor-Bindungs-Domäne (RBD), mit der das Virus an eine Zelle andocken kann, als auch (S2) eine Untereinheit, die als Fusions-Protein (FP) die Verschmelzung von Virushülle und Zellmembran bewirkt. Die Rezeptor-Bindungs-Domäne (RBD) umfasst eine N-terminale Domäne (NTD) und eine C-terimale Domäne (CTD), die beide als Rezeptor-Bindungs-Domäne fungieren können und unterschiedliche Proteine und Zucker binden.
  • Das Spike-Protein (S-Protein) von SARS-CoV-2 spielt eine zentrale Rolle bei der Virusinfektion und Pathogenese. S1 erkennt und bindet an Wirtsrezeptoren, und nachfolgende Konformationsänderungen in S2 erleichtern die Fusion zwischen der Virushülle und der Wirtszellmembran. Der Infektion liegt der Mechanismus mit den Schritten der Bindung der viralen Rezeptor-Bindungs-Domäne an den Rezeptor der Wirtszelle, gefolgt von der Verschmelzung der Membranen, Eindringen der viralen RNA in die Wirtszelle , Vermehrung der viralen RNA unter Ausnutzung der zellulären Maschinerie der Wirtszelle und Austritt des Virus aus der Wirtszelle
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung reduziert oder verhindert das mindestens ein kompatibles Solut oder Solutgemisch, vorzugsweise Ectoin und/oder seine Derivate, bevorzugt enthalten in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, die Verschmelzung der viralen Membranen mit der Membran der angegriffenen Zelle, insbesondere einer Epithelzelle und/oder Endothelzelle. In einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung wird durch das mindestens eine kompatible Solut, vorzugsweise Ectoin und/oder seine Derivate, vorzugsweise biobasiert, bevorzugt enthaltend in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, die Vermehrung des ss(+)RNA-Virus, insbesondere in der Wirtszelle, reduziert oder verhindert.
  • Die überraschende Wirkung erfindungsgemäßer kompatibler Solute ist in u.a. in Beispiel 3 und in 4 und 5 gezeigt. Es konnte signifikant gezeigt werden, dass A549 Zellen, die mit Ectoin vorinkubiert wurden, weniger bis kein gebundenes virales Cov2 S1 Protein an der Zelloberfläche aufwiesen. Dieser deutliche und starke Effekt von Ectoin ist überraschend und reproduzierbar. Ebenso wird gezeigt, dass der Effekt abhängig von der Konzentration des Ectoins ist. Somit wird überraschend gezeigt, dass kompatible Solute abhängig von ihrer Konzentration einen signifikanten schützenden Effekt auf die Wirtszellen von ss(+)-RNA-Viren haben. Dieser Effekt erfindungsgemäßer Solute ermöglicht eine Prävention sowie Behandlung im Sinne der vorliegenden Erfindung.
  • Der beobachtete Effekte von Ectoin wird derzeit mit einer Theorie begründet, die auf die für Ectoin bekannte Protein und Membran stabilisierende Wirkung zurückgeführt wird. Es wird vermutet, dass erfindungsgemäße kompatible Solute sich um die jeweiligen Bindungspartner anlagern und durch eine Hydrathülle abschirmen. Ohne auf diese Theorie beschränkt zu werden, wird vermutet, dass die Hydrathülle der Solute, welche sich mutmaßlich um die viralen Peplomere (Spike Proteine) anlagern, die Konformation des gefalteten bzw. „geschlossenen“ Proteins stabilisieren und auf diese Weise das Entfalten bzw. „Öffnen“ des Spike Proteins und damit die Zugänglichkeit der Rezeptor-Bindungs-Domäne reduziert oder verhindert wird. Dadurch gelangen die Rezeptor-Bindungs-Domäne des Cov2 S1 Proteins und der „virale Rezeptor“ der Wirtszelle nicht in ausreichende Nähe, sodass es nicht zu einer Bindung kommt.
  • Ein ähnlicher Effekt kann ebenfalls auf der Wirkseite der Wirtszelle vermutet werden. Hier scheint das erfindungsgemäße Solut, bevorzugt Ectoin und/oder seine Derivate, sich um die viralen Rezeptoren anzulagern. Damit wird eine doppelte Abschirmung der Rezeptor-Bindungs-Domäne am Virus und des viralen Rezeptors auf der Wirtszelle erzielt, die zu einer Reduzierung der Bindung zwischen diesen Bindungspartnern führt. Es ist nicht auszuschließen, dass selbiges auf die zelluläre Serinprotease TMPRSS2 zutrifft, welche für die Prozessierung des SARS-CoV-2 Spike Proteins erforderlich ist, um die Verschmelzung einzuleiten (Hoffmann et al. 2020).
  • Daher wird in einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung des mindestens einen kompatiblen Soluts oder Solutgemisches, bevorzugt Ectoin und/oder seine Derivat, vorzugsweise enthaltend in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, die Membran der Übergangsepithelien, der inneren Epithelgewebe und/oder des Endothels abgeschirmt.
  • Bevorzugt werden die von den erfindungsgemäßen ss(+)-RNA-Viren als Bindungsdomäne erforderlichen Oberflächenstrukturen auf humanen Zellen (virale Rezeptoren) abgeschirmt. Besonders bevorzugt werden die Bindungsdomänen der viralen Rezeptoren, umfassend das Angiotensin konvertierende Enzym 2 (ACE2), die Aminopeptidase N (APN) und/oder die Dipeptidylpeptidase 4 (DPP4), durch das mindestens eine kompatible Solut oder Solutgemisch, bevorzugt Ectoin und/oder seine Derivate, abgeschirmt. Das Angiotensin konvertierende Enzym 2 (ACE2) Rezeptor, wird in vielen Organen exprimiert, umfassend Lunge, Herz, Leber, Darm, Auge und Niere und dort von den im Sinne der Erfindung genannten Viren als Rezeptor zur Bindung an die jeweilige Zelle genutzt.
  • Ohne daran gebunden zu sein, ist eine These zum Wirkmechanismus, dass durch das Abschirmen membrangebundener Oberflächenproteine auf der Wirtszelle, welche das Virus als Rezeptor zur Erzielung einer Bindung an die humane Zelle nutzt („viralen Rezeptors“), eine Bindung des Virus und damit eine virale Infektion der Zelle reduziert oder verhindert wird. Insbesondere werden die für das Virus zur Bindung erforderlichen Zuckerreste des „viralen Rezeptors“ abgeschirmt. Eine These zum Wirkmechanismus ist, dass die Abschirmung durch die Bildung von Wasserstoff-Brücken zwischen den OH-Gruppen der viralen Rezeptoren auf der Wirtszelle und den erfindungsgemäßen Soluten, bevorzugt Ectoin, erzielt wird. Die starke Wasserbindungskapazität für Ectoin ist bekannt, sodass es vernünftig erscheint eine Anlagerung der Solute und folglich Rekrutierung von Wassermolekülen zur Ausbildung mindestens einer oder mehrerer Hydrathüllen. Dies würde dazu führen, dass mangels Interaktion zwischen den Bindungspartnern keine Bindung und somit final keine Verschmelzung der Membranen erfolgen würde. Die Verhinderung der vorgenannten Schritte würde auf der Grundlage dieser Theorie erfindungsgemäß zur Verhinderung oder Reduzierung der Vermehrung des Virus in der Wirtzelle führen. Damit würde der Krankheitsverlauf der viralen Erkrankungen im Sinne der Erfindung umfassend Infektionen und/oder Entzündungen des Übergangsepithels, inneren Epithels und des Endothels, gestoppt und/oder abgemildert werden. Damit wird eine SARS-CoV-2-Infektion behandelt oder der Ausbruch der typischen Symptome vorgebeugt. Bevorzugt wird auf diese Weise die Covid-19-Endothelialiitis behandelt oder präventiv verhindert.
