DE69728776T2

DE69728776T2 - Behandlung von durch vielfach ungesättigten lipid-metaboliten vermittelten lungenerkrankungen und tests für epoxidhydrolase-inhibitoren

Info

Publication number: DE69728776T2
Application number: DE69728776T
Authority: DE
Inventors: Bruce D. Hammock; Mehran F. Moghaddam; Jeffrey M. Cheek; Babak Borhan; James Fergusson; David F. Grant; Jessica F. Greene; Kazu Kawachinagano MATOBA; Jiang Zheng; F. Marlene SISEMORE
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1996-08-13
Filing date: 1997-08-13
Publication date: 2005-05-25
Anticipated expiration: 2017-08-14
Also published as: DE69728776D1; EP0926951A1; AU4069297A; WO1998006261A1; US5955496A; EP0926951B1; ATE264618T1; EP0926951A4; CA2262525C; ES2221064T3; CA2262525A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Behandlung von Entzündungsleiden, wie z. B. dem Atemnotsyndrom bei Erwachsen (ARDS), und anderen akuten Entzündungssymptomen, wie z. B. dem systemischen inflammatorischen Reaktionssyndrom (SIRS), und genauer gesagt Verfahren zur Behandlung von Entzündungserkrankungen, die durch mehrfach ungesättigte Lipidmetaboliten durch Hemmung von Epoxid-Hydrolase vermittelt werden, Verfahren zur Untersuchung oder zum Screenen von Epoxid-Hydrolase-Inhibitoren auf Toxizität sowie Verfahren zur Analyse von Metaboliten von Lipidmetaboliten als Indikatoren von oxidativer Belastung und Erkrankungszuständen. Die Erfindung umfasst als einen Aspekt auch neue biologisch aktive Tetrahydrofurandiole aus Arachidonsäure (Dihydroxy-oxy-eicosadienate oder DiHOxyEDEs).
Diese Erfindung wurde unter Unterstützung der US-Regierung in Form des Grant ES02710 gemacht, der von den National Institutes of Health verliehen wird. Die US-Regierung hält bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
Hintergrund der Erfindung
Entzündungen zeigen sich durch Rötungen, Schwellungen, Wärmeempfinden und Schmerz als Reaktion des Körpers auf Verletzungen oder Beeinträchtigungen. Zahlreiche Chemikalien, wie z. B. Histamine, Kinine, Prostaglandine, Blutplättchen-aktivierende Faktoren, Leukotriene und Substanz P (von Nervenenden), gelten als chemische Mediatoren von Entzündungsreaktionen. Mediatoren der akuten Entzündungsreaktion scheinen bei einem oder mehreren Symptomen eine Rolle zu spielen, zu denen erhöhte Gefäßdurchlässigkeit, Anziehen von Leukozyten, Schmerzentstehung, lokale Ödeme und Nekrose zählen.
Die Entzündungsreaktion ist einer der wichtigsten physiologischen Mechanismen zur Aufrechterhaltung der menschlichen Gesundheit. Entzündungsstörungen oder unan gebrachte Entzündungsreaktionen können jedoch zu Gewebeschäden, Erkrankungen oder zum Tod führen.
Anschwellen ist eine typische Entzündungsreaktion geschädigten Gewebes. Anschwellen entsteht durch Entweichen von Wasser und gelösten Substanzen aus dem Blut direkt in die Gewebematrix. Die erhöhte Durchlässigkeit von Blutgefäßen nach einer Verletzung kann auf direkte Schädigungen der Blutgefäße zurückzuführen sein oder nach der Freisetzung von Substanzen wie Histaminen (Entzündungsmediatoren) auftreten, die Lücken zwischen die Blutgefäße auskleidenden Endothelzellen öffnen. Diese und andere Entzündungssignale können direkt auf Leukozyten einwirken, was dazu führt, dass Leukozyten an den Wänden von Blutgefäßen anhaften, ihre Morphologie verändern und durch die Blutgefäßwand austreten und in das Gewebe eindringen. Eine leichte Schwellung (oder ein Ödem) hat keine Auswirkung auf die funktionelle Integrität des geschädigten Gewebes (außer vielleicht im Gehirn), doch bei schweren Verletzungen führen massive Schwellungen zur Verformung der Gewebestruktur und zur Behinderung der Sauerstoffversorgung der Zellen und verursachen extensiven Flüssigkeitsverlust aus dem Gefäßkompartiment.
Entzündungsreaktionen sind auch an diversen chronischen Symptomen beteiligt, wie z. B. Asthma, obwohl gegenwärtig noch nicht geklärt ist, welche Entzündungszellen oder welche speziellen Mediatoren bei Asthma signifikant beteiligt sind.
Das Atemnotsyndrom bei Erwachsen (ARDS) ist eine Lungenerkrankung, die eine Sterblichkeitsrate von 50% mit sich bringt und aus Lungenläsionen entsteht, die durch zahlreiche Bedingungen, wie sie bei Traumapatienten und schweren Brandopfern auftreten, verursacht werden. (R. H. Ingram Jr., "Adult Respiratory Distress Syndrome", Harrison's Principals of Internal Medicine 13, 1240 (1995)). Unter möglicher Ausnahme von Glucocorticoiden sind bis heute keine Therapeutika bekannt, die als Mittel zur Prävention oder Behandlung von Gewebeschädigungen, beispielsweise mikrovaskulären Schäden, in Verbindung mit akuter Entzündung, die während des frühen Entwicklungsstadiums von ARDS auftritt, wirksam sind.
ARDS, das teilweise durch die Entwicklung von alveolaren Ödemen definiert ist, weist ein klinisches Symptom einer Lungenerkrankung auf, die durch direkte und indirekte Lungenverletzungen entsteht. Während frühere Studien eine scheinbar voneinander unabhängige Vielzahl von Verursachern eingehend betrachteten, wurden bisher die auslösenden Vorgänge, die der Pathophysiologie von ARDS zugrunde liegen, nicht zur Gänze verstanden. ARDS wurde ursprünglich als einzelnes Organversagen angesehen, wird heute jedoch als eine Komponente des Multiorgandysfunktionssyndrom (MOFS) betrachtet. Pharmakologische Intervention oder Prävention bei bzw. von Entzündungsreaktionen wird gegenwärtig als vielversprechenderes Verfahren zur Überwachung des Erkrankungsverlaufs erachtet als verbesserte atmungsunterstützende Verfahren (siehe beispielsweise Demling, Annu. Rev. Med. 46, 193–203 (1995)).
Eine andere Erkrankung (oder Gruppe von Erkrankungen), die akute Entzündung umfasst, ist das systemisch inflammatorische Reaktionssyndrom (SIRS). SIRS ist die jüngst von einer Gruppe an Forschern eingeführte Bezeichnung, um miteinander verbundene Leiden zu beschreiben, die beispielsweise aus Sepsis, Pankreatitis, multiplen Traumata, wie z. B. Gehirnverletzungen, und Gewebeschäden, wie z. B. Fleischwunden in der Muskulatur, aus chirurgischen Eingriffen am Gehirn, hämorrhagischen Schocks und durch Immunreaktionen verursachten Organschäden hervorgehen (Bone, JAMA 268 (24), 3452–3455 (1992)).
Das US-Patent 5.504.111 der Erfinder Falvin et al., ausgegeben am 2. April 1996, schlägt die Verwendung von 2,3-Alkylcarbonyloxybenzoesäure zur Behandlung von ARDS vor. Die Patentinhaber schlagen vor, dass ein Zweck ihrer Erfindung auch in der therapeutischen Behandlung und/oder Prävention von Sepsis und septischen Schocks liegt, da für viele der physiologischen und auch pathologischen Prozesse, die mit ARDS zusammenhängen, gezeigt wurde, dass sie an den Leiden von Sepsis und septischen Schocks beteiligt sind.
Das US-Patent 5.488.033 des Erfinders Wei, ausgegeben am 30. Januar 1996, offenbart Behandlungen mit dem Corticotropin-freisetzenden Faktor als geeignete Behandlungsart bei systemischen Entzündungssymptomen wie SIRS durch Unterdrücken von Gefäßdurchlässigkeit, wenn diese das Symptom derartiger Gefäßdurchlässigkeit aufweisen.
Das US-Patent 5.455.271 der Erfinder Yuan et al., ausgegeben am 3. Oktober 1995, offenbart Inhibitoren von Leukotrien-A₄-Hydrolase. Diese Metalloprotein-Hydrolase soll die Fähigkeit der Hemmung der Aktivität von Epoxid-Hydrolase und Aminopeptidase besitzen. Das Patent schlägt vor, dass selektive Inhibitoren von LTA4-Hydrolase als potentielle Entzündungshemmer von Interesse sind. Das Patent offenbart eine Gruppe von Übergangszustands-analogen Inhibitoren, die auf den vorgeschlagenen Mechanismen der Aminopeptidase-Aktivität und der natürlichen Substratstruktur des LTA4-Hydrolase-Enzyms basieren.
Das US-Patent 5.530.114 der Erfinder Bennett et al., ausgegeben am 25. Juni 1996, offenbart Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen, die empfindlich gegenüber Änderungen der Synthese oder des Metabolismus von Arachidonsäure sind, durch Bereitstellung von Antisense-Oligonucleotiden, die fähig sind, die Funktion von RNA-kodierenden Proteinen zu hemmen, die in die Synthese und den Metabolismus von Arachidonsäure und verwandten Verbindungen eingebunden sind. Speziell beschrieben werden verschiedene Leukotriene, die aus einem oxidativen Stoffwechselweg (dem Lipoxygenase-Stoffwechselweg) resultieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Hierin wird ein Verfahren zur Behandlung von Entzündungserkrankungen, insbesondere des Atemnotsyndroms bei Erwachsenen (ARDS), offenbart, welches das Verabreichen einer wirksamen therapeutischen Menge eines Epoxid-Hydrolase-Inhibitors an einen Patienten umfasst, der einer solchen Therapie bedarf. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Inhibitors von löslicher Epoxid- Hydrolase oder mikrosomaler Epoxid-Hydrolase zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Entzündungserkrankungen bereit.
Aspekte der Erfindung beziehen sich allgemein auf die Feststellung der Erfinder, dass der Diolmetabolit von Linoleat anscheinend zu ARDS-Symptomen führt und entzündungsfördernd wirkt. Demgemäß können Arzneimittel zur Herstellung des Medikaments verwendet werden, die die Bildung von Leukotoxin und Leukotoxindiol hemmen, Arzneimittel also, die Epoxid-Hydrolase-Inhibitoren wie Chalkonoxide, Lipidalkoxide, Glycidole und Diimide umfassen oder die die Entzündung (die durch Leukotoxindiol ausgelöst wurde) mittels THF-Diole eines Arachidonats, das entzündungshemmend wirkt, behandeln. Insbesondere verzögert oder verhindert der lösliche oder mikrosomale Epoxid-Hydrolase-Inhibitor eine Entzündungsreaktion bei einem Patienten durch Hemmen der Bildung eines oder mehrerer mehrfach ungesättigter Lipidmetaboliten. Die Verwendung ist beispielsweise wirksam, um die Bildung eines oder mehrerer Dihydroxy-oxy-eicosadienate (DiHOxyEDEs) in der Arachidonsäurereihe von Oxylipinen, Leukotoxindiolen in der Linolsäurereihe oder anderen Lipiddiolen, einschließlich von Tetrahydrofurandiolen, zu hemmen.
