ES2285852T3 - Compuestos de diamino-propanol para el tratamiento de la isquemia. - Google Patents

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Abstract

Uso de un compuesto potenciador de la GalT-2, en el que el compuesto es levógiro y está representado por la siguiente fórmula I: en la que: R y R1 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificado con o sin un sustituyente, y además en la que R y R1 pueden unirse para formar un anillo de 5, 6 ó 7 miembros; R2 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C6-C30 de cadena lineal o ramificado con o sin de uno a tres dobles enlaces; y R3 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C6-C20 de cadena lineal o ramificado con o sin de uno a tres dobles enlaces y arilo o arilo sustituido en el que el sustituyente es halógeno, alcoxilo C1-C4, metilendioxilo, mercapto C1-C4, amino o amino sustituido en el que el sustituyente de amino puede ser alquilo C1-C4; para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de isquemia en un mamífero que padece o es propenso a la isquemia.

Description

Compuestos de diamino-propanol para el tratamiento de la isquemia.
Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención
La presente invención incluye métodos para el tratamiento de estados modulados por lactosilceramida y, más particularmente, al uso de uno o más compuestos que potencian la actividad de la UDP-galactosa, GlcCer, \beta1\rightarrow4 galactosiltransferasa (GalT-2) para tratar a un sujeto que padece de o es propenso a la isquemia.
2. Antecedentes
La proliferación celular inadecuada en un organismo puede modular el desarrollo o la gravedad de una variedad de estados. Por ejemplo, se reconoce que determinados estados pueden tratarse o prevenirse aumentando la proliferación celular en animales adultos o pre-adultos. En particular, se ha propuesto que los estados relacionados con infección, ulceración, degeneración (por ejemplo, muerte celular apoptótica y necrótica), envejecimiento, hematopoyesis, angiogénesis, determinadas respuestas inmunitarias, reparación tisular y celular pueden verse afectadas positivamente aumentando la proliferación de células específicas. Véase generalmente Alberts, B. y otros (1989) en Molecular Biology of the Cell 2ª edición Garland Publishing Co. (Nueva York y Londres); Kandel, E.R y otros (1991) en Principles of Neuroscience, Apppleton & Lange, (Norwalk, Connecticut); Cold Spring Harbor Conf. Proliferación celular (1979), Cold Spring Harbor Laboratories, (Nueva York); Tissue Growth Factors, (1981) R. Baseega, ed., (Springer-Verlag, Nueva York).
La proliferación de células animales particulares ha atraído interés. Por ejemplo, se ha informado de que la proliferación de células del músculo liso (SMC), epitelios, y otras íntimas efectúan integridad y desarrollo vascular, por ejemplo, tal como en malformación vascular y formación de lesiones vasculares. Además, se cree que la proliferación de determinadas células de la piel potencia las respuestas frente a diversos traumatismos, tales como heridas (por ejemplo, tras lesiones térmicas). Se reconoce particularmente que las SMC y los epitelios desempeñan papeles significativos en la angiogénesis. Véase por ejemplo, Tissue Growth Factors, citado anteriormente; Folkman y Shing (1992), J. Biol. Chem. 267: 10931.
También ha atraído atención la proliferación de células asociadas al corazón, cerebro, hígado, riñón, ojo y otros órganos. Por ejemplo, se ha sugerido que el aumento de varias células específicas puede tratar o prevenir determinadas enfermedades neurodegenerativas tales como las que afectan a los sistemas central y periférico (por ejemplo, motor). Las enfermedades degenerativas de la retina y otras estructuras oculares pueden conducir al deterioro progresivo de la visión. En particular, se cree que las distrofias maculares relacionadas con la edad (por ejemplo, enfermedad de Stargardt) se ven afectadas negativamente por la proliferación inadecuada de determinadas células, por ejemplo, mácula. Se ha propuesto que el efecto de muchos, si no todos los trastornos neurodegenerativos puede compensarse potenciando la proliferación de células específicas. Véase por ejemplo, Kusiak, J.W et al (1996) Mol. Chem. Neuropathol. 153; Kandel, E.R y otros citado anteriormente; Ncary y otros (1996) Trends Neurosci. (1996) 13.
Se ha reconocido que la adhesión celular inadecuada puede contribuir también a algunos estados. Por ejemplo, se ha sugerido que se potencia la coagulación sanguínea mediante la adhesión de plaquetas y quizás otras células sanguíneas a los vasos lesionados. Además, se cree que determinadas respuestas inmunitarias, por ejemplo, la inflamación asociada al rechazo de cuerpos extraños, y el reclutamiento de células inmunitarias se potencian en muchos casos mediante la adhesión celular. El aumento de la adhesión de determinadas células puede aumentar también la angiogénesis tras traumatismos, durante el desarrollo o trás el implante de injertos.
Se ha informado de que una variedad de moléculas celulares sintéticas, semisintéticas y que se producen de manera natural desempeñan un papel significativo en la proliferación celular animal. Tales moléculas incluyen determinadas citocinas, factores de crecimiento, receptores celulares, moléculas de la matriz, enzimas, factores de transcripción de moléculas mensajeras secundarias (por ejemplo, nucleótidos cíclicos), y mitógenos tales como ésteres de forbol.
Otras moléculas tales como moléculas de adhesión parecen desempeñar papeles significativos para iniciar y mantener el contacto célula a célula adecuado.
Más particularmente, las moléculas con capacidad para modular rutas celulares que comprenden glicoesfingolípidos (GSL) han atraído un interés considerable. Se ha informado de que los GSL desempeñan un papel en la proliferación y adhesión de células animales entre otras funciones. Véanse por ejemplo, Chatterjee, S., Biochem. Biophys. Res Comm. (1991) 181:554; Hakomori, S.I. (1983) en Sphingalipid Chemistry, eds. Kanfer, J.N. y Hakomori, S.I. (Plenum Press, Nueva York); Obeid, L. M y otros (1993) Science 259: 1769 y referencias citadas en los mismos.
Se han descrito rutas celulares específicas en relación a los GSL tales como glucosilceramida (GlcCer) y lactosilceramida (LacCer). Por ejemplo, una ruta implica la síntesis de la GlcCer acoplando la UDP-glucosa a la ceramida en una reacción catalizada por la UDP-glucosa glucosiltransferasa (GlcT-1). Otra etapa convierte la GlcCer en LacCer usando UDP-galactosa, GlcCer, \beta1\rightarrow4 galactosiltransferasa (GaIT-2). Véase por ejemplo, Chatterjee y otros citado anteriormente.
Se han llevado a cabo intentos para inhibir las etapas que implican a la GlcT-1. Por ejemplo, se ha informado de que el enantiómero D del 1-fenil-2-decanoilamino-3-morfolino-1-propanol (D-PDMP) inhibe la GlcT-1 y reduce la proliferación de células vasculares. Se ha informado de que no está claro el mecanismo de acción de PDMP. Véase por ejemplo, Felding-Habermann, B. y otros (1991) Biochemistry 29:6314; Shukla, G.S. y otros Biochem. Biophys. Acta. (1991) 1083:101; Inokuchi, J. y otros, J. Lipid Res. (1987) 28:565; y Chatterjee, S., citado anteriormente.
También se han descrito las morfolinoceramidas específicas como inhibidores de la GlcT-1. Véase Carson, K. y B. Ganem (1994) Tetrahedron Lets. 35:2659.
Se cree que el aumento de los niveles de LacCer potencia la proliferación de determinadas células animales tales como células del músculo liso de la aorta y células de melanoma específicas. Véase por ejemplo, Chatterjee, S., citado anteriormente y Noirijiri, H. et al (1988) J. Biol. Chem. 263:443.
Por tanto, sería deseable tener métodos eficaces para modular los niveles de LacCer, por ejemplo, potenciando la actividad de la GalT-2. En particular, sería útil tener métodos terapéuticos para aumentar los niveles de LacCer para tratar o prevenir estados o enfermedades afectados por las lactosilceramidas.
Sumario de la invención
Ahora se han descubierto tratamientos para tratar o prevenir la isquemia. En particular, se han descubierto tratamientos que incluyen aumentar la actividad de la UDP-galactosa, GlcCer, \beta1\rightarrow4 galactosiltransferasa (GalT-2).
Más específicamente, la invención proporciona el uso de un compuesto potenciador de la GalT-2 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de la isquemia.
Las terapias de la invención son particularmente eficaces para potenciar la reparación tisular y para el tratamiento o prevención de la degeneración no deseada que implica particularmente a células tales como neuronas del sistema nervioso central (SNC) o periférico (SNP) incluyendo el ojo. En un protocolo de la invención, puede observarse un aumento en la proliferación celular tras el contacto de los tejidos o células con una o más composiciones de la invención, mientras que el control muestra mucha menos proliferación. En particular, la presente invención ofrece una variedad de protocolos in vitro e in vivo para someter a prueba las composiciones tal como se expone en la discusión y ejemplos que siguen.
Los estados modulados por LacCer que pueden potenciarse según la invención incluyen también la angiogénesis (neovascularización); y responden a diversos traumatismos, por ejemplo, ulceración del músculo liso y células relacionadas; reparación tisular, particularmente en respuesta a quemaduras o a una incisión; e implante de injertos.
