KR102004593B1 - 쿠메스트롤을 포함하는 상피성 난소암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
쿠메스트롤을 포함하는 상피성 난소암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 쿠메스트롤을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 쿠메스트롤을 유효성분으로 포함하는 상피성 난소암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 쿠메스트롤을 유효성분으로 포함하는 상피성 난소암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 쿠메스트롤을 유효성분으로 포함하는 조성물은 식물에서 추출된 것으로서 화학적 합성물에 비해 체내 독성 내지 부작용을 최소화할 수 있으며, 상피성 난소암 세포 내 증식 및 이주성을 억제하고 용량 의존적으로 상피성 난소암 세포주 내 사멸 세포의 수를 증가시킬 뿐만 아니라, PI3K/AKT, ERK1/2 또는 P38 신호전달경로를 억제하는 타겟 억제제 또는 시스플라틴 및 파클리탁셀과 같은 항암화학치료제와 병용 처리하는 경우 세포 사멸의 시너지 효과를 얻을 수 있는바, 생명과학, 의약학 등 다양한 산업 분야에 널리 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 쿠메스트롤을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 쿠메스트롤을 유효성분으로 포함하는 상피성 난소암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 쿠메스트롤을 유효성분으로 포함하는 상피성 난소암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
난소암은 초기 증상 및 조기 진단을 위한 효과적인 바이오마커의 부재로 대다수의 난소암 환자들이 병기(stage) III 또는 IV에 진단되며 낮은 5년 생존율을 나타내며, 2016년 통계학적 분석을 통해 미국 내 사망률 5위에 이르는 치명적인 암으로 분류되었다(Siegel RL et al., CA Cancer J Clin, 65:5-29 2016; and Jayson GC et al., Lancet, 384:1376-88, 2014).
대다수의 난소암은 난소 상피세포로부터 유전적 변이 발생에 따라 악성 종양으로 발생되어 상피성 난소암으로 명명된다. 상피성 난소암은 조직병리학적 분석을 통해 장액성 난소암(serous carcinoma), 점액성 난소암(mucinous carcinoma), 자궁내막양 난소암(endometrioid carcinoma), 투명세포암(clear cell carcinoma)으로 분류된다 (Kaku T et al., Med Electron Microsc, 36:9-17, 2003).
일반적인 상피성 난소암의 치료 방법은 종양감축술(cytoreductive surgery) 이후 항암화학요법 또는 방사선치료를 실시하는 것이다. 하지만, 고등급 장액성 난소암과 투명세포암은 백금계, 탁산계 항암제를 동시에 사용하는 표준 항암화학요법에 저항성을 나타내며 나쁜 예후를 나타낸다 (Tan DS and Kaye S, J Clin Pathol, 60:355-60, 2007; Vaughan S et al., Nat Rev Cancer, 11(10):719-25, 2011). 그러므로 상피성 난소암 신호전달과정 내 세포사멸기전을 방해함에 따라 나타나는 항암제 내성을 극복하기 위해 상피성 난소암 예방법 및 새로운 치료제 개발이 요구된다.
쿠메스트롤은 콩과식물, 미니양배추, 시금치 등에 포함되어 있는 파이토에스트로겐으로서 상피성 난소암, 자궁경부암, 폐암, 전립선암 등에 다량 존재하는 CK2 단백질 인산화효소 억제제로 작용한다고 보고되었다(Ahmad KA et al., Adv Enzyme Regul, 2008; and Duncan JS and Litchfield DW, Biochim Biophys Acta, 2008). 또한, 쿠메스트롤은 유방암 세포주 내 세포사멸, 면역반응, ER stress와 관련된 유전자의 발현을 유도하며, 전립선암 세포주 내에서는 저산소 조건 내 종양형성과 전이에 관여하는 HIF1α 단백질의 발현을 억제시키는 것으로 보고된 바 있다(Obiorah IE et al., Cancer Prev Res (Phila), 2014; and Cho SY et al., Bioorg Med Chem Lett, 2014).
파이토에스트로겐은 에스트로겐 수용체(ESR1, ESR2)가 estrogen-response element에 결합하는 활성을 나타내는 것으로 알려져 있지만, 현재까지 상피성 난소암 내에서 쿠메스트롤을 이용한 치료기전에 관한 연구는 보고된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 천연물 유래 물질을 이용한 새로운 상피성 난소암 치료제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 상피성 난소암 세포주 ES2 세포를 사용하여 쿠메스트롤에 의한 세포 증식과 이주성 억제 및 세포 사멸 유도 효과를 확인하고, 쿠메스트롤이 상피성 난소암 세포주 ES2 내 세포 증식 관련 PI3K/AKT와 MAPK 신호전달기전을 비활성화시킨다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 쿠메스트롤을 유효성분으로 포함하는 상피성 난소암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 쿠메스트롤을 유효성분으로 포함하는 상피성 난소암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 약학적 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 이용하여 상피성 난소암 세포주의 증식 및 이주 능력을 억제시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 약학적 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 이용하여 상피성 난소암 세포주의 사멸 효과를 향상시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 쿠메스트롤을 유효성분으로 포함하는 상피성 난소암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 쿠메스트롤을 유효성분으로 포함하는 상피성 난소암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 한다.
본 발명은 또한, 상기 약학적 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 이용하여 상피성 난소암 세포주의 증식 및 이주 능력을 억제시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 약학적 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 이용하여 상피성 난소암 세포주의 사멸 효과를 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 쿠메스트롤을 유효성분으로 포함하는 조성물은 식물에서 추출된 것으로서 화학적 합성물에 비해 체내 독성 내지 부작용을 최소화할 수 있으며, 상피성 난소암 세포 내 증식 및 이주성을 억제하고 용량 의존적으로 상피성 난소암 세포주 내 사멸 세포의 수를 증가시킬 뿐만 아니라, PI3K/AKT, ERK1/2 또는 P38 신호전달경로를 억제하는 타겟 억제제 또는 시스플라틴 및 파클리탁셀과 같은 항암화학치료제와 병용 처리하는 경우 세포 사멸의 시너지 효과를 얻을 수 있는바, 생명과학, 의약학 등 다양한 산업 분야에 널리 활용될 수 있다.
도 1은 상피성 난소암 세포 내 쿠메스트롤에 의한 세포 사멸 기전을 나타낸 것이다.
도 2는 상피성 난소암 ES2 세포 내 쿠메스트롤에 의한 영향을 분석한 결과를 나타낸 것으로, (A)는 쿠메스트롤 용량에 의존적인 ES2 세포의 증식력을 나타낸 것이고, (B), (C)는 트랜스웰 막을 이용한 세포 이동성을 분석한 결과를 나타낸 것이고, (D)는 TUNEL 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 상피성 난소암 ES2 세포 내 쿠메스트롤 적용에 따른 PCNA, ERBB2 발현 양상을 분석한 결과로 (A)는 PCNA 발현 세포를 염색하여 관찰한 결과를 나타낸 것이고, (B)는 ERBB2 발현 세포를 염색하여 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 ES2 세포 내 쿠메스트롤의 용량의존적 투여에 따른 PI3K, MAPK 신호전달분자 인산화 패턴 분석 결과를 나타낸 것으로, (A) AKT, (B) p70S6K, (C) ERK1/2, (D) p38, (E) JNK1/2 및 (F) p90RSK의 용량 의존적 인산화 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 ES2 세포 내 쿠메스트롤의 시간의존적 투여에 따른 PI3K, MAPK 신호전달분자 인산화 패턴 분석 결과를 나타낸 것으로, (A) AKT, (B) p70S6K, (C) S6, (D) ERK1/2, (E) p90RSK 및 (F) JNK1/2의 시간 의존적 인산화 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 ES2 세포 내 쿠메스트롤과 신호전달기전 억제제를 통한 (A) AKT, (B) p70S6K, (C) S6 및 (D) ERK1/2 인산화 패턴 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 쿠메스트롤과 기존 항암화학치료제를 이용한 상피성 난소암 내 치료 효율을 나타낸 것이다.