  • Daher wird in einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung des kompatibles Solut oder Solutgemisches die Membran der Übergangsepithelien, der inneren Epithelgewebe und/oder des Endothel mit kompatiblen Soluten abgeschirmt.
  • In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung des mindestens einen kompatible Soluts oder Solutgemisches, vorzugsweise Ectoin und/oder seine Derivate, wird das mindestens eine Solut oder das Solutgemisch in Kombination mit anti-viralen Verbindungen, entzündungshemmenden Verbindungen, Interleukin-Blockern, entzündungshemmenden Anti-Zytokinen, Inhibitoren der viralen Rezeptoren und/oder Vakzinen verabreicht.
  • Eine erfindungsgemäße Kombination ermöglicht eine Kombinationstherapie, z.B. eine Akutbehandlung zum Schutz des noch intakten Gewebes, zur Unterstützung der Rehabilitation der bereits angegriffenen Gewebe, zur Reduzierung des infektiösen Atems/Sputums jeweils in Kombination mit einer immunisierenden Therapie mit einem Vakzin.
  • Eine andere Ausführungsform einer Kombination ist die Verwendung des mindestens einen erfindungsgemäßen Soluts oder Solutgemisches, bevorzugt Ectoin, mit einem Corticoid-Präparat. Diese Kombination wird bevorzugt zur Behandlung von erfindungsgemäßen viralen Erkrankungen der unteren Atemwege, besonders der Lunge, besonders bevorzugt in Form eines erfindungsgemäßen Inhalats, verwendet.
  • In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung des kompatibles Solut oder Solutgemisch wird das mindestens eine Solut oder das Solutgemisch, bevorzugt Ectoin und/oder seine Derivate, vorzugsweise enthaltend in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, bei Patienten angewendet, welche aus Regionen mit hoher Feinstaubbelastung stammen, einer Berufsgruppe mit hoher Feinstaubbelastung angehören, eine Gefäßvorerkrankung und/oder chronische Atemwegserkrankungen aufweisen.
  • Besondere Patientengruppen bzw. Risikopatienten (Wang et al 2020) sind Patienten mit geschwächter Endothelfunktion, wie z. B. Patienten mit Diabetes, Herzinsuffizienz, Bluthochdruck, koronaren Herzkrankheiten, kardiovaskulären Beeinträchtigungen, peripheren Gefäßerkrankung, zerebrovaskulären Erkrankungen, zerebrovaskulärer Insuffizienz, Immundefizienz und/oder chronischen obstruktiven Lungenerkrankungen (COPD).
  • In Bezug auf Vorerkrankungen der Atemwege gehören Raucher und Personen, welche besonders starken Feinstaubbelastung ausgesetzt sind, Asthmatiker u. ä. ebenfalls zur Risikogruppe (Zhao et al. 2020). Insbesondere wurde gezeigt, dass das Virus bei Menschen, die einer Feinstaubbelastung ausgesetzt sind, häufiger zu einem schweren Verlauf der Infektion führt als bei Menschen mit geringerer Belastung (Xiao Wu et al 2020).
  • Ein weiterer Gegenstand ist eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Prävention oder Behandlung von durch ss(+)RNA-Viren der Familie Coronavriridae verursachten Erkrankungen, worin mindestens ein kompatibles Solut oder ein Solutgemisch im Sinne der vorliegenden Erfindung enthalten ist. Bevorzugt enthält die Zusammensetzung ein Solut ausgewählt aus der Gruppe umfassend Glycerylglucosid (Glycoin), Mannosylglycerat (Firoin), Mannosylglycramid (Firoin-A), Ectoin und Verbindungen der Formel I und/oder II. Besonders bevorzugt ist Ectoin, Hydroxyectoin und Glycoin.
  • In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthaltend mindestens ein Solut oder Solutgemisch liegt das mindestens eine kompatible Solut oder das Solutgemisch mit einem Anteil von größer gleich 0,0001 Gew.-% bis kleiner gleich 70 Gew.-% in der Zusammensetzung vor, bezogen auf den Gesamtgehalt der Zusammensetzung. Weitere Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthalten größer gleich 0,001 Gew.-%, größer gleich 0,01 Gew.-%, größer gleich 0,1 Gew.-%, größer gleich 1,0 Gew.%, größer gleich 1,5 Gew.-%, größer gleich 2,0 Gew.-%, größer gleich 2,5 Gew.-%, größer gleich 3,0 Gew.-% jeweils bis kleiner gleich 65 Gew.-%, kleiner gleich 60 Gew.-%, kleiner gleich 55 Gew.-%, kleiner gleich 50 Gew.-%, kleiner gleich 45 Gew.-%, kleiner gleich 40 Gew.-%, kleiner gleich 35 Gew.-%, kleiner gleich 30 Gew.-%, kleiner gleich 25 Gew.-%, kleiner gleich 20 Gew.-%.
  • Bevorzugte Anteile des erfindungsgemäßen Soluts in der Zusammensetzung hängen von der jeweiligen Formulierung ab. Bevorzugt enthält eine erfindungsgemäße Zusammensetzung mindestens ein kompatibles Solut oder das Solutgemisch, bevorzugt Ectoin und/oder seine Derivate, mit einem Anteil von größer gleich 0,5 Gew.-% bis kleiner gleich 15 Gew.-%, vorzugsweise größer gleich 0,5 Gew.-% bis kleiner gleich 10 Gew.-%, größer gleich 0,5 Gew.-% bis kleiner gleich 5,0 Gew.-%, besonders bevorzugt größer gleich 0,5 Gew.-% bis kleiner gleich 4,0 Gew.-%, bezogen auf den Gesamtgehalt der Zusammensetzung. Bevorzugt gelten die vorstehenden Bereich für eine Infusionslösung im Sinne der vorliegenden Erfindung.
  • Eine erfindungsgemäße Ausführungsform der Inhalatlösung enthält einen Anteil von größer gleich 2 Gew.-% bis kleiner gleich 25 Gew.-%, größer gleich 5 Gew.-% bis kleiner gleich 25 Gew.-%, bevorzugt größer gleich 8 Gew.-% bis kleiner gleich 22 Gew.-%, größer gleich 10 Gew.-% bis kleiner gleich 20 Gew.-% und bevorzugt größer gleich 10 Gew.-% bis kleiner gleich 18 Gew.-%.
