JP3808505B2 - キナゾリノンを含有する医薬組成物およびそれの利用方法 - Google Patents
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Description
本発明はキナゾリノンを含有する組成物に関する。より詳しくは、本発明は、活性成分として本明細書中に定義されるようなキナゾリノン誘導体を含んで成る、メサンギウム細胞の増殖を抑制するための組成物に関する。
1967年に発行された米国特許第3,320,124号には、キナゾリノン誘導体でコクシジウム症を治療する方法が記載されクレイムされている。
別称７−ブロモ−６−クロロ−３−〔３−（３−ヒドロキシ−２−ピペリジニル）−２−オキソプロピル〕−４（３Ｈ）−キナゾリノンとしても知られるハロフギノンは、American Cyanamid Companyにより前記特許明細書中に最初に記載されそしてクレイムされた化合物であり、前記特許明細書によると好ましい化合物であり、明細書中に記載されクレイムされた誘導体の中から市販された唯一のものであった。
その後、米国再発行特許第26,833号並びに米国特許第4,824,847号、同第4,855,299号、同第4,861,758号および同第5,215,993号は全てハロフギノンの殺コクシジウム性質に関し、前記米国特許第4,340,596号はそれがタイレリア症を無くすのにも利用できると教示している。
1991年に、本発明者らの１人は、コラーゲン合成の減少が、コクシジウム抑制剤としての使用に推奨される量で投与したハロフギノンによって治療した家禽に皮膚断裂や皮膚強度の低下を引き起こす重要な原因であると注目し同定したことを報告する文献を発表した。細胞レベルでは、ハロフギノンはトリ皮膚繊維芽細胞によるコラーゲン合成を抑制することもわかった〔I. Granot他, Poult. Sci., 第70巻, 第1559〜1563頁（1991）〕。
しかしながら、その時点では、米国特許第3,320,124号に開示されたハロフギノンや関連のキナゾリノン誘導体が繊維症の治療におよび関連の化粧用途に並びに正当な理由に効果的に利用できることは教示されていなかったし、認識されていなかったし、疑われてもいなかった。
一次および二次繊維症、例えば全身性繊維症、対宿主性移植片病（GVHD）、肺および肝繊維症並びに多種多様な自己免疫疾患に関連する様々な臨床状態および障害が、正常組織の構造と機能の破壊をもたらす結合組織の過剰生産により識別される。それらの病気は、主な徴候が過剰なコラーゲン沈着である細胞機能の混乱の点からが一番よく判断することができる。
現在、繊維症性疾患の大部分の治療は効果がなく、それらの容赦ない病気進行に対してほとんど効果がない。細胞外間隙中へのコラーゲン沈着を減らすために様々な試みがなされている。承知の通り、進行性繊維増殖症は結合組織の過剰生産を表し、それが正常組織の構造と機能の破壊を引き起こす。繊維症におけるコラーゲンの重要な役割は、それの蓄積を抑制する薬剤を開発する試みを思いつかせた〔K.I. Kivirikko, Annals of Medicine, 第25巻, 113〜126頁（1993）〕。
そのような薬剤は、プロコラーゲンポリペプチド鎖の合金を活性調節することにより作用することができ、またはある特定の翻訳後現象を抑制することができ、それが細胞外コラーゲン繊維の形成の減少かまたは改変した性質を有する繊維の蓄積のいずれかをもたらすだろう。組織の完全性の維持と様々な疾患におけるコラーゲンの関与という点からのこのタンパク質の重要性にもかかわらず、コラーゲン合成の阻害剤は数種類しか入手できない。
コラーゲン産生繊維芽細胞の増殖を遅らせる試みにおいて細胞毒性薬〔J.A. Casas他, Ann. Phem. Dis.,第46巻, 763頁（1987）〕、中でも細胞外基質中へのコラーゲンの分泌を遅くするコルチシン〔D. Kershenobich他, N. Engl. J. Med., 第318巻, 1709頁（1988）〕および重要なコラーゲン代謝酵素の阻害剤〔K. Karvonen他, J. Biol. Chem., 第265巻, 8415頁（1990）；C.J. Cunliffe他, J. Med. Chem.,第35巻, 2652頁（1992）〕が使われている。
不運にも、それらの阻害剤は１つもコラーゲン型特異的でない。また、他の極めて重要なコラーゲン形成分子、例えば古典的補体経路のClq、神経筋の接合終板のアセチルコリンエステラーゼ、コングルチニンおよび肺胞界面活性物質アポ蛋白の生合成を妨害するという毒性結果について深刻な心配がある。
コラーゲン生合成を阻害することのできる他の薬剤、例えばニフェジピンおよびフェニトインは、別のタンパク質の合成も阻害し、従ってコラーゲン生合成経路を非特異的に遮断する〔T. Salo他, J. Oral Pathol. Med.,第19巻, 404頁（1990）〕。
β−アミノプロピオニトリルのようなコラーゲン架橋阻害剤は有用な抗繊維症剤として働くことができるけれども、それらも非特異的である。それを長期使用するとラチリスム性（lathritic）症候群を引き起こし、弾性繊維形成を妨害する。というのは、別の繊維状結合組織タンパク質であるエラスチンも架橋されてしまうからである。加えて、コラーゲン架橋阻害効果は二次的であり、コラーゲン過剰生産はコラーゲナーゼによるそれの分解より優るに違いない。
最近提出された米国特許出願第08/181,066号は、繊維症状態を有するヒト患者の治療方法であって、コラーゲンＩ型の合成を阻害するのに有効な式Ｉ：
（上式中
ｎは１または２であり；
Ｒ1は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニルおよび低級アルコキシから成る群より選ばれた基であり、
Ｒ2はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシから成る群より選ばれた基であり、そして
Ｒ3は水素および低級アルケンオキシ−カルボニルから成る群より選ばれた基である）
の医薬活性化合物の医薬上有効な量を含んで成る組成物を患者に投与することを含んで成る方法を記載しクレイムしている。
更なる研究と開発の後、ハロフギノンがメサンギウム細胞増殖を抑制するのに利用できることをたった今発見した。従って、米国特許出願第3,320,124号（その開示は参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されクレイムされた他のキナゾリノン誘導体も同様な性質を有すると思われる。
よって、本発明によれば、メサンギウム細胞の増殖を抑制するための組成物であって、メサンギウム細胞の増殖を抑制するのに有効な量の式Ｉの化合物：
（上式中、
ｎは１または２であり、
Ｒ1は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニルおよび低級アルコキシから成る群より選ばれた基であり、
Ｒ2はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシから成る群より選ばれた基であり、そして
Ｒ3は水素および低級アルケンオキシ−カルボニルから成る群より選ばれた基である）
または生理学的に許容されるその塩を含んで成る組成物が提供される。
本発明はまた、メサンギウム細胞増殖を有するヒト患者の治療方法であって、メサンギウム細胞増殖を抑制するのに有効な医薬有効量の式Ｉの医薬活性化合物：
（上式中、
Ｒ1は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニルおよび低級アルコキシから成る群より選ばれた基であり、
Ｒ2はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシから成る群より選ばれた基であり、そして
Ｒ3は水素および低級アルケンオキシ−カルボニルから成る群より選ばれた基である）
または生理学的に許容されるその塩を含んで成る組成物を前記患者に投与することを含んで成る方法も提供する。
本発明の好ましい態様では、前記化合物がハロフギノンである。
米国特許出願第08,181,066号では、本発明の前記化合物が強皮症や対宿主性移植片病のような繊維症状態の治療に有効であることを明白に示しそして証明している。そのような説明は、該化合物が効果をもたらす前に不活性化されるかもしれない；該化合物が標的部位に到達しないかもしれない；または他の機能的性質が該化合物を生体内利用に不適当にするかもしれない、という根拠のない憶測を取り除く。しかしながら、それらの可能性は、この同一化合物が過剰なコラーゲン沈着に関連する２つの特定の繊維症状態、即ち強皮症とGVHD、の治療に有効であることが証明されたという正にこの事実によって完全に否定される。従って、前記米国特許出願の開示は参考として本明細書中に組み込まれる。
ここで本発明の新発見について説明すると、単状分節状糸球体硬化症（FSGS）は、一般に蛋白尿と進行性腎機能低下に関連づけられる糸球体損傷の一形態の組織学的説明である〔H.G. RennkeおよびP.S. Klein,“Pathogenesis and Significance of Nonprimary Focal and Segmental Glomerulosclerosis,”Am. J. Kid. Dis., 第13巻, 443〜446頁（1989）〕。
最初、FSGSは末期の腎不全で死亡したネフローゼ患者について評された。近年では、FSGSは多数のヒト全身および腎疾患における糸球体の最終共通経路であると見なされている。それらは正常な老化と糖尿病性腎症のような過程を含む。FSGSの病変は様々な見かけ上無関係の有害刺激から端を発し、メサンギウムの肥大と糸球体硬化から、初期損傷の終了のずっと後の腎活動停止までに至り得る。FSGSの病変は、腎臓病の進行を研究するのに最もよく使われている動物モデル−腎剥離モデル−においても重要である。
FSGS病変はアテローム硬化症の過程と多くの類似性を示す〔例えば、J.R. DiamondおよびM.J. Karnovsky,“Focal and Segmental Glomerulosclerosis:Analogies to Atherosclerosis,”Kid. Int.,第33巻, 917〜924頁（1988）を参照のこと〕。両者とも、関与細胞が血管内皮細胞、その下にある血管平滑筋細胞（VSMC）またはそれらの腎相当物のメサンギウム細胞である。後者の２つの細胞型は起源、顕微解剖学および組織化学的特徴の面で密接に関連している。更に、それらの細胞は、アンギオテンシンII受容体、幾つかの媒介物質に対するカルシウム依存性収縮性応答、並びに血小板およびマクロファージ由来生成物に対する増殖性応答を包含する機能特性を共有している。腎硬化症と血管硬化症の進行は共に、特にM. KashgarianおよびR.B. Sterzel,“The Pathobiology of the Mesangium,”Am. J. Kid. Dis., 第41巻, 524〜529頁（1992）により記載された通り、高血圧と血管ストレス、高脂質血、凝固カスケードの活性化により影響を受ける。
上述したように、そして下記に更に説明するように、ハロフギノンがヒトメサンギウム細胞増殖の有力な阻害剤であることをたった今発見した。
承知の通り、メサンギウムは糸球体の軸上間質を形成している。それは糸球体細胞集団の第三種（その他は内皮細胞と上皮細胞である）であるメサンギウム細胞とメサンギウム基質とから成る。メサンギウム細胞は不安定な場所に位置し、有窓性内皮を経由して糸球体の毛細血管内腔と接触している。従ってメサンギウム高分子や濾過残渣により常に灌流される。それらの残渣は、メサンギウム細胞を活性化して増殖させ且つ基質生産に関する該細胞の分泌表現型を変更することができる免疫複合体や循環性サイトカインを含むことがある。メサンギウムの細胞外基質の肥大を伴うメサンギウム増生は、糸球体硬化症過程に先行するかまたはそれと付随して起こる〔例えば、A. El Nahas Meguid, “Growth Factors and Glomerular Sclerosis,”Kid. Int., 第41巻. S15-S20頁（1992）；J. Floege他, “Regulation of Mesangial Cell Proliferation,”Am. J. Kid. Dis., 第17巻, 673〜676頁（1991）を参照のこと〕。
加えて、メサンギウム細胞の増殖および／またはメサンギウム基質肥大は、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病および膜性増殖性糸球体腎炎のような病気の基本的な特徴である。従って、メサンギウム細胞の増殖を抑制する能力は、単状分節状糸球体腎炎の組織病理学的病変の状況下で起こる末期腎臓病への進行を防ぐと期待される。更に、それはメサンギウム肥大により特徴づけられる上述の腎臓病の治療において治療手段として用いることができる。FSGSの病因は、細胞外基質（ＥＣＭ）中に埋まったメサンギウム細胞（ＭＣ）の異常増殖が関係する〔例えば、H.G. Rennke他，同一文献；J.R. Diamond他，同一文献を参照のこと〕。
生理的条件下では、腎性ＭＣの大部分はＧo期のままであり、細胞増殖は内因性の増殖促進因子と増殖抑制分子との間のバランスによって調節される。損傷性刺激に応答して、血小板および非血小板由来増殖因子とサイトカインが放出され、ＭＣ増殖を刺激する。それらの増殖因子の中には血小板由来増殖因子（PDGF）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）およびインターロイキン−１（IL-1）がある。それらの増殖因子の増殖促進活性を妨害する分子は糸球体硬化症の進行を遅らせることができる。