El uso de un compuesto potenciador de la GalT-2 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la isquemia en un sujeto, particularmente un mamífero tal como un primate y especialmente un ser humano que necesita tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que puede promover la actividad de la GalT-2. Preferiblemente, un compuesto administrado aumenta la proliferación celular en al menos aproximadamente el 15% o el 25% en un ensayo de proliferación celular in vitro convencional. A continuación se describen ejemplos de un ensayo de este tipo. Generalmente se prefiere que el compuesto administrado muestre una CE_{50} de al menos aproximadamente 10 \muM en un ensayo de la GalT-2 in vitro convencional tal como se define a continuación, más preferiblemente una CE_{50} de aproximadamente 1 \muM o inferior, todavía más preferiblemente una CE_{50} de aproximadamente 0,001 \muM o inferior en un ensayo de la GalT-2 in vitro convencional tal como se define a continuación. Tal como se define en el presente documento, la CE_{50} es una concentración del compuesto potenciador de la proliferación celular que muestra al menos aproximadamente una estimulación del 10% al 20% de la proliferación celular con respecto a un control adecuado tal como se describe a continuación. Tales compuestos que pueden potenciar la actividad de la GalT-2 se denominan generalmente en el presente documento "compuestos potenciadores de la GalT-2" u otro término similar.
Los compuestos adecuados para su uso en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la isquemia de la invención son generalmente levógiros e incluyen los de la siguiente fórmula I:
1
en la que R, R^{1}, R^{2} y R^{3} son tal como se definen a continuación; y sales farmacéuticamente aceptables de tales compuestos.
El término "levógiro" (opuesto a "dextrógiro") se usa en el presente documento para indicar los compuestos de fórmula I que tienen la capacidad de rotar la luz polarizada en sentido contrario a las agujas del reloj, es decir, en la dirección L o (-) tal como se define de manera específica a continuación. Los compuestos de fórmula I preferidos muestran una rotación óptica específica de al menos -5, -10, -20, -30, -50, -100, -200 hasta aproximadamente - 300 grados en relación a un compuesto ópticamente inactivo adecuado.
Los compuestos potenciadores específicamente preferidos para su uso en los métodos terapéuticos de la invención incluyen enantiómeros L de los siguientes compuestos:
1-fenil-2-decanoilamino-3-morfolino-1-propanol;
1-fenil-2-hexadecanoilamino-3-morfolino-1-propanol;
1-fenil-2-hexadecanoilamino-3-piperidino-1-propanol;
1-fenil-2-hexadecanoilamino-3-pirrolidino-1-propanol;
1-morfolino-2-hexadecanoilamino-3-hidroxioctadec-4,5-eno; y
1-pirrolidino-2-hexadecanoilamino-3-hidroxioctadec-4,5-eno.
Los compuestos inhibidores especialmente preferidos para su uso en los métodos de la invención son L-1-fenil-2-decanoilamino-3-morfolino-1-propanol (L-PDMP) y trans-1-pirrolidino-2-hexadecanoilamino-3-hidroxioctadec-4,5-eno.
Otros compuestos potenciadores de GalT-2 adecuados pueden identificarse fácilmente mediante pruebas simples, por ejemplo mediante pruebas in vitro de un compuesto potenciador de la GalT-2 candidato en relación a un control para determinar la capacidad de promover la actividad de la GalT-2, por ejemplo en al menos el 10% más que un control.
En el presente documento se describen métodos para la detección y el análisis de compuestos que promueven la actividad de la GalT-2 y que muestran capacidad terapéutica para tratar o prevenir los estados descritos anteriormente. Los métodos de análisis y detección preferidos incluyen ensayos tanto in vitro como in vivo para determinar la capacidad terapéutica de los agentes para modular las células que responden a LacCer.
Los ensayos de detección in vitro preferidos implican una o más etapas asociadas con rutas relacionadas con la LacCer. Tales ensayos incluyen las siguientes etapas de 1) a 4):
1) cultivar una población de células que responden LacCer con LacCer;
2) añadir a las células un compuesto potenciador de la GalT-2 candidato o conocido;
3) medir la actividad de una función o molécula celular en la ruta relacionada con la LacCer; y
4) determinar el efecto del compuesto potenciador de la GalT-2 candidato o conocido sobre la célula, por ejemplo, midiendo la actividad de la función o molécula celular. Normalmente, la función celular será una o más de proliferación celular, adhesión celular o expresión de proteínas de superficie específicas sobre las células. Los ejemplos de moléculas celulares incluyen enzimas que responden a LacCer tal como se especifica a continuación.
Ese ensayo puede medir de manera eficaz la capacidad del compuesto potenciador de la GalT-2 para promover la actividad de la GalT-2. En el presente documento, la referencia a un "ensayo de la GalT-2 in vitro convencional" u otra frase similar se refiere al protocolo anterior de etapas 1) a 4) cuando la molécula celular específica medida en la etapa 3) anterior es GalT-2. Tal como se describe en más detalle a continuación, otros ensayos in vitro de la invención miden moléculas celulares específicas en las rutas o etapas relacionadas con LacCer. Los ensayos in vitro pueden realizarse con casi nada de población de células que responden a LacCer tal como se indica a continuación.
Las células que responden a LacCer adecuadas que pueden usarse o someterse a prueba para determinar su compatibilidad con el ensayo de la GalT- 2 in vitro convencional incluyen células asociadas con la íntima vascular, particularmente células del músculo liso y endoteliales; células renales, neuronas, neurogliocitos así como determinadas células inmunitarias tales como leucocitos. Las células pueden inmortalizarse, cultivarse o pueden ser células primarias tal como se desee. Adicionalmente pueden usarse también cortes de tejido u órganos.
Aunque generalmente se prefiere usar células enteras en el ensayo, en algunos casos puede emplearse un lisado de tales células o tejido, o una fracción considerablemente purificada del lisado. Las fracciones subcelulares o lisados de LacCer preferidos incluyen GalT-2.
Los ensayos de detección in vitro pueden adaptarse según el uso deseado. Por ejemplo, tal como se indicó anteriormente, se ha encontrado que la LacCer manifiesta cambios en determinadas funciones celulares tales como la proliferación celular y la adhesión celular. Por tanto, puede modificarse el ensayo de la GalT-2 in vitro convencional anterior (por ejemplo, en la etapa 3) para incluir la medición de un aumento en la adhesión o proliferación celular (o ambas) en respuesta a la LacCer añadida, y para determinar cualquier efecto del compuesto potenciador de la GalT-2 sobre la función celular. El compuesto potenciador de la GalT-2 candidato o conocido sometido a prueba en el ensayo puede emplearse como un único agente activo o en combinación con otros agentes incluyendo otros compuestos potenciadores de la GalT-2 que han de someterse a prueba. En la mayoría de los casos, los ensayos in vitro se realizan con un ensayo de control adecuado que comprende habitualmente las mismas condiciones de prueba que en las etapas anteriores, pero sin la adición del compuesto potenciador de la GalT-2 al medio. En tales casos, puede identificarse que un compuesto potenciador de la GalT-2 candidato muestra la actividad deseada, mostrando una actividad superior en al menos aproximadamente el 10 por ciento en relación al control; más preferiblemente actividad superior en al menos aproximadamente el 20% en relación al ensayo de control; y todavía más preferiblemente actividad superior en al menos aproximadamente el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 100%, 150% ó 200% o más en relación al control.
En el presente documento se describen ensayos para detectar una célula que responde a LacCer, pudiéndose usar las células. En un ensayo, puede ponerse en contacto una célula que potencialmente responde a LacCer con LacCer y entonces puede medirse una función o molécula celular deseada como una función de la cantidad de LacCer añadida. En la mayoría de los casos, se considera que la célula responde a LacCer si el ensayo empleado muestra al menos aproximadamente el 10%, preferiblemente al menos aproximadamente el 20%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 50%, y todavía más preferiblemente al menos aproximadamente el 75% o 100% de cambio en la actividad de la molécula o función celular (en relación a un control) tal como se determina mediante los ensayos proporcionados en el presente documento. Los ensayos pueden usarse para identificar la capacidad de respuesta a LacCer en una variedad de células o tejidos, incluyendo células cultivadas (es decir, células primarias o líneas celulares inmortalizadas), cortes de tejido y órganos.
Los ensayos in vitro son particularmente útiles para detectar los posibles efectos sinergísticos entre un compuesto potenciador de la GalT-2 candidato o conocido y una o más moléculas distintas, por ejemplo, otros compuestos potenciadores de la GalT-2 que pueden aumentar la adhesión o proliferación celular. Los ejemplos de tales posibles moléculas incluyen factores de crecimiento, citocinas, polipéptidos, péptidos y particularmente hormonas peptídicas, y moléculas pequeñas tales como nucleótidos cíclicos y determinados nucleósidos.
En el presente documento se describen ensayos In vivo para determinar la capacidad terapéutica de un compuesto potenciador de la GalT-2 candidato o conocido para modular las funciones celulares afectadas por LacCer, por ejemplo proliferación celular, adhesión celular o ambas. La función celular monitorizada de manera adecuada puede existir previamente en el animal de prueba, o puede inducirse la función celular, por ejemplo, administrando un fármaco que puede modular la función celular o realizando un procedimiento quirúrgico invasivo tal como angioplastia. Además de la adhesión y proliferación celular, las funciones celulares que pueden someterse a ensayo de manera adecuada incluyen, por ejemplo, reestructuración de vasos, angiogénesis, regeneración de células y tejido incluyendo particularmente, reparación tisular, y respuestas inmunitarias, por ejemplo reclutamiento de células inmunitarias específicas tales como células B y T.
Los ensayos in vivo adecuados adicionales incluyen los destinados a evaluar la función neurológica global en un animal de prueba según métodos convencionales. Por ejemplo, puede someterse a prueba la capacidad terapéutica de un compuesto candidato potenciador de la GalT, conocido, deseado, evaluando la función del SNC y/o SNP del animal de prueba. Tales pruebas se conocen en el campo e incluyen las pruebas que pueden medir la percepción, cognición, aptitudes motoras (por ejemplo, reflejos) y visión.
Los ensayos in vivo pueden modificarse de varios modos según sea necesario. Por ejemplo, en determinadas realizaciones de la presente invención relacionadas con la medición de la proliferación celular de los vasos, puede someterse a ensayo in vitro a un vaso sometido a análisis tras la extracción de un animal o someterse a ensayo in vivo si se desea. En la mayoría de las realizaciones, la actividad del compuesto potenciador de la GalT-2 en un ensayo in vivo dado se compara con un control adecuado (por ejemplo, un animal operado de manera simulada) en el que se realiza el ensayo del mismo modo que el ensayo de prueba pero sin la administración del compuesto potenciador de la GalT-2 al sujeto de prueba. Pueden emplearse una variedad de sujetos de prueba, particularmente mamíferos tales como conejos, primates, diversos roedores y similares.
Tal como se indicó anteriormente, los ensayos de detección (o bien in vitro o bien in vivo) pueden realizarse en una amplia variedad de células, tejidos y órganos que responden a LacCer. Además, los ensayos pueden detectar compuestos potenciadores de la GalT-2 útiles midiendo la actividad de las funciones y/o moléculas diana en relación a las rutas relacionadas con LacCer. Por tanto, los presentes ensayos pueden medir la actividad en diversos entornos celulares, de tejidos o de órganos.
De manera significativa, el uso de ensayos de detección múltiples (por ejemplo, una combinación de los ensayos in vitro y/o in vivo) con un único compuesto potenciador de la GalT-2 puede ampliar la selectividad y sensibilidad de detección según se desee.
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Tal amplio espectro de pruebas proporciona ventajas adicionales. Por tanto, por ejemplo, los ensayos in vitro de la invención pueden realizar de manera eficaz múltiples análisis, aumentando así la eficacia y probabilidad de identificar compuestos potenciadores de la GalT-2 con capacidad terapéutica. Esto es especialmente útil cuando se necesita someter a prueba a un gran número de compuestos. Por ejemplo, pueden prepararse bibliotecas de compuestos potenciadores de la GalT-2 mediante métodos sintéticos convencionales incluyendo manipulaciones químicas de tipo combinatorio y después someterse a prueba según la invención.
Adicionalmente, muchas de las etapas relacionadas con LacCer son "aguas abajo" de GalT-2, y por tanto los ensayos incluyen moléculas y funciones celulares que son activas aguas abajo de GalT-2. Por consiguiente, pueden registrarse cambios pequeños pero significativos en la actividad de la GalT-2 como señales que pueden someterse a prueba fácilmente.
A continuación se discuten otros aspectos de la invención.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un modelo que representa la señalización redox mediada por LacCer que conduce a la expresión de ICAM-1 en células endoteliales y la adhesión a neutrófilos.
La figura 2 es un modelo que representa la utilización de LDL-ox, LacCer, y el segundo mensajero lipídico en la proliferación de H-ASMC.
La figura 3 es un modelo que representa el papel de la LacCer como segundo mensajero lipídico y el efecto de la relación de L-PDMP para anular este fenómeno.
La figura 4 muestra el efecto de L-PDMP y LDL-ox sobre la actividad de la MAPK.
Descripción detallada de la invención
Tal como se trató anteriormente, la presente invención ofrece el uso de un compuesto potenciador de la GalT-2 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento y prevención de la isquemia. Generalmente los métodos de tratamiento incluyen la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto potenciador de la GalT-2 a un sujeto, preferiblemente a un paciente que necesita tal tratamiento.
En el documento US 5.972.928 (solicitud estadounidense, número de serie 08/998.262 presentada el 24 de diciembre de 1997) en tramitación junto con la presente y en el documento WO-98/52553 (solicitud PCT PCT/US98/09958), se describió que LacCer es una molécula de señalización celular que puede modular diversas enfermedades, trastornos posteriores a la cirugía y particularmente, reestenosis e infecciones bacterianas. Es decir, se encontró que los cambios en los niveles celulares de LacCer alteraban el desarrollo o gravedad de aquellos estados. Más particularmente, se encontró que en las células que responden a LacCer, LacCer funciona como una molécula de señal para efectuar cambios en determinadas etapas celulares (algunas veces denominadas en el presente documento "etapas relacionadas con LacCer" o "rutas relacionadas con LacCer"). Además se describió que las rutas relacionadas con LacCer afectan a una variedad de funciones tales como la adhesión y proliferación celular.
La solicitud de patente estadounidense en tramitación junto con la presente, número de serie 08/998.262 describe además métodos para inhibir la actividad de la GalT-2 poniendo en contacto la célula que responde a GalT-2 o LacCer con una cantidad eficaz de un compuesto inhibidor de la GalT-2 tal como D-PDMP. Además se describen métodos terapéuticos de inhibición de la proliferación celular no deseada administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto inhibidor de GalT-2 específico. Según la presente invención, se ha encontrado que determinados enantiómeros L de D-PDMP (por ejemplo, L-PDMP) pueden estimular de manera eficaz la GalT-2 y aumentar la proliferación y adhesión en las células que responden a LacCer.
Los métodos terapéuticos descritos en el presente documento comprenden generalmente la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto potenciador de la GalT-2 a un sujeto que necesita tal tratamiento, tal como un mamífero, y particularmente un primate tal como un ser humano. Los métodos de tratamiento de la invención comprenden también la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula 1 tal como se define en el presente documento a un sujeto, particularmente un mamífero tal como un ser humano que necesita tal tratamiento para una indicación descrita en el presente documento.
Los sujetos típicos incluyen mamíferos que padecen o son propensos a isquemia, es decir, isquemia cuyo desarrollo o gravedad puede tratarse o prevenirse aumentando la proliferación, quimioatracción o adhesión de determinadas células. Ejemplos ilustrativos de tales estados incluyen la reparación tisular tras heridas (por ejemplo, después de cirugía, después de una exposición térmica tal como quemadura, o injerto) y/o pérdida de piel debida a riesgos medioambientales tales como calor o frío extremos, luz UV u otra radiación, productos químicos, etc.; malformación vascular particularmente en embriones o animales no adultos; angiogenésis; y vasculogenésis. También se contemplan enfermedades afectadas por la adhesión o proliferación celular deficiente tales como trastornos de la coagulación sanguínea, úlceras tales como úlceras de decúbito y diabéticas; trastornos neurodegenerativos tales como enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (es decir, ELA o "enfermedad de Lou Gehrig"), enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, trastornos de copnvulsiones graves incluyendo epilepsia, disautonomía familiar, y trastornos relacionados con la isquemia. Los trastornos neurodegenerativos en particular que pueden tratarse o prevenirse según la invención incluyen lo que afectan al ojo, por ejemplo, distrofia de Fuch, amaurosis congénita de Leber, distrofias de conos/bastones, esclerosis coroidea areolar central, atrofia girata, coroideremia, retinitis pigmentosa, y distrofias maculares relacionadas con la edad, particularmente las patologías maculares que afectan a los ancianos.
En el presente uso puede emplearse una variedad de compuestos potenciadores de GalT-2. Pruebas simples, por ejemplo, en un ensayo in vitro convencional tal como se definió anteriormente, pueden identificar fácilmente los compuesto potenciadores de GalT-2 adecuados. Los compuestos potenciadores de GalT-2 preferidos incluyen los que contienen una estructura principal de propanol. Generalmente se prefieren para su uso en la composición farmacéutica de la invención compuestos levógiros de la siguiente fórmula 1:
2
en la que:
R y R^{1} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C_{1}-C_{6} de cadena lineal o ramificado con o sin un sustituyente tal como amino, hidroxilo o mercapto y en la que además R y R^{1} pueden tomarse juntos para formar un sustituyente de anillo de 5, 6 ó 7 miembros tal como pirrolidino, morfolino, tiomorfolino, piperidino, azacicloheptilo y similares;
R^{2} se selecciona del grupo que consiste en alquilo C_{6}-C_{30} de cadena lineal o ramificado con o sin de uno a tres dobles enlaces; y
R^{3} se selecciona del grupo que consiste en alquilo C_{6}-C_{20} de cadena lineal o ramificado con o sin de uno a tres dobles enlaces y arilo tal como arilo carbocíclico (por ejemplo, fenilo), o arilo sustituido tal como arilo carbocíclico (por ejemplo, fenilo), en el que el sustituyente es halógeno, alcoxilo C_{1}-C_{4}, metilendioxilo, mercapto C_{1}-C_{4}, amino o amino sustituido en el que los sustituyentes de amino pueden ser de manera adecuada alquilo C_{1}-C_{4}.