  • In einer anderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Inhalatlösung werden geringere Konzentrationen des mindestens einen erfindungsgemäßen Soluts oder Solutgemisches, bevorzugt Ectoin und/oder seine Derivate, eingesetzt. Bei dieser Ausführungsform werden mehrmalige Applikationen des Inhalts bevorzugt, um auch mit einer geringeren Konzentration eine vergleichbar hohe Dosis zu erzielen, wie mit einer einmaligen Applikation. Welche Konzentration das Inhalat aufweisen sollte, ist abhängig von dem Zustand des Patienten, der angestrebten Therapie, einer ggf. vorhandenen Vorschädigung der Lunge und/oder anderen Kriterien wie z. B. Alter und allgemeine Konstitution des Patienten, welche den Vorgang der Inhalation an sich beeinflussen kann.
  • Insbesondere bei einer bereits geschädigten Lunge, welche eine geringere Aufnahmekapazität im Vergleich zu einer gesunden Lunge hat, ist die Verwendung eines Inhalats mit einem geringeren Anteil des mindestens einen erfindungsgemäßen Soluts sinnvoll.
  • Daher beträgt eine andere Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Inhalatlösung einen Anteil von größer gleich 0,5 Gew.-% bis kleiner gleich 20 Gew.-%, bevorzugt größer gleich 1,3 Gew.-% bis kleiner gleich 18 Gew.-%, bevorzugt größer gleich 2 Gew.-% bis kleiner gleich 15 Gew.-% und besonders bevorzugt größer gleich 3 Gew.-% bis kleiner gleich 10 Gew.-%.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung liegt diese vor
    1. i) in festen Formen umfassend Pulver, Granulat, Kapseln, Lutsch- und Brausetabletten,
    2. ii) in flüssigen Formen umfassend Lösung, Injektion, Infusion und Suspension, und/oder
    3. iii) als Gemisch umfassend Spray, Aerosole und Inhalat.
  • Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann topisch (z.B. auf das Auge), oral, nasal, intravenös, inhalativ, intratracheal und/oder buccal (z.B. Lutschtablette) verabreicht werden. Bevorzugt wird die erfindungsgemäße Zusammensetzung oral, intratracheal oder, durch Inhalieren verabreicht. Es kann ein Trockeninhalat oder ein Aerosol sein. Lösungen werden bevorzugt für Mund, Nase, Rachen und Augen in Form von Tropfen oder Spray verwendet. Eine Kombination ist abhängig von der erforderlichen Therapie sehr gut möglich.
  • In einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung der Zusammensetzung liegt diese in flüssiger Form als Infusionslösung vor oder in flüssiger Form, welche geeignet ist zur Verwendung mit einem Vernebler und/oder Respirator.
  • Für eine maximal gesättigte Solutlösung werden Konzentrationen bevorzugt, welche knapp unter der Löslichkeitsgrenze des jeweiligen Soluts liegen. Eine solche hoch konzentrierte Solutlösung kann als Ausgangslösung zur Anfertigung der jeweils vor Ort erforderlichen Lösung verwendet werden. Auf diese Weise können, abhängig von der erforderlichen Verabreichung, dem Zustand (Vorerkrankungen, Alter usw.) des Patienten und/oder angestrebten Therapie individuelle Lösungen verdünnt werden. Dies ist insbesondere dann von Vorteil, wenn nicht unterschiedlich konzentrierte Lösungen gelagert werden können. Für Ectoin wurde eine maximal Löslichkeit von etwa 620 g/L bei 40°C und etwa 550 g/L bei 25°C ermittelt.
  • Eine Infusionslösung wird vorzugsweise bei der ungefähren Körpertemperatur verabreicht. Ein durchschnittlicher Infusionsbeutel umfasst ein Volumen von 500 ml. Ausgehend von einer Einmal-Gabe des vollständigen Volumens eines Infusionsbeutels weist die Infusionslösung eine maximale Konzentration von 4 % (isoton) auf, sodass der Körper keinen osmotischen Schock erleidet. Eine wiederholte Verabreichung kann erfolgen, ist jedoch von der Entscheidung des Arztes abhängig.
  • Bevorzugt wird bei der Prävention oder Behandlung von durch ss(+)RNA-Viren der Familie Coronavriridae verursachten Erkrankungen die erfindungsgemäße Zusammensetzung verwendet, wobei eine Infusion in Kombination mit einem Inhalat verabreicht wird.
  • Insbesondere ein Medizinprodukt (z. B. 6), das zwischendurch sich selbst verabreicht werden kann ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Es ist bekannt, dass besonders Personal im Gesundheitswesen einem hohen Risiko ausgesetzt ist. Dazu gehören, Ärzte sowie Pflegepersonal in Krankenhäusern und Personal in anderen Einrichtungen, wie in Seniorenheimen, Feuerwehr, Kindergärten und Schulen. Das Risiko kann durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Nasensprays, Augentropfen, Lutschtablette, Mundspülung und/oder Mundsprays reduziert werden. Dadurch wird die Gefahr einer Tröpfcheninfektion wesentlich reduziert und die pflegenden und behandelnden Personen geschützt.
  • Mögliche Produkte, insbesondere Medizinprodukte, können nach folgenden Applikationen unterteilt werden Lunge, Nase, Mund/Rachen und Auge, wie in 6 dargestellt. Jede der in 6 gezeigten Applikationen ist mit dem mindestens einen erfindungsgemäßen Solut oder einem Solutgemisch kombinierbar. 6 stellt keine abschließende Auflistung dar, sondern lediglich die am häufigsten verwendeten Produkte. Diese sind im Sinne der Erfindung zur Verwendung bei der Prävention und Behandlung von durch ss(+)-RNA-Viren verursachten Erkrankungen geeignet.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit umfassend
    • - mindestens eine gebrauchsfertige Zusammensetzung im Sinne der Erfindung zur Inhalation, vorzugsweise in Ampullen oder Einweg-Kartuschen, und
    • - eine Vorrichtung, vorzugsweise zur sofortigen und kontrollierten, Verabreichung der Zusammensetzung, insbesondere durch Inhalation.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Zusammensetzung im Sinne der Erfindung in einer Vorrichtung zur kontrollierten Abgabe der Zusammensetzung, wobei
    • - die Vorrichtung zur Erzeugung von Aerosolen der Zusammensetzung geeignet ist,
    • - eine Inhalation der Zusammensetzung über Mund und/oder Nase ermöglicht,
    • - eine dosierte Abgabe eines definierten Sprühstoßes einer flüssigen oder trockenen Zusammensetzung gewährleistet,
    • - eine dosierte Abgabe einer flüssigen Zusammensetzung in die Augen gewährleistet, und/oder
    • - ein Versprühen der Zusammensetzung im Mundraum, Rachen und/oder Nasenraum ermöglicht.