도 2는 상피성 난소암 ES2 세포 내 쿠메스트롤에 의한 영향을 분석한 결과를 나타낸 것으로, (A)는 쿠메스트롤 용량에 의존적인 ES2 세포의 증식력을 나타낸 것이고, (B), (C)는 트랜스웰 막을 이용한 세포 이동성을 분석한 결과를 나타낸 것이고, (D)는 TUNEL 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 상피성 난소암 ES2 세포 내 쿠메스트롤 적용에 따른 PCNA, ERBB2 발현 양상을 분석한 결과로 (A)는 PCNA 발현 세포를 염색하여 관찰한 결과를 나타낸 것이고, (B)는 ERBB2 발현 세포를 염색하여 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 ES2 세포 내 쿠메스트롤의 용량의존적 투여에 따른 PI3K, MAPK 신호전달분자 인산화 패턴 분석 결과를 나타낸 것으로, (A) AKT, (B) p70S6K, (C) ERK1/2, (D) p38, (E) JNK1/2 및 (F) p90RSK의 용량 의존적 인산화 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 ES2 세포 내 쿠메스트롤의 시간의존적 투여에 따른 PI3K, MAPK 신호전달분자 인산화 패턴 분석 결과를 나타낸 것으로, (A) AKT, (B) p70S6K, (C) S6, (D) ERK1/2, (E) p90RSK 및 (F) JNK1/2의 시간 의존적 인산화 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 ES2 세포 내 쿠메스트롤과 신호전달기전 억제제를 통한 (A) AKT, (B) p70S6K, (C) S6 및 (D) ERK1/2 인산화 패턴 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 쿠메스트롤과 기존 항암화학치료제를 이용한 상피성 난소암 내 치료 효율을 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 쿠메스트롤의 상피성 난소암 세포 내 세포 사멸 기전을 밝혔다(도 1).
본 발명은 일 관점에서 쿠메스트롤을 유효성분으로 포함하는 상피성 난소암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서 쿠메스트롤을 유효성분으로 포함하는 상피성 난소암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "조성물"은 특정 성분을 포함하는 산물뿐만 아니라, 특정 성분의 배합에 의해 직접 또는 간접적으로 만들어지는 임의의 산물을 포함하는 것으로 간주된다.
본 발명에 있어서, 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 담체는 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 완충 물질, 물, 염, 전해질, 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 약학적 조성물은 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국부 투여용으로 제형화하는 것을 특징으로 할 수 있고, 완충제, 항균성 보존제, 계면활성제, 산화방지제, 긴장성 조정제, 방부제, 증점제 및 점도 개질제로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 보조제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 용액, 현탁액, 에멀젼, 겔 및 분말로 구성된 군에서 선택되는 제형을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 증상의 경중도, 환자의 체중, 연령, 성, 투여 방식 및 투여시간 등과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 건강기능식품은 건강기능식품에 관한 법률 제6722호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 식품을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있고, 과립제, 정제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 껌, 차, 젤리, 각종 음료수, 드링크제, 알코올 음료 등으로 제조될 수 있으며, 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 인체를 비롯한 동물 신체에 투여하기 적합한 임의의 생약 형태, 더욱 구체적으로는 경구 투여에 통상적인 임의의 형태, 예를 들어 식품 또는 사료, 식품 또는 사료의 첨가제 및 보조제, 강화된 식품 또는 사료, 정제, 환제, 과립, 캡슐 및 발포 배합물 등과 같은 고체 형태 또는 용액, 현탁액, 유화액, 음료, 페이스트 등과 같은 액체형태 일 수 있고, 영양제, 비타민, 전해질, 감미제, 착색제, 유기산, 방부제 등을 함유할 수 있으며, 이러한 성분들을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 쿠메스트롤이 PI3K/AKT 및 MAPK 신호전달기전을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, PI3K/AKT, ERK1/2 또는 P38 신호전달경로를 억제하는 타겟 억제제를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, 시스플라틴 또는 파클리탁셀을 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고 상피성 난소암 치료제로 사용되는 화학치료제를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 약학적 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 이용하여 상피성 난소암 세포주의 증식 및 이주 능력을 억제시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 약학적 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 이용하여 상피성 난소암 세포주의 사멸 효과를 향상시키는 방법에 관한 것이다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
실시예
1: 재료의 준비
1-1: 실험동물 및 세포배양
상피성 난소암 세포주인 ES2 세포는 American Type Culture Collection에서 구매하여 사용하였으며, 세포의 단층배양을 위해서 McCoy’5A (Modified) 배지에 10%의 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 함께 혼합하여 사용하였다.
