DE69530510T2 - Chinazolinon enthaltende arzneimittel und verfahren zu deren verwendung - Google Patents

Description

• Die voDie vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Chinazolinonen zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Abschwächen einer Mesangialzellproliferation.
• Im US-Patent 3,320,124, das 1967 erteilt wurde, wird ein Verfahren zur Behandlung von Kokzidiose mit Chinazolinonderivaten beschrieben und beansprucht.
• Halofuginon, anders bekannt als 7-Bromo-6-chloro-3-[3-(3-hydroxy-2-piperidinyl)-2-oxopropyl]-4-(3H)-chinazolinon, wurde zuerst in dem genannten Patent der amerikanischen Firma Cyanamid beschrieben und beansprucht, und war die bevorzugte Verbindung, die in diesem Patent offenbart wurde, und dasjenige unter den dort beschriebenen und beanspruchten Derivaten, das kommerzialisiert wurde.
• Nachfolgend betreffen das US-Reissuepatent 26,833 und die US-Patente 4,824,847; 4,855,299; 4,861,758 und 5,215,993 alle die kokzidiozidalen Eigenschaften von Halofuginon, von dem das US-Patent 4,340,596 offenbart, dass es auch zur Bekämpfung von Theileriose verwendet werden kann.
• 1991 veröffentlichte einer der jetzigen Erfinder einen Artikel, in dem berichtet wurde, dass ein verminderte Kollagensynthese als wichtiger ursächlicher Faktor beim Reißen von Haut und einer verminderten Hautstärke von Geflügel erkannt und identifiziert wurde, das mit Halofuginon behandelt wurde, welches in den zur Verwendung als Kokzidiostatikum empfohlenen Menge verabreicht wurde. Es wurde auch herausgefunden, dass auf der zellulären Ebene Halofuginon die Kollagensynthese bei Vogelhaut-Fibroblasten unterdrückt [1. Granot, et al., Poult. Sci., Band 70, Seiten 1559-1563 (1991)].
• Zu dieser Zeit war jedoch aus gutem Grund weder offenbart, erkannt, noch vermutet, dass Halofuginon oder die verwandten Chinazolinonderivate aus dem US-Patent 3,320,124 effektiv zur Behandlung von fibrotischen Krankheiten und für verwandte kosmetische Anwendungen verwendet werden können.
• Klinische Zustände und Krankheiten, die in Verbindung mit primärer oder sekundärer Fibrose stehen, wie systemische Sklerose, Transplantat-Gegen-Empfänger-Reaktion (GVHD), pulmonale und hepatische Fibrose und eine große Vielfalt an Autoimmunkrankheiten, unterscheiden sich durch übermäßige Produktion von Bindegewebe, was zur Zerstörung der normalen Gewebearchitektur und Funktion führt. Diese Krankheiten können am besten hinsichtlich der Störungen der zellulären Funktionen interpretiert werden, wobei eine bedeutende Erscheinungsform davon eine übermäßige Kollagenablagerung ist.
• Es ist allgemein anerkannt, dass die meisten Behandlungen von fibrotischen Erkrankungen gegenwärtig unwirksam sind und wenig Einfluss auf deren unerbittliches pathologisches Fortschreiten haben. Verschiedene Versuche wurden unternommen, um die Kollagenablagerung im extrazellulären Raum zu reduzieren. Wie bekannt ist, zeigen fortschreitende fibro-proliferative Krankheiten eine übermäßige Produktion an Bindegewebe, was zur Zerstörung der normalen Gewebearchitektur und Funktion führt. Die entscheidende Rolle von Kollagen bei der Fibrose hat zu Versuchen geführt, Medikamente zu entwickeln, die dessen Akkumulation inhibieren [K. I. Kivirikko, Annals of Medicine, Band 25, Seiten 113–126 (1993)].
• Solche Medikamente können entweder durch Modulation der Synthese von Prokollagen Polypeptidketten wirken oder einige spezifische posttranslationale Ereignisse inhibieren, was entweder zur verminderten Bildung von extrazellulären Kollagenfasern oder zu einer Akkumulation von Fasern mit veränderten Eigenschaften führt. Trotz der Bedeutung dieses Proteins bei der Aufrechterhaltung der Gewebeintegrität und dessen Beteiligung an verschiedenen Störungen, stehen nur wenige Inhibitoren der Kollagensynthese zur Verfügung.
