DE69937146T2

DE69937146T2 - Verfahren zur quantifizierung der blutplättchenaktivierung

Info

Publication number: DE69937146T2
Application number: DE69937146T
Authority: DE
Inventors: David J. Shelburne SCHNEIDER; Burton E. Colchester SOBEL; Paula B. Essex Jct. TRACY; Paul G. Burlington HELD; Paul D. Burlington HALE; Norman R. Shelburne ALPERT
Original assignee: Lionheart Technologies Inc
Current assignee: Lionheart Technologies Inc
Priority date: 1998-07-15
Filing date: 1999-07-02
Publication date: 2008-08-28
Anticipated expiration: 2019-07-03
Also published as: WO2000004388A3; EP1095280B1; DE69937146D1; US6391568B1; WO2000004388A2; EP1095280A2; ATE373828T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Quantifizieren und Bewerten einer Blutplättchenaktivierung in Vollblutproben und zum Überwachen der Dosierung von blutverdünnenden pharmakologischen Mitteln nach den Ansprüchen 1, 21 und 37. Das Verfahren umfasst ein Einwirkenlassen einer physiologischen Konzentration eines Agonisten auf die Blutplättchen, die einige der Blutplättchen aktiviert, was zur Entstehung mindestens einer Bindungsstelle auf der Oberfläche der aktivierten Plättchen führt, und Messen der aktivierten Plättchen. Die vorliegende Erfindung erlaubt die Bewertung spezifischer Blutplättchenaktivierungskomponenten.
2. Beschreibung des verwandten Stands der Technik
Blutplättchenaktivierung ist eine kritische Komponente von Hämostase oder Blutungsstillstand, dem Prozess, der nach einer Gefäßverletzung Bluten verhindert. Während einer Hämostase haften sich Blutplättchen an die Stelle der Gefäßverletzung an. Die Blutplättchen erfahren eine Aktivierung, die zu einer Veränderung in ihrer Form führt, was die Entstehung eines hämostatischen Verschlusses erleichtert. Die Blutplättchenaktivierung bringt auch einen als Degranulation bekannten Prozess mit sich, der die folgenden Bestandteile liefert: Proteine (z. B. Faktor V und Fibrinogen) und Kalzium, das für die Koagulierungsabfolge notwendig ist; Agonisten (z. B. Serotonin, Thromboxan und ADP), die zusätzliche Blutplättchen aktivieren und sammeln; und eine negativ geladene Phospholipid-Oberfläche am Blutplättchen, die eine Ansammlung und die Aktivierung von Koagulationsfaktoren begünstigt. Eine genaue Bewertung der Blutplättchenaktivierung würde es Ärzten ermöglichen, das Blutungsrisiko nach invasiven Eingriffen bei Patienten mit sowohl angeborener als auch erworbener gestörter Blutplättchenfunktion (z. B. im Zusammenhang mit Nierenversagen oder nach Einnahme von Medikamenten, welche die Blutplättchenfunktion verändern) bestimmen zu können.
Die Blutplättchenaktivierung ist auch bei Thrombose kritisch, einem pathologischen Prozess, bei dem die Aktivierung von Blutplättchen und die Koagulationskaskade als Reaktion auf das Aufreißen atherosklerotischen Belags zu einem Verschluss des Blutgefäßes führt. Ein Thrombose komplizierender Belagsaufriss ist für die meisten Myokard-Infarkte (Herzanfälle) und zerebrovaskulären Syndrome (Schlaganfälle) verantwortlich. Es stellte sich heraus, dass eine Therapie mit Mitteln, die eine Aggregation von Blutplättchen verhindern, wie etwa Aspirin, Ticlopidin und ReoPro das Auftreten von Herzmuskelinfarkten und Herztod bei Patienten mit einer bekannten Herzerkrankung reduzierten. Es erwies sich auch, dass eine Therapie mit Aspirin und Ticlopidin das Auftreten eines Schlaganfalls bei Patienten mit einer zerebrovaskulären Erkrankung senkte.
Die Hauptkomplikation bei der blutverdünnenden Therapie ist Blutung. Eine genaue Abschätzung der Blutplättchenaktivierung würde die Bestimmung einer optimalen Therapie für jeden Patienten erleichtern und dazu beitragen, das Auftreten von Thrombose zu reduzieren, während gleichzeitig die hämostatische Reaktion aufrechterhalten wird, die zum Verhindern von Blutung notwendig ist.
Herkömmliche Assays zur Blutplättchenfunktionsanalyse werden an blutplättchenreichem Plasma durchgeführt und nicht an Vollblut. Für solche Zwecke vorgesehene Blutplättchenpräparate können ihre funktionalen Eigenschaften verändern und bewirken, dass die Analyseergebnisse falsch sind. Beispielsweise ermittelt eine Blutplättchenaggregationsmessung die Aggregation von Blutplättchen und reflektiert die Aktivierung des Oberflächen-Glycoproteins IIb-IIIa und die Degranulation von Blutplättchen. Dieses Verfahren beruht auf einem in vitro-Phänomen, das mit der in vivo-Blutplättchenfunktion wenig zu tun hat.
Das US-Patent Nr. 5,529,902 offenbart ein Fluoreszenz-Immunoassay zur Blutplättchenfunktionsanalyse, das auf der Bestimmung der P-Selectin-Expression beruht. Diese Analyse krankt an den folgenden Nachteilen: (1) wie bei den herkömmlichen Blutplättchenfunktionsanalysen wird das Verfahren unter Verwendung blutplättchenreichen Plasmas durchgeführt und kann nicht direkt an Vollblutproben durchgeführt werden; (2) das Verfahren ist dadurch kompliziert, dass die Anzahl von Blutplättchen in jeder Probe unabhängig mengenmäßig bewertet werden muss, bevor die Analyse durchgeführt wird; (3) die Analyse macht es erforderlich, dass jede Probe in zwei Teile aufgeteilt wird, wovon einer als Kontrolle dient; und (4) die Analyse erlaubt die Bestimmung nur eines Markers der Blutplättchenaktivierung.
Strömungszytometrie wurde im Zusammenhang mit Oberflächen-Glycoprotein-spezifischen Antikörpern verwendet, um das Ausmaß einer Blutplättchenaktivierung zu bestimmen [siehe z. B. R. E. Scharf et al., Arteriosclerosis and Thrombosis, 12, 1475 (1992]. Obwohl Vollblutproben unter Verwendung von auf Strömungszytometrie beruhenden Assays getestet werden können, sind die Prozeduren zeitaufwändig und erfordern eine kostspielige Instrumentausrüstung, und sind deshalb vom praktischen Einsatz her weniger geeignet, große Anzahlen von Proben schnell und wirtschaftlich zu testen.