Auf dem Gebiet der Erfindung wurde bis heute Leukotoxin oder cis-9,10-Epoxyoctadec-12(Z)-ensäure als Verursacher von durch ARDS gekennzeichneter toxischer Reaktionen aufgrund seiner (bzw. ihrer) Gegenwart in Haut und Plasma solcher Patienten angesehen. Leukotoxin und Isoleukotoxin (cis-9,10-Epoxyoctadec-12(Z)-ensäure und cis-12,13-Epoxyoctadec-9(Z)-ensäure) sind Monoepoxide von Linolsäure (Octadeca-9(Z),12(Z)-diensäure), eine essentielle Fettsäure, die üblicherweise in Pflanzenöl und tierischen Fetten vorkommt. Im Körper wird Linolsäure zu den Regioisomeren von Leukotoxin und Isoleukotoxin durch Cytochrom P-450 und andere oxidative Wege aktiviert und dann zu den entsprechenden Dihydroxy-Verbindungen, Leukotoxindiol (cis-9,10-Dihydroxyoctadec-12(Z)-ensäure oder 9,10-DiHODE) und Isoleukotoxindiol(cis-12,13-Dihydroxyoctadec-9(Z)-ensäure oder 12,13-DiHODE) durch Epoxid-Hydrolase metabolisiert. Diese Reaktion wird durch mikrosomale Epoxid-Hy drolase (mEH) und lösliche Epoxid-Hydrolase (sEH) durchgeführt, wobei das lösliche Enzym von größerer Bedeutung ist.
Überraschenderweise zeigten die Studien der Erfinder, dass die Zelltoxizität von Leukotoxin offenbar aus der Umwandlung dieses Epoxids in sein entsprechendes vic-Diol (9,10-DiHODE) resultiert, d. h. aus einer Reaktion, die durch Epoxid-Hydrolase katalysiert wird (Schema 1). Das bedeutet, dass es offenbar ein (durch Epoxid-Hydrolase erzeugter) Metabolit von Leukotoxin ist, der für Lungenzellen, Vaskularepithelzellen und andere Zellarten, die mit ARDS und verwandten Erkrankungen in Verbindung stehen, toxisch ist. Es ist wahrscheinlich, dass Diolmetaboliten für zahlreiche biologische Wirkungen, die den Leukotoxinen zugeschrieben werden, verantwortlich sind.
Die Bedeutung dieser neuen Erkenntnis, dass Epoxid-Hydrolase offenbar einen von einer Entzündung herrührenden Mediator bioaktivieren, sowie die klinische Bedeutung von Leukotoxin-vermittelten Schäden führen unweigerlich zu einem Bedarf an wirksamen und ortsspezifischen Inhibitoren von Epoxid-Hydrolase. Da es gegenwärtig, wenn überhaupt, nur wenige spezifische Inhibitoren von Epoxid-Hydrolase gibt, die zudem keine anderen Aspekte von Zellhomöostase betreffen, ist ein anderer Aspekt dieser Erfindung, ein Untersuchungssystem dazu einzusetzen, eine Klassifizierung von Epoxid-Hydrolase-Inhibitoren (z. B. Chalkonoxide, Glycidole, Epoxy-Fettsäureester) auf Grundlage ihrer Wirksamkeit als Hemmer von Epoxid-Hydrolase vorzunehmen, die minimale Nebenwirkungen auf die Zellhomöostasis haben.
Demgemäß wird hierin auch ein Verfahren zum Screenen von Inhibitoren einer Epoxid-Hydrolase beschrieben, welches das Bereitstellen eines Insektenzellsystems mit darin wachsenden Insektenzellen umfasst. Diese Insektenzellen werden mit einem rekombinanten Baculovirus infiziert, das Epoxid-Hydrolase in den Insektenzellen unter Zellwachstumsbedingungen exprimiert. Ein potentieller Inhibitor von Epoxid-Hydrolase wird mit den Insektenzellen des Insektenzellensystems inkubiert, und die Insektenzellen werden hiernach auf ihre Lebensfähigkeit untersucht. Aktivierende Enzyme, die Lipide zu biologisch aktiven Metaboliten von Vorläufersubstanzen oxidieren, sind auch wertvoll. Besonders bevorzugt werden Insektenzellen, die Reduktase und P-450 in Form einer einzigen Fusion exprimieren.
Hierin wird auch ein Verfahren zur Untersuchung von Inhibitoren einer Epoxid-Hydrolase mit reduzierten Nebenwirkungen in vivo beschrieben, welches das Bereitstellen eines Zellsystems umfasst, das eine Säugerzelllinie enthält, worin die Zelllinie eine Epoxid-Hydrolase exprimiert und ein bestimmbares Niveau an interazellulärem freiem Ca²⁺ oder eine bestimmbare Membrandurchlässigkeit aufweist. Der mutmaßliche Inhibitor wird mit der Zelllinie inkubiert, und anschließend werden die inkubierten Zellen auf Veränderungen von intrazellulärem, freiem Ca²⁺ oder der Membrandurchlässigkeit untersucht. Noch bevorzugter umfasst die Untersuchung eine Überwachung des Calciumzuflusses oder -einströmens.
Ein (polyklonaler oder monoklonaler) Antikörper kann gegen DiHOxyEDEs, Leukotoxindiole und andere ähnliche Oxylipine gebildet und zur Diagnose oder für klinische Anwendungen eingesetzt werden.
Ebenfalls beschrieben wird die Verwendung von transgenen Systemen, um Leukotoxine, Leukotoxindiole, DiHOxyEDEs und andere Oxylipine unter Einsatz von P-450 und/oder Epoxid-Hydrolase zu produzieren. Neben anderen Anwendungsarten können diese Materialien als Arzneimittel oder Prodrugs eingesetzt werden. Niedrige Werte an Leukotoxin sind beispielsweise bekannt dafür, in Tier- und Pflanzensystemen antimikrobielle Aktivität zu zeigen. Die Erfinder glauben, dass Leukotoxindiol ein selektierbarer Marker für rekombinante Pflanzen sein und dazu eingesetzt werden könnte, um Pathogene in Pflanzensystemen zu bekämpfen. In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung werden DiHOxyEDEs mit biologischer Aktivität offenbart.
Andere Ziele und Aspekte dieser Erfindung ergeben sich aus der Lektüre der folgenden Beschreibung und aus den veranschaulichenden Versuchsdaten und -ergebnissen.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Die zwei Teile von 1, d. h. die Bilder (A) und (B), veranschaulichen die Wirkung von Lipiden auf die bioelektrischen Eigenschaften primärer, kultivierter Monoschichten von Epithelzellen der Lungenalveolen von Ratten; und
die mehreren Teile von 2 veranschaulichen grafisch die Wirkung der Lipide auf die Lebensfähigkeit kultivierter Zellen von Spodoptera frugiperda, die mit rekombinanten Baculoviren infiziert wurden, um unterschiedliche Enzyme zu produzieren.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die Erfinder zeigen in In-vitro- und in In-vivo-Experimenten, dass Leukotoxindiole in geringeren Konzentrationen sehr viel stärker toxisch sind und viel stärker ausgeprägte Symptome verursachen als die Ausgangs-Leukotoxine. Die Leukotoxindiolkonzentrationen, die biologische Aktivität in vitro zeigen, stimmen auch mit den In-vivo-Werten von Leukotoxin, die bei Verbrennungs- und ARDS-Patienten beobachtet wurden, überein. Diese Daten zeigen, dass zahlreiche Pathologien, die Leukotoxin und Isoleukotoxin zugeschrieben werden, durch Enzymaktivierung entstehen, die in hohem Maße durch lösliche Epoxid-Hydrolase vermittelt wird.
Die Daten der Erfinder bezüglich der Enzymaktivierung von Leukotoxin und Isoleukotoxin, sowohl in vivo als auch in vitro, zeigen die Fähigkeit von löslicher Epoxid-Hydrolase, eine Vielzahl von unterschiedlichen Oxylipinen zu metabolisieren. Mit "Oxylipin" wird auf jegliche Arten der Fettsäure mit zusätzlichem Sauerstoff, z. B. Epoxide, Diole, Monohydroxyverbindungen, Prostaglandine und dergleichen, Bezug genommen. Diese Daten geben die Umwandlung von Arachidonsäure-Epoxiden zu Diolen und von Arachidonsäure-Diepoxiden zu Tetrahydrofurandiolen und Tetraolen an. So stellt die vorliegende Erfindung therapeutische Verfahren bereit, die auf klinischen Eingriffen basieren, um die durch Epoxid-Hydrolase vermittelten Wege zu verhindern. Insbesondere zielt die Praxis der vorliegenden Erfindung auf das Hemmen von Epoxid-Hydrolase durch vier Klassen synthetischer chemischer Enzyminhibitoren oder durch Antisense-Nucleinsäuren ab.
Geeignete Epoxid-Hydrolase-Inhibitoren sind Verbindungen, die wechselweise Substrate für das Enzym bereitstellen, Lipidalkoxide (z. B. das 9-Methoxid von Stearinsäure), lipophile Diimide (z. B. Dicyclohexylcarbodiimid), Phenylglycidole (z. B. SS-4-Nithrophenylglycidol) und Chalkonoxide.
Demgemäß wird einem Patienten, der eine Therapie benötigt, eine wirksame therapeutische Menge eines Epoxid-Hydrolase-Inhibitors oder einer Antisense-Nuclein säure verabreicht. Eine derartige Verabreichung erfolgt typischerweise in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei beispielsweise der Inhibitor als Wirkstoff als Säureadditionssalz vorliegt und die Zusammensetzung so formuliert wird, dass sie zur oralen oder parenteralen Verabreichung oder zur Verabreichung als Suppositorium geeignet ist. Zudem werden auch Zusammensetzungen in Erwägung gezogen, die zur Injektion geeignet und aus wässrigen, injizierbaren, gepufferten oder ungepufferten, isotonischen und sterilen Salzlösungen oder Glucoselösungen zusammengesetzt sind. Der Wirkstoff kann auch in Zusammensetzungen wie Tabletten oder Pillen eingesetzt werden, die vorzugsweise eine Einheitsdosis enthalten und mit herkömmlichen Tablettenbestandteilen vermischt werden können. Der effektive Dosierungswert des Epoxid-Hydrolase-Inhibitors kann unterschiedlich gewählt werden, um die gewünschte therapeutische Reaktion für eine bestimmte Zusammensetzung und Verabreichungsweise zu erzielen. Die gesamte täglich zu verabreichende Dosis sollte im Bereich von etwa 0,001 bis etwa 100 μM/kg Körpergewicht liegen. Bei der praktischen Umsetzung der Erfindung sollten jedoch Arzneimittel wie Clofibrat, das bekanntermaßen lösliche Epoxid-Hydrolase und Cytochrom P-450 induziert, und Arzneimittel wie Acetaminophen, das Glutathion abreichert, vermieden werden. Und zwar, weil die Erfinder über Versuchsdaten verfügen, die zeigen, dass Leukotoxin toxischer wird, wenn der Glutathionspiegel abnimmt. Hingegen sollten parallele Therapien gefördert werden, die darauf abzielen, wechselnde Wege des Leukotoxin-Metabolismus zu verstärken, wie z. B. die Verabreichung von N-Acetylcystein, Glutathion und deren Methylester.
Andere Inhibitoren von Epoxid-Hydrolase und potentielle Therapeutika für ARDS können durch enzym- oder zellbasierte Tests gefunden werden. Bei enzymbasierten Tests wird der vermeintliche Inhibitor (wie z. B. jene Verbindungen, die auf sterische und elektronische Eigenschaften bekannter Substrate oder auf dem Verständnis des Enzymmechanismus basieren) in einem kleinen Volumen (1 μl) eines organischen Co-Lösungsmittels zu einer wässrigen Lösung von rekombinanter oder natürlicher Epoxid-Hydrolase zugesetzt. Nach Vorinkubation bei 37°C (0–10 Minuten) wird das Substrat in 1 μl organischen Co-Lösungsmittels zugegeben, und die Probe wird für 1 bis 10 Minuten inkubiert. Das Diol wird spektralphotometrisch (Wixtrom et al., Analy. Biochem. 174, 291–299 (1988); Dietz et al., Analy. Biochem. 216, 176–187 (1994)) oder radiochemisch (Borhan et al., Analy. Biochem. 231, 188–200 (1995)) überwacht.