• Zytotoxische Medikamente wurden in einem Versuch zur Verlangsamung der Proliferation von Kollagen produzierenden Fibroblasten verwendet [J. A. Casas, et al., Ann. Rhem. Dis., Band 46, Seite 763 (1987)], darunter Colchicin, das die Kollagenabscheidung in die extrazelluläre Matrix verlangsamt [D. Kershenobich, et al., N. Engl. J. Med., Band 318, Seite 1709 (1988)] und Inhibitoren von Schlüsselenzymen des Kollagenmetabolismus (K. Karvonen, et al., J. Biol. Chem., Band 265, Seite 8415 (1990) und C. J. Cunliffe, et al., J. Med. Chem., Band 35, Seite 2652 (1992)].
• Leider sind keine dieser Inhibitoren Kollagen-Typ spezifisch. Es gibt auch ernsthafte Bedenken hinsichtlich toxischer Konsequenzen durch eine Beeinträchtigung der Biosynthese anderer lebenswichtiger Kollagenmoleküle, wie Clq im klassischen Aktivierungsweg, Acetylcholinesterase der neuromuskulären Synapse, Konglutinin und pulmonäres Surfactant-Apoprotein.
• Andere Arzneimittel, die die Kollagensynthese inhibieren können, wie Nifedipin und Phenytoin, inhibieren ebenso die Synthese von anderen Proteinen, wobei der Kollagenbiosyntheseweg nicht-spezifisch blockiert wird [T. Salo, et al., J. Oral Pathol. Med., Band 19, Seite 404 (1990)].
• Kollagenvernetzungsinhibitoren, wie β-Aminopropionitril sind auch nicht-spezifisch, obwohl sie als nützliche antifibrotische Mittel dienen können. Deren anhaltende Verwendung verursacht das lathritische Syndrom und beeinflusst die Elastogenese störend, da Elastin, ein anderes faseriges Bindegewebsprotein, ebenfalls vernetzt ist. Zusätzlich ist der Kollagenvernetzungs-inhibierende Effekt sekundär und die Kollagenüberproduktion hat dessen Abbau durch Kollagenase voranzugehen.
• In der kürzlich eingereichten, ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 08/181,066 wird ein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen Patienten, der unter einem fibrotischen Zustand leidet, beschrieben und beansprucht, umfassend die Verabreichung einer Zusammensetzung an den Patienten, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge einer pharmazeutisch aktiven Verbindung der Formel I:

  

  worin:
  R₁ ein Bestandteil aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Halogen, Nitro, Benzo, Niederalkyl, Phenyl und Niederalkoxy ist;
  R₂ ein Bestandteil aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxy, Acetoxy und Niederalkoxy ist; und
  R₃ ein Bestandteil aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und Niederalkenoxycarbonyl ist; wirksam um die Kollagen-Typ I Synthese zu inhibieren.
• Nach weiterer Forschung und Entwicklung wurde nun entdeckt, dass Halofuginon zum Abschwächen einer Mesangialzellprofileration verwendet werden kann. Es wird daher geglaubt, dass andere Chinazolinonderivate, die in US-Patent 3,320,124 beschrieben und beansprucht sind, deren Lehren hiermit durch Verweis eingeschlossen sind, ähnliche Eigenschaften aufweisen.
• Folglich wird entsprechend der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer Verbindung der Formel I zur Verfügung gestellt:

  

  worin: n = 1 oder 2;
  R₁ ein Bestandteil aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halogen, Nitro, Benzo, Niederalkyl, Phenyl und Niederalkoxy ist;
  R₂ ein Bestandteil aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Acetoxy und Niederalkoxy ist; und
  R₃ ein Bestandteil aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und Niederalkenoxylcarbonyl ist;
  oder eines physiologisch annehmbaren Salzes davon; für die Herstellung einer Zusammensetzung zum Abschwächen einer Mesangialzellprofileration.
• In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist diese Verbindung Halofuginon.