  • Bevorzugt wird durch die Vorrichtung, bevorzugt elektronisch gesteuert, eine Aerosol-Partikelgröße VMD (Volumetric Median Diameter) in einem Bereich von größer gleich 3 µm bis kleiner gleich 7 µm erzielt, wodurch eine verbesserte Inhalation erzielt wird. Besonders bevorzugt sind Partikelgrößen in einem Bereich von größer gleich 3,0 µm bis kleiner gleich 6,5 |jm, größer gleich 3,0 µm bis kleiner gleich 6,0 |jm, größer gleich 3,0 µm bis kleiner gleich 5,5 |jm, größer gleich 3,0 µm bis kleiner gleich 5,0 |jm, größer gleich 3,0 µm bis kleiner gleich 4,5 |jm, größer gleich 3,5 µm bis kleiner gleich 5,0 |jm, größer gleich 4,0 µm bis kleiner gleich 5,0 |jm, jeweils mit einer Standardabweichung von +/- 0,005-0,1 µm.
  • In einer Ausführung der vorgenannten Vorrichtung wird eine kontinuierliche Rate von 0,5 mL Ectoin/min abgegeben. Daraus ergibt sich eine Abgabe von 20 mg/min an Ectoin, ausgehend von einer 1,3 %-Ectoin-Inhalatlösung.
  • Figurenliste
    • 1 Gating-Strategie zum Ausschluss der toten Zellen von der Analyse. A) FL1 zeigt die grüne Fluoreszenz, die sich aus dem Nachweis von zellgebundenem SARS-Cov-2 S1 ergibt. Tote Zellen wurden mit Propidiumiodid gegengefärbt. Die Färbung toter Zellen ist durch eine Verschiebung auf der FL2-Achse sichtbar. Somit sind Zellen in Gate R2 lebende Zellen. B) Die Zellen im Gate R2 wurden als Histogramm aufgetragen und die mittlere Fluoreszenzintensität dieser Zellen bestimmt.
    • 2 Nachweis der Bindung des Cov2 S1 Proteins an A549 Zellen mittels Durchflusszytometrie. Es wird die mittlere Fluoreszenzintensität lebender Zellen gezeigt.
    • 3 Nachweis des Effektes von Ectoin im Vergleich zu NADA auf die Bindung des Cov2 S1 Proteins an A549 Zellen. Die Bindung des Cov2 S1 Proteins an A549 Zellen wurden mittels Immunfluoreszenz und anschließender Durchflusszytometrie gemessen. Es wird die mittlere Fluoreszenzintensität lebender Zellen gezeigt. Messserie n=2 für 1,25 % und 2,5 %, n=1 für 5 %; es werden die Mittelwerte aus beiden Messungen gezeigt.
    • 4 Darstellung der Ergebnisse als relative Zunahme der Fluoreszenz. Die Zunahme der Fluoreszenz von A549-Zellen aufgrund der Bindung des Cov2 S1-Proteins an die Zelloberfläche wurde berechnet, indem die mittlere Fluoreszenzintensität der mit dem Protein stimulierten Zellen durch die Intensität der nicht mit dem Protein stimulierten Zellen geteilt wurde.
    • 5 In dieser Figur sind alle möglichen Formulierungen und Applikationen der erfindungsgemäßen Solute, bzw. Zusammensetzungen enthaltend das mindestens eine Solut oder Solutgemisch, bevorzugt Ectoin und/oder seine Derivate, zusammengefasst. Lediglich die Infusionslösung ist in dieser Figur nicht dargestellt.
  • Referenzen
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    • Zhao et al. Qianwen Zhao, Meng Meng, Rahul Kumar, Yinlian Wu, Jiaofeng Huang, Ningfang Lian, Yunlei Deng, Su Lin. The impact of COPD and smoking history on the severity of Covid-19: A systemic review and meta-analysis. Accepted article
  • Die nachfolgenden Beispiele zeigen die Wirksamkeit von ausgewählten kompatiblen Soluten, um die Ausführbarkeit der Erfindung zu demonstrieren, ohne jedoch die Erfindung auf diese zu beschränken.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Inhibition der Bindung des SARS-CoV-2 spike S1 Proteins an A549 Zellen durch kompatible Solute
  • Material
    • Ectoin: (4S)-2-Methyl-1,4,5,6-tetrahydropyrimidin-4-carbonsäure, CAS Nr. 96702-03-3
    • NADA: Ny-Acetyl-L-2,4-diaminobutyric acid Produkt Beschreibung, CAS Nr. 1190-46-1
    • Hydroxyectoin: CAS-Nr. 165542-15-4
    • Glycoin: CAS-Nr. 22160-26-5
    • Mannosylglycerat: CAS-Nr. 164324-35-0
    • Glycin-Betain: CAS Nr. 107-43-7
    • L-Prolin: CAS-Nr. 147-85-3
    • SARS-CoV-2 Spike S1 protein: trenzyme life science services, Cat. No. P2020-001, Lot No.: 1IPO
  • Methode
  • Es wurden das Angiotensin-konvertierende Enzym 2 (ACE2) exprimierende A549-Zellen aus der American Type Culture Collection (ATCC) verwendet (Uhal et al. 2013). Die anhaftenden Zellen wurden routinemäßig in T-75-Kolben in DMEM mit 10% FCS, die Penicilin und Streptomycin als Antibiotika enthielten, in einem CO2-Inkubator (5% CO2, 37 °C) kultiviert. Als der Boden des Kolbens zu 2/3 mit Zellen bedeckt war, wurden diese durch Accutase abgelöst
  • Um den Assay durchzuführen, wurden die A549-Zellen bis zur Konfluenz in DMEM mit 10% FCS kultiviert und die Kultivierung im konfluenten Zustand wurde weitere vier Tage durchgeführt, während derer das Zellkulturmedium ersetzt wurde.
  • Für das Hemmungsexperiment wurden die Zellen mit Accutase abgelöst. Jeweils 105 Zellen wurden in ein Probenröhrchen überführt und mit unterschiedlichen Konzentrationen des kompatiblen Soluts vorbehandelt (Tabelle 2), um ein Endvolumen von 100 µl zu gegeben.
  • Nach 30 Min Inkubation wird das HIS-markierte SARS-Cov2-S1-Protein in jedes Röhrchen hinzugefügt und weitere 60 Minuten auf einem Tumble-Shaker bei 450 U/min und Raumtemperatur inkubiert.