Los compuestos adecuados de fórmula I anterior y otros compuestos potenciadores de GalT-2 pueden prepararse fácilmente mediante procedimientos conocidos o pueden obtenerse a partir de fuentes comerciales.. Véanse, por ejemplo, Abe, A. y otros (1992) J. Biochem. 111:191-196; Inokuchi, J. y otros (1987) J. Lipid Res. 28:565-571; Shukla, A. y otros (1991) J. Lipid Res. 32:73; Vunnam, R.R. y otros (1980) Chem. and Physics of Lipids 26:265; Carson, K. y otros (1994) Tetrahedron Lets. 35:2659; y Akira, A. y otros (1995) J. Lipid Research 36:611 y Chatterjee, citado anteriormente.
Tal como se indicó previamente, el término "levógiro" se usa en el presente documento para describir los compuestos representados por la fórmula I anterior que tienen capacidad para hacer rotar la luz polarizada en el sentido L o (-), es decir, en sentido contrario a las agujas de reloj. La rotación de la luz polarizada se mide normalmente mediante el uso de un polarímetro y la mayoría de las veces se expresa como grados de rotación específica (es decir [\alpha]_{D}). La rotación específica de cualquier compuesto representado por la fórmula I anterior, se define en el presente documento como la rotación observada de la luz polarizada plana a 589 nm (línea D del sodio) en una trayectoria de muestra (1 decímetro de longitud) y una concentración de muestra de (1 g/mL). Puede usarse una variedad de disolventes ópticamente inactivos como controles adecuados, tales como agua o acetona. Véase McMurry, J. en Organic Chemistry 3ª edición (1992) Brooks Cole Publishing Co., Pacfic Grove, CA.
En una composición farmacéutica usada en la invención, puede administrarse un compuesto de tratamiento a un sujeto en cualquiera de varias vías, incluyendo por vía intracorporal o por vía tópica. Adicionalmente, puede administrarse un compuesto potenciador de la GalT-2 como un profiláctico para prevenir la aparición de o reducir la gravedad de un estado objetivo. Alternativamente, puede administrarse un compuesto potenciador de la GalT-2 durante el transcurso de un estado objetivo, por ejemplo, para ayudar a aliviar los síntomas.
Puede administrarse un compuesto de tratamiento a un sujeto, o bien solo o bien en combinación con uno o más agentes terapéuticos, tales como una composición farmacéutica en mezclada con un excipiente convencional, es decir sustancias vehículo inorgánicas u orgánicas farmacéuticamente aceptables adecuadas para aplicación parenteral, enteral o intranasal que no reacciona que no reaccionan de manera perjudicial con los principios activos y que no son perjudiciales para el receptor de las mismas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen pero no se limitan a agua, disoluciones salinas, alcohol, aceites vegetales, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, aceite perfumado, diglicéridos y monoglicéridos de ácido graso, ésteres de ácido graso de petroetral, hidroximetil-celulosa, polivinilpirrolidona, etc. Las preparaciones farmacéuticas pueden esterilizarse si se desea mezcladas con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes, aromatizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no reaccionan de manera perjucial con los principios activos.
Tales composiciones pueden prepararse para su uso en la administración parenteral, particularmente en forma de suspensiones o disoluciones líquidas; para la administración oral, particularmente en forma de comprimidos o cápsulas; por vía intranasal, particularmente en forma de polvos, gotas nasales, o aerosoles; por vía vaginal; por vía tópica, por ejemplo en forma de crema; por vía rectal, por ejemplo como supositorios; etc.
Los agentes farmacéuticos pueden administrarse de manera conveniente en forma farmacéutica unitaria y pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en las técnicas farmacéuticas, por ejemplo, tal como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980). Las formulaciones para la administración parenteral pueden contener como excipientes comunes tales como solución salina o agua estéril, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. En particular, el polímero de lactida biocompatibles, biodegradables, copolímero de lactida/glicolida, o copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno pueden ser excipientes útiles para controlar la liberación de determinados compuestos potenciadores de GalT-2.
Otros sistemas de administración parenteral potencialmente útiles incluyen partículas de copolímero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables, y liposomas. Las formulaciones para la administración por inhalación contienen como excipientes, por ejemplo, lactosa, o pueden ser disoluciones acuosas que contienen, por ejemplo, lauril éter de polioxietileno 9, glicocolato y desoxicolato, o disoluciones aceitosas para la administración en forma de gotas nasales, o como gel para aplicarse por vía intranasal. Las formulaciones para administración parenteral pueden también incluir glicocolato para administración bucal, metoxisalicilato para administración rectal, o ácido cítrico para administración vaginal. Otros sistemas de administración administrarán el/los agente(s) terapéutico(s) directamente en un sitio quirúrgico, por ejemplo, después de angioplastia de balón puede administrarse un compuesto potenciador de la GalT-2 mediante el uso de endoprótesis vasculares.
Puede realizarse la administración intraocular según se necesite, por ejemplo implantando un dispositivo que pueda liberar uno o más compuestos potenciadores de la GalT-2. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense número 5.618.553 para la descripción relativa a dispositivos de implantes intraoculares.
Puede emplearse un compuesto potenciador de la GalT-2 en la presente composición farmacéutica como el único agente farmacéutico activo o puede usarse en combinación con otros principios activos, por ejemplo, factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF); neurotrofinas, por ejemplo el factor de crecimiento nervioso (NGF); una citocina; y determinadas proteínas de baja densidad tales como LDL-ox y/o derivados de fosfotidilcolina oxidados tales como derivado de 1-palmitoil-2-(5-oxovaleril)-sn-glicerol-3-fosfocolina (POVPC) de ADC mínimamente modificado.
La concentración de uno o más compuestos de tratamiento en una composición terapéutica variará dependiendo de varios factores, incluyendo la dosificación del compuesto potenciador de la GalT-2 que va a administrarse, las características químicas (por ejemplo, hidrofobicidad) de la composición empleada, y el modo y vía de administración previsto. En términos generales, pueden proporcionarse uno o más de los compuestos potenciadores de la GalT-2 en una disolución tampón fisiológica acuosa que contiene aproximadamente del 0,1 al 10% p/v de un compuesto para administración parenteral.
Se apreciará que las cantidades preferidas reales de los compuestos activos usados en una tratamiento dado variarán según, por ejemplo, el compuesto específico que se está utilizando, la composición particular formulada, el modo de administración y las características del sujeto, por ejemplo la especie, sexo, peso, salud general y edad del sujeto. Las tasas de administración óptimas para un protocolo de administración dado pueden determinarse fácilmente por los expertos en la técnica usando pruebas de determinación de la dosificación convencionales realizadas con respecto a las directrices precedentes. Los intervalos de dosis adecuados pueden incluir desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día.
Los compuestos terapéuticos de la invención se administran adecuadamente en forma protonada y soluble en agua, por ejemplo, como una sal farmacéuticamente aceptable, normalmente una sal de adición de ácido tal como una sal de adición de ácido inorgánico, por ejemplo una sal de clorhidrato, sulfato, o fosfato, o como una sal de adición de ácido orgánico tal como una sal de acetato, maleato, fumarato, tartrato, o citrato. Las sales terapéuticamente aceptables de los compuestos terapéuticos de la invención pueden incluir también sales de metales, particularmente sales de metales alcalinos tales como una sal de sodio o una sal de potasio; sales de metales alcalinotérreos tales como una sal de magnesio o calcio; sales de amonio tales como una sal de amonio o tetrametilamonio; o sales de adición de aminoácidos tales como una sal de lisina, glicina, o fenilalanina.
Los compuestos potenciadores de la GalT-2 preferidos muestran una actividad significativa en un ensayo de proliferación celular convencional. Preferiblemente, el compuesto potenciador de la GalT-2 promueve la proliferación celular en al menos del 10 al 25%, preferiblemente al menos aproximadamente en el 50%, en relación a un ensayo de control adecuado. En un ensayo de este tipo, se usa entre aproximadamente de 0,1 a 100 \muM, preferiblemente entre aproximadametne de 1 a 50 \muM de un compuesto potenciador de la GalT-2 deseado. Los ensayos de proliferación celular a modo de ejemplo incluyen el recuento de células viables y el monitorización de la actividad de enzimas del ciclo del ácido cítrico tales como la lactato deshidrogenasa. Un ensayo preferido mide la incorporación de uno o más nucleótidos marcados de manera detectable en el ADN, por ejemplo:
a) cultivando células adecuadas en el medio y añadiendo 1) un compuesto potenciador de la GalT-2 candidato y 2) un nucleósido radiomarcado tal como ^{3}H-timidina normalmente en una cantidad entre aproximadamente de 0,1 a 100 \muCi;
b) incubando las células, por ejemplo, durante aproximadamente 6-24 horas, y normalmente seguido por lavado; y
c) midiendo la incorporación del nucleósido radiomarcado en el ADN durante ese tiempo en relación a un cultivo de control que se prepara y se incuba bajo las mismas condiciones que el cultivo de ensayo pero que no incluye el posible compuesto potenciador de la GalT-2. La medición puede lograrse mediante varios métodos incluyendo precipitación con ácido tricloroacético (TCA) del ADN marcado sobre filtros seguido por recuento de centelleo. Véanse, por ejemplo, Chatterjee, S., Biochem. Biophys. Res Comm. (1991) 181:554; Chatterjee, S. y otros (1982) Eur. J. Biochem. 120:435 para la descripción relativa a este ensayo.
Las referencias en el presente documento a un "ensayo de proliferación celular in vitro convencional" u otra frase similar se refieren a un ensayo que incluye las etapas anteriores a) a c). Un ejemplo preferido de un ensayo de proliferación celular usa células del músculo liso de la aorta (ASMC), particularmente las obtenidas de un ser humano, vaca o un conejo. Un protocolo adecuado implica preparar ASMC según métodos convencionales y cultivar las mismas en placas de microtitulación en un medio adecuado tal como F-10 de Ham. Se diluye entonces en el medio un compuesto potenciador de la GalT-2 deseado, preferiblemente hasta una concentración final de entre aproximadamente 1 a 100 \mug, más preferiblemente entre de aproximadamente 1 a 50 \mug por ml de medio o inferior seguido de un periodo de incubación de entre aproximadamente 1-5 días, preferiblemente aproximadamente 1 día o inferior. Tras la incubación, puede realizarse una proliferación celular convencional, por ejemplo, la incorporación de timidina tritiada o el ensayo de lactato deshidrogenasa tal como se mencionó anteriormente. Los ensayos se realizan preferiblemente por triplicado con una variación de entre el 5% al 10%. Véanse, por ejemplo, Ross, R. J Cell. Biol. (1971) 50: 172; Chatterjee, S. y otros (1982) Eur. J. Biochem. 120:435; Bergmeyer, H.V. In Principles of Enzymatic Analysis. (1978) Verlag Chemie, NY; y la solicitud de patente estadounidense en tramitación junto con la presente con número de serie 08/998.262 presentada el 24 de diciembre de 1997 y la solicitud PCT PCT/US98/09958.
Adicionalmente, los compuestos potenciadores de la GalT-2 preferidos muestran una actividad significativa en un ensayo de adhesión celular convencional. Preferiblemente, el compuesto potenciador de la GalT-2 aumenta la adhesión celular en al menos el 25%, preferiblemente al menos en el 50% o más en relación a un ensayo de control adecuado. En un ensayo de este tipo, se usa entre aproximadamente de 0,1 a 100 \muM, preferiblemente entre aproximadamente de 1 a 50 \muM de un compuesto potenciador de la GalT-2 deseado. Por ejemplo, un ensayo de adhesión celular preferido incluye las siguientes etapas:
a) marcar una primera población de células inmunitarias, preferiblemente determinados leucocitos, con un marcador detectable que puede ser un marcador cromático, radiactivo, luminiscente (por ejemplo, fluorescente o fosforescente), o enzimático que pueda producir una marca detectable,
b) poner en contacto la primera población de células con una segunda población de células endoteliales marcadas de manera detectable, por ejemplo con un marcador cromático, radiactivo, luminiscente (por ejemplo, fluorescente o fosforescente), o enzimático preferiblemente diferente del marcador empleado en la etapa a), y
c) detectar cualquier adhesión entre la primera y segunda población de células.
Las referencias en el presente documento a un "ensayo de adhesión celular in vitro convencional" u otra fase similar se refieren a un ensayo que incluye las etapas anteriores a) a c). La detección en la etapa c) puede lograrse mediante una diversidad de métodos tales como microscopía (mediante recuento manual de las células), particularmente microscopía confocal y fotomicroscopía basada en fluorescencia que implica FACS; técnicas de clasificación celular automatizadas, métodos inmunológicos tales como ELISA y RIA; y recuento de centelleo. Véanse los ejemplos a continuación en la solicitud de patente estadounidense en tramitación junto con la presente con número de serie 08/998.262 presentada el 24 de diciembre de 1997 y la solicitud PCT PCT/US98/09958 para la descripción relativa a los ensayos de adhesión celular preferidos.
Un ensayo de adhesión celular in vitro preferido mide los leucocitos polimorfonucleares (PMN y/o monocitos) o plaquetas y el aumento de la adhesión de células endoteliales antes, durante o después del contacto con un compuesto potenciador de la GalT-2 deseado. Los PMN o monocitos pueden recogerse y purificarse según métodos convencionales detallados a continuación. Los PMN o monocitos se marcan después mediante incubación con un colorante fluorescente adecuado tal como colorante fluorescente de Cell Tracker (por ejemplo, verde) o Calcein-Am. Aproximadamente en el mismo momento, se pone en contacto una monocapa de células endoteliales preparada según métodos de cultivo celular convencionales en un sustrato adecuado tal como un portaobjetos o una placa petri de plástico esterilizada con el compuesto potenciador de la GalT-2 lavado y marcado con otro colorante fluorescente tal como colorante fluorescente de Cell Tracker (por ejemplo, naranja). Se incuban entonces los PMN o monocitos y células endoteliales durante aproximadamente entre 10 minutos y una pocas horas, preferiblemente aproximadamente 30 minutos a 37ºC. Luego se eliminan por lavado del portaobjetos las células que no adheridas con un tampón fisiológicamente aceptable tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se cuantifican entonces las células que se adhieren mediante métodos convencionales tal como mediante el uso de un lector de placas fluorescente. El número de células adheridas sobre el portaobjetos puede cuantificarse de varias formas incluyendo la expresión del número de PMN/mm^{2} sobre la monocapa de células endoteliales. Alternativamente, pueden cuantificarse las células que se adhieren mediante la inspección tras la fotomicroscopía y pueden visualizarse y fotografiarse por microscopía. Se evalúa entonces la adherencia celular mediante inspección de la fotomicrografía. Véanse los ejemplos que siguen.
Se prefieren particularmente ensayos de GalT-2 realizados con las ASMC y realizados en general según los métodos descritos anteriormente. Véanse, por ejemplo, Chatterjee, S., y Castiglione, E. (1987) Biochem. Biophys. Acta, 923:136; y Chatterjee, (1991) S. Biochem. Biophys. Res Comm., 181:554.
Adicionalmente los ensayos de adhesión celular in vitro preferidos incluyen la detección inmunológica de moléculas de adhesión sobre PMN usando anticuerpos específicos, particularmente monoclonales, que pueden unirse específicamente a las moléculas de adhesión. Un ensayo particularmente preferido implica citometría de flujo.
Los ensayos de adhesión in vitro descritos anteriormente son compatibles con el análisis de una diversidad de moléculas de adhesión específicas tales como ICAM-1 (molécula de adhesión intracelular I), Mac-1 (CD11b/CD18), LFA-1 y selectina E.
Otro ensayo in vitro preferido controla específicamente la formación de LacCer como indicativo de la actividad de la enzima Galt-2 e incluye las siguientes etapas a) a d):
a) cultivar una población de células que responden a LacCer preferiblemente hasta la confluencia en medio con suero deficiente en lipoproteína, por ejemplo aproximadamente 1 mg de suero deficiente en lipoproteína/proteína/ml de medio o menos;
b) recoger las células preferiblemente en un tampón dispersivo adecuado, por ejemplo, tampón de cacodilato;
c) incubar la células recogidas preferiblemente con una molécula marcada de manera detectable tal como un donador de azúcar de nucleósido difosfato marcado de manera detectable tal como [^{14}C]-UDP-galactosa normalmente en una cantidad de aproximadamente entre 0,1 y 100 \muCi; y
d) medir la formación de LacCer como indicativo de la actividad de la enzima GalT-2.
El ensayo de las etapas a) a d) anterior se denomina algunas veces en el presente documento como "ensayo de la enzima GalT-2" o un término similar. Preferiblemente, el compuesto potenciador de la GalT-2 aumenta la actividad de la enzima GalT-2 en al menos aproximadamente el 10% preferiblemente al menos aproximadamente el 25%, 50%, 75% o más en relación a un ensayo de control adecuado.
Además los compuestos potenciadores de la GalT-2 preferidos adicionales incluyen los que muestran al menos un aumento de 2 a 5 veces mayor en la actividad de la GalT-2 en relación con GlcT-1 tal como se mide mediante el ensayo enzimático de GalT-2 o ensayos enzimáticos de GlcT-1 convencionales. Son más preferidos los compuestos potenciadores de la GalT-2 que muestran al menos un aumento de 5 a 10 veces mayor en la actividad de la GalT-2 en relación con el potenciamiento de GlcT-1, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente de 10 a 50 veces. Se han notificado métodos para medir la actividad de la GlcT-1. Véase, por ejemplo, Carson, K., y Ganem, B. citado anteriormente; Shukla, A. y Radin., N.S. J. Lipid. Res. 32:713.
Los compuestos potenciadores de la GalT-2 particularmente preferidos incluyen los que pueden potenciar específicamente la actividad de la enzima GalT-2. Es decir, el compuesto potenciador de la Galt-2 proporciona una estimulación relativamente pobre de otras enzimas tales como hidroxiceramida galactosiltransferasa, glucocerebrósido glucosidasa, y particularmente GlcT-1. De manera significativa, el compuesto potenciador de la GalT-2 debe evitar efectos farmacológicos no deseados que podrían surgir de la inhibición no selectiva de otras enzimas relacionadas con GSL. Los ejemplos de tales compuestos potenciadores de la GalT-2 preferidos son los que potencian o estabilizan de otra manera la formación de un estado de transición de GalT-2.
