DE60313754T2

DE60313754T2 - Botanischer extrakt mit antikrebs-aktivität enthaltend isoliquiritigenin

Info

Publication number: DE60313754T2
Application number: DE60313754T
Authority: DE
Inventors: Sophie PH.D Millwood CHEN
Original assignee: MEDICAL RES AND EDUCATION TRUS; Medical Research and Education Trust San Diego
Current assignee: MEDICAL RES AND EDUCATION TRUS; Medical Research and Education Trust San Diego
Priority date: 2002-03-06
Filing date: 2003-03-06
Publication date: 2008-01-24
Anticipated expiration: 2023-03-07
Also published as: DE60313754D1; WO2003075943A3; AU2003217982A8; ATE361746T1; AU2003217982A1; WO2003075943A2; EP1487434B1; EP1487434A2

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Anmeldung betrifft botanische Extraktzusammensetzungen gemäß Anspruch 9 und deren Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Prostatakrebs.
HINTERGRUND
Es wird angenommen, dass Phytoöstrogene, wie die in Sojaprodukten enthaltenen Isoflavone, therapeutisches Potenzial in der Krankheitsbehandlung und -prävention haben. Insbesondere wird angenommen, dass Phytoöstrogene nützlich bei der Behandlung von mit Östrogen in Verbindung stehenden Störungen, wie zum Beispiel Osteoporose, Symptome der Menopause und hormonabhängige Krebsarten, sind.
Es wurde bereits beschrieben, dass endogene und exogene Hormone eine Rolle bei der Entstehung von hormonabhängigen Krebsarten, wie Brustkrebs, Darmkrebs, Lungenkrebs, Endometrialkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Harnblasenkrebs, Hodenkrebs, Schilddrüsenkrebs und Knochenkrebs spielen (siehe, zum Beispiel, Henderson et al, "Hormonal carcinogenesis", Carcinogenesis (2000), 21 (3): 427-433). Epidemiologische Untersuchungen haben gezeigt, dass eine Ernährungsweise mit einem hohen Anteil an Phytoöstrogenen, wie jene, die in Sojaprodukten enthalten sind, mit einer niedrigeren Inzidenz von hormonabhängigen Krebsarten einhergeht (H. Wiseman, "The therapeutic potential of phytoestrogens", Expert. Opin. Investig. Drugs (2000), 9 (8): 1829-40).
Das Prostatakarzinom, eine hormonabhängige Krebsart, ist ein großes Gesundheitsproblem unter den Männern Nordamerikas und Europas (S. H. Landis etal., "Cancer Statistics, 1998", CA Cancer R Clin. (1998)48: 6-29). Eine chronische Prostatavergrößerung in Kombination mit erhöhtem Prostataspezifischem Antigen (PSA) kann oft zu einem Prostatakarzinom führen. Jedes Jahr treten in den USA 160,000 neue Fälle und 39,000 Todesfälle durch diese Krankheit auf (Landis). Brustkrebs, eine andere hormonabhängige Krebsart, ist ebenso ein großes Gesundheitsproblem. Für das Jahr 2001 werden zufolge der American Cancer Society 192,200 neue invasive Inzidenzen und 40,200 Todesfälle durch Brustkarzinome vorhergesagt (National Alliance of Breast Cancer Organizations News, 15(1): 2, January, 2001). Die Früherkennung und die frühzeitige Intervention sind oft der Schlüssel zur erfolgreichen Behandlung dieser Erkrankungen. Obwohl eine Chemotherapie oft eine Behandlungsmöglichkeit für Patienten mit Brustkrebs im fortgeschrittenen Stadium ist, ist sie für Patienten mit Prostatakrebs im fortgeschrittenen Stadium unwirksam. Konventionelle Behandlungsmethoden schließen eine Operation, Bestrahlung, Hormontherapie und Chemotherapie ein. Es bleibt die Notwendigkeit alternativer Mittel, die die bereits existierenden Therapien erweitern oder ersetzen.
Obwohl die existierenden therapeutischen Mittel gut geeignet für ihre Bestimmungszwecke sind, bleibt das Bedürfnis nach anderen pflanzlichen Heilmitteln zur Behandlung von Prostatakrebs.
KURZFASSUNG
Zusammensetzungen gemäß Anspruch 9, die nützlich bei der Behandlung von Prostatakrebs sind, werden nachfolgend im Detail beschrieben.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein Hochleistungsflüssigkeitschromatogramm (gemessen bei 254 Nanometern) einer mehrkomponentigen, botanischen Extraktzusammensetzung, die Extrakte von Panax pseudo-ginseng Wall, Isatisindigotica Fort, Ganoderma lucidium Karst, Dendrathema morifolium Tzvel, Glycyrrhiza glabra L, Sculletaria bailcalensis Georgi, Rabdosia rubescens und Serenoa repens enthält; ein Pfeil zeigt die Position von Wogonin (bezeichnet als "1-16-2") im Elutionsprofil.
2 zeigt ¹³C NMR Spektren von Wogonin getrennt von einer mehrkomponentigen, botanischen Extraktzusammensetzung wie in 1; (a) getrennte (DEPT) Spektren für -CH₃, -CH₂ und -CH Gruppen; (b) gesamtes ¹³C NMR Spektrum.
3 zeigt ein Massenspektrum von Wogonin, getrennt von einer mehrkomponentigen, botanischen Extraktzusammensetzung wie in 1, mit einer Reinheit größer als 95%.
4 zeigt ein Hochleistungsflüssigkeitschromatogramm von Isoliquiritigenin isoliert aus Glycyrrhiza uralensis.
5 zeigt ein Absorptionsspektrum für den Isoliquiritigenin Peak im Chromatogramm von 4.
6 zeigt ¹³C NMR Spektren von Isoliquiritigenin getrennt von Glycyryhiza uralensis; (a) getrennte (DEPT) Spektren für -CH₃, -CH₂ und -CH Gruppen; (b) gesamtes ¹³C NMR Spektrum.
7 zeigt ein Massenspektrum von Isoliquiritigenin getrennt von Glycyrrhiza uralensis, mit einer Reinheit größer als 95%.
8 zeigt eine graphische Darstellung der Zelllebensfähigkeit von LNCaP und DU-145 Prostatakrebszellen als Funktion der Wogonin-Konzentration.
9 zeigt eine graphische Darstellung der Zelllebensfähigkeit von DU-145 und LNCaP Prostatakrebszellen, und MCF-7 Brustkrebszellen, als eine Funktion von Isoliquiritigenin-Konzentration.
10 zeigt DNA-Histogramme, die den Effekt auf den LNCaP Zellzyklus in Abwesenheit (A) und Anwesenheit (B) von Wogonin bei 20 Mikrogramm/Milliliter veranschaulichen.
11 zeigt Veränderungen im LNCaP Zellzyklus induziert durch Wogonin und Isoliquiritigenin.
12 zeigt Veränderungen im DU-145 Zellzyklus induziert durch Wogonin und Isoliquiritigenin.
13 zeigt eine graphische Darstellung, die die Wirksamkeit von Wogonin und Isoliquiritigenin bei der ER-alpha-Luc Reportergen-Aktivierung darstellt. (Vergleich)
14 zeigt eine graphische Darstellung, die die Wirksamkeit von Wogonin und Isoliquiritigenin bei der ER-beta-Luc Reportergen-Aktivierung darstellt. (Vergleich)
15 zeigt eine graphische Darstellung von COX-2 Inhibition als eine Funktion der Isoliquiritigenin-Konzentration.
16 zeigt eine graphische Darstellung der Zelllebensfähigkeit von PTX 10 Eierstockkrebszellen (resistent gegen Taxol) bei Anwesenheit von steigenden Konzentrationen von Wogonin. (Vergleich)
17 zeigt eine graphische Darstellung der Zelllebensfähigkeit von PTX 10 Eierstockkrebszellen (resistent gegen Taxol) bei Anwesenheit von steigenden Konzentrationen von Isoliquiritigenin. (Vergleich)
DETAILIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Hierin werden Zusammensetzungen nach Anspruch 9 und deren Verwendung zur Behandlung von Prostatakrebs bei Personen, die eine solche Behandlung benötigen, offenbart. Eine Person, die eine solche Prostatakrebsbehandlung benötigt kann eine Person mit bereits diagnostiziertem Prostatakrebs sein oder eine Person, die die Entstehung von Prostatakrebs verhindern oder verzögern möchte, zum Beispiel bei Prostatakrebs in der Familiengeschichte. Beinhaltet ist ebenso die Behandlung von anderen Östrogen-abhängigen Krebsarten außer Prostatakrebs, wie zum Beispiel Brustkrebs, Endometrialkrebs, Darmkrebs, Lungenkrebs, Harnblasenkrebs, Hodenkrebs, Eierstockkrebs, Schilddrüsenkrebs oder Knochenkrebs. Eine Person, die eine Behandlung einer Östrogen-abhängigen Erkrankung benötigt, kann eine Person mit einer diagnostizierten Östrogen-abhängigen Erkrankung, wie zum Beispiel Osteoporose oder Symptome der Menopause sein, oder eine Person, die die Entstehung einer Östrogen-abhängigen Erkrankung verhindern oder verzögern möchte. Die Behandlung umfasst die Anwendung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die ein Phytoöstrogen aus der Gruppe des Isoliquiritigenin, den pharmazeutisch verträglichen Salzen oder Glykosiden davon, oder Kombinationen einer oder mehrerer vorstehend aufgeführten Verbindungen nach den Ansprüchen 1 und 9 enthält. Ein Phytoöstrogen ist eine aus Pflanzen gewonnene Verbindung oder ein Metabolit dieser Verbindung, der dessen Wirkung nachahmt oder die Bindung, den Metabolismus oder die Produktion von endogenem Östrogen im Körper verändert.