Bei zellbasierten Tests kann Linoleat oder Leukotoxin in organischem Co-Lösungsmittel, gefolgt von einem vermeintlicher Inhibitor zu Insektenzellen, die mit einem rekombinanten Baculovirus infiziert oder transfiziert worden sind, zugegeben werden. Sf-Zellen, die mit P-450, Epoxid-Hydrolase, Glutathion-Transferase oder anderen relevanten Genen transfiziert wurden, können, wie jüngst von einigen der Forscher beschrieben (siehe Grant et al., Biochem. Pharmacol. 51, 503–515 (1996)) hergestellt werden. Die Zelllebensfähigkeit kann mittels MTT bestimmt werden.
Unter den Epoxid-Hydrolase-Inhibitoren, die in der praktischen Umsetzung dieser Erfindung eingesetzt werden können, finden sich wechselnde Substrate für die Enzyme, wie z. B. das Epoxid von Methyloleat und anderen Fettsäuren und -estern oder Methylepoxyoctadecenat (EpOD), die intravenös über die Oberschenkelvene oder durch Einatmen über die Lunge verabreicht werden. Wie bereits vorangehend erwähnt, sind auch Chalkonoxide und Phenylglycidole Epoxid-Hydrolase-Inhibitoren. Geeignete Chalkonoxide für diese Anwendung werden in Tabelle A veranschaulicht.
TABELLE A
Wie die Daten in Tabelle A zeigen, wurden Tests sowohl mit Maus- als auch mit Human-Enzymen zur Hemmung löslicher Epoxid-Hydrolase durchgeführt, wovon die IC50-Werte angegeben werden, wobei die Maus-sEH-Werte bei 8 μg/ml (0,3 μM) und die Human-sEH-Werte bei 16 μg/ml (0,26 μM) ermittelt wurden.
Geeignete Chalkonoxide umfassen 4-Phenylchalkonoxid und 4-Fluorchalkonoxid. Geeignete Glycidole umfassen S,S-4-Nitrophenylglycidol. Von diesen wird angenommen, dass sie stabile Acylenzyme und Übergangszustands-Mimetika bilden. Wechselweise wurden Alkoxylipide oder Kohlenwasserstoffe als kompetitive Inhibitoren gezeigt. Es wird angenommen, dass Alkoxygruppen (OCH₃, OC₂H₅, OC₃H₉) hydrolytisch stabile, sterische Mimetika der Substrate sind. Die allgemeine Struktur ist RCH-(OCH₃)R' für ein Methoxid, wobei R und R' hydrophob sind. Eine typische Verbindung ist 9-Methoxyoctadecansäure. Sie können in hoher Ausbeute aus dem entsprechenden Olefin durch Brownsche Oxymercurierung-Demercurierung in geeignetem Lösungsmittel (beispielsweise Ethanol für Ethoxide und Methanol für Methoxide) hergestellt werden.
Da diese spezifischen Inhibitoren jedoch andere Aspekte der Zellhomöostase beeinflussen können, sind weitere Forschungen nach anderen, therapeutisch wirksamen Epoxid-Hydrolase-Inhibitoren mit minimalen Nebenwirkungen wünschenswert. Diese Forschungen werden durch die praktische Umsetzung anderer Aspekte der Erfindung erleichtert, durch die Mittel zum Screenen potentiell nützlicher Epoxid-Hydrolase-Inhibitoren und zur Untersuchung von Nebenwirkungen, wie nachstehend beschrieben, bereitgestellt werden.
Die gleichzeitige Inkubation von Leukotoxin oder Isoleukotoxin und dem potentiellen Inhibitor kann mit Insektenzellen erfolgen, wie z. B. Sf-21-Zellen, die lösliche Epoxid-Hydrolase exprimieren. Nach ausreichender Inkubation, beispielsweise 2 bis 5 Stunden, schützen diese Sf-21-Zellen, die das Enzym exprimieren. Einer der Vorteile eines solchen Systems bei Enzymuntersuchungen ist, dass die Bioaktivität potentieller Inhibitoren (durch die Zellmembran) bereits berücksichtigt wurde, sodass Inhibitoren mit einem hohen Toxizitätsgrad für Zellen von weiteren Untersuchungen ausgeschlossen werden und somit kein radioaktiver Abfall anfällt. Dieser Test wird nachstehend näher beschrieben.
Zu den Aspekten dieser Erfindung zählen auch Erkenntnisse, die einen Arachidonsäure-(AA-)Weg umfassen. AA kann durch Cytochrom-P-450-Epoxygenase metabolisiert werden, um Epoxyeicosatriensäuren (EETs) zu ergeben. Diese EETs können durch lösliche Epoxid-Hydrolase weiter metabolisiert werden, um die entsprechenden Dihydroxyeicosatriensäuren (DHETs) zu ergeben. Studien haben gezeigt, dass die EETs und DHETs einen ganzen Menge biologischer Aktivitäten, wie z. B. Hemmung von Na/K-ATPase, Gefäßerweiterung der Koronararterie sowie Mobilisierung von Ca²⁺ und Hemmung der Blutplättchenaggregation, aufweisen. Ähnlich dazu setzt Cytochrom-P-450-Epoxygenase freie Linolsäure zu 9,10-Epoxyoctadec-12-enat (Leukotoxin) um.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Erkenntnis der Erfinder, dass Cytochrom-P-450-Epoxygenase auch freie Fettsäuren, einschließlich AA, zu unterschiedlich positionierten Diepoxiden sowie zu Monoepoxiden (EETs) umsetzen kann, und diese Diepoxide der AA (Diepoxyeicosadienate oder DiEpEDEs) werden nacheinander durch lösliche Epoxid-Hydrolase zu bisher unbekannten DiHOxyEDEs metabolisiert. Die Erfinder haben 5-cis- und 5-trans-Regio- und -Positionsisomere von DiHOxyEDEs synthetisiert und gereinigt und für manche davon herausgefunden, dass sie biologisch aktiv sind; diese neuen Verbindungen werden in Tabelle 1 gezeigt.
Die Erfinder konnten für diese biologisch aktiven DiHOxyEDEs Biosynthese in biologischen Matrices detektieren. Diese Erkenntnis dient dazu, den P-450/Epoxid-Hydrolase-Zweig eines AA-Weges weiter ausdehnen, und die Erfinder glauben, dass dies direkte Auswirkungen auf die Behandlung von ARDS haben könnte. Darüber hinaus glauben die Erfinder, dass dieser dritte AA-Weg an einer Vielzahl anderer zellvermittelter Vorgänge, Diabetes mit einbegriffen, beteiligt ist.
Viele Signaltransduktionswege umfassen den Arachidonsäurestufenprozess. Dieser Stufenprozess wird ausgelöst, wenn sich ein spezifischer Ligand, wie z. B. ein Hormon oder ein Wachstumsfaktor, mit seinem Zelloberflächenrezeptor verbindet, der wiederum eine Phospholipase aktiviert. Phospholipase A₂ spaltet die Fettsäure an der zweiten Acyl-Position aus Phospholipiden im inneren Teilblatt der Plasmamembran. Arachidonsäure kommt üblicherweise an dieser Position vor. Freie Arachidonsäure wird zu unzähligen wichtigen Regulationsmolekülen metabolisiert, die an Vorgängen wie Zellaktivierung, Zellteilung, Chemotaxis, Entzündung, Ovulation und Wundheilung beteiligt sind. Es gibt zwei gut erforschte Wege des Arachidonsäuremetabolismus. Der erste ist der Cyclooxygenaseweg, der zur Produktion von Prostaglandinen und schließlich zu Thromboxanen und Prostazyklinen führt. Der zweite ist der Lipoxygenaseweg, der Arachidonsäure zu Verbindungen wie etwa verschiedenen Leukotrienen umsetzt. Die Produkte des Arachidonsäure-(AA-)Stufenprozesses können aus den Zellen freigesetzt werden und sich dann an spezifische Zelloberflächenrezeptoren anderer Zelltypen binden. Die Rezeptoren für Leukotriene, Thromboxane und Prostaglandine sind oft mit dem Phosphatidylinositweg verbunden, was zu einem Ansteigen an intrazellulärem freiem Ca²⁺ führt. Anfangs geht der Anstieg von intrazellulärem freiem Ca²⁺ auf die Freisetzung aus dem endoplasmatischen Reticulum zurück. Dieser Anstieg an intrazellulärem Ca²⁺ führt wiederum zur Produktion nicht identifizierter zweiter Messenger, was den Ca²⁺-Zufluss aus dem extrazellulären Raum stimuliert. Daher umfassen Untersuchungen der Wirksamkeit von AA-Metaboliten oft deren Fähigkeit, einen Anstieg an intrazellulärem Ca²⁺ auszulösen. Wie sich zeigt, ist ein Aspekt dieser Erfindung die Entdeckung neuer Arachidonsäuremetaboliten, bezüglich derer die Erfinder zeigen, dass sie biologische Aktivität besitzen, und an denen erfindungsgemäß Tests durchgeführt werden können, um zu bestimmen, ob und inwieweit intrazelluläres Ca²⁺ betroffen ist.
Die Erfinder erachten die Behandlung von Lungenerkrankungen als eine wichtige therapeutische Anwendung eines Aspekts dieser Erfindung. Die Lunge mit ihrer riesigen Oberfläche ist der Umwelt direkt ausgesetzt, sie ist besonders empfindlich für oxidative Schädigungen und Entzündungsprodukten. Da das gesamte Herzminuten volumen über die Lungenarterie geht, können die Lungen auch durch hämatogene Agenzien geschädigt werden. Die Zellheterogenität in Lungen von Säugetieren verkompliziert die unmittelbare Untersuchung jener Lungenzellen, die am ehesten geschädigt werden können. Darüber hinaus erschwert es die komplexe Lungenanatomie, genau zu erkennen, wo biologische Agenzien im Lungengewebe metabolisiert werden. Das Zielgewebe und die Abfolge der Vorgänge, die bei einem Alveolarödem auftreten, sind noch nicht schlüssig belegt; folglich bleiben die wechselseitigen Beziehungen zwischen den Endothel-, Epithel-, und Entzündungskompartimenten und deren relativen Beiträge bei der Milderung von Schädigungen der Luft-Blut-Schranke ungewiss.
Da das Alveolarepithel dem Fluidstrom und darin gelösten Substanzen durch die Luft-Blut-Schranke den Hauptwiderstand entgegensetzt, konzentrierte sich die Versuchsmethodik der Erfinder auf diese Komponente, wobei ein in vitro errichtetes physiologisches Modell der Alveolarepithel-Schranke eingesetzt wurde. Die Verwendung eines serumfreien Kultivierungssystems ermöglicht, gemeinsam mit synthetisierten und gereinigten Oxylipinen, mechanistische Experimente, deren Ziel es ist, die Zellprozesse zu erklären, die für die Aufrechterhaltung und Auflösung der Funktion der Alveolarepithel-Schranke entscheidend sind.
ARDS-Beschwerden treten bei einer Vielfalt verschiedener Patienten mit schweren Verbrennungen oder Sepsis auf. Sepsis ist ihrerseits eines der SIRS-Syndrome. Bei ARDS tritt eine akute Entzündungsreaktion mit einer hohen Anzahl an Neutrophilen auf, die in das Interstitium und die Alveolen wandern. Setzt sich diese Entwicklung fort, so werden Entzündung, Ödem und Zellvermehrung stärker, und schließlich führt dies zu einer eingeschränkten Fähigkeit, Sauerstoff zu extrahieren. ARDS ist daher eine übliche Komplikation bei zahlreichen Erkrankungen und Traumata. Die einzige Behandlung ist unterstützend. Es gibt geschätzte 150.000 Fälle pro Jahr, und die Sterblichkeitsrate liegt im Bereich von 10% bis 90%.