• In der US-Patentanmeldung Nr. 08,181,066 wird ausdrücklich gezeigt und bewiesen, dass die genannten Verbindungen der vorliegenden Erfindung in der Behandlung von fibrotischen Zuständen, wie Sklerodermie und Transplantat-Gegen-Empfänger-Reaktion wirksam sind. Eine solche Ausführung beugt jeglicher grundloser Spekulation vor, dass die Verbindung vor der Erzeugung einer Wirkung inaktiviert werden kann; dass die Verbindung das Zielgebiet nicht erreichen kann, oder dass andere funktionelle Eigenschaften die Verbindung ungeeignet zur in vivo Verwendung machen. Diesen Möglichkeiten wird jedoch durch die alleinige Tatsache völlig widersprochen, dass gezeigt wurde, dass die identischen Verbindungen in der Behandlung von zwei spezifischen fibrotischen Zuständen, die mit einer exzessiven Kollagenablagerung in Verbindung stehen, d. h. Sklerodermie und GVHD wirksam sind; daher sind die Lehren der genannten US-Patentanmeldung hiermit durch Verweisung eingeschlossen.
• Bezugnehmend nun auf die neue Entdeckung der vorliegenden Erfindung ist die fokale. und segmentale Glomerulosklerose (FSGS) die histologische Beschreibung einer Form von glomerulärer Verletzung, die üblicherweise mit Proteinuria und dem fortschreitenden Verlust der Nierenfunktion in Verbindung steht [siehe z. B. H. G. Rennke und P. S. Klein, "Pathogenesis and Significance of Nonprimary Focal and Segmental Glomerulosclerosis," Am. J. Kid. Dis., Band 13, Seiten 443–446 (1989)].
• Ursprünglich wurde FSGS bei nephrotischen Patienten beschrieben, die an Nierenversagen im Endstadium gestorben waren. In den letzten Jahren wurde FSGS als ein letzter gemeinsamer Weg im Glomerulus bei einer Anzahl von humanen systemischen und renalen Erkrankungen identifiziert. Diese beinhalten Prozesse wie die normale Alterung und die diabetische Nephropathie. Die pathologische Läsion von FSGS kann aus einer Vielfalt von dem Anschein nach unverwandten schädlichen Reizen resultieren, was durch die mesangiale Expansion und Glomerulosklerose lange nach der Beendigung der anfänglichen Verletzung zum Nierentod führt. Die Läsion von FSGS ist auch entscheidend in dem Tiermodell, das am häufigsten zur Untersuchung des Fortschreitens der Nierenerkrankung verwendet wird – im renalen Ablationsmodell.
• Die Läsion von FSGS zeigt viele Ähnlichkeiten zum fortschreiten der Atherosklerose [siehe z. B., J. R. Diamond und M. J. Karnovsky, "Focal and Segmental Glomerulosclerosis: Analogies to Atherosclerosis," Kid. Int., Band 33, Seiten 917–924 (1988)]. In beiden sind die teilnehmenden Zellen vaskuläre Endothelzellen und die darunter liegenden glatten Gefäßmuskelzellen (VSMC) oder deren renaler Gegenpart: Die Mesangialzellen. Die letzteren Zelltypen sind nahe verwandt hinsichtlich Ursprung, mikroskopischer Anatomie und histochemischen Eigenschaften. Zusätzlich teilen sich diese Zellen funktionelle Eigenschaften, einschließlich der Angiotensin II Rezeptoren; Kalzium-abhängige kontraktile Antwort auf mehrere Mediatoren, und eine proliferative Antwort auf Blutblättchen- und Makrophagen-abgeleitete Produkte. Das Fortschreiten von sowohl renaler als auch vaskulärer Sklerose wird beeinflusst durch Hypertonie und vaskulären Stress, Hyperlipedämie, und die Aktivierung der Koagulationkaskade; wie unter anderem von M. Kashgarian und R. B. Sterzel, "The Pathobiology of the Mesangium," Am J. Kid. Dis., Band 41, Seiten 524–529 (1992), beschrieben.
• Wie oben festgestellt, wurde nun entdeckt, dass Halofuginon ein wirksamer Inhibitor der humanen Mesangialzellproliferation ist, wie hier weiter unten beschrieben werden wird.
• Wie bekannt ist, bildet das Mesangium den axialen Raum des Glomerulus. Es besteht aus Mesangialzellen – der dritten Art der glomerulären Zellpopulation (wobei die anderen Endothel- und Epithelzellen sind), und aus der mesangialen Matrix. Die Mesangialzelle ist an einer prekären Position lokalisiert, wobei sie sich mit dem glomerulären Kapillarlumen über das mit Löchern versehene Endothel in Kontakt befindet. Das Mesangium ist somit ständig von Makromolekülen und Filtrationsrückständen perfundiert. Diese Rückstände können eine Entzündung verursachende (phlogenic) Immunkomplexe oder zirkulierende Zytokine umfassen, die die Mesangialzellen aktivieren können, zu proliferieren und ihren sekretorischen Phenotyp hinsichtlich ihrer Produktion von Matrix zu ändern. Eine mesangiale Proliferation mit Expansion der mesangialen extrazellulären Matrix schreitet entweder voran oder begleitet den Prozess der glomerulären Sklerose [siehe z. B., A. El. Nahas Meguid, "Growth Factors and Glomerular Sclerosis," Kid. Int., Band 41, Seiten S15–S20 (1992); J. Floege, et al., "Regulation of Mesangial Cell Proliferation," Am. J. Kid. Dis., Band 17, Seiten 673–676 (1991)].
• Zusätzlich ist die Proliferation von Mesangialzellen und/oder eine Mesangialmatrixexpansion ein hauptsächliches Merkmal von Krankheiten wie Lupus Nephritis, IgA Nephropathie; Hennoch-Schoenlein Purpura undMembrano-proliferativer Glomerulonephtritis. Von dem Potential eine Mesangzellproliferation abzuschwächen wird daher erwartet, dass es das Fortschreiten einer Nierenerkrankung bis zum Endstadium verhindert, das im Zusammenhang mit der histopathologischen Läsion einer fokalen segmentalen FSGF auftritt. Darüber hinaus kann es als therapeutisches Hilfsmittel bei der Behandlung der oben erwähnten Nierenerkrankungen, die durch mesangiale Expansion charakterisiert sind, angewandt werden. Die Pathogenese von FSGS beinhaltet die abnormale Proliferation von Mesangialzellen (MC), die in die extrazelluläre Matrix (ECM) eingebettet sind (siehe H. G. Rennke, et al., ebd.; J. R. Diamond, et al., ebd.).
• Unter physiologischen Bedingungen bleibt die Mehrzahl der renalen MCs in der G_o Phase und wird das Zellwachstum kontrolliert durch ein Gleichgewicht zwischen endogenen wachstumsfördernden Faktoren und proliferationsinhibierenden Molekülen. Als Antwort auf schädliche Reize werden Blutblättchen- und nicht-Blutblättchenabgeleitete Wachstumsfaktoren und Zytokine freigesetzt und diese stimulieren die MC-Proliferation. Unter diesen Wachstumsfaktoren sind der Blutblättchen-abgeleitete Wachstumsfaktor (PDGF), der basische Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) und Interleukin-1 (IL-1 ). Moleküle, die die wachstumsfördernde Aktivität dieser Wachstumsfaktoren störend beeinflussen, können das Fortschreiten der Glomerulosklerose abschwächen. Unter diesen sind Arten von Heparin [siehe J. Floege, et al., "Heparin Supresses Mesangial Cell Proliferation and Matrix Expansion in Experimental Mesangioproliferative Glomerulonephritis," Kid. Int., Band 43, Seiten 369– 380 (1993); A. Wolthuis, et al., "Heparins Modulate Extracellular Matrix and Protein Synthesis in Rat Mesanglial Cells, Virchows Arch B, Cell Pathol., Band 63, Seiten 181– 189 (1993)] und höchstwahrscheinlich Heparansulfat [siehe A. Schmidt, et al., "The Antiproliferative Activity of Arterial Heparan Sulfate Resides in Domains Enriched with 2-O-Sulfated Uronic Acid Residues," J. Biol. Chem., Band 267, Seiten 19242–19247 (1992)] und andere polyanionische Moleküle [siehe M. Benzera, et al., "Antiproliferativie Activity to Vascular Smooth Muscle Cells and Receptor Binding of Heparin-Mimicking Polyaromatic Anionic Compounds," Arterioscler. Thromb., Band 14 (Dezember 1994), in Druck; F. Pugliese, et al., "Regualtion of Cultured Human Mesanglial Cell Growth by Ionized Macromolecules," J. Am. Soc. Nephrol., Band 2, Seiten 595–599 (1992)].