Wie zuvor beschrieben, wurden pflanzliche Heilmittel bereits bei der Behandlung von Krebs eingesetzt. Zum Beispiel ist Scutellaria baicalensis eine Quelle für Wogonin (Y. Y. Zhang etal., "Comparative study of Scutellaria planipes and Scutellaria baicalensis", Biomed. Chronzatogra. (1998), 12: 31-3) und Glycyrrhiza uralensis und Glycyrrhiza glabra sind Quellen für Isoliquiritigenin (H. Hayashi H. et al., "Seasonal variation of glycyrrhizain and isoliquiritigenin glycosides in the root of glycyrrhiza glabra L", Biol. Pharm. Bull. (1998) 21: 987-9).
Cumestrol ist ein Phytoöstrogen, dass in Alfalfa und Rotklee enhalten ist, und von dem bekannt ist, dass es phytoöstrogene Wirkung aufweist (siehe, zum Beispiel, US-Patentanmeldung Publikationsnummer 20010044431 A1 von Rodriguez).
Wogonin wurde bereits als starkes, entzündungshemmendes Mittel wegen seiner inhibierenden Wirkung gegenüber Cyclooxygenase 2 (COX-2) und gegenüber der Genexpression von induzierbarer COX-2 und Stickstoffmonoxidsynthase beschrieben (siehe, zum Beispiel, Y. S. Chi et al., "Effect of wogonin, a plant flavone from Scutellaria radix, an the expression of cyclooxygenase-2 and the induction of inducible nitric oxide synthase and the induction of inducible nitric Oxide synthase in inhibitors and lipopolysaccharide-treated RAW 264.7 cells", Biochem. Pharmacol. (2001), 61 (11): 1417-27). Jedoch hat der Erfinder derzeit keine Kenntnis über Beschreibungen der östrogenen Wirkung von Wogonin.
Über Isoliquiritigenin wurde bereits berichtet, dass es Östrogen-ähnliche Wirkung hat (siehe, zum Beispiel, S. Tamir "Estrogen-like activity of glabrene and other constituents isolated from licorice root", J : Steroid Biochem. Mol. Biol. (2001), 78 (3): 291-8). Jedoch hat der Erfinder derzeit keine Kenntnis über Beschreibungen der Wirkung von Isoliquiritigenin als Inhibitor für COX-2-Aktivität.
Neue Studien haben die Notwendigkeit von COX-2 Inhibitoren als Antikrebsmittel gezeigt (siehe, zum Beispiel, A. Kirschenbaum et al., "The role of cyclocxygenase-2 in prostatecancer" Urology (2001),58 (2 suppl. 1): 127-131 ; and E. T. Hawk et al., "COX-2 in Cancer-A Player That's Defining the Rules" J. Natl. CancerInst. (2002), 94 (8): 545-546). Der Inhibitor blockiert die Angiogenese des Krebses und reduzierte die Krebsmetastasen (siehe, zum Beispiel, E. Fosslien "Review: Molecular pathology of cyclooxygenas-2 in cancer-induced angiogenesis", Ann. Clin. Lab Sci. (2001), 31 (4): 325-348).
Die JP-A-60178815 offenbart die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die u.a. 0,3-15% Isoliquiritigenin enthält, gegen tierische Krebszellen.
Die WO-A-99809615 offenbart eine pflanzliche Zusammensetzung zur Behandlung von Prostatakrebs, die Isatis indigotica Fort, Panax pseudo-ginseng Wall, Ganoderma lucidum Karst, Sculletaria baicalensis Georgi, Dendranthema morifolium Tzvel, Glycyrrhiza glabra, Rabdosia rubescens und Serenca repens, und optionell weitere zytotoxische Mittel enthält.
Die EP-A-0656213 offenbart Zusammensetzungen, die u.a. Phloretin in Hyaluronsäure als Penetrations-Enhancer kombiniert mit anderen neoplastischen Mitteln. Case XIA offenbart eine Kombination von Methotrexat, Pholertin und Alpha II-Interferon; Case XIB offenbart eine Kombination von Methyl-CCNU, Carboplatin und Methotrexat, Phloretin und Immunstimulierende Mittel.
Die vorliegende Arbeit zeigt die potente Wirkung von Wogonin und Isoliquiritigenin, die Östrogenrezeptor-alpha und -beta zu aktivieren und die biochemischen Reaktionen in Krebszellen zu triggern. Die COX-2-Inhibitor-Wirkung von Isoliquiritigenin wird ebenso veranschaulicht. Die suppressiven Effekte beider Verbindungen auf die Krebszell-Proliferation werden ebenfalls dargestellt. Die Zytotoxizität von Wogonin und Isoliquiritigenin gegenüber Krebszellen kann entweder abhängig oder unabhängig von Östrogenrezeptoren sein.
Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 9 und deren Verwendung gemäß Anspruch 1 kann zusätzlich Wogonin mit umfassen. Der Ausdruck Wogonin, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die CAS Reg. Nr. 632-85-9, auch bekannt als 5,7-Dihydroxy-8-methoxyflavon und seine pharmazeutisch verträglichen Salze und Ester, seine selektiv substituierten Analogen, wie nachfolgend aufgeführt, ein Extrakt einer Pflanze aus der Familie der Scutellaria oder eine Kombination, die eine oder mehrere der eben genannten Verbindungen enthält.
Ein Ester des Wogonin ist vorzugsweise ein Glykosid des Wogonin. Es gibt keine besondere Einschränkung der verwendeten Monosaccharide und Polysaccharide zur Herstellung der Glykoside des Wogonin. Geeignete Monosaccharid-Zucker sind Glucose, Glucuronsäure, Mannose, Fructose, Galactose, Xylose, Rutinose oder Rhamnose, und Kombinationen, die eines oder mehrere der eben genannten Monosaccharide beinhalten. Geeignete Polysaccharide sind Dimere, Trimere, Oligomere und Polymere eines oder mehrerer der oben genannten Monosaccharide.
Wogonin-Analoge sind, zum Beispiel, Genistein, Biochanin, Prunetin, Scutellarein, Daidzin, Luteolin, Apigenin, Acacetin, 3,6,4-Trihydoxylflavon, 7,3-Dihydroxy-4,1-dimethoxy-isoflavon, 3R-2', 3'-Dihydoxy-7,4-dimethoxy-isoflavon, oder eine Kombination, die eine oder mehrere der oben genannten Wogonin-Analoge enthält.
Wogonin kann ebenso in Form eines Extraktes aus einer Pflanze der Familie Sculletaria, wie zum Beispiel aus Scutellaria baicalensis, oder eine Kombination einer oder mehrerer der eben genannten Verbindungen sein.
Wogonin kann ein selektiv substituiertes Analoges von Wogonin der Formel
sein, worin R¹ für C₁-C₆-Alkyl (vorzugsweise Methyl) steht; R² für Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl, oder C₂-C₆-Acyl (vorzugsweise Wasserstoff) steht; R³-R¹⁰ unabhängig voneinander für Wasserstoff, Hydroxy, C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Alkoxy oder C₂-C₆-Acyl (vorzugsweise Wasserstoff oder Hydroxy, insbesondere Wasserstoff) stehen, mit der Maßgabe, dass zumindest vier der Reste R³-R¹⁰ Wasserstoff sind. In einer bevorzugten Ausführung ist R¹ Methyl, R² Wasserstoff und R³-R¹⁰ sind unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Methoxy, Ethoxy, Acetyl oder Propionyl, mit der Maßgabe, dass zumindest fünf der Reste R³-R¹⁰ für Wasserstoff stehen.
Methoden zur Synthese oder Isolierung von Wogonin, seiner pharmazeutisch verträglichen Salze oder Ester, seiner teilweise substituierten Analogen sind allgemein bekannt. Siehe, zum Beispiel, International Patent Application No. WO01051482 A1 to Wallace et al; P. Rivaille et al., C. R. Acad. Sci., Paris, Ser. C(1969), 268(2): 2213-16; M.-C. Lin et al., J. Chromatogr, A (1999), 830(2): 387-395; Y.-C. Chef et al., Biochem. Pharmacol. (2001), 61(11): 1417-1427.
Wenn Wogonin vorliegt, umfasst es 0,5 Gew.-% oder mehr, bevorzugt 1 Gew.-% oder mehr, mehr bevorzugt 2 Gew.-% oder mehr, insbesondere bevorzugt 5 Gew.-% oder mehr, weiter bevorzugt 10 Gew.-% oder mehr, vor allem bevorzugt 20 Gew.-% oder mehr bezogen auf das Gesamtgewicht des Medikaments. Zusammensetzungen, die 50 Gew.-% Wogonin enthalten, werden ebenfalls in Betracht gezogen.
Das Phytoöstrogen gemäß Anspruch 9 umfasst Isoliquiritigenin. Der Ausdruck Isoliquiritigenin bezieht sich erfindungsgemäß auf die CAS Reg. Nr. 961-29-5; auch bekannt als 2',4,4'-Trihydroxychalcon, und seine pharmazeutisch verträglichen Salze oder Glykosidester, ein Extrakt aus Glycyrrhiza uralensis oder Glycyrrhiza glabra, oder eine Kombination, die eine oder mehrere der eben genannten Verbindungen enthält.
Ein Ester des Isoliquiritigenin ist ein Glykosid des Isoliquiritigenin. Es gibt keine besondere Einschränkung der verwendeten Monosaccharide und Polysaccharide zur Herstellung der Glykoside des Isoliquiritigenin. Geeignete Monosaccharid-Zucker sind Glucose, Glucuronsäure, Mannose, Fructose, Galactose, Xylose, Rutinose oder Rhamnose, und Kombinationen, die eines oder mehrere der eben genannten Monosaccharide beinhalten. Geeignete Polysaccharide sind Dimere, Trimere, Oligomere und Polymere eines oder mehrerer der oben genannten Monosaccharide.
Die Verwendung eines Isoliquiritigenin-Analogs, zum Beispiel Phloretin oder 4,2,4'-Trihydroxychalcon ist ebenfalls offenbart Ein Extrakt aus Glycyrrhiza uralensis oder Glycyrrhiza glabra, ist eine Quelle von Isoliquiritigenin, eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder Glykosidesters des Isoliquiritigenin oder einer Kombination einer oder mehrerer der eben genannten Verbindungen.