Eine anderes allgemein verwendetes Assay zur Gesamtblutplättchenfunktionsanalyse ist die Messung der Blutungszeit. Diese Prozedur ermittelt Hämostase und reflektiert nur indirekt die Verteilung von Blutplättchen und die Koagulationskaskade. Sie ist bekanntermaßen unempfindlich, was die eigentliche Blutplättchenfunktion betrifft.
Zusammenfassend haben die kritische Rolle von Blutplättchen bei Hämostase und Thrombose und die Entwicklung neuer, wirksamerer blutverdünnender Verschreibungen sowie die Unzulänglichkeiten, die mit herkömmlichen Ermittlungen der Blutplättchenfunktion zusammenhängen, den Bedarf an einer genauen Analyse der Blutplättchenaktivierung begründet. Diese Analyse würde es Gesundheitsdienstleistern ermöglichen, eine Blutplättchenreaktivität und somit das Risiko zu definieren, das mit erhöhter Reaktivität (thrombotischer Verschluss von Gefäßen) und gesenkter Reaktivität (übermäßige Blutung) zusammenhängt. Weil jede Einzelperson anders auf eine blutverdünnende Therapie anspricht, würde es diese Analyse ermöglichen, eine Therapie patientenspezifisch auf die Bedürfnisse dieser Einzelperson anzupassen und die über die Zeit nötige Dosierungseinstellung zu erleichtern.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Um die vorstehenden Probleme zu lösen, besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein verbessertes Verfahren zur Ermittlung der Blutplättchenaktivierung in Vollblutproben bereitzustellen. Das Problem wird nach den Ansprüchen 1, 21 und 27 gelöst. Im Gegensatz zu herkömmlichen Assays zur Blutplättchenfunktionsanalyse wie Messen von Blutplättchenaggregation und Blutungszeiten, ermöglicht die vorliegende Erfindung die Ermittlung spezieller Komponenten der Blutplättchenaktivierung. Somit erleichtert dieses Assay eine Bestimmung erhöhter Blutplättchenreaktivität und senkt dadurch das Risiko, das mit erhöhter Reaktivität (thrombotischer Verschluss von Gefäßen) und gesenkter Reaktivität (übermäßige Blutung) zusammenhängt. Dieses Assay erleichtert auch eine Bestimmung der Angemessenheit einer Reaktivitätshemmung anschließend an die Behandlung mit blutverdünnenden Verschreibungen im Hinblick auf spezielle Komponenten zur Blutplättchenaktivierung. Weil jede Einzelperson anders auf eine blutverdünnende Therapie anspricht, ermöglicht es dieses Assay dementsprechend, die Therapie patientenspezifisch auf die Bedürfnisse jedes einzelnen Patienten anzupassen und die bei jedem über die Zeit nötige Dosierungseinstellung zu erleichtern.
Die speziellen Komponenten zur Blutplättchenaktivierung umfassen die folgenden: Aktivierung des Oberflächen-Glycoproteins IIb-IIIa, das eine Bindungsstelle für Fibrinogen aufweist und somit für die Vernetzung von Blutplättchen durch Fibrinogen sorgt [siehe z. B. S. J. Shattil et al., Blood, 70, 307 (1987), und C. S. Abrams et al,. Blood, 75, 128 (1990)]; die Freisetzung des Inhalts von Alpha-Körnchen, bei denen eine Degranulation zur Freisetzung von Speicherproteinen und Expression des Integrin-P-Selectins auf der Oberfläche des Blutplättchens führt [siehe z. B. J. N. George et al., J. Clin. Invest., 78, 340 (1986]; die Freisetzung des Inhalts dichter Körnchen, bei denen eine Degranulation zur Freisetzung von Nucleotiden und Kalzium führt; die Freisetzung des Inhalts von Lyosomen, bei denen eine Degranulation zur Freisetzung von Speicherproteinen führt; der Prokoagulationseffekt, wodurch Blutplättchen eine Ansammlung und Aktivität von Koagulationsfaktoren begünstigen; und Formveränderung, wodurch Blutplättchen ihre Oberfläche vergrößern, wodurch die Entstehung eines hämostatischen Verschlusses begünstigt wird.
Um die Reaktivität von Blutplättchen genau wiederzugeben, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen des Ausmaßes einer Blutplättchenaktivierung im Ansprechen auf physiologische Konzentrationen eines Agonisten bereit. Nach dem Einwirkenlassen eines solchen Agonisten werden die Blutplättchen Lösungen ausgesetzt, die Folgendes enthalten: fluorchrom-markierte Liganden, die sich an alle Blutplättchen, sowohl aktivierte als auch nicht aktivierte, binden; fluorchrom-markierte Liganden, die sich nur an aktivierte Blutplättchen binden; und biotin-konjugierte Liganden, welche die Bindung von Blutplättchen an eine feste Phase erleichtern. Nach dem Einwirkenlassen eines Fixierungsmittels (z. B. Formaldehyd) auf die Blutplättchen werden die Blutplättchen durch Einwirkenlassen einer mit Streptavidin oder Avidin beschichteten Oberfläche an eine feste Phase gebunden.
Die Interaktion der Blutplättchen mit der beschichteten Oberfläche wird vorzugsweise durch Zentrifugieren begünstigt. Ungebundene fluorchrom-markierte Liganden werden vorzugsweise durch Waschen entfernt.
Die speziellen Komponenten zur Blutplättchenaktivierung werden vorzugsweise durch Messen der Fluoreszenzsignalstärken bestimmt, die von jedem der gebunden aktivierungsabhängigen fluorchrom-markierten Liganden abgegeben werden, und die vom fluorchrom-markierten Marker aller Blutplättchen abgegeben werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung lässt sich anhand der folgenden ausführlichen Beschreibung in Zusammenschau mit den Zeichnungen umfassender verstehen und einschätzen:
1 ist eine grafische Darstellung des Ausmaßes der Blutplättchenaktivierung, die durch Einwirkenlassen ausgewählter Konzentrationen des Agonisten ADP (Adenosin-5'-diphosphat) auf eine Vollblutprobe bewirkt wird, wobei die Blutplättchenaktivierung als das Verhältnis zwischen dem Fluoreszenzsignal, das durch fluorchrom-markierte Antikörper, die an ein Protein, P-Selectin, an die Oberfläche der aktivierten Blutplättchen gebunden sind, erzeugt wird, und dem Fluoreszenzsignal, das durch fluorchrom-markierte Antikörper erzeugt wird, die an sämtliche Blutplättchen im Reaktionsgefäß gebunden sind, definiert ist.
2 ist eine grafische Darstellung des Ausmaßes der Blutplättchenaktivierung, die durch Einwirkenlassen ausgewählter Konzentrationen des Agonisten ADP auf eine Vollblutprobe bewirkt wird, wobei die Blutplättchenaktivierung als das Verhältnis zwischen dem Fluoreszenzsignal, das durch das an die Oberfläche aktivierter Blutplättchen gebundene fluorchrom-markierte Fibrinogen erzeugt wird, und dem Fluoreszenzsignal definiert ist, das durch an sämtliche Blutplättchen im Reaktionsgefäß gebundene fluorchrom-markierte Antikörper erzeugt wird.