• Die Erfindung wird nun in Verbindung mit bestimmten bevorzugten Ausführungsformen in den folgenden Beispielen beschrieben, so dass Aspekte davon vollständiger verstanden und vahrgenommen werden können. Somit dienen die folgenden Beispiele, die bevorzugte Ausführungsformen beinhalten, der Illustration der Praxis dieser Erfindung, wobei zu verstehen ist, dass die Besonderheiten lediglich beispielhaft und zum Zweck der illustrativen Diskussion von bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gezeigt sind und dargestellt sind, um zur Verfügung zu stellen, was für die nützlichste und leicht verstandene Beschreibung von Formulierungsverfahren, sowie von Prinzipien und konzeptionellen Aspekten der Erfindung gehalten wird.
• Die Ergebnisse der durchgeführten Experimente werden unten unter Verweis auf die beigefügten Figuren beschrieben.
• In den Zeichnungen:
• 1 ist eine charakteristische Kurve, die die inhibierende Wirkung von steigenden Konzentrationen von Halofuginon auf die Mesangialzellproliferation zeigt;
• 2 ist eine charakteristische Kurve, die die antiproliferative Wirkung von Halofuginon auf Mesangialzellen als Funktion der Konzentration (10–75 ng/ml) und Tagen in Kultur zeigt, 2A zeigt die Wirkung von am Tag 1 zugefügtem Halofuginon und 2B zeigt die Wirkung von sowohl an Tag 1 als auch an Tag 4 zugefügtem Halofuginon;
• 3 ist eine charakteristische Kurve, die die Umkehrung der antiproliferativen Wirkung von 0,05 μg/ml Halofuginon auf glomeruläre Mesangialzellen zeigt; und
• 4 ist eine charakteristische Kurve, die die Wirkung von steigenden Konzentrationen an Halofuginon und Heparin auf die Zellanzahl (4A) und Wachstumsrate (4B) von glomerulären Mesangialzellen vergleicht.
• Beispiele
• I. Experimentelle Verfahren
• Zellen
• Primäre Kulturen von Mesangialzellen wurden aus isolierten Rattenglomeruli erhalten, wie früher beschrieben [siehe A. Amore, et al., "Functional Consequences of the Binding of Gliadin to Cultured Raf Mesangial Cells: Bridging Immunoglobin A to Cells and Modulation of Eicosanoid Synthesis and Altered Cytokine Production," Am. J. Kid. Dis., Band 23, Seiten 290–301 (1994)].
• In Kürze, die renalen Cortices aus Rattennieren wurden aus der Medulla und Kapsel seziert, zu einer Paste zerkleinert, behutsam durch ein 106-mm Stahlsieb gepresst und schließlich in PBS suspendiert. Glomeruli wurden aus dieser Suspension durch fortlaufendes Sieben durch Nylonsiebe isoliert. Die gewaschenen Glomeruli wurden in RPMI resuspendiert und mit Typ IV Kollagenase für 5 Minuten bei 37°C digeriert, um die Epithelzellen zu entfernen. Nach der Resuspension wurden die Glomeruli auf Plastikkulturschalen ausplattiert. Die Zellen wurden bei naher Konfluenz subkultiviert. Experimente wurden an den Zellen nach der dritten bis vierten Subkultur durchgeführt.
• Eine glomeruläre Mesangialzelllinie (SV40 MES 13) wurde von der ATCC erhalten. Das Kulturmedium war aus einer 3 : 1 Mischung von Dulbecco's modifizierten Eagle's Medium und Ham's F-12 Medium, angereichert mit 5% fetalem Rinderserum, und 14 mM HEPES, zusammengesetzt.
• Die SV40 MES 13 Zelllinie wurde 1986 aus einer 7 bis 10 Wochen alten transgenen C57B1/6J X SJUJ Maus für die frühe Region des Simianvirus 40 (SV40) etabliert. Glomeruläre Mesangialzellen wurden isoliert, trypsiniert und geklont.