Die genaue Ursache für ARDS ist nicht bekannt. Dennoch wird angenommen, dass eine Überaktivierung der Neutrophilen über Phospholipase-A₂-Aktivität zur Freisetzung von großen Mengen an Linolsäure führt. Diese Linolsäure wird ihrerseits durch Neutrophil-Cytochrom-P-450-Epoxygenase enzymatisch zu 9,10-Epoxy-12-octadecenat umgesetzt. Dieses Lipidepoxid, oder Leukotoxin, kann in großen Mengen in verbrannter Haut und im Serum von Verbrennungspatienten gefunden werden. Darüber hinaus löst es ARDS aus, wenn es Ratten, Mäusen, Hunden und anderen Säugetieren injiziert wird. Der Wirkungsmechanismus ist jedoch nicht bekannt.
Genau wie die Epoxidprodukte von AA (DiEpEDEs) durch lösliche Epoxid-Hydrolase metabolisiert werden können, um DiHOxyEDEs zu produzieren, kann auch das Linoleatepoxid (Leukotoxin) durch lösliche Epoxid-Hydrolase 9,10-DiHODE umgewandelt werden. Dieses Leukotoxin verursacht keinen Anstieg an intrazellulärem Ca²⁺ in Alveolarzellen. Allerdings verursacht 9,10-DiHODE einen drastischen Anstieg an intrazellulärem Ca²⁺. Die Erfinder glauben, dass ein Großteil der Schädigungen von Alveolarzellen bei einer ARDS-Erkrankung durch einen gewaltigen Anstieg an intrazellulärem freiem Ca²⁺ ausgelöst werden kann. Es wird angenommen, dass der Anstieg an intrazellulärem Ca²⁺ sowohl durch 9,10-DiHODE als auch durch 12,13-DiHODE verursacht wird. Zellschädigung und Zelltod allgemein werden oft durch einen irreversiblen Anstieg an intrazellulärem Ca²⁺ verursacht. Somit kann erstmals ein Mechanismus für ARDS vorgestellt werden.
Mehrfach ungesättigte Lipide wie Linolsäure und Arachidonsäure dienen als Vorläufersubstanzen für biologisch aktive Metaboliten. Die Addition eines einzigen Sauerstoffatoms über chemische oder enzymatische Verfahren an ein Olefin oder einen Kohlenwasserstoff dieser essentiellen Fettsäuren erzeugt Epoxide und andere sauerstoffhaltige Metaboliten (die allgemein als Oxylipine bezeichnet werden), die Schlüssel-Zwischenprodukte in Biosynthesewegen sind. Ein 5-Lipoxygenase-Metabolit von Arachidonsäure beispielsweise (z. B. Leukotrien A₄) weist direkte biologische Aktivität auf und wird zu potenten Mediatoren metabolisiert. Von einem P-450 Monooxygenase-Metaboliten von Arachidonat, nämlich 5,6-Epoxyeicosatrienat, wur de angenommen, dass es ein zweiter Messenger für Agonisten-induzierten Calciumeintritt in die Zelle ist. Ein Weg zur Beseitigung dieser Verbindungen umfasst Hydrierung durch Epoxid-Hydrolase. Diese Enzyme, die Epoxide zu mutmaßlich weniger reaktiven (und besser wasserlöslichen) Diolen umsetzen, kommen in allen Geweben von Wirbeltieren vor, wobei die höchsten Konzentrationen in der Leber und der Niere exprimiert werden. Die Rolle von Epoxid-Hydrolasen, von denen angenommen wird, dass sie Zellschutz vor exogenen und endogenen Epoxiden bereitstellen, wird als eine durch Detoxifizierung angesehen.
Epoxid-Hydrolase (EH) ist ein allgegenwärtig vorkommendes Enzym, das in allen Gewebearten der Wirbeltiere auftritt, wobei die Konzentration in der Leber und der Niere am höchsten ist. Es gibt zwei Haupttypen von EH mit breiter Substratspezifizität: mikrosomale Epoxid-Hydrolase (mEH) und lösliche Epoxid-Hydrolase (sEH). Beide Enzyme gehören zur α/β-Hydrolase-Familie. Anders als Cholesterinepoxid-Hydrolase und Leukotrien-A₄-Hydrolase setzen sie Epoxide zu Diolen durch einen Zweistufenmechanismus um, der ein isolierbares, kovalentes Acylenzymzwischenprodukt umfasst. Beide Enzyme metabolisieren Epoxide zu trans-Diolen oder trans-vic-Diolen. Durch EH hydrolysierte Verbindungen sind stärker hydrophil und daher leichter auszuscheiden die Ausgangsverbindung. Daher wird EH üblicherweise als ein Weg zur Detoxifizierung angesehen. Manchmal aktiviert EH jedoch eine Verbindung zu einer hochreaktiven und stärker toxischen Spezies, wie im Fall von Benzo[a]pyren. Ein geeignetes Verfahren zur Überwachung der Produkte, die durch EH gebildet werden, ist es, das Substrat direkt dem gereinigten Enzym zuzusetzen. Dies liefert jedoch keinerlei Information über die Toxizität des Metabolismusprodukts oder das Verhalten des Substrats und/oder des Metaboliten in einer Zellumgebung.
Die Erfinder beobachteten zuerst, dass in einer Insektenzelllinie (Sf-21-Zellen), die üblicherweise einen sehr niedrigen Grad an endogener Epoxid-Hydrolase-Aktivität exprimiert, weder Leukotoxin noch Isoleukotoxin Zelltoxizität induzierte; die entsprechenden Diole taten dies allerdings. Durch Einsatz eines Baculovirus-Expressions-Systems in diesem Modell stellten die Erfinder fest, dass Leukotoxin nur gegenüber Zellen cytotoxisch war, in die Epoxid-Hydrolase transfiziert worden war, wodurch die Rolle dieses Enzyms bei der Bioaktivierung von Leukotoxin bestätigt wurde. Die Erfinder untersuchten in weiterer Folge die selektive Toxizität von von Leukotoxin abgeleiteten Oxylipinen in ihrem Säugetier-Lungenmodell (d. h. in Monoschichten aus primär kultivierten Alveolarepithelzellen von Ratten).
Wie bereits zuvor kurz erwähnt haben die Erfinder ein Screening-Verfahren entwickelt, wobei Baculoviren, die klonierte Maus- und Human-sEH in Insektenzellen, wie z. B. Spandoptera frugiperda-Insektenzellen (Sf-21-Zellen), exprimierten, transfiziert wurden. Eine Beschreibung dieser transfizierten Insektenzellen wurde erst jüngst veröffentlicht. Siehe Grant et al., „Development of an in situ Toxicity Assay System Using Recombinant Baculoviruses", Biochem. Pharmacol. 51, 503–515 (1996), das durch Verweis hierin vollumfänglich aufgenommen ist. Der signifikante Vorteil dieses Insektenzellsystems im Vergleich zu anderen Zellsystemen ist seine relativ hohe Konzentration an transgenen Enzymen und seine relativ niedrige Konzentration an endogenen Enzymen. Daher stellen Interferenzen von endogenen Enzymen, wie sie in anderen Zellstruktursystemen anzutreffen sind, kein Problem dar.
Dennoch weist die Verwendung von Säugetierzellstrukturen zum Testen der Toxizität immer noch den Vorteil auf, dass die Umgebung in einer Säugetierzelle der physiologischen Umgebung einer menschlichen Zelle ähnlicher ist als jene des Sf-21-Zellsystems. Daher wurde ein anderes Zellsystem, das eine primäre Monoschicht aus Ratten-Alveolarzellen vom Typ II aufweist, zum Testen der Zelltoxizität entwickelt. In diesem System werden Zellen bezüglich Schädigungen wie Membrandurchlässigkeit und Calciumzufluss überwacht. Das Testsystem kann wie nachstehend beschrieben erzeugt werden.
Epithelzellen der Lungenalveole werden aus erwachsenen Ratten unter Verwendung von früher berichteten Verfahren isoliert. (Cheek et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 125, 59–69 (1994). Kurz beschrieben werden Ratten anästhesiert, tracheostomiert und ausgeblutet. Nach der Perfusion der pulmonalen Gefäßanordnung werden die exzidierten Lungen bei 37°C 20 Minuten lang mit einer Emulsion aus Fluorinert FC-75 (3M, St. Paul, Minnesota) und Rinderserumalbumin in einer ausgeglichenen Salzlösung gefüllt. Nach der Verdrängung der Emulsion durch Spülung wird eine Elastaselösung über die Luftwege infundiert und wird 20 Minuten lang bei 37°C inkubieren gelassen. Elastase-verdaute Lungen werden zerkleinert, filtriert und gesammelt, um eine Suspension einzelner Zellen zu ergeben, die dann mittels eines diskontinuierlichen Percoll-Gradienten zentrifugiert wurden. Die resultierende angereicherte Zellsuspension wird unter Anwendung der IgG-Panning-Technik weiter gereinigt (Dobbs et al., Am. Rev. Resp. Dis. 134, 141–145 (1986)), um eine Endzellsuspension von etwa 80% Typ II an Alveolarepithelzellen zu ergeben. Für physiologische Studien werden isolierte Zellen vom Typ II auf Gewebekultur-behandelte Transwell-Inserts (Costar, Van Nuys, Kalifornien) in Ham's F-12, das mit 10%igem neonatalem Rinderserum und 0,1 μM Dexamethason (Sigma, St. Louis, Missouri) angereichert war, in einer Impfdichte von 1,5 × 10⁶ Zellen/cm² ausplattiert. Für Abbildungsversuche (z. B. Calciumzuflussstudien) werden isolierte Zellen des Typs II auf Deckgläser aufgestrichen. Nach 48 Stunden in Kultur bei 37°C in 5% CO₂/Luft wird das Ausgangsmedium aus den Kulturen entfernt und durch serumfreies F-12 + 6 Nährmedium, bestehend aus Ham's F-12, ergänzt mit Natriumbicarbonat (14 mM), N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES, 10 mM) und L-Cystin (0,15 mM), und die folgenden Wachstumsfaktoren umfassend, ersetzt: Insulin (5 μg/ml), Transferrin (5 μg/ml), Epidermiswachstumsfaktor (25 ng/ml), Hydrocortison (1 μM), Rinder-Hypothalamus-Extrakt (7,5 μg/ml) und Retinol (0,1 μM), wie vorangehend beschrieben (Cheek et al., s. o.). Monoschichten werden dann in serumfreiem Medium weitere 24 bis 48 Stunden lang inkubiert und dann für Studien bezüglich der Zelltoxizität aus dem Inkubator entfernt.
In beiden oben erwähnten Zellsystemen wurden Studien bezüglich der Zelltoxizität an den Methylestern und den freien Säuren von Linolsäure, Leukotoxin, Isoleukotoxin, Leukotoxin-vic-diol und Isoleukotoxin-vic-diol durchgeführt. Obwohl Forscher früher vorgeschlagen haben, dass Leukotoxin die Verbindung sei, die toxische Reaktionen bei Verbrennungspatienten hervorruft, zeigten die Ergebnisse für Sf-21-Zellen, die Lac-Z exprimierten, und für Ratten-Alveolarzellen des Typs II keine Anzeichen von Zelltoxizität, nachdem diese Zellen Methyllinoleat, Methylleukotoxin oder Methylisoleukotoxin ausgesetzt worden waren. Darüber hinaus wiesen nicht nur beide vic-Diole hohe Toxizität in beiden System auf, sondern es wurde auch der Zelltod bei Sf-21-Zellen festgestellt, die EH exprimierten und Methylleukotoxin und Methylisoleukotoxin ausgesetzt wurden. Daher lassen die Daten darauf schließen, dass es das aus EH-Aktivität resultierende Diol und nicht das Epoxid ist, das die bei Verbrennungsopfern und möglicherweise auch bei ARDS-Patienten auftretende Toxizität verursacht.