1-2: 실험 재료
후보 조성물질인 쿠메스트롤은 Sigma Aldrich로부터 구매하여 사용하였으며, 쿠메스트롤에 의한 신호전달메커니즘을 확인하기 위하여 phospho-AKT, ERK1/2, P70S6K, P90RSK, S6, JNK, P38 단백질 및 total-AKT, ERK1/2, P70S6K, P90RSK, S6, JNK, P38 단백질을 Cell Signaling Techonology사(Beverly, MA, USA)로부터 구매하였다. 이 외, PCNA와 ERBB2 항체는 각각 Santa Cruz Biotechnology 및 Thermo 사에서 구매하였다. 또한 타겟 신호전달과정을 억제함에 따른 효과를 규명하기 위하여 PI3K 억제제인 LY294002를 Cell Signaling Technology사로부터, ERK1/2, P38, mTOR 억제제인 U0126, SB203580, Rapamycin을 Enzo Life Science사(Farmingdale, NY, USA)로부터 구매하여 사용하였다. 또한 항암화학요법에 사용되는 시스플라틴과 파클리탁셀은 Sigma-Aldrich, Inc(St. Louis, MO, USA)에서 구매하여 사용하였다.
실시예
2: 세포 증식 능력 분석
2-1:
BrdU를
이용한 세포 증식 능력 분석
상피성 난소암 세포의 증식 능력에 쿠메스트롤이 미치는 영향을 확인하기 위하여 FBS 기아 조건으로 배양한 1 ×103개의 ES2 세포와 McCoy’5A (Modified) 배지 100 ㎕를 96 well에 분주하고 쿠메스트롤을 용량의존적으로 (0, 5, 10, 20, 50, 100 μM) 처리하여 48시간 동안 배양한 다음, BrdU 키트 (Cat No: 1167229001, Roche)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 실험을 수행하였다. 48시간 인큐베이션 후, 10 μM BrdU를 각 well에 추가적으로 넣어 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 2시간 동안 배양하였다. ES2 세포에 BrdU를 labeling 하고 세포를 고정하여 anti-BrdU-POD 용액을 상온에서 90분 인큐베이션 시킨 이후 3차례 씻어주었다. 마지막으로 100 ㎕의 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine substrate으로 세포를 반응하여 ELISA 리더기를 사용하여 370 nm, 492 nm 내 흡광도를 측정하여 세포 증식 능력을 분석하였다.
2-2:
TUNEL
분석(assay)
3 ×104 개의 ES2 세포를 10% FBS가 포함 된 McCoy’5A (Modified) 배지 300 ㎕와 함께 공초점 접시(Confocal dish, catalog number: 100350, SPL Life Science, 한국)에 분주하여 배양한 뒤, 24시간 FBS 기아상태로 추가로 배양하여 쿠메스트롤 50 μM을 48 시간 동안 처리하였다. 이후, 세포를 에어드라이 시키고 4% paraformaldehyde로 상온에서 1시간 인큐베이션하여 세포를 고정시켰다. 고정된 세포는 PBS로 한번 헹궈내고 0.1% sodium citrate에 0.1% Triton X-100가 함유된 용액을 사용하여 아이스 위에서 2분간 인큐베이션 시켰다. 다음으로 In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red (Roche) 에 포함된 TUNEL 염색 혼합물(Staining mixture)을 사용하여 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 1시간 동안 배양하였다. 마지막으로 PBS로 헹구고 DAPI를 염색한 후, LSM710 (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA) 공초점 현미경을 이용하여 세포를 관찰 및 촬영하였다.
2-3:
면역형광법
3 ×104 개의 ES2 세포를 10% FBS가 포함 된 McCoy’5A (Modified) 배지 300 ㎕와 함께 공초점 접시(catalog number: 100350, SPL Life Science, 한국)에 분주하여 배양한 뒤, 24시간 FBS 기아상태로 추가로 배양하여 쿠메스트롤 50 μM을 48시간 동안 처리한 뒤 메탄올로 10분간 세포를 고정하고, 2 μg/ml의 PCNA, 1 μg/ml의 ERBB2로 희석된 항체를 처리하였으며 대조군에는 mouse IgG를 처리하여 4℃에서 16시간 인큐베이션 하였다. 이후, 0.1% BSA (bovine serum albumin)이 포함된 PBS로 2번의 워싱과정을 거쳐 2차 항체로는 goat anti-mouse IgG Alexa 488 (catalog number: A-11001, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 antibody dilution buffer에 1:200으로 희석하여 상온에서 1시간동안 배양하였다. ES2 세포를 0.1% BSA-PBS로 워싱한 다음 DAPI 염색을 추가적으로 시행하여 ES2 세포 내 타겟 단백질뿐만 아니라 핵을 동시에 관찰할 수 있도록 하였다. 실험 종료 후 LSM710 (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA) 공초점 현미경을 이용하여 세포를 관찰 및 촬영하였다.
2-4:
트랜스웰을
이용한 세포 이주 능력 측정
ES2 세포의 이주 능력에 쿠메스트롤이 미치는 영향을 확인하기 위하여 FBS 기아 조건으로 배양한 1 X 105개의 ES2 세포와 McCoy'5A (Modified) 배지 100 ㎕를 8-mm 트랜스웰 인서트(inserts) (Corning, Inc., Corning, NY, USA)에 분주하고 50 μM 쿠메스트롤을 처리하여 12시간 동안 배양한 다음, 메탄올로 10분간 트랜스-막(trans-membrane)을 이동한 세포를 고정하여, 건조 및 헤마톡실린 (catalog number: HHS32, Sigma Aldrich, Inc.) 염색을 30분 동안 수행하고, 씻어주었다. 슬라이드 글라스에 막을 올려주고 퍼마운트 용액(Permount solution)으로 고정하여 세포 이주 능력을 광학현미경 DM3000 (Leica)로 관찰, 촬영, 계산하였다.
2-5: 상피성 난소암 ES2 세포에 대한
쿠메스트롤의
영향 분석
쿠메스트롤에 의해 상피성 난소암 세포주 ES2 세포의 변화양상을 분석하기 위하여 먼저 쿠메스트롤을 용량의존적으로 (0, 5, 10, 20, 50, 100 μM) 첨가한 배지에 48시간 배양하였으며 이후 세포 증식 양상을 분석한 결과 ES2 세포의 증식력이 쿠메스트롤에 의해 단계적으로 감소함을 확인할 수 있었다(도 2A).
이를 토대로 50 μM 쿠메스트롤을 사용하여 transwell membrane을 이동한 ES2 세포의 수를 확인한 결과 대조군에 비해 쿠메스트롤의 농도가 높아질수록 세포의 이주능력이 감소함을 확인하였다(도 2B, 2C). 뿐만 아니라, 50 μM 쿠메스트롤을 ES2 세포에 처리하였을 때 DNA 분절화(DNA fragmentation)가 발생되며 세포 사멸이 유도되는 것을 확인하였다(도 2D).
동일한 조건 아래 면역형광기법을 바탕으로 상피성 난소암 증식마커인 PCNA, ERBB2 발현 세포를 염색하여 관찰한 결과 핵과 세포막에 과다 발현을 보이던 PCNA와 ERBB2가 쿠메스트롤을 처리함에 따라 감소함을 확인할 수 있었다(도 3). 이를 통해 쿠메스트롤이 ES2 세포의 증식을 억제시키는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예
3: 단백질 발현 분석
3-1:
웨스턴
블롯
ES2 세포에 쿠메스트롤 또는 세포신호전달 억제제와의 혼합물을 처리한 다음 ES2 세포로부터 전체 단백질을 추출하여 Bradford protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 단백질을 정량하였다. 이후, 추출한 단백질을 95℃에서 5분간 변성하였으며 10% SDS/PAGE 젤을 이용하여 전기영동을 수행한 뒤, 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)으로 옮겨주고, 1차 항체와 2차 항체를 차례로 인큐베이션 시킨 다음 화학발광 감지(chemiluminescence detection, SuperSignal West Pico, Pierce, Rockford, IL, USA) 시약을 사용하여 ChemiDoc EQ system과 Quantity One software (Bio-Rad) 기기를 사용하여 타겟 단백질의 발현을 분석하였다.
3-2:
쿠메스트롤에
의한 상피성 난소암 세포 내 신호전달기전 조절 양상 분석
쿠메스트롤에 의해 유도되는 상피성 난소암 세포의 증식 억제 및 세포 사멸에 영향을 미치는 PI3K/AKT, MAPK 신호전달메커니즘을 확인하기 위하여 쿠메스트롤을 용량의존적(0, 10, 20, 50 μM), 시간 의존적(0, 5, 15, 30, 60, 120 분; 50 μM 쿠메스트롤) 투여에 따라 웨스턴블롯을 이용하여 타겟 신호전달분자의 인산화 양상을 분석하였다. 그 결과, 쿠메스트롤에 의해 AKT, P70S6K, ERK1/2 MAPK, JNK MAPK, P90RS의 인산화가 감소되고 이와는 반대로 P38 MAPK의 인산화는 용량의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 4). 뿐만 아니라, 시간의존적으로 PI3K의 하위 신호전달분자인 AKT, P70S6K, S6의 인산화 감소 및 ERK1/2 MAPK, JNK MAPK의 인산화가 감소하는 양상을 확인하였으며 (도 5), 이를 통해 쿠메스트롤이 ES2 세포 내에서 PI3K, MAPK 신호전달기전을 조절함에 따라 ES2 세포의 증식을 억제하는 것을 알 수 있었다.
실시예
4:
쿠메스트롤과
AKT
, P38,
ERK1
/2 신호전달기전 억제제 혼합물을 통한 ES2 세포 내 신호전달물질 인산화 패턴 분석
상피성 난소암 세포주 내 쿠메스트롤에 의해 조절되는 신호전달기전을 분석하기 위하여 쿠메스트롤과 함께 PI3K/AKT 억제제 (LY294002), P38 억제제 (SB203580), ERK1/2 억제제 (U0126)를 병용 처리하여 신호전달물질의 인산화 경향을 확인하였다(도 6). 그 결과, 쿠메스트롤에 의해 감소하였던 AKT, P70S6K, S6는 LY294002를 병용 처리함에 따라 더욱 감소되는 양상을 나타내었으며 쿠메스트롤, LY294002, U0126를 동시에 처리하였을 때 각각의 인산화 경향이 단독 또는 LY294002와 병용 처리하였을 때보다 추가적으로 감소하는 양상을 나타내었다. ERK1/2의 인산화 역시 쿠메스트롤을 단독 또는 U0126과 병용 처리하였을 때 감소하였으며, 이와 비교시 쿠메스트롤, LY294002, U0126을 모두 함께 처리하였을 때 그 효과가 더 증대되는 것으로 나타났다. 이를 통해 쿠메스트롤은 PI3K, MAPK을 조절하여 상피성 난소암의 사멸을 유도하며, PI3K, MAPK 신호전달기전을 조절하는 억제제와 병용 처리 시 사멸효과는 더욱 증대된다는 것을 확인하였다.
실시예
5:
쿠메스트롤과
항함화학요법에
의한 상피성 난소암 세포의 증식 양상 비교 분석
쿠메스트롤을 상피성 난소암 치료를 위한 항암제로서 개발하기 위해 현재 일반적으로 사용되고 있는 항암화학치료제 시스플라틴과 파클리탁셀을 단독 또는 쿠메스트롤과 병용 처리하여 ES2 세포의 증식 능력을 비교 분석 하였다(도 7). 먼저 쿠메스트롤(50 μM), paclitaxel (20 μM), cisplatin (50 μM)을 단독으로 ES2 세포에 처리하였을 때 대조군에 비해 세포 증식 능력이 각각 46%, 30%, 36% 감소하였으며 기존 항암화학요법과 쿠메스트롤을 병용 처리 하였을 때 ES2 세포의 증식은 paclitaxel, cisplatin을 단독으로 처리하였을 때보다 더 효율적인 세포 사멸 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다. 이를 통해 쿠메스트롤이 상피성 난소암 치료제로서 또는 기존 항암제 치료에 있어 보조치료제로서 개발 가능성이 높음을 확인할 수 있었다.
통계분석
본 실험결과는 SAS (statistical analysis system) 통계프로그램을 이용하여 평균과 표준오차를 계산하였고, 일원배치분산분석 (one-way ANOVA)을 실시하였다. P < 0.05 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (10)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 쿠메스트롤; PI3K/AKT 억제제; 및 ERK1/2 억제제 및 P38 억제제 중 1종 이상의 타겟 억제제;를 유효성분으로 포함하는 조성물을, PCNA 및 ERBB2 단백질이 과발현된 인간을 제외한 포유동물의 상피성 난소암 세포주에 처리하여 PCNA 및 ERBB2 단백질의 발현을 억제하는 방법.
- 삭제
Priority Applications (1)
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| KR1020160174375A KR102004593B1 (ko) | 2016-12-20 | 2016-12-20 | 쿠메스트롤을 포함하는 상피성 난소암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020160174375A KR102004593B1 (ko) | 2016-12-20 | 2016-12-20 | 쿠메스트롤을 포함하는 상피성 난소암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
Publications (2)
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|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020160174375A KR102004593B1 (ko) | 2016-12-20 | 2016-12-20 | 쿠메스트롤을 포함하는 상피성 난소암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
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- 2016-12-20 KR KR1020160174375A patent/KR102004593B1/ko active IP Right Grant
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| Publication number | Publication date |
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