3 ist eine grafische Darstellung der Senkung der Blutplättchenaktivierung, die durch das blutverdünnende Medikament ReoPro bewirkt wird, wobei das Ausmaß der Blutplättchenaktivierung, die durch Einwirkenlassen ausgewählter Konzentrationen des Agonisten ADP auf eine Vollblutprobe bewirkt wird, als das Verhältnis zwischen dem Fluoreszenzsignal, das durch das an die Oberfläche aktivierter Blutplättchen gebundene fluorchrom-markierte Fibrinogen erzeugt wird, und dem Fluoreszenzsignals definiert ist, das durch an sämtliche Blutplättchen im Reaktionsgefäß gebundene fluorchrom-markierte Antikörper erzeugt wird.
4 ist eine grafische Darstellung der Senkung der Blutplättchenaktivierung, die durch die blutverdünnenden Medikamente Aspirin und Ticlid bewirkt wird, wobei das Ausmaß der Blutplättchenaktivierung, die durch Einwirkenlassen ausgewählter Konzentrationen des Agonisten ADP auf eine Vollblutprobe bewirkt wird, als das Verhältnis zwischen dem Fluoreszenzsignal, das durch an P-Selectin an die Oberfläche aktivierter Blutplättchen gebundene fluorchrom-markierte Antikörper erzeugt wird, und dem Fluoreszenzsignal definiert ist, das durch an sämtliche Blutplättchen im Reaktionsgefäß gebundene fluorchrom-markierte Antikörper erzeugt wird.
5 ist eine grafische Darstellung der Senkung der Blutplättchenaktivierung, die durch die blutverdünnenden Medikamente Aspirin und Ticlid bewirkt wird, wobei das Ausmaß der Blutplättchenaktivierung, die durch Einwirkenlassen ausgewählter Konzentrationen des Agonisten ADP auf eine Vollblutprobe bewirkt wird, als das Verhältnis zwischen dem Fluoreszenzsignal, das durch das an die Oberfläche aktivierter Blutplättchen gebundene fluorchrom-markierte Fibrinogen erzeugt wird, und dem Fluoreszenzsignal definiert ist, das durch an sämtliche Blutplättchen im Reaktionsgefäß gebundene fluorchrom-markierte Antikörper erzeugt wird.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Ermittlung spezieller Komponenten zur Blutplättchenaktivierung in Blutproben bereit. In der bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung werden Vollblutproben verwendet, weil die Blutplättchenreaktivität durch die Verfahren, die eingesetzt wurden, um gereinigte Blutplättchenpräparate zu erhalten, oder durch die Entfernung ausgewählter Blutbestandteile verfälscht werden kann.
In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung muss die künstliche Aktivierung von Koagulation, die auftritt, wenn Blut Fremdoberflächen ausgesetzt wird, verhindert werden, weil diese künstliche Aktivierung die Blutplättchenreaktivität verfälscht. Das Einwirkenlassen einer Fremdoberfläche auf Blut aktiviert ein Protein, Faktor XII, was wiederum die Koagulationskaskade einleitet, die zur Entstehung von Thrombin führt; Thrombin aktiviert die Blutplättchen und bildet Fibrin. Andererseits bringt die Einleitung der Koagulationskaskade in vivo nach einer Gefäßverletzung keine Aktivierung des Faktors XII mit sich. Eine Gefäßverletzung bewirkt, dass Blut dem Gewebefaktor ausgesetzt wird, der mit dem Faktor VIIa einen Komplex bildet und die Koagulationskaskade einleitet. Dementsprechend wird in der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eine künstliche Aktivierung der Koagulationskaskade durch Hemmen des Faktors XIIa verhindert, während die übrige Koagulationskaskade wegen ihres Wechselspiels mit der Blutplättchenaktivierung unangetastet bleibt.
Somit erfolgt in der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eine Ermittlung der Blutplättchenaktivierung unter Verwendung von Vollblutproben, die vorzugsweise nur mit einem Maistrypsin-Inhibitor behandelt werden, einem speziellen Hemmstoff des Faktors XIIa, der keine Wirkung auf andere Koagulationsfaktoren hat. Andere Antikoagulantien wie Chelat-Kalzium werden für gewöhnlich vermieden, weil es sich herausgestellt hat, dass sie eine künstliche Verstärkung einer ADP-induzierten Blutplättchenaktivierung verursachen.
In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Ausmaß der Blutplättchenaktivierung im Ansprechen auf physiologische Konzentrationen eines Agonisten wie etwa, aber nicht darauf beschränkt, ADP (Adenosin-5'-diphosphat) oder TRAP (Thrombinrezeptoragonistpeptid) bestimmt. Nach dem Einwirkenlassen eines solchen Agonisten werden die Blutplättchen entweder gleichzeitig oder nacheinander den folgenden Lösungen (A–D) ausgesetzt:

(A) Einer Lösung, die fluorchrom-markierte Liganden enthält, die sich an alle Blutplättchen, sowohl aktivierte als auch nicht aktivierte binden; Beispiele für solche fluorchrom-markierte Liganden umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, fluorchrom-markierte Antikörper, die sich an alle Blutplättchen binden.
(B) Einer Lösung, die fluorchrom-markierte Liganden enthält, die sich nur an aktivierte Blutplättchen binden; Beispiele für solche fluorchrom-markierte Liganden umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, fluorchrom-markierte Antikörper, die sich an P-Selectin auf der Oberfläche aktivierter Blutplättchen binden, oder fluorchrom-markiertes Fibrinogen, das sich an Stellen auf der Oberfläche aktivierter Blutplättchen bindet.
(C) Einer Lösung, die Liganden enthält, welche die Bindung aller Blutplättchen an eine feste Phase begünstigen; Beispiele für solche Liganden umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, biotin-markierte Antikörper, die sich an sämtliche Blutplättchen binden.
(D) Einer Lösung, die ein Fixierungsmittel enthält, das eine weitere Blutplättchenaktivierung verhindert; Beispiele für ein solches Fixierungsmittel umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, 1,5%-iges Formaldehyd.

Eine Wechselwirkung zwischen Blutplättchen und der festen Phase kann durch Zentrifugieren der Proben verstärkt werden, nachdem die Proben in ein Behältnis wie etwa Mikrotitrationsplatten gegeben wurden.
Nachdem die Blutplättchen an eine feste Phase, die mindestens eine Vertiefung einer Mikrotitrationsplatte umfasst, aber nicht darauf beschränkt ist, gebunden ist, werden ungebundene fluorchrom-markierte Liganden durch Waschen beseitigt, und die speziellen Bestandteile der Blutplättchenaktivierung werden durch Messen der Fluoreszenzsignalstärken bestimmt, die von jedem der gebundenen aktivierungsabhängigen fluorchrom-markierten Liganden abgegeben werden, und die vom fluorchrom-markierten Marker sämtlicher Blutplättchen abgegeben werden.