Vorstudien der Erfinder an der Mäuseleber führten sie zu der Entdeckung der Tetrahydrofurandiole von Arachidonsäure. Methylester dieser Verbindungen verursachten eine In-vitro-Aktivierung menschlicher polymorphkerniger Leukozyten, obwohl in denselben Untersuchungen deren Vorläufer-Methyldiepoxyarachidonate nicht bioaktiv waren. Das Auftreten solch differenzieller biologischer Wirkung setzt eine Aktivierung der Diepoixde durch lösliche Epoxid-Hydrolase voraus und deutet auf eine frühe Rolle als entzündungsfördernde Substanz des Tetrahyrofurandiols von Arachidonsäure hin.
In anderen Experimenten zeigten eine Reihe von Methylarachidonat-Analogen, d. h. Methylarachidonatmethoxide, Hemmwirkung gegenüber gereinigter löslicher Epoxid-Hydrolase (sEH). Die Bedeutung dieser Erkenntnis war, dass die Verbindungen das Potential haben, um als biochemische Werkzeuge in Studien zu dienen, die darauf abzielen, die Rolle von sEH in vivo zu bestimmen. Sollten die Produkte von sEH darüber hinaus ohne Zweifel in die Entzündungsentwicklung eingebunden sein, so könnten solche Inhibitoren als Pharmazeutika zur Prävention von Entzündungsbeschwerden dienen. Ein anderer Typ von mit den Methylarachidonatmethoxiden in Verbindung stehender biologischer Aktivität ist deren Wachstumshemmung in vitro von Keratinozyten in bestimmten Konzentration und deren Zelltoxizität gegenüber diesen Keratinozyten. Schließlich scheinen diese Verbindungen in Pflanzen biolo gisch aktiv zu sein und die Fähigkeit zu besitzen, in Kartoffelknollen, die mit einem Schadpilz infiziert waren, Phytoalexinproduktion zu induzieren.
Die Synthese von Methylarachidonat-THF-Diolen resultierte aus der Epoxidierung von Methylarachidonat, gefolgt von der Abtrennung seiner Diepoxide, saurer Hydrolyse und Zyklisierungsverfahren dieser Diepoxide – die Säure katalysiert sowohl den Hydrolyse- als auch den Zyklisierungsprozess dieser Diepoxide. Die Hydrolyseprodukte wurden anschließend Säulenchromatographie unterzogen, um die Methylarachidonat-THF-Diole vom Rest des Gemischs zu trennen. Diese synthetischen THF-Diole wurden als Standards in Gaschromatographie/Massenspektroskopie-Verfahren unter chemischer Ionisierung mit negativen Ionen verwendet, was die Erfinder zu der Erkenntnis führte, dass diese Verbindungen natürliche, in der Mäuseleber vorkommende Produkte sind. Zusätzlich wurden diese synthetischen Verbindungen in In-vitro-Aktivierungsuntersuchungen von polymorphkernigen Leukozyten eingesetzt. Die Aktivierung dieser Leukozyten wurde mittels eines bekannten Durchflusszytometrieverfahrens bestimmt.
Methylarachidonatmethoxide wurden durch Methoxymercurierung von Methylarachidonat hergestellt, was zu einer Nettoaddition von MeOH an einer oder mehreren Doppelbindungen führte und in einem Gemisch von Mono-, Di-, Tri-, und Tetramethoxyarachidonaten resultierte. Nach der Abtrennung des nichtumgesetzten Methylarachidonats vom Rest des Gemisches wurde das Methoxidgemisch von Methylarachidonat, mittels einer TSO-Standardhemmungsuntersuchung, als Inhibitor von löslicher Epoxid-Hydrolase bestimmt. Die Hemmstufen dieses Gemisches der Verbindungen waren 98% bei 100 μM, 95% bei 10 μM und 30% bei 1 μM. Aufgrund dieser wichtigen Erkenntnis kam unter den Erfindern größeres Interesse an der allgemeinen Toxizität dieser Verbindungen auf, und sie beschlossen, ihre Toxizität durch Inkubieren dieser Verbindungen mit Keratinozyten in vitro und durch Messen ihrer Zelltoxizität oder ihrer Wachstumshemmung für diese Zellen zu testen. Auf der Stufe von etwa 100 μM zeigten diese Verbindungen 100%ige Toxizität gegenüber den entwässerten Keratinozyten. In einem anderen Experiment hemmten diese Verbindun gen bei einer Stufe von etwa 10 μM das Wachstum der zuvor genannten Zellen völlig. Es wurde auch herausgefunden, dass Methylarachidonatmethoxide fähig waren, bei Kartoffelknollen, die durch einen Pilz infiziert worden waren, Phytoalexinproduktion zu induzieren, wenn sie mit 50 μg/Scheibe aufgetragen wurden. Die Produktion von Phytoalexin ist für die Fähigkeit von mit Pathogenen infizierten Pflanzen, Erkrankungen zu bekämpfen, wichtig.
Methylleukotoxin und Methylisoleukotoxin und deren Diole wurden aus Methyllinoleat unter Verwendung von m-Chlorperbenzoesäure, wie zuvor beschrieben und durch Schema 1 veranschaulicht, chemisch synthetisiert. Diese zwei Monoepoxide und die Diastereomere des 9,10-12,13-Diepoxids (nicht dargestellt) wurden voneinander und von störenden Verbindungen unter Einsatz von Normalphasensäulenchromatographie getrennt. Jedes dieser Monoepoxide wurde dann unter Verwendung von Perchlorsäure und gereinigter oder enzymatisch rekombinanter löslicher Epoxid-Hydrolase zu seinem Diol hydrolysiert. Die Reinheit und Identität aller Verbindungen wurden durch eine Kombination von zumindest Dünnschichtchromatographie (DC), Gaschromatographie (GC), Gaschromatographie-"low resolution electron impact"-Massenspektrometrie (GC/LREI/MS) und ¹H- und ¹³C-Kernresonanz (NMR) und durch Vergleichen dieser Daten mit jenen, die in der einschlägigen Literatur gefunden wurden, bestätigt. Freie Fettsäuren wurden unter Einsatz desselben Lösungsmittelsystems, das 1% Essigsäure enthielt, gereinigt. Die Toxizität der Verbindungen wurde mit Sprague-Dawley-Ratten aus den Simonson-Labors in Gilroy, Kalifornien, ausgewertet.
Ratten wurden mittels Herzpunktur freie Fettsäuren, gelöst in Phosphat-gepufferter Salzlösung, die 5% DMSO enthielt, verabreicht, nachdem sie durch intraperitonale Injektion von Pentobarbital anästhesiert worden waren. Da das Lungensystem reinem Leukotoxindiol ausgesetzt wurde, führte dies zu unverzüglichen Atembeschwerden mit tödlichem Ausgang in weniger als 2 Stunden. wenn 35 mg/kg injiziert wurden. Keine klaren Symptome oder Sterblichkeit wurden bei Dosen des Ausgangs-Leukotoxins bis zu 100 mg/kg beobachtet. Männliche Swiss-Webster-Mäuse (18– 20 g) von Bantin-Kingman (Fremont, CA, USA) erhielten Schwanzveneninjektionen von freien Fettsäuren, gelöst in 2-Methoxyethanol, nachdem sie durch Inhalieren von Methoxyfluoran anästhesiert worden waren. Wenn 200 mg/kg eines Gemisches aus Leukotoxin- und Isoleukotoxindiol verabreicht wurden, so trat in 30% der Fälle innerhalb von 4 Minuten der Tod ein. Alle der behandelten Mäuse waren zumindest 2 Stunden lethargisch und zeigten Schwierigkeiten beim Atmen. Hingegen wurde keine Toxizität bei den Ausgangs-Leukotoxinen bei 200 mg/kg beobachtet. Bei 500 mg/kg der Leukotoxine wurde eine Mortalität von nur 25% beobachtet, wobei der Tod innerhalb von 18 bis 24 Stunden eintrat, und bei keinem Tier wurden Symptome, die länger als 10 Minuten andauerten, beobachtet. Keine tödlichen Auswirkungen oder Symptome wurden nach intraperitonaler oder subkutaner Injektion von Leukotoxin, Isoleukotoxin oder deren Diolen in Dosen von bis zu 175 mg/kg beobachtet.
Sf-21-Zellen wurden mit rekombinanten Baculoviren infiziert, wodurch sie entweder menschliche, lösliche Epoxid-Hydrolase (hsEH), lösliche Maus-Epoxid-Hydrolase (msEH), menschliche mikrosomale Epoxid-Hydrolase (hmEH) oder β-Galactosidase (Lac-Z) als Kontrollvirus produzierten. Zwei Tage nach der Infektion wurden unterschiedliche Konzentrationen von Lipiden, gelöst in 2%iger Endkonzentration von DMSO (Vol.-%), zugesetzt. Drei Tage nach der Infektion wurde ein Lebensfähigkeitstest mittels MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) durchgeführt.
Wie 2(A) zeigt, verursachte Methyllinoleat keine Änderung der Lebensfähigkeit. Aus 2(B) ist ersichtlich, dass Methylleukotoxin für Lac-Z exprimierende Zellen nichttoxisch, für hmEH exprimierende Zellen leicht toxisch, doch für Zellen, die entweder menschliche sEH oder Maus-sEH exprimierten, toxisch (LC₅₀ ~ 290 μM) war. 2(C) zeigt, dass Methylleukotoxindiol für alle Zelltypen toxisch (LC₅₀ ~ 160 μM) war. 2(D) zeigt, dass Methylisoleukotoxin für Lac-Z exprimierende Zellen nichttoxisch, für hmEH exprimierende Zellen leicht toxisch und für jene Zellen, die Maus-sEH oder menschliches sEH exprimierten, toxisch (LC₅₀ ~ 150 μM) war. 2(E) zeigt, dass Methylisoleukotoxindiol für alle Zellen toxisch (LC₅₀ ~ 200 μM) war, was zeigt, dass die Hydrolyse der Epoxide von Methylleukotoxin und Methylisoleukotoxin zu ihren Diolen die diesen Verbindungen zugeschriebene Toxizität auslöst.
Alle Experimente wurden drei bis sieben Mal an verschiedenen Tagen wiederholt. Alle Wiederholungen wurden in die Berechnung der LC⁵⁰-Werte mit einer mittels des Programms Polo berechneten oberen und unteren Vertrauensgrenze einbezogen. Ähnliche Resultate wie jene für die Methylester (hierin erwähnt) wurden für die freie Fettsäuren erzielt (die Daten sind nicht dargestellt). Die Diepoxide waren viel weniger toxisch (LC₅₀ ~ 600 μM), und ihre Hydratisierungsprodukte (Daten nicht dargestellt) verursachten in Konzentrationen von bis zu 1 mM bei keinem Zelltyp Toxizität.
Die folgenden Daten aus 1 sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben; n = 5–10 Monoschichten. (*) gibt einen signifikant niedrigeren Mittelwert an als jener des Ausgangs-Lipids (Methyllinoleat) zum selben Zeitpunkt nach der Exposition, wie mittels ANOVA/Scheffe-Einwegkontrast bestimmt wurde.