特にそれらはヘパリン種〔J. Floege他, “Heparin Supresses Mesangial Cell Proliferation and Matrix Expansion in Experimental Mesangioproliferative Gluomerulonephritis,”Kid. Int., 第43巻, 369〜380頁（1983）；A. Wolthuis他, “Heparins Modulate Extracellular Matrix and Protein Synthesis in Rat Mesangial Cells, Virchows Arch B,”Cell Pathol., 第63巻, 181〜189頁（1993）参照〕、多分ヘパラン硫酸〔A. Schmidt他, “The Antiproliferative Activity of Arterial Heparan Sulfate Resides in Domains Enriched with 2-0-Sulfated Uronic Acid Residues,”J. Biol. Chem., 第267巻, 19242〜19247頁（1992）参照〕および他のポリアニオン分子〔M. Benezra他, “Antiproliferative Activity to Vascular Smooth Muscle Cells and Receptor Binding of Heparin-Mimicking Poly-aromatic Anionic Compounds,”Arterioscler. Thromb., 第14巻（1994年12月），印刷中；F. Pugliese他, “Regulation of Cult-ured Human Mesangial Cell Growth by Ionized Macromolecules,”J. Am. Soc, Nephrol., 第２巻, 595〜599頁（1992）参照〕である。
本発明の局面をより十分に理解し認識できるように、本発明を次の実施例において幾つかの好ましい実施態様に関して記載するが、それらの特定の実施態様に本発明を限定するつもりはない。反対に、添付した請求の範囲により限定されるような本発明の範囲内に含まれるような全ての変更、修正および等価物を包含するつもりである。よって好ましい実施態様を含む下記実施例は、本発明の実施を例証するために役立つだろうし、与えられる事項は一例のつもりであり且つ本発明の好ましい実施態様の実例となる記述のためであり、配合手順並びに本発明の理論および概念の最も有用で且つ容易に理解できる説明であると思われるものを提供するという理由で与えられると理解されるだろう。
添付図面を参照しながら、実施した実験の結果を下記に記載する。
図面において、
図１は、メサンギウム細胞増殖に対する増加する濃度のハロフギノンの抑制効果を示す特徴的な曲線であり；
図２は、濃度（10〜75 ng/ml）と培養日数の関数としてのメサンギウム細胞に対するハロフギノンの増殖抑制効果を示す特徴的な曲線であり、図２Ａは第１日に添加したハロフギノンの効果を示し、図２Ｂは第１日と第４日に添加したハロフギノンの効果を示し；
図３は、糸球体メサンギウム細胞に対する0.05μg/mlのハロフギノンの増殖抑制効果の復帰を示す特徴的な曲線であり；そして
図４は、糸球体メサンギウム細胞の細胞数（図４Ａ）と増殖速度（図４Ｂ）に対する増加する濃度のハロフギノンの効果を比較する特徴的な曲線である。
実施例
Ｉ．実験手順
細胞
以前に記載されたようにして、単離されたラット糸球体からメサンギウム細胞の初代培養物を得た〔A. Amore他, “Functional Con-sequences of the Binding of Gliadin to Cultured Rat mesangial Cells: Bridging Immunoglobulin A to Cells and Modulation of Eicosanoid Synthesis and Altered Cytokine Production,”Am. J. Kid. Dis., 第23巻, 290〜301頁（1994）を参照のこと〕。
簡単に言えば、ラット腎臓の腎皮質を髄質と被膜から切除し、細かく刻んでペーストにし、ゆるやかに106mmのスチール篩を通し、最後にＰＢＳ中に懸濁した。ナイロン篩上での連続した篩分けによりこの懸濁液から糸球体を単離した。洗浄した糸球体をRPMI中に再懸濁し、次いで37℃で５分間IV型コラーゲナーゼで消化して上皮細胞を除去した。再懸濁後、糸球体をプラスチック製培養皿の上に置いた。細胞を集密近くまで継代培養した。第３〜４代継代培養後の細胞において実験を行った。
糸球体メサンギウム細胞系（SV40 MES 13）をATCCから入手した。培地は、５％ウシ胎児血清と14mM HEPESが補足されたダルベッコ改良イーグル培地とハムF-12培地の３：１混合物から成った。
SV40 MES 13細胞系は、シミアンウイルス40(SV40)の初期領域についてトランスジェニックである７〜10週齢のC57B1/6J×SJL/Jマウスから1986年に確立された。糸球体メサンギウム細胞を単離し、トリプシン処理し、そしてクローニングした。それらのメサンギウム細胞は、細胞質全体に豊富な平行繊維を有するアクチンのために顕著な細胞骨格染色を示し、そして10-6ＭのアンギオテンシンIIの存在下で収縮する。それらは報告上は５％ウシ胎児血清中で26時間の倍加時間を有し、軟寒天中でコロニーを形成することができる。該細胞は無限の培養寿命を有しそして大型Ｔ抗原について染色すると思われる。該細胞系はサイトケラチンおよび第VIII因子関連抗原が陰性である。形質転換された表現型にもかかわらず、SV40 MES 13細胞系正常な糸球体メサンギウム細胞の特徴を維持しており、従って糸球体細胞生物学の研究に有用である〔L.J. Striker他, “Glomerular Epithelial, mesangial and Endothelial Cell Lines from Transgenic Mice,”Kid. Int.,第33巻, 677〜684頁（1988）参照〕。
細胞増殖
Ａ． 3 Ｈ−チミジン取込み
10％ＦＣＳが補足されたDMEM中に細胞を接種した（４×104細胞／16mmウエル）。接種から24時間後、培地を0.2％ＦＣＳ含有培地により置換し、そして48時間後、細胞を増殖刺激剤と3Ｈ−チミジン（１Ci／ウエル）に更に24〜48時間暴露した。トリクロロ酢酸不溶性物質中に取り込まれた放射能を測定することにより、ＤＮＡ合成を測定した〔M. Benezra他, “Thrombin-Induced Release of Active Basic Fibroblast Growth Factor-Heparan Sulfate Complexes from Subendothelial Extracellular Matrix,”Blood, 第81巻, 3324〜3332頁（1993）参照〕。
Ｂ．増殖速度
細胞（1.5×104細胞／ウエル）を24ウエルの培養皿に接種し、上記と同様にして増殖刺激剤に暴露した。接種後１〜６日目にPBS中の2.5％ホルムアルデヒドにより細胞を固定した。プレートを0.1Ｍホウ酸塩緩衝液（pH8.5）の浴の中に浸し、メチレンブルー（0.1Ｍホウ酸塩緩衝液, pH8.5中１％）で染色し（１時間, 24℃）、そして水で４回洗浄した。この手順は実質上全ての非細胞結合型色素を除去した。特定の細胞に取り込まれたメチレンブルーを0.5mlの0.1N HClを使って溶解させ（１時間, 25℃）、620nmでの吸光度を測定することにより定量した。細胞数算定（細胞カウンティング）により測定された細胞数は、分光光度法による吸光度と相関した〔R. GlodmanおよびZ. Bar-Shavit, “Dual Effect of Nomal and Stimulated Macrophages and Their Conditioned Media on Target Cell Proliferation,”J. Natl. Cancer Inst., 第63巻, 1004〜1016頁（1979）参照〕。
初期細胞接種密度は、実験の終了時に細胞数と吸光度との間に直線関係が保証されるように選んだ。各実験において、３ウエルを試験化合物の添加前に固定し、初期平均吸光度を測定した。この値を使って、次の式に従って対照細胞と薬剤処理細胞の倍加時間（ＤＴ）を算出した：
ＤＴ＝Ｉｎ ２／Ｉｎ 〔（ＯＤt／ＯＤc）／ｈ〕
上式中、
ＤＴ＝倍加時間（時間で）
ＯＤt＝実験終了時の試験ウエルの光学濃度
ＯＤc＝実験開始時の対照ウエルの光学濃度
ｈ＝インキュベーション時間（時間で）
増殖速度は、薬剤処理細胞の倍加時間を対照細胞のそれで割ることにより算出した〔A. Horowitz他, “In Vitro Cytotoxicity of Liposome-Encapsulated Doxorubicin: Dependence on Liposome Composition and Drug Release,” Biochim. Biophys. Acta,第1109巻, 203〜209頁（1992）〕。
Ｃ．細胞数
細胞を24ウエルプレートのウエルあたり５×103細胞の密度で接種した。接種後の様々な時点で、0.05％トリプシン、0.01Ｍリン酸ナトリウム（pH7.4）および0.02％EDTA（ＳＴＶ）を使って細胞を解離させ、そしてCoulterカウンター（Coulter Electronic Ltd.）中でカウントした。
II．細胞増殖
糸球体メサンギウム細胞に対するハロフギノンの増殖抑制効果
Ａ．増殖速度
まばらに接種した（1.5×104細胞／ウエル）糸球体ＭＣを、増加する濃度のハロフギノンの非存在下または存在下で10％ＦＣＳに暴露した。接種から５日後に、ＳＴＶを使って細胞を解離させそしてカウントした。図１に示されるように、25ng/mlでＭＣ増殖の60〜70％阻害が得られ、50mg/mlでほとんど完全な阻害が得られた。同様な実験において、増加する濃度のハロフギノンの非存在下または存在下で接種した細胞を、接種後様々な日数でＳＴＶにより解離させ、カウントした。75ng/mlのハロフギノン濃度で細胞増殖の完全な阻害が得られた（図２Ａ）。ハロフギノンを１日目と４日目の２回添加した時、より有力な増殖抑制効果が得られた。この効果は低濃度の薬剤のところで最もよく表れた（図２Ｂ）。
Ｂ．可逆性
別の実験において、ＭＣをハロフギノンに48時間暴露し、次いで薬剤を除去し、普通増殖培地中で増殖させた。図３に証明されるように、薬剤の除去が未処理のＭＣの増殖速度と同様な増殖速度の加速増加を引き起こした。細胞を低密度（500および1,000細胞／ウエル）で接種した時に同様な結果が得られ、そしてハロフギノンの非存在下と存在下のそれらの増殖速度を、メチレンブルーでの細胞染色後に実験手順に記載した式を使って決定した。75μg/mlのハロフギノンの存在下でほとんど完全な増殖の阻害が得られた（図４）。同条件下で、ヘパリンはまったく効果がなかった（図４）。
Ｃ． 3 Ｈ−チミジン取込み
集密下の糸球体ＭＣを10％ＦＣＳ含有培地中に維持し、増加する濃度のハロフギノンの非存在下と存在下で3Ｈ−チミジンに暴露した（48時間、37℃）。0.035μg/mlのハロフギノン濃度でＤＮＡ合成の完全な阻害が得られ、0.025μg/mlほどの低い濃度で50％阻害が得られた（示してない）。
Ｄ．bFGFで誘発された細胞増殖に対する効果
増殖が阻止された静止状態の糸球体ＭＣを0.5％ＦＣＳ含有培地中に維持し（48時間）、次いで低濃度の塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）により増殖を刺激した。ハロフギノン（0.050μg/ml）への暴露は、増殖阻止されたＭＣ中へのbFGF誘発チミジン取込みのほとんど完全な阻害をもたらした（示してない）。この結果は、ハロフギノンがbFGFの増殖促進活性を効果的に拮抗することを示唆する。
Ｅ．他の化合物の効果
ヘパリンは糸球体ＭＣに対して増殖抑制効果を発揮すると報告されている（J. Floege他，同一文献；A. Wolthius他，同一文献）。本発明者らの実験では、15μg/mlの濃度までヘパリンにほとんどまたは全く阻害効果がなく、50μg/mlのヘパリンで約25％阻害が得られた。細胞数（図４Ａ）または増殖速度（図４Ｂ）のどちらを測定しても、同様な結果が得られた。
III．現行アプローチを上回る利点
糸球体ＭＣの増殖を抑制するための現行アプローチはヘパリン（J. Floege他，同一文献）、低分子量ヘパリンであるスラミン（Pugliese他，同一文献）、カルシウムチャンネル遮断薬（即ちアムロジピン；P.J. ShultzおよびL. Raij, “Effect of Amlodipine on Mesangial Cell Proliferation and Protein Synthesis,” Am. J. Hypertens., 第５巻, 912〜914頁（1992）参照〕およびコレステロール合成阻害剤〔M.P. O'Donnell他, “Lovastatin Retards the progression of Established Glomerular Disease in Obese Zucker Rats,”Am. J. Kid. Dis., 第22巻, 83〜89頁（1993）参照〕を使用する。ヘパリンは有力な抗凝固剤であり、それの増殖抑制活性は比較的小さく、入手源と製造会社によって大きな変動がある。スラミンは有効量において毒性が高く、アムロジピンとロバスタチンは試験管内で比較的小さな効果を示し、ヒトの腎臓病の進行過程を変えることはできない。
本発明のアプローチは、bFGFを含む様々な増殖因子の活性を阻害し且つ糸球体ＭＣのオートクリン増殖を阻害する、非常に有力で、安価で且つ非毒性の化合物を使用する。更に、ハロフギノンは低分子量化合物であり、多分経口投与が可能であろう。該化合物は家禽を治療する際の使用がＦＤＡにより認可されている。それらの特徴のため、ハロフギノンは腎臓病の進行を抑制するのに最も有望で臨床的に有用な薬剤である。
糸球体ＭＣの増殖を効果的に抑制する非毒性化合物としてのハロフギノンの使用は、単状分節状糸球体硬化症やメサンギウム肥大が重要な役割を果たしている他の腎臓病の病態生理学を抑制するための効果的な方策を提供する。
本発明が上述の例証的な実施例の細部に限定されないこと、および本発明がそれの本質的特性から逸脱することなく他の特定形態で具体化できることは当業者にとって明らかであろう。従って、上述の記載よりもむしろ添付の請求の範囲を参照し、本発明の実施態様および実施例は全ての面で例示的であって限定的でないと見なされ、従って請求の範囲の意味および均等物の範囲の中に入る全ての変更はその中に包含されるものである。
1967年に発行された米国特許第3,320,124号には、キナゾリノン誘導体でコクシジウム症を治療する方法が記載されクレイムされている。
別称７−ブロモ−６−クロロ−３−〔３−（３−ヒドロキシ−２−ピペリジニル）−２−オキソプロピル〕−４（３Ｈ）−キナゾリノンとしても知られるハロフギノンは、American Cyanamid Companyにより前記特許明細書中に最初に記載されそしてクレイムされた化合物であり、前記特許明細書によると好ましい化合物であり、明細書中に記載されクレイムされた誘導体の中から市販された唯一のものであった。
その後、米国再発行特許第26,833号並びに米国特許第4,824,847号、同第4,855,299号、同第4,861,758号および同第5,215,993号は全てハロフギノンの殺コクシジウム性質に関し、前記米国特許第4,340,596号はそれがタイレリア症を無くすのにも利用できると教示している。
1991年に、本発明者らの１人は、コラーゲン合成の減少が、コクシジウム抑制剤としての使用に推奨される量で投与したハロフギノンによって治療した家禽に皮膚断裂や皮膚強度の低下を引き起こす重要な原因であると注目し同定したことを報告する文献を発表した。細胞レベルでは、ハロフギノンはトリ皮膚繊維芽細胞によるコラーゲン合成を抑制することもわかった〔I. Granot他, Poult. Sci., 第70巻, 第1559〜1563頁（1991）〕。
しかしながら、その時点では、米国特許第3,320,124号に開示されたハロフギノンや関連のキナゾリノン誘導体が繊維症の治療におよび関連の化粧用途に並びに正当な理由に効果的に利用できることは教示されていなかったし、認識されていなかったし、疑われてもいなかった。
一次および二次繊維症、例えば全身性繊維症、対宿主性移植片病（GVHD）、肺および肝繊維症並びに多種多様な自己免疫疾患に関連する様々な臨床状態および障害が、正常組織の構造と機能の破壊をもたらす結合組織の過剰生産により識別される。それらの病気は、主な徴候が過剰なコラーゲン沈着である細胞機能の混乱の点からが一番よく判断することができる。
現在、繊維症性疾患の大部分の治療は効果がなく、それらの容赦ない病気進行に対してほとんど効果がない。細胞外間隙中へのコラーゲン沈着を減らすために様々な試みがなされている。承知の通り、進行性繊維増殖症は結合組織の過剰生産を表し、それが正常組織の構造と機能の破壊を引き起こす。繊維症におけるコラーゲンの重要な役割は、それの蓄積を抑制する薬剤を開発する試みを思いつかせた〔K.I. Kivirikko, Annals of Medicine, 第25巻, 113〜126頁（1993）〕。
そのような薬剤は、プロコラーゲンポリペプチド鎖の合金を活性調節することにより作用することができ、またはある特定の翻訳後現象を抑制することができ、それが細胞外コラーゲン繊維の形成の減少かまたは改変した性質を有する繊維の蓄積のいずれかをもたらすだろう。組織の完全性の維持と様々な疾患におけるコラーゲンの関与という点からのこのタンパク質の重要性にもかかわらず、コラーゲン合成の阻害剤は数種類しか入手できない。
コラーゲン産生繊維芽細胞の増殖を遅らせる試みにおいて細胞毒性薬〔J.A. Casas他, Ann. Phem. Dis.,第46巻, 763頁（1987）〕、中でも細胞外基質中へのコラーゲンの分泌を遅くするコルチシン〔D. Kershenobich他, N. Engl. J. Med., 第318巻, 1709頁（1988）〕および重要なコラーゲン代謝酵素の阻害剤〔K. Karvonen他, J. Biol. Chem., 第265巻, 8415頁（1990）；C.J. Cunliffe他, J. Med. Chem.,第35巻, 2652頁（1992）〕が使われている。
不運にも、それらの阻害剤は１つもコラーゲン型特異的でない。また、他の極めて重要なコラーゲン形成分子、例えば古典的補体経路のClq、神経筋の接合終板のアセチルコリンエステラーゼ、コングルチニンおよび肺胞界面活性物質アポ蛋白の生合成を妨害するという毒性結果について深刻な心配がある。
コラーゲン生合成を阻害することのできる他の薬剤、例えばニフェジピンおよびフェニトインは、別のタンパク質の合成も阻害し、従ってコラーゲン生合成経路を非特異的に遮断する〔T. Salo他, J. Oral Pathol. Med.,第19巻, 404頁（1990）〕。
β−アミノプロピオニトリルのようなコラーゲン架橋阻害剤は有用な抗繊維症剤として働くことができるけれども、それらも非特異的である。それを長期使用するとラチリスム性（lathritic）症候群を引き起こし、弾性繊維形成を妨害する。というのは、別の繊維状結合組織タンパク質であるエラスチンも架橋されてしまうからである。加えて、コラーゲン架橋阻害効果は二次的であり、コラーゲン過剰生産はコラーゲナーゼによるそれの分解より優るに違いない。
最近提出された米国特許出願第08/181,066号は、繊維症状態を有するヒト患者の治療方法であって、コラーゲンＩ型の合成を阻害するのに有効な式Ｉ：
ｎは１または２であり；
Ｒ1は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニルおよび低級アルコキシから成る群より選ばれた基であり、
Ｒ2はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシから成る群より選ばれた基であり、そして
Ｒ3は水素および低級アルケンオキシ−カルボニルから成る群より選ばれた基である）
の医薬活性化合物の医薬上有効な量を含んで成る組成物を患者に投与することを含んで成る方法を記載しクレイムしている。
更なる研究と開発の後、ハロフギノンがメサンギウム細胞増殖を抑制するのに利用できることをたった今発見した。従って、米国特許出願第3,320,124号（その開示は参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されクレイムされた他のキナゾリノン誘導体も同様な性質を有すると思われる。
よって、本発明によれば、メサンギウム細胞の増殖を抑制するための組成物であって、メサンギウム細胞の増殖を抑制するのに有効な量の式Ｉの化合物：
ｎは１または２であり、
Ｒ1は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニルおよび低級アルコキシから成る群より選ばれた基であり、
Ｒ2はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシから成る群より選ばれた基であり、そして
Ｒ3は水素および低級アルケンオキシ−カルボニルから成る群より選ばれた基である）
または生理学的に許容されるその塩を含んで成る組成物が提供される。
本発明はまた、メサンギウム細胞増殖を有するヒト患者の治療方法であって、メサンギウム細胞増殖を抑制するのに有効な医薬有効量の式Ｉの医薬活性化合物：
Ｒ1は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニルおよび低級アルコキシから成る群より選ばれた基であり、
Ｒ2はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシから成る群より選ばれた基であり、そして
Ｒ3は水素および低級アルケンオキシ−カルボニルから成る群より選ばれた基である）
または生理学的に許容されるその塩を含んで成る組成物を前記患者に投与することを含んで成る方法も提供する。
本発明の好ましい態様では、前記化合物がハロフギノンである。
米国特許出願第08,181,066号では、本発明の前記化合物が強皮症や対宿主性移植片病のような繊維症状態の治療に有効であることを明白に示しそして証明している。そのような説明は、該化合物が効果をもたらす前に不活性化されるかもしれない；該化合物が標的部位に到達しないかもしれない；または他の機能的性質が該化合物を生体内利用に不適当にするかもしれない、という根拠のない憶測を取り除く。しかしながら、それらの可能性は、この同一化合物が過剰なコラーゲン沈着に関連する２つの特定の繊維症状態、即ち強皮症とGVHD、の治療に有効であることが証明されたという正にこの事実によって完全に否定される。従って、前記米国特許出願の開示は参考として本明細書中に組み込まれる。
ここで本発明の新発見について説明すると、単状分節状糸球体硬化症（FSGS）は、一般に蛋白尿と進行性腎機能低下に関連づけられる糸球体損傷の一形態の組織学的説明である〔H.G. RennkeおよびP.S. Klein,“Pathogenesis and Significance of Nonprimary Focal and Segmental Glomerulosclerosis,”Am. J. Kid. Dis., 第13巻, 443〜446頁（1989）〕。
最初、FSGSは末期の腎不全で死亡したネフローゼ患者について評された。近年では、FSGSは多数のヒト全身および腎疾患における糸球体の最終共通経路であると見なされている。それらは正常な老化と糖尿病性腎症のような過程を含む。FSGSの病変は様々な見かけ上無関係の有害刺激から端を発し、メサンギウムの肥大と糸球体硬化から、初期損傷の終了のずっと後の腎活動停止までに至り得る。FSGSの病変は、腎臓病の進行を研究するのに最もよく使われている動物モデル−腎剥離モデル−においても重要である。
FSGS病変はアテローム硬化症の過程と多くの類似性を示す〔例えば、J.R. DiamondおよびM.J. Karnovsky,“Focal and Segmental Glomerulosclerosis:Analogies to Atherosclerosis,”Kid. Int.,第33巻, 917〜924頁（1988）を参照のこと〕。両者とも、関与細胞が血管内皮細胞、その下にある血管平滑筋細胞（VSMC）またはそれらの腎相当物のメサンギウム細胞である。後者の２つの細胞型は起源、顕微解剖学および組織化学的特徴の面で密接に関連している。更に、それらの細胞は、アンギオテンシンII受容体、幾つかの媒介物質に対するカルシウム依存性収縮性応答、並びに血小板およびマクロファージ由来生成物に対する増殖性応答を包含する機能特性を共有している。腎硬化症と血管硬化症の進行は共に、特にM. KashgarianおよびR.B. Sterzel,“The Pathobiology of the Mesangium,”Am. J. Kid. Dis., 第41巻, 524〜529頁（1992）により記載された通り、高血圧と血管ストレス、高脂質血、凝固カスケードの活性化により影響を受ける。
上述したように、そして下記に更に説明するように、ハロフギノンがヒトメサンギウム細胞増殖の有力な阻害剤であることをたった今発見した。
承知の通り、メサンギウムは糸球体の軸上間質を形成している。それは糸球体細胞集団の第三種（その他は内皮細胞と上皮細胞である）であるメサンギウム細胞とメサンギウム基質とから成る。メサンギウム細胞は不安定な場所に位置し、有窓性内皮を経由して糸球体の毛細血管内腔と接触している。従ってメサンギウム高分子や濾過残渣により常に灌流される。それらの残渣は、メサンギウム細胞を活性化して増殖させ且つ基質生産に関する該細胞の分泌表現型を変更することができる免疫複合体や循環性サイトカインを含むことがある。メサンギウムの細胞外基質の肥大を伴うメサンギウム増生は、糸球体硬化症過程に先行するかまたはそれと付随して起こる〔例えば、A. El Nahas Meguid, “Growth Factors and Glomerular Sclerosis,”Kid. Int., 第41巻. S15-S20頁（1992）；J. Floege他, “Regulation of Mesangial Cell Proliferation,”Am. J. Kid. Dis., 第17巻, 673〜676頁（1991）を参照のこと〕。
加えて、メサンギウム細胞の増殖および／またはメサンギウム基質肥大は、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病および膜性増殖性糸球体腎炎のような病気の基本的な特徴である。従って、メサンギウム細胞の増殖を抑制する能力は、単状分節状糸球体腎炎の組織病理学的病変の状況下で起こる末期腎臓病への進行を防ぐと期待される。更に、それはメサンギウム肥大により特徴づけられる上述の腎臓病の治療において治療手段として用いることができる。FSGSの病因は、細胞外基質（ＥＣＭ）中に埋まったメサンギウム細胞（ＭＣ）の異常増殖が関係する〔例えば、H.G. Rennke他，同一文献；J.R. Diamond他，同一文献を参照のこと〕。
生理的条件下では、腎性ＭＣの大部分はＧo期のままであり、細胞増殖は内因性の増殖促進因子と増殖抑制分子との間のバランスによって調節される。損傷性刺激に応答して、血小板および非血小板由来増殖因子とサイトカインが放出され、ＭＣ増殖を刺激する。それらの増殖因子の中には血小板由来増殖因子（PDGF）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）およびインターロイキン−１（IL-1）がある。それらの増殖因子の増殖促進活性を妨害する分子は糸球体硬化症の進行を遅らせることができる。特にそれらはヘパリン種〔J. Floege他, “Heparin Supresses Mesangial Cell Proliferation and Matrix Expansion in Experimental Mesangioproliferative Gluomerulonephritis,”Kid. Int., 第43巻, 369〜380頁（1983）；A. Wolthuis他, “Heparins Modulate Extracellular Matrix and Protein Synthesis in Rat Mesangial Cells, Virchows Arch B,”Cell Pathol., 第63巻, 181〜189頁（1993）参照〕、多分ヘパラン硫酸〔A. Schmidt他, “The Antiproliferative Activity of Arterial Heparan Sulfate Resides in Domains Enriched with 2-0-Sulfated Uronic Acid Residues,”J. Biol. Chem., 第267巻, 19242〜19247頁（1992）参照〕および他のポリアニオン分子〔M. Benezra他, “Antiproliferative Activity to Vascular Smooth Muscle Cells and Receptor Binding of Heparin-Mimicking Poly-aromatic Anionic Compounds,”Arterioscler. Thromb., 第14巻（1994年12月），印刷中；F. Pugliese他, “Regulation of Cult-ured Human Mesangial Cell Growth by Ionized Macromolecules,”J. Am. Soc, Nephrol., 第２巻, 595〜599頁（1992）参照〕である。
本発明の局面をより十分に理解し認識できるように、本発明を次の実施例において幾つかの好ましい実施態様に関して記載するが、それらの特定の実施態様に本発明を限定するつもりはない。反対に、添付した請求の範囲により限定されるような本発明の範囲内に含まれるような全ての変更、修正および等価物を包含するつもりである。よって好ましい実施態様を含む下記実施例は、本発明の実施を例証するために役立つだろうし、与えられる事項は一例のつもりであり且つ本発明の好ましい実施態様の実例となる記述のためであり、配合手順並びに本発明の理論および概念の最も有用で且つ容易に理解できる説明であると思われるものを提供するという理由で与えられると理解されるだろう。
添付図面を参照しながら、実施した実験の結果を下記に記載する。
図面において、
図１は、メサンギウム細胞増殖に対する増加する濃度のハロフギノンの抑制効果を示す特徴的な曲線であり；
図２は、濃度（10〜75 ng/ml）と培養日数の関数としてのメサンギウム細胞に対するハロフギノンの増殖抑制効果を示す特徴的な曲線であり、図２Ａは第１日に添加したハロフギノンの効果を示し、図２Ｂは第１日と第４日に添加したハロフギノンの効果を示し；
図３は、糸球体メサンギウム細胞に対する0.05μg/mlのハロフギノンの増殖抑制効果の復帰を示す特徴的な曲線であり；そして
図４は、糸球体メサンギウム細胞の細胞数（図４Ａ）と増殖速度（図４Ｂ）に対する増加する濃度のハロフギノンの効果を比較する特徴的な曲線である。
実施例
Ｉ．実験手順
細胞
以前に記載されたようにして、単離されたラット糸球体からメサンギウム細胞の初代培養物を得た〔A. Amore他, “Functional Con-sequences of the Binding of Gliadin to Cultured Rat mesangial Cells: Bridging Immunoglobulin A to Cells and Modulation of Eicosanoid Synthesis and Altered Cytokine Production,”Am. J. Kid. Dis., 第23巻, 290〜301頁（1994）を参照のこと〕。
簡単に言えば、ラット腎臓の腎皮質を髄質と被膜から切除し、細かく刻んでペーストにし、ゆるやかに106mmのスチール篩を通し、最後にＰＢＳ中に懸濁した。ナイロン篩上での連続した篩分けによりこの懸濁液から糸球体を単離した。洗浄した糸球体をRPMI中に再懸濁し、次いで37℃で５分間IV型コラーゲナーゼで消化して上皮細胞を除去した。再懸濁後、糸球体をプラスチック製培養皿の上に置いた。細胞を集密近くまで継代培養した。第３〜４代継代培養後の細胞において実験を行った。
糸球体メサンギウム細胞系（SV40 MES 13）をATCCから入手した。培地は、５％ウシ胎児血清と14mM HEPESが補足されたダルベッコ改良イーグル培地とハムF-12培地の３：１混合物から成った。
SV40 MES 13細胞系は、シミアンウイルス40(SV40)の初期領域についてトランスジェニックである７〜10週齢のC57B1/6J×SJL/Jマウスから1986年に確立された。糸球体メサンギウム細胞を単離し、トリプシン処理し、そしてクローニングした。それらのメサンギウム細胞は、細胞質全体に豊富な平行繊維を有するアクチンのために顕著な細胞骨格染色を示し、そして10-6ＭのアンギオテンシンIIの存在下で収縮する。それらは報告上は５％ウシ胎児血清中で26時間の倍加時間を有し、軟寒天中でコロニーを形成することができる。該細胞は無限の培養寿命を有しそして大型Ｔ抗原について染色すると思われる。該細胞系はサイトケラチンおよび第VIII因子関連抗原が陰性である。形質転換された表現型にもかかわらず、SV40 MES 13細胞系正常な糸球体メサンギウム細胞の特徴を維持しており、従って糸球体細胞生物学の研究に有用である〔L.J. Striker他, “Glomerular Epithelial, mesangial and Endothelial Cell Lines from Transgenic Mice,”Kid. Int.,第33巻, 677〜684頁（1988）参照〕。
細胞増殖
Ａ． 3 Ｈ−チミジン取込み
10％ＦＣＳが補足されたDMEM中に細胞を接種した（４×104細胞／16mmウエル）。接種から24時間後、培地を0.2％ＦＣＳ含有培地により置換し、そして48時間後、細胞を増殖刺激剤と3Ｈ−チミジン（１Ci／ウエル）に更に24〜48時間暴露した。トリクロロ酢酸不溶性物質中に取り込まれた放射能を測定することにより、ＤＮＡ合成を測定した〔M. Benezra他, “Thrombin-Induced Release of Active Basic Fibroblast Growth Factor-Heparan Sulfate Complexes from Subendothelial Extracellular Matrix,”Blood, 第81巻, 3324〜3332頁（1993）参照〕。
Ｂ．増殖速度
細胞（1.5×104細胞／ウエル）を24ウエルの培養皿に接種し、上記と同様にして増殖刺激剤に暴露した。接種後１〜６日目にPBS中の2.5％ホルムアルデヒドにより細胞を固定した。プレートを0.1Ｍホウ酸塩緩衝液（pH8.5）の浴の中に浸し、メチレンブルー（0.1Ｍホウ酸塩緩衝液, pH8.5中１％）で染色し（１時間, 24℃）、そして水で４回洗浄した。この手順は実質上全ての非細胞結合型色素を除去した。特定の細胞に取り込まれたメチレンブルーを0.5mlの0.1N HClを使って溶解させ（１時間, 25℃）、620nmでの吸光度を測定することにより定量した。細胞数算定（細胞カウンティング）により測定された細胞数は、分光光度法による吸光度と相関した〔R. GlodmanおよびZ. Bar-Shavit, “Dual Effect of Nomal and Stimulated Macrophages and Their Conditioned Media on Target Cell Proliferation,”J. Natl. Cancer Inst., 第63巻, 1004〜1016頁（1979）参照〕。
初期細胞接種密度は、実験の終了時に細胞数と吸光度との間に直線関係が保証されるように選んだ。各実験において、３ウエルを試験化合物の添加前に固定し、初期平均吸光度を測定した。この値を使って、次の式に従って対照細胞と薬剤処理細胞の倍加時間（ＤＴ）を算出した：
