DE69831229T2 - Schnelle bestimmung des verhältnisses von biologischen molekülen - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND
  • Existierende Verfahren zum Ermitteln von Mengenverhältnissen biologischer Moleküle verwenden mehrere Schritte und erfordern zur Durchführung häufig viel Zeit. Diese Verfahren benutzen häufig zwei oder mehr Komponenten, gewöhnlich Antikörper, die für jedes der biologischen Moleküle spezifisch sind. Zum Ermitteln des Verhältnisses sind daher zwei oder mehr einzelne Tests durchzuführen. Diese Systeme verlängern folglich die zum Ermitteln des Verhältnisses erforderliche Zeit und erhöhen außerdem die Reagenzkosten.
  • Darüber hinaus nutzen viele der bestehenden Verfahren zum Ermitteln der Konzentrationen biologischer Moleküle mehrere Komponenten, gewöhnlich Antikörper oder markierte Antigene, in Konzentrationen, die die Konzentration der biologischen Moleküle in einer Probe übersteigen. Nicht konkurrierende oder Sandwich-Tests basieren auf den Einsatz von Antikörpern, die gegenüber den biologischen Molekülen im Überschuss sind. Konkurrierende Immunoassays basieren auf einer Konkurrenz der Bindung eines biologischen Moleküls und eines markierten biologischen Moleküls hinsichtlich einer beschränkten Konzentration von Antikörpern. Da manche biologischen Moleküle, z.B. Hämoglobin oder Zellenrezeptoren, in biologischen Fluiden mit hohen Konzentrationen auftreten, lassen sich bestehende Verfahren, die einen Überschuss an Komponenten gegenüber den biologischen Molekülen verlangen, nur beschränkt anwenden. Darüber hinaus müssen die Proben im Allgemeinen vor einem Versuch verdünnt werden.
  • Eine Bestimmung des Verhältnisses biologischer Moleküle hat sich als ein wichtiger Indikator für viele medizinische Zustände und Verfahren herausgestellt. Insbesondere ist die Ermittlung des Verhältnisses verwandter biologischer Moleküle von Nutzen. Verwandte biologische Moleküle entstehen in einem Organismus, wenn ein biologisches Molekül modifiziert wird. Biologische Moleküle können beispielsweise durch kovalente chemische Abänderung oder durch die reversible Bindung von Molekülen modifiziert werden.
  • Biologische Moleküle lassen sich in einem Organismus in einer intermolekularen Weise chemisch modifizieren. Beispielsweise lässt sich Hämoglobin, ein im Blut vorhandener Sauerstoffträger in Organismen, durch Glucoseanteile modifizieren, wenn der Blutstrom hohe Spiegel von Glucose enthält. In dem Blutstrom kondensiert die Aldehydgruppe von Glucose mit dem Valin des Hämoglobin, um eine Schiffsche Base zu bilden. Diese reversible Reaktion folgt auf eine praktisch irreversible Neuanordnung, in der die Doppelbindung in C-2 des Zuckers übergeht, um ein stabiles Fructosederivat von Hämoglobin zu ergeben. Stryer, Biochemistry, 3. Ausg., W. H. Freeman & Co., New York 1988. In dieser Weise modifiziertes Hämoglobin wird als Hämoglobin A1-C bezeichnet.
  • Außerdem können biologische Moleküle in einer intramolekularen Weise modifiziert werden. Beispielsweise wird Troponin I, das normalerweise in einer reduzierten Form in Muskelzellen vorliegt, oxidiert, wenn es in den Blutstrom von Organismen freigegeben wird, die an einer myokardialen Infarktbildung leiden. Insbesondere können Cysteinkomponenten innerhalb eines einzelnen Moleküls von Troponin I oxi dieren, um ein intramolekulares Disulfidbindeglied zu bilden. Verfahren zum Detektieren verwandter Formen von Troponin I, die von Muskelzellen nach einer myokardialen Infarktbildung freigegeben werden, sind in der PCT-Veröffentlichung WO 96/33415 offenbart.