In 1 zeigt das Behandeln von Monoschichten mit 300 μM Methyllinoleat (leere Quadrate, gepunktete Linie), Methylleukotoxin (schwarze Dreiecke, Strichlinie), Methylisoleukotoxin (schwarze Kreise, durchgehende Linie), Methylleukotoxindiol (leere Dreiecke, Strichlinie) oder Methylisoleukotoxindiol (leere Kreise, durchgehende Linie), bereitgestellt in weniger als 2%igem Methanol (Vol.-%). Unmittelbar vor der Exposition (0 Stunden), und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung des Lipids wurden die bioelektrischen Eigenschaften [transepithelialer Widerstand (R_t), Kurzschlussstrom (I_eq)] mittels eines oben beschriebenen Volt-Ohm-Meters aufgenommen. 1(A) zeigt, dass die Behandlung von Monoschichten mit 300 μM Leukotoxindiol oder Isoleukotoxindiol zu einem erhöhten I_eq innerhalb der ersten fünf Stunden nach Exposition führt, was ein Hinweis auf einen reduzierten transepithelialen Netto-Ionentransport ist. Völlige Abwesenheit von I_eq innerhalb der ersten 24 Stunden nach Exposition weist auf einen Verlust der Epithelzelllebensfähigkeit hin. 1(B) zeigt die R_t-Werte derselben Monoschichten wie (A). Verminderte R_t wurde in den ersten fünf Stunden nach Exposition bei 300 μM Isoleukotoxin festgestellt, ein Hinweis, dass die parazelluläre Durchlässigkeit aufgrund der Verabreichung des Lipids anstieg. 24 Stunden, nachdem die Monoschichten entweder Methylleukotoxindiol oder Methylisoleukotoxindioi ausgesetzt worden waren, waren die R_t-Werte vernachlässigbar, was einen Abfall der Zelllebensfähigkeit und der Monoschichtintegrität als Folge der Behandlung mit dem einen oder dem anderen Diol bestätigt. Keine biologische Aktivität wurde in diesem System mit der Ausgangsverbindung, Monoepoxid(en) oder Diol(en) der Methyloleatreihe beobachtet. In unabhängigen Experimenten waren nur Methylleukotoxindiol und Methylisoleukotoxindiol wirksam, um intrazelluläres Calcium, überwacht mittels Fura-2, ansteigen zu lassen, wobei 50 μM die geringste wirksame Dosis in Alveolarepithelzellen war, während die anderen Verbindungen bei Dosen von bis zu 300 μM inaktiv blieben (Daten nicht dargestellt).
Weiters führten die Erfinder eine enzymatische In-vitro-Hydrolyse von Methylen-unterbrochenen AA-Diepoxide von Diepoxyeicosadienaten (DiEpEDEs) zu deren THF-Diolen oder von Dihydroxy-oxy-eicosadienaten (DiHOxyEDEs) durch und testeten diese auf biologische Aktivität.
So wurden Methyl-DiEpEDE und -DiHOxyEDE-Standards hergestellt und ihre Strukturen bestätigt. Die Identität des DiHOxyEDE-Standardgemisches wurde mittels Gaschromatographie/Massenspektrometrie-Verfahren unter chemischer Ionisierung mit negativen Ionen, d. h. Gas/Flüssigkeit-Chromatographie, gekoppelt mit Massenspektrometrie unter negativer chemischer Ionisierung (GC/NICI/MS) definiert, nachdem es durch ein Standardverfahren zu Pentafluorbenzyl-(PFB-)Estertrimethylsilyl-(TMS-)Ether umgesetzt worden war. Warum nicht ein Diastereomer-reiner Standard verwendet wurde, erklärt sich dadurch, dass alle Diastereomere, die in vivo anwesend sein können, umfasst werden sollten. Die GC/NICI/MS-Analyse dieser derivatisierten Verbindungen ergab ein sehr klares diagnostisches Fragment mit m/z = 497, das alle möglichen Diastereomere von Bis-TMS-Ethercarboxylatanionen ([M-PFB]^–) von DiHOxyEDEs umfasst. Darüber hinaus ergaben DiHOxyEDE-PFB-Ester-bis-d⁹-TMS-Ether ein m/z von 515; dies bestätigt die Gegenwart von nur zwei Hydroxylgruppen. Hydrierte PFB-Ester-bis-TMS-Ether ergaben ein m/z von 501; dies weist auf die Gegenwart von zwei Olefinen hin. Bedauerlicherweise konnten solche Nachweismethoden für DiEpEDEs nicht eingesetzt werden, da diese Verbindungen offenbar Umordnungen erfahren und dadurch das Nachweisen der entsprechenden Carboxylatanionen behindern.
Um die Biogenese von DiEpEDEs zu untersuchen, wurden Lebern von Clofibrat-gefütterten Mäusen extrahiert, verseift und derivatisiert. Die Analyse der PFB-Ester-TMS-Ether-Derivate aus Extrakten von mit Clofibrat gefütterten Mäuselebern zeigten die Gegenwart von Verbindungen an, die ein m/z = 497 bei derselben Retentionszeit ergaben wie die bestätigten Standardgemische der Erfinder. Weiters führte das Anreichern der Leberproben mit dem synthetisierten Standardgemisch zu Coelution der Analyten mit den Standards. Zusätzlich verhielten sich die Analyten in den behandelten Lipidextrakten unter allen anderen oben beschriebenen Derivatisierungsbedingungen gleich wie die synthetischen Standards der Erfinder. Die Behandlung von Methylarachidonat mit den Extraktions-, Hydrolyse- und Derivatisierungsverfahren der Erfinder ergab keine DiHOxyEDEs. Dies schloss die Möglichkeit einer künstlichen Produktion von DiEpEDEs und DiHOxyEDEs aus AA aus. Obwohl der Ausschluss des Hydrolyseschritts aus der Methodik der Erfinder die DiHOxyEDE-Produktion aus synthetischen DiEpEDE-Standards (freien Säuren) ausschloss, verhinderte dies nicht gänzlich den Nachweis von DiHOxyEDEs in Leberextrakten. Dies bestätigte, dass DiHOxyEDEs authentische Metaboliten von AA in Mäuselebern sind. Da die Erfinder weiters fähig waren, DiHOxyEDE-PFB-Ester ohne Hydrolyse der Lipidextrakte zu bilden, kann man daraus schließen, dass DiHOxyEDEs in den Zellen in Form der freien Säure vorliegen.
Erhöhte DiHOxyEDE-Konzentrationen in den verseiften Präparaten der Erfinder zeigen, dass in Abwesenheit eines Hydrolyse-Schrittes ein Teil der nachgewiesenen DiHOxyEDEs durch Hydrolyse der Epoxide in DiEpEDEs und/oder acylierten DiEpEDEs und DiHOxyEDEs gebildet wurden. Umgekehrt weisen die erhöhten Konzentrationen an DiHOxyEDEs in Clofibrat-behandelten Mausgeweben darauf hin, dass ein biologischer und nicht ein autooxidativer Weg zu deren Produktion führt. Eine an dere Möglichkeit ist, dass eine erhöhte Konzentration an H₂O₂, resultierend aus der Peroxisomproliferation, für einen Teil der AA-Epoxidierung verantwortlich ist, was wiederum zur DiHOxyEDE-Produktion führt. Die Signifikanz dieses Weges der Epoxidierung kann minimal sein, da die Induzierbarkeit von Cytochrom P-450 durch Clofibrat festgestellt wurde. Schließlich enthalten Gewebe von adipösen Zucker-Ratten höhere Konzentrationen an DiHOxyEDE als jene von mageren Tieren. Da adipöse Zucker-Ratten zu einer Erkrankung an Diabetes neigen, kann dies ein Hinweis darauf sein, dass DiHOxyEDEs eine physiologische Rolle in der Ätiologie dieser Erkrankung spielen.
Im Bemühen, die biologische Aktivität von DiEpEDEs und DiHOxyEDEs zu definieren, wurden diese Verbindungen chemisch hergestellt und als Methyfester getrennt. Weiters wurde Methyl-AA, Diastereomer- und Positionsgemische aus Methyl-DiEpEDE und Methyl-DiHOxyEDE in einem Calciumzufluss-Test getestet, wobei isolierte Epithelzellen der Lungenalveole von Ratten verwendet wurden.
Das Methyl-DiHOxyEDE-Gemisch löste ein sofortiges, schnelles und dauerhaftes Ansteigen des Zuflusses von Ca²⁺ aus dem Medium in die Zellen aus (Daten nicht dargestellt). Darüber hinaus zeigte sich, dass DiHOxyEDEs für Keratinozyten und Fibroblasten über einen langen Zeitraum nichttoxisch sind. Durch Aussetzen gegenüber einem Methyl-DiEpEDE-Gemisch entstand ein verzögertes, langsames und unbeständiges Ansteigen des Ca²⁺-Zuflusses in die Eptihelzellen. Das beschränkte Ausmaß an Aktivität, das durch die Diepoxide beobachtet werden konnte, kann durch deren In-situ-Umsetzung zu DiHOxyEDE verursacht worden sein. Methyl-AA beeinflusste den Zufluss von Ca²⁺ in die pulmonalen Epithelzellen nicht, obwohl diese Zellen auf einen Ca²⁺-Ionophor ansprachen.
Um die quantitative Beziehung zwischen Struktur und Aktivität von Methyl-DiHOxyEDEs zu untersuchen, wurden sie weiter gereinigt und jeweils mit pulmonalen Epithelzellen inkubiert. Wie zu erkennen ist waren all die Verbindungen, die in trans-Konfiguration über den Tetrahydrofuranring vorlagen (nachstehend als trans-Isomere bezeichnet), bezüglich des Auslösens eines Ca²⁺-Zuflusses praktisch inaktiv. Regioisomere mit einer exozyklischen Hydroxylgruppe am ω-Terminus der Fettsäure waren stets wirksamer. Darüber hinaus erhöhte eine Oxidation inmitten der Kette die Wirksamkeit von DiHOxyEDE.
Tabelle 1 veranschaulicht neue, biologisch aktive Verbindungen, die die Erfinder entdeckt haben, gemeinsam mit mehreren Daten bezüglich der Aktivität.
TABELLE 1
TABELLE 2
Wie in den Tabellen 1 und 2 zusammengefasst ist, wurden die neuen Verbindungen dieses dritten AA-Stufenprozesses, nämlich DiEpEDEs und die 5-trans und 5-cis-Isomere von DiHOxyEDEs, auf ihre Fähigkeit getestet, ein Ansteigen an intrazellulärem freiem Ca²⁺ in pulmonalen Alveolarzellen von Ratten zu verursachen. Zuerst testeten die Erfinder die Wirkung des Ausgangsmoleküls Methyl-AA und fanden heraus, dass diese nicht die Fähigkeit besaß, ein Ansteigen an intrazellulärem Ca²⁺ auszulösen. Interessanterweise führte eine Inkubation dieser Zellen mit Methyl-DiHOxyEDE über mehr als 24 Stunden nicht zu Zelltod. In einem weiteren Schritt testeten die Erfinder ein Gemisch aus Diastereomeren und Positionsisomeren von DiEpEDEs und fanden heraus, dass es bei Konzentrationen im Bereich von 20 μM bis 300 μM ein allmähliches aber stetiges Ansteigen von intrazellulärem Ca²⁺ verursachte, wobei dies von der Dosis abhing. DiEpEDEs werden zu DiHOxyEDEs umgesetzt, daher kann deren allmähliche Wirkung auf deren langsame Umsetzung zu DiHOxyEDEs durch zelluläre Epoxid-Hydrolasen zurückgeführt werden. Ein racemisches Gemisch aus cis- und trans-Regioisomeren von DiHOxyEDEs verursachte einen drastischen und sofortigen Anstieg an intrazellulärem Ca²⁺.