ＤＴ＝Ｉｎ ２／Ｉｎ 〔（ＯＤt／ＯＤc）／ｈ〕
上式中、
ＤＴ＝倍加時間（時間で）
ＯＤt＝実験終了時の試験ウエルの光学濃度
ＯＤc＝実験開始時の対照ウエルの光学濃度
ｈ＝インキュベーション時間（時間で）
増殖速度は、薬剤処理細胞の倍加時間を対照細胞のそれで割ることにより算出した〔A. Horowitz他, “In Vitro Cytotoxicity of Liposome-Encapsulated Doxorubicin: Dependence on Liposome Composition and Drug Release,” Biochim. Biophys. Acta,第1109巻, 203〜209頁（1992）〕。
Ｃ．細胞数
細胞を24ウエルプレートのウエルあたり５×103細胞の密度で接種した。接種後の様々な時点で、0.05％トリプシン、0.01Ｍリン酸ナトリウム（pH7.4）および0.02％EDTA（ＳＴＶ）を使って細胞を解離させ、そしてCoulterカウンター（Coulter Electronic Ltd.）中でカウントした。
II．細胞増殖
糸球体メサンギウム細胞に対するハロフギノンの増殖抑制効果
Ａ．増殖速度
まばらに接種した（1.5×104細胞／ウエル）糸球体ＭＣを、増加する濃度のハロフギノンの非存在下または存在下で10％ＦＣＳに暴露した。接種から５日後に、ＳＴＶを使って細胞を解離させそしてカウントした。図１に示されるように、25ng/mlでＭＣ増殖の60〜70％阻害が得られ、50mg/mlでほとんど完全な阻害が得られた。同様な実験において、増加する濃度のハロフギノンの非存在下または存在下で接種した細胞を、接種後様々な日数でＳＴＶにより解離させ、カウントした。75ng/mlのハロフギノン濃度で細胞増殖の完全な阻害が得られた（図２Ａ）。ハロフギノンを１日目と４日目の２回添加した時、より有力な増殖抑制効果が得られた。この効果は低濃度の薬剤のところで最もよく表れた（図２Ｂ）。
Ｂ．可逆性
別の実験において、ＭＣをハロフギノンに48時間暴露し、次いで薬剤を除去し、普通増殖培地中で増殖させた。図３に証明されるように、薬剤の除去が未処理のＭＣの増殖速度と同様な増殖速度の加速増加を引き起こした。細胞を低密度（500および1,000細胞／ウエル）で接種した時に同様な結果が得られ、そしてハロフギノンの非存在下と存在下のそれらの増殖速度を、メチレンブルーでの細胞染色後に実験手順に記載した式を使って決定した。75μg/mlのハロフギノンの存在下でほとんど完全な増殖の阻害が得られた（図４）。同条件下で、ヘパリンはまったく効果がなかった（図４）。
Ｃ． 3 Ｈ−チミジン取込み
集密下の糸球体ＭＣを10％ＦＣＳ含有培地中に維持し、増加する濃度のハロフギノンの非存在下と存在下で3Ｈ−チミジンに暴露した（48時間、37℃）。0.035μg/mlのハロフギノン濃度でＤＮＡ合成の完全な阻害が得られ、0.025μg/mlほどの低い濃度で50％阻害が得られた（示してない）。
Ｄ．bFGFで誘発された細胞増殖に対する効果
増殖が阻止された静止状態の糸球体ＭＣを0.5％ＦＣＳ含有培地中に維持し（48時間）、次いで低濃度の塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）により増殖を刺激した。ハロフギノン（0.050μg/ml）への暴露は、増殖阻止されたＭＣ中へのbFGF誘発チミジン取込みのほとんど完全な阻害をもたらした（示してない）。この結果は、ハロフギノンがbFGFの増殖促進活性を効果的に拮抗することを示唆する。
Ｅ．他の化合物の効果
ヘパリンは糸球体ＭＣに対して増殖抑制効果を発揮すると報告されている（J. Floege他，同一文献；A. Wolthius他，同一文献）。本発明者らの実験では、15μg/mlの濃度までヘパリンにほとんどまたは全く阻害効果がなく、50μg/mlのヘパリンで約25％阻害が得られた。細胞数（図４Ａ）または増殖速度（図４Ｂ）のどちらを測定しても、同様な結果が得られた。
III．現行アプローチを上回る利点
糸球体ＭＣの増殖を抑制するための現行アプローチはヘパリン（J. Floege他，同一文献）、低分子量ヘパリンであるスラミン（Pugliese他，同一文献）、カルシウムチャンネル遮断薬（即ちアムロジピン；P.J. ShultzおよびL. Raij, “Effect of Amlodipine on Mesangial Cell Proliferation and Protein Synthesis,” Am. J. Hypertens., 第５巻, 912〜914頁（1992）参照〕およびコレステロール合成阻害剤〔M.P. O'Donnell他, “Lovastatin Retards the progression of Established Glomerular Disease in Obese Zucker Rats,”Am. J. Kid. Dis., 第22巻, 83〜89頁（1993）参照〕を使用する。ヘパリンは有力な抗凝固剤であり、それの増殖抑制活性は比較的小さく、入手源と製造会社によって大きな変動がある。スラミンは有効量において毒性が高く、アムロジピンとロバスタチンは試験管内で比較的小さな効果を示し、ヒトの腎臓病の進行過程を変えることはできない。
本発明のアプローチは、bFGFを含む様々な増殖因子の活性を阻害し且つ糸球体ＭＣのオートクリン増殖を阻害する、非常に有力で、安価で且つ非毒性の化合物を使用する。更に、ハロフギノンは低分子量化合物であり、多分経口投与が可能であろう。該化合物は家禽を治療する際の使用がＦＤＡにより認可されている。それらの特徴のため、ハロフギノンは腎臓病の進行を抑制するのに最も有望で臨床的に有用な薬剤である。
糸球体ＭＣの増殖を効果的に抑制する非毒性化合物としてのハロフギノンの使用は、単状分節状糸球体硬化症やメサンギウム肥大が重要な役割を果たしている他の腎臓病の病態生理学を抑制するための効果的な方策を提供する。
本発明が上述の例証的な実施例の細部に限定されないこと、および本発明がそれの本質的特性から逸脱することなく他の特定形態で具体化できることは当業者にとって明らかであろう。従って、上述の記載よりもむしろ添付の請求の範囲を参照し、本発明の実施態様および実施例は全ての面で例示的であって限定的でないと見なされ、従って請求の範囲の意味および均等物の範囲の中に入る全ての変更はその中に包含されるものである。
Claims (2)
- メサンギウム細胞の増殖を抑制するための組成物であって、メサンギウム細胞の増殖を抑制するのに有効な量の式Ｉの化合物：
（上式中、
ｎは１または２であり、
Ｒ1は水素、ハロゲン、ニトロ、ベンゾ、低級アルキル、フェニルおよび低級アルコキシから成る群より選ばれた基であり、
Ｒ2はヒドロキシ、アセトキシおよび低級アルコキシから成る群より選ばれた基であり、そして
Ｒ3は水素および低級アルケンオキシ−カルボニルから成る群より選ばれた基である）
または生理学上許容されるその塩を含んで成る組成物。 - 前記化合物がハロフギノンである、請求項１に記載の組成物。
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