  • Tabelle 3: kompatibles Solut + CoV2 S1
    Konzentration [%] kompatibles Solut Gehalt CoV2 S1 [µg]
    5 5 2 1 0
    2,5 5 2 1 0
    1,25 5 2 1 0
    0 5 2 1 0
  • Die Auswertung erfolgte über die Immunfluoreszenz mittels Durchflusszytometrie. Die Bindung des SARS-CoV-2 Spike S1-Proteins wird durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung eines CyFlow SL (Sysmex GmbH) -Durchflusszytometers analysiert. Die Zellen wurden zuerst bei 300 × g, 5 min zentrifugiert und dann in 100 µl PBS mit 1,5 % fötalem Kälberserum und 10 mM Natriumazid resuspendiert. Die Zellen wurden dann 30 Minuten mit 5 µg/ml eines gegen den HIS-Tag gerichteten Maus-Antikörpers (Biolegend) inkubiert. Nach dem Waschen (PBS mit 1,5% fötalem Kälberserum und 10 mM Natriumazid) wurden die Zellen mit dem sekundären Antikörper (20 µg/ml, Kaninchen-Anti-Maus-IgG (H + L), mit Alexafluor 488 markiert, Invitrogen) für 20 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden dann einmal gewaschen und in 1 ml PBS ohne Azid/FCS resuspendiert. Kurz vor der Messung wurden 10 µl einer 0,5 mg/ml Propidiumiodidlösung zugegeben. Danach wurden die Zellen sofort durch ein 50 µm-Zellsieb filtriert und dann sofort gemessen. Alle Schritte werden bei 4 °C im Dunkeln durchgeführt.
  • Die Fluoreszenz der A549 Zellen wird dann durch Durchflusszytometrie analysiert. Zu diesem Zweck wird eine Region auf die lebenden Zellen gelegt (die toten Zellen können von der Analyse ausgeschlossen werden, da sie den roten Propidiumiodidfarbstoff absorbieren) und das geometrische Mittel der relativen Fluoreszenz (MFI) der Zellen in dieser Region bestimmt wie in 1 gezeigt.
  • Beispiel 2: Nachweis der Bindung des SARS-Cov2-S1-Proteins in Abhängigkeit der Konzentration an A549 Zellen
  • A549-Zellen werden bis zur Konfluenz in DMEM mit 10 % FCS kultiviert. Danach wurden die Zellen jeden Tag mit frischem Zellkulturmedium versorgt. Anschließend wurden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen des SARS-Cov2-S1-Proteins ohne ein Extremolyt stimuliert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Analyse erfolgte mittels Zytometrie.
  • Tabelle 4: MFI-Werte zu Fig. 2. Der entsprechende Variationskoeffizient in Prozent (CV%) der Fluoreszenzintensität der Zellen wird ebenfalls angegeben.
    MFI CV%
    Unstained A549 1,17 71,39
    A549 control staining 1,84 87,62
    A549+1µCov2 S1 2,29 65,24
    A549+2µCov2 S1 2,90 70,55
    A549+5µCov2 S1 4,23 88,75
  • Im Vergleich von ungefärbten („unstained A549“) und gefärbten A549-Kontroll-Zellen („A549 control staining“) wird eine geringe Hintergrundfärbung gemessen. Gefärbte A549-Kontroll-Zellen sind Zellen, die nicht mit Cov2 S1-Protein stimuliert wurden, sondern mit einem Fitc markierten Antikörper zur Anfärbung behandelt wurden. Unter Berücksichtigung dieser Kontrollen war das Signal des gebundenen Spike-Proteins bereits nach Stimulation der Zellen mit 1 µg Cov2 S1 nachweisbar. Durch Verwendung höherer Mengen des Proteins war eine erhöhte Proteinbindung an den A549-Zellen nachweisbar.
  • Somit kann mittels dieses Assays eine konzentrationsabhängige Bindung einer Bindungsdomäne, wie Cov2 S1, an ACE-exprimierenden Zellen, wie A549, nachgewiesen werden und eine Substanz auf ihre Wirkung hin untersucht werden, die Bindung von Cov2 S1 an A549-Zellen zu hemmen.
  • Der Assay kann in abgewandelter Form unter Verwendung der nachfolgend genannten Zelllinien durchgeführt werden. Jede Zelllinien, welche das Angiotensin-konvertierende Enzym 2 (ACE2), die Aminopeptidase N (APN) und/oder Dipeptidylpeptidase 4 (DPP4) exprimiert ist eine geeignete Zelllinie im Sinne des erfindungsgemäßen Assays. Die detaillierten Eigenschaften der nachstehend aufgeführten Zelllinien können unter anderem im Proteinatlas: https://www.proteinatlas.org/ENSG00000130234-ACE2/cell nachgeschlagen werden und sind dem Fachmann bekannt.
  • Tabelle 5: ACE-Rezeptor exprimierende Zelllinien
    Bezeichnung ACE2 Herkunft Anbieter (Beispiele der Verfügbarkeit)
    COS7 + Niere (Affe) Creative biogene CSC- RO0290, LGCStandards ATCC® CRL-1651 ™
    Hek293 + humane Niere Creative biogene CSC- RO0292/ LgcStandards ATCC® CRL-1573™
    Hek293T + humane Niere Creative biogene CSC- RO0641 LgcStandards ATCC® CRL-11268™
    Hep2G + Leber LgcStandards ATCC® HB-8065™
    HUVEC + Endothel LgcStandards ATCC® CRL-1730™
    RPMI-8226 + Peripheres Blut LgcStandards ATCC® CCL-155™
  • Bevorzugt wird in dem Assay ein geeigneter Antikörper mitgeführt, der die Expression des Rezeptors auf der Zelloberfläche nachweist. Zelllinien, die eine geringe mRNA Expression für ACE aufweisen, werden in DMEM mit mindestens 10 % FCS kultiviert. Hep 2G-Zellen weisen eine hohe Expression der RNA für ACE auf. HUVEC Zellen exprimieren ACE2 und werden in Vascular Cell Basal Medium unter Verwendung des Endothelial Cell Growth Kit-(ATCC) kultiviert. Als Kontrolle werden MRC5 Zellen mitgeführt, die den ACE-Rezeptor nicht exprimieren. Darüber hinaus wurde in Hoffmann et al. 2020 gezeigt, dass sie Zellen nicht durch SARS CoV2 infiziert werden, Daher stellen die MRC5- Zellen eine hervorragende Kontrolle für die Spezifität des verwendeten Bindungsassay dar. MRC5 Zellen werden in DMEM mit 10% FCS kultiviert.
  • Die HUVEC-Zelllinie, die für ACE-Inhibition-tests bereits verwendet wird (Don et al.), ist besonders geeignet, um den Nachweis einer potentiellen Covid-19-Endotheliaiits wie derzeit diskutiert zu erbringen und den positiven Effekt erfindungsgemäßer kompatibler Solute, wie dem Ectoin, zu zeigen.
  • Im Bindungsversuch werden die vorgenannten Zelllinien mit den in Tabelle 6 gezeigten CoV2 S1-Konzentrationen inkubiert.
  • Beispiel 3: Einfluss von Ectoin auf die Bindung des SARS-Cov2-S1-Proteins an A549 Zellen
  • Tabelle 6: kompatibles Solut + CoV2 S1
    Konzentration [%] kompatibles Solut Gehalt CoV2 S1 [µg]
    20 5 2 1 0
    15 5 2 1 0
    10 5 2 1 0
    5 5 2 1 0
    2,5 5 2 1 0
    1,25 5 2 1 0
    0 5 2 1 0
  • Um zu untersuchen, ob Ectoin einen Einfluss auf die Bindung des Cov2 S1 Proteins an A549 Zellen hat, wurden abgelöste Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen eines erfindungsgemäßen Soluts, wie Ectoin, untersucht. Dazu wurden die Zellen mit dem jeweiligen Solut vorinkubiert und anschließend mit unterschiedlichen Konzentrationen des Cov2 S1 Proteins behandelt (siehe Beispiel 1 und 2).