Wie in Tabelle 1 zusammengefasst, wurde die Messung von intrazellulärem Calcium wie folgt durchgeführt. Intrazelluläres freies Ca²⁺ wurde mittells der FURA-2-Methode gemessen (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260, 3440–3450 (1985)). Zellen wurden auf einem Deckglas gezüchtet und mit FURA-2/AM (1 μM) (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA) 20 Minuten lang bei 37°C geladen. Die Zellen wurden dann vom physiologischen Puffer abgespült und auf ein inverses Mikroskop gegeben, das mit einem Spektralfluorimeter (Photon Technology Inc.) verbunden war. Einzelne Zellen wurden abwechselnd bei 340 nm und 380 nm angeregt, und die Emission wurde bei 510 nm bei beiden Anregungswellenlängen gemessen. Das Fluoreszenzverhältnis (340/380) ist eine indirekte Messung von intrazellulärem freiem Ca²⁺. Zur Messung des Zuflusses von extrazellulärem Calcium in die Alveolarepithelzellen wurden kultivierte Pneumozyten mit einem physiologischen Puffer mit einem End-pH von 7,2 inkubiert, wobei Folgendes (in mM) enthalten war: NaCl (125), KCl (5), KH₂PO₄ (1,2), CaCl₂ (2,0), HEPES (25), Glucose (6) und MgSO₄ (1,2). Für Experimente, die in Abwesenheit von extrazellulärem Calcium durchgeführt wurden, wurden Zellen in einem nominellen Calciumpuffer, der (in mM) NaCl (125), KCl (3), KH₂PO₄ (1,2), HEPES (25), MgSO₄ (1,2) und MgCl₂ (3,8) enthielt, aufrechterhalten.
Während des Ablaufes der Experimente, die calciumfreie Inkubation erforderten, wurde Ethylenglykol-bis-tetraessigsäure (EGTA) dem nominellen Ca²⁺-Puffer in einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben, um das restliche extrazelluläre Calcium zu entfernen. Am Ende der calciumfreien Inkubation wurde die Rekultivierung des nominellen Ca²⁺-Puffers auf eine ausreichende Calciumkonzentration durch Zugabe von 3 mM CaCl₂ durchgeführt. Am Ende aller Experimente wurde der Calciumionophor Ionomycin als positive Kontrolle zugegeben, um sicherzustellen, dass der FURA-2-Indikator auf Veränderungen des intrazellulären freien Calciums reagierte.
Um die Beziehung zwischen Struktur und Aktivität in den DiHOxyEDEs zu untersuchen, wurden diese gereinigt und auf ihre Fähigkeit getestet, ein Ansteigen an intrazellulärem freiem Ca²⁺ auszulösen. Faszinierenderweise wurde herausgefunden, dass die cis-DiHOxyEDEs (bei 50 μM) bezüglich eines Anstiegs an intrazellulärem Ca²⁺ sehr viel wirksamer waren als trans-DiHOxyEDEs. Diese cis-DiHOxyEDEs verursachten ein Ansteigen an Ca²⁺, das im Bereich von 23% bis 161% höher als die Ruhekonzentrationen 5 Minuten nach der Aussetzung war. Die trans-DiHOxyEDEs verursachten jedoch nur einen geringen Anstieg an intrazellulärem freiem Ca²⁺ im Bereich von 0% bis 11% über den Ruhekonzentrationen von freiem Ca²⁺ 5 Minuten nach der Aussetzung gegenüber den DiHOxyEDEs. Daher gab es einen signifikanten Unterschied in der biologischen Wirksamkeit zwischen den cis- und den trans-Stereoisomeren dieser neuen AA-Metaboliten. Die bioaktive Wirksamkeit hing auch von der Anordnung der Tetrahydrofurandiolgruppen entlang der Kohlenstoffkette ab. Die Anordnung der cis-Tetrahydrofurandiol-Gruppierung an einem der Enden der Kohlenstoffkette resultierte in einer Verminderung der DiHOxyEDE-Fähigkeit, ein Ansteigen an intrazellulärem Ca²⁺ auszulösen; d. h., dass Oxidation inmitten der Kette die Wirksamkeit ansteigen ließ. Wie bereits zuvor bemerkt, fasst Tabelle 1 die Strukturen der neuen biologisch aktiven Arachidonsäuremetaboliten zusammen.
Das Calciumion war lange als ein wichtiger physiologischer Regulator bekannt. Viele Zellen reagieren auf extrazelluläre Stimuli durch eine Änderung ihrer intrazellulären Calciumkonzentration, was wiederum biochemische Veränderungen entweder per se oder durch Wechselwirkung mit Calmodulin auslöst. In zahlreichen Nerven- und Muskelzellen resultiert eine Aktivierung von Adenylat-Cyclase in einem Zufluss von extrazellulärem Calcium. cAMP aktiviert einen spannungsabhängigen Calciumkanal in der präsynaptischen Nervenmembran, was Calciumionen einströmen lässt und synaptische Transmission auslöst. Der Calciumzufluss in Muskelzellen führt zur Muskelkontraktion und ist verantwortlich für eine erhöhte Herzschlagfrequenz mit erhöhter Herzschlagstärke, was durch β-adrenergische Agonisten ausgelöst wird. Innerhalb des Gasaustauschbereichs der Lunge eines erwachsenen Säugers stellt das Alveolarepithel den Hauptwiderstand für die Bewegung von Wasser und gelösten Substanzen durch die Luft-Blut-Schranke und in die Lufträume der Alveolen bereit und beugt somit pulmonalen Ödemen vor. Die Veränderung der intrazellulären Calciumkonzentrationen in pulmonalen Epithelzellen kann deren Fähigkeit ändern, die Epithelschrankenfunktion und die Produktion oberflächenaktiver Substanzen aufrechtzuerhalten.
Beide an der Biogenese von DiHOEDEs beteiligten Enzyme, von denen die Erfinder gezeigt haben, dass sie endogene Metaboliten mit der Fähigkeit, Calciumzufluss auszulösen, sind, sind durch eine Vielzahl von Arzneimitteln und Pestiziden induzierbar. Die In-vitro-Untersuchungen der Erfinder zeigten, dass synthetische Gemische aus Methyl-DiHOEDEs intrazelluläre Calciumkonzentrationen in isolierten pulmonalen Epithelzellen rasch anheben können. Gemische von Vorläufer-Methyl-DiEpEDEs erhöhten die intrazellulären Calciumkonzentrationen mit einer signifikant geringeren Geschwindigkeit. Nach dem Reinigen des Gemisches aus Methyl-DiHOEDE-Isomeren beobachteten die Erfinder, dass manche dieser Regio- und Positionsisomere wirksamer als andere und manche im Test auf intrazellulären Calciumzufluss inaktiv waren (siehe Tabelle 1).
Da DiHOEDEs bioaktiv sind und ihre Biogenese induzierbar ist, sollten diese neuen Metaboliten als wichtige chemische Mediatoren betrachtet werden, die die Fähigkeit besitzen, zelluläre Homöostase zu verändern.
Daher deckt die Entdeckung dieser biologisch aktiven Eicosanoide auch einen anderen wichtigen, chemischen Mediationsweg auf, der durch Xenobiotika beeinflusst wird und fähig ist, intrazelluläre Calciumkonzentrationen anzuheben. Dieser Weg kann möglicherweise als Möglichkeit für pharmakologische Erfindungen dienen, um bestimmte biologische Ereignisse zu beeinflussen. Schließlich können DiHOEDEs eine wertvolle Gruppe biochemischer Werkzeuge zur Durchführung von Experimenten in Verbindung mit Calcium (und anderen Ionen) darstellen.
Aufgrund ihrer biologischen Aktivität weisen diese Verbindungen zahlreiche Verwendungszwecke auf. Wie Leukotoxine und deren Diole können sie beispielsweise als diagnostische und klinische Forschungsmittel eingesetzt werden, und Antikörper gegen sie können gebildet werden. Wurden erst einmal Antikörper für Linoleat- oder Arachidonatoxylipinen erzeugt, können sie eingesetzt werden, um diese Verbindungen in spezifischen Gewebearten mittels immunhistologischer Verfahren zu überwachen.
Polyklonale Antikörper wurden gegen DiHOxyEDEs und andere Oxylipine unter Verwendung der im Folgenden beschriebenen Verfahren erzeugt. Solche Antikörper wurden und werden im Allgemeinen in Tieren durch vielfache subkutane (sk) oder intraperitonale (ip) Injektionen des Haptens und eines Adjuvans erzeugt. Es kann nützlich sein, die Verbindungen unter Verwendung eines bifunktionellen oder derivatisierenden Mittels, z. B. Maleimidbenzoyl-Sulfosuccinimidester (Verbindung über Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (über Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl₂ oder R¹N=C=NR, mit einem Protein zu konjugieren, das in den zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z. B. Napfschnecken-Hämocyanin-, Serumalbumin-, bovines Thyreoglobulin- oder Sojabohnentrypsin-Inhibitor. Das Verbinden kann über C-1-Säure, Diol oder vorzugsweise einen ω-Kohlenstoff-Linker, der die wichtigsten funktionellen Gruppen aufweist, vollzogen werden. Ein Metabolit des Oxylipins kann als Hapten eingesetzt werden. Das β-Glucuronidmetabolit des Leukotoxindiols wurde beispielsweise für diesen Zweck hergestellt. Verschiedene Werkzeuge in den heterologen Tests werden die Nachweisempfindlichkeit erhöhen.
Tiere können gegen die immunogenen Konjugate oder Derivate durch Kombinieren von 0,1 mg des Konjugats, für Kaninchen und Mäuse mit Freundschem komplettem Adjuvans, und subkutanes Injizieren der Lösung an mehreren Stellen (Kaninchen) oder intraperitonafes Injizieren bei Mäusen immunisiert werden. Einen Monat später werden die Tiere geboostet. Sieben bis vierzehn Tage später wird den Tieren Blut abgenommen, und das Serum wird auf Anti-Haptentiter untersucht. Die Tiere werden geboostet, bis der Titer den Sättigungseffekt aufweist. Vorzugsweise wird der Titer mit einem Konjugat desselben Haptens geprüft, allerdings mit einem unterschiedlichen Protein und/oder über einen unterschiedlichen Vernetzer verbunden. Auch werden Aggregationsmittel wie Alaun verwendet, um die Immunantwort zu verstärken.
Monoklonale Antikörper werden durch Gewinnung von Milzzellen aus immunisierten Tieren und Immortalisieren dieser Zellen auf herkömmliche Weise, beispielsweise durch Fusion mit Myelomzelien oder durch EB-Virustransformation und Screenen auf Klone, die den gewünschten Antikörper aufweisen.
Solche Antikörper sind in diagnostischen Untersuchungen nützlich. In einer Ausführungsform zur Untersuchung einer Rezeptorverbindung wird eine Antikörperzusammensetzung, die sich an alle einer ausgewählten Vielzahl von Vertretern der neuen Verbindungen bindet, an eine unlösliche Matrix immobilisiert, die Testprobe wird mit der immobilisierten Antikörperzusammensetzung in Kontakt gebracht, um all die Verbindungen zu adsorbieren, und dann werden die immobilisierten Verbindungen mit zahlreichen, für jeden Vertreter spezifischen Antikörper in Kontakt gebracht, wobei jeder der Antikörper jeweils als spezifischer Antikörper für ein vorbestimmtes Mitglied der Familie identifiziert werden kann, wie z. B. durch einzigartige Markierungen wie diskrete Fluorophore oder dergleichen. Durch Bestimmung der Gegenwart und/oder der Menge jeder einzelnen Markierung können der relative Anteil und die Menge jedes Mitglieds der Familie bestimmt werden.
Solche Antikörper sind auch nützlich zur Affinitätsreinigung aus Kulturen oder natürlicher Quellen oder aus rekombinanten Zellen. Die Antikörper und resultierende Im mundiagnostik für Leukotoxine und Leukotoxindiole sind zur Vorhersage einer Neigung zu ARDS und verwandten Erkrankungen, des Verlaufs der Erkrankung und für erfolgreiche Überwachungstherapien nützlich. Immundiagnostik für Tetrahydrofurandiole sind zur Überwachung des Erkrankungsverlaufs und der Therapie beispielsweise bei Diabetes und Entzündungserkrankungen nützlich.
BEISPIEL 1
Polyklonale Antikörper an den Arachidonsäure-THF-Diolmetaboliten
Hapten: Ein Gemisch der THF-Diole von Arachidonsäure (AATHF-Diole; Verbindungen 1–12 in Tabelle 1) wurde als Hapten für die Bildung von Antikörpern eingesetzt.
