DE69634900T2 - Proteintyrosine-kinaseinhibitoren zur behandlung der osteoarthritis - Google Patents

Proteintyrosine-kinaseinhibitoren zur behandlung der osteoarthritis Download PDF

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Description

  • Hintergrund
  • Die Osteoarthritis oder degenerative Gelenkerkrankung ist eine langsam fortschreitende, irreversible, oft nur ein Gelenk betreffende Krankheit, die gekennzeichnet ist durch Schmerz und Funktionsverlust (Mankin und Brandt, Pathogenesis of Osteoarthritis in "Textbook of Rheumatology", Kelly, et al., (Hrg.) 3. Ausgabe, W.B. Saunders Co., Philadelphia, SS..14699–111471) und Dean, Arth. Rheum. 20 (Suppl. 2): 2 (1991)). Die dem Schmerz und der Schwächung zu Grunde liegende Ursache ist der Abbau des Knorpelgewebes, der als Ergebnis der Krankheit auftritt. Ein typisches klinisches Bild im Endstadium zeigt eine vollständige Abtragung des das Gewicht tragenden Gelenkknorpels, was einen vollständigen Ersatz des Gelenks erforderlich macht.
  • Derzeit gibt es keinen bekannten nachgewiesenen therapeutischen Ansatz, mit welchem die klinische Progression der Osteoarthritis verlangsamt werden könnte, obwohl steroide und nichtsteroide entzündungshemmende Arzneimittel eingesetzt werden, um den Schmerz und die mit dem Schmerz einhergehende Entzündung zu mildern. Es besteht daher ein Bedarf nach neuen Therapeutika, welche die durch Osteoarthritis verursachte Verkümmerung des Gelenks verlangsamen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es wurde nun gefunden, dass Tyrosinkinaseinhibitoren in Chondrocyten eine Gelenkverkümmerung deutlich reduzieren oder verhindern. Genauer gesagt verlangsamen die Tyrosinkinaseinhibitoren Genistein, Herbimycin A, 4,5-Dianilinophthalimid (DAPH), Tyrphostin AG 82 und Tyrphostin AG 556 den durch Interleukin-1 (IL-1) induzierten Abbau der extrazellulären Matrix von Chondrocyten in Zellkultur (Beispiele 1 und 7). Herbimycin A und Tyrphostin AG 82 reduzieren auch eine Gelenkverkümmerung in einem Explantat-Test von Rinderknorpel (Beispiele 2 und 3). Es ist auch gezeigt worden, dass Proteintyrosinkinase- Inhibitoren IL-1 induzierte Zuwachsraten der Stromelysin-mRNA-Spiegel und IL-1 induzierte Zuwachsraten der Prostromyelysin-Proteinspiegel hemmen (Beispiel 5). Auf der Grundlage dieser Entdeckungen werden Verfahren zur Behandlung von Menschen mit Osteoarthritis und Verfahren zur Hemmung des Knorpelabbaus beim Menschen offenbart.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung besteht in der Verwendung von Proteintyrosinkinase-Inhibitoren zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Menschen oder eines Tieres mit Osteoarthritis. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung von Proteintyrosinkinase-Inhibitoren zur Herstellung eines Medikaments für die Hemmung oder Verhinderung von Knorpelabbau bei Mensch oder Tier.
  • Die offenbarte Verwendung hemmt den mit einer Osteaoarthritis einhergehenden Knorpelabbau. Die zur Zeit für Osteoarthritis eingesetzten Behandlungsverfahren erleichtern nur die Symptome der Krankheit, z.B. den Schmerz und die Entzündung als Folge einer Gelenkzerstörung. Daher weist die offenbarte Verwendung gegenüber den zur Zeit eingesetzten Behandlungsverfahren den Vorteil auf, dass ein Fortschreiten der Krankheit eher verlangsamt oder angehalten werden kann als nur eine Linderung der Symptome.
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Proteintyrosinkinasen (PTKs) treten als membrangebundene Rezeptoren oder als cytoplasmatische Proteine auf. Sie spielen bei der Regulation eines breiten Spektrums von Zellfunktionen eine Rolle, einschließlich der Cytokinantwort, der antigenabhängigen Immunantwort, der Zelltransformation durch RNA-Viren, der Onkogenese, dem Zellcyclus sowie der Modifikation der Zellmorphologie. Die PTKs regulieren diese Funktionen, indem sie direkt oder indirekt die intrazellulären Signalwege, einschließlich Ras, die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K), die Phospholipase C-γ (PLC-γ) und den mitogenaktivierten Stoffwechselweg (MAP) aktivieren. Es ist nun gefunden worden, dass PTKs ebenfalls Zellfunktionen regulieren, die zu einem mit der Osteoarthritis einhergehenden Knorpelabbau führen.
  • Eine Aktivierung der PTKs hat eine Autophosphorylierung eines Tyrosinrestes in der Proteintyrosinkinase zur Folge. Eine Autophosphorylierung von PTKs erleichtert die Wechselwirkung von Proteinsubstraten mit dem aktiven Zentrum und ergibt eine Autophosphorylierung von Tyrosinresten in den Proteinsubstraten. Proteinsubstrate von PTKs sind im Allgemeinen Moleküle, die im Cytosol Signale weitergeben und deren Funktion als Ergebnis der Phosphorylierung aus- und angeschaltet wird. Eine Aktivierung der Proteinsubstrate über PTKs kann eine Kaskade von intrazellulären Reaktionen auslösen, die zur Aktivierung von anderen Proteinen oder von zuvor nicht exprimierten oder zu wenig exprimierten Genen führen kann. Diese Kaskade von Ereignissen wird als Signalkette bezeichnet, die Zellfunktionen einschließlich der oben beschriebenen Zellfunktionen reguliert.
  • Weil PTKs Zellfunktionen regulieren, die den mit Osteoarthritis einhergehenden Abbau von Knorpel verursachen, lässt sich das Fortschreiten der Krankheit über PTK-Inhibitoren verlangsamen oder anhalten. Der hier verwendete Ausdruck "Hemmung einer PTK" bezieht sich auf eine Blockade des Signalübertragungswegs, über welchen eine aktivierte PTK eine Zellfunktion kontrolliert. In der vorliegenden Erfindung wird ein PTK-Inhibitor verwendet, der einen Signalübertragungsweg blockiert, über welchen eine aktivierte PTK eine oder mehrere Zellfunktionen reguliert, die zu einem Abbau von Knorpel führen. Dazu gehören PTK-Inhibitoren, die in Zellkultur den Knorpelabbau in IL-1-aktivierten Chondrocyten reduzieren, welche in Zellkultur die Aktivität von Matrixmetalloproteinase (MMP) und/oder den mRNA-Spiegel für Aggrecanase in IL-1 aktivierten Chondrocyten herabsetzen und/oder welche in Zellkultur den Aggrecanaseproteinspiegel in Chondrocyten herabsetzen.
  • Ein PTK-Inhibitor weist ein kleines organisches Molekül oder Polypeptid auf, das, wie oben beschrieben, einen PTK-regulierten Signalweg blockiert. Ein PTK-Inhibitor wie er hier verwendet wird kann über eine Anzahl unterschiedlicher Mechanismen wirken. Der PTK-Inhibitor kann vorzugsweise wirken, indem er, wie oben beschrieben, die Autophosphoralierungsreaktion am Anfang hemmt. Alternativ kann der PTK-Inhibitor z.B. über die Hemmung der Phosphorylierung des Proteinsubstrats wirken, indem er mit dem Proteinsubstrat oder ATP um die Bindung an PTK konkurriert. Eine PTK kann auch über mehr als einen dieser Mechanismen wirken.
  • Ein PTK-Inhibitor wie er hier verwendet wird kann über andere Mechanismen wirken. Beispielsweise über Verbindungen, welche die Bindung von aktivierenden Molekülen (z.B. Wachstumsfaktoren) an Rezeptor-PTKs verhindern, entweder durch Blockade des Rezeptors (z.B. ein Rezeptorantagonist) oder durch Bindung an das aktivierende Molekül selbst.
  • Alternativ kann ein PTK-Inhibitor wirken, indem er eine der biochemischen Reaktionen in der Kaskade der durch die Aktivierung der PTK ausgelösten Reaktionen blockiert. Beispielsweise kann, wie oben beschrieben, die Aktivierung einer PTK zur Aktivierung der Ras, der Phosphatidylinositol 3 Kinase (PI3K), der Phospholipase C-γ (PLC-γ) und des mitogenaktivierten Stoffwechselweges (MAP) führen. Stoffe, welche irgendeinen dieser Stoffwechselwege nach ihrer Auslösung durch PTK-Aktivierung blockieren können, können ebenso die von der jeweiligen PTK kontrollierten Zellfunktionen unterdrücken.
  • Für die hier beschriebenen Verwendungen geeignete PTK-Inhibitoren sind PTK-Inhibitoren, welche natürliche Produkte darstellen. Beispiele sind Lavendustin A, Erbstatin, Herbimycin A, Rapamycin, Piceatannol und Lavendustin B. Die chemischen Strukturen dieser Verbindungen sind im CALBIOCHEM®-Katalog für Signalübertragung von 1995 (Seiten 143–153) (im Folgenden als CALBIOCHEM®-Katalog bezeichnet) wiedergegeben.
  • Die hier offenbarten Verwendungen geeigneter PTK-Inhibitoren können auch synthetische PTK-Inhibitoren umfassen. Synthetische PTK-Inhibitoren werden im CALBIOCHEM®-Katalog von 1995 (Seiten 143–153) sowie von Levitzki und Gazit in Science 267: 1782 (1995) beschrieben.
  • In einer Ausführungsform umfasst der in dem Behandlungsverfahren benutzte PTK-Inhibitor eine durch die Strukturformel (I) wiedergegebene Verbindung:
    Figure 00040001
    in welcher m eins oder zwei ist; R1 -H, -OH oder -OMe ist, R2 -H, oder -CN ist und R1 -H, -NO2, Halogen oder ein organischer Rest ist, der so ausgesucht ist, dass die durch die Strukturformel (I) wiedergegebene Verbindung PTKs hemmt. Beispiele für geeignete organische Reste sind -CN, -CO-NH2, -CS-NH2, -CO-NHR10, -CS-NHR10, Phenyl, substituiertes Phenyl, substituiertes Heteroaryl und Heteroaryl (z.B. Pyrimidyl, Pyridinyl). Geeignete Substituenten für eine substituierte Alkyl- oder Alkenylgruppe sind -NH2, -NO2, Halogen,-CN, -CO-NH2, -CS-NH2, -CO-NHR10, CS-NHR10, phenylsubstitutuiertes Phenyl, substitutuiertes Heteroaryl und Heteroaryl. R10 ist eine substituierte oder unsubstituierte geradkettige oder verzweigtkettige C1- bis ca. C8-Alkyl- oder Alkenylgruppe. Geeignete Substituenten für eine Phenyl- oder Heteroarylgruppe sind Halogen, -NO2, -CN und gerad- oder verzweigtkettiger C1-C4-Alkyl. Eine substituierte Phenyl-, Alkyl- oder Alkenylgruppe kann mehr als einen Substituenten aufweisen.
  • Beispiele für durch die Strukturformel (I) wiedergegebene Verbindungen sind Dihydroxynitrostyroltyrphostin AG18, Tyrphostin AG82, Tyrphostin AG99, Tyrphostin AG213, Tyrphostin. AG308, Tyrphostin AG494, Tyrphostin AG555, 3,4-Dihydroxy-cis-cinnamonitril, Tyrphostin AG825, Tyrphostin AG765, Tyrphostin A48, Tyrphostin A51, Tyrphostin B42, Tyrphostin B44(–), Tyrphostin B46, Tyrphostin B48, Tyrphostin B50(+) und Tyrphostin B56. Die Strukturen dieser Verbindungen sind bei Levitzki und Gazit und/oder in dem CALBIOCHEM®-Katalog von 1995 auf den Seiten 143–153 wiedergegeben. Vorzugsweise umfasst der durch Strukturformel (I) wiedergegebene PTK-Inhibitor 3,4-Dihydroxy-cis-cinnamonitril, d.h. m ist 2, R1 ist -H und R2 ist -CN.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst der synthetische PTK-Inhibitor das durch Formel (II) wiedergegebene Dianilinophthalimid:
    Figure 00050001
    worin R3-R6 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe -H, -Cl, -OH und -OMe. Beispiele sind 3,4-Dianilinophthalimid und 2,5-Dianilinophthalimid. Die Strukturen dieser Verbindungen sind bei bei Levitzki und Gazit veröffentlicht.
  • In einer anderen Ausführungsform ist der synthetische PTK-Inhibitor eine Verbindung, die Chinolin oder Isochinolin umfasst und durch die Strukturformel (III) wiedergegeben wird:
    Figure 00050002
    in welcher n eins, zwei oder drei ist und RIII ein organischer Rest ist, der so ausgewählt ist, dass die durch Strukturformel (III) wiedergegebene Verbindung PTKs hemmt. Beispiele für geeignete organische Reste sind -CO-NH2, -CS-NH2, -CO-NHR10, -CS-NHR10, substituierter Alkyl und substituierter Alkenyl. R10, der substituierte Alkyl und der substituierte Alkenyl sind wie oben für die Strukturformel (I) definiert. Beispiele für Verbindungen, die PTK-Inhibitoren sind und Isochinolin umfassen sind durch die Strukturformel (IV) wiedergegebene Verbindungen:
    Figure 00060001
  • In einer weiteren Ausführungsform ist der synthetische PTK-Inhibitor eine Chinazolin aufweisende Verbindung und wird durch die Strukturformel (V) wiedergegeben:
    Figure 00060002
    in welcher n eins, zwei oder drei ist und RV ein organischer Rest ist, der so ausgewählt wurde, dass die durch Strukturformel (V) wiedergegebene Verbindung ein PTK-Inhibitor ist. RV kann beispielsweise -NHR11, -OR11, -SR11 sein, wobei RIII eine Phenylgruppe, eine substituierte Phenylgruppe, eine substituierte Heteroarylgruppe oder eine Heteroarylgruppe (z.B. Pyrimidyl oder Pyridinyl) ist, die wahlweise mit einem oder mehreren Substituenten substituiert sind, welche ausgewählt sind aus der Gruppe Halogen, -OH, -OMe, -NH2, -CN und -NO2. Tyrphostin AG1478 ist ein Beispiel für eine durch die Strukturformel (V) wiedergegebene Verbindung. Die Struktur dieser Verbindung wird bei Levitzki und Gazit gezeigt. Siehe auch Barker, europäische Patentanmeldung 0520722 (1992), Fry et al. Science 255:1093 (1994) und Osherov und Levitizki, Eur. J. Biochem. 225:1047 (1994).
  • In einer anderen Ausführungsform wird der PTK-Inhibitor durch die Strukturformel (VII) wiedergegeben:
    Figure 00070001
    in welcher m, R1 und R2 die gleiche Bedeutung wie oben für die Strukturformel (I) haben und p eine ganze Zahl von eins bis etwa acht ist, vorzugsweise von eins bis etwa vier.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist der PTK-Inhibitor ein Triphostin. Triphostine werden in Mazunder et al., Biochemistry 34:15111 (1995) definiert, deren ganze Lehre hiermit als Referenz in die vorliegende Anmeldung einbezogen wird.
  • Weitere Beispiele für PTK-Inhibitoren sind Tyrphostin AG10, Tyrphostin AG17, Tyrphostin AG825, Tyrphostin AG789, Tyrphostin AG1112, Tyrphostin AG 370, Tyrphostin AG 879, Bis-trphostin, 5-Amino-N-(2,5-dihydroxybenzyl)methylsalicylat, 2,5-Dihydroxymethylcinnamat, HNMPA-(AM)3, RG-13022, RG-14620 und ST638. Verbindungen, welche den katalytischen Ort der Tyrosinkinase hemmen sind die Ca2+-Antagonisten Chlorpromazin, Imipramin und Dibucain (End et al., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 107:670 (1987), Flavonoide (Hagiwara et al., Biochem. Pharmacol 37:2987 (1987), 4-Hydroxycinnamide (Shiraishi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 147:322 (1987) und α-Cyanocinnamide (Shiraishi et al., Chem. Pharm Bull. 36:914 (1988). Zu den Strukturen dieser Verbindungen siehe auch Levitzki und Gazit oder den CALBIOCHEM®-Katalog von 1995.
  • Es ist darauf hinzuweisen, dass sich zu den Strukturformeln I–VII und zu den oben angeführten Verbindungen viele Modifikationen herstellen lassen, welche Analoga ergeben, die ebenfalls PTK-Inhibitoren sind. Solche Modifikationen sind der Ersatz einer phenolischen Hydroxylgruppe durch -H, eine Niederalkylgruppe (z.B. eine gerad- oder verzweigtkettige C1-C4-Alkylgruppe), -Cl, -OCH3 oder -NH2 oder die Addition einer -Cl-, -OCH3- oder -NH2-Gruppe an einen Phenol- oder Resorcinring. Analoga wie die oben beschriebenen fallen unter die Bedeutung des Ausdrucks "PTK-Inhibitor" und lassen mit Hilfe von in vitro-Assays durch ihre Fähigkeit, z.B. in Kultur den IL-1 stimulierten Knorpelabbau in Chondrocyten zu hemmen, identifizieren, wie z.B. der in Beispiel 1 beschriebene Assay.
  • Unter einer "therapeutisch wirksamen Menge" eines Proteintyrosinkinase-Inhibitors wird die Menge an Inhibitor verstanden, welche nach ihrer Verabreichung an eine Person oder ein Tier mit Osteoarthritis eine Verbesserung des mit der Osteoarthritis einhergehenden Krankheitsverlaufs bewirkt, ohne dass nicht hinnehmbare Nebenwirkungen verursacht werden. "Verbesserung des mit einer Osteoarthritis einhergehenden Krankheitsverlaufs" kann eine Senkung der Menge an aktiver Matrix-Metalloproteinase in der Person sein, z.B. durch Hemmung einer Matrix-Metalloproteinase, durch Verhinderung der Transkription eines eine Matrix-Metalloproteinase kodierenden Gens, durch Verhinderung der Synthese und/oder Sekretion einer Matrix-Metalloproteinase oder durch Verhinderung der von IL-1 induzierten Aufregulation der Aktivität der Matrix-Metalloproteinase. Alternativ kann sie auch eine Verlangsamung, ein Anhalten oder eine Umkehr der Verminderung des Verlusts der Funktion sein, welche typischerweise in mit Osteoarthritis befallenen Gelenken beobachtet wird, beispielsweise durch Verringerung der Abbaugeschwindigkeit von Knorpel im Gelenk. "Verbesserung des mit einer Osteoarthritis einhergehenden Krankheitsverlaufs" kann auch eine Linderung des mit einer Osteoarthritis einhergehenden Schmerzes oder Entzündung sein.
  • Der Fachmann ist in der Lage, die Menge an Inhibitor zu bestimmen, die einem Menschen oder einem Tier zu verabreichen ist. Die Menge an PTK, die einem Menschen oder einem Tier zu verabreichen ist hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, wie dem allgemeinen Gesundheitszustand, der Größe, dem Alter und Geschlecht von Mensch oder Tier sowie von dem Weg der Verabreichung. Sie hängt auch von dem Ausmaß, dem Ort und der Heftigkeit der Osteoarthritis oder dem Knorpelabbau von Mensch und Tier ab. Ein Fachmann ist in der Lage, an Hand dieser und anderer Faktoren die genaue Dosierung zu bestimmen. Typischerweise werden einer Person zwischen etwa 0,1 und 1000 mg pro Tag verabreicht. Vorzugsweise werden einer Person zwischen etwa 0,1 und 100 mg pro Tag verabreicht, mehr bevorzugt zwischen etwa 1 und 300 mg pro Tag. Die einem Tier verabreichte Menge an PTK-Inhibitor hängt von der Art des Tieres ab.
  • Der Inhibitor kann intrartikulär (z.B. durch Injektion) in eine Gelenk mit durch Osteoarthritis verursachten Knorpelabbau verabreicht werden. Eine intraartikuläre Injektion hat den Vorteil, dass der Inhibitor auf den Ort der Injektion lokalisiert bleibt und dass die Konzentration des Inhibitors in anderen Körperteilen reduziert wird. Dies ist besonders für die Reduktion unerwünschter Nebenwirkungen von Vorteil. wenn der zur Behandlung von Osteoarthritis oder zur Verminderung des Knochenabbaus eingesetzte Proteintyrosinlcinase-Inhibitor unspezifisch ist und auch andere Proteinkinasen hemmt. Andere Arten von parenteraler Administration, die sich einsetzen lassen, sind eine systemische Verabreichung wie z.B. eine intramuskuläre, intravenöse, subkutane oder intraperitoneale Injektion.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Inhibitor oral verabreicht werden, z.B. in Kapseln, Suspensionen oder Tabletten. Alternativ lässt sich der Inhibitor topisch nahe dem Gelenk mit durch Osteoarthritis verursachtem Gelenkabbau verabreichen.
  • Der PTK-Inhibitor kann an Mensch oder Tier zusammen mit einem verträglichen pharmazeutischen Träger als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Osteoarthritis verabreicht werden. Geeignete pharmazeutische Träger können inerte Inhaltsstoffe enthalten, die mit dem PTK-Inhibitor nicht in Wechselwirkung treten. Es lassen sich pharmazeutische Standardformulierungstechniken einsetzen, wie die in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. beschriebenen. Geeignete pharmazeutische Träger für intraartikuläre und andere parenterale Verabreichung sind z.B. steriles Wasser, physiologische Kochsalzlösung, bakteriostatisches Salz (Saline mit ca. 0,9% mg/ml Benzylalkohol), phosphatgepufferte Saline, Hanks-Lösung, Ringers Lactat und dergl.. Verfahren zum Verkapseln der Zusammensetzungen (wie z.B. bei einer Beschichtung mit Hartgelatine oder Cyclodextran) sind im Stand der Technik bekannt (Baker, et al., "Controlled Release of Biological Active Agents", John Wiley and Sons, 1986). Geeignete Träger für eine topische Verabreichung sind im Handel erhältliche Inertgele, mit Albumin supplementierte Flüssigkeiten, Methylcellulose oder eine Kollagenmatrix. Typisch für eine solche Formulierung sind Salben Cremes und Gele. Bevorzugte Träger für topische Verabreichung sind solche, welche die Penetration des PTK-Inhibitors durch die Haut erleichtern.
  • Der PTK-Inhibitor kann auch als zumindest ein physiologisch verträgliches Salz verabreicht werden, wie z.B. das Hydrochloridsalz, das Hydrobromidsalz und das Essigsäuresalz.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Zusammensetzung zusätzlich zum Inhibitor eines oder mehrere pharmakologisch aktive Mittel. Osteoarthritis ist in den befallenen Gelenken durch Schmerz gekennzeichnet. Folglich kann es von Vorteil sein, den PTK-Inhibitor mit einem Analgetikum oder einer anderen schmerzstillenden Beimischung zu verabreichen. Geeignete Analgetika sind Acetylsalicylsäure, Acetominophen und dergl..
  • Osteoarthritis kann durch eine Entzündung in den befallenen Gelenken gekennzeichnet sein. Folglich kann es auch vorteilhaft sein, den PTK-Inhibitor zusammen mit einem entzündungshemmenden Mittel wie ein nicht steroides entzündungshemnmendes Medikament oder ein Steroid (z.B. Triamcinolon, Amcinonid und dergl.) zu verabreichen. Eine Osteoarthritis ist auch durch eine Überaktivität von Matrixmetalloproteinase-Enzymen gekennzeichnet. Folglich kann es auch von Vorteil sein, den PTK-Inhibitor zusammen mit einem Matrixmetalloproteinase-Inhibitor zu verabreichen.
  • Die Erfindung wird nun ausführlicher und genauer durch die folgenden Beispiele beschrieben. Wo Gemistein vorkommt sollte es als Bezugssubstanz angesehen werden.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Hemmung des Knochenabbaus durch Proteintyrosinkinase-Inhibitoren in einem Matrix.Breakdown-Assay von Chondrocyten in Zellkultur
  • Isolierung des Knorpels
  • Es wurde ein Zellkultur-Assay verwendet, um die Fähigkeit der Testverbindungen zu messen, den Abbau der extrazellulären Matrix mittels einer Metalloproteinase zu verlangsamen. Dieser Assay maß die Menge des 35S, der aus Chondrocyten freigesetzt wurde, die in einem Medium mit 35S-markiertem Natriumsulfat wuchsen. Der Zellkultur-Assay wurde wie folgt durchgeführt:
    Von einem Schlachthof wurden zwei oder drei Gelenke von 1 bis 2 Wochen alten Kälbern erhalten. Das proximale Ende des Unterschenkels war etwa 4 bis 5'' lang, um die Immobilisierung im Halter zu erleichtern. Das Gelenk wurde gekühlt gehalten und auf Eis transportiert. Die unversehrten Gelenke wurden außen mit einer geeigneten antimikrobiellen Seife gut gewaschen, mit warmem Wasser sauber abgewaschen, in Betadin und schließlich mit 70% Ethanol gereinigt. Bis zu diesem Zeitpunkt wurden alle Schritte so durchgeführt, dass sichergestellt war, dass das Gelenk so sauber wie möglich gehalten wurde. Alle nachfolgenden Schritte erfolgten in einer sterilen Umgebung (d.h., ein Edgeguard-Abzug für Gewebekulturen mit laminarer Strömung). Das Gelenk wurde immobilisiert und die Synovialflüssigkeit mit eine Nadel und einer Spritze abgesaugt. Das Gelenk wurde sodann unter Verwendung eines #21 Skalpells aufgeschnitten, um den Gelenkknorpel freizulegen. Unter Verwendung von verschließbaren Gefäßklemmen, Zangen und einem #15 Skalpell wurde der Knorpel in Stücken mit vollständiger Dicke herausgeschnitten. Sorgfalt wurde darauf verwandt, nicht zu tief in den unter dem Knorpel liegenden Knochen hineinzuschneiden, um ein Bluten zu verhindern. Die Knorpelstücke wurden in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen gegeben, das 25 ml mit einer 1 % Antibiotikalösung (Penicillin, Streptomycin, und Fungizon; GIBCO/BRL) supplementierte phosphatgepufferte Saline nach Dulbecco (D-PBS) enthielt. Die Scheiben von jedem Gelenk wurden sodann in getrennte 50 ml Zentrifugenröhrchen gegeben. Die D-PBS wurde dekantiert und durch 25 ml mit Antibiotika supplementierte frische D-PBS ersetzt und dann vorsichtig gerührt.
  • Enzymatischer Verdau
  • Die Knorpelstücke wurden in ein frisches 50 ml Zentrifugenröhrchen übertragen und noch einmal mit 25 ml antibiotikafreiem D-PBS gewaschen. Für den enzymatischen Verdau wurde eine Lösung mit 1 mg/ml Hyaluronidase in serumfreiem 1:1 DMEM/Ham's F-12 hergestellt. Diese Lösung wurde mit einem 0,22 mm Milex-GV-Filter sterilfiltriert und bis zu ihrer Verwendung auf Eis gehalten. Die Knorpelstücke wurden in dem 50 ml Zentrifugenröhrchen mit annähernd 5 ml Hyaluronidaselösung pro Gelenk 2 × 15 Minuten lang bei 37°C unter sorgfältigem Rühren bei der 15-Minutenmarke einem Verdau unterzogen. Diese Vorgehensweise entfernte restliche Hyaluronsäure von der Oberfläche der Scheibchen. Die Lösung für den enzymatischen Verdau wurde sodann abgezogen und die Knorpelstücke mit 25 ml D-PBS gewaschen.
  • Es wurde eine zweite Lösung für den enzymatischen Verdau mit 2,5 mg Trypsin und 2 mg Collagenase P pro ml serumfreiem DMEM/F12 hergestellt. Diese Lösung wurde ebenfalls mit einem 0,22 mm Milex-GV-Filter sterilfiltriert und bis zu ihrer Verwendung auf Eis gehalten. Die Knorpelstücke wurden in dem 50 ml Zentrifugenröhrchen mit annähernd 5 ml Trypsin:Hyaluronidase-Lösung pro Gelenk 2 × 15 Minuten lang bei 37°C unter sorgfältigem Rühren bei der 15-Minutenmarke einem Verdau unterzogen. Diese Vorgehensweise entfernte die synovialen Fibroblasten und jegliches anhängende Bindegewebe von der Oberfläche der Scheibchen. Die Lösung für den enzymatischen Verdau wurde sodann sorgfältig entfernt und aufbewahrt und die Knorpelstücke mit 25 ml D-PBS gewaschen.
  • Es wurde eine dritte Lösung mit 2 mg Collagenase P (BMB) pro ml serumfreiem DMEM/F12 hergestellt. Diese Lösung wurde mit einem 0,22 mm Milex-GV-Filter sterilfiltriert und bis zu ihrer Verwendung auf Eis gehalten. Die vorverdauten Knorpelstücke wurden zuletzt mit nahezu 20 ml einer Lösung für den enzymatischen Verdau pro Gelenk 5 bis 6 Stunden lang bei 37°C in einem Bellco-Verdauungskolben unter Rühren einem Verdau unterzogen, zu welchem Zeitpunkt dann das Knorpelgewebe vollständig verdaut war.
  • Kultur und Wachstum isolierter Chondrocyten
  • Die Enzyme für den Verdau der synovialen Fibroblasten und Chondrocyten wurden durch Zugabe eines gleichen Volumens von mit 5% fötalem Rinderserum supplementiertem DMEM/F12 neutralisiert. Die Fibroblasten wurden in DMEM mit einer Zelldichte von 6,6 × 103 Zellen pro cm2 ausplattiert. Die Chondrocyten wurden mittels Filtration durch ein 70 mm Zellfilter aus Nylon (Falcon Labware, Inc.) gewonnen, welcher die verbliebenen unverdauten Zellstücke und Zellklumpen entfernte. Die Chondrocyten wurden sodann mittels Zentrifugation bei 1000 g über zehn Minuten bei Raumtemperatur gesammelt. Die Chondrocyten wurden dann in 40 ml mit 5% fötalen Rindersserum supplementiertem DMEM/F12 resuspendiert. In einem Coulter-Counter wurde ein Aliquot von 200 μl in 20 ml isotonischer Lösung ausgezählt. Die Chondocyten wurden mit 1:1 (v/v) DMEM/F12, der mit 5% fötalem Rinderserunm supplementiert worden war, auf eine Dichte von 2 × 104 Zellen pro cm2 Kulturoberfläche verdünnt. Mit dieser Dichte konnten die Zellen, sobald sie plattiert waren, zusammenfließen. Vier Tage später wurden die Zellen erneut mit Medium gefüttert. Diese Zeitspanne stellte sicher, dass sich die Chondrocyten an die Kunststoffvertiefungen anhefteten.
  • Die Chondrocyten wurden pro Vertiefung mit 8 × 104 Zellen/2 cm2 mit 0,5 ml 1:1 (v/v) DMEM/F12, der mit 10% fötalem Rinderserum supplementiert war in 24 Lochplatten plattiert und 4 Tage lang inkubiert. Die Kulturen wurden dann an den Tagen 4, 7, 11, 14, 18 und 21 mit 0,5 ml/Vertiefung DMEM/F12 plus 10% fötalem Rinderserum gefüttert. Zu diesem Zeitpunkt waren die Zellen dicht zusammengewachsen und haben eine dreidimensionale extrazelluläre Struktur ausgebildet.
  • Radiomarkierung und Chase von Chondrocyten
  • Am Tag 22 werden die Vertiefungen mit 2 × 1 ml D-PBD gewaschen und 30 Minuten in 0,5 ml DMEM/F12 pro Vertiefung inkubiert. Dieses Hungermedium wurde entfernt, durch 0,5 ml/Vertiefung DMEM/F23 plus 10 μCi 35S-markiertem Natriumsulfat ersetzt und 48 Stunden bei 27°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden sodann erneut mit 0,5 ml DMEM/F12 plus 10% fötalem Rinderserum gefüttert. Die Kulturen wurden zwei weitere Tage mit kaltem Sulfat (in den Gewebskulturmedien) "gechased" und am Tag 26 erneut mit 0,5 ml frischem DMEM/F12 plus 10% fötalem Rinderserum gefüttert.
  • Experimenteller Zusatz und Ernte
  • Am Tag 27 wurden die Vertiefungen mit 2 × 1 ml D-PBD gewaschen und 22–24 Stunden in 0,5 ml serumfreiem DMEM/F12, 1 ng/ml rhIL-1α plus der zu testenden Verbindung mit den gewünschten Konzentrationen inkubiert.. Die Vertiefungen wurden sorgfältig gewaschen, um jegliches restliche fötale Rinderserum zu entfernen, welches die Endergebnisse beeinflussen könnte. Es erfolgte ein erster Kontrolldurchgang, in welchem der Assay ohne die zu untersuchende Verbindung ausgeführt wurde. Ein zweiter Kontrolldurchgang wurde ebenfalls unternommen, in welchem der Assay ohne die Test-Verbindung und ohne rhIL-1α ausgeführt wurde. Am Tag 28 wurden die 0,5 ml Medium entnommen und in einem Minigefäß mit 4 ml Szintillationsflüssigkeit ausgezählt. Die Zellschicht wurde mit 1 × 1 ml D-PBS gewaschen und und mit 0,5 ml 1 × Trypsin-EDTA (erworben von Gibco-BRC, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland) (inkubiert über mindestens 15–20 Minuten) wie zuvor zur Szintillationsmessung geerntet. Die Daten werden gemäß der folgenden Formel als von der Gesamtheit in das Medium abgegebene prozentuale Radiomarkierung angegeben:
    Figure 00140001
  • Die mittlere prozentuale Freisetzung wird verwendet, um nach der folgenden Formel die prozentuale Hemmung zu ermitteln:
    Figure 00140002
    in welcher
    • A
    = % Freisetzung in Gegenwart der Testverbindung;
    B
    = % Freisetzung in der Kontrolle; und
    C
    = % Freisetzung in Gegenwart von rhIL-1α
    bedeuten.
  • Die in diesem Versuch untersuchten Kinaseinhibitoren waren 10 μM Herbimycin A (PTK-Inhibitor), 50 µM Genistein (PTK-Inhibitor), 5 µM H88 (Proteinkinase A-Inhibitor, im Folgenden als "PKA"-Inhibitor bezeichnet), 0.5 µM H89 (PKA-Inhibitor), 0.5 µM Calphostin C (Proteinkinase C-Inhibitor, im Folgenden als "PKC"-Inhibitor bezeichnet) und 5 µM KN-93 (Ca/Calmodulin-abhängiger Kinase II-Inhibitor). Lediglich die Tyrosinkinase-Inhibitoren Herbimycin A und Genistein übten auf die IL-1 induzierte Freisetzung von 35S-markierten Proteoglykanen eine Hemmwirkung aus, wobei die Hemmwirkung sich auf 75%–100% belief. PKC, PKA und die Ca/Calmodulin-abhängigen Kinase II-Inhibitoren wiesen keine Wirkung auf.
  • Der oben beschriebene Assay wurde wiederholt. Genistein und Herbimycin A zeigten 58% bzw. 89% Hemmung. Eine geringe oder gar keine Hemmung wurden bei den obigen PKA-, PKC-, PKG- (0,5 µM H89) und Ca/Calmodulin-abhängigen Kinase II-Inhibitoren beobachtet. Der Kaseinkinase I-Inhibitor CKI-7 (20 µM) zeigte auch keine Wirkung. Zusätzlich ist die Tatsache anzuführen, dass auch verschiedene Tyrphostine (Tyrosinkinase-Inhibitoren) in diesem Assay untersucht wurden. Die Konzentrationen und prozentualen Hemmungen waren wie folgt: 50 µM Tyrphostin AG 82 (40% Hemmung), 50 µM Tyrphostin AG 126 (keine Hemmung), 50 mM Tyrphostin AG 556 (100% Hemmung), 1 µM Tyrphostin AG 129G (keine Hemmung) und DAPH mit 2 µM (keine Hemmung) and 20 µM (keine Hemmung).
  • Beispiel 2
  • Hemmung des Knorpelabbaus im Assay mit Rinderknorpelexplantat durch Proteintyrosinkinase-Inhibitoren
  • Es wurde ein Gewebekultur-Assay verwendet, um zu bestimmen, ob die Verbindungen der vorliegenden Erfindung fähig sind, den Abbau der extrazellulären Matrix durch Metalloproteinasen zu verlangsamen. Dieser Assay bestimmt den Gehalt an 35S-Glycosaminoglykan (35S-GAG), das aus markierten Rinderknorpelexplantaten freigesetzt wurde.
  • Kniegelenkce von 1 bis 3 Wochen alten Kälbern wurden unmittelbar nach der Schlachtung aus dem Schlachthof erhalten und dann auf Eis transportiert. Die unversehrten Gelenke wurden gut mit Leitungswasser gewaschen und in einer von Burre National, Inc„ Baltimore, MD. erhaltenen 50% (v/v) Povidin-Iod-Lösung getränkt. Alle folgenden Schritte erfolgten unter Verwendung steriler Standardtechniken in einem Abzug für Gewebekulturen mit laminarer Strömung. Das Gelenk wurde in einem Schienbeinhalter immobilisiert und die Gelenkkapsel aufgeschnitten, um den Gelenkknorpel freizulegen. Knorpelexplantatpfropfen von etwa 15 mg Nassgewicht wurden unter Verwendung eines sterilen Korkenziehers aus Stahl aus den flachen gelenkigen Oberflächen des untersten Knieabschnitts entnommen und in einer 250 ml Druckflasche gesammelt, die etwa 100 ml frisches Minimum Essential Medium nach Dulbecco (DMEM) enthielt, welches von Gibco BRC, Life Technologies, Gaithersburg, MD erhalten wurde und 4,5 g/L (D)-Glucose und (L)-Glutamin ohne Natriumpyruvat enthielt. Die frischen Medien enthielten auch genug Hepes-Puffer und Natriumbicarbonat, so dass der pH-Wert etwa 7,4 betrug. Ferner wurden die Medien unmittelbar vor Gebrauch mit 100 Einheiten Penicillin, 100 μg Streptomycin und 50 μg (L)-Ascorbinsäure pro ml Medium supplementiert.
  • Nach dem Waschen wurden die Pfropfenexplantate vier mal mit 50 ml frischem DMEM gewaschen. Die Pfropfen wurden dann zum Äquilibrieren für mindestens 1 Stunde in den Inkubator gebracht, bevor mit der Herstellung von Scheiben aus der zusammenhängenden gelenkigen Oberfläche eines jeden Pfropfens fort gefahren wird. Von einzelnen Pfropfen wurde von dem Ende, das die zusammenhängende Oberfläche des Gelenks bildet eine 1 mm dicke Scheibe abgeschnitten. Unter Verwendung einer sterilen Klemme wurde der Pfropfen stabil auf der sterilen Unterlage (4 mm Durchmesser × 1,5 mm Tiefe) gehalten. Zum sorgfältigen Abschneiden der Scheibe wurde eine Skalpellklinge verwendet. Nur die an der Oberfläche zusammenhängende Fläche ließ sich gut in Kultur halten.
  • Die einzelnen erhaltenen Scheiben wurden in einen Gewebekulturkolben überführt, der etwa 100 ml frisches Medium enthielt. Der dir Scheiben enthaltende Kolben wurde in einen Inkubator mit 37°C (mit 5% CO2 und 95% Luft) gesetzt und über Nacht sowie mindestens einen zusätzlichen Tag vor der Markierung äquilibrieren gelassen. War man bereit zum Markieren, wurde das alte Medium durch 50 ml etwa 1,2 mCi 35C-Natriumsulfat enthaltendes frisches Medium ersetzt. Die Pfropfen wurden über etwa 48 Stunden als Masse markiert. Am nächsten Morgen wurde das "heiße" Medium entfernt und durch frisches "kaltes" Medium ersetzt. Die Scheiben wurden vor ihrer Verwendung für die jeweiligen Versuche erneut äquilibrieren gelassen.
  • Unmittelbar vor Durchführung des Assays wurde das Medium, in welchem die Scheiben aufbewahrt wurden, ausgetauscht. Die Scheiben wurden dann bis zur Herstellung des Testmediums und der beiden Kontrollmedien zum Inkubator zurück gebracht. Das Testmedium bestand aus der gewünschten Konzentration einer Verbindung, die auf ihre Fähigkeit getestet werden sollte, den extrazellulären Matrixabbau zu hemmen, zusammen mit rekombinantem menschlichem Interleukin rhIL-1α (5 ng/ml) in frischer DMEM-Lösung und Plasminogen (0,4 µM). Das Kontrollmedium war mit dem Testmedium identisch, mit der Ausnahme, dass das erste Kontrollmedium kein rhIL-1α enthielt und das zweite Kontrollmedium keine Testverbindung. Jeweils 250 μl Test- und Kontrollmedium wurden auf getrennte TC-Platten mit 96 Vertiefungen übertragen. Es wurden abgeflammte Klemmen verwendet, um eine Scheibe vom Inkubator zur jeweiligen TC-Platte mit 96 Vertiefungen zu übertragen, die entweder mit dem Testmedium oder einem der beiden Kontrollmedien gefüllt wurden.
  • Die Dünnschichtplatten wurden sodann in den Inkubator gelegt und 3–4 Tage lang kultiviert (die anfängliche Inkubation mit rhIL-1α braucht mindestens 3 Tage, um die endogenen Metalloproteinasen zu stimulieren). Ein Aliquot von 50 μl Medium von jeder TC-Platte wurde aufbewahrt und ausgezählt. Das restliche Medium wurde mit einer Saugvorrichtung entfernt.
  • Die Knorpelscheiben von jeder TC-Platte wurden ebenfalls zum Auszählen aufbewahrt. Die Scheiben wurden mit Klemmen entnommen, in Eppendorf-Cups gegeben und dann bei 50°–55°C 4–6 Stunden lang mit Papain verdaut. Ein Aliquot von 50 μl wurde sodann ausgezählt.
  • Die prozentuale Freisetzung von 35S-GAG wird wie folgt berechnet: % 35S-GAG-Freisetzung = {(cpmMedium)/cmpMedium + cpmExplantat)} × 100%
  • Die prozentuale Hemmung bei 50 µM extrazellulärer Matrixschädigung im Knorpelexplantat wurde wie folgt berechnet:
    Figure 00170001
    in welcher
    • A
    = % GAG-Freisetzung, induziert durch rhIL-1α;
    B
    = % GAG-Freisetzung in Abwesenheit von rhIL-1α; und
    C
    = % GAG-Freisetzung in Gegenwart von rhIL-1α plus 50 µM der zu testenden
    Verbindung.
  • In dem oben beschriebenen Assay wurden die folgenden Proteinkinase-Inhibitoren untersucht:
    Figure 00170002
  • Der Assay mit Herbimycin A (2 µM) (ein Tyrosinkinase-Inhibitor) zeigte ca. 70% Hemmung der IL-1-stimulierten Freisetzung von radiomarkiertem Proteoglykan. Keiner der anderen Proteinkinase-Inhibitoren zeigte irgend eine signifikante Hemmung der Proteoglykan- Freisetzung. Dieses Ergebnis zeigt, dass Proteintyrosinkinase-Inhibitoren die Aktivität von IL-1-induzierter Matrixmetalloproteinase (MMP) reduzieren kann. Für eine genauere Diskussion über die Rolle von IL-1 und Plasminogen für die Aktivität von MMP. siehe Beispiel 3.
  • Beispiel 3
  • Hemmung des IL-1-induzierten Aggrecanaseabbaus von 35S-markiertem Proteoglykan in Explantaten von Rinderknorpel durch Proteintyrosinkinase-Inhibitoren
  • Der in Beispiel 2 beschriebene Assay lässt sich mit und ohne zugesetztem Plasminogen ausführen. Mit Plasminogen wurden die aktiven Formen der Metalloproteinasen (MMPs) und des Plasmins erzeugt. Es wird angenommen, dass in diesem Assay die MMPs, "Aggrecanase" und Plasmin das Knorpelexplantat abbauten. Ohne zugesetztes Plasminogen legten die Western-Blot-Daten nahe, dass nur die inaktiven Vorformen der MMPs produziert wurden. In Abwesenheit von Plasminogen trat ein Knorpelabbau primär als Ergebnis der "Aggrecanase"-Aktivität auf.
  • Um auf Aggrecanase-Aktivität zu testen erfolgte der in Beispiel 2 beschriebene Assay ohne Zusatz von Plasminogen mit den folgenden Tyrosinkinase-Inhibitoren: Genistein (50 µM) und Herbimycin A (1 µM). Genistein zeigte eine 37% Hemmung, während Herbimycin A eine 78% Hemmung zeigte.
  • Für Herbimycin A erfolgte eine Dosiswirkung. Die Ergebnisse zeigen, dass 0,25 µM, 0,5 µM und 1,0 µM Herbimycin A die Freisetzung von 35S-markiertem Proteoglykan dosisabhängig hemmten: jeweils 55%, 63% und 78%.
  • In einem abschließenden Versuch wurden auch zwei Tryphostine (Tyrosinkinase-Inhibitoren) in dem oben beschriebenen Rinderexplantat-Assay untersucht: 50 µM Tryphostin AG 82 und 50 µM Tryphostin AG 126. Für Tryphostin AG 82 wurde eine 31% Hemmung beobachtet während sich bei Tryphostin AG 126 keine Wirkung bemerkbar machte.
  • Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Tyrosinkinase-Inhibitoren IL-1-induzierte Aggrecanase-Aktivität und den aus IL-1-induzierter Aggrecanase-Aktivität resultierenden Knorpelabbau hemmen können.
  • Beispiel 4
  • Hemmung von IL-1-induzierten Zuwächsen an Stromelysin-mRNA-Spiegeln in primären Chondrocyten von Rindern durch Proteintyrosinkinase-Inhibitoren
  • Die Isolierung von Knorpel und der enzymatische Knorpelabbau erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Die Chondrocyten wurden durch Zugabe eines gleichen Volumens DMEM/F12, das zur Neutralisierung der Enzyme mit mit 10% fötalem Rinderserum supplementiert worden war, durch Filtration durch ein 70 mm Zellfilter aus Nylon (Falcon) und durch Zentrifugation bei 1000 g über 10 Minuten bei Zimmertemperatur gewonnen. Die Chondrocyten wurden mit 5 × 104 Zellen/cm2 unter Verwendung von 1:1 DMEM/F12, 10% FBS, 1% Antibiotika-Lösung (Penicillin, Streptomycin, Fungizon:GIBCO/BRL) ausgesät und bei 32°C und 5% CO2 inkubiert.. Die Zellen wurden an den Tagen 4, 7 und 10 erneut mit DMEM/F12 plus 10% fötalem Rinderserum gefüttert. Am Tag 11 wurden die Zellkulturen (mit Ausnahme der + Interleukin 1α-Kontrolle) in phosphatgepufferter Saline gewaschen und 2 Stunden lang mit 5 ml serumfreiem DMEM/F12 vorinkubiert, das die folgenden Proteinkinase-Inhibitoren enthielt: 1) Proteinkinase A (PKA)-Iinhibitoren; 0.5 µM H88 (Seikagaku Corp.)„ 0.5 µM H89 (Seikagaku Corp.); 2) Proteinkinase G (PKG)- und PKA-Iinhibitor; 5,0 µM H89; 3) Proteinkinase C (PKC)-Inhibitoren; 0,5 µM Calphoszin C (Calbiochem); 1,0 µM Chelerythrin (Calbiochem); 4) Ca2+/Calmodulin-Kinase II-Inhibitor; 5.0 µM KN93 (Seikagaku Corp.); 5) Proteintyrosinkinase (PTK)-Inhibitoren; 50 µM Genistein (Calbiochem), 10 µM Herbimycin A (Calbiochem), 50 µM Tyrphostin A25 (AG 82) (Calbiochem), 50 µM Tyrphostin AG 126 (Calbiochem), 50 µM Tyrphostin B56 (AG 556) (Calbiochem), 20 µM DAPH (Calbiochem).
  • Es wurden sodann in serumfreiem DMEM/F12, das 1 % Antibiotika-Lösung enthielt, für 24 Stunden 1 ng/ml rekombinantes menschliches Interleukin 1α (IL-1 α) zu allen Zellkulturen gegeben.
  • Ein RNA STAT 60 (Tel-Test "B", Inc.) wurde eingesetzt, um aus der Zellschicht gemäß den Angaben des Herstellers die Gesamt-RNA zu isolieren. 15 μg Gesamt-RNA aus jeder der obigen Bedingungen wurden in einem 2,2 M Formaldehyd/1,2% Agarosegel abgetrennt und auf eine Trägermembran aus Nylon (Schleicher & Schuell) übertragen, indem unter Verwendung des "TURBOBLOTTER"-Systems nach den Angaben des Herstellers (Schleicher & Schuell) ein milder alkalischer Transfer erfolgte. Die RNA auf dem Northern Blot wurde durch entwickeln bei 80°C über 30 Minuten auf der Membran fixiert.
  • Die DNA-Sonden für das menschliche Stromelysin und die menschliche Glyceraldehyd-6-Phosphatdehydrogenase (GADPH) wurden mit [α-32P]dCTP (Amersham) unter Verwendung des Random Priming Kit (Boehringer Mannheim) und nach den Angaben des Herstellers markiert.
  • Die Vorhybridisierung (1,5 Stunden) und die Hybridisierung (über Nacht) des Northern Blots mit den radioaktiven Sonden erfolgten in 50% Formamid, einer 1 × GIBCO/BRL-Hybridisierungslösung,. 0,1 % SDS und 10 mM einbasischem Natriumphosphat bei 42°C. Der Blot wurde nacheinander zwei mal in 1 × SSC/0,1% SDS gewaschen (15 Minuten pro Waschung bei Zimmertemperatur) und zwei mal in 0,2 × SSC/0,1% SDS (30 Minuten/Waschung bei 55°C). Der Blot wurde in der Luft trocknen gelassen und über Nacht bei –70°C einem Röntgenfilm mit Verstärkerschirm ausgesetzt.
  • Die Ergebnisse des Northern Blot Versuchs zeigen auf dramatische Weise, dass die Tyrosinkinase-Inhibitoren Genistein, Herbimycin A, Tyrphostin B56 (AG 556) und DAPH in der Lage waren, die IL-1-induzierte Aufregulation der Stromelysin-mRNA-Spiegel zu hemmen. Eine totale Hemmung der IL-1-induzierten Aufregulation von Stromelysin-mRNA trat auf, wenn die Tyrosinkinase-Inhibitoren eingesetzt wurden. Keiner der PKA-, PKC-, PKG- oder Ca2+/Calmodulin-Kinase II-Inhibitoren war in der Lage, irgendeine Wirksamkeit zu entwickeln, da im Vergleich mit den Spiegeln in IL-1-behandelten Chondrocyten keine Reduktion der Stromelysin-mRNA-Spiegel zu sehen war. Zusätzlich übten die beiden Tyrosikonase-Inhibitoren Tryphostin A25 (AG 82) und Tryphostin AG 126 keine Wirkung auf IL-1-induzierte Stromelydin-mRNA-Spiegel aus, was zeigt, dass innerhalb der Proteintyrosinkinase-Inhibitoren eine Anforderung an die Spezifität besteht.
  • Beispiel 5
  • Hemmung von IL-1-induzierten Zuwächsen an Prostromelysin-Protein-Spiegeln in primären Chondrocyten von Rindern durch Proteintyrosinkinase-Inhibitoren
  • Die Isolierung und Kultur der primären Gelenkschondrocyten von Rindern sowie die Zugabe der Inhibitoren erfolgten wie oben in Beispiel 4 angegeben. Die folgenden Proteinkinase-Inhibitoren wurden untersucht: 1) Proteinkinase A (PKA)-Iinhibitoren; 0.5 µM H88 (Seikagaku Corp.)„ 0.5 µM H89 (Seikagaku Corp.); 2) Proteinkinase C (PKC)-Inhibitoren; 0,5 µM Calphostin C (Calbiochem); 1,0 µM Chelerythrin (Calbiochem); 3) Ca2+/Calmodulin-Kinase II-Inhibitor; 5.0 µM KN93 (Seikagaku Corp.); 4) Proteintyrosinkinase (PTK)-Inhibitoren; 50 µM Genistein (Calbiochem), 10 µM Herbimycin A (Calbiochem).
  • Nach der 24-stündigen IL-1α-Inkubation wurde das Medium jeder Probe gemessen und auf Eis in Gegenwart der Proteaseinhibitoren EGTA (5mM), Pefabloc (1 mM), Pepstatin (1 μg/ml) und NEM (5 mM) gesammelt. Die Medien wurden unter Verwendung einer Centriprep-10-Ultrafiltrationsvorrichtung (Amicon) auf das etwa 40-fache aufkonzentriert. Die aufkonzentrierten Proben wurden zu äquivalenten Anfangskonzentrationen (Zellzahl/Kulturvolumen) normalisiert, in Gegenwart von SDS-Laemmli-Probenpuffer reduziert und in einem vorgegossenen 12% Polyacrylamidgel (BioRad) einer Elektophorese unterzogen. Die Proteinproben wurden sodann mittels Elektroblotting auf Nitrocellulose übertragen und unter Verwendung primärer Antikörper, welche sowohl Prostromelysin als auch Stromelysin erkennen, einem Immunnachweis unterzogen. Die immunreaktiven Banden wurden mittels eines ABC-Nachweises (Pierce) und eines NBT/BCIP-Farbreagenz (Sigma) sichtbar gemacht.
  • Prostromelysin ließ sich, wie erwartet, in Gegenwart von IL-1α nachweisen. Ohne eine IL-1α-Behandlung wurde kein Prostromelysin nachgewiesen. Ferner zeigte der Kontrollversuch, dass keiner der Inhibitoren in Abwesenheit von IL-1α eine Wirkung auf die Prostromelysinspiegel ausübte.
  • Die Inhibitoren H-88 und H-89 (spezifisch für PKA), Calphostin C (spezifisch für PKC) und KN-93 (spezifisch für Calcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II) zeigten keine Wirkung auf die IL-1α-induzierten Prostromelysinspiegel. Im Gegensatz dazu wurde von den beiden spezifischen Tyrosinkinase-Inhibitoren Genistein und Herbimycin A eine IL-1α-induzierte Prostromelysinexpression vollständig gehemmt.
  • Es wurde eine Wiederholung des Western-Immunoblotting-Versuchs unter Verwendung von Antistromelysin-Antikörpern durchgeführt. Ferner wurden zusätzliche Inhibitoren aus 4 Enzymfamilien untersucht: 1) Proteintyrosinkinase (PTK)-Inhibitoren: 1 µM Tyrphostin AG 1296 (Calbiochem), 50 µM Tyrphostin A25 (AG 82) (Calbiochem), 50 µM Tyrphostin AG 126 (Calbiochem); 2) Guanylatcyclase-Inhibitor; 10 µM LY 83583 (Calbiochem); 3) Caseinkinase I-Inhibitor; 20 µM CKI-7 (Seikagaku Corp.); und 4) Proteinkinase G (PKG)- und PKA-Inhibitor; 5.0 µM H89.
  • Die für die Inhibitorwirkungen an IL-1α-induzierten Prostromelysinproteinspiegeln erhaltenen Ergebnisse gleichen den für die Stromelysin-mRNA-Spiegel beobachteten (siehe Beispiel 4). PKC, PKA, PKG und Ca2+/Calmodulin-Kinase II-Inhibitoren wiesen keine Wirkung an IL-1α-induzierten Prostromelysinproteinspiegeln auf. Auch die Tyrphostine AG 126 und AG 1296, der Caseinkinase I-Inhibitor CKI-7 und der Guanylatcyclase-Inhibitor LY-83583 übten keine Wirkung auf die IL-1α-induzierten Prostromelysinproteinspiegel aus. Andererseits zeigten die Tyrosinkinase-Inhibitoren Herbimycin A, Genistein, Tryphostin AG 556 und DAPH eine dramatische Reduktion der Prostromelysinproteinspiegel. (Es ist darauf hinzuweisen, dass von DAPH erzeugte immunoreaktive Banden in ihrem Molekulargewicht den aktiven Formen von Stromelysin zu entsprechen schienen). Tyrphostin AG 82 zeigte eine leichte Hemmwirkung.
  • Diese Ergebnisse sowie die in Beispiel 4 angegebenen Ergebnisse legen nahe, dass Tyrosinkinase-Inhibitoren zumindest teilweise ihre Wirkung durch Verhinderung der Expression der Matrixmetalloproteinasen (MMP) und oder der Produktion von Matrixmetalloproteinase-mRNA ausüben.
  • Beispiel 6
  • Beurteilung von Genistein, Herbimycin A und Staurosporin in einem In-vitro-Cytotoxizitäts-Assay.
  • Durch die Beurteilung der Cytotoxizität von Verbindungen mit In-vitro-Verfahren lassen sich Kriterien zusammenstellen, mit denen sich eine Rangordnung unter den Verbindungen aufstellen lässt. In diesen Verfahren wird die Zellpermeabilität, die Freisetzung von cytosolischen Enzymen und das oxidative Potential der Zellen beurteilt. Der Einsatz von Tetrazolium-Farbstoffen zur Beurteilung der Cytotoxizität ist auf dem Gebiet der Onkologie eingeführt worden, wo solche Assays zur Beurteilung des cytotoxischen Potentials verschiedener Chemoterapeutika entwickelt wurden. Wir übernahmen den Einsatz von MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) in einem Assay unter Verwendung von primären Rindergelenkschondrocyten. Die Vorgehensweise bei diesen Assay wird im Folgenden beschrieben.
  • Wie in Beispiel 1 beschrieben, werden aus Kälbern radiokarpale Gelenke isoliert. Die Zellen wurden in mit 10% fötalem Rinderserum supplementiertem DMEM/F12-Medium auf zwei Platten mit 96 Löchern mit 4 × 104 Zellen pro Loch plattiert. An den Tagen 4, 7, 11, 14, 18, 21 und 24 werden die Kulturen neu versorgt. Am Tag 27 werden die Zellen mit PBS gewaschen und 20 Stunden lang mit 0,2 ml/Loch serumfreiem DMEM/F12 plus 0,1 % DMSO und den Testverbindungen inkubiert. Als Testverbindungen wurden jeweils Genistein (50 µM), Herbimycin (10 µM) und Staurosporin (1 µM) eingesetzt. Nach 20-stündiger Inkubation werden über 4 Stunden bei 37°C 50 einer 2 mg/ml MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) enthaltenden Lösung zugesetzt. Nach 24 Stunden wird das Medium entfernt und das Loch einmal mit 0,2 ml PBS ausgespült. Es werden dann zu jedem Loch 100 μl Mineralöl gegeben und die Platte über Nacht bei 40°C inkubiert. Die Platte mit 96 Löchern wird sodann in einem Mikroplattenleser bei 560 nm ausgelesen, wobei die Absorption bei 750 nm subtrahiert wurde, um die Zelltrümmer auszumachen.
  • Genistein und Herbimycin wiesen keine signifikante Cytotoxizität auf (Reduktion des MTT-Farbstoffs <50%). Staurosporin zeigte eine mit einer Cytotoxizität in Einklang stehende Reduktion von MTT und schien gegenüber kultivierten Chondrocyten über einen längeren Zeitraum cytotoxisch zu sein.
  • Beispiel 7
  • Wirkung von Proteintyrosinkinase-Inhibitoren auf den Aggrecan-Abbau in primären Rindergelenks-Chondrocyten
  • Primäre Rindergelenks-Chondrocyten von radiokarpalen Kalbsgelenken wurden wie oben in Beispiel 6 beschrieben isoliert und kultiviert, wobei die folgenden Proteinkinase-Inhibitoren zugesetzt wurden: 1) Proteinkinase A (PKA)-Iinhibitoren; 0.5 µM H88 (Seikagaku Corp.), 0.5 µM H89 (Seikagaku Corp.); 2) Proteinkinase C (PKC)-Inhibitoren; 0.5 µM Calphostin C (Calbiochem), 1.0 µM Chelerythrin (Calbiochem); 3) Ca2+/Calmodulin-Kinase II-Inhibitor; 5.0 µM KN93 (Seikagaku Corp.); 4) Proteintyrosinkinase-Inhibitoren; 50 µM Genistein (Calbiochem), 10 µM Herbimycin A (Calbiochem). Nach 24-stündiger IL-1α-Inkubation wurde das Medium jeder Probe gemessen und in Gegenwart der Proteinase-Inhibitoren EGTA (5 mM), Pefaloc (1 mM), Pepstatin (1 μg/ml) und NEM (5 mM) auf Eis gesammelt. Unter Verwendung einer Centripep-10-Ultrafiltrationsvorrichtung (Amicon) wurden die Medien auf das etwa 40-fache aufkonzentriert.
  • Nach dem Verfahren von Sandy et al. J Biol. Chem. (1991) 266:8683–8685 und Sandy et al. J. Clin. Invest. (1992) 89:1512–1516 wurden die in den Medien enthaltenen Proteoglykane durch Inkubationen mit Chondroitinase ABC, Keratinase und Keratinase II entglykosyliert. Die Proben der entglykosylierten Medien wurden einer 4–15% Gradienten-SDS-PAGE unterzogen und auf Nitrocellulosemembranen übertragen (Für ein 2-B-6- und BC-3-Immunoblotting wurden Mengen von 2 ml bzw. 6 ml Medium eingesetzt). Die Membranen wurden mit 1 % fettfreier Trockenmilch und 1 % BSA maskiert und sodann 1 Stunde lang entweder in einem primären monoklonalen BC-3-Antikörper oder einem primären monoklonalen 2-B-6-Antikörper inkubiert. Der 2-B-6-Antikörper weist auf mit Chondroitinase behandelten Proteoglykanen Reste von Chondroitinsulfat nach (sowohl unversehrte als auch Abbauprodukte). Der BC-3-Antikörper weist "ARGSV..." nach, das neue aus der Spaltung der interglobulären Aggrecan-Domäne bei Glu373/Ala374 durch Aggrecanase sich ergebende N-terminale Ende ("Neoepitop"). Es ist wichtig, zu erwähnen, dass die BC-3- und 2-B-6-Antikörper eine niedrige Sensitivität aufweisen. Nach drei Waschungen wurden die Membranen entweder mittels alkalischer Phosphatase konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Antikörpern (für den 2-B-6-Blot) oder biotinylierten Ziegen-Anti-Maus-Antikörpern (für den BC-3-Blot) inkubiert (gefolgt von einem mittels alkalischer Phaosphatase konjugierten Streptavidin/Biotin-Komplex). Nach dreimaligem Waschen wurden die immunoreaktiven Proteine unter Verwendung des kolorimetrischen Substrats NTB/BCIP (Sigma) nachgewiesen.
  • Das mit 2-B-6-Antikörpern nachgewiesene unversehrte Aggrecan (das oberste Band) sowie einige Aggrecan-Abbauprodukte befanden sich zusammen mit Decorin und Biglykan (50K Dublett) in den mit IL-1α behandelten Medienproben. Die Kontrollprobe (ohne IL-1) zeigt primär unversehrtes Aggrecan sowie sehr geringe Abbauprodukte. Die Bänder in den IL-1-Proben, die bei 230K, 200K, 130K und 100 K zu sehen sind, wurden zuvor mittels einer Sequenzanalyse als Spaltprodukte der IL-1-induzierten "Aggrecanase" identifiziert.
  • Zwischen den Proben sind drei Hauptunterschiede zu bemerken. Wie erwartet nimmt der Gesamtgehalt an PG-Fragmenten mit dem Verhältnis Il-1 zu Kontrolle zu (kein IL-1 vorhanden). Die Intensität eines Abbaufragments "230K" nimmt mit der IL-1-Stimulierung zu und es wurde gezeigt, dass dies von einer "Aggrecanase"-Spaltung herrührt. Die Intensität der Färbung (d.h. der Gesamtmenge an PG-Fragmenten) ist im Verhältnis zu H-88 und H-89 (PKA-Inhibitoren), Calphostin C und Chelerythrin (PKC-Inhibitoren) sowie Kn-93- Proben (Calmodulin-abhängiger Kinase-Inhibitor) in mit Gemistein und Herbimycin A behandelten durch IL-1 stimulierten Chondrocyten reduziert. Die Wirkung des Tyrosinkinase-Inhibitors stimmt mit den zuvor für Prostromelysin sowohl mit der Northern-als auch Wester-Blot-Analyse in den Beispielen 4 und 5 erhaltenen Ergebnissen überein.
  • Zusätzlich reduziert eine Behandlung von IL-1-stimulierten Chondrocyten mit Genistein und Herbimycin deutlich den Spiegel der 230K Aggrecan-Abbauprodukte, während die Spiegel der obersten Bande (unversehrtes Aggrecan) angehoben werden, was in Übereinstimmung ist mit einer Hemmung des Aggrecanabbaus. Im Gegensatz dazu zeigen die Proben mit H-88, H-89, Calphostin C, Chelerythrin und KN-93 ein dem IL-1 allein ähnliches Muster (d.h. ein ungefähr ähnliches Verhältnis von unversehrtem Aggrecan zu 230K Fragment).
  • Der BC-3-Antikörper wies eine immunoreaktive Bande bei etwa 230K in IL-1-stimulierten Proben ± H-89 (PKA-Inhibitor) oder Claphostin C (PKC-Inhibitor) nach, was eine Aggrecanase-Abbauaktivität anzeigt. Im Gegensatz dazu kommt dieses Aggrecanasevermittelte Fragment in mit den Tyrosinkinase-Inhibitoren Genistein und Herbimycin A behandelten Proben nicht vor, was mit den obigen 2-B-6-Ergebnissen in Übereinstimmung steht. Eine bemerkte Inkonsistenz betraf das Fehlen dieser Bande in der mit KN-93 (Calmodulin-abhängiger Kinaseinhibitor) behandelten Probe. In keiner der vorherigen Untersuchungen (z.B. Prostromelysin-Western-Blottimg, Northern-Blotting und 2-B-6) ist eine Wirkung dieses Inhibitors beobachtet worden. Die obigen BC-3- und 2-B-6-Daten unterstützen den Schluss, dass Inhibitoren von PTKs den IL-1-stimulierten Abbau von Proteoglykan durch Aggrecanase hemmen.
  • Es wurde eine Wiederholung des Western-Immunoblottung-Versuchs unter Verwendung von 2-B-6-Antikörpern durchgeführt. Ferner wurden vier zusätzliche Inhibitoren aus vier Enzymfamilien untersucht: 1) Proteintvrosinkinase (PTK)-Inhibitor; 1 µM Tryphostin AG 1296 (Calbiochem), 50 µM Tyrphostin A25 (AG 82) (Calbiochem}, 50 µM Tyrphostin AG 126 (Calbiochem), 50 µM Tyrphostin B56 (AG 556) (Calbiochem), 20 µM DAPH (Calbiochem); 2) Guanylatcyclase-Iinhibitor; 10 µM LY83583 (Calbiochem); 3) Caseinkinase I-Inhibitor; 20 µM CKI-7 (Seikagaku Corp.); und 4) Proteinkinase G (PKG)- und PKA-Iinhibitor; 5.0 µM H89.
  • Wie aus den obigen Ausführungen ersichtlich, lieferte das Kontrollmedium (kein IL-1, keine Inhibitoren) eine größere unversehrte Bande von Aggrecan. Auch keiner der Inhibitoren für PKA, PKC, PKG, der Calcium/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase II oder der Caseinkinase zeigten irgend eine Hemmung des IL-1-induzierten Aggrecanabbaus. Darüber hinaus zeigten die Tryphstine AG 126, und AG 1296 keine Hemmwirkung. Andererseits wurde eine Hemmung des IL-1-induzierten Aggrecanabbaus bei Herbimycin A (nahezu 100% Hemmung), Tyrphostin AG 556 (100% Hemmung), Genistein (teilweise Hemmung), DAPH (gemäßigt starke Hemmung) und Tyrphostin AG 82 (gemäßigte Hemmung) beobachtet.

Claims (11)

  1. Verwendung eines Proteintyrosinkinaseinhibitors zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Einzelperson oder eines Tieres mit Osteoarthritis durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des Proteintyrosinkinaseinhibitors an die Einzelperson oder das Tier, wobei der Proteintyrosinkinaseinhibitor nicht ein Flavon, ein Isoflavon, Hymenialdisin oder ein Hymenialdisinanalogon ist.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Proteintyrosinkinaseinhibitor (a) Interleukin-1 stimulierten Knorpelabbau in Chondrocyten in Zellkultur und/oder (b) Interleukin-1 stimulierte Biosynthese von Matrixmetallproteinaseenzymen in Chondrozyten in Zellkultur und/oder (c) Interleukin-1 stimulierten Knorpelabbau in einer Knorpelexplantatprobe und/oder (d) Interleukin-1 stimulierte Aggrecanaseaktivität durch Chondrocyten in Zellkultur inhibiert.
  3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch kekennzeichnet, dass der Proteintyrosinkinaseinhibitor (a) dargestellt ist durch die folgende Strukturformel:
    Figure 00270001
    wobei: m eins oder zwei ist, R1 -H, -OH oder -OMe ist, R2 -H, oder -CN ist, und RI -H, -NO2, Halogen oder ein organischer Rest ist, (b) dargestellt ist durch die folgende Strukturformel:
    Figure 00280001
    wobei R3– R6 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -H, -Cl, -OH und -OMe (c) eine Verbindung ist, dargestellt durch eine Struktur, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    Figure 00280002
    wobei: n eins, zwei oder drei ist und RIII und RV jeweils ein organischer Rest ist, (d)
    Figure 00290001
    wobei: m eins oder zwei ist, R1 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OH und -OMe, R2 -H, oder -CN ist, und p eine ganze Zahl von eins bis etwa acht ist (e) ein Tyrphostin oder (f) Herbimycin A ist.
  4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Proteintyrosinkinaseinhibitor (a) dargestellt ist durch die folgende Strukturformel:
    Figure 00290002
    ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Tyrphostin AG 556 und Tyrphostin AG82 oder (b) 4,5-Dianilinphthalimid (DAPH) ist.
  5. Verwendung eines Proteintyrosinkinaseinhibitors zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Einzelperson oder eines Tieres mit Osteoarthritis durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des Proteintyrosirilcinaseinhibitors an die Einzelperson oder das Tier, wobei der Proteintyrosinkinaseinhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Tyrphostin, Lavendustin, Erbstatin, Herbimycin, Rapamycin und Piceatannol.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Proteintyrosinkinaseinhibitor (a) Interleukin-1 stimulierten Knorpelabbau in Chondrocyten in Zellkultur und/oder (b) Interleukin-1 stimulierte Biosynthese von Matrixmetallproteinaseenzymen in Chondrozyten in Zellkultur und/oder (c) Interleukin-1 stimulierten Knorpelabbau in einer Knorpelexplantatprobe und/oder (d) Interleukin-1 stimulierte Aggrecanaseaktivität durch Chondrocyten in Zellkultur inhibiert.
  7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Proteintyrosinkinaseinhibitor in Kombination mit einem Analgetika, einem entzündungshemmenden Mittel oder einer Kombination daraus verabreicht wird.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Proteintyrosinkinaseinhibitor durch Injektion, oral oder topisch verabreicht wird.
  9. Verwendung eines Proteintyrosinkinaseinhibitors zur Herstellung eines Medikaments zur Verringerung von Knorpelabbau, das Chondrocyten aufweist, die mit einem Proteintyrosinkinaseinhibitor, ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Tyrphostin, Lavendustin, Erbstatin, Herbimycin, Rapamycin und Piceatannol, inkubiert wurde.
  10. Proteintyrosinkinaseinhibitor zur Verwendung in der Therapie bei der Behandlung einer Einzelperson oder eines Tieres mit Osteoarthritis durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des Proteintyrosinkinaseinhibitors an eine Einzelperson oder ein Tier, wobei der Proteintyrosinkinaseinhibitor einen Rest mit der folgenden Strukturformel:
    Figure 00310001
    aufweist:
  11. Verwendung eines Proteintyrosinkinaseinhibitors zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung einer Einzelperson oder eines Tieres mit Osteoarthritis durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des Proteintyrosinkinaseinhibitors an die Einzelperson oder das Tier, wobei der Proteintyrosinkinaseinhibitoreinen Rest mit der folgenden Strukturformel:
    Figure 00310002
    aufweist.
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