Ein selektiv substituiertes Analoges von Isoliquiritigenin, hat die Formel
worin die Reste R¹¹-R¹⁴ unabhängig voneinander für Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyl (vorzugsweise Wasserstoff) stehen; die Reste R¹⁵-R²⁰ unabhängig voneinander für Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆Alkoxy oder C₂-C₆-Acyl (vorzugsweise Wasserstoff) stehen, mit der Maßgabe, dass zumindest drei der Reste R¹⁵-R²⁰ für Wasserstoff stehen. In einer bevorzugten Ausführungsform stehen R¹¹-R¹⁴ für Wasserstoff und R¹⁵-R²⁰ stehen unabhängig voneinander für Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Methoxy, Ethoxy, Acetyl oder Propionyl, mit der Maßgabe, dass zumindest vier der Reste R¹⁵-R²⁰ für Wasserstoff stehen.
Methoden zur Synthese oder Isolierung von Isoliquiritigenin , seiner pharmazeutisch verträglichen Salze oder Glykosidester, seiner teilweise substituierten Analogen sind allgemein bekannt. Siehe, zum Beispiel, S. K. Srivastava et al., Indian J. Chem., Sect. B (1981), 20B (4): 347-8; and F. A. Macias et al., Phytochemistry (1998), 50(1) : 35-46.
Wenn Isoliquiritigenin vorliegt, umfasst es 0,5 Gew.-% oder mehr, insbesonder 1 Gew.-% oder mehr, bevorzugt 2 Gew.-% oder mehr, besonders bevorzugt 5 Gew.-% oder mehr, insbesondere bevorzugt 10 Gew.-% oder mehr, vor allem bevorzugt 20 Gew.-% oder mehr bezogen auf das Gesamtgewicht des Medikaments. Zusammensetzungen, die 50 Gew-% Isoliquiritigenin enthalten, werden ebenfalls in Betracht gezogen.
Das Phytoöstrogen gemäß Anspruch 1 oder die Zusammensetzung gemäß Anspruch 9 kann zusätzlich Cumestrol mit umfassen. Der Ausdruck Cumestrol, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die CAS Reg. Nr. 479-13-0, auch bekannt als 3,9-Dihydroxy-6H-benzofuro[3,2-c][I]benzopyran-6-on und seine pharmazeutisch verträglichen Salze und Ester, seine selektiv substituierten Analogen, ein Extrakt aus Taraxacum mongolicum, Alfalfa-Sprossen (Medicago sativa), Broccoli (Brassica oleracea) oder Eclipta prostrata, oder eine Kombination, die eine oder mehrere der eben genannten Verbindungen enthält.
Ein Ester des Cumestrol ist vorzugsweise ein Glykosid des Cumestrol. Es gibt keine besondere Einschränkung der verwendeten Monosaccharide und Polysaccharide zur Herstellung der Glykoside des Cumestrol. Geeignete Monosaccharid-Zucker sind Glucose, Glucuronsäure, Mannose, Fructose, Galactose, Xylose, Rutinose oder Rhamnose, und Kombinationen, die eines oder mehrere der eben genannten Monosaccharide beinhalten. Geeignete Polysaccharide sind Dimere, Trimere, Oligomere und Polymere eines oder mehrerer der oben genannten Monosaccharide.
Ein Cumestrol-Analog ist 4-Ethyl-7-hydroxy-3-(p-methoxyphenyl)-2H-l-benzopyran-2-on (Wedelolacton),
Das Cumestrol kann einen Extrakt aus Taraxacum mongolicum, Alfalfa-Sprossen (Medicago sativa), Broccoli (Brassica oleracea) oder Eclipta prostrata als Quelle für Cumestrol, ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder einen Ester von Cumestrol, eine selektiv substituiertes Analoges von Cumestrol, oder eine Kombination, die eine oder mehrere der eben genannten Verbindungen enthält, umfassen.
Ein selektiv substituiertes Analoges von Cumestrol hat die Formel
worin R²¹ und R²² unabhängig voneinander für Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyl (vorzugsweise Wasserstoff)stehen; die Reste R²³-R²⁸ unabhängig voneinander für Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆Alkoxy oder C₂-C₆-Acyl (vorzugsweise Wasserstoff) stehen, mit der Maßgabe, dass zumindest drei der Reste R²³-R²⁸ für Wasserstoff stehen. In einer bevorzugten Ausführung sind R²¹ und R²² Wasserstoff; und die Reste R²³-R²⁸ stehen unabhängig voneinander für Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Methoxy, Ethoxy, Acetyl oder Propionyl, mit der Maßgabe, dass zumindest vier der Reste R²³-R²⁸ für Wasserstoff stehen.
Methoden zur Synthese oder Isolierung von Cumestrol, seiner pharmazeutisch verträglichen Salze oder Ester, seiner selektiv substituierten Analogen sind allgemein bekannt. Siehe, zum Beispiel, P. M. Dewick et al., J. Claem. Soc. D (1969), 9: 466-7; T. Kappe et al., Z. Naturforsch., Teil B (1974), 29 (3-4): 292-3; R. Laschober et al., Sylzthesis (1990), 5: 387-8; F. A. Macias et al., Phytochemistry(1998), 50(1): 35-46; K. Hiroya et al., PerA : in 1 (2000), 24: 4339-4346; G. A. Kraus etal., Journal of Organic Chemistry (2000), 65 (18): 5644-5646; and M.Okada et al., Planta Med. (2000), 66 (6): 572-575.
Wenn Cumestrol vorliegt, umfasst es 0,5 Gew.-% oder mehr, insbesondere 1 Gew.-% oder mehr, bevorzugt 2 Gew.-% oder mehr, besonders bevorzugt 5 Gew.-% oder mehr, insbesondere bevorzugt 10 Gew.-% oder mehr, vor allem bevorzugt 20 Gew.-% oder mehr bezogen auf das Gesamtgewicht des Medikaments. Zusammensetzungen, die 50 Gew.-% Cumestrol enthalten, werden ebenfalls in Betracht gezogen.
Zusätzlich aktive Antikrebs-Inhaltsstoffe sind in den Zusammensetzungen und Präparaten gemäß Anspruch 9 verwendet gemäß Anspruch 1 enthalten. Von der Gabe von Isoliquiritigenin, gegebenenfalls im Gemisch mit Wogonin und/oder Cumestrol in Kombination mit anderen Antikrebsmitteln, wird angenommen, die Antikrebswirkung zu stimulieren.
Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 9 und deren Verwendung gemäß Anspruch 1 umfasst mehr als 0,5 Gew.-% eines Phytoöstrogens, ausgewählt unter Isoliquiritigenin. Wogonin und/oder Cumestrol können ebenso enthalten sein ebenso wie zumindest ein Antikrebsmittel. In solchen Zusammensetzungen kann Isoliquiritigenin in Mengen von 0,5 bis 50 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der aktiven Inhaltsstoffe in der Zusammensetzung, enthalten sein. Innerhalb dieses Bereichs kann die Menge größer oder gleich 1, 2, 5 oder 10 Gew-% sein. Ebenso innerhalb dieses Bereichs kann die Menge bis zu 40, 30 oder 20 Gew.-% sein. Die obigen Gew.-% beziehen sich auf das Gesamtgewicht der aktiven Inhaltsstoffe in der Zusammensetzung.
Das Antikrebsmittel ist ausgewählt unter Oridonin, Indirubin, Taxol, Cisplatin, Camptothecan, Vincristin, Monocrotalin, Maytansin, Homoharringtonin, Colchicin, Irisquinon A, Irisquinon B, Irisquinon C, Acronycin, Matrin, Oxymartin, Curcumin, Paricin, Pariphyllin und Kombinationen eines oder mehrerer der vorstehend aufgeführten Antikrebsmittel. Bevorzugte Antikrebsmittel enthalten Oridonin.
Ebenso umfasst sind alternative Antikrebsmittel, wie Extrakte einer der Pflanzen Rabdosia rubescens, Panax pseudo-ginseng Wall, Ganoderma lucidum Karst, Scutellaria baicalensis Georgi, Glycine max, Curcuma longa und Kombinationen, die eine oder mehrere der eben genannten Pflanzen enthalten. Ein Extrakt von Rabdosia rubescens kann Oridonin enthalten; ein Extrakt von Humulus lupulus kann Lupulon enthalten; ein Extrakt von Panax pseudo-ginseng Wall kann ein Gensenosid enthalten; ein Extrakt von Sculletaria baicalensis Georgi kann Baicalin enthalten; ein Extrakt von Glycine max kann ein Soja-Flavonoid, ein Soja-Isoflavonoid oder beides enthalten; ein Extrakt von Curcuma longa kann Curcumin enthalten.
Diese alternativen Antikrebsmittel können 1 bis 10 Gew.-Teile eines Extraktes aus Rabdiosa rubescens umfassen; 10 bis 40 Gew.-Teile eines Extraktes aus Panax pseudo-ginseng Wall umfassen; 100 bis 500 Gew.-Teile eines Extraktes aus Ganoderma lucidum Karst umfassen; 10 bis 100 Gew.-Teile eines Extraktes aus Scutellaria baicalensis Georgi umfassen; 10 bis 100 Gew.-Teile eines Extraktes aus Glycine max umfassen; und 10 bis 100 Gew.-Teile eines Extraktes aus Curcuma longa umfassen.
Diese alternativen Antikrebsmittel können ein Extrakt aus Humulus lupus; und ein Extrakt ausgewählt aus Panax pseudo-ginseng Wall, Ganoderma lucidum Karst, Scutellaria baicalensis Georgi, Glycine max, Curcuma longa, und Kombinationen eines oder mehrerer der eben genannten Pflanzen umfassen.
Diese alternativen Antikrebsmittel können 10 Gew.-Teile eines Extraktes aus Humulus lupulus; 10 bis 40 Gew.-Teile eines Extraktes aus Panax pseudo-ginseng Wall; 100 bis 500 Gew.-Teile eines Extraktes aus Ganoderma lucidum Karst; 10 bis 100 Gew.-Teile eines Extraktes aus Scutellaria baicalensis Georgi; 10 bis 100 Gew.-Teile eines Extraktes aus Glycine max; und 10 bis 100 Gew.-Teile eines Extraktes aus Curcuma longa umfassen.