Bindungschemie: Das Hapten wurde über die Carbonsäuregruppe an verschiedene Proteine gebunden. Die Carbonsäure der AATHF-Diole wurde unter Einsatz von N-Hydroxysulfosuccinimid und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDG) aktiviert. Die aktivierten AATHF-Diole wurden dann mit verschiedenen Proteinlösungen (Rinderserumalbumin, BSA; Ovalbumin, OVA; Konalbumin, CONA; Hämocyanin der Napfschnecke, KLH) umgesetzt, um die folgenden Proteinkonjugate (Beschichtungsantigene) zu ergeben:
BSA-AATHF-Diole
OVA-AATHF-Diole
CONA-AATHF-Diole
KLH-AATHF-Diole
239A30-AATHF-Diole
239A30 ist ein Ovalbumin, dessen freie Amiongruppen mit 1,3-Diaminopropan modifiziert wurden, wodurch ein Spacer zwischen der Proteinoberfläche und dem konju gierten Hapten bereitgestellt wird. Alle Konjugate wurden durch ausgiebige Dialyse gereinigt und bei –20°C gelagert.
Immunisierung von Kaninchen: Die KLH-AATNF-Diole und 239A30-AATHF-Diole wurden verwendet, um Kaninchen zu immunisieren. Polyklonale Antikörper wurden in weiblichen weißen Neuseeland-Kaninchen (3–5 kg) erzeugt. Antigene wurden in Freundschem komplettem Adjuvans emulgiert und in die Haut am Rücken verabreicht. In einer typischen Immunisierungsvorschrift wurde den Kaninchen am ersten Tag intradermal 100 μg Antigen injiziert. Nach einem Monat wurden die Kaninchen mit einer zusätzlichen Dosis von 50–100 μg Antigen in Freund's inkomplettem Adjuvans geboostet, und zehn Tage später wurden 10–15 ml Blut aus der Ohrvene abgenommen. Serum wurde durch Zentrifugieren isoliert, Natriumazid als Konservierungsmittel (0,02%) zugegeben, dann in Aliquoten aufgeteilt und bei –20°C oder –80°C gelagert. Das Serum wurde zur Erkennung des Analyten gescreent. Da Antikörper gegen AATHF-Diole erhalten wurden, wurde das Boosten und die Blutabnahme wie zuvor beschrieben monatlich fortgesetzt. Die Kaninchen wurden nach dem vierten Boosten ausbluten gelassen. Die Charakterisierung der Antikörper erfolgte anhand dieser letzten Blutabnahme.
Screening von Kaninchen-Seren, um sie an die wie oben beschrieben produzierten Beschichtungsantigene zu binden: Um zu bestimmen, ob die produzierten Antiseren die AATHF-Diole binden könnten, wurde eine Schachbretttitration durchgeführt, wobei jedes Kaninchenserum gegen die verschiedenen Beschichtungsantigene, die wie oben beschrieben produziert worden waren, gescreent wurde. Die Schachbretttitrationen wurden mit Hilfe einer enzymgekoppelten Immundadsorptionsbestimmung durchgeführt. Kurz beschrieben wurden die Beschichtungsantigene auf die Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte in einen Puffer mit hohem pH-Wert unter Einsatz passiver Adsorption aufgetragen. Jedes Beschichtungsantigen wurde in verschiedenen Konzentrationen getestet. Nach einem Waschschritt wurden in jede Vertiefung unterschiedliche Verdünnungen des Antikörpers zugesetzt. Nach einer Inkubation wurde ein Sekundärantikörper (an alkalische Phosphatase gebun denes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG) zugesetzt und bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem Waschschritt wurden die gebundenen Antikörper anhand der Umsetzung eines p-Nitrophenylphosphat-Substrats zu p-Nitrophenol detektiert.
Die resultierenden Antiseren banden sich gut an die BSA-AATHF-Diol- und die OVA-AATHF-Diol-Beschichtungsantigene. Die CONA-AATHF-Diol-Beschichtung wurde bisher noch nicht getestet. Nachfolgendes Screenen zeigte, dass sich der Antikörper 935 (Anti-KLH-AATHF-Diol) gut an 239A30-AATHF-Diol band.
ELISA zum Screenen auf Lösungsmittelbeständigkeit: Wegen möglicher Löslichkeitsprobleme des Analyten wurde DMSO ausgewählt, um die Solubilisierung zu verbessern, während jegliche negative Auswirkungen des Lösungsmittels auf den Antikörper eingeschränkt wurden. So wurden in den ersten Studien Antikörperbindung und -hemmung durch AATHF-Diole in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von DMSO gescreent. Konzentrationen zwischen 10 und 25% ergaben keinen signifikanten Abfall des Maximalsignals, das bei Abwesenheit des Analyts erzeugt wird. Die relative Hemmung durch AATHF-Diole blieb also unverändert. So wurden in Folgeexperimenten Konzentrationen von 25% DMSO eingesetzt.
Kompetitiver Enzymimmuntest: Es wurde ein standardisiertes indirektes Kompetitiv-ELISA-Format eingesetzt, um AATHF-Diole nachzuweisen. Kurz beschrieben wurden die Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit 239A30-AATHF-Diol mittels passiver Adsorption beschichtet. Nach einer Waschung wurde der Analyt (AATHF-Diole oder andere strukturverwandte Verbindungen) und danach der Anti-AATHF-Diol-Antikörper (#935) zugesetzt. Nach einer Stunde Inkubation wurden die nicht gebundenen Materialien aus der Vertiefung durch einen Waschschritt entfernt. Der Sekundärantikörper (an alkalische Phsophatase gebundenes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG) wurde in jede Vertiefung zugesetzt und für eine Stunde inkubiert. Ungebundenes Material wurde weggewaschen und das Substrat zugegeben. Die Bildung von gefärbtem Produkt war umgekehrt proportional zur Menge des in der Vertiefung enthaltenen Analyten.
Hemmung im kompetitiven Enzymimmuntest durch Arachidonsäuremetaboliten und andere strukturverwandte Verbindungen: Dieses System (Beschichten mit 239A30-AATHF-Diolen, 1 μg/ml; Antikörper 935 verdünnt auf 1/1000; Präparieren des Analyten in einer Endkonzentration in der Vertiefung von 25% in DMSO) wurde eingesetzt, um Screenings zur Hemmung durch unterschiedlichen Arachidonsäuremetaboliten und andere strukturverwandte Verbindungen durchzuführen (siehe nachstehende Tabelle 3).
TABELLE 3 Hemmung durch unterschiedliche Arachidonsäuremetaboliten und andere, strukturverwandte Verbindungen
Im ersten Experiment beliefen sich die getesteten Konzentrationen auf 1, 100, 10.000 und 1.000.000 pg/μl. Im zweiten Experiment beliefen sich die getesteten Konzentrationen auf 10^–6 pg/μl, 10^–4 pg/μl, 0,01, 1, 100, 10.000 und 1.000.000 pg/μl.
Obwohl nahezu bei allen Verbindungen die erwarteten, S-förmig verlaufenden Kurven erhalten wurden, war die Spannweite der Konzentrationen zu groß, um eine IC50 (häufig als Indikator für die Empfindlichkeit herangezogen) genau zu berechnen. Daher sind die hierin angegebenen Daten als prozentuelle Hemmung bei 100 pg/μl angegeben.
Wurde dieselbe Verbindung in beiden Experimenten getestet, so waren die Hemmungen bei 100 pg/μl bemerkenswert ähnlich, ein Hinweis in diesem Screenexperiment, dass diese Antikörper THF-Diole von Arachidonsäure, Linolsäure und Eicosadiensäure sowohl in Form der freien Säure als auch in Form des Methylesters erkennen können.
BEISPIEL 2
Mäusen wurden (via intravenöse Injektion) Leukotoxin/Isoleukotoxin (400 mg/kg) oder Leukotoxin/Isoleukotoxindiole (400 mg/kg) über die Schwanzvene verabreicht. Die Mäuse, denen Leukotoxin/Isoleukotoxindiole verabreicht wurden, starben innerhalb von 5 Minuten nach der Injektion an Atembeschwerden, während die Tiere mit der Leukotoxin/Isoleukotoxin-Injektion überlebten.
In Summe gesehen haben die Erfinder gezeigt, dass Leukotoxindiol in zahlreichen Zellen, wie z. B. Alveolarepithel von Ratten, menschlichem Bronchialepithel (HeLa) und Herzmuskel, rascher wirkt und stärker toxisch ist als Leukotoxin. Intravenöse Injektionen von Leukotoxindiol (300 mg/kg) induzierten rasch ARDS-ähnliche Symptome, wie z. B. pulmonale Ödeme, Atembeschwerden und mehrfaches Organversagen. innerhalb einer Stunde Aussetzungszeit gegenüber diesem Leukotoxindiol weisen sowohl Mäuseleber als auch -lunge drastische Anzeichen von Zellnekrose auf. Diese beiden Organe sind auch die ersten, die im Krankheitsverlauf von ARDS versagen. Diese unerwarteten Ergebnisse sind besonders erstaunlich, da Epoxid-Hydrolase normalerweise als Entgiftungsenzym galt. Demgemäß wird die vorliegende Erfindung in einem Aspekt angewandt, um Entzündungserkrankungen, insbesondere ARDS, zu behandeln, indem sie Verfahren zum Screenen von Inhibitoren von Epoxid-Hydrolase bereitstellt und das Verabreichen therapeutischer Mengen an Epoxid-Hydrolase-Inhibitoren an Patienten vorsieht. Da die Erfinder entdeckt haben, dass neue DiHOxyEDEs Biomarker für Entzündungen sind, ist es darüber hinaus ein weiterer Aspekt dieser Erfindung, Antikörper gegen Linoleat- oder Arachidonat-Oxylipinen zu bilden, die mittels immunhistologischer Verfahren in Geweben nützlich überwacht werden können.
Wenn die Erfindung vorangehend auch in Verbindung mit bevorzugten spezifischen Ausführungsformen beschrieben wurde, so versteht es sich dennoch, dass die Beschreibung und die Beispiele die Erfindung den Schutzumfang der Erfindung, der durch den Schutzumfang der beiliegenden Patentansprüche definiert ist, veranschaulichen, nicht jedoch einschränken sollen.

Claims

Verwendung eines Inhibitors von löslicher Epoxid-Hydrolase oder mikrosomaler Epoxid-Hydrolase zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Entzündungserkrankung.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Entzündungserkrankung Atemnotsyndrom bei Erwachsenen ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin der Inhibitor von löslicher Epoxid-Hydrolase oder mikrosomaler Epoxid-Hydrolase die Bildung von Dihydroxy-oxy-eicosadienaten (DiHOxyEDEs) oder die Bildung von Dihydroxylipiden hemmt.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin der Inhibitor von löslicher Epoxid-Hydrolase oder mikrosomaler Epoxid-Hydrolase eine Antisense-Nukleinsäure, ein alternatives Substrat für die Enzyme, ein Chalkonoxid, ein Phenylglycidol, ein Lipidalkoxid oder ein lipophiles Diimid ist.
Verwendung nach Anspruch 4, worin das Chalkonoxid 4-Phenylchalkonoxid oder 4-Fluorchalkonoxid ist.
Verwendung nach Anspruch 4, worin das Phenylglycidol S,S-4-Nitrophenylglycidol ist.
Verwendung nach Anspruch 4, worin der Inhibitor von löslicher Epoxid-Hydrolase oder mikrosomaler Epoxid-Hydrolase das 9-Methoxid von Stearinsäure ist.
Verwendung nach Anspruch 4, worin der Inhibitor von löslicher Epoxid-Hydrolase oder mikrosomaler Epoxid-Hydrolase Dicyclohexylcarbodiid ist.
Verwendung nach Anspruch 4, worin der Inhibitor von löslicher Epoxid-Hydrolase oder mikrosomaler Epoxid-Hydrolase ein Methylarachidonatmethoxid ist.