En la mayoría de los casos, los ensayos descritos anteriormente de manera general usarán células que responden a LacCer conocidas y se cultivarán en un medio adecuado para mantener las células en el ensayo, por ejemplo medio esencial mínimo de Eagles (HMEM) o medio F-10 de Ham.
Los ensayos in vitro de la invención son particularmente útiles para la evaluación posterior de compuestos potenciadores de la GalT-2 que muestran una actividad adecuada en un ensayo in vitro tal como los descritos anteriormente. Se prefiere un modelo de reestenosis de conejo que acompaña a un procedimiento quirúrgico invasivo tal como angioplastia de balón. Un protocolo adecuado implica la administración al animal de un vehículo adecuado o un vehículo combinado con uno o más compuestos potenciadores de la GalT-2 de interés. La cantidad del compuesto potenciador de la GalT-2 administrado variará dependiendo de diversos parámetros que incluyen el grado de daño asociado con el procedimiento quirúrgico de interés. En los casos en los que se emplea angioplastia de balón, el conejo recibirá normalmente un compuesto potenciador de la Galt-2 candidato en una dosis (por ejemplo, i.m o i.p.) de aproximadamente entre 0,5 y 100, preferiblemente de 1 a 20 y más peferiblemente de entre 10 mg/kg de peso corporal del conejo. Un programa de dosificación preferido provee la administración de un compuesto potenciador de la GalT-2 comenzando 24 horas antes de realizar un procedimiento quirúrgico invasivo, y continuando después la administración del compuesto potenciador de la Galt-2 durante 15 días tras el procedimiento quirúrgico. En otros protocolos, pueden realizarse inyecciones diarias del compuesto potenciador de la Galt-2 durante aproximadamente de 2 a 12 semanas tras el procedimiento quirúrgico invasivo. Se prefieren generalmente inyecciones diarias, por ejemplo i.m. o i.p., del compuesto potenciador de la GalT-2. Posteriormente, se sacrifican los conejos y se extrae un vaso para el examen, preferiblemente la aorta. Se fija entonces el vaso con formalina y se analiza la proliferación de endotelio, medios y adventicia vascular usando procedimientos histológicos convencionales. Preferiblemente, la administración del compuesto potenciador de la GalT-2 aumentará la proliferación celular de la íntima, por ejemplo, epitelio de SMC o células relacionadas en al menos aproximadamente el 10%, 20%, 40%, 50%, 70%, 100% hasta aproximadamente el 200% o superior en este ensayo.
El término "procedimiento quirúrgico invasivo" significa una técnica médica o veterinaria asociada con una lesión significativa en el endotelio de un vaso que choca por ejemplo con un órgano tal como el corazón, hígado o el riñón, o una extremidad. Tal vaso comprende la aorta, el vaso coronario, las venas y arterias iliaca y femoral. El procedimiento quirúrgico invasivo puede estar asociado con técnicas que implican, por ejemplo, cirugía cardiaca, cirugía abdominotorácica, cirugía arterial, utilización de un implante (por ejemplo una endoprótesis vascular o catéter), o andarterectomía. Un procedimiento quirúrgico invasivo preferido en la angioplastia, particularmente la angioplastia de balón. Preferiblemente, el procedimiento quirúrgico invasivo se realiza en un mamífero tal como un primate, particularmente un ser humano, roedor o un conejo, o un animal doméstico tal como un cerdo, perro o gato.
Se cree que la angiogénesis y los procesos relacionados implican una proliferación celular significativa, particularmente de SMC, que conduce a la formación de brotes de células endoteliales y bucles vasculares. Adicionalmente los ensayos preferidos son los que pueden monitorizar la angiogénesis antes y después de la administración de un compuesto según esta invención. En particular, puede evaluarse y cuantificarse la angiogénesis (si se desea) mediante el uso de modelos animales previamente caracterizados de isquemia de las extremidades traseras. Adicionalmente, los modelos animales conocidos relacionados con la monitorización cuantitativa de la angiogénesis son los que implican lesión a los vasos infligida mediante cirugía invasiva tal como se describió anteriormente. En particular, se conocen en el campo métodos convencionales de cuantificación angiográfica de la femoral y otras arterias grandes y pueden realizarse en roedores y otros modelos animales. Véanse, por ejemplo, LeFree, y otros Proc. SPIE, 626: 334-331 (1986); Mancini, y otros Circulation, 75: 452-460 (1987); y Folkman J. y otros J. Biol. Chem. 267L: 10931 (1992) y referencias citadas en los mismos para la descripción relativa a estos métodos. Los compuestos potenciadores de la GalT-2 pueden aumentar la angiogénesis tal como se mide, por ejemplo, evaluando los diámetros luminales angiográficos, en al menos aproximadamente el 5%, preferiblemente en el 10%, 20%, 50% hasta aproximadamente el 100% cuando se compara con un control adecuado.
Se ha notificado que la potenciación de la angiogénesis es beneficiosa en el tratamiento o prevención de una diversidad de estados tales como isquemia cerebrovascular, isquemia renal, isquemia pulmonar, isquemia de las extremidades, cardiomiopatía isquémica, isquemia miocárdica y estados relacionados. Por consiguiente, los compuestos potenciadores de la GalT-2 de esta invención son útiles en el tratamiento o la prevención de estos estados y relacionados.
Los ensayos in vivo adicionalmente preferidos son los que miden la función de SNC y/o SNP de animales de prueba tales como un primate, roedor, conejo y similares. Por ejemplo, pueden medirse la percepción, cognición y visión mediante una diversidad de métodos convencionales en modelos de animales y particularmente en pacientes humanos. En particular, puede monitorizarse y cuantificarse la degeneración macular en el ojo, si se desea, mediante pruebas fotográficas bien conocidas, por ejemplo, fotografía del fondo de ojo, angiografía con fluoresceína, y similares para clasificar lesiones maculares antes y después de la administración de un compuesto potenciador de la GalT-2 deseado. Pueden realizarse pruebas adicionales bien conocidas tales como ensayos de la función de recuperación macular, sensibilidad del campo visual central, sensibilidad de contraste espaciotemporal, y la prueba Farnsworth-Munsell de 100 tonos para evaluar la eficacia de los compuestos en los pacientes.
Se describen en el presente documento métodos para detectar y analizar compuestos potenciadores de la GalT-2 con capacidad terapéutica para tratar o prevenir la isquemia. Se considera adecuadamente que una enfermedad está modulada por LacCer si las células o tejidos afectados aumentan la actividad de la GalT-2 en aproximadamente de 2 a 50 veces, normalmente de aproximadamente 2 a 10 veces, y más normalmente de aproximadamente 2 a 5 veces superior a la de las células o tejidos de control (no afectados). Puede medirse la actividad de la GalT-2 mediante métodos a los que se ha hecho referencia en el presente documento. Sin estar limitado por la teoría, parece que el aumento de la actividad de la GalT-2 produce cantidades sustanciales de LacCer. Se cree que LacCer potencia la aparición de o contribuye a los estados mencionados, particularmente aumentado la proliferación o adhesión celular.
Tal como se declara de manera general, se ha descubierto que las etapas novedosas relacionadas con LacCer descritas en el presente documento relacionan cambios en la actividad de la GalT-2 con la proliferación o adhesión celular en células que responden a a LacCer. Se ha determinado que las etapas relacionadas con LacCer pueden agruparse en aquéllas que modulan la proliferación y adhesión celular. Se ha descubierto que las etapas relacionadas con LacCer incluyen una diversidad de moléculas identificadas tales como enzimas, factores citosólicos, factores nucleares, especies radicales y proteínas de adhesión específicos. Los ejemplos más particulares de tales moléculas en las etapas bioquímicas relacionadas con Lac-Cer incluyen proteínas de unión a GTP, cinasas, factores citosólicos, factores nucleares, factores de transcripción, y especies de oxígeno, particularmetne especies de oxígeno reactivas (denominadas algunas veces en el presente documento "EOR" o "MOR").
Los métodos de detección se conforman para incluir una o más etapas asociadas con las rutas relacionadas con LacCer. Más particularmente, los métodos de detección incluyen etapas específicas que miden la actividad de moléculas que actúan para modular la proliferación o adhesión celular. En algunos casos, una molécula particular actuará para inhibir tanto la proliferación como la adhesión celular a través de una ruta relacionada con LacCer.
Las etapas relacionadas con LacCer se encuentran normalmente en células que responden a LacCer. Una célula que resonde a LacCer puede ser una línea celular inmortalizada o un cultivo primario de células (por ejemplo, obtenidas a partir de un tejido u órgano) que manifiestan un cambio en una o más moléculas o funciones celulares específicas tales como proliferación o adhesión, tras el contacto con una cantidad adecuada de LacCer.