Die Art und Weise, auf welche die Ermittlung spezieller Bestandteile der Blutplättchenaktivierung durchgeführt wird, lässt sich durch Bezugnahme auf die folgenden Anschauungsbeispiele umfassender in Erfahrung bringen, die den Umfang der Erfindung in keiner Weise einschränken sollen.
Beispiel 1
Einfangen von Blutplättchen in Mikrotitrationsnäpfen und Bestimmen der Blutplättchenaktivierung durch Messen des Grads an P-Selectin-Expression an der Blutplättchenoberfläche
P-Selectin ist ein vollständiges Membranprotein in den Alpha-Körnchen von Blutplättchen. Während einer Blutplättchenaktivierung führt eine Alpha-Körnchen-Exozytose zu einer Verschmelzung der Körnchenmembran mit der Blutplättchenmembran, was P-Selectin an die Blutplättchenmembranoberfläche befördert. Die Expression von P-Selectin kann dadurch gemessen werden, dass Blutplättchen mit einem immobilisierten Antikörper in einem Mikrotitrationsnapf eingefangen und dann zwei Fluoreszenzmarker verwendet werden: CD 42·PerCP (ein IgG-Antikörper gegen Glycoprotein IX mit PerCP als Fluoreszenzmarkierung), das alle Blutplättchen markiert, und CD 62·PE (ein IgG-Antikörper gegen P-Selectin mit Phycoerythrin als Fluoreszenzmarkierung), das P-Selectin exprimierende Blutplättchen und somit diejenigen Blutplättchen markiert, die aktiviert sind. Zwei Konzentrationen von ADP, einem schwachen Antagonisten, werden verwendet, um die Blutplättchen zu aktivieren, und die Dosiswirkung von ADP auf die Blutplättchen wird im Vollblut charakterisiert. Indem feststehende ADP-Dosen verwendet werden, ist es möglich, den Grad der Blutplättchenaktivierung in jeder Probe zu bestimmen, und die Wirksamkeit der blutverdünnenden Therapie kann, indem das Gefälle einzelner Reaktionskurven analysiert wird, oder durch die Aktivierung im Ansprechen auf eine ausgewählte Konzentration des Agonisten, wie in 1 gezeigt, bestimmt werden.
Ähnliche Ergebnisse wurden bei Parallelversuchen erzielt, bei denen die Assoziierung markierter Liganden mit Blutplättchen unter Verwendung von Strömungszytometrie bestimmt wurde. Wenn eine Strömungszytometriebestimmung der Assoziation von Liganden mit Blutplättchen durchgeführt wird, wird ohne zugesetzte Agonisten eine minimale Blutplättchenaktivierung beobachtet (d. h. weniger als 1 Prozent der Blutplättchen werden bei Nichtvorhandensein von Agonisten aktiviert, wenn P-Selectin als Marker zur Aktivierung verwendet wird).
Beispiel Vorgehensweise
Es wurde eine Phlebotomie unter Verwendung eines Zweispritzenverfahrens durchgeführt, wobei die ersten 3 ml Blut verworfen wurden. Eine Aktivierung von Blutplättchen wurde in Vollblut aufgezeichnet, das direkt in eine Spritze aufgezogen wurde, die 32 μg/ml Maistrypsin-Inhibitor (Corn Trypsin Inhibitor CTI, 9:1 Volumenanteil) enthielt, ein Mittel, das Faktor XIIa hemmt, ohne sich auf andere Koagulationsfaktoren auszuwirken. CTI wurde als Antikoagulans verwendet, um eine Aktivierung der Kontaktfaktorpassage zu verhindern und eine Analyse der Aktivierung von Blutplättchen in Abhängigkeit vom Zusatz exogener Aktivatoren zu ermöglichen. Im Gegensatz zu CTI verändern andere Antikoagulantien, insbesondere Kalzium-Chelatbildner wie Citrat die Aktivierung von Blutplättchen. 5 μl Blut wurden in Mikrozentrifugengläser gegeben, die Folgendes enthielten: einen Hepes Tyrodes-Puffer (5 mM HEPES, 137 mM NaCl, 2,7 mM NaHCO₃, 0,36 mM NaH₂PO₄, 2 mM CaCl₂, 4 mM MgCl₂ und 5 mM Dextrose, pH 7,4), ein gegen Glycoprotein IX (CD 42a) gerichteter PerCP-konjugierter IgG, ein gegen P-Selectin (CD 62) gerichteter Phycoerythrin(PE)kongugierter IgG, ein gegen Glycoprotein IIb (CD 41) gerichteter biotin-konjugierter Antikörper und ausgewählte Konzentrationen von ADP (0, 0,4, 0,8 μM). CD 42a bindet sich an aktivierungsunabhängige Epitope am Glycoprotein IX und wurde deshalb dazu verwendet, alle Blutplättchen zu kennzeichnen und von daher nachzuweisen. Das biotin-konjugierte CD 41 bindet sich an ein aktivierungsunabhängiges Epitop am Glycoprotein IIB und dient somit als Ligand zum Einfangen von Blutplättchen. P-Selectin exprimiert sich nur auf der Oberfläche aktivierter Blutplättchen und dient deshalb dazu, Blutplättchen zu markieren, die eine Degranulation erfahren haben. Nach einer Zugabe von Blut wurde die Reaktionslösung vorsichtig gemischt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Blutplättchen wurden fixiert und die roten Blutzellen nach 15-minütiger Inkubation durch Zugabe von Optilyse-C (1,5%-iges Formaldehyd) lysiert. Das Reaktionsgemisch wurde dann in einen mit Streptavidin beschichteten Napf in einer Mikrotitrationsplatte gegeben. Die Platte wurde zentrifugiert (1000 × g, 15 Minuten lang), um die Wechselwirkung zwischen den Blutplättchen und der festen Phase zu optimieren. Die Näpfe wurden dann dreimal mit Hepes Tyrodes-Puffer gewaschen. Die Fluoreszenzstärke wurde für jeden Liganden mit einem Mikroplattenfluoreszenzplattenleser bestimmt.
