DE69935720T2

DE69935720T2 - Diamino-propanol-verbindungen zur behandlung von ischaemien

Info

Publication number: DE69935720T2
Application number: DE69935720T
Authority: DE
Inventors: Subroto Columbia CHATTERJEE
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 1998-07-27
Filing date: 1999-07-22
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2019-07-23
Also published as: US6511979B1; DE69935720D1; EP1098642A1; WO2000006145A1; CA2336549A1; JP2002521435A; ES2285852T3; EP1098642B1; EP1098642A4; AU756008B2; AU5224999A; ATE358473T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beinhaltet Verfahren zur Behandlung von Zuständen, die durch Lactosylceramid moduliert werden, und insbesondere die Verwendung einer oder mehrerer Verbindungen, welche die UDP-Galactose, GlcCer, β1→4-Galactosyltransferase-(GalT-2)-Aktivität verstärken, zur Behandlung eines Individuums, das unter Ischämie leidet oder dafür anfällig ist.
2. Hintergrund
Eine unzureichende Zellproliferation in einem Organismus kann die Entwicklung oder die Schwere einer Reihe von Zuständen modulieren. Man hat zum Beispiel die Erkenntnis gewonnen, dass bestimmte Zustände durch Erhöhen der Zellproliferation bei adulten oder präadulten Tieren behandelt oder verhindert werden können. Es wurde insbesondere vorgeschlagen, dass Zustände in Verbindung mit Infektion, Geschwürbildung, Degeneration (z.B. apoptotischem und nekrotischem Zelltod), Altern, Hämatopoese, Angiogenese, bestimmten Immunantworten, Zell- und Gewebereparatur durch Erhöhen der Proliferation spezifischer Zellen positiv beeinflusst werden können. Siehe allgemein Alberts, B., et al. (1989) in Molecular Biology of the Cell 2. Aufl. Garland Publishing Co. (New York und London); Kandel, E.R., et al. (1991) in Principles of Neuroscience, Appleton & Lange, (Norwalk, Connecticut); Cold Spring Harbor Conf. Cell Proliferation (1979), Cold Spring Harbor Laboratories, (New York); Tissue Growth Factors, (1981) R. Baseega, Hrsg., (Springer-Verlag, New York).
Die Proliferation bestimmter Tierzellen hat Interesse auf sich gezogen. Zum Beispiel wurde berichtet, dass die Proliferation von glatten Muskelzellen (SMCs), Epithelien und von anderer Intima die Gefäßentwicklung und -integrität beeinflusst, wie z.B. bei fehlerhafter Gefäßbildung und Bildung vaskulärer Läsionen. Zusätzlich wird angenommen, dass die Proliferation bestimmter Hautzellen die Reaktionen auf verschiedene Traumata, wie Verwundung (z.B. nach thermischer Verletzung), verstärkt. Es wird insbesondere erkannt, dass SMCs und Epithelien signifikante Rollen bei der Angiogenese spielen. Siehe z.B. Tissue Growth Factors, s.o.; Folkman und Shing (1992), J. Biol. Chem. 267:10931.
Die Proliferation von Zellen, die mit Herz, Gehirn, Leber, Niere, Auge und anderen Organen in Verbindung stehen, hat ebenfalls Aufmerksamkeit erregt. Es wurde zum Beispiel vorgeschlagen, dass eine Erhöhung der Anzahlen spezifischer Zellen bestimmte neurodegenerative Erkrankungen, wie solche, die das zentrale und periphere (z.B. das motorische) System beeinflussen, behandeln oder verhindern kann. Degenerative Erkrankungen der Retina und anderer Augenstrukturen können zu progressiver Verschlechterung des Sehens führen. Insbesondere wird angenommen, dass mit dem Alter zusammenhängende Makuladystrophien (z.B. Stargardt-Erkrankung) durch eine unzureichende Proliferation bestimmter Zellen, z.B. Makula, negativ beeinflusst werden. Es wurde vorgeschlagen, dass die Wirkung vieler, wenn nicht aller, neurodegenerativer Störungen durch Verstärkung der Proliferation spezifischer Zellen aufgehoben werden kann. Siehe z.B. Kusiak, J.W., et al (1996) Mol. Chem. Neuropathol. 153; Kandel, E.R., et al., s.o.; Neary et al. (1996) Trends Neurosci. (1996) 13.
Man kam zu der Erkenntnis, dass eine unzureichende Zelladhäsion ebenfalls zu einigen Zuständen beitragen kann. Man hat beispielsweise vorgeschlagen, dass die Blutkoagulation durch Adhäsion von Plättchen und möglicherweise anderen Blutzellen an verletzte Gefäße verstärkt wird. Zusätzlich wird angenommen, dass bestimmte Immunantworten, z.B. Entzündung in Verbindung mit der Abstoßung von Fremdkörpern, und die Rekrutierung von Immunzellen in vielen Fällen durch Zelladhäsion verstärkt wird. Eine erhöhte Adhäsion bestimmter Zellen kann ferner die Angiogenese nach Trauma, während der Entwicklung oder nach Transplantation verbessern.
Von einer Vielzahl synthetischer, semisynthetischer und natürlich vorkommender Zellmoleküle wurde berichtet, dass sie signifikante Rollen bei der Proliferation von Tierzellen spielen. Solche Moleküle sind u.a. bestimmte Cytokine, Wachstumsfaktoren, Zellrezeptoren, Matrixmoleküle, Enzyme, Secondmessenger-Moleküle (z.B. zyklische Nukleotide), Transkriptionsfaktoren und Mitogene, wie Phorbolester.
Andere Moleküle, wie Adhäsionsmoleküle, scheinen signifikante Rollen bei der Einleitung und Aufrechterhaltung eines geeigneten Zell-Zell-Kontaktes zu spielen.
Insbesondere haben Moleküle mit der Fähigkeit, zelluläre Wege zu modulieren, die Glykosphingolipide (GSLs) umfassen, erhebliches Interesse erweckt. von den GSLs wurde berichtet, dass sie neben anderen Funktionen Rollen bei der Proliferation und Adhäsion tierischer Zellen spielen. Siehe z.B. Chatterjee, S., Biochem. Biophys. Res Comm. (1991) 181:554; Hakomori, S.I. (1983) in Sphingolipid Chemistry, Hrsg. Kanfer, J.N., und Hakomori, S.I. (Plenum Press, New York); Obeid, L.M., et al. (1993) Science 259:1769 und die darin genannten Bezugsstellen.
Spezifische zelluläre Wege in Zusammenhang mit GSLs, wie Glucosylceramid (GlcCer) und Lactosylceramid (LacCer), wurden offenbart. Ein Weg umfasst beispielsweise die Synthese von GlcCer durch Kopplung von UDP-Glucose an Ceramid in einer Umsetzung, die von der UDP-Glucose-Glucosyltransferase (GlcT-1) katalysiert wird. Ein weiterer Schritt wandelt GlcCer in LacCer mithilfe der UDP-Galactose, GlcCer, β1→4-Galactosyltransferase (GalT-2) um. Siehe z.B. Chatterjee et al., s.o.
Es wurden Versuche unternommen, die Schritte zu hemmen, an denen GlcT-1 beteiligt ist. Es wurde zum Beispiel berichtet, dass das D-Enantiomer von 1-Phenyl-2-decanolylamino-3-morpholino-1-propanol (D-PDMP) GlcT- 1 hemmt und die Proliferation vaskulärer Zellen verringert. Es wurde berichtet, dass der Mechanismus der PDMP-Wirkung unklar ist. Siehe z.B. Felding-Habermann, B., et al. (1991) Biochemistry 29:6314; Shukla, G.S., et al. Biochem. Biophys. Acta (1991) 1083:101; Inokuchi, J., et al., J. Lipid. Res. (1987) 28:565; und Chatterjee, S., s.o.
Spezifische Morpholinoceramide wurden ebenfalls als GlcT-1-Inhibitoren offenbart. Siehe Carson, K., und B. Ganem (1994) Tetrahedron Lets. 35:2659.
Es wird angenommen, dass erhöhte Spiegel an LacCer die Proliferation von bestimmten Tierzellen, wie glatten Muskelzellen der Aorta und speziellen Melanomzellen, verstärken. Siehe z.B. Chatterjee, S., s.o., und Noirijiri, H., et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:443.
Somit wäre es wünschenswert, über wirksame Verfahren zur Modulation der Spiegel von LacCer zu verfügen, z.B. durch Verstärken der GalT-2-Aktivität. Es wäre insbesondere nützlich, über therapeutische Verfahren zur Erhöhung der LacCer-Spiegel zu verfügen, um Zustände oder Erkrankungen zu behandeln oder zu verhindern, die von Lactosylceramiden beeinflusst werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Wir haben jetzt Therapien zur Behandlung oder Vorbeugung von Ischämie entdeckt. Insbesondere haben wir Therapien entdeckt, die eine Erhöhung der Aktivität der UDP-Galactose, GlcCer, β1→4-Galactosyl-transferase (GalT-2) beinhalten.
Genauer gesagt, stellt die Erfindung die Verwendung einer GalT-2-verstärkenden Verbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung oder Vorbeugung von Ischämie bereit.
Erfindungsgemäße Therapien sind besonders wirksam zur Verstärkung der Gewebereparatur und zur Behandlung oder Vorbeugung von ungewünschter Degeneration, an der insbesondere Zellen beteiligt sind, wie Neuronen des zentralen (ZNS) oder peripheren (PNS) Nervensystems, einschließlich des Auges. Bei einem erfindungsgemäßen Protokoll kann eine Erhöhung der Zellproliferation nach Zell- oder Gewebekontakt mit einer oder mehreren erfindungsgemäßen Zusammensetzungen beobachtet werden, wohingegen eine Kontrolle viel weniger Proliferation zeigt. Die vorliegende Erfindung umfasst insbesondere eine Vielzahl an In-vitro- und In-vivo-Protokollen zum Testen der Zusammensetzungen, wie in der folgenden Beschreibung und den folgenden Beispielen dargelegt.
LacCer-modulierte Zustände, die erfindungsgemäß verstärkt werden können, beinhalten ferner die Angiogenese (Neuvaskularisierung) und die Reaktion auf verschiedene Traumata, z.B. Geschwürbildung von glatten Muskel- und verwandten Zellen; Gewebereparatur, insbesondere als Reaktion auf Verbrennung oder Schnitt; und Transplantation.
Die Verwendung einer GalT-2-verstärkenden Verbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Ischämie bei einem Individuum, insbesondere einem Säuger, wie einem Primaten und insbesondere einem Menschen, der einer Behandlung bedarf, einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung, welche die GalT-2-Aktivität fördern kann. Vorzugsweise erhöht eine verabreichte Verbindung in einem Standard-in-vitro-Zellproliferationsassay die Zellproliferation um mindestens etwa 15% oder 25%. Beispiele für einen derartigen Assay sind nachstehend beschrieben. Im Allgemeinen ist bevorzugt, dass die verabreichte Verbindung eine EC₅₀ von mindestens etwa 10 μM in einem Standard-in-vitro-GalT-2-Assay, wie nachstehend definiert, stärker bevorzugt eine EC₅₀ von mindestens etwa 1 μM oder weniger, noch stärker bevorzugt eine EC₅₀ von etwa 0,001 μM oder weniger in einem Standard-in-vitro-GalT-2-Assay, wie nachstehend definiert, aufweist. Wie hier definiert, ist die EC₅₀ eine Konzentration der die Zellproliferation verstärkenden Verbindung, die eine mindestens 10%ige bis 20%ige Stimulation der Zellproliferation in Bezug auf eine geeignete Kontrolle, wie nachstehend beschrieben, aufweist. Verbindungen, welche die GalT-2-Aktivität verstärken können, werden hier allgemein als "GalT-2-verstärkende Verbindungen" oder mit einem anderen ähnlichen Begriff bezeichnet.
Verbindungen, die sich für die Verwendung zur Herstellung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Ischämie eignen, sind im Allgemeinen linksdrehend und beinhalten diejenigen der folgenden Formel I:
wobei R, R¹, R² und R³ wie nachstehend definiert sind; sowie pharmazeutisch annehmbare Salze solcher Verbindungen.
Der Begriff "linksdrehend" (im Gegensatz zu "rechtsdrehend") wird hier verwendet, um Verbindungen der Formel I zu bezeichnen, welche die Fähigkeit besitzen, polarisiertes Licht gegen den Uhrzeigersinn zu drehen, d.h. in die L- oder (-)-Richtung, wie nachstehend spezifisch definiert. Bevorzugte Verbindungen der Formel I zeigen eine spezifische optische Drehung von mindestens –5, 10, –20, –30, –50, –100, –200 bis zu etwa –300 Grad in Bezug auf eine geeignete optisch inaktive Verbindung.
Speziell bevorzugte verstärkende Verbindungen für die Verwendung bei den erfindungsgemäßen Therapieverfahren sind u.a. L-Enantiomere der folgenden Verbindungen:
1-Phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol;
1-Phenyl-2-hexadecanoylamino-3-morpholino-1-propanol;
1-Phenyl-2-hexadecanoylamino-3-piperidino-1-propanol;
1-Phenyl-2-hexadecanoylamino-3-pyrrolidino-1-propanol;
1-Morpholino-2-hexadecanoylamino-3-hydroxyoctadec-4,5-en
und
1-Pyrrolidino-2-hexadecanoylamino-3-hydroxyoctadec-4,5-en.
Besonders bevorzugte Inhibitorverbindungen für die Verwendung bei den erfindungsgemäßen Verfahren sind L-1-Phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol (L-PDMP) und trans-1-Pyrrolidino-2-hexadecanoylamino-3-hydroxyoctadec-4,5-en.
Weitere geeignete GalT-2-verstärkende Verbindungen können durch einfaches Testen, z.B. durch In-vitro-Testen, eines Kandidaten für eine GalT-2-verstärkende Verbindung im Vergleich zu einer Kontrolle hinsichtlich der Fähigkeit, die GalT-2-Aktivität zu fördern, z.B. um mindestens 10% mehr als eine Kontrolle, leicht identifiziert werden.
Verfahren zum Nachweis und zur Analyse von Verbindungen, welche die GalT-2-Aktivität fördern und therapeutisches Vermögen zur Behandlung oder Verbeugung der vorstehend beschriebenen Zustände zeigen, sind hier beschrieben. Bevorzugte Nachweis- und Analyseverfahren sind u.a. sowohl In-vitro- als auch In-vivo-Assays zur Bestimmung des therapeutischen Vermögens von Mitteln zur Modulation von LacCer-responsiven Zellen.
Bevorzugte In-vitro-Nachweisassays beinhalten einen oder mehrere Schritte, die an Wegen beteiligt sind, die mit LacCer zusammenhängen. Solche Assays beinhalten die folgenden Schritte 1) bis 4):

1) Kultivieren einer Population LacCer-responsiver Zellen mit LacCer;
2) Zugabe einer bekannten oder eines Kandidaten für eine GalT-2-verstärkende Verbindung zu den Zellen;
3) Messen der Aktivität eines Zellmoleküls oder einer Zellfunktion in dem mit LacCer zusammenhängenden Weg und
4) Bestimmen der Wirkung der bekannten oder des Kandidaten für eine GalT-2-verstärkende Verbindung auf die Zelle, z.B. durch Messen der Aktivität des Zellmoleküls oder der Zellfunktion. Üblicherweise ist die Zellfunktion eine oder mehrere aus Zellproliferation, Zelladhäsion oder Expression spezifischer Oberflächenproteine auf den Zellen.

Beispiele für Zellmoleküle sind u.a. LacCer-responsive Enzyme, wie nachstehend genauer angegeben.
Der Assay kann die Fähigkeit der GalT-2-verstärkenden Verbindung, die GalT-2-Aktivität zu fördern, effizient messen. Bezugnahmen hierin auf einen "Standard-in-vitro-GalT-2-Assay" oder ein anderer ähnlicher Ausdruck betreffen das vorstehende Protokoll der Schritte 1) bis 4), wenn das im vorstehenden Schritt 3) gemessene spezifische Zellmolekül GalT-2 ist. Wie nachstehend in mehr Einzelheiten beschrieben wird, messen andere erfindungsgemäße In-vitro-Assays spezifische Zellmoleküle in den mit LacCer zusammenhängenden Schritten oder Wegen. Die erfindungsgemäßen In-vitro-Assays können mit fast jeder Population LacCer-responsiver Zellen durchgeführt werden, wie nachstehend bereitgestellt.
Geeignete LacCer-responsive Zellen, die verwendet oder hinsichtlich der Kompatibilität mit dem Standard-in-vitro-GalT-2-Assay getestet werden können, sind u.a. Zellen, die mit der Gefäßintima in Zusammenhang stehen, insbesondere Endothel- und glatte Muskelzellen; Nierenzellen, Neuronen, Glia- sowie bestimmte Immunzellen, wie Leukozyten. Die Zellen können je nach Wunsch immortalisiert, kultiviert oder Primärzellen sein. Zusätzlich können auch Gewebeschnitte oder Organe verwendet werden.
Es ist zwar allgemein bevorzugt, dass in dem Assay ganze Zellen verwendet werden, aber in einigen Fällen kann ein Lysat von solchen Zellen oder von Gewebe oder eine im Wesentlichen gereinigte Fraktion des Lysats eingesetzt werden. Bevorzugte LacCer-Lysate oder subzelluläre Fraktionen beinhalten GalT-2.
Die In-vitro-Nachweisassays können an die beabsichtigte Verwendung angepasst werden. Wie vorstehend gesagt, wurde zum Beispiel gefunden, dass LacCer Veränderungen in bestimmten Zellfunktionen, wie Zellproliferation und Zelladhäsion, manifestiert. Somit kann der vorstehende Standard-in-vitro-GalT-2-Assay derart modifiziert werden (z.B. im Schritt 3), dass er die Messung einer Erhöhung der Zellproliferation oder -adhäsion (oder von beidem) als Reaktion auf das zugegebene LacCer umfasst, und dass jegliche Wirkung der GalT-2-verstärkenden Verbindung auf die Zellfunktion bestimmt wird. Die in dem Assay getestete bekannte oder der Kandidat für eine GalT-2-verstärkende Verbindung kann als einziger Wirkstoff oder in Kombination mit anderen Mitteln, einschließlich anderer zu testender GalT-2-verstärkender Verbindungen, eingesetzt werden. In den meisten Fällen werden die In-vitro-Assays mit einem geeigneten Kontrollassay durchgeführt, der in der Regel die gleichen Testbedingungen umfasst, wie bei den vorstehenden Schritten, aber ohne Zugabe der GalT-2-verstärkenden Verbindung zum Medium. In solchen Fällen kann ein Kandidat für eine GalT-2-verstärkende Verbindung derart identifiziert werden, dass sie eine zumindest etwa 10 Prozent höhere Aktivität als die Kontrolle, stärker bevorzugt eine mindestens etwa 20% höhere Aktivität im Vergleich zum Kontrollassay und noch stärker bevorzugt eine 30%, 40%, 50%, 60%, 70, 80%, 100%, 150% oder 200 höhere Aktivität oder mehr im Vergleich zur Kontrolle aufweist.
Hier sind Assays zum Nachweis einer LacCer-responsiven Zelle beschrieben, wobei diese Zellen verwendet werden können. In einem Assay kann eine potenziell LacCer-responsive Zelle mit LacCer in Kontakt gebracht und dann kann ein gewünschtes Zellmolekül oder eine gewünschte Zellfunktion als Funktion der Menge an zugegebenem LacCer gemessen werden. In den meisten Fällen wird die Zelle als LacCer-responsiv angesehen, wenn der eingesetzte Assay mindestens etwa 10%, vorzugsweise mindestens etwa 20%, stärker bevorzugt mindestens etwa 50% und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 75% oder 100% Änderung der Aktivität des Moleküls oder der Zellfunktion (in Bezug zu einer Kontrolle) zeigt, wie durch die hier bereitgestellten Assays bestimmt. Die Assays können zur Identifikation einer LacCer-Reaktionsfähigkeit in einer Reihe von Zellen oder Geweben, einschließlich kultivierter Zellen (d.h. Primärzellen oder immortalisierter Zelllinien), Gewebeschnitten und Organen, verwendet werden.
Die In-vitro-Assays eignen sich besonders zum Nachweis potenzieller synergistischer Wirkungen zwischen einer bekannten oder einem Kadidaten für eine GalT-2-verstärkende Verbindung und einem oder mehreren anderen Molekülen, z.B. anderen GalT-2-verstärkenden Verbindungen, welche die Zellproliferation oder -adhäsion erhöhen können. Beispiele für solche potenziellen Moleküle sind u.a. Wachstumsfaktoren, Cytokine, Polypeptide, Peptide und insbesondere Peptidhormone sowie kleine Moleküle, wie zyklische Nukleotide und bestimmte Nukleoside.
Hier sind In-vivo-Assays zur Bestimmung des therapeutischen Vermögens einer bekannten oder eines Kandidaten für eine GalT-2-verstärkende Verbindung beschrieben, Zellfunktionen zu modulieren, die von LacCer beeinflusst werden, z.B. Zellproliferation, Zelladhäsion oder beides. Die untersuchte Zellfunktion kann geeigneterweise bereits in dem Versuchstier existieren, oder die Zellfunktion kann induziert werden, z.B. durch Verabreichen eines Arzneistoffs, der in der Lage ist, die Zellfunktion zu modulieren, oder mittels Durchführung eines invasiven chirurgischen Verfahrens, wie Angioplastie. Zusätzlich zu Zellproliferation und -adhäsion sind Zellfunktionen, die geeigneterweise getestet werden können, u.a. Gefäßremodellierung, Angiogenese, Regeneration von Zellen und Gewebe, einschließlich insbesondere Gewebereparatur, und Immunantworten, z.B. Rekrutierung spezifischer Immunzellen, wie B- und T-Zellen.
Weitere geeignete In-vivo-Assays beinhalten solche, die so gestaltet sind, dass sie die neurologische Gesamtfunktion in einem Versuchstier gemäß herkömmlichen Verfahren untersuchen. Zum Beispiel kann das therapeutische Vermögen einer gewünschten, bekannten oder eines Kandidaten für eine GalT- verstärkende Verbindung durch Untersuchen der ZNS- und/oder PNS-Funktion in dem Versuchstier getestet werden. Solche Tests sind im Fachgebiet bekannt und beinhalten Tests, die Wahrnehmung, Erkennung, motorische Fähigkeiten (z.B. Reflexe) und Sehen messen können.
Die In-vivo-Assays können nach Bedarf auf eine Reihe von Weisen modifiziert werden. Zum Beispiel kann bei bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, welche die Messung der Gefäßzellproliferation betreffen, ein der Analyse unterzogenes Gefäß nach Entnahme aus dem Tier in vitro oder, wenn gewünscht, in vivo getestet werden. Bei den meisten Ausführungsformen wird die Aktivität der GalT-2-verstärkenden Verbindung in einem gegebenen In-vivo-Assay mit einer geeigneten Kontrolle (z.B. einem scheinoperierten Tier) verglichen, bei dem der Assay wie der Testassay, aber ohne Verabreichung der GalT-2-verstärkenden Verbindung an das Testindividuum, durchgeführt wird. Man kann eine Vielzahl an Testindividuen einsetzen, insbesondere Säuger, wie Kaninchen, Primaten, verschiedene Nager und dergleichen.
Wie vorstehend erwähnt, können die Nachweisassays (entweder in vitro oder in vivo) an einer großen Vielfalt an LacCer-responsiven Zellen, Geweben und Organen durchgeführt werden. Ferner können die Assays geeignete GalT-2-verstärkende Verbindungen nachweisen, indem die Aktivität von Zielmolekülen und/oder Funktionen gemessen wird, die an Wegen beteiligt sind, die mit LacCer zusammenhängen. So können die erfindungsgemäßen Assays die Aktivität in mehreren Zell-, Gewebe- und Organumgebungen messen.
Signifikanterweise kann die Verwendung mehrerer Nachweisassays (z.B. einer Kombination aus den In-vitro– und/oder In-vivo-Assays) mit einer einzigen GalT-2-verstärkenden Verbindung die Selektivität und Empfindlichkeit je nach Wunsch erweitern.
Dieses Breitspektrumtesten bietet zusätzliche Vorteile. So können zum Beispiel erfindungsgemäße In- vitro-Assays effizient mehrfache Analysen durchführen und dadurch die Effizienz und Wahrscheinlichkeit der Identifikation von GalT-2-verstärkenden Verbindungen mit therapeutischem Vermögen erhöhen. Dies ist besonders nützlich, wenn große Anzahlen von Verbindungen getestet werden müssen. Zum Beispiel können Bibliotheken GalT-2-verstärkender Verbindungen durch Standardsyntheseverfahren, einschließlich Manipulationen des Typs der kombinatorischen Chemie, hergestellt und dann erfindungsgemäß getestet werden.
Weiterhin befinden sich viele der mit LacCer zusammenhängenden Schritte "stromabwärts" von GalT-2, und daher beinhalten die Assays Moleküle und Zellfunktionen, die stromabwärts von GalT-2 aktiv sind. Folglich können mäßige, aber signifikante Änderungen in der GalT-2-Aktivität als leicht testbare Signale aufgefangen werden.
Weitere Aspekte der Erfindung werden nachstehend erläutert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Modell, das die LacCer-vermittelte Redox-Signalübermittlung zeigt, die zur ICAM-1-Expression in Endothelzellen und zur Adhäsion an Neutrophile führt.
2 ist ein Modell, das die Verwendung von Ox-LDL, LacCer und Lipid-Second-messenger bei der Proliferation von H-ASMC zeigt.
3 ist ein Modell, das die Rolle von LacCer als Lipid-Second-messenger und die Wirkung der Beziehung von L-PDMP zur Beseitigung dieses Phänomens zeigt.
4 zeigt die Wirkung von L-PDMP und Ox-LDL auf die MAPK-Aktivität.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie vorstehend erläutert, umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung einer GalT-2-verstärkenden Verbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung und Vorbeugung von Ischämie. Die Behandlungsverfahren umfassen Im Allgemeinen die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer GalT-2-verstärkenden Verbindung an ein Individuum, vorzugsweise an einen Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf.
In dem gleichzeitig angemeldeten US 5,972,928 (U.S.-Anmeldung mit der laufenden Nr. 08/998,262, eingereicht am 24. Dezember 1997) und in WO-98/52553 (PCT-Anmeldung PCT/US98/09958) wurde offenbart, dass LacCer ein Zellsignalmolekül ist, das verschiedene Erkrankungen, postoperative Störungen und insbesondere Restenose und bakterielle Infektionen modulieren kann. D.h., es wurde gefunden, dass Veränderungen in den zellulären Spiegeln von LacCer die Entwicklung oder Schwere dieser Zustände verändern. Genauer gesagt, wurde gefunden, dass in LacCer-responsiven Zellen LacCer als Signalmolekül wirkt, das Veränderungen in bestimmten zellulären Schritten (hier manchmal als "mit LacCer zusammenhängende Schritte" oder "zusammenhängende Wege" bezeichnet) bewirkt. Es wurde ferner offenbart, dass mit LacCer zusammenhängende Wege eine Reihe von Funktionen, wie Zellproliferation und -adhäsion, beeinflussen.
Die gleichzeitig angemeldete U.S.-Anmeldung mit der laufenden Nr. 08/998,262 offenbart ferner Verfahren zur Hemmung der Aktivität von GalT-2, indem die GalT-2- oder LacCer-responsive Zelle mit einer wirksamen Menge einer GalT-2-Inhibitorverbindung, wie D-PDMP, zusammengebracht wird. Weiterhin beschrieben sind therapeutische Verfahren zur Hemmung von ungewünschter Zellproliferation durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer spezifischen GalT-2 hemmenden Verbindung. Erfindungsgemäß wurde gefunden, dass bestimmte L-Enantiomere von D-PDMP (z.B. L-PDMP) in der Lage sind, GalT-2 wirksam zu stimulieren und die Proliferation und -adhäsion in LacCer-responsiven Zellen zu erhöhen.
Die hier beschriebenen Therapieverfahren umfassen im Allgemeinen die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer GalT-2-verstärkenden Verbindung an ein Individuum, das einer solchen Behandlung bedarf, wie einen Säuger und insbesondere einen Primaten, wie einen Menschen. Erfindungsgemäße Behandlungsverfahren umfassen ferner die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel I, wie hier definiert, an ein Individuum, insbesondere einen Säuger, wie einen Menschen, der einer solchen Behandlung aufgrund einer hier offenbarten Indikation bedarf.
Übliche Individuen sind u.a. Säuger, die unter Ischämie leiden oder dafür anfällig sind, d.h. einer Ischämie, deren Entwicklung oder Schwere durch Erhöhung der Proliferation, Chemoattraktion oder Adhäsion bestimmter Zellen behandelt oder verhindert werden kann. Veranschaulichend für solche Zustände sind u.a. Gewebereparatur nach Verwundung (z.B. nach Operation, nach Aussetzen gegenüber Wärme, wie Verbrennung, oder Transplantation) und/oder ein Verlust von Haut durch Umweltgefahren, wie Hitze- oder Kältebelastung, UV-Licht oder andere Strahlung, Chemikalien usw.; fehlerhafte Gefäßbildung, insbesondere in Embryonen oder Jungtieren; Angiogenese und Vaskulogenese. Ebenfalls in Betracht gezogen werden Erkrankungen, die durch eine mangelhafte Zellproliferation oder -adhäsion beeinflusst werden, wie Blutgerinnungsstörungen, Geschwüre, wie Diabetes- und Dekubitusgeschwüre; neurodegenerative Störungen, wie Chorea Huntington, amyotrophe Lateralsklerose (d.h. ALS oder "Lou-Gehrig-Krankheit"), Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, mehrere Anfallsleiden, einschließlich Epilepsie, familiäre Dysautonomie, und mit Ischämie zusammenhängende Störungen. Besondere neurodegenerative Störungen, die erfindungsgemäß behandelt oder verhindert werden können, beinhalten solche, welche das Auge betreffen, z.B. Fuchs-Dystrophie, kongenitale Amaurose nach Leber, Stäbchen/Zapfen-Dystrophien, zentrale areolare Sklerose der Choroidea, Gyratatrophie, Choroideremie, Retinitis pigmentosa und mit dem Alter zusammenhängende Makuladystrophien, insbesondere die Makulapathologien, die Ältere betreffen.
Eine Reihe GalT-2-verstärkender Verbindungen kann zur erfindungsgemäßen Verwendung eingesetzt werden. Einfaches Testen, z.B. in einem Standard-in-vitro-Assay, wie vorstehend definiert, kann geeignete GalT-2-verstärkende Verbindungen leicht identifizieren. Bevorzugte GalT-2-verstärkende Verbindungen sind u.a. solche, die ein Propanolgrundgerüst enthalten. Allgemein bevorzugt für die Verwendung in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung sind linksdrehende Verbindungen der folgenden Formel I:
wobei R und R¹ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff und geradkettigem oder verzweigtem C₁-C₆-Alkyl mit oder ohne Substituent, wie Amino, Hydroxy oder Mercapto, besteht, und wobei R und R¹ weiterhin unter Bildung eines 5-, 6- oder 7-gliedrigen Ringsubstituenten, wie Pyrrolidino, Morpholino, Thiomorpholino, Piperidino, Azacycloheptyl und dergleichen, miteinander verbunden sein können;
R² aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus geradkettigem oder verzweigtem C₆-C₃₀-Alkyl mit oder ohne eine bis drei Doppelbindungen besteht; und
R³ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus geradkettigem oder verzweigtem C₆-C₂₀-Alkyl mit oder ohne eine bis drei Doppelbindungen und Aryl, wie carbocyclischem Aryl (z.B. Phenyl), oder substituiertem Aryl, wie carbocyclischem Aryl (z.B. Phenyl), besteht, wobei es sich bei dem Substituenten um Halogen, C₁-C₄-Alkoxy, Methylendioxy, C₁-C₄-Mercapto, Amino oder substituiertes Amino, wobei der Aminosubstituent geeigneterweise C₁-C₄-Alkyl sein kann, handelt.
Geeignete Verbindungen der vorstehenden Formel I und andere GalT-2-verstärkende Verbindungen können durch bekannte Verfahren leicht hergestellt oder aus kommerziellen Quellen erhalten werden. Siehe zum Beispiel Abe, A., et al., (1992) J. Biochem. 111:191-196; Inokuchi, J., et al. (1987) J. Lipid Res. 28:565-571; Shukla, A., et al. (1991) J. Lipid Res. 32:73; Vunnam, R.R., et al., (1980) Chem. and Physics of Lipids 26:265; Carson, K., et al., (1994) Tetrahedron Lets. 35:2659 und Akira, A., et al., (1995) J. Lipid Research 36:611 sowie Chatterjee, s.o.
Wie zuvor erwähnt, wird der Begriff "linksdrehend" hier verwendet, um durch die vorstehende Formel I dargestellte Verbindungen zu beschreiben, welche die Fähigkeit besitzen, polarisiertes Licht in L- oder (-)-Richtung, d.h. gegen den Uhrzeigersinn, zu drehen. Die Drehung von polarisiertem Licht wird gewöhnlich unter Verwendung eines Polarimeters gemessen und wird sehr häufig als Grad der spezifischen Drehung (d.h. [α]_D) ausgedrückt. Die spezifische Drehung einer beliebigen, durch die vorstehende Formel I dargestellten Verbindung ist hier als die beobachtete Drehung von in einer Ebene polarisiertem Licht bei 589 nm (Natrium-D-Linie) in einem Probenweg (mit 1 Dezimeter Länge) und bei einer Probenkonzentration von (1 g/ml) definiert. Eine Reihe von optisch inaktiven Lösungsmitteln, wie Wasser oder Aceton, kann als geeignete Kontrollen verwendet werden. Siehe McMurry, J., in Organic Chemistry 3. Aufl. (1992) Brooks Cole Publishing Co., Pacific Grove, CA.