Más específicamente, una o una combinación de estrategias pueden identificar una célula de mamífero que responde a LacCer. Por ejemplo, en un enfoque, se siembran aproximadamente 1 x 10^{5} células en placas petri en un medio de crecimiento adecuado. Para cultivos primarios de células, se obtiene un tejido u órgano deseado de un animal y se dispersa según métodos conocidos (por ejemplo, mediante sonicación, agitación mecánica y/o exposición a agentes dispersantes conocidos en la técnica, por ejemplo, detergentes y proteasas). Después de uno o unos cuantos días, se retira el medio de crecimiento de la placa petri y se lavan las células con solución salina tamponada con fosfato. Se preparan entonces las células en un medio adecuado durante aproximadamente de 1 a 5 horas, momento en el que se añade LacCer al cultivo. La cantidad de LacCer añadida dependerá de varios parámetros tales como el tipo de célula o tejido particular que se esta sometiendo a prueba. Sin embargo, en la mayoría de los casos, se añadirá LacCer al cultivo a una concentración de entre aproximadamente 1 \mug y 1 mg, preferiblemente de entre aproximadamente 1 \mug y 500 \mug, y más preferiblemente de entre aproximadamente 1 \mug y 50 \mug por ml de medio de cultivo. Después de exponer las células a LacCer durante entre aproximadamente de 1 y 60 minutos, preferiblemente entre aproximadamente 1 y 10 minutos o menos, se retira el medio y se lisan las células en un tampón de lisis adecuado tal como los descritos en detalle a continuación. Entonces, se someten a ensayo las células según cualquiera de los métodos descritos en el presente documento para determinar la respuesta a LacCer añadido.
Las células de mamíferos que responden a LacCer particularmente preferidas incluyen células asociadas con la vasculatura de un órgano o extremidad, particularmente células cardiacas o renales, por ejemplo células endoteliales y células del músculo liso. Se prefieren adicionalmente neuronas y células relacionadas. Más particularmente, células ASMC humanas (denominadas algunas veces en el presente documento H-ASMC para indicar el origen humano) y endoteliales. También se prefieren ciertas células inmunitarias tales como glóbulos blancos, particularmente PMN y monocitos.
Los compuestos potenciadores de la GalT-2 preferidos también incluyen los que muestran una buena capacidad para modular una o más moléculas específicas en una etapa relacionada con LacCer tras la exposición a LacCer. Los compuestos particularmente preferidos muestran al menos el 20%, preferiblemente al menos el 50% y más preferiblemente al menos el 90% o más de un aumento en la actividad de la molécula (en relación con un ensayo de control adecuado) a una concentración de entre aproximadamente 0,1 y 100 \mug/ml, preferiblemente de entre aproximadamente 1 y 10 \mug/ml en un ensayo de detección in vitro. La actividad de las moléculas puede aumentar (o algunas veces disminuir tal como se describió anteriormente) de cualquiera de varias formas fácilmente detectables incluyendo síntesis, degradación o almacenamiento alterados; modificación de proteínas, por ejemplo fosforilación, o a través de un efecto alostérico como con ciertas enzimas.
En particular, si la molécula de interés es una enzima, los compuestos potenciadores de la GalT-2 preferidos incluyen los que muestran una buena actividad en un ensayo enzimático tal como se describe a continuación. Preferiblemente, una CE_{50} en tal ensayo es aproximadamente de 1 \muM o inferior, más preferiblemente una CE_{50} de aproximadamente 0,001 \muM o inferior.
Se realiza a medida generalmente un experimento de control para su uso en un ensayo particular. Por ejemplo, la mayoría de los experimentos de control implican someter una muestra de prueba (por ejemplo, una población de células que responden a LacCer o un lisado de las mismas) a medio, solución salina, tampón o agua en lugar de un posible compuesto potenciador de la GalT-2 en paralelo a las células que reciben una cantidad del compuesto de prueba. Se realiza entonces un ensayo deseado según los presentes métodos. Se describen a continuación ejemplos específicos de experimentos de control adecuados.
Los presentes métodos de detección también pueden usarse para identificar compuestos potenciadores de la GalT-2 obtenidos a partir de fuentes biológicas, incluyendo factores de crecimiento específicos, citocinas, hormonas peptídicas y polipeptídicas y lipoproteínas (por ejemplo LDL-ox) que modulan la actividad de la GalT-2.
Los presentes métodos de detección incluyen además ensayos que miden la actividad de moléculas específicas en etapas bioquímicas relacionadas con LacCer. Pueden realizarse las mediciones mediante manipulaciones de laboratorio convencionales tales como ensayos de qumioluminiscencia, separaciones por cromatografía en capa fina (CCF) u otros métodos cromatográficos tales como HPLC, aislamiento y purificación de ácidos nucleicos, electroforesis en gel de SDS-PAGE, autorradiografía, recuento por centelleo, densitometría, inmunotransferencias de tipo Northern y Western, e inmunoensayos (por ejemplo, pruebas de RIA y ELISA). Véase de manera general Sambrook y otros en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed. 1989); y Ausubel y otros (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York para la discusión relativa a muchos de los métodos convencionales, cuyas descripciones se incorporan como referencia al presente documento.
En un aspecto, los presente ensayos in vitro miden la actividad de ciertas enzimas en células que responden a LacCer. Se ha descubierto que la actividad de las enzimas se modula tras la exposición de las células a LacCer y/o un compuesto potenciador de la GalT-2 específico tal como L-PDMP, liproproteína oxidada (LDL-ox), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), y factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha).
En particular, se ha descubierto que L-PDMP aumenta la actividad de la GalT-2 y puede usarse para someter a prueba el efecto sobre otras enzimas según los métodos descritos en el presente documento. Los ensayos in vitro descritos en el presente documento pueden usarse para someter a prueba la actividad de estas enzimas, por ejemplo, enzimas redox específicas, proteínas de unión a nucleótidos, y cinasas tal como se describe a continuación.
Por ejemplo, un ensayo in vitro particular mide la actividad de una oxidasa que puede sintetizar una especie de oxígeno, particularmente una ROS tal como superóxido. Una enzima particularmente preferida es la NADPH oxidasa. La actividad de la NADPH oxidasa puede someterse a ensayo mediante métodos convencionales incluyendo el fraccionamiento de la enzima a partir de componentes celulares y midiendo después la actividad mediante un ensayo enzimático tal como los que emplean un método de quimioluminiscencia convencional.
Alternativamente, puede someterse a ensayo la NADPH oxidasa midiendo la producción de superóxido en células intactas. Normalmente, se realiza la medición en presencia de un veneno mitocondrial tal como KCN, un potenciador de la NADH oxidasa. Alternativamente, puede someterse a ensayo la actividad de la NADPH oxidasa en células que responden a LacCer intactas midiendo la producción de superóxido. La medición de superóxido puede realizarse de varias formas incluyendo la incubación de las células con un compuesto orgánico policíclico fotosensible (por ejemplo, un compuesto de acridilio). La reducción del compuesto policícliclo por el superóxido provoca la emisión de luz que puede detectarse mediante un contador de fotones convencional. Los métodos preferidos para medir la actividad de la NADPH oxidasa se describen en Bhunia, A.K. et al (1997) J. Biol. Chem. 275:15642.
Se proporcionan ensayos in vitro adicionales que miden una o más enzimas que se ha descubierto que están moduladas por LacCer y compuestos potenciadores de la GalT-2 descritos en el presente documento. Las enzimas incluyen proteína de unión a Ras-GTP, Raf-1, proteína cinasa activada por mitógeno (MAP) (MEK-2), y otras proteínas cinasas activadas por mitógeno tales como MAPK P44. Cada una de estas enzimas puede someterse a ensayo mediante uno o una combinación de métodos convencionales.
Por ejemplo, puede medirse la incorporación de un nucleósido trifosfato, particularmente un nucleósido trifosfato cíclico tal como nucleósido trifosfato de guanidina (GTP) en una proteína oncogénica tal como la proteína ras (es decir, carga de GTP en ras) mediante la proteína de unión a ras-GTP mediante varios enfoques distintos que incluyen la detección directa de la incorporación de nucleósidos trifosfato (por ejemplo, GTP) en Ras. Por ejemplo, en un enfoque, se marcan metabólicamente las células que responden a LacCer con ortofosfato radiactivo (por ejemplo, se marcan con ^{32}P) para marcar de manera detectable el GTP dentro de las células. Las células marcadas se incuban con LacCer seguido por un compuesto potenciador de la GalT-2 y se lavan y se lisan después en un tampón de lisis adecuado tal como RIPA (véase a continuación). Posteriormente, se separa el lisado celular en placas de CCF adecuadas. Se exponen las placas de CCF a la película de rayos X y se someten después a densitometría, si se desea, para cuantificar la incorporación del GTP en la proteína Ras. Se ha descrito un método preferido para detectar la carga de GTP en ras en Chatterjee, S. y otros (1997) Glycobiology, 7:703.
También se proporcionan métodos para medir la actividad de las enzimas Raf-1 y Mek-2. Por ejemplo, en un enfoque, las células que responden a LacCer se incuban con LacCer y un compuesto potenciador de la GalT-2, se lavan, y entonces se recogen después de aproximadamente 1 a 60 minutos, preferiblemente de 1 a 10 minutos o menos, tras la exposición a LacCer. Se preparan lisados de células completas y después se someten a electroforesis en gel de SDS-PAGE convencional. Se transfieren los geles a un soporte de membrana adecuado y después se tratan con sonda con anticuerpo anti-RAF-1 o anti-MEK según los procedimientos de hibridación de inmunotransferencia de tipo Western convencionales. Se describen ejemplos preferidos de ensayos para medir las enzimas Raf-1 y Mek-2 en Bhunia, A.K. y otros (1996) J. Biol. Chem., 271:10660.