  • Biologische Moleküle lassen sich außerdem reversibel modifizieren, wenn Liganden hoher Affinität an diese binden. Beispielsweise können Zellenrezeptoren, die auf der Oberfläche einer Zelle präsentiert werden, natürliche oder synthetische Liganden mit Gleichgewichtsdissoziationskonstanten im mikromolaren bis picomolaren Bereich binden.
  • KURZBESCHREIBUNG
  • Die Erfindung betrifft unter anderem neue Verfahren zum raschen Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle. Die Erfindung betrifft teilweise ferner einen Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses verwandter biologischer Moleküle.
  • Die Erfindung beschleunigt ein Ermitteln von Verhältnissen biologischer Moleküle im Vergleich zu der Geschwindigkeit einer Ermittlung dieser Verhältnisse mittels bestehender Verfahren. Die Erfindung steigert die Geschwindigkeit, um das Verhältniss biologischer Moleküle zu ermitteln, indem die Anzahl von Schritten reduziert wird, die zum Ermitteln des Verhältnisses erforderlich sind.
  • Der Erfinder entdeckte, dass sich das Verhältnis biologischer Moleküle ohne ein Messen der absoluten Konzentrationen der biologischen Moleküle rasch ermitteln lässt, indem ein Bindungsmolekül, vorzugsweise ein Antikörper, verwendet wird, das jedes der biologischen Moleküle erkennt, in der Zeit jedoch lediglich an eines der biologischen Moleküle bindet.
  • 1, die ein Ausführungsbeispiel der Erfindung veranschaulicht, dient als Beispiel zur Veranschaulichung für das rasche Bestimmen des Verhältnisses biologischer Moleküle. Die Anzahl von Schritten wird verringert, indem eine Probe mit einer ersten Komponente getestet wird, die von jedem der interessierenden biologischen Moleküle einen Bruchteil bindet. Wenn die Konzentration der ersten Komponente geringer ist als die Konzentrationen der biologischen Moleküle, bindet die erste Komponente die biologischen Moleküle in einem Verhältnis, das zu dem Verhältnis, in dem die biologischen Moleküle in Lösung vorliegen, in Beziehung steht.
  • Gemäß einem Ausführungsbeispiel schließt die Bindung eines der biologischen Moleküle an die erste Komponente die Bindung des anderen aus, obwohl die erste Komponente die Fähigkeit aufweist, an jedes der Moleküle unabhängig zu binden. Die Verteilung der an die erste Verbindung gebundenen biologischen Moleküle ist eine statistisch Verteilung, die in einer direkten Beziehung zu der Verteilung biologischer Moleküle in der Probe steht.
  • Diese beiden Eigenschaften der ersten Komponente, nämlich die Eigenschaft einer Mehrfachbindung und die Eigenschaft einer ausschließlichen Bindung, ermöglichen es der ersten Komponente, die biologischen Moleküle in einem Verhältnis zu binden, das zu dem Verhältnis der biologischen Moleküle in der Probe in Beziehung steht. Falls beispielsweise die erste Komponente in der Lage ist, sowohl Moleküle A als auch B zu binden, und A und B in der Probe in einem Verhältnis von 3 zu 1 vorliegen, wird die gebundene erste Komponente in einem Verhältnis von 3 zu 1 oder nahezu in diesem Verhältnis an A und B gebunden haben.
  • Biologische Moleküle A und B binden an die erste Komponente in einem Verhältnis, das zu deren Verhältnis in der Probe in Beziehung steht, wobei die relativen ON-Raten des Bindens von A und B an die erste Komponente das endgültige Verhältnis von an die erste Komponente gebundenem A und B bestimmen. Das Verhältnis von A zu B kann daher an die erste Komponente in einem Verhältnis gebunden werden, das zu dem in einer Probe vorhandenem Verhältnis von A zu B proportional ist.