In einer bei der Erfindung verwendeten pharmazeutischen Zusammensetzung kann eine Behandlungsverbindung einem Individuum auf mehrerlei Wegen, einschließlich intrakorporal oder topisch, verabreicht werden. Zusätzlich kann eine GalT-2-verstärkende Verbindung als Prophylaktikum verabreicht werden, um das Einsetzen eines Zustands, auf den abgezielt wird, zu verhindern oder seine Schwere zu verringern. Alternativ kann eine GalT-2-verstärkende Verbindung im Verlauf eines Zustands, auf den abgezielt wird, verabreicht werden, z.B. damit sie dazu beiträgt, Symptome zu lindern.
Eine Behandlungsverbindung kann einem Individuum entweder allein oder in Kombination mit einem oder mehreren Therapeutika als pharmazeutische Zusammensetzung im Gemisch mit einem herkömmlichen Arzneimittelhilfsstoff, d.h. pharmazeutisch annehmbaren organischen oder anorganischen, zur parenteralen, enteralen oder intranasalen Applikation geeigneten Trägersubstanzen, die nicht nachteilig mit den Wirkstoffen reagieren und für ihren Empfänger nicht schädlich sind, verabreicht werden. Geeignete pharmazeutisch annehmbare Träger sind u.a. Wasser, Salzlösungen, Alkohol, Pflanzenöle, Polyethylenglykole, Gelatine, Lactose, Amylose, Magnesiumstearat, Talk, Kieselsäure, viskoses Paraffin, Parfümöl, Fettsäuremonoglyceride und -diglyceride, petroethrische Fettsäureester, Hydroxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon usw., sind aber nicht darauf beschränkt. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können sterilisiert und, wenn gewünscht, mit Hilfsstoffen gemischt werden, z.B. mit Gleitmitteln, Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Benetzungsmitteln, Emulgatoren, Salzen zum Beeinflussen des osmotischen Drucks, Puffern, Farbstoffen, Geschmacksstoffen und/oder aromatischen Substanzen und dergleichen, die mit den Wirkstoffen nicht nachteilig reagieren.
Solche Zusammensetzungen können für die Verwendung zur parenteralen Verabreichung, insbesondere in Form flüssiger Lösungen oder Suspensionen; für die orale Verabreichung, insbesondere in Form von Tabletten oder Kapseln; intranasal, insbesondere in Form von Pulvern, Nasentropfen oder Aerosolen; vaginal; topisch, z.B. in Form einer Creme; rektal, z.B. als Suppositorium usw. hergestellt werden.
Die Pharmazeutika können geeigneterweise in Einheitsdosisform verabreicht und durch eines der Verfahren hergestellt werden, die im pharmazeutischen Fachgebiet bekannt sind, z.B. wie in Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980) beschrieben. Formulierungen zur parenteralen Verabreichung können als übliche Arzneimittelhilfsstoffe beispielsweise steriles Wasser oder Kochsalzlösung, Polyalkylenglycole, wie Polyethylenglycol, Öle pflanzlichen Ursprungs, hydrierte Naphthaline und dergleichen enthalten. Insbesondere können biokompatibles, biologisch abbaubares Lactidpolymer, Lactid-/Glycolid-Copolymer oder Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymere geeignete Arzneimittelhilfsstoffe zur Steuerung der Freisetzung bestimmter GalT-2-verstärkender Verbindungen sein.
Weitere potenziell geeignete parenterale Zuführungssysteme beinhalten Ethylen-Vinylacetat-Copolymer-Partikel, osmotische Pumpen, implantierbare Infusionssysteme und Liposomen. Formulierungen für die Inhalationsverabreichung enthalten als Arzneimittelhilfsstoffe zum Beispiel Lactose oder können wässrige Lösungen sein, die zum Beispiel Polyoxyethylen-9-laurylether, Glykocholat und -desoxycholat enthalten, oder ölige Lösungen für die Verabreichung in Form von Nasentropfen oder als intranasal zu applizierendes Gel. Formulierungen für die parenterale Verabreichung können ferner Glykocholat für die buccale Verabreichung, Methoxysalicylat für die rektale Verabreichung oder Citronensäure für die vaginale Verabreichung enthalten. Anderer Zuführungssysteme verabreichen das (die) Therapeutik (um/a) direkt an einer Operationsstelle, z.B. kann eine GalT-2-verstärkende Verbindung nach Ballonangioplastie unter Verwendung von Stents verabreicht werden.
Eine intraokulare Verabreichung kann nach Bedarf durchgeführt werden, z.B. durch Implantieren einer Vorrichtung, die eine oder mehrere GalT-2-verstärkende Verbindungen freisetzen kann. Siehe z.B. eine Offenbarung in Bezug auf intraokulare Implantatvorrichtungen im U.S.-Patent Nr. 5,618,553.
Eine GalT-2-verstärkende Verbindung kann in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung als einziger pharmazeutischer Wirkstoff eingesetzt oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen verwendet werden, z.B. Wachstumsfaktoren, wie Plättchen-Wachstumsfaktor (PDGF), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF); Neurotrophinen, z.B. Nervenwachstumsfaktor (NGF); einem Cytokin und bestimmten Proteinen geringer Dichte, wie ox-LDL und/oder oxidierte Phosphatidylcholin-Derivate, wie 1-Palmitoyl-2-(5-oxovalexyl)-sn-glycerin-3-phosphocholin-(POVPC-)Derivat aus minimal modifizierten ADC.
Die Konzentration von einer oder mehreren Behandlungsverbindungen in einer therapeutischen Zusammensetzung variiert in Abhängigkeit von einer Reihe von Faktoren, einschließlich der Dosierung der zu verabreichenden GalT-2-verstärkenden Verbindung, den chemischen Eigenschaften (z.B. der Hydrophobie) der eingesetzten Zusammensetzung und der beabsichtigten Weise und dem beabsichtigten Weg der Verabreichung. Allgemein gesagt, kann (können) eine oder mehrere GalT-2-verstärkende Verbindung(en) zur parenteralen Verabreichung in einer wässrigen physiologischen Pufferlösung bereitgestellt werden, die etwa 0,1 bis 10% w/v einer Verbindung enthält.
Man erkennt, dass die tatsächlichen bevorzugten Mengen an Wirkstoffen, die bei einer gegebenen Therapie verwendet werden, z.B. je nach der verwendeten spezifischen Verbindung, der bestimmten formulierten Zusammensetzung, der Verabreichungsweise und den Eigenschaften des Individuums, z.B. der Spezies, dem Geschlecht, dem Gewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand und dem Alter des Individuums, variieren. Optimale Verabreichungsraten für ein gegebenes Verabreichungsprotokoll können vom Fachmann unter Verwendung herkömmlicher Dosierungsermittlungstests, die im Hinblick auf die vorstehenden Richtlinien durchgeführt werden, leicht sichergestellt werden. Geeignete Dosisbereiche können von etwa 1 μg/kg bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag beinhalten.
Erfindungsgemäße therapeutische Verbindungen werden geeigneterweise in einer protonierten und wasserlöslichen Form verabreicht, z.B. als pharmazeutisch annehmbares Salz, üblicherweise ein Säureadditionssalz, wie ein Additionssalz einer anorganischen Säure, z.B. ein Hydrochlorid-, Sulfat- oder Phosphatsalz, oder als Additionssalz einer organischen Säure, wie ein Acetat-, Maleat-, Fumarat-, Tartrat- oder Citratsalz. Pharmazeutisch annehmbare Salze erfindungsgemäßer therapeutischer Verbindungen können auch Metallsalze beinhalten, insbesondere Alkalimetallsalze, wie ein Natriumsalz oder Kaliumsalz; Erdalkalimetallsalze, wie Magnesium- oder Calciumsalz; Ammoniumsalze, wie ein Ammonium- oder Tetramethylammoniumsalz; oder Aminosäureadditionssalze, wie ein Lysin-, Glycin- oder Phenylalaninsalz.
Bevorzugte GalT-2-verstärkende Verbindungen zeigen signifikante Aktivität in einem Standard-Zellproliferationsassay. Vorzugsweise fördert die GalT-2-verstärkende Verbindung die Zellproliferation um mindestens 10 bis 25%, vorzugsweise mindestens etwa 50%, im Vergleich zu einem geeigneten Kontrollassay. In einem solchen Assay werden zwischen etwa 0,1 bis 100 μM, vorzugsweise zwischen etwa 1 bis 50 μM, einer gewünschten GalT-2-verstärkenden Verbindung verwendet. Beispielhafte Zellproliferationsassays beinhalten das Zählen lebensfähiger Zellen und das Untersuchen der Aktivität spezifischer Enzyme des Citronensäurezyklus, wie der Lactatdehydrogenase. Ein bevorzugter Assay misst den Einbau von einem oder mehreren nachweisbar markierten Nukleosiden in DNA, z.B. durch:

a) Kultivieren geeigneter Zellen in Medium und Zugabe von 1) einem Kandidaten für eine GalT-2-verstärkende Verbindung und 2) einem radioaktiv markierten Nukleosid, wie ³H-Thymidin, üblicherweise in einer Menge zwischen etwa 0,1 bis 100 μCi;
b) Inkubieren der Zellen, z.B. für etwa 6–24 Stunden, und üblicherweise gefolgt von Waschen; und
c) Messen des Einbaus des radioaktiv markierten Nukleosids in DNA über diesen Zeitraum im Vergleich zu einer Kontrollkultur, die unter den gleichen Bedingungen wie die Assaykultur vorbereitet und inkubiert wird, aber nicht die potenzielle GalT-2-verstärkende Verbindung enthält. Die Messung kann mit verschiedenen Verfahren erreicht werden, einschließlich Trichloressigsäure-(TCA-)Fällung von markierter DNA auf Filter, gefolgt von Szintillationszählung. Siehe z.B. Chatterjee, S., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1991) 181:554; Chatterjee, S., et al. (1982) Eur. J. Biochem. 120:435 hinsichtlich einer Offenbarung in Bezug auf diesen Assay.

Bezugnahmen hierin auf einen "Standard-in-vitro-Zellproliferationsassay" oder ein anderer ähnlicher Ausdruck beziehen sich auf einen Assay, der die vorstehenden Schritten a) bis c) enthält. Ein bevorzugtes Beispiel für einen Zellproliferationsassay verwendet glatte Muskelzellen aus Aorta (ASMCs), insbesondere solche, die aus einem Mensch, einer Kuh oder einem Kaninchen erhalten werden. Ein geeignetes Protokoll umfasst die Präparation von ASMCs gemäß Standardverfahren und deren Kultivieren in Mikrotiterplatten in einem geeigneten Medium, wie Ham's-F-10. Eine gewünschte GalT-2-verstärkende Verbindung wird dann in das Medium hinein verdünnt, vorzugsweise auf eine Endkonzentration von zwischen etwa 1 bis 100 μg, stärker bevorzugt zwischen etwa 1 bis 50 μg, per ml Medium oder weniger, gefolgt von einem Inkubationszeitraum zwischen etwa 1–5 Tagen, vorzugsweise von etwa 1 Tag oder weniger. Nach der Inkubation kann eine Standard-Zellproliferation durchgeführt werden, z.B. Einbau von tritiiertem Thymidin oder ein Lactatdehydrogenase-Assay, wie vorstehend erwähnt. Die Assays werden vorzugsweise in Dreifachansätzen mit einer Variation von zwischen 5% bis 10% durchgeführt. Siehe z.B. Ross, R., J. Cell. Biol. (1971) 50:172; Chatterjee, S., et al. (1982) Eur. J. Biochem. 120:435; Bergmeyer, H.V., in Principles of Enzymatic Analysis (1978) Verlag Chemie, NY, sowie die gleichzeitig angemeldete U.S.-Anmeldung mit der laufenden Nr. 08/998,262, eingereicht am 24. Dezember 1997, und die PCT-Anmeldung PCT/US98/09958.
Zusätzlich zeigen bevorzugte GalT-2-verstärkende Verbindungen eine signifikante Aktivität in einem herkömmlichen Zelladhäsionsassay. Vorzugsweise erhöht die GalT-2-verstärkende Verbindung die Zelladhäsion um mindestens 25%, vorzugsweise mindestens 50% oder mehr verglichen mit einem geeigneten Kontrollassay. Bei einem solchen Assay werden zwischen etwa 0,1 bis 100 μM, vorzugsweise zwischen etwa 1 bis 50 μM, einer gewünschten GalT-2-verstärkenden Verbindung verwendet. Zum Beispiel beinhaltet ein bevorzugter Zelladhäsionsassay die folgenden Schritte:

a) Markieren einer ersten Population von Immunzellen, vorzugsweise bestimmter Leukozyten, mit einer nachweisbaren Markierung, die eine chromatische, radioaktive, lumineszente (z.B. fluoreszente oder phosphoreszente) oder enzymatische Markierung sein kann, die in der Lage ist, eine nachweisbare Markierung zu erzeugen,
b) In-Kontakt-Bringen der ersten Population von Zellen mit einer zweiten Population von Endothelzellen, die nachweisbar markiert sind, z.B. mit einer chromatischen, radioaktiven, lumineszenten (z.B. fluoreszenten oder phosphoreszenten) oder enzymatischen Markierung, die sich vorzugsweise von der im Schritt a) verwendeten Markierung unterscheidet; und
c) Nachweisen jeglicher Adhäsion zwischen der ersten und der zweiten Population von Zellen.

Bezugnahmen hierin auf einen "Standard-in-vitro-Zelladhäsionsassay" oder ein anderer ähnlicher Ausdruck betreffen einen Assay, der die vorstehenden Schritte a) bis c) beinhaltet. Der Nachweis im Schritt c) kann durch eine Reihe von Verfahren erzielt werden, wie Mikroskopie (durch manuelles Zählen von Zellen), insbesondere konfokale Mikroskopie und auf Fluoreszenz basierende Mikroskopie unter Beteiligung von FACS; automatische Zellsortierungstechniken, immunologische Verfahren, wie ELISA und RIA; und Szintillations zählung. Siehe eine Offenbarung in Bezug auf bevorzugte Zelladhäsionsassays in den nachstehenden Beispielen und denjenigen in der gleichzeitig angemeldeten U.S.-Anmeldung mit der laufenden Nr. 08/998,262, eingereicht am 24. Dezember 1997, sowie in der PCT-Anmeldung PCT/US98/09958.
Ein bevorzugter In-vitro-Zelladhäsionsassay misst polymorphonukleäre Leukozyten (PMNs und/oder Monozyten) oder Plättchen und eine erhöhte Endothelzelladhäsion vor, während oder nach dem Kontakt mit einer gewünschten GalT-2-verstärkenden Verbindung. Die PMNs oder Monozyten können gemäß nachstehend im Einzelnen beschriebenen Standardverfahren gesammelt und gereinigt werden. Die PMNs oder Monozyten werden dann durch Inkubation mit einem geeigneten Fluoreszenzfarbstoff markiert, wie fluoreszentem Cell-Tracker-Farbstoff (z.B. grün) oder Calcein-AM. Zu etwa dem gleichen Zeitpunkt wird eine Endothelzell-Monolayer, die gemäß Standard-Zellkulturverfahren auf einem geeigneten Substrat, wie einem Objektträger oder einer sterilisierten Kunststoff-Petrischale, hergestellt wurde, mit der GalT-2-verstärkenden Verbindung in Kontakt gebracht, die gewaschen und mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff, wie fluoreszentem Cell-Tracker-Farbstoff (z.B. orange), markiert wurde. Die PMNs oder Monozyten und die Endothelzellen werden dann für zwischen etwa 10 Minuten bis wenige Stunden, vorzugsweise etwa 30 Minuten, bei 37°C inkubiert. Nichtadhärente Zellen werden dann mit einem physiologisch annehmbaren Puffer, wie phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), von dem Objektträger abgewaschen. Anhaftende Zellen werden dann durch Standardverfahren, wie unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenlesegeräts, quantifiziert. Die Anzahl adhärenter Zellen auf dem Objektträger kann auf mehrerlei Weisen quantifiziert werden, einschließlich Ausdrücken der Anzahl an PMN/mm² auf der Endothelzell-Monolayer. Alternativ können die anhaftenden Zellen durch Inspektion nach Photomikroskopie quantifiziert und mittels Mikroskopie sichtbar gemacht und photographiert werden. Die Zelladhärenz wird dann durch Inspektion der mikroskopischen Aufnahme untersucht. Siehe die folgenden Beispiele.
Besonders bevorzugt sind GalT-2-Assays, die mit den ASMCs und im Allgemein gemäß zuvor beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Siehe z.B. Chatterjee, S., und Castiglione, E. (1987) Biochem. Biophys. Acta, 923:136; und Chatterjee, S. (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm., 181:554.
Weiterhin bevorzugte In-vitro-Zelladhäsionsassays beinhalten einen immunologischen Nachweis von Adhäsionsmolekülen auf PMNs unter Verwendung spezifischer, insbesondere monoklonaler, Antikörper, die in der Lage sind, die Adhäsionsmoleküle spezifisch zu binden. Ein besonders bevorzugter Assay beinhaltet Durchflusszytometrie.
Die vorstehend beschriebenen In-vitro-Adhäsionsassays sind kompatibel mit der Analyse einer Reihe von spezifischen Adhäsionsmolekülen, wie ICAM-1 (intrazelluläres Adhäsionsmolekül 1), Mac-1 (CD11b/CD18), LFA-1 und E-Selektin.
Ein weiterer bevorzugter In-vitro-Assay untersucht spezifisch die LacCer-Bildung, die ein Anzeichen für die GalT-2-Enzymaktivität ist, und umfasst die folgenden Schritte a) bis d):

a) Kultivieren einer Population LacCer-responsiver Zellen, vorzugsweise bis zur Konfluenz, in Lipoproteindefizientem Serum-Medium, z.B. etwa 1 mg Lipoproteindefizientes Serum/Protein/ml Medium oder weniger;
b) Ernten der Zellen, vorzugsweise in einem geeignet dispergierenden Puffer, z.B. Cacodylat-Puffer;
c) Inkubieren der geernteten Zellen, vorzugsweise mit einem nachweisbar markierten Molekül, wie einem nachweisbar markierten Nukleosiddiphosphatzucker-Donor, wie [¹⁴C]-UDP-Galactose, üblicherweise in einer Menge zwischen etwa 0,1 bis 100 μCi; und
d) Messen der LacCer-Bildung als Anzeichen für die Aktivität des GalT-2-Enzyms.

Der vorstehende Assay mit den Schritten a) bis d) wird hier manchmal als "GalT-2-Enzymassay" oder mit einem ähnlichen Begriff bezeichnet. Vorzugsweise erhöht die GalT-2-verstärkende Verbindung die Aktivität des GalT-2-Enzyms um mindestens etwa 10%, vorzugsweise mindestens etwa 25%, 50%, 75% oder mehr im Vergleich zu einem geeigneten Kontrollassay.
Weiterhin bevorzugte GalT-2-verstärkende Verbindungen beinhalten solche, die eine mindestens 2- bis 5-fach höhere Zunahme der GalT-2-Aktivität im Vergleich zu GlcT-1 zeigen, wie mit dem GalT-2-Enzymassay oder herkömmlichen GlcT-1-Enzymassays gemessen. Stärker bevorzugt sind diejenigen GalT-2-verstärkenden Verbindungen, die eine mindestens etwa 5- bis 10-fach, sogar noch stärker bevorzugt eine mindestens etwa 10- bis 50-fach höhere Zunahme der GalT-2-Aktivität im Vergleich zur Verstärkung von GlcT-1 zeigen. Verfahren zur Messung der GlcT-1-Aktivität sind beschrieben worden. Siehe z.B. Carson, K., und Ganem, B., s.o.; Shukla, A., und Radin, N.S., J. Lipid. Res. 32:713.
Besonders bevorzugte GalT-2-verstärkende Verbindungen sind u.a. solche, die in der Lage sind, spezifisch die Aktivität des GalT-2-Enzyms zu verstärken. D.h. die identifizierte GalT-2-verstärkende Verbindung liefert eine relativ schlechte Stimulation anderer Enzyme, wie der Hydroxyceramidgalactosyltransferase, der Glucocerebrosidglucosidase und insbesondere der GlcT-1. Signifikanterweise sollte die GalT-2-verstärkende Verbindung ungewünschte pharmakologische Wirkungen vermeiden, die sich aus der nichtselektiven Hemmung anderer, mit GSL zusammenhängender Enzyme ergeben könnten. Beispielhaft für solche GalT-2-verstärkenden Verbindungen sind diejenigen, welche die Bildung eines GalT-2-Übergangszustands verstärken oder anderweitig stabilisieren.
In den meisten Fällen verwenden die vorstehend allgemein beschriebenen Assays bekannte LacCer-responsive Zellen und werden in einem Medium kultiviert, das für das Halten solcher Zellen in dem Assay geeignet ist, z.B. Eagles' essentielles Minimalmedium (HMEM) oder Ham's-F-10-Medium.
Die erfindungsgemäßen In-vivo-Assays eignen sich ganz besonders für die anschließende Untersuchung von GalT-2-verstärkenden Verbindungen, die eine geeignete Aktivität in einem In-vitro-Assay zeigen, wie die vorstehend beschriebenen. Ein Kaninchenmodell der Restenose in Verbindung mit einem invasiven chirurgischen Verfahren, wie Ballon-Angioplastie, begleitet, ist bevorzugt. Ein geeignetes Protokoll beinhaltet das Verabreichen eines geeigneten Vehikels oder von Vehikel in Kombination mit einer oder mehreren GalT-2-verstärkenden Verbindungen von Interesse an das Tier. Die Menge der verabreichten GalT-2-verstärkenden Verbindung variiert in Abhängigkeit von mehreren Parametern, einschließlich des Ausmaßes der Schädigung in Verbindung mit dem chirurgischen Verfahren von Interesse. In Fällen, in denen Ballon-Angioplastie eingesetzt wird, empfängt das Kaninchen üblicherweise einen Kandidaten für eine GalT-2-verstärkende Verbindung in einer Dosis (z.B. i.m. oder i.p.) zwischen etwa 0,5 bis 100, vorzugsweise 1 bis 20 und stärker bevorzugt etwa 10 mg/kg Körpergewicht des Kaninchens. Ein bevorzugtes Dosierungsschema sieht die Verabreichung einer GalT-2-verstärkenden Verbindung beginnend 24 Stunden vor der Durchführung eines invasiven chirurgischen Verfahrens und dann die Fortsetzung der Gabe der GalT-2-verstärkenden Verbindung für 15 Tage nach dem chirurgischen Verfahren vor. In anderen Protokollen können tägliche Injektionen der GalT-2-verstärkenden Verbindung für etwa 2 bis 12 Wochen nach dem invasiven chirurgischen Verfahren durchgeführt werden. Tägliche Injektionen, z.B. i.m. oder i.p., der GalT-2-verstärkenden Verbindung sind in der Regel bevorzugt. Anschließend werden die Kaninchen euthanasiert, und ein Gefäß, vorzugsweise die Aorta, wird für die Untersuchung entnommen. Das Gefäß wird dann mit Formalin fixiert und hinsichtlich der Proliferation von Gefäßendothelien, Media und Advantitia unter Verwendung histologischer Standardverfahren analysiert. Vorzugsweise erhöht die Verabreichung der GalT-2-verstärkenden Verbindung die Intima-Zellproliferation, z.B. von SMCs-Epithelien oder verwandten Zellen, um mindestens etwa 10%, 20%, 40%, 50%, 70%, 100 bis zu etwa 200% oder mehr in diesem Assay.
Der Begriff "invasives chirurgisches Verfahren" bedeutet eine medizinische oder veterinärmedizinische Technik in Verbindung mit einer signifikanten Schädigung des Endothels eines Gefäßes, wodurch z.B. ein Organ, wie das Herz, die Leber oder die Niere, oder eine Gliedmaße betroffen ist. Ein solches Gefäß umfasst die Aorta, ein Koronargefäß, die Femur- und Ileumarterien und -venen. Das invasive chirurgische Verfahren kann mit Techniken einhergehen, die z.B. Herzchirurgie, abdominothorakale Chirurgie, Arterienchirurgie, Entnahme einer Implementation (z.B. eines vaskulären Stents oder Katheters) oder Endarterektomie beinhalten. Ein bevorzugtes invasives chirurgisches Verfahren ist Angioplastie, insbesondere Ballon-Angioplastie. Vorzugsweise wird das invasive chirurgische Verfahren an einem Säuger, wie einem Primaten, insbesondere einem Menschen, Nager oder einem Kaninchen, oder einem domestizierten Tier, wie einem Schwein, einem Hund oder einer Katze, durchgeführt.
Es wird angenommen, dass an Angiogenese und damit zusammenhängenden Vorgängen eine signifikante Zellproliferation, insbesondere von SMCs, beteiligt ist, was zur Bildung von Endothelzellsprossen und Gefäßschleifen führt. Weiterhin bevorzugte Assays sind diejenigen, welche die Angiogenese vor und nach der Verabreichung einer erfindungsgemäßen Verbindung untersuchen können. Die Angiogenese kann (wenn gewünscht) insbesondere unter Verwendung zuvor charakterisierter Tiermodelle für eine Hinterpfotenischämie untersucht und quantifiziert werden. Zusätzlich bekannte Tiermodelle im Hinblick auf eine quantitative Untersuchung der Angiogenese sind diejenigen, die eine durch invasive Chirurgie herbeigeführte Gefäßschädigung umfassen, wie vorstehend beschrieben. Insbesondere sind herkömmliche Verfahren zur angiographischen Quantifizierung der Femur- und anderer großer Arterien im Fachgebiet bekannt und können bei Nagern und anderen Tiermodellen durchgeführt werden. Siehe z.B. LeFree et al. Proc. SPIE 626:334-331 (1986); Mancini et al. Circulation 75:452-460 (1987); und Folkman J., et al. J. Biol. Chem. 267L:10931 (1992) und die darin genannten Bezugsstellen hinsichtlich einer Offenbarung in Bezug auf diese Modelle. Bevorzugte GalT-2-verstärkende Verbindungen sind in der Lage, die Angiogenese, wie z.B. durch angiographische Untersuchung luminaler Durchmesser gemessen, um mindestens etwa 5%, vorzugsweise 10%, 20%, 50% bis zu etwa 100 verglichen mit einer geeigneten Kontrolle zu erhöhen.
Es wurde berichtet, dass eine Verstärkung der Angiogenese zur Behandlung und Vorbeugung einer Reihe von Zuständen, wie zerebrovaskulärer Ischämie, Nierenischämie, Lungenischämie, Ischämie einer Gliedmaße, ischämischer Kardiomyopathie, Myokardischämie und verwandten Zuständen, vorteilhaft ist. Folglich eignen sich die erfindungsgemäßen GalT-2-verstärkenden Verbindungen zur Behandlung oder Vorbeugung dieser und ähnlicher Zustände.
Zusätzlich bevorzugte In-vivo-Assays sind diejenigen, welche die Funktion des ZNS und/oder PNS von Versuchstieren, wie einem Primaten, Nager, Kaninchen und dergleichen, messen. Zum Beispiel können Wahrnehmung, Erkennen und Sehen durch eine Reihe herkömmlicher Verfahren bei Tiermodellen und insbesondere bei menschlichen Patienten gemessen werden. Insbesondere kann die Makuladegeneration im Auge, wenn gewünscht, durch bekannte photographische Tests, z.B. Fundusphotographie, Fluorescein-Angiographie und dergleichen zur Einteilung von Makulaläsionen in Grade, vor und nach der Verabreichung einer gewünschten GalT-2-verstärkenden Verbindung untersucht und quantifiziert werden. Zusätzliche bekannte Tests, wie Makulaerholungsfunktionsassays, Empfindlichkeit des zentralen Gesichtsfeldes, spatiotemporale Kontrastempfindlichkeit und der Farnsworth-Munsell-100-Schattierungen-Test, können durchgeführt werden, um die Wirksamkeit der Verbindungen bei Patienten zu untersuchen.
Verfahren zum Nachweis und zur Analyse GalT-2-verstärkender Verbindungen mit therapeutischem Vermögen sind hier zur Behandlung oder Vorbeugung von Ischämie beschrieben. Geeigneterweise wird angenommen, dass einer Erkrankung durch LacCer moduliert wird, wenn die betroffenen Zellen oder das betroffene Gewebe zunehmen. Eine GalT-2-Aktivität, die etwa 2- bis 50-fach, üblicherweise etwa 2- bis 10-fach und noch üblicher etwa 2- bis 5-fach höher als diejenige von Kontroll-(nicht betroffenen) Zellen oder Gewebe ist. Die GalT-2-Aktivität kann durch hier genannte Verfahren gemessen werden. Ohne sich an eine Theorie zu binden, scheint es, dass eine erhöhte GalT-2-Aktivität erhebliche Mengen an LacCer erzeugt. Es wird angenommen, dass dieses LacCer insbesondere durch Erhöhung der Zellproliferation oder -adhäsion das Einsetzen der genannten Zustände verstärkt oder zu diesen Zuständen beiträgt.
Allgemein gesagt, wurde gefunden, dass die hier offenbarten neuen, mit LacCer zusammenhängenden Schritte Veränderungen in der GalT-2-Aktivität hin zu einer Zellproliferation oder -adhäsion in LacCer-responsiven Zellen betreffen. Es wurde bestimmt, dass die mit LacCer zusammenhängenden Schritte in diejenigen gruppiert werden können, die Zellproliferation und -adhäsion modulieren. Es wurde gefunden, dass die mit LacCer zusammenhängenden Schritte eine Reihe an identifizierten Molekülen, wie spezifische Enzyme, cytosolische Faktoren, Kernfaktoren, Radikalspezies und Adhäsionsproteine, beinhalten. Genauere Beispiele für solche Moleküle in den mit LacCer zusammenhängenden biochemischen Schritten sind u.a. GTP-bindende Proteine, Kinasen, cytosolische Faktoren, Kernfaktoren, Transkriptionsfaktoren und Sauerstoffspezies, insbesondere reaktive Sauerstoffspezies (hier manchmal als "ROS" oder "ROM" bezeichnet).
Die Nachweisverfahren haben derartige Formate, dass sie einen oder mehrere Schritte in Verbindung mit Wegen, die mit LacCer zusammenhängen, beinhalten. Genauer gesagt, enthalten die Nachweisverfahren spezifische Schritte, welche die Aktivität von Molekülen messen, die eine Modulation der Zellproliferation oder -adhäsion bewirken. In einigen Fällen bewirkt ein bestimmtes Molekül die Hemmung sowohl der Zellproliferation als auch der -adhäsion über einen mit LacCer zusammenhängenden Weg.
Die mit LacCer zusammenhängenden Schritte findet man üblicherweise in Zellen, die LacCer-responsiv sind. Eine LacCer-responsive Zelle kann eine immortalisierte Zelllinie oder eine Primärkultur von Zellen sein (die z.B. aus einem Gewebe oder Organ erhalten wird), welche eine Veränderung in einem oder mehreren spezifischen Zellmolekülen oder -funktionen, wie Proliferation oder Adhäsion, nach dem Kontakt mit einer geeigneten Menge an LacCer aufweist.
Genauer gesagt, kann eine oder eine Kombination von Strategien eine LacCer-responsive Säugerzelle identifizieren. Zum Beispiel werden bei einem Ansatz etwa 1 × 10⁵ Zellen in Petrischalen in geeignetem Wachstumsmedium ausgesät. Für Primärkulturen von Zellen wird ein gewünschtes Gewebe oder Organ aus einem Tier gewonnen und gemäß Standardverfahren (z.B. durch Ultraschallbehandlung, mechanisches Schütteln und/oder Aussetzen gegenüber im Fachgebiet bekannten Dispersionsmitteln, z.B. Detergentien und Proteasen) dispergiert. Nach einem oder wenigen Tagen wird das Wachstumsmedium aus der Petrischale entfernt, und die Zellen werden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Die Zellen werden dann in einem geeigneten Medium für etwa 1 bis 5 Stunden initiiert, zu welchem Zeitpunkt LacCer zu der Kultur hinzugefügt wird. Die Menge an zugegebenem LacCer hängt von mehreren Parametern ab, wie der bestimmten Zelle oder dem bestimmten Gewebetyp, die getestet werden. In den meisten Fällen wird LacCer jedoch zu der Kultur in einer Konzentration zwischen etwa 1 μg bis 1 mg, vorzugsweise zwischen etwa 1 μg bis 500 μg und stärker bevorzugt zwischen etwa 1 μg bis 50 μg per ml Kulturmedium zugegeben. Nachdem die Zellen LacCer zwischen etwa 1 bis 60 Minuten, vorzugsweise zwischen etwa 1 bis 10 Minuten oder weniger, ausgesetzt worden sind, wird das Medium entfernt, und die Zellen werden in einem geeigneten Lysepuffer, wie den nachstehend im Einzelnen beschriebenen, lysiert. Die Zellen werden dann gemäß einem der hier beschriebenen Verfahren hinsichtlich ihrer Antwort auf das zugegebene LacCer getestet.
Besonders bevorzugte LacCer-responsive Säugerzellen sind u.a. Zellen, die mit der Vaskulatur eines Organs oder einer Gliedmaße in Zusammenhang stehen, insbesondere Herz- oder Nierenzellen, z.B. Endothelzellen und glatte Muskelzellen. Weiterhin bevorzugt sind Neuronen und verwandte Zellen. Genauer gesagt, humane ASMCs (hier manchmal als H-ASMCs bezeichnet, um auf den humanen Ursprung hinzuweisen) und Endothelzellen. Ebenfalls bevorzugt sind bestimmte Immunzellen, wie weiße Blutzellen, insbesondere PMNs und Monozyten.
Bevorzugte GalT-2-verstärkende Verbindungen beinhalten ferner diejenigen, welche ein gutes Vermögen zeigen, ein oder mehrere spezifische Moleküle in einem mit LacCer zusammenhängenden Schritt nach Aussetzen gegenüber LacCer zu modulieren. Besonders bevorzugte Verbindungen zeigen mindestens 20%, vorzugsweise mindestens 50% und stärker bevorzugt mindestens 90% oder mehr einer Zunahme in der Aktivität des Moleküls (in Bezug auf einen geeigneten Kontrollassay) bei einer Konzentration zwischen etwa 0,1 bis 100 μg/ml, vorzugsweise zwischen etwa 1 bis 10 μg/ml, in einem In- vitro-Nachweisassay. Die Aktivität der Moleküle kann auf eine beliebige von mehreren leicht nachweisbaren Weisen, einschließlich veränderter Synthese, verändertem Abbau oder veränderter Speicherung; Proteinmodifikation, z.B. Phosphorylierung, oder über eine allosterische Wirkung, wie bei bestimmten Enzymen, zunehmen (oder manchmal abnehmen, wie vorstehend beschrieben).
Wenn das Molekül von Interesse ein Enzym ist, beinhalten GalT-2-verstärkende Verbindungen insbesondere diejenigen, die eine gute Aktivität in einem Enzymassay, wie nachstehend beschrieben, aufweisen. Vorzugsweise beträgt eine EC₅₀ in einem solchen Assay etwa 1 μM oder weniger, stärker bevorzugt eine EC₅₀ von etwa 0,001 μM oder weniger.
Ein Kontrollexperiment wird gewöhnlich auf die Verwendung in einem bestimmten Assay zugeschnitten. Zum Beispiel beinhalten die meisten Kontrollexperimente das Aussetzen einer Testprobe (z.B. einer Population von LacCer-responsiven Zellen oder eines Lysates davon) gegenüber Medium, Kochsalzlösung, Puffer oder Wasser anstelle einer potenziellen GalT-2-verstärkenden Verbindung parallel zu den Zellen, die eine Menge der Testverbindung erhalten. Ein gewünschter Assay wird dann gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt. Spezifische Beispiele für geeignete Kontrollexperimente sind nachstehend beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Nachweisverfahren können auch zur Identifikation GalT-2-verstärkender Verbindungen verwendet werden, die aus biologischen Quellen erhalten werden, einschließlich spezifischer Wachstumsfaktoren, Cytokine, Polypeptide und Peptidhormone und Lipoproteine (z.B. Ox-LDL), welche die GalT-2-Aktivität modulieren.
Die erfindungsgemäßen Nachweisverfahren beinhalten ferner Assays, welche die Aktivität spezifischer Moleküle in mit LacCer zusammenhängenden biochemischen Schritten messen. Die Messungen können durch Standardlabormanipulationen durchgeführt werden, wie Chemilumineszenztests, Dünnschichtchromatographie-(DC-)Trennungen oder andere chromatographische Verfahren, wie HPLC, Nukleinsäureisolation und -reinigung, SDS-PAGE-Gelelektrophorese, Autoradiographie, Szintillationszählung, Densitometrie, Northern- und Western-Blot-Hybridisierung und Immunassays (z.B. RIA- und ELISA-Tests). Siehe allgemein Sambrook et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl. 1989); und Ausubel et al. (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, hinsichtlich einer Erläuterung in Bezug auf viele der Standardverfahren, deren Offenbarungen hier durch Bezugnahme aufgenommen sind.
Unter einem Aspekt messen die erfindungsgemäßen In-vitro-Assays die Aktivität bestimmter Enzyme in LacCer-responsiven Zellen. Es wurde gefunden, dass die Aktivität der Enzyme nach Aussetzen der Zellen gegenüber LacCer und/oder einer spezifischen GalT-2-verstärkenden Verbindung, wie L-PDMP, oxidiertem Lipoprotein (ox-LDL), Nervenwachstumsfaktor (NGF), Plättchen-Wachstumsfaktor (PDGF), epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), moduliert wird.
Es wurde insbesondere gefunden, dass L-PDMP die Aktivität von GalT-2 erhöht und zum Testen der Wirkung auf andere Enzyme gemäß den hier beschriebenen Verfahren verwendet werden kann. Die hier beschriebenen In-vitro-Assays können dazu verwendet werden, die Aktivität dieser Enzyme, z.B. spezifischer Redox-Enzyme, nukleotidbindender Proteine und Kinasen, zu testen, wie nachstehend beschrieben.
Zum Beispiel misst ein bestimmter In-vitro-Assay die Aktivität einer Oxidase, die eine Sauerstoffspezies, insbesondere eine ROS, wie Superoxid, synthetisieren kann. Ein besonders bevorzugtes Enzym ist NADPH-Oxidase. Die Äktivität der NADPH-Oxidase kann mittels Standardverfahren untersucht werden, einschließlich Fraktionieren des Enzyms aus Zellkomponenten und anschließendes Messen der Aktivität mittels Enzymassay, wie denjenigen, die ein Standard-Chemilumineszenzverfahren einsetzen.
Alternativ kann die NADPH-Oxidase durch Messen der Superoxidproduktion in intakten Zellen untersucht werden. Üblicherweise erfolgt die Messung in Gegenwart eines Mitochondriengiftes, wie KCN, ein Verstärker der NADH-Oxidase. Alternativ kann die Aktivität der NADPH-Oxidase in intakten LacCer-responsiven Zellen durch Messen der Superoxidproduktion untersucht werden. Die Superoxidmessung kann auf mehrerlei Weisen durchgeführt werden, einschließlich Inkubieren der Zellen mit einer lichtempfindlichen polycyclischen organischen Verbindung (z.B. einer Acridylium-Verbindung). Eine Verringerung der polycyclischen Verbindung durch Superoxid bewirkt eine Lichtemission, die mit einem Standard-Photonenzähler nachgewiesen werden kann. Bevorzugte Verfahren zur Messung der NADPH-Oxidase-Aktivität sind in Bhunia, A.K., et al. (1997) J. Biol. Chem. 275:15642 beschrieben.
Es werden weitere In-vitro-Assays bereitgestellt, die ein oder mehrere Enzyme messen, von denen gefunden wurde, dass sie durch LacCer und hier offenbarte GalT-2-verstärkende Verbindungen moduliert werden. Die Enzyme sind u.a. Ras-GTP-bindendes Protein, Raf-1, mitogenaktivierte Protein-(MAP-)kinase (MEK-2) und andere mitogenaktivierte Proteinkinasen, wie p44-MAPK. Jedes dieser Enzyme kann durch ein oder eine Kombination herkömmlicher Verfahren getestet werden.
Zum Beispiel kann der Einbau eines Nukleosidtriphosphats, insbesondere eines zyklischen Nukleosidtriphosphats, wie Guanidinnukleosidtriphosphat (GTP), in ein Onkogenprotein, wie das ras-Protein, (d.h. die ras-GTP-Beladung) durch das ras-GTP-bindende Protein, durch eine Reihe verschiedener Ansätze, einschließlich des direkten Nachweises des Nukleosidtriphosphat-(z.B. des GTP-)Einbaus in Ras, gemessen werden. Bei einem Ansatz werden zum Beispiel LacCer-responsive Zellen metabolisch mit radioaktivem (z.B. ³²P-markiertem) Orthophosphat markiert, um das GTP im Inneren der Zellen nachweisbar zu markieren. Die markierten Zellen werden mit LacCer und anschließend mit einer GalT-2- verstärkenden Verbindung inkubiert, dann gewaschen und in einem geeigneten Lysepuffer, wie RIPA (siehe nachstehend), lysiert. Danach wird das Zelllysat auf geeigneten DC-Platten aufgetrennt. Die DC-Platten werden mit Röntgenfilm exponiert und dann, wenn gewünscht, einer Densitometrie unterzogen, um den Einbau von GTP in das Ras-Protein zu quantifizieren. Ein bevorzugtes Verfahren zum Nachweis der ras-GTP-Beladung wurde in Chatterjee, S., et al., (1997) Glycobiology 7:703 offenbart.
Es werden auch Verfahren zum Messen der Aktivität der Raf-1- und Mek-2-Enzyme bereitgestellt. Bei einem Ansatz werden die LacCer-responsiven Zellen zum Beispiel mit LacCer und einer potenziellen GalT-2-verstärkenden Verbindung inkubiert, gewaschen und dann nach etwa 1 bis 60 Minuten, vorzugsweise 1 bis 10 Minuten oder weniger, nach dem Aussetzen gegenüber LacCer geerntet. Gesamtzelllysate werden hergestellt und dann einer Standard-SDS-PAGE-Gelelektrophorese unterzogen. Die Gele werden auf einen geeigneten Membranträger übertragen und gemäß herkömmlichen Westernblot-Hybridisierungsverfahren mit Anti-RAF-1- oder Anti-MEK-Antikörper sondiert. Bevorzugte Beispiele für Assays zum Messen des Raf-1- und des Mek-2-Enzyms sind in Bhunia, A.K., et al., (1996) J. Biol. Chem. 271:10660 offenbart.
Es werden weitere In-vitro-Assays bereitgestellt, welche die Aktivität von DNA-bindenden Proteinen, z.B. von Transkriptionsfaktoren, wie c-fos oder dem DNA-bindenden Protein nukleärer Faktor κB (NF-κB), messen. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass diese DNA-bindenden Proteine durch LacCer und GalT-2-verstärkende Verbindung moduliert werden. Die DNA-bindenden Proteine können durch eine Reihe herkömmlicher Ansätze getestet werden.
Zum Beispiel kann die Aktivität des DNA-bindenden Proteins NF-κB durch einen Standard-Polyacrylamidgel-Mobilitätsverschiebungsassay gemessen werden. Der Gelassay wird durchgeführt, nachdem LacCer-responsive Zellen mit LacCer und danach mit einer GalT-2-verstärkenden Verbindung in Kontakt gebracht wurden. Ein Zelllysat wird aus den LacCer-responsiven Zellen hergestellt, das dann mit einer Oligonukleotidsequenz in Kontakt gebracht wird, die eine erkannte NF-κB-DNA-Bindungssequenz umfasst (oder daraus besteht). Das Reaktionsgemisch wird dann für eine Zeit inkubiert, die ausreicht, dass das NF-κB-Protein und die DNA-Bindungssequenz einen spezifischen Bindungskomplex bilden können. Der spezifische Bindungskomplex wird dann auf einem SDS-PAGE-Polyacrylamidgel aufgetrennt, das anschließend getrocknet und mit Röntgenfilm exponiert wird.
Weitere geeignete In-vitro-Assays zur Messung der Modulation durch LacCer und GalT-2-verstärkende Verbindungen sind u.a. die Untersuchung der Expression von Zellproliferationsfaktoren (z.B. Cyclin). Ein bevorzugter proliferierender Zellfaktor für eine solche Analyse ist das proliferierende Zellkernantigen (PCNA oder Cyclin). Bei einem geeigneten Ansatz werden die kultivierten Zellen mit LacCer und anschließend mit einer GalT-2-verstärkenden Verbindung inkubiert und dann mit einem geeigneten Puffer gewaschen. PCNA kann in den kultivierten Zellen unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nachgewiesen (und, wenn gewünscht, quantifiziert) werden, der in der Lage ist, spezifisch an PCNA zu binden, (z.B. PC10-Antikörper). Siehe Sasaki, K., et al. (1993) Cytometry 14:876-882. PCNA kann dann in den Zellen durch eine Reihe immunologischer Verfahren nachgewiesen werden, einschließlich Durchflusszytometrie oder immunhistochemischer Visualisierung fixierter Zellschnitte.
Weiterhin bevorzugte GalT-2-verstärkende Verbindungen sind in der Lage, die Aktivität bestimmter Glykosphingolipide der Globo-Reihe, insbesondere von GALNac1→3Galα1-4Galβ1→GlcCer (im Folgenden "GbOse₄Cer") zu hemmen und ihre Spiegel zu verringern. Die zellulären Spiegel von GbOse₄Cer können durch eine Reihe von Verfahren gemessen werden, einschließlich des folgenden allgemeinen Verfahrens (im Folgenden als ein "GbOse₄Cer-Assay" bezeichnet):