• Diese Mesangialzellen zeigen eine markante zytoskelettale Färbung für Actin mit reichlich vorhandenen parallelen Fibrillen überall im Zytoplasma und ziehen sich in Gegenwart von 10^-6 M Angiotensin II zusammen. Sie haben eine berichtete Verdopplungszeit von 26 h in 5% fetalem Rinderserum und sind fähig, Kolonien in Weichagar zu bilden. Die Zellen scheinen eine unbegrenzte Lebensdauer in Kultur zu haben und färben für großes T-Antigen. Die Zelllinie ist Zytokeratin- und Faktor VIIIbezogen Antigen-negativ. Trotz ihres transformierten Phänotyps behält die SV40 MES 13-Zelllinie Merkmale normaler glomerulärer Mesangialzellen und sind nützlich zur Untersuchung von glomerulärer Zellbiologie [siehe L. J. Striker, et al., "Glomerular Epithelial, Mesanglial and Endothelial Cell Lines from Transgenic Mice," Kid. Int., Band 33, Seiten 677–-684 (1988)].
• Zellproliferation
• A. ³H-Thymidin-Inkoraoration
• Zellen wurden in DMEM, das mit 10% FCS angereichert war, plattiert (4 × 10⁴ Zellen/16 mm Well). Vierundzwanzig Stunden nach dem Aussäen wurde das Medium durch ein Medium ersetzt, das 0,2% FCS enthielt, und 48 h später wurden die Zellen Wachstumsstimulantien und ³H-Thymidin (1 Ci/Well) für weitere 24–48 h ausgesetzt. Die DNA-Synthese wurde durch Messung der in Trichloressigsäure-unlöslichem Material inkorporierten Radioaktivität untersucht [siehe M. Benezra, et al., "Thrombin-Induced Release of Active Basic Fibroblast Groth Factor-Heparan Sulfate Complexes from Subendothelial Extracellular Matrix," Blood., Band 81, Seiten 3324–3332 (1993)]:
• B. Wachstumsrate
• Zellen (1.5 × 10⁴ Zellen/Well) wurden in 24-Well Kulturplatten ausgesät und wie oben beschrieben Wachstumsstimulantien ausgesetzt. Ein bis sechs Tage nach dem Aussäen wurden die Zellen mit 2.5% Formaldehyd in PBS fixiert. Die Platten wurden in ein Bad aus 0,1 M Borat-Puffer (pH 8.5) eingetaucht, gefärbt (1 h, 24 °C) mit Methylenblau (1% in 0,1 M Borat-Puffer, pH 8.5) und viermal in Wasser gewaschen. Dieses Verfahren entfernte praktisch alles nicht-Zellen-gebundene Färbemittel.
• Spezifisches zell-inkorporiertes Methylenblau wurde mit 0,5 ml von 0,1 N HCl (1 h, 25°C) aufgelöst und durch Messung der dekadischen Extinktion bei 620 nm⁹ bestimmt. Die durch Zell-Zählung bestimmte Zellzahl korrelierte mit der spektrophotometrischen dekadischen Extinktion [siehe R. Glodman und Z. Bar-Shavit, "Dual Effect of Normal and Stimulated Macrophages and Their Conditioned Media on Target Cell Proliferation," J. Natl. Cancer Inst., Band 63, Seiten 1004–1016 (1979)].
• Die anfängliche Zell-Plattierungsdichte wurde so gewählt, dass ein lineares Verhältnis zwischen Zellzahl und dekadischer Extinktion am Ende des Experiments sichergestellt war. Bei jedem Experiment wurden 3 Wells zur Bestimmung der anfänglichen durchschnittlichen dekadischen Extinktion vor Zugabe der Testverbindung festgelegt. Dieser Wert wurde unter Verwendung der folgenden Gleichung zur Berechnung der Verdopplungszeit (DT) der Kontrolle und die Medikament-behandelten Zellen verwendet:
  DT = In 2 / IN [OD_t/_cOD_c) /h] worin:
  DT = Verdopplungszeit in Stunden;
  OD_t = optische Dichte des Test-Wells am Ende des Experiments;
  OD_c = optische Dichte des Kontroll-Wells am Anfang des Experiments;
  h = Dauer der Inkubation in Stunden.
• Die Wachstumsrate wurde durch Teilung der Verdopplungszeit von Medikamentbehandelten Zellen durch diejenige der Kontrollzellen berechnet [A. Horowitz, et al., "In Vitro Cytotoxicity of Liposome-Encapsulated Doxorubicin: Dependence of Liposome Composition and Drug Release," Biochim. Biophys. Acta., Band 1109, Seiten 203–209 (1992)].
• C. Zeltzahl
• Zellen wurden mit einer Dichte von 5 × 10³ Zellen/Well auf einer 24-Well-Platte ausgesät. Zu unterschiedlichen Zeiten nach dem Aussäen wurden die Zellen mit 0,05% Trypsin, 0.01 M Natriumphosphat (pH 7.4) and 0.02% EDTA (STV) getrennt, und in einem Coulter-Zähler gezählt (Coulter Electronic Ltd.).
• II. Zellproliferation
• Antiproliferative Wirkung von Halofuginon auf glomeruläre Mesangialzellen
• A. Wachstumsrate
• Spärlich ausgesäte (1.5 × 10° Zellen/Well) glomeruläre MC wurden 10% FCS in Abwesenheit und Anwesenheit von steigenden Konzentrationen Halofuginon ausgesetzt. Fünf Tage nach dem Aussäen wurden die Zellen mit STV getrennt und gezählt. Wie in 1 gezeigt, wurde eine 60–70%ige Inhibierung der MC-Proliferation bei 25 ng/ml, mit einer fast vollstandigen Inhibierung bei 50 ng/ml erzielt. In einem ähnlichen Experiment wurden die Zellen in Abwesenheit und Anwesenheit von steigenden Konzentrationen an Halofuginon mit STV getrennt und an verschiedenen Tagen nach dem Aussäen gezählt. Eine vollständige Inhibierung der Zellproliferation wurde bei 75 ng/ml Halofuginon erzielt (2A). Eine stärkere antiproliferative Wirkung wurde beobachtet, wenn Halofuginon zweimal zugegeben wurde, an Tag 1 und Tag 4. Dieser Effekt wurde am besten bei niedrigen Konzentrationen des Medikaments gezeigt (2B).
• B. Reversibilität
• In einem anderen Experiment wurden MC Halofuginon für 48 h ausgesetzt, gefolgt von einer Entfernung des Medikaments und anschließendem Wachstum in regulärem Wachstumsmedium. Wie in 3 gezeigt, resultiert die Entfernung des Medikaments im Gewinn einer beschleunigten Wachstumsrate, ähnlich der von unbehandeltem MC. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn die Zellen mit einer niedrigen Dichte (500 und 1000 Zellen/Well) ausgesät wurden und deren Wachstumsrate in Abwesenheit und Anwesenheit von Halofuginon nach Färbung mit Methylenblau unter Verwendung der im experimentellen Verfahren beschriebenen Gleichung bestimmt wurde. Eine fast vollständige Inhibierung des Wachstums wurde in Anwesenheit von 75 μg/ml Halofuginon erzielt (4). Unter denselben Bedingungen wurde keine Wirkung von Heparin festgestellt (4).
• C. ³H-Thymidin-Inkoraoration
• Subkonfluente glomeruläre MC wurden in einem 10% FCS enthaltendem Medium gehalten und ³H-Thymidin in Abwesenheit und Anwesenheit von steigenden Konzentrationen Halofuginon ausgesetzt (48 h, 37°C). Eine vollständige Inhibierung der DNA-Synthese wurde bei 0,035 μg/ml Halofuginon beobachtet, wohingegen eine 50 %ige Inhibierung bei einer so niedrigen Konzentration wie 0,025 μg/ml (nicht gezeigt) erhalten wurde.
• D. Wirkung auf bFGF-induzierte Zellaroliferation
• Ruhige, Wachstums-gebremste glomeruläre MC wurden in einem 0,5% FCS enthaltendem Medium gehalten (48 h) und durch niedrige Konzentrationen von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) zur Proliferation stimuliert. Eine Exposition gegenüber Halofuginon (0,050 μg/ml) resultierte in einer fast vollständigen Inhibierung von bFGF-stimulierter Thymidin-Inkorporation in Wachstums-gebremsten MC (nicht gezeigt). Dieses Ergebnis legt nahe, dass Halofuginon der Wachstums-fördernden-Wirkung von bFGF wirksam entgegenwirkt.