Das Antikrebsmittel kann zu 1 bis 90 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht der aktiven Inhaltsstoffe in der Zusammensetzung enthalten sein. Innerhalb dieses Bereichs kann die Menge des Antikrebsmittels größer oder gleich 2, 5 oder 10 Gew-% sein. Ebenso innerhalb dieses Bereichs kann die Menge des Antikrebsmittels bis zu 80, 70, 50 oder 25 Gew.-% sein.
Zusätzlich zu einem Antikrebsmittel kann die Zusammensetzung gemäß Anspruch 9 und deren Verwendung gemäß Anspruch 1 ein Immunstimulans umfassen, ausgewählt unter Ginsenosiden, Ferulasäure, Mannan, Synanthrin, Eleutherosid A, Eleutherosid B, Eleutherosid C, Eleutherosid D, Eleutherosid E, Gynosid, β-Pachyman, Inulin, Glycoproteinen, Interferonen, y-Globulinen, Extrakten von Ganoderma lucidum, Extrakten von Coriolus versicolor, Extrakten von Poria cocos und Kombinationen, die eine oder mehrere der vorstehend aufgeführten Verbindungen umfassen. Das bevorzugte Immunstimulans beinhaltet beta-Pachyman.
Das Immunstimulans wird mit 1 bis 90 Gew.-% des Gesamtgewichts der aktiven Inhaltsstoffe der Zusammensetzung verwendet. Innerhalb dieses Bereichs kann die Menge des Immunstimulans größer oder gleich 2, 5, 10, 20 oder 50 Gew-% sein. Ebenso innerhalb dieses Bereichs kann die Menge bis zu 80, 70 oder 60 Gew.-% sein.
In einer bevorzugten Ausführung umfasst die Zusammensetzung mehr als 0,5 Gew.-% des Phytoöstrogens Isoliquiritigenin; ein Antikrebsmittel, ausgewählt unter Oridonin, Colchicin, Vincristin, Camptothecan, Maytansin, Taxol, und Kombinationen einer oder mehrerer der eben genannten Antikrebsmittel; und ein Immunstimulans, ausgewählt unter Ginsenosiden, Mannan, Synanthrin, Eleutherosid A, Eleutherosid B, Eleutherosid C, Eleutherosid D, Eleutherosid D, Gynoside, β-Pachyman, Interferon, und Kombinationen einer oder mehrerer der eben genannten Immunstimulanzien. In dieser Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung vorzugsweise: 1 bis 40 Gew.-% Isoliquiritigenin (Wogonin und/oder Cumestrol können ebenfalls enthalten sein, sodass die Zusammensetzung 1 bis 40 Gew.-% Isoliquiritigenin zusammen mit Wogonin und/oder Cumestrol umfasst); 0,05 bis 5 Gew.-% einer Verbindung ausgewählt unter Oridonin, Camptothecan, Vincristin, Indirubin, Colchicin, Ginsenoside, und Kombinationen einer oder mehrerer der soeben genannten Verbindungen; und 10 bis 98 Gew.-% einer Verbindung, ausgewählt unter beta-Pachyman, Mannan, Synanthrin, Gynoside, und Kombinationen die eine oder mehrere der eben genannten Verbindungen umfassen, wobei alle Gewichtsprozentangaben auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung bezogen sind.
In einer anderen bevorzugten Ausführung umfasst die Zusammensetzung gemäß Anspruch 9 und deren Verwendung gemäß Anspruch 1 Isoliquiritigenin, gegebenenfalls in Kombination mit Wogonin und/oder Cumestrol; Oridonin; und beta-Pachyman. In dieser Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung vorzugsweise: 1 bis 30 Gew.-% Isoliquiritigenin (Wogonin und/oder Cumestrol können ebenfalls enthalten sein, so dass die Zusammensetzung 1 bis 30 Gew.-% Isoliquiritigenin zusammen mit Wogonin und/oder Cumestrol umfasst); 0,1 bis 5 Gew.-% Oridonin; und 20 bis 90 Gew.-% beta-Pachyman; wobei sich alle Gew.-% sich auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung beziehen.
Da die Zusammensetzung als mehrere Komponenten umfassend beschrieben werden kann, versteht es sich, dass jede Komponente chemisch unterschiedlich ist, besonders in Anbetracht der Tatsache, dass eine einzige chemische Verbindung der Definition von mehr als einer Komponente genüge tut.
Wogonin, Isoliquiritigenin, Cumestrol, ihre pharmazeutisch verträglichen Salze oder Ester, oder ihre teilweise substituierten Analogen, wie bereits definiert, können aus natürlichen Quellen isoliert oder entsprechend allgemein bekannten Methoden, wie oben beschrieben, synthetisiert werden. Die Reinheit dieser, in den Zusammensetzungen verwendeten Verbindungen kann in Abhängigkeit von ihrer Isolierungs- oder Synthesemethode variieren, aber Reinheiten zwischen 5 und mehr als 99% können für die Verwendung in der Zusammensetzung als angemessen betrachtet werden.
Die Phytoöstrogene können in Form einer pharmazeutisch akzeptierbaren Zusammensetzung vorliegen. Methoden zur Formulierung von pharmazeutisch akzeptierbaren Zusammensetzungen sind allgemein bekannt. Pharmazeutische Formulierungen können eine oder mehrere, von der Verabreichungsform abhängige, biologisch nichtaktive Verbindungen umfassen, z.B. sonstige Inhaltsstoffe wie Stabilisierungsmittel (um eine Langzeit-Lagerung zu gewährleisten), Emulgiermittel, Bindemittel, Verdickungsmittel, Salze und Konservierungsmittel.
Bei oraler Verabreichung können Wogonin, Isoliquiritigenin, Cumestrol, deren pharmazeutisch verträglichen Salze und Ester, deren selektiv substituierten Analogen oder Kombinationen, die einen oder mehrere der eben genannten Verbindungen umfassen, mit inerten Verdünnungsmitteln oder mit einem assimilierbaren, essbaren Trägern oder direkt mit der Nahrung nach Diät verabreicht werden. Die Formulierungen können in Exzipienten inkorporiert werden, und in Form von einnehmbaren Tabletten, Bukkaltabletten, Pastillen, Kapseln, Elixiren, Suspensionssirupe oder Wafern verabreicht werden. Die Tabletten, Pastillen, Pillen oder Kapseln können ebenso folgendes beinhalten: ein Bindemittel, wie Tragantgummi, Akazia, Maisstärke oder Gelatine; Exzipienten, wie Dicalciumphosphat; einen Zerfallsbeschleuniger, wie Maisstärke, Kartoffelstärke oder Alginsäure; ein Gleitmittel wie Magnesiumstearat; ein Süßungsmittel, wie Saccharose, Laktose oder Saccharin; ein Geschmacksmittel, wie Pfefferminz oder Moosgrünöl. Ist die Darreichungsform eine Kapsel, kann sie, zusätzlich zu den oben genannten Stoffen, einen flüssigen Träger beinhalten. Verschiedene andere Stoffe können als Ummantelung oder zur anderweitigen Modifizierung der äußerlichen Beschaffenheit der Darreichungsform beinhaltet sein. Ein Sirup oder Elixier kann Saccharose als Süßungsmittel, Methyl- und Propylparabene als Konservierungsmittel, einen Farbstoff und einen Geschmacksstoff, wie Kirsch- oder Orangengeschmack, enthalten. Diese Zusatzstoffe sollten in den verwendeten Mengen im Wesentlichen ungiftig sein. Des Weiteren können die aktiven Mittel in Zubereitungen oder Formulierungen mit verzögerter Wirkstoff-Freigabe enthalten sein. Formulierungen für die parenterale Anwendung können sterile wässrige Lösungen und Dispersionen einschließen und sterile Pulver, zur zeitlich unabhängigen Zubereitung von sterilen, injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. Die Lösungen und Dispersionen können auch Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Additive enthalten, und können so konzipiert sein, dass sie die zelluläre Aufnahme des aktiven Mittels der Zusammensetzung verstärken, z.B. als Liposomen. Steril injizierbare Lösungen können hergestellt werden, indem man die aktiven Verbindungen, zusammen mit einem oder mehrerer der verschieden anderen, oben beschriebenen Inhaltsstoffe, in der benötigten Menge in das entsprechende Lösungsmittel bringt, und diese anschließend sterilisiert. Dispersionen werden allgemein dadurch hergestellt, indem man die verschiedenen, sterilen aktiven Inhaltsstoffe in ein steriles Vehikel bringt, dass das zugrundeliegende Dispersionsmedium und die benötigten anderen Inhaltsstoffe, von den oben aufgeführten, enthält. Im Falle steriler Pulver, die man zur Herstellung von sterilen Injektionslösungen verwendet, sind die bevorzugten Herstellungsmethoden die Vakuumtrocknungs- und Gefriertrocknungstechniken, welche zu einem Pulver der aktiven Inhaltsstoffe plus jedem anderen, zusätzlich gewünschten Inhaltsstoff, der zuvor sterilfiltrierten Lösung, führen. Pharmazeutische Formulierungen zur Oberflächenanwendung können speziell eine lokale Anwendung nützlich sein. Formulierungen zur topischen Anwendung umfassen Salben, Sprays, Gele, Suspensionen, Lotionen oder Cremes. Formulierungen zur topischen Verabreichung können allgemein bekannte Trägerstoffe wie Isopropanol, Glycerin, Paraffin, Stearylalkohol oder Polyethylenglykol beinhalten. Der pharmazeutisch verträgliche Trägerstoff kann auch einen bereits bekannten Absorptionsverstärker enthalten. Absorptionsverstärker sind zum Beispiel Dimethylacetamid ( U.S. Pat. Nr. 3,472,931 von Stoughton), Trichlorethanol oder Trifluorethanol ( U.S. Pat. Nr. 3,891,757 von Higuchi), bestimmte Alkohole und Mischungen davon ( British Pat. Nr. 1,001,949 von Meyer und 1,464,975 von Astra Lakemedel). Ist ein konventionelles Medium oder Mittel inkompatibel zu den therapeutisch aktiven Inhaltsstoffen, dann ist dessen Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen und Darstellungen ausgenommen.
Die Zusammensetzung kann gegebenenfalls in einer essbaren Form, vorzugsweise einem Pulver, einer Kapsel oder einer Tablette, vorliegen. Alternativ kann die Zusammensetzung in Form eines Suppositoriums vorliegen.
Die beschriebenen, pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten vorzugsweise 0,5 bis 100 Gew.-% des aktiven Mittels. Innerhalb dieses Bereichs können die Zusammensetzungen und Präparate vorzugsweise den aktiven Bestandteil in einer Menge von zumindest 1, 2, 5, 10 oder 20 Gew.-% umfassen. Ebenso innerhalb dieses Bereichs kann die Zusammensetzung eine Menge des aktiven Mittels von bis zu 90, 80, 70, 60 oder 50 Gew.-% umfassen. Die Menge der aktiven Verbindungen in solchen pharmazeutisch nützlichen Zusammensetzungen und Präparaten ist so bemessen, dass die geeignete Dosis erreicht wird.
Eine andere Ausführungsform betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 9 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Person mit Prostatakrebs. Ebenso offenbart ist die Verwendung der eben erwähnten Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung anderer Krebsarten, z.B. einer Östrogen-abhängigen Krebsart oder einer Östrogen-abhängigen Krankheit. Die Ausdrücke "behandeln" und "Behandlung" beziehen sich erfindungsgemäß auf die Verringerung der Stärke und/oder Häufigkeit der Symptome und/oder deren zugrundeliegenden Ursache, die Unterbindung des Auftretens der Symptome und/oder deren zugrundeliegenden Ursache und die Verbesserung oder Beseitigung eines Schadens. Demnach umfasst zum Beispiel die vorliegende Methode zum "Behandeln" von Prostatakrebs entsprechend sowohl die Prävention der Erkrankung als auch die Behandlung der Erkrankung bei einem Individuum mit klinischer Symptomatik.
Mit den Ausdrücken "wirksame Menge", "pharmazeutisch wirksame Menge" oder "eine wirksame anti-östrogene Menge" eines Mittels, ist hierin eine nichttoxische, aber ausreichende Menge des Mittels gemeint, um den gewünschten prophylaktischen und therapeutischen Effekt zu bewirken. Die exakte, benötigte Menge wird, wie unten aufgezeigt, von Person zu Person variieren, abhängig vom Alter und der allgemeinen Verfassung der Person, der Schwere des zu behandelnden Zustandes, dem jeweils angewendeten Phytoöstrogen und der Verabreichungsform. Daher ist es nicht möglich eine exakte "wirksame Menge" zu spezifizieren. Jedoch kann eine geeignete "wirksame" Menge in jedem einzelnen Fall durch einen Fachmann mit Hilfe von Routineversuchen bestimmt werden.
Mit "pharmazeutisch verträglichem Träger" ist ein Stoff gemeint, welcher weder biologisch noch anderweitig unwünschenswert ist; zum Beispiel kann der Stoff zusammen mit dem ausgewählten Phytoöstrogen einer Person verabreicht werden, ohne jegliche unerwünschten, biologischen Auswirkungen oder Wechselwirkungen in schädlicher Art auf irgendeine andere Komponente der pharmazeutischen Zusammensetzung, in der er enthalten ist, zu haben.
Krebs ist das Wachstum neuer Zellen in einem Körper, wobei die neuen Zellen typischerweise nachteilige Auswirkungen auf den Körper haben. Krebs wird charakterisiert durch ein Ansteigen der Zahl abnormaler, oder neoplastischer Zellen, die aus einem normalen Gewebe entstanden sind, welche sich vermehren um eine Tumormasse zu bilden, wobei angrenzendes Gewebes durch diese neoplastischen Tumorzellen befallen wird und sich maligne Zellen bilden, die sich gegebenenfalls entweder über das Blut oder das lymphatische System in regionalen Lymphknoten ausbreiten und die durch Metastasenbildung in entfernte Körperregionen ausstreuen. In kanzerösem Zustand vermehrt sich eine Zelle unter Bedingungen, unter denen normale Zellen nicht wachsen würden. Krebs manifestiert sich in einer großen Vielfalt an Formen, charakterisiert durch unterschiedliche Grade an Invasivität und Aggressivität.
Die Anwendung eines Phytoöstrogens gemäß Anspruch 1 bietet eine effektive Anti-Prostatakrebs Wirkung. Es wird angenommen, dass die allgemeine Antikrebs-Wirkung von Wogonin, Isoliquiritigenin und Cumestrol auf die Wirkung als COX-2-Inhibitoren zurückzuführen ist. COX-2 ist ein induzierbares Schlüssel-Enzym bei der Umwandlung von Arachidonsäure zu Prostaglandinen und anderen Eikosanoiden. Die COX-2-Expression kann durch viele Faktoren induziert werden, zum Beispiel Wachstumsfaktoren, Interleukin-1 und krebsfördernde Faktoren. Das Enzym tritt in einer Reihe von Tumorzellen und Krebsarten beim Menschen, darunter Prostatakrebs, auf. Die Verwendung von COX-2-Inhibitoren als Antikrebs-Therapeutika ist bekannt.
Zusätzlich zur allgemeinen Antikrebs-Wirksamkeit, werden die Phytoöstrogene Wogonin, Isoliquiritigenin und Cumestrol hierin als nützliche Antikrebsmittel bei hormonabhängigen Krebsarten offenbart. Hormonabhängige Krebsarten schließen zum Beispiel Harnblasenkrebs, Knochenkrebs, Brustkrebs, Darmkrebs, Endometrialkrebs, Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Hodenkrebs und Schilddrüsenkrebs ein.
Bei der Behandlung von Prostatakrebs kann die Phytoöstrogenzusammensetzung gemäß Anspruch 9 oral, parenteral, transdermal, rektal, nasal, bukkal, vaginal oder durch ein implantiertes Reservoir mittels Dosisformulierungen verabreicht werden, die konventionelle, nichttoxische pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe, Zusätze und Vehikel enthalten. Der Ausdruck "parenteral" schließt erfindungsgemäß eine subkutane, intravenöse und intramuskuläre Injektion ein. Die Menge der wirksamen Verbindung, die verabreicht wird, wird natürlich von der zu behandelnden Person, deren Gewicht, der Verabreichungsform und der Entscheidung des behandelnden Arztes abhängen.
In Kombination mit einem Antikrebsmittel wird die Dosierung des Phytoöstrogens 0,01 mg/kg/Tag bis 1000 mg/kg/Tag, bevorzugt 0,01 mg/kg/Tag bis 300 mg/kg/Tag, bevorzugter 1 mg/kg/Tag bis 300 mg/kg/Tag betragen, und die Dosierung des Antikrebsmittels wird 0,1 mg/kg/Tag bis 100 mg/kg/Tag, bevorzugt 0,3 mg/kg/Tag bis 50 mg/kg/Tag, bevorzugter 0,01 mg/kg/Tag bis 50 mg/kg/Tag, betragen. Die Dosierung des Immunstimulans wird 1 mg/kg/Tag bis 5000 mg/kg/Tag betragen, bevorzugt 5 mg/kg/Tag bis 1000 mg/kg/Tag.
Ebenso wird hierin die Verwendung der Phytoöstrogene Wogonin, Isoliquiritigenin und Cumestrol zur Behandlung anderer Östrogen-abhängigen Erkrankungen offenbart, wie zum Beispiel Knochenschwund, Knochenbrüche, Osteoporose, Osteoporose durch Glukokortikoide verursacht, Morbus Paget, abnorm gesteigerte Knochenabnahme, Periodontalerkrankung, Zahnausfall, rheumatische Arthritis, Osteoarthritis, periprosthetische Osteolyse, Osteogenesis imperfecta, metastatische Knochenerkrankung, Hyperkalzämie bei Malignität, Knorpeldegenerierung, Endometriose, fibroide Erkrankung des Uterus, Hitzewallungen, kardiovaskuläre Krankheit, Minderung der kognitiven Leistung, cerebral degenerative Erkrankungen, Restenose, Gynäkomastie, Proliferation der vaskulären, glatten Muskelzellen, Fettleibigkeit, Inkontinenz, und Kombinationen davon. Östrogen-abhängige Erkrankungen schließen erfindungsgemäß auch die Symptome der Menopause, also dem Übergang vom gebärfähigen zum nichtgebärfähigen Lebensabschnitt einer Frau, vor allem charakterisiert durch das Ausbleiben der Menstruation, ein. Symptome der Menopause, schließen zum Beispiel ein: Hitzewallungen, Schweißausbrüche infolge vasomotorischer Instabilität, psychologische und emotionale Symptome der Ermüdung, Schlaflosigkeit, Irritierbarkeit und Nervosität, Schlafmangel, Schwindel, kardiale Symptome; die Häufigkeit von koronarer Herzkrankheit steigt, Übelkeit, Darmträgheit, Durchfall, Arthralgie, Myalgie und Kombinationen der eben genannten Symptome.
Osteoporose, oder Minderung der Knochendichte, führt zu häufigen Knochenbrüchen und zum Zerfall der Wirbelsäule. Knochenschwund beginnt meist in einem Alter um 35 Jahre. Dieser Schwund beschleunigt sich während der Menopause, welche in der Regel etwa in einem Alter von 45 bis 55 Jahren auftritt. Der Verlust an Knochenmasse beträgt etwa 1 bis 2% pro Jahr nach der Menopause. Die ersten betroffenen Stellen sind die Wirbelsäule, welche nach vorne kippt, was zu einer schiefen Haltung und Rückenschmerzen führt, die Hüfte und die Handgelenke. Osteoporose entwickelt sich über Jahrzehnte und hängt sowohl von dem Höchstwert der Knochenmasse als auch von dem Grad des Knochenschwundes ab.
Bei der Behandlung von Östrogen-abhängigen Erkrankungen kann die Phytoöstrogenzusammensetzung oral, parenteral, transdermal, rektal, nasal, bukkal, vaginal oder durch ein implantiertes Reservoir mittels Dosisformulierungen verabreicht werden, welche konventionelle, nichttoxische pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe, Zusätze und Vehikel enthalten. Der Ausdruck "parenteral", schließt erfindungsgemäß eine subkutane, intravenöse und intramuskuläre Injektion ein. Die Menge des wirksamen Stoffes, die verabreicht wird, wird natürlich von der zu behandelnden Person, deren Gewicht, der Verabreichungsform und der Entscheidung des behandelnden Arztes abhängen. Jedoch wird die Dosierung des Phytoöstrogens im Allgemeinen 0,1 mg/kg/Tag bis 1000 mg/kg/Tag betragen, bevorzugt 0,1 mg/kg/Tag bis 300 mg/kg/Tag.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.
ALLGEMEINER VERSUCHSBEDINGUNGEN
Wogonin wurde aus 7 Gramm einer mehrkomponentigen botanischen Extraktzusammensetzung extrahiert, die Extrakte aus Panax pseudo-ginseng Wall, Isatis Indigotica Fort, Ganoderma lucidium Karst, Dendrathema morifolium Tzvel, Glycyrrhiza glabra L, Sculletaria bailcalensis Georgi, Rabdosia rubescens und Serenoa repens enthielt. Das Pulver wurde unter Verwendung eines Soxhlet-Extraktor eine Stunde in 150 ml Aceton gelöst. Der Flüssigephasenextrakt wurde durch Siliceagelsäulenchromatographie weiter aufgereinigt; wobei ein Lösungssystem von 2:1 Cyclohexan:Aceton verwendet wurde. Etwa 25 Milligramm des gelben Pulvers erhielt man aus den Fraktionen 11-13 (8 Milliliter pro Fraktion). Das Pulver wurde aus reinem Ethanol umkristallisiert, was gelbe Kristalle ergab.
1 zeigt eine Hochleistungschromatogramm, das die Position des Wogonin im Elutionsprofil veranschaulicht. Das Chromatgramm erhielt man mit einem Shimadzu SPD-M10A Chromatographen und Verwendung einer C18 Umkehrphasen-Säule und zwei Lösungssysteme aus Wasser und Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure.
Die chemische Struktur und das Molekulargewicht des gelben Kristalls wurde durch totale (2(b)) und DEPT (2(a)) ¹³C NMR (d-4 Methanol Lösungsmittel auf Varian^UNITY Inova 400 System) bestimmt. Die Probe wurde auch durch Elektroionisierung mit einem Hewlett Packard VG 7070 analysiert; das Massenspektrum wird in 3 gezeigt und weist auf ein Molekulargewicht von 284, übereinstimmend mit Wogonin, hin.
Isoliquiritigenin wurde aus der Flavonoid-Fraktion des konzentrierten Pulvers aus Glycyrrhiza glabra (bezogen von Shanghai Zhao Wei Technology Development Co.), das mit reinem Ethanol extrahiert wurde, aufgereinigt. Rund 1 Gramm des Flavonoid-Konzentrats (gelöst in 5 Milliliter Wasser) wurde durch eine Sephadex LH-20 Säule (2,5 × 30 Millimeter) geleitet und durch einen Lösungsmittel-Gradient aus einem Methanol-Wasser-Gemisch eluiert. Das rohe Isoliquiritigenin erhielt man aus Fraktion 27 (10 Milliliter pro Fraktion). Das Rohprodukt wurde weiter aufgereinigt durch Siliceagelchromatographie, durch Flution mit einem Lösungsmittelgemisch aus Methylenchlorid:Methanol (5:1).
Die chemische Struktur und das Molekulargewicht des Isoliquiritigenins wurde bestimmt durch ein Absorptionsspektrum (5) in Verbindung mit einer HPLC Separation (4), durchgeführt mit einem Shimadzu SPD-M10A Chromatographen, sowie den ¹³C NMR Spektren (6(a), DEPT; 6(b), total) und einem Massenspektrum (7). Das Absorptionsspektrum war identisch mit demjenigen der Referenzverbindung, die von Sigma Chemical Co., (St. Louis, Missouri) bezogen wurde.
Die Antikrebswirkungen von Wogonin und Isoliquiritigenin wurden durch die Bestimmung derer Fähigkeiten evaluiert, das Tumorzellenwachstum zu hemmen, den Krebszellenzyklus zu verändern und die Östrogenrezeptoren zu aktivieren.
Krebszelllinien: LNCaP, DU-145 und MCF-7 Zellen wurden bezogen von der American Type Culture Collection. PTX 10, eine Taxol-resistente Eierstockkrebs-Zelllinie, erhielt man vom Brander Cancer Research Laboratoy, New York Medical College. Die Zellen wurden in RPMI 1640 Kulturmedium gehalten, ergänzt durch 10% Hitze-inaktiviertes FBS, 5 Millimol Glutamin, 50 Einheiten/Milliliter Penicillin G und 50 Gramm/Milliliter Streptomycin. Die Zellen wurden gewöhnlich zu 1 × 10⁵ Zellen/Milliliter in T-75 Glaskolben ausgesät, sich über Nacht anheften lassen, und dann mit dem pflanzlichen Extrakt behandelt. Die Zellen wurden zu unterschiedlichen Zeiten durch Trypsinisierung geerntet.
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirkung von Wogonin und Isoliquiritigenin bei der Wachstumshemmung der Hormon-sensitiven Prostatakrebszelllinie LNCaP.
Der MTT-Test (MTT = 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) wurde verwendet, um lebensfähige Zellen zu zählen. Die Testreagenzien wurden bezogen von Boehringer Mannheim (Roche Diagnosis Corp, Indianopolis, Indiana). In diesem Test wird der Tetrazolium-Farbstoff MTT gespalten, um durch metabolisch aktive Zellen Formazan zu bilden und zeigt eine kräftige, rote Absorptionsbande bei 550-618 nm. Das Protokoll für den Zelllebensfähigkeits-Test wurde durch den Hersteller bereitgestellt und in unserem Labor wie unten beschrieben modifiziert.
Prostatakrebszellen oder Brustkrebszellen (Vergleich) wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in einer Konzentration von 3 × 10³ Zellen pro Vertiefung (MCF-7; Brustkrebszellen) oder 6 × 10³ Zellen pro Vertiefung (LNCaP oder DU145; Prostatakrebszellen), in ein Volumen von 100 Mikroliter Zellkulturmedium ausgesät. Nach 24 Stunden wurden 20 Mikroliter-Teilproben der Verbindungen in verschieden Konzentrationen zu den angehefteten Zellen hinzugegeben. Jede Konzentration wurde in drei Vertiefungen gegeben, um Mittelwerte zu erhalten. Um Lösungsmitteleffekte auszuschließen, wurden 20 Mikroliter des Lösungsmittel, das bei der Herstellung der höchsten Konzentration der Verbindungen (ein Maximum von 0,5 Volumen-% von Dimethylsulfoxid (DMSO)) verwendet wurde, zu den Kontrollzellen in jeder Vertiefung gegeben. Die Platten wurden bei 37°C für 72 Stunden in einem CO₂-Inkubator inkubiert. Am Ende von Tag 3 (nach 72 Stunden) wurde das Kulturmedium vorsichtig, ohne die Zellen zu verwirbeln, herausgenommen, und durch 100 Mirkoliter frischem Zellmedium ersetzt. 10 Mikroliter des MTT-Reagenz wurden zu jeder Vertiefung hinzugegeben und die Platten wurden daraufhin wieder bei 37°C für 4 Stunden in einem CO₂-Inkubator inkubiert. 100 Mikroliter des Natriumdodecylsulfat (SOS) Solubilisierungsreagenz (von Boehringer Mannheim) wurden zu jeder Vertiefung hinzugegeben. Die Platte wurde über Nacht im CO₂-Inkubator stehen gelassen und von einem ELISA Reader (EL800, Bio-Tek Instruments, Inc.) bei einer Wellenlänge von 580 nm abgelesen. Die prozentuale Zelllebensfähigkeit wurde anhand der folgenden Gleichung berechnet:
wobei V die prozentuale Zelllebensfähigkeit ist, A_control die Absorption der Kontrollzellen ist, und A_treated die Absorption der behandelten Zellen ist. Die 8 und 9 veranschaulichen die Wirkung des Wogonins und des Isoliquiritigenins, das Wachstum von LNCaP (Androgen-abhängig) und DU-145 (Androgen-unabhängig) Prostatakrebszellen zu hemmen. Es ist offensichtlich, dass die Zellwachstumshemmung dosisabhängig ist. Die Konzentration der Verbindungen, die zu 50%-iger Inhibition des Krebszellenwachstums, bezeichnet als ED₅₀, führt, wurde durch lineare Interpolation bestimmt. Die ED₅₀-Werte für die beiden Verbindungen, die man durch diese Messungen erhielt, sind in den Spalten 1 und 2 von Tabelle 1 zu sehen. Tabelle 1 ED₅₀ Werte aus MTT Assays als Funktion von Verbindung und Zelltypus

LNCaP (μg/ml) DU145 (μg/ml) MCF7 (μg/ml)

Wogonin 10.00 18.6 NA

Isoliquiritigenin 3.51 7.60 3.25
BEISPIEL 2 (VERGLEICHSBEISPIEL)
Dieses Beispiel veranschaulicht die Aktivität des Isoliquiritigenins bei der Wachstumshemmung der Brustkrebszelllinie MCF-7.
Die gleichen Protokolle, die in Beispiel 1 beschrieben wurden, wurden verwendet, um die Effekte des Isoliquiritigenins auf MCF-7 Zellen zu bewerten. MCF-7 ist eine Brustkrebszelllinie, die Östrogenrezeptoren exprimiert. Daher ist es ein gutes Modell zur Untersuchung der Effekte von Antikrebsmitteln auf Östrogenrezeptor-positiven Brustkrebs.
9 zeigt die MTT-Test-Graphen für Isoliquiritigenin mit MCF-7. Die Messwerte zeigen, dass Isoliquiritigenin das Wachstum der MCF-7 Zellen inhibitierte, und man konnte einen dosisabhängigen beobachten. Die ED₅₀-Werte werden in Spalte 3 von obiger Tabelle 1 gezeigt.
BEISPIEL 3
Dieses Beispiel veranschaulicht die Modulation des LNCaP-Zellzyklus durch Wogonin und Isoliquiritigenin. LNCaP-Zellen haben einen hormonabhängigen Zellzyklus.
Probenvorbereitung für Zellzyklus-Messung: Gezüchtete Zellen (2-4 × 10⁶ Zellen) wurden für 24-48 Stunden jeweils zwei verschiedenen Konzentrationen von Wogonin und Isoliquiritigenin in Kolben mit einer Fläche von 12,5 cm² ausgesetzt, bevor sie abgeerntet wurden. Die Zellen wurden in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und in eiskaltem 70%-igen Ethanol fixiert. Teilproben der fixierten Zellen wurden in PBS rehydriatisert und mit 1,0 Mikrogramm/Milliliter DAPI (4,6-Diamidiono-2-phenylindol von Eastman Kodak, Rochester, NY) angefärbt und in 10 millimolarem Piperazin-N,N-bis-2-ethan-sulfonsäurepuffer (Calbiochem, La Jolla, CA) gelöst, der 100 millimolar NaCl, 2mM MgCl₂ und 0,1% Triton X-100 (Sigma) bei pH 6,8, wie kürzlich von Halicka et al. (H. D. Halicka, B. Ardelt, G. Juan, A.Mittelman, S. Chef, F. Traganos and Z.Darzynkiewicz, "Apoptosis and Cell Cycle Effects Induced by Extracts of the Chinese Herbal Preparation of PC SPES", International J. of Oncology (1997), 11: 437-448) beschrieben, enthielt.
Der zelluläre DNA-Gehalt wurde mit einem ELITE ESP Flusszytometer (Coulter Inc., Fl.), unter Verwendung einer UV-Laserbelichtung, gemessen. Das Multicycleprogramm wurde dazu verwendet, die DNA-Häufigkeitshistogramme zu entzerren, um die Frequenz der Zellen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus zu bestimmen.
10 zeigt die DNA-Histogramme von LNCaP-Zellen bei Anwesenheit und Abwesenheit von Wogonin zu 3 Mikrogramm/Milliliter nach 24 Stunden. Es ist evident, dass es eine Veränderung der G1-Phase, wie durch den Pfeil angedeutet, gab. Die Datenanalyse ergab, dass der Anstieg in der G1-Phase proportional zur Wogonin-Konzentration war.
Ähnliche Messungen wurden mit Isoliquiritigenin vorgenommen. 11 fasst die Effekte von Wogonin und Isoliquiritigenin auf die G1, S und G₂M-Phasen des LNCaP-Zellzyklus zusammen. Die Daten zeigen, dass Wogonin einen G1-Phasenstillstand und Isoliquiritigenin einen G₂M-Phasenstillstand induzierte. Eine Verlängerung entweder in der G1- oder der G₂M-Phase führt zur Suppression der LNCaP-Zelllebensfähigkeit.
BEISPIEL 4
Dieses Beispiel zeigt die Veränderung des DU-145-Zellzyklus durch Wogonin und Isoliquiritigenin.
Das Protokoll, das in Beispiel 3 beschrieben wurde, wurde dazu verwendet, den Effekt von Wogonin auf die Hormon-unabhängige Prostatakrebszelllinie DU-145 zu untersuchen. Die Ergebnisse werden in 12 veranschaulicht und zeigen, dass Wogonin die G₂M-Phase von DU-145 prolongiert. Die Verlängerung der G₂M-Phase führt zu einer Suppression der DU-145-Zelllebensfähigkeit.
BEISPIEL 5 (VERGLEICH)
Die östrogene Wirkung von Wogonin und Isoliquiritigenin wurde durch die Bestimmung deren Fähigkeit zur Aktivierung von Östrogen-Rezeptoren (Unterklasse Alpha und Beta) gezeigt.
HEK 293 Zellen (ATCC CRL-1573) wurden mit einem Expressionsvektor für hER_α und hER_β, und einem ERE-LUC Reportergen (plus einem TK-LUC Reporter zur Normalisierung) nach dem Protokoll von Yoon et al ("Differential activation of wild-type and variant forms of estrogen receptora by synthetic and natural estrogenic compounds using a promoter containing three estrogen-responsiveelements", J. Steroid Biochem. & Molecular Biology (2000), 28: pages 25-32) transfiziert.
Die Zellen wurden dann getrennt Wogonin und Isoliquiritigenin in Konzentrationen von 0, 0,07, 0,02, 0,08, 0,3, 0,7, 1,4 (oder 4) und 9 μg/ml für 20 Stunden ausgesetzt, und danach wurden die Zelllysate auf Reportergen-Expression untersucht (Tzukennan et al. "Human estrogen receptortransactivational capacity is determined by both cellular and promoter content and mediated by two functionally distinct intermolecular regions", Mol. Endocrinol. (1994),8: 21-30).
13 zeigt das Dosis-Ansprechverhalten des ERα-Luc-Reportergens, das durch Wogonin und Isoliquiritigenin aktiviert wurde.
14 zeigt das Dosis-Ansprechverhalten des ERβ-Luc-Reportergens, das durch Wogonin und Isoliquiritigenin aktiviert wurde. Es ist sehr signifikant, dass Wogonin und Isoliquiritigenin eine bis zu 10-fach höhere Leistungsfähigkeit bei der Aktivierung des ERβ-Luc-Reportergens haben, als bei der Aktivierung des ERα-Luc-Reportergens.
BEISPIEL 6
Dieses Beispiel veranschaulicht die Hemmung der COX-2-Aktivität durch Isoliquiritigenin.
COX ist ein bifunktionales Enzym, das sowohl Cyclooxygenase-, als auch Peroxidase-Aktivität zeigt. Die Cyclooxygenase-Aktivität ist verantwortlich für die Oxidation der Arachidonsäure zu Prostaglandin G₂ (PGG₂) und die Peroxidase-Aktivität ist verantwortlich für die anschließende Reduktion von PGG₂ zum entsprechenden Alkohol, PGH₂. Manche Methoden, die zur Bestimmung von COX-2-Inhibitoraktivität verwendet werden, schließen die Messung der Sauerstoffaufnahme mittels eines Oxygraphen, den Umsatz von radioaktiver Arachidonsäure oder die Messung der Prostaglandine, die aus PGH₂ gebildet werden (unter Verwendung Immunassay-Techniken), ein.
In diesen Experimenten wird der Schafs-COX-2 Inhibitor Screening Test, käuflich erhältlich unter der Katalognr. 760101 von Cayman Chemical (Ann Arbor, MI 48108) verwendet. Dieser Immunoassay verwendet einen Antikörper, der an alle wichtigen Prostaglandine bindet, um quantitativ die Menge von PGF_2α, das in der COX-Reaktion unter Verwendung von Arachidonsäure als Substrat entsteht, zu messen. Das End-Volumen der Reaktionen, die unten beschrieben sind, ist üblicherweise 1,15 ml. COX-1 und COX-2 (zum Beispiel, 20 μl einer Lösung aus 1 bis 100 Einheiten/ml COX, wobei eine Einheit definiert ist, als die Menge eines Enzyms, das ein Nanomol Sauerstoff pro Minute bei 37°C in 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, der 100 μM Arachidonsäure, 5 mM EDTA, 2 mM Phenol und 1 μM Hematin enthält, verbraucht) wird zuerst mit einem Puffer (z.B. 0,1 M Tris, pH 8,0, 5 mM EDTA, 2 mM Phenol) und Häm (z.B. 10 μl von 10 mM Häm) in einem Mikrofugen-Röhrchen vermischt. Das Häm ist ein Cofaktor des COX, und führt zu maximaler Aktivität im Test. COX-Proben, die den Inhibitor enthalten, können mit dem Inhibitor (z.B. 1-100 μM) vorgemischt werden, bevor das Substrat hinzugefügt wird. Das Arachidonsäuresubstrat (z.B. 10 μl einer 10 mM Lösung) kann für kurze Zeit und bei einer Temperatur, die für die Reaktion, die zu den nachweisbaren Produkten führt, ausreicht, zu der COX/Häm/Inhibitor-Mischung gegeben werden (z.B. 2 Minuten bei 37°). Die Reaktion kann mit Säure (z.B. 50 μl aus 1 M HCl) beendet werden. Zusätzliches Zinnchlorid (z.B. 100 μl einer gesättigten Lösung) kann für die Quantifizierung des Prostaglandins hinzugegeben werden, um das entstandene PGH₂ in das stabilere PGF_2a umzuwandeln. Das Prostaglandin, das in diesen Reaktionen entstanden ist, wird üblicherweise mit einem Enzym-Immunoassay quantifiziert.
Der Enzym-Immunoassay zum Nachweis von Prostaglandin kann in geeigneter Weise in einer Platte mit 96 Vertiefungen unter Verwendung eines Antikörpers zum Nachweis von Prostaglandin durchgeführt werden. Als Kontrollen können Prostaglandin-Standards und COX-Proben mit 100% Aktivität (kein Inhibitor) gemessen werden. Proben zur Hintergrund-Korrektur können ebenso verwendet werden. Kontrollen und Reaktionen, die mit COX und den interessierenden Inhibitoren durchgeführt werden, werden mit dem Prostaglandin-Screening-Antiserum in einer Menge, die ausreicht um das in den COX-Reaktionen entstandene Prostaglandin nachzuweisen (z.B. 50 μl des Antiserums gelöst in 6 ml eines geeigneten EIA-Puffers), inkubiert. Die Reaktionen können für eine bestimmte Zeit und Temperatur, die ausreichen, um Interaktionen des Antiserums und des Prostaglandins zuzulassen (z.B. 18 Stunden bei Raumtemperatur), inkubiert werden. Für das Entwickeln der Platte werden die Reaktionsansätze zuerst gewaschen und dann für etwa 60 Minuten mit 200 μl Ellman-Reagenz inkubiert. Die Platte kann bei 405-420 nm mit einem Plattenleser abgelesen werden. Die Prostaglandin-Standards werden dazu verwendet, eine Standardkurve der Prostaglandin-Konzentration zu berechnen. Die Menge des Prostaglandins in jeder Probe mit Inhibitor wird von der Menge des Prostaglandins in der Probe mit 100% Aktivität subtrahiert, durch die Menge des Prostaglandins in der Probe mit 100% Aktivität dividiert, und mit 100 multipliziert, um eine prozentuale Hemmung zu erhalten. Die graphische Darstellung der prozentualen Hemmung im Vergleich zum Inhibitor erlaubt die Berechnung des IC₅₀-Wertes (die Konzentration bei der die Hemmung 50% beträgt).
Methoden zur Messung der Aktivität eines COX-Inhibitors sind beschrieben zum Beispiel in W. Xie, J. G. Chipman, D. L. Robertson, et al., "Expression of a mitogen-responsive gene encoding prostaglandin synthase is regulated bymRNA splicing", Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991), 88: 2692-2696; K. M. Maxey, K. R. Maddipati, and J.Birkmeier, "Interference in enzyme immunoassays", J.Clin. Ifnmunoassay (1992),15: 116-120; P. Pradelles, J. Grassi, and J. A. Maclouf, "Enzyme immunoassays of eicosanoids using acetylcholinesterase as label: An alternative toradioimmunoassay", Anal. Chem. (1985), 57: 1170-1173; Maclouf, J., Grassi, J., and Pradelles, P. Development of enzyme-immunoassay techniques for the measurement of eicosanoids, Prostaglandinafzd Lipid Metabolism ifz Radiation Irajur (197), pages 355-364.
15 zeigt die Dosis-abhängige inhibitorische Aktivität von Isoliquiritigenin auf COX-2, gemessen entsprechend der oben beschriebenen Prozedur. Ein IC₅₀ von 10,5 μM wurde aus den Daten berechnet.
BEISPIEL 7
Dieses veranschaulicht die Zytotoxizität von Wogonin und Isoliquiritigenin auf eine Eierstockkrebszelllinie (Vergleichsbeispiel).
Zellen von PTX 10, einer Taxol-resistenten Eierstockkrebszelllinie, wurden in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin (alles von Gibco/BRL Life Technologies, Inc., Grand Island, NY), bei 37,5°C unter einer Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft, gehalten. Bei Beginn des Experiments hatten die Kulturen Dichten unter 5 × 10⁵ Zellen/ml und die Zellen wuchsen exponentiell und asynchron.
Der MTT-Test wurde durchgeführt, um den Effekt von Wogonin und Isoliquiritigenin auf das Zellwachstum von PTX 10 zu untersuchen. Das MTT-Testprotokoll ist das gleiche wie in Beispiel 1 beschrieben. Die 16 und 17 zeigen die Inhibitionskurven einer PTX-Zelllinie bei Anwesenheit von Wogonin und Isoliquiritigenin. Eine konzentrationsabhängige Hemmung konnte anhand dieser beiden Figuren klar beobachtet werden. Die ED₅₀-Werte die aus den Inhibitionskurven errechnet wurden, sind 1,56 μg/mL und 3,32 μg/mL für Wogonin bzw. Isoliquiritigenin, wie in Tabelle 2 zu sehen. Tabelle 2 ED₅₀

PTX 10 (Taxol-resistente Eierstockkrebszelle)

Wogonin (I-16-2) <1.56 μg/mL

Isoliquiritigenin 3,32 μg/mL
Daher könnten Wogonin und Isoliquiritigenin bei der Behandlung von Krebsarten, die resistent auf die Behandlung mit anderen Mitteln, wie zum Beispiel Taxol, sind, Verwendung finden.
BEISPIEL 8

Eine Zusammensetzung, gemäß dieser Offenbarung, wurde in Kapseln, 6mal täglich, zwei älteren freiwilligen Patienten mit diagnostiziertem Prostatakrebs verabreicht. Als Maß für die Krebsprogression wurde die Höhe des Prostata-spezifischen Antigens (PSA), eine Substanz, die von der Prostatadrüse produziert wird, in der Blutbahn gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3

Patient Alter	Behandlung vor der Behandlung mit Zusammensetzung 1	PSA bei Beginn der Behandlung ng/mL	PSA nach 1 Monat der Behandlung ng/mL	PSA nach 2 Monaten der Behandlung ng/mL	Prozentuale PSA Verringerung nach 1 Monat der Behandlung	Prozentuale PSA Verringerung nach 2 Monaten der Behandlung
73	Kastration plus Flutamid	80	40	6	50 %	92,5 %
79	Prostataectonomie, keine Medikation	120	64	18	46,7 %	85 %

Wie der Tabelle 3 zu entnehmen ist, konnte eine dramatische Reduktion der PSA-Höhe nach 1 und 2 Monaten Behandlung mit Zusammensetzung 1 beobachtet werden.
Zusammensetzungen, die Wogonin, Isoliquiritigenin, Cumestrol, und Kombinationen davon, enthalten, haben sowohl phytoöstrogene, als auch Antikrebs-Aktivität. Die beanspruchten Zusammensetzungen enthalten ein zusätzliches Antikrebsmittel und ein Immunstimulans. Die Antikrebs-Aktivität wird durch die Fähigkeit des Wogonins und Isoliquiritigenins zur Hemmung des Wachstums von Krebszelllinien veranschaulicht. Die Identifikation von Isoliquiritigenin als COX-2 Inhibitor weist darauf hin, dass es eine allgemeine Antikrebsaktivität besitzt. Die Identifikation der phytoöstrogenen Aktivität des Wogonins weist darauf hin, dass, zusätzlich zur allgemeinen Antikrebsaktivität, zurückzuführen auf die COX-2 Hemmung, Wogonin insbesondere zur Behandlung von hormonabhängigen Krebsarten Verwendung finden kann.

Claims

Verwendung eines Phytoöstrogens bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Prostatakrebs, wobei das Phytoöstrogen mehr als 0,5 Gew.-% des Medikaments, bezogen auf das Gesamtgewicht des Medikaments, umfasst und das Phytoöstrogen ausgewählt ist unter Isoliquiritigenin, seinen pharmazeutisch verträglichen Salzen und Glycosidestern und einer Kombination einer oder mehrerer der vorstehend erwähnten Verbindungen; und das Medikament außerdem ein Antikrebsmittel enthält, das ausgewählt ist unter Oridonin, Indirubin, Taxol, Cisplatin, Camptothecan, Vincristin, Monocrotalin, Maytansin, Homoharringtonin, Colchicin, Irisquinon A, Irisquinon B, Irisquinon C, Acronycin, Matrin, Oxymatrin, Curcumin, Paricin, Pariphyllin und Kombinationen eines oder mehrerer der vorstehend aufgeführten Antikrebsmittel; und ein Immunstimulans, ausgewählt unter Ginsenosiden, Ferulasäure, Mannan, Synanthrin, Eleutherosid A, Eleutherosid B, Eleutherosid C, Eleutherosid D, Eleutherosid E, Gynosid, beta-Pachyman, Inulin, Glycoproteinen, Interferonen, y-Globulinen, Extrakten von Ganoderma lucidum, Extrakten von Coriolus versicolor, Extrakten von Poria cocos und Kombinationen, die eine oder mehrere der vorstehend aufgeführten Verbindungen umfassen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Phytoöstrogen mehr als 2 Gew.-% des Medikaments, bezogen auf das Gesamtgewicht des Medikaments, umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Phytoöstrogen mehr als 5 Gew.-% des Medikaments, bezogen auf das Gesamtgewicht des Medikaments, umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Phytoöstrogen mehr als 10 Gew.-% des Medikaments, bezogen auf das Gesamtgewicht des Medikaments, umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Phytoöstrogen mehr als 20 Gew.-% des Medikaments, bezogen auf das Gesamtgewicht des Medikaments, umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Medikament einen Extrakt von Glycyrrhiza uralensis, Glycyrriza glabra oder eine Kombination der vorstehend erwähnten Verbindungen umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Medikament außerdem Wogonin, Cumestrol oder eine Kombination der vorstehend erwähnten Verbindungen umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Medikament für die Verabreichung einer Dosis von 0,01 mg/kg/Tag bis 300 mg/kg/Tag Isoliquiritigenin formuliert ist.
Zusammensetzung, umfassend mindestens 0,5 Gew.-% an Isoliquiritigenin, seinen pharmazeutisch verträglichen Salzen oder Glycosidestern oder Kombinationen einer oder mehrerer der vorstehend aufgeführten Verbindungen, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung; und mindestens ein Antikrebsmittel, dass ausgewählt ist unter Oridonin, Indirubin, Taxol, Cisplatin, Camptothecan, Vincristin, Monocrotalin, Maytansin, Homoharringtonin, Colchicin, Irisquinon A, Irisquinon B, Irisquinon C, Acronycin, Matrin, Oxymatrin, Curcumin, Paricin, Pariphyllin und Kombinationen eines oder mehrerer der vorstehend aufgeführten Antikrebsmittel; und ein Immunstimulans, ausgewählt unter Ginsenosiden, Ferulasäure, Mannan, Synanthrin, Eleutherosid A, Eleutherosid B, Eleutherosid C, Eleutherosid D, Eleutherosid E, Gynosid, beta-Pachyman, Inulin, Glycoproteinen, Interferonen, y-Globulinen, Extrakten von Ganoderma lucidum, Extrakten von Coriolus versicolor, Extrakten von Porig cocos und Kombinationen, die eine oder mehrere der vorstehend aufgeführten Verbindungen enthalten.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, die weiterhin Wogonin, Cumestrol oder eine Kombination der vorstehend erwähnten Verbindungen umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder 10, worin das Antikrebsmittel Oridon und das Immunstimulans beta-Pachyman ist.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11 mit einem Phytoöstrogenanteil am Medikament, wie er in den Ansprüchen 2 bis 5 definiert ist.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12 zur Verwendung als Medikament.