  • In diesem „proof-of-concept“ Versuch mit n=1 konnte bereits in Anwesenheit von 2,5 % Ectoin eine geringere Fluoreszenz des an A549-Zellen gebundenen Cov2 S1 Proteins gemessen wurde (Daten nicht gezeigt). Dies deutet auf eine reduzierte Bindung des Cov2 S1 Proteins an A549 Zellen in Anwesenheit von Ectoin. Im Vergleich zu Ectoin wurde für NADA kein Einfluss auf die Bindung zwischen Cov2 S1 und den A549-Zellen festgestellt. Sowohl der Versuchsansatz [1,25/2,5% NADA + 5 µg Cov2 S1 + A549] sowie [5 µg Cov2 S1 + A549] zeigen dieselbe mittlere Fluoreszenz (vgl. 2 und 3). Somit scheint NADA die Bindung des Virus an die Wirtszelle nicht zu beeinflussen.
  • Um den Versuch zu verifizieren wurde die Konzentrationen von 1,25 % und 2,5 % wiederholt und 5 % des jeweiligen Soluts zusätzlich untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt.
  • Tabelle7: MFI-Werte zu Fig. 4. Der entsprechende Variationskoeffizient in Prozent (CV%) der Fluoreszenzintensität der Zellen wird ebenfalls angegeben.
    5% Ectoin MFI CV%
    Without Cov2 S1 2,23 181,07
    1µCOV2 S1 2,07 88,77
    2µCov2 S1 2,17 134,70
    5µCov2 S1 2,43 123,09
    2.5% Ectoin MFI CV%
    Without Cov2 S1 2,03 131,63
    1µCov2 S1 2,43 142,38
    2µCov2 S1 3,15 174,07
    5µCov2 S1 2,61 159,93
    1.25% Ectoin MFI CV%
    Without Cov2 S1 2,17 117,24
    1µCov2 S1 3,09 151,13
    2µCov2 S1 2,21 152,85
    5µCov2 S1 3,25 144,79
    5% γ-NADA MFI CV%
    Without Cov2 S1 1,77 102,48
    1µCov2 S1 2,52 113,55
    2µCov2 S1 2,68 124,69
    5µCov2 S1 3,51 121,95
    2.5% γ-NADA
    Without Cov2 S1 1,62 101,84
    1µCov2 S1 2,35 129,73
    2µCov2 S1 2,99 144,33
    5µCov2 S1 4,26 130,39
    1.25% γ-NADA MFI CV%
    Without Cov2 S1 1,61 83,86
    1µCov2 S1 2,33 126,42
    2µCov2 S1 3,06 142,59
    5µCov2 S1 4,06 154,67
  • Bei 5 % Ectoin konnte eine vollständige Hemmung der Bindung des Cov2 S1 Proteins an A549 Zellen gezeigt werden. Im Vergleich dazu konnte mit NADA keine Hemmung erzielt werden. Hier steigt die mittlere Fluoreszenz in Anwesenheit von 1,25 %, 2,5% oder 5 % NADA vergleichbar an, wie die mittlere Fluoreszenz des Versuchssatzes ohne ein kompatibles Solut (vgl. 2).
  • Beispiel 4: Einfluss von Glycoin und Ectoin auf die Bindung des SARS-Cov2-S1-Proteins
  • Zu Beispiel 3 analoge Versuche werden mit den Zelllinien HUVEC, HEK293, RPMI-8226 und Hep G2 (Tabelle 5) durchgeführt. Als kompatible Solute werden Ectoin und Glycoin in unterschiedlichen Konzentrationen (Tabelle 3) getestet.
  • Beispiel 5: Einfluss von Glycoin, Mannosylglycerat, Hydroxyectoin und Ectoin auf die Bindung des SARS-Cov2-S1-Proteins
  • Zu Beispiel 3 analoge Versuche werden mit den Zelllinien HUVEC, HEK293, RPMI-8226 und Hep G2 (Tabelle 5) durchgeführt, wobei die Zellen nicht mit Ectoin vorinkubiert werden, sondern eine zeitgleiche Gabe von Ectoin oder Glycoin und Cov2 S1 Protein erfolgt. Als Solute werden Ectoin, Hydroxyectoin, Mannosylglycerat und Glycoin in unterschiedlichen Konzentrationen (Tabelle 3) getestet.
  • Als weiteren Ansatz erfolgt eine Vorinkubation des Cov2 S1 Protein mit Ectoin oder Glyocin und anschließend eine Inkubation der Zellen mit dem vorinkubierten Ansatz [Cov2 S1 Protein + Ectoin] in unterschiedlichen Konzentrationen gemäß Tabelle 3. Die Vorinkubation [Cov2 S1 Protein + Ectoin] erfolgt für 5 min, 10 min und 30 min jeweils bei RT. Anschließend erfolgt die Analyse wie in Beispiel 3 analog. Der Versuch wird mit den Zelllinien HUVEC, HEK293, RPMI-8226 und Hep G2 (Tabelle 5) durchgeführt
  • Beispiel 6: Berechnung der Zunahme der relativen Fluoreszenz
  • Um die Experimente vergleichbar zu machen, wurde der Anstieg der Fluoreszenz von A549-Zellen aufgrund der Bindung des Cov2 S1-Proteins an die Zelloberfläche berechnet, indem die mittlere Fluoreszenzintensität der Zellen durch die mittlere Fluoreszenzintensität der Hintergrundfärbung dividiert wurde. Für die Ermittlung der Hintergrundfärbung wurden die Zellen mit einem Antikörper in Abwesenheit von Cov2 S1 gefärbt. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt.
  • Es ist zu sehen, dass in Abwesenheit eines kompatiblen Soluts eine konzentrationsabhängige Zunahme der mittleren Fluoreszenz (fold Floureszenz) bei Zugabe des Cov2 S1-Proteins an A549-Zellen nachgewiesen wird. Während Ectoin bereits bei 1,25 % eine positive Wirkung zeigt und die Bindung des Cov2 S1-Proteins an A549-Zellen hemmt, kann für NADA bei gleicher Konzentration keine signifikante Wirkung nachgewiesen werden. Die Wirkung von Ectoin verstärkt sich mit zunehmender Konzentration und erzielt bei 5 % Ectoin eine vollständige Hemmung der Bindung. Im Vergleich dazu wird mit 5 % NADA eine geringe Hemmung der Bindung gezeigt.
  • Beispiel 7: Atomkraftspektroskopie zur Bestimmung des Effekts von kompatiblen Soluten auf die Stabilität von Membranen
  • Auf der Grundlage der Methode nach Roychoudhury et al. wird zum Nachweis einer Bindung zwischen einem viralen membranständigen Protein, insbesondere Peplomer, und einem humanen membranständigen Oberflächenprotein ein Verfahren mittels Atomkraftmikroskopie durchgeführt. Das Verfahren basiert auf den folgenden Schritten.