a) Kultivieren einer Population LacCer-responsiver Zellen (z.B. Zellen des proximalen Tubulus aus "humaner Niere") vorzugsweise bis zur Konfluenz in Lipoproteindefizientem Serum-Medium, z.B. etwa 1 mg Lipoproteindefizientes Serum/Protein/ml Medium oder weniger;
b) Ernten der Zellen, z.B. in einem geeigneten dispergierenden Puffer, wie Cacodylat-Puffer; und
c) Messen der GSLs und insbesondere von GbOse₄Cer als Hinweis auf die Fähigkeit der bekannten oder des Kandidaten für eine GalT-2-verstärkende Verbindung, N-Acetylgalactosaminyltransferase zu hemmen.

Die bekannte oder der Kandidat für eine GalT-2-verstärkende Verbindung kann bei einem der Schritte a) bis c) des GbOse₄Cer-Assay zugegeben werden, obwohl im Allgemeinen bevorzugt ist, dass die Verbindung während der Inkubation mit dem Lipoprotein-defizienten Serum-Medium zugegeben wird. Die GSLs, einschließlich GbOse₄Cer, können durch eine Reihe von Verfahren, einschließlich Chromatographie, z.B. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), zusammen mit geeigneten GSL-Standards (die z.B. von Sigma, St. Louis, MO, erhalten werden) gemessen und quantifiziert werden. Vorzugsweise hat die GalT-2-verstärkende Verbindung in dem GbOse₄Cer-Assay eine IC₅₀ von mindestens etwa 10 μM, stärker bevorzugt eine IC₅₀ von etwa 1 μM oder weniger, noch stärker bevorzugt eine IC₅₀ von etwa 0,001 μM oder weniger in dem Assay. Siehe z.B. Chatterjee, S., et al. (1982); J. Lipid Res. 23:513-22; Ullman, M.D., et al (1977) J. Lipid Res. 18:371-78; BASU, M., et al. (1987) Methods Enzm. 138:575-607; Chatterjee, S., et al. (1988), J. Bid. Cler. 263:13017-23 und Chatterjee, S., et al. Glycoconjugate J. (1996) 13:481-486.
Das folgende nicht beschränkende Beispiel veranschaulicht die Erfindung weiter.
Beispiel 1
Die Wirkungen von L-PDMP und ox-LDL auf die MAPK-Aktivität wurden untersucht. Konfluente Kulturen von glatten Muskelzellen aus humaner Aorta wurde für 2 Stunden mit L-PDMP (10 μM) vorinkubiert. Als nächstes wurde ox-LDL (10 μg/ml) zu den Zellen gegeben. Nach 10-minütiger Inkubation bei 37°C wurden die Zellen geerntet, und die MAP-Kinase-Aktivität wurde in den Immunniederschlägen gemessen. Die Ergebnisse sind in 4 der Zeichnungen dargestellt. Diese Ergebnisse stellen Werte +SD von drei unabhängigen Experimenten dar, die in Doppelansätzen analysiert wurden.
Die Erfindung wurde anhand ihrer bevorzugten Ausführungsformen im Einzelnen beschrieben. Man erkennt jedoch, dass der Fachmann nach Erwägen dieser Offenbarung Modifikationen und Verbesserungen innerhalb des Geistes und Umfangs der Erfindung, wie in den folgenden Ansprüchen dargelegt, vornehmen kann.

Claims

Verwendung einer GalT-2-verstärkenden Verbindung, wobei die Verbindung linksdrehend ist und durch die folgende Formel I dargestellt wird:
wobei R und R¹ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff und geradkettigem oder verzweigtem C₁-C₆-Alkyl mit oder ohne Substituent besteht, und wobei R und R¹ weiterhin unter Bildung eines fünf-, sechs- oder siebengliedrigen Rings miteinander verbunden sein können; R² aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus geradkettigem oder verzweigtem C₆-C₃₀-Alkyl mit oder ohne eine bis drei Doppelbindungen besteht; und R³ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus geradkettigem oder verzweigtem C₆-C₂₀-Alkyl mit oder ohne eine bis drei Doppelbindungen und Aryl oder substituiertem Aryl besteht, wobei es sich bei dem Substituenten um Halogen, C₁-C₄-Alkoxy, Methylendioxy, C₁-C₄-Mercapto, Amino oder substituiertes Amino, wobei der Aminosubstituent C₁-C₄-Alkyl sein kann, handelt; zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Ischämie bei einem Säuger, der unter Ischämie leidet oder dafür anfällig ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Ischämie anhand einer unzureichenden Zellvermehrung diagnostiziert wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung, die die GalT-2-verstärkende Verbindung umfasst, weiterhin wenigstens einen der Wirkstoffe Plättchen-Wachstumsfaktor (PDGF), oxidiertes Lipoprotein geringer Dichte (ox-LDL), transformierender Wachstumsfaktor alpha (TNF-α2) oder eine weitere GalT-2-verstärkende Verbindung umfasst und die pharmazeutische Zusammensetzung in Form einer einzigen Zusammensetzung oder in Form von zwei oder mehr getrennten Zusammensetzungen, wobei jede Zusammensetzung wenigstens einen der Wirkstoffe GalT-2-verstärkende Verbindung, Plättchen-Wachstumsfaktor (PDGF), oxidiertes Lipoprotein geringer Dichte (ox-LDL), transformierender Wachstumsfaktor alpha (TNF-α2) oder eine weitere GalT-2-verstärkende Verbindung umfasst, vorliegt oder in Form eines Kits vorliegt, der wenigstens zwei getrennte Behälter umfasst, wobei jeder Behälter eine pharmazeutische Zusammensetzung umfasst, die wenigstens einen der Wirkstoffe GalT-2-verstärkende Verbindung, Plättchen-Wachstumsfaktor (PDGF), oxidiertes Lipoprotein geringer Dichte (ox-LDL), transformierender Wachstumsfaktor alpha (TNF-α2) oder eine weitere GalT-2-verstärkende Verbindung umfasst.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die Verbindung in einem Standard-in-vitro-Zellproliferationsassay die Zellvermehrung um wenigstens 25% verstärkt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die Verbindung in einem Standard-in-vitro-Zelladhäsionsassay die Zelladhäsion um wenigstens 25% verstärkt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die Verbindung in einem Standard-in-vitro- GalT-2-Enzymassay ein EC₅₀ von etwa 1 μM oder weniger aufweist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die Verbindung in einem Standard-in-vitro-GbOse₄-Cer-Assay ein IC₅₀ von etwa 0,001 μM oder weniger aufweist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei R und R¹ unter Bildung eines fünf-, sechs- oder siebengliedrigen Rings miteinander verbunden sind.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei R und R¹ unter Bildung eines Pyrrolidino-, Morpholino-, Thiomorpholino-, Piperidino- oder Azacycloheptylrings miteinander verbunden sind.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die Verbindung linksdrehend ist und aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 1-Phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol, 1-Phenyl-2-hexadecanoylamino-3-morpholino-1-propanol, 1-Phenyl-2-hexadecanoylamino-3-piperidino-1-propanol, 1-Phenyl-2-hexadecanoylamino-3-pyrrolidino-1-propanol, 1-Morpholino-2-hexadecanoylamino-3-hydroxyoctadec-4,5-en und 1-Pyrrolidino-2-hexadecanoylamino-3-hydroxyoctadec-4,5-en besteht.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei es sich bei der Verbindung um L-PDMP handelt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei es sich bei der Verbindung um trans-1-Pyrrolidino-2-hexadecanoylamino-3-hydroxyoctadec-4,5-en handelt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung ein Gemisch aus der Verbindung und herkömmlichen Arzneimittelhilfsstoffen umfasst.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung für die Verwendung bei der parenteralen Verabreichung, oralen Verabreichung, intranasalen Verabreichung, vaginalen Verabreichung oder topischen Verabreichung zubereitet ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung für die Verwendung eines Stents vorgesehen ist.