Se proporcionan ensayos in vitro adicionales que miden la actividad de proteínas de unión a ADN, por ejemplo factores de transcripción tales como c-fos, o la proteína de unión a ADN del factor nuclear kb (NF-kB). Se ha descubierto sorprendentemente que estas proteínas de unión a ADN están moduladas por LacCer y un compuesto potenciador de la GalT-2. Las proteínas de unión a ADN pueden someterse a ensayo mediante varios enfoques convencionales.
Por ejemplo, puede medirse la actividad de la proteína de unión a ADN NF-kB mediante un ensayo de cambio de movilidad en gel de poliacrilamida convencional. Se realiza el ensayo en gel después de poner en contacto células que responden a LacCer con LacCer seguido por un posible compuesto potenciador de la GalT-2. Se prepara un lisado celular a partir de las células que responden a LacCer que se pone en contacto después con una secuencia de oligonucleótido que comprende (o consiste en) una secuencia de unión a ADN de NF-kB reconocida. Se incuba entonces la mezcla de reacción durante un tiempo suficiente para permitir que la proteína NF-kB y la secuencia de unión a ADN formen un complejo de unión específico. Se separa después el complejo de unión específico sobre un gel de poliacrilamida de SDS-PAGE que se seca posteriormente y se expone a una película de rayos X.
Los métodos in vitro adicionales adecuados para medir la modulación por LacCer y compuestos potenciadores de la GalT-2 incluyen monitorizar la expresión de factores de proliferación celulares (por ejemplo, ciclina). Un factor celular de proliferación preferido para tal análisis es un antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA o ciclina). En un enfoque adecuado, se incuban las células cultivadas con LacCer seguido por un compuesto potenciador de la GalT-2 y después se lavan con un tampón adecuado. Puede detectarse el PCNA en las células cultivadas (y cuantificarse si se desea) usando un anticuerpo monoclonal que puede unirse específicamente a PCNA (por ejemplo, anticuerpo PC10). Véase Sasaki, K. y otros (1993) Cytometry 14:876-882. Puede detectarse después el PCNA en las células mediante una diversidad de métodos inmunológicos que incluyen citometría de flujo o visualización inmunohistoquímica de secciones celulares fijadas.
Los compuestos potenciadores de la GalT-2 adicionalmente preferidos pueden inhibir la actividad de y reducir los niveles de ciertos glucoesfingolípidos de la serie globo particularmente GALNac1\rightarrow3Gal\alpha1\rightarrow4Gal\beta1\rightarrowGlcCer (a continuación en el presente documento "GbOse_{4}-Cer"). Pueden medirse los niveles celulares de GbOse_{4}-Cer mediante una diversidad de métodos que incluyen el siguiente método general (denominado a continuación en el presente documento "ensayo de GbOse_{4}-Cer"):
a) cultivar una población de células que responden a LacCer (por ejemplo, células del túbulo proximal de "riñón humano") preferiblemente hasta la confluencia en medio con suero deficiente en lipoproteína, por ejemplo, aproximadamente 1 mg de suero deficiente en lipoproteína/proteína/ml de medio o menos;
b) recoger las células, por ejemplo en un tampón dispersivo adecuado tal como tampón cocodilato; y
c) medir los GSL y particularmente GbOse_{4}-Cer como indicativos de la capacidad del compuesto potenciador de la GalT-2 conocido o candidato para inhibir la N-acetilgalactosaminiltransferasa.
El compuesto potenciador de la GalT-2 conocido o candidato puede añadirse en cualquiera de las etapas a) a c) del ensayo de GbOse_{4}-Cer, aunque generalmente se prefiere que el compuesto se añada durante la incubación con el medio con suero deficiente en lipoproteína. Pueden medirse y cuantificarse los GSL que incluyen GbOse_{4}-Cer mediante una diversidad de métodos que incluyen cromatografía, por ejemplo cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC); junto con patrones de GSL adecuados (obtenidos, por ejemplo, de Sigma, St. Louis, MO). Preferiblemente, el compuesto potenciador de la GalT-2 tiene una CI_{50} de al menos aproximadamente 10 \muM en el ensayo de GbOse_{4}-Cer, más preferiblemente una CI_{50} de aproximadamente 1 \muM o menos, aún más preferiblemente una CI_{50} de aproximadamente 0,001 \muM o menos en el ensayo. Véase, por ejemplo, Chatterjee, S., y otros (1982); J. Lipid Res 23:513-22; Ullman, M.D., et al (1977) J. Lipid Res. 18:371-78; BASU, M. y otros (1987) Methods Enzm. 138: 575-607; Chatterjee. S. y otros (1988), J. Bid Cler 263:13017-23 y Chatterjee, S. y otros Glycoconjugate J. (1996) 13:481-486.
El siguiente ejemplo no limitante ilustra adicionalmente la invención.
Ejemplo 1
Se examinaron los efectos de L-PDMP y LDL-ox sobre la actividad de la MAPK. Se preincubaron cultivos confluentes de células del músculo liso aórtico humano durante 2 horas con L-PDMP (10 \muM). A continuación se añadió LDL-ox (10 \mug/ml) a las células. Tras la incubación durante 10 minutos a 37ºC, se recogieron las células y se midió la actividad de la MAP cinasa en los inmunoprecipitados. Se muestran los resultados en la figura 4 de los dibujos. Esos resultados representan los valores +DE de tres experimentos separados analizados por duplicado.
La invención se ha descrito en detalle con referencia a realizaciones preferidas de la misma. Sin embargo, se apreciará que los expertos en la técnica, tras considerar esta descripción, pueden hacer modificaciones y mejoras dentro del espíritu y alcance de la invención tal como se expone en las siguientes reivindicaciones.

Claims (15)

1. Uso de un compuesto potenciador de la GalT-2, en el que el compuesto es levógiro y está representado por la siguiente fórmula I:
3
en la que:
R y R^{1} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C_{1}-C_{6} de cadena lineal o ramificado con o sin un sustituyente, y además en la que R y R^{1} pueden unirse para formar un anillo de 5, 6 ó 7 miembros;
R^{2} se selecciona del grupo que consiste en alquilo C_{6}-C_{30} de cadena lineal o ramificado con o sin de uno a tres dobles enlaces; y
R^{3} se selecciona del grupo que consiste en alquilo C_{6}-C_{20} de cadena lineal o ramificado con o sin de uno a tres dobles enlaces y arilo o arilo sustituido en el que el sustituyente es halógeno, alcoxilo C_{1}-C_{4}, metilendioxilo, mercapto C_{1}-C_{4}, amino o amino sustituido en el que el sustituyente de amino puede ser alquilo C_{1}-C_{4};
para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de isquemia en un mamífero que padece o es propenso a la isquemia.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que la proliferación celular insuficiente es un diagnóstico de isquemia.
3. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la composición farmacéutica que comprende el compuesto potenciador de GalT-2 comprende además al menos un factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL-ox), factor de crecimiento transformador alfa (TNF-\alpha2) u otro compuesto potenciador de GalT-2, y estando la composición farmacéutica en forma de una única composición o en forma de dos o más composiciones separadas, comprendiendo cada composición al menos uno de compuesto potenciador de GalT-2, factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL-ox), factor de crecimiento transformador alfa (TNF-\alpha2) o u otro compuesto potenciador de GalT-2, o en forma de un kit que comprende al menos dos recipientes separados, comprendiendo cada recipiente una composición farmacéutica que comprende al menos uno de un compuesto potenciador de GalT-2, factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL-ox), factor de crecimiento alfa transformador (TNF-\alpha2) u otro compuesto potenciador de GalT-2.
4. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el compuesto potencia la proliferación celular en al menos el 25% en un ensayo de proliferación celular in vitro convencional.
5. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el compuesto potencia la adhesión celular en al menos el 25% en un ensayo de adhesión celular in vitro convencional.
6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el compuesto muestra una CE_{50} de aproximadamente 1 \muM o inferior en un ensayo enzimático de la GalT-2 in vitro convencional.
7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el compuesto muestra una CI_{50} de aproximadamente 0,001 \muM o inferior en un ensayo de GbOse_{4}-Cer in vitro convencional.
8. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que R y R^{1} se unen para formar un anillo de 5, 6 ó 7 miembros.
9. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que R y R^{1} se unen para formar un anillo de pirrolidino, morfolino, tiomorfolino, piperidino o azacicloheptilo.
10. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el compuesto es levógiro y se selecciona del grupo que consiste en:
1-fenil-2-decanoilamino-3-morfolino-1-propanol;
1-fenil-2-hexadecanoilamino-3-morfolino-1-propanol;
1-fenil-2-hexadecanoilamino-3-piperidino-1-propanol;
1-fenil-2-hexadecanoilamino-3-pirrolidino-1-propanol;
1-morfolino-2-hexadecanoilamino-3-hidroxioctadec-4,5-eno; y
1-pirrolidino-2-hexadecanoilamino-3-hidroxioctadec-4,5-eno.
11. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el compuesto es L-PDMP.
12. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el compuesto es trans-1-pirrolidino-2-hexadecanoilamino-3-hidroxioctadec-4,5-eno.
13. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que la composición farmacéutica comprende una mezcla del compuesto y excipientes convencionales.
14. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que la composición farmacéutica se prepara para su uso en administración parenteral, para administración oral, para administración por vía intranasal, para administración por vía vaginal o para administración por vía tópica.
15. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que la composición farmacéutica es para el uso de una endoprótesis vascular.
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