  • Die zu testende Bindungsdomäne oder das vollständige Protein wird an einer Oberfläche gebunden. Die Oberfläche kann dabei eine Membran sein und sogar eine ganze Zelle, welche den Rezeptor, wie ACE2, APN und/oder DPP4 exprimiert. Es werden mindestens zwei unterschiedliche Ansätze getestet, ein Ansatz enthält den humanen viralen Rezeptor mit einem kompatiblen Solut (Ectoin 1 M) in einem Puffer (300 mM KCl und 20 mM Tris bei pH 7,8) und ein Ansatz den humanen viralen Rezeptor im Puffer ohne Solut. In einem nächsten Schritt wird die Spitze des atomar führbaren Arms (AFM tip) der Vorrichtung (AFM Gerät von Asylum Research, Olympus OMCL TR400 Siliziumnitrid Canilever mit einer Federkonstante von 20 pN / nm) mit einer viralen Rezeptorbindungsdomäne versehen, vorzugsweise S1, oder dem ganzen Protein, vorzugsweise des SARS-CoV-2. Das Protein weist eine HIS-Markierung auf. Anschließend wird diese Spitze der gebundenen Probe (viraler Rezeptor mit/ohne Solut) angenähert und schrittweise in Kontakt gebracht. Während des Annäherns sowie während des Entfernens von dem gebundenen Protein wird die Newton Kraft gegen die Distanz zwischen den potentiellen Bindungspartnern - hier ACE2 und S1 - ermittelt und als Kraftkurve aufgezeichnet (Rückzugsgeschwindigkeit von 400 nm/s).
  • Die gemessene Kraft der Versuchsansätze mit Solut im Vergleich zu ohne Solut erlauben Rückschlüsse auf molekulare Interaktionen zwischen einem membrangebundenen Protein, wie ACE2, und dem potentiellen Bindungspartner, wie das SARS-CoV-2 Protein, und Aussagen über die abschirmende Wirkung der Solute auf membrangebundene Protein , wie es für Ectoin bereits in Roychoudhury et al. gezeigt wurde. Die Methode ist geeignet, alle kompatiblen Solute zu testen.
  • Die Atomkraftspektroskopie wird beispielhaft mit folgenden Kombinationen durchgeführt
    Ectoin - Spike S1 Protein
    Hydroxyectoin - Spike S1 Protein
    Glycoin - Spike S1 Protein
    Mannosylglycerat - Spike S1 Protein
  • Beispiel 8: Beispiele von Formulierungen des Soluts im Sinne der Erfindung A-1) Solut haltige Inhalatlösung 13%
  • Das Ziel eines Inhalats im Sinne der Erfindung ist es die Lungenoberfläche möglichst gut und großflächig mit einer dünnen Ectoin-Hydrat-Schicht zu benetzen. Eine theoretisch maximal und komplett benetzte Lunge wird unter Heranziehung der Daten von Hahn et al. und Roychoudhury et al berechnet.
  • Die Fläche eines hydratisierten Ectoins: 3,5e10-10 m *3,5e10-10 m * 3,14 = 3,85e10-19 m2 (Kreisformel). Abstand Ectoin zu einem Wassermolekül = 0,35 nm
  • Bei Annahme, dass dies gleich dem Radius ist und die Oberfläche der Lunge = 100 - 150 m2 wird für eine vollständige Belegung der Fläche berechnet, dass 2,6e1020 Ectoin-Moleküle erforderlich sind um eine einschichtige Hydrathülle zu erzielen. Für zwei Hydrathüllen wären 5,2e1020 Ectoin-Moleküle erforderlich
  • Zu berücksichtigen ist, dass vorstehende Berechnung für eine eher kleine Lunge gilt und die Fläche bis zu 1,5 fach größer sein kann. Der angenommen Radius des hydratisierten Ectoins mit 0,35nm ist der dichtest mögliche Zustand. Bei weniger dichtem Zustand (r = 0,8 nm) wäre weniger Ectoin erforderlich. Daher ist die vorliegende Rechnung lediglich als indikativ zu betrachten und im Einzelfall ggf. an Größe und/oder Alter des Patienten anzupassen.
    Molekulargewicht Ectoin: 142,16 g/mol
    1 mol = 6,022e1023 Teilchen
    Menge Ectoin = 5,2e1020 / (6,022e1023 × mol-1) = 0,864e10-3 mol = 0,123 g Ectoin
  • Bei einer 13% Lösung (130 g/l) wären das 0,00094 I bzw. 0,94 mL
  • Damit wäre eine effektiv in der Lunge ankommende Dosis zwischen 1 - 1,5 mL einer 13 %igen Solut haltigen Inhalatlösung erforderlich, damit Ectoin theoretisch homogen in der Lunge verteilt wird. Diese ermittelte Konzentration beruht auf der Annahme einer einmaligen Applikation
  • A-2) Solut haltigen Inhalatlösung 3,9%
  • Ausgehend von einer 3,9 %-igen Solut haltigen Inhalatlösung wäre eine dreimalige Applikation, z. B über den Tag verteilt, erforderlich um eine zur 13 %-igen Lösung vergleichbare Dosis zu erzielen.
  • A) Infusionslösung 4 %
  • Eine isotonische NaCI-Lösung von 0,9% hat eine osmolare Aktivität von 286 mOsmol/kg H2O. Eine 2% ige Ectoinlösung hat eine Osmolarität vom 147 mOsmol/kg H2O. Damit hat eine isotonische Ectoinlösung eine Konzentration von 3,89%.
  • Eine isotonische Infusionslösung ist bevorzugt, um das Gewebe nicht zu irritieren oder zu schädigen. Daher beträgt eine isotonische Ectoin-Infusionslösung 3,89 % Ectoin. Eine weitere Kombination ist eine Ectoin-Infusionslösung in Kombination mit einer zur Infusion geeigneten NaCI-lösung. Ein solches Produkt enthält eine geringe Menge an NaCl in Kombination mit einer angepassten Ectoinlösung, sodass insgesamt eine isotonische Ectoin-NaCI-Infusionslösung vorliegt.
  • Mit den anderen Soluten im Sinne der Erfindung können entsprechende Infusionslösung gemäß ihrer Osmolarität berechnet werden.
    Solut Solut [%] NaCl [%]
    Ectoin 3,0 3,5 3,8 4 0,9++
    Hydroxyectoin * * * * 0,9++
    Betain * * * * 0,9++
    Glycoin * * * * 0,9++
    *entsprechend der Osmolarität zu ermitteln bzw. ++auf eine physiologisch verträgelich Lösung anzupassen
  • I.v. Pharmakokinetik Studie von Ectoin/kg in der Ratte
  • In einer i.v. Pharmakokinetik Studie wurde eine Ectoinmenge von 100 mg/kg in der Ratte eingesetzt. Orale Toxdaten geben einen NOAL von 2000 mg/kg Körpergewicht/Tag an. Oral aufgenommenes Ectoin (1000 mg/kg) ergaben in der Ratte eine Plasmakonzentration von 99 µg/ml.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims (21)

  1. Kompatibles Solut oder Solutgemisch zur Verwendung bei der Prävention oder Behandlung von durch ss(+)RNA-Viren der Familie Coronavriridae verursachten Erkrankungen, worin das mindestens eine kompatible Solut ausgewählt wird aus organischen und hoch wasserlöslichen Verbindungen.
  2. Kompatibles Solut oder Solutgemisch zur Verwendung nach Anspruch 1, worin das mindestens eine Solut eine Wasserbindungskapazität von größer gleich 7 mol/mol H2O/Solut aufweist.
  3. Kompatibles Solut oder Solutgemisch zur Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das mindestens eine Solut ausgewählt wird aus Glycerylglucosid (Glycoin), Glycin-Betain, Mannosylglycerat (Firoin), Mannosylglycramid (Firoin-A), Ectoin und seinen Derivaten der Formel I und/oder II sowie den physiologisch verträglichen Salzen, Amiden und Estern der vorgenannten Verbindungen, wobei
    Figure DE102020112603A1_0003
    Figure DE102020112603A1_0004
     R1 = H oder Alkyl, R2 = H, COOH, COO-Alkyl oder CO-NH-R5, R3 und R4 jeweils unabhängig voneinander H oder OH, R5 = H, Alkyl, ein Aminosäurerest, Dipeptidrest oder Tripeptidrest n = 1, 2 oder 3, Alkyl = einen Alkylrest mit C1-C4 Kohlenstoffatomenbedeuten.
  4. Kompatibles Solut oder Solutgemisch zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Erkrankung durch ein ss(+)RNA-Virus aus der Gattung Betacoronavirus und/oder Alphacoronavirus ausgelöst wird.
  5. Kompatibles Solut oder Solutgemisch zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Erkrankung durch ein ss(+)RNA-Virus verursacht wird, welches ausgewählt wird aus SARS-CoV-1, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 und/oder HCoV-229E.
  6. Kompatibles Solut oder Solutgemisch zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die virale Erkrankung eine Infektion und/oder Entzündung der Übergangsepithelgewebe und/oder inneren Epithelgewebe umfasst.
  7. Kompatibles Solut oder Solutgemisch zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die virale Erkrankung eine Infektion und/oder Entzündung des Endothels umfasst.
  8. Kompatibles Solut oder Solutgemisch zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das ss(+)RNA-Virus mit mindestens einem membrangebundenen Protein oder Bestandteil davon auf humanen Zellen interagiert und dieses Protein oder den Bestandteil davon als Rezeptor zur Bindung an die Zelle nutzt.
  9. Kompatibles Solut oder Solutgemisch zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das ss(+)RNA-Virus mit einem Rezeptor ausgewählt aus Angiotensin-konvertierendem Enzym 2 (ACE2), Aminopeptidase N (APN) und/oder Dipeptidylpeptidase 4 (DPP4) interagiert.
  10. Kompatibles Solut oder Solutgemisch zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das mindestens eine kompatible Solut das Entfalten und/oder Öffnen des zur Bindung an den humanen Rezeptor geeigneten viralen Proteins des ss(+)RNA-Virus reduziert oder verhindert.
  11. Kompatibles Solut oder Solutgemisch zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin die Vermehrung des ss(+)RNA-Virus reduziert oder verhindert wird.
  12. Kompatibles Solut oder Solutgemisch zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin das mindestens eine kompatible Solut die Membran der Übergangsepithelien, der inneren Epithelgewebe und/oder des Endothels abschirmt.
  13. Kompatibles Solut oder Solutgemisch zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin das mindestens eine Solut in Kombination mit anti-viralen Verbindungen, entzündungshemmenden Verbindungen, Interleukin-Blockern, entzündungshemmenden Anti-Zytokinen, Inhibitoren der viralen Rezeptoren und/oder Vaccinen verabreicht wird.
  14. Kompatibles Solut oder Solutgemisch zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin das mindestens eine Solut bei Patienten angewendet wird, welche aus Regionen mit hoher Feinstaubbelastung stammen, einer Berufsgruppe mit hoher Feinstaubbelastung angehören, eine Gefäßvorerkrankung und/oder chronische Atemwegserkrankungen aufweisen.
  15. Zusammensetzung enthaltend mindestens ein Solut oder Solutgemisch zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin das mindestens eine kompatible Solut oder das Solutgemisch mit einem Anteil von größer gleich 0,0001 Gew.-% bis kleiner gleich 70 Gew.-% in der Zusammensetzung vorliegt, bezogen auf den Gesamtgehalt der Zusammensetzung.
  16. Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 15, welche vorliegt i) in festen Formen umfassend Pulver, Granulat, Kapseln, Lutsch- und Brausetabletten, ii) in flüssigen Formen umfassend Lösung, Injektion, Infusion und Suspension, und/oder iii) als Gemisch umfassend Spray, Aerosole und Inhalat.
  17. Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, welche in flüssiger Form als Infusionslösung vorliegt oder in flüssiger Form, welche geeignet ist zur Verwendung mit einem Vernebler und/oder Respirator.
  18. Zusammensetzung zur Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, worin bei der Prävention oder Behandlung von durch ss(+)RNA-Viren der Familie Coronavriridae verursachten Erkrankungen eine Infusion in Kombination mit einem Inhalat verabreicht wird.
  19. Ein Kit umfassend - mindestens eine gebrauchsfertige Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 18 zur Inhalation und - eine Vorrichtung zur Verabreichung der Zusammensetzung.
  20. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 18 zur Verwendung in einer Vorrichtung zur kontrollierten Abgabe der Zusammensetzung, wobei - die Vorrichtung zur Erzeugung von Aerosolen der Zusammensetzung geeignet ist, - eine Inhalation der Zusammensetzung über Mund und/oder Nase ermöglicht, - eine dosierte Abgabe eines definierten Sprühstoßes einer flüssigen oder trockenen Zusammensetzung gewährleistet, - eine dosierte Abgabe einer flüssigen Zusammensetzung in die Augen gewährleistet, und/oder - ein Versprühen der Zusammensetzung im Mundraum, Rachen und/oder Nasenraum ermöglicht.
  21. Verfahren zur Identifikation eines kompatible Soluts nach einem der Ansprüche 1 bis 14, umfassend die Schritte - Bereitstellen einer Zelllinie, welche membranständige Oberflächenproteine als potentiell virale Rezeptoren aufweist, - In Kontakt bringen der Zellen mit einer Verbindung, welche potentiell ein kompatibles Solut nach einem der Ansprüche 1 bis 14 ist, - Hinzufügen einer viralen Rezeptorbindungsdomäne, welche ein messbares Signal umfasst, - Inkubation des Ansatzes, - Aufzeichnen des an der Zelle messbaren Signals und - Ermittlung einer reduzierten Bindung zwischen der viralen Rezeptorbindungsdomäne und dem humanen membranständigen Oberflächenprotein.
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