Beispiel 2
Einfangen von Blutplättchen in Mikrotitrationsnäpfen und Bestimmen der Blutplättchenaktivierung durch Messen des Grads an Fibrinogenbindung an die Blutplättchenoberfläche
Eine Blutplättchenaktivierung spiegelt sich auch in der Aktivierung des Oberflächen-Glycoproteins IIB-IIIa wieder, das eine Bindungsstelle für Fibrinogen aufweist. Der Grad an Fibrinogenbindung kann dadurch gemessen werden, dass Blutplättchen mit einem immobilisierten Antikörper in einem Mikrotitrationsnapf eingefangen und dann zwei Fluoreszenzmarker verwendet werden: CD 42·PerCP (ein IgG-Antikörper gegen Glycoprotein IX mit PerCP als Fluoreszenzmarkierung), das alle Blutplättchen markiert; und Fibrinogen·FITC (Fibrinogen konjugiert mit Fluorescein-Isothiocynat als Fluoreszenzmarkierung), das alle Blutplättchen markiert, bei denen eine Aktivierung des Oberflächen-Glycoproteins IIb-IIIa stattgefunden hat. Zwei Konzentrationen von ADP werden verwendet, um die Blutplättchen zu aktivieren, und die Dosiswirkung von ADP auf die Blutplättchen wird im Vollblut charakterisiert. Indem feststehende ADP-Dosen verwendet werden, ist es möglich, den Grad der Blutplättchenaktivierung in jeder Probe zu bestimmen. Die Wirksamkeit der blutverdünnenden Therapie kann, indem das Gefälle einzelner Reaktionskurven analysiert wird, oder durch die Aktivierung im Ansprechen auf eine ausgewählte Konzentration des Agonisten, wie in 2 gezeigt, bestimmt werden.
Beispiel 2 Vorgehensweise
Es wurde eine Phlebotomie unter Verwendung eines Zweispritzenverfahrens durchgeführt, wobei die ersten 3 ml Blut verworfen wurden. Eine Aktivierung von Blutplättchen wurde in Vollblut aufgezeichnet, das direkt in eine Spritze aufgezogen wurde, die 32 μg/ml Maistrypsin-Inhibitor (Corn Trypsin Inhibitor CTI, 9:1 Volumenanteil) enthielt, ein Mittel, das Faktor XIIa hemmt, ohne sich auf andere Koagulationsfaktoren auszuwirken. CTI wurde als Antikoagulans verwendet, um eine Aktivierung der Kontaktfaktorpassage zu verhindern und eine Analyse der Aktivierung von Blutplättchen in Abhängigkeit vom Zusatz exogener Aktivatoren zu ermöglichen. CTI wurde verwendet und keine anderen Antokoagulantien, weil im Gegensatz zu CTI andere Antikoagulantien, insbesondere Kalzium-Chelatbildner wie Citrat die Aktivierung von Blutplättchen verändern. 5 μl Blut wurden in Mikrozentrifugengläser gegeben, die Folgendes enthielten: einen Hepes Tyrodes-Puffer (5 mM HEPES, 137 mM NaCl, 2,7 mM NaHCO₃, 0,36 mM NaH₂PO₄, 2 mM CaCl₂, 4 mM MgCl₂ und 5 mM Dextrose, pH 7,4), ein gegen Glycoprotein IX (CD 42a) gerichteter PerCP-konjugierter IgG, Fibrinogen, konjugiert mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), ein gegen Glycoprotein IIb (CD 41) gerichteter biotin-konjugierter Antikörper und ausgewählte Konzentrationen von ADP (0, 0,4, 0,8 μM). CD 42a bindet sich an aktivierungsunabhängige Epitope am Glycoprotein IX und wurde deshalb dazu verwendet, alle Blutplättchen zu kennzeichnen und von daher nachzuweisen. Das biotin-konjugierte CD 41 bindet sich an ein aktivierungsunabhängiges Epitop am Glycoprotein IIB und dient somit als Ligand zum Einfangen von Blutplättchen. Fibrinogen bindet sich nur dann an die Oberfläche von Blutplättchen, wenn das Oberflächen-Glycoprotein IIb-IIIa aktiviert ist, und dient somit dazu, aktivierte Blutplättchen auszuweisen. Nach einer Zugabe von Blut wurde die Reaktionslösung vorsichtig gemischt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Blutplättchen wurden fixiert und die roten Blutzellen nach 15-minütiger Inkubation durch Zugabe von Optilyse-C (1,5%-iges Formaldehyd) lysiert. Das Reaktionsgemisch wurde dann in einen mit Streptavidin beschichteten Napf in einer Mikrotitrationsplatte gegeben. Die Platte wurde zentrifugiert (1000 × g, 15 Minuten lang), um die Wechselwirkung zwischen den Blutplättchen und der festen Phase zu optimieren. Die Näpfe wurden dann dreimal mit Hepes Tyrodes-Puffer gewaschen. Die Fluoreszenzstärke wurde für jeden Liganden mit einem Mikroplattenfluoreszenzplattenleser bestimmt.
Beispiel 3
Einfangen von Blutplättchen in Mikrotitrationsnäpfen und Bestimmen einer durch ReoPro bewirkten Hemmung von sich an Blutplättchen bindendes Fibrinogen
Eine Blutplättchenaktivierung wird durch das Medikament ReoPro gehemmt, und dies spiegelt sich in der Hemmung einer Bindung von Fibrinogen an den aktivierten Konformer des Oberflächen-Glycoproteins IIb-IIIa wieder. Der Grad an Fibrinogenbindung kann dadurch gemessen werden, dass Blutplättchen mit einem immobilisierten Antikörper in einem Mikrotitrationsnapf eingefangen und dann zwei Fluoreszenzmarker verwendet werden: CD 42·PerCP (ein IgG-Antikörper gegen Glycoprotein IX mit PerCP als Fluoreszenzmarkierung), das alle Blutplättchen markiert; und Fibrinogen·FITC (Fibrinogen konjugiert mit Fluorescein-Isothiocynat als Fluoreszenzmarkierung), das Blutplättchen markiert, bei denen eine Aktivierung des Oberflächen-Glycoproteins IIb-IIIa stattgefunden hat. Zwei Konzentrationen von ADP werden verwendet, um die Blutplättchen zu aktivieren, und die Dosiswirkung von ADP auf die Blutplättchen wird in Vollblut und in mit ReoPro versetztem Vollblut charakterisiert. Die Konzentration des verwendeten ReoPro ist diejenige, von der man weiß, dass sie die Aggregation von Blutplättchen hemmt, wie durch die Verwendung von Aggregometrie bestimmt wird. Wie in 3 gezeigt ist, hemmt eine Vorbehandlung von Blut mit ReoPro eine Bindung von Fibrinogen·FITC an Blutplättchen.
Beispiel 3 Vorgehensweise
Es wurde eine Phlebotomie unter Verwendung eines Zweispritzenverfahrens durchgeführt, wobei die ersten 3 ml Blut verworfen wurden. Eine Aktivierung von Blutplättchen wurde in Vollblut aufgezeichnet, das direkt in eine Spritze, die 32 μg/ml Maistrypsin-Inhibitor (Corn Trypsin Inhibitor CTI, 9:1 Volumenanteil) enthielt, und in eine Spritze aufgezogen wurde, die CTI (32 μg/ml) plus ReoPro (3 μg/ml) enthielt. 5 μl Blut wurden in Mikrozentrifugengläser gegeben, die Folgendes enthielten: einen Hepes Tyrodes-Puffer (5 mM HEPES, 137 mM NaCl, 2,7 mM NaHCO₃, 0,36 mM NaH₂PO₄, 2 mM CaCl₂, 4 mM MgCl₂ und 5 mM Dextrose, pH 7,4), ein gegen Glycoprotein IX (CD 42a) gerichteter PerCP-konjugierter IgG, Fibrinogen, konjugiert mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), ein gegen Glycoprotein IIb (CD 41) gerichteter biotin-konjugierter Antikörper und ausgewählte Konzentrationen von ADP (0, 0,4, 0,8 μM). CD 42a bindet sich an aktivierungsunabhängige Epitope am Glycoprotein IX und wurde deshalb dazu verwendet, alle Blutplättchen zu kennzeichnen und von daher nachzuweisen. Das biotin-konjugierte CD 41 bindet sich an ein aktivierungsunabhängiges Epitop am Glycoprotein IIB und dient somit als Ligand zum Einfangen von Blutplättchen. Fibrinogen bindet sich nur dann an die Oberfläche von Blutplättchen, wenn das Oberflächen-Glycoprotein IIb-IIIa aktiviert ist, und dient somit dazu, aktivierte Blutplättchen auszuweisen. Nach einer Zugabe von Blut wurde die Reaktionslösung vorsichtig gemischt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Blutplättchen wurden fixiert und die roten Blutzellen nach 15-minütiger Inkubation durch Zugabe von Optilyse-C (1,5%-iges Formaldehyd) lysiert. Das Reaktionsgemisch wurde dann in einen mit Streptavidin beschichteten Napf in einer Mikrotitrationsplatte gegeben. Die Platte wurde zentrifugiert (1000 × g, 15 Minuten lang), um die Wechselwirkung zwischen den Blutplättchen und der festen Phase zu optimieren. Die Näpfe wurden dann dreimal mit Hepes Tyrodes-Puffer gewaschen. Die Fluoreszenzstärke wurde für jeden Liganden mit einem Mikroplattenfluoreszenzplattenleser bestimmt.
Beispiel 4
Einfangen von Blutplättchen in Mikrotitrationsnäpfen und Bestimmen einer Degranulationshemmung nach Einnahme von Aspirin und Ticlid
Nach der Einnahme zweier blutverdünnender Mittel, und zwar Aspirin und Ticlid, ist eine Blutplättchenaktivierung gehemmt. Eine Degranulation im Ansprechen auf ADP wurde vor und nach der Einnahme von Aspirin und Ticlid bestimmt, indem Blutplättchen mit einem immobilisierten Antikörper in einem Mikrotitrationsnapf eingefangen und dann zwei Fluoreszenzmarker verwendet werden: CD 42·PerCP (ein IgG-Antikörper gegen Glycoprotein IX mit PerCP als Fluoreszenzmarkierung), das alle Blutplättchen markiert, und CD 62·PE (ein gegen P-Selectin gerichteter, mit Phycoerythrin [PE] konjugierter IgG). P-Selectin exprimiert sich nur auf der Oberfläche aktivierter Blutplättchen und dient somit dazu, Blutplättchen zu markieren, die eine Degranulation erfahren haben. Zwei Konzentrationen von ADP werden verwendet, um die Blutplättchen zu aktivieren, und die Dosiswirkung von ADP auf die Blutplättchen wird in Vollblut charakterisiert, das von Personen vor und nach 4-tägiger Einnahme von Aspirin (325 mg/Tag) und Ticlid (250 mg/zweimal täglich) abgenommen wurde. Wie in 4 gezeigt, hemmt eine Einnahme von Aspirin und Ticlid eine ADP-induzierte Degranulation von Blutplättchen.
Beispiel 4 Vorgehensweise
Es wurde eine Phlebotomie unter Verwendung eines Zweispritzenverfahrens durchgeführt, wobei die ersten 3 ml Blut verworfen wurden. Eine Aktivierung von Blutplättchen wurde in Vollblut aufgezeichnet, das direkt in eine Spritze aufgezogen wurde, die 32 μg/ml Maistrypsin-Inhibitor (Corn Trypsin Inhibitor CTI, 9:1 Volumenanteil) enthielt. 5 μl Blut wurden in Mikrozentrifugengläser gegeben, die Folgendes enthielten: einen Hepes Tyrodes-Puffer (5 mM HEPES, 137 mM NaCl, 2,7 mM NaHCO₃, 0,36 mM NaH₂PO₄, 2 mM CaCl₂, 4 mM MgCl₂ und 5 mM Dextrose, pH 7,4), ein gegen Glycoprotein IX (CD 42a) gerichteter PerCP-konjugierter IgG, CD 42 konjugiert mit Phycoerythrin (PE), ein gegen Glycoprotein IIb (CD 41) gerichteter biotin-konjugierter Antikörper und ausgewählte Konzentrationen von ADP (0, 0,4, 0,8 μM). CD 42a bindet sich an aktivierungsunabhängige Epitope am Glycoprotein IX und wurde deshalb dazu verwendet, alle Blutplättchen zu kennzeichnen und von daher nachzuweisen. Das biotin-konjugierte CD 41 bindet sich an ein aktivierungsunabhängiges Epitop am Glycoprotein IIB und dient somit als Ligand zum Einfangen von Blutplättchen. CD 42 bindet sich nur dann an die Oberfläche von Blutplättchen, wenn eine Degranulation stattgefunden hat und sich P-Selectin auf der Oberfläche des Blutplättchens exprimiert. Nach einer Zugabe von Blut wurde die Reaktionslösung vorsichtig gemischt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Blutplättchen wurden fixiert und die roten Blutzellen nach 15-minütiger Inkubation durch Zugabe von Optilyse-C (1,5%-iges Formaldehyd) lysiert. Das Reaktionsgemisch wurde dann in einen mit Streptavidin beschichteten Napf in einer Mikrotitrationsplatte gegeben. Die Platte wurde zentrifugiert (1000 × g, 15 Minuten lang), um die Wechselwirkung zwischen den Blutplättchen und der festen Phase zu optimieren. Die Näpfe wurden dann dreimal mit Hepes Tyrodes-Puffer gewaschen. Die Fluoreszenzstärke wurde für jeden Liganden mit einem Mikroplatten fluoreszenzplattenleser bestimmt.
Beispiel 5
Einfangen von Blutplättchen in Mikrotitrationsnäpfen und Bestimmen einer Fibrinogenbindungshemmung nach Einnahme von Aspirin und Ticlid
Nach der Einnahme zweier blutverdünnender Mittel, und zwar Aspirin und Ticlid, ist eine Blutplättchenaktivierung gehemmt. Die Aktivierung von Glycoprotein IIb-IIIa im Ansprechen auf ADP wurde vor und nach der Einnahme von Aspirin und Ticlid bestimmt, indem Blutplättchen mit einem immobilisierten Antikörper in einem Mikrotitrationsnapf eingefangen und dann zwei Fluoreszenzmarker verwendet wurden: CD 42·PerCP (ein IgG-Antikörper gegen Glycoprotein IX mit PerCP als Fluoreszenzmarkierung), das alle Blutplättchen markiert; und Fibrinogen·FITC (Fibrinogen konjugiert mit Fluorescein-Isothiocynat [FITC]). Fibrinogen bindet sich an den aktivierten Konformer des Oberflächen-Glycoproteins IIb-IIIa. Zwei Konzentrationen von ADP werden verwendet, um die Blutplättchen zu aktivieren, und die Dosiswirkung von ADP auf die Blutplättchen wird in Vollblut charakterisiert, das von Personen vor und nach 4-tägiger Einnahme von Aspirin (325 mg/Tag) und Ticlid (250 mg/zweimal täglich) abgenommen wurde. Wie in 5 gezeigt, hemmt eine Einnahme von Aspirin und Ticlid eine ADP-induzierte Bindung von Fibrinogen an Blutplättchen.
Beispiel 5 Vorgehensweise
Es wurde eine Phlebotomie unter Verwendung eines Zweispritzenverfahrens durchgeführt, wobei die ersten 3 ml Blut verworfen wurden. Eine Aktivierung von Blutplättchen wurde in Vollblut aufgezeichnet, das direkt in eine Spritze aufgezogen wurde, die 32 μg/ml Maistrypsin-Inhibitor (Corn Trypsin Inhibitor CTI, 9:1 Volumenanteil) enthielt. 5 μl Blut wurden in Mikrozentrifugengläser gegeben, die Folgendes enthielten: einen Hepes Tyrodes-Puffer (5 mM HEPES, 137 mM NaCl, 2,7 mM NaHCO₃, 0,36 mM NaH₂PO₄, 2 mM CaCl₂, 4 mM MgCl₂ und 5 mM Dextrose, pH 7,4), ein gegen Glycoprotein IX (CD 42a) gerichteter PerCP-konjugierter IgG, Fibrinogen konjugiert mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), ein gegen Glycoprotein IIb (CD 41) gerichteter biotin-konjugierter Antikörper und ausgewählte Konzentrationen von ADP (0, 0,4, 0,8 μM). CD 42a bindet sich an aktivierungsunabhängige Epitope am Glycoprotein IX und wurde deshalb dazu verwendet, alle Blutplättchen zu kennzeichnen und von daher nachzuweisen. Das biotin-konjugierte CD 41 bindet sich an ein aktivierungsunabhängiges Epitop am Glycoprotein IIB und dient somit als Ligand zum Einfangen von Blutplättchen. Fibrinogen bindet sich an die Oberfläche von Blutplättchen, wenn das Oberflächen-Glycoprotein IIb-IIIa aktiviert ist. Nach einer Zugabe von Blut wurde die Reaktionslösung vorsichtig gemischt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Blutplättchen wurden fixiert und die roten Blutzellen nach 15-minütiger Inkubation durch Zugabe von Optilyse-C (1,5%-iges Formaldehyd) lysiert. Das Reaktionsgemisch wurde dann in einen mit Streptavidin beschichteten Napf in einer Mikrotitrationsplatte gegeben. Die Platte wurde zentrifugiert (1000 × g, 15 Minuten lang), um die Wechselwirkung zwischen den Blutplättchen und der festen Phase zu optimieren. Die Näpfe wurden dann dreimal mit Hepes Tyrodes-Puffer gewaschen. Die Fluoreszenzstärke wurde für jeden Liganden mit einem Mikroplattenfluoreszenzplattenleser bestimmt.

Claims

Verfahren zur Messung der Blutplättchenreaktivität in einer Vollblutprobe ohne Herstellung eines blutplättchenreichen Präparates, das Folgendes umfasst: (A) Aktivieren eines Teils der Blutplättchen in der Vollblutprobe durch Zugabe einer Menge eines Blutplättchenagonisten zu der Probe, so dass eine Vollblutprobe mit aktivierten Blutplättchen und nicht aktivierten Blutplättchen entsteht; (B) Einwirkenlassen folgender Substanzen auf die Vollblutprobe von (A): eines aktivierungsabhängigen fluorchrom-markierten Liganden aus einem Liganden, der sich an ein oder mehrere aktivierte Blutplättchen bindet; eines aktivierungsunabhängigen fluorchrom-markierten Liganden aus einem Liganden, der sich an aktivierte Blutplättchen und nicht aktivierte Blutplättchen bindet; eines Bindungsliganden, der sämtliche Blutplättchen an eine feste Oberfläche bindet; eines Fixierungsmittels, das die Aktivierung weiterer Blutplättchen verhindert; (C) Einwirkenlassen einer festen Oberfläche auf die Blutprobe von (B), wobei der Bindungsligand sämtliche Blutplättchen an die feste Oberfläche bindet; (D) Messen der Fluoreszenz des aktivierungsabhängigen fluorchrom-markierten Liganden und des aktivierungsunabhängigen fluorchrom-markierten Liganden.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Blutplättchenagonist Adenosin-5'-diphosphat (ADP) ist.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die ADP-Konzentration 0,4 μM beträgt.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die ADP-Konzentration 0,8 μM beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Blutplättchenagonist ein Thrombinrezeptoragonistpeptid (TRAP) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem sich der aktivierungsabhängige fluorchrom-markierte Ligand an ein von den aktivierten Blutplättchen als Ergebnis der Aktivierung exprimiertes Protein bindet.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das von den aktivierten Blutplättchen als Ergebnis der Aktivierung exprimierte Protein P-Selectin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der aktivierungsabhängige fluorchrom-markierte Ligand ein fluorchrom-markierter Anti-P-Selectin-Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der aktivierungsabhängige fluorchrom-markierte Ligand fluorchrom-markiertes Fibrinogen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der aktivierungsunabhängige fluorchrom-markierte Ligand ein fluorchrom-markierter Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem der fluorchrom-markierte Antikörper ein fluorchrom-markierter Anti-Glycoprotein IX-Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Bindungsligand, der sämtliche Blutplättchen an eine feste Oberfläche bindet, ein biotin-konjugierter Antikörper ist und die feste Oberfläche mit Avidin oder Streptavidin beschichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem der biotin-konjugierte Antikörper ein biotin-konjugierter Anti-Glycoprotein IIb-Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Fixierungsmittel Formaldehyd ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die feste Oberfläche mindestens eine Vertiefung einer Mikrotitrationsplatte ist.
Verfahren nach Anspruch 14, das weiterhin das Zentrifugieren der Mikrotitrationsplatte zur Erhöhung der Bindung sämtlicher Blutplättchen an die feste Oberfläche während des Einwirkungsschrittes (C) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, das weiterhin das nach dem Zentrifugieren erfolgende Waschen der mindestens einen Vertiefung der Mikrotitrationsplatte vor der Fluoreszenzmessung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin den Einsatz einer Mikroplatten-Fluoreszenz-Anzeigevorrichtung zur Fluoreszenzmessung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Agonist von Schritt (A) und die Substanzen von Schritt (B) der Vollblutprobe gleichzeitig zugegeben werden.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Agonist von Schritt (A) und die Substanzen von Schritt (B) der Vollblutprobe nacheinander zugegeben werden.
Verfahren nach Anspruch 1, das Folgendes umfasst: (A) Aktivieren eines Teils der Blutplättchen in der Vollblutprobe durch Zugabe einer Menge eines Blutplättchenagonisten zu der Probe, die die Expression mindestens einer Bindungsstelle für Fibrinogen auf der Oberfläche der aktivierten Blutplättchen induziert, so dass eine Vollblutprobe mit aktivierten Blutplättchen und nicht aktivierten Blutplättchen entsteht; (B) Einwirkenlassen folgender Substanzen auf die Vollblutprobe von (A): fluorchrom-markierten Fibrinogens; eines aktivierungunsabhängigen fluorchrom-markierten Liganden aus einem Liganden, der sich an aktivierte Blutplättchen und nicht aktivierte Blutplättchen bindet; eines Bindungsliganden, der sämtliche Blutplättchen an eine feste Oberfläche bindet; eines Fixierungsmittels, das die Aktivierung weiterer Blutplättchen verhindert; (C) Einwirkenlassen einer festen Oberfläche auf die Vollblutprobe von (B), wobei der Bindungsligand sämtliche Blutplättchen an die feste Oberfläche bindet; (D) Messen der Fluoreszenz des fluorchrom-markierten Fibrinogens und des aktivierungsunabhängigen fluorchrom-markierten Liganden.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem der Bluttplättchenagonist ADP ist.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die ADP-Konzentration 0,4 μM beträgt.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die ADP-Konzentration 0,8 μM beträgt.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem der Blutplättchenagonist TRAP ist.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem der aktivierungsunabhängige fluorchrom-markierte Ligand ein fluorchrom-markierter Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 26, bei dem der fluorchrom-markierte Antikörper ein fluorchrom-markierter Anti-Glycoprotein IX-Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem der Bindungsligand, der sämtliche Blutplättchen an eine feste Oberfläche bindet, ein biotin-konjugierter Antikörper ist und die feste Oberfläche mit Avidin oder Streptavidin beschichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 28, bei dem der biotin-konjugierte Antikörper ein biotin-konjugierter Anti-Glycoprotein IIb-Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem das Fixierungsmittel Formaldehyd ist.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem die feste Oberfläche mindestens eine Vertiefung einer Mikrotitrationsplatte ist.
Verfahren nach Anspruch 31, das weiterhin das Zentrifugieren der Mikrotitrationsplatte zur Erhöhung der Bindung sämtlicher Blutplättchen an die feste Oberfläche während des Einwirkungsschrittes (C) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 32, das weiterhin das nach dem Zentrifugieren erfolgende Waschen der mindestens einen Vertiefung der Mikrotitrationsplatte vor der Fluoreszenzmessung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 21, das weiterhin den Einsatz einer Mikroplatten-Fluoreszenz-Anzeigevorrichtung zur Fluoreszenzmessung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem der Agonist von Schritt (A) und die Substanzen von Schritt (B) der Vollblutprobe gleichzeitig zugegeben werden.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem der Agonist von Schritt (A) und die Substanzen von Schritt (B) der Vollblutprobe nacheinander zugegeben werden.
Verfahren nach Anspruch 1, das Folgendes umfasst: (A) Aktivieren eines Teils der Blutplättchen in der Vollblutprobe durch Zugabe einer Menge eines Blutplättchenagonisten zu der Probe, die die Expression von P-Selectin auf der Oberfläche der aktivierten Blutplättchen induziert, so dass eine Vollblutprobe mit aktivierten Blutplättchen und nicht aktivierten Blutplättchen entsteht; (B) Einwirkenlassen folgender Substanzen auf die Vollblutprobe von (A): eines fluorchrom-markierten Liganden, der sich an P-Selectin bindet; eines aktivierungsunabhängigen fluorchrom-markierten Liganden aus einem Liganden, der sich an aktivierte Blutplättchen und nicht aktivierte Blutplättchen bindet; eines Bindungsliganden, der sämtliche Blutplättchen an eine feste Oberfläche bindet; eines Fixierungsmittels, das die Aktivierung weiterer Blutplättchen verhindert; (C) Einwirkenlassen einer festen Oberfläche auf die Vollblutprobe von (B), wobei der Bindungsligand sämtliche Blutplättchen an die feste Oberfläche bindet; (D) Messen der Fluoreszenz des fluorchrom-markierten Liganden, der sich an P-Selectin bindet, und des aktivierungsunabhängigen fluorchrom-markierten Liganden.
Verfahren nach Anspruch 37, bei dem der Blutplättchenagonist ADP ist.
Verfahren nach Anspruch 38, bei dem die ADP-Konzentration 0,4 μM beträgt.
Verfahren nach Anspruch 38, bei dem die ADP-Konzentration 0,8 μM beträgt.
Verfahren nach Anspruch 37, bei dem der Blutplättchenagonist TRAP ist.
Verfahren nach Anspruch 37, bei dem der fluorchrom-markierte Ligand, der sich an P-Selectin bindet, ein fluorchrom-markierter Anti-P-Selectin-Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 37, bei dem der aktivierungsunabhängige fluorchrom-markierte Ligand ein fluorchrom-markierter Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 43, bei dem der fluorchrom-markierte Antikörper ein fluorchrom-markierter Anti-Glycoprotein IX-Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 37, bei dem der Bindungsligand, der sämtliche Blutplättchen an eine feste Oberfläche bindet, ein biotin-konjugierter Antikörper ist und die feste Oberfläche mit Avidin oder Streptavidin beschichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 45, bei dem der biotin-konjugierte Antikörper ein biotin-konjugierter Anti-Glycoprotein IIb-Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 37, bei dem das Fixierungsmittel Formaldehyd ist.
Verfahren nach Anspruch 37, bei dem die feste Oberfläche mindestens eine Vertiefung einer Mikrotitrationsplatte ist.
Verfahren nach Anspruch 48, das weiterhin das Zentrifugieren der Mikrotitrationsplatte zur Erhöhung der Bindung sämtlicher Blutplättchen an die feste Oberfläche während des Einwirkungsschrittes (C) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 49, das weiterhin das nach dem Zentrifugieren erfolgende Waschen der mindestens einen Vertiefung der Mikrotitrationsplatte vor der Fluoreszenzmessung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 37, das weiterhin den Einsatz einer Mikroplatten-Fluoreszenz-Anzeigevorrichtung zur Fluoreszenzmessung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 37, bei dem der Agonist von Schritt (A) und die Substanzen von Schritt (B) der Vollblutprobe gleichzeitig zugegeben werden.
Verfahren nach Anspruch 37, bei dem der Agonist von Schritt (A) und die Substanzen von Schritt (B) der Vollblutprobe nacheinander zugegeben werden.