• E. Wirkung anderer Verbindungen
• Von Heparin wurde berichtet, dass es eine antiproliferative Wirkung auf glomeruläre MC ausübt [siehe J. Floege, et al., ebd.; A. Wolthius, et al., ebd.]. In unseren Experimenten gab es wenig oder keine inhibierende Wirkung von Heparin bis zu einer Konzentration von 15 μg/ml, und etwa 25% Inhibierung bei 50 μg/ml Heparin. Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, ungeachtet ob die Zellzahl (4A) oder die Wachstumsrate (4B) bestimmt wurden.
• III Vorteile gegenüber aktuellen Ansätzen
• Aktuelle Ansätze, die Proliferation von glomerulären MC zu inhibieren, verwenden Heparin [siehe Floege, et al., ebd.], niedrig-Mr Heparin, Suramin [siehe Pugliese, et al., ebd., Calciumkanal-Blocker [d. h., Amlodipine; siehe P. J. Shultz und L. Raij, "Effect of Amlodipine on Mesanglial Cell Proliferation and Protein Synthesis," Am. J. Hypertens., Band 5, Seiten 912–914 (1992)] und Inhibitoren der Chlolesterinsynthese [siehe M. P. O'Donnell, et al., "Lovastatin Retards the Progression of Established Glomerular Disease in Obese Zucker Rats," Am. J. Kid. Dis., Band 22, Seiten 83–89 (1993)]. Heparin ist ein wirksames Antikoagulans und seine antiproliferative Wirkung ist relativ gering und größeren Schwankungen unterworfen, abhängig von der Quelle und der herstellenden Firma. Suramin ist hochtoxisch bei der wirksamen Dosis, wohingegen Amlodip'in und Lovastatin in vitro eine relativ kleine Wirkung zeigen und darin versagen, den fortschreitenden Verlauf einer renalen Erkrankung bei Menschen zu ändern.
• Der Ansatz der vorliegenden Erfindung verwendet eine hochwirksame, preiswerte und nicht-toxische Verbindung, die die Aktivität von verschiedenen Wachstumsfaktoren, einschließlich bFGF, inhibiert, und das autokrine Wachstum von glomerulären MC inhibiert. Weiterhin ist Halofuginon eine Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht, die aller Wahrscheinlichkeit nach oral verabreicht werden kann. Die Verbindung wurde von der FDA zur Verwendung bei der Behandlung von Nutztieren zugelassen. Diese Charaktenstika machen Halofuginon zum meistverspechendsten, klinisch verwendbaren Medikament zur Inhibierung des Fortschreitens einer renalen Erkrankung.
• Von der Verwendung von Halofuginon als nicht-toxischer Verbindung, die die glomeruläre MC-Proliferation wirksam inhibiert, wird erwartet, dass sie eine wirksame Stategie zur Inhibierung der Pathophysiologie von fokaler segmentaler Glomerulosklerose und anderen Nierenerkrankungen zur Verfügung stellt, wo eine mesangiale Expansion eine Schlüsselrolle spielt.
• Es wird für Fachleute offensichtlich sein, dass die Erfindung nicht auf die Details der vorangegangenen erläuternden Beispiele beschränkt ist ist.

Claims (3)

1. Verwendung einer Verbindung der Formel I:

   

   worin: n = 1 oder 2; R₁ ein Bestandteil aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halogen, Nitro; Benzo, Niederalkyl, Phenyl und Niederalkoxy ist; R₂ ein Bestandteil aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Acetoxy und Niederalkoxy ist; und R₃ ein Bestandteil aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und Niederalkenoyl-carbonyl ist; oder eines physiologisch annehmbaren Salzes davon; für die Herstellung einer Zusammensetzung zum Abschwächen einer Mesangialzellproliferation.
2. Verwendung. nach Anspruch 1, wobei Halofuginon für die Herstellung der Zusammensetzung verwendet wird.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung für die Abschwächung der Mesangialzellproliferation bei Menschen bestimmt ist, die an Mesangialzellproliferation leiden.