  • Die zweite Komponente der Erfindung erfasst den Komplex, der zwischen der ersten Komponente und einem der beiden biologischen Moleküle gebildet wird. Dieser Komplex kann detektiert werden, wenn die zweite Komponente lediglich an eines der biologischen Moleküle, z.B. entweder A oder B, bindet, oder falls die zweite Komponente an den Komplex bindet, der zwischen einem der biologischen Moleküle und der ersten Komponente gebildet wird. Die letztere Ausprägung kann von Vorteil sein, falls die biologischen Moleküle bezüglich der Konzentration der zweiten Komponente mit hohen Konzentrationen in der Probe vorliegen, da die zweite Komponente an den Komplex, der ein biologisches Molekül und die erste Komponente aufweist, und nicht an das ungebundene biologische Molekül binden wird.
  • Sobald die zweite Komponente an den Komplex bindet, der die erste Komponente und ein biologisches Molekül enthält, kann ein Signal anhand eines Reportermoleküls gemes sen werden, das an eine der Komponenten der Erfindung angehängt ist. Dieses Signal lässt sich auf eine Standardkurve anwenden, die das Signal mit einem Verhältnis der biologischen Moleküle in Beziehung setzt. Die Standardkurve kann unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren durch Messen des Signals für Proben vorbereitet werden, die mit bekannten Verhältnissen der biologischen Moleküle zubereitet wurden.
  • Wenn biologische Moleküle nicht mit der gleichen Affinität an die erste Komponente binden, können Standardkurven, die das Verhältnis mit einem Signal in Beziehung setzen, das durch eine der Komponenten, vorzugsweise die erste Komponente, erzeugt wurde, verwendet werden, um das Verhältnis von A zu B in der Probe zu ermitteln. Darüber hinaus lassen sich Normalisierungsfaktoren einsetzen, um das Verhältnis von A zu B in einer Probe zu ermitteln.
  • Das Verhältnis der biologischen Moleküle wird äußerst rasch bestimmt, wenn die Komponenten und die Probe gleichzeitig und in demselben Gefäß miteinander vermischt werden. Dieser Ansatz minimiert die Anzahl von Schritten, die erforderlich sind, um das Verhältnis biologischer Moleküle zu ermitteln und bietet dadurch einen Vorteil gegenüber bestehenden Techniken zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle. Insbesondere beziehen sich Anwendungen der hier beschriebenen Verfahren und Ausrüstungssätze teilweise auf ein Erhöhen der Effizienz der Überwachung einer Medikamentenverabreichung, Überwachung des Blutzuckerspiegelverlaufs von Diabetikern und Überwachung des Zeitpunkts einer myokardialen Infarktbildung.
  • Die rasche Geschwindigkeit einer Ermittlung des Verhältnisses biologischer Moleküle kann die Gesundung von Patienten beschleunigen, die unter speziellen medizinischen Symptomen leiden. Da die Diagnoseergebnisse rasch vorliegen, ist es möglich, beschleunigt mit der angebrachten Behandlung zu beginnen. Im Falle von Herzinfarkten wird beispielsweise eine rasche Ermittlung des Verhältnisses von oxidiertem gegenüber reduziertem Troponin I die Bestimmung des Zeitpunkts einer myokardialen Infarktbildung beschleunigen und es dadurch ermöglichen, dem Patienten rasch eine geeignete Behandlung zukommen zu lassen. Ein Beschleunigen der Behandlung eines Patienten wird die Erholung des betreffenden Patienten von dem Myokardinfarkt fördern.
  • Das rasche Ermitteln des Verhältnisses von verwandten biologischen Moleküle kann außerdem die Verabreichung eines therapeutischen Medikaments an einen Patienten verbessern. Im Falle eines Medikaments, das an einen Zellenoberflächenrezeptor bindet und ihn blockiert, kann eine rasche Ermittlung des Verhältnisses von freiem zu besetztem Rezeptor bestimmen, ob dem Patienten im Sinne einer effizienten Therapie eine höhere oder geringere Dosis des Medikaments zu verabreichen ist.
  • Außerdem ermöglicht die Erfindung das Bestimmen von Verhältnissen von verwandten biologischen Molekülen, die in einer Probe in hohen Konzentrationen vorliegen. Beispielsweise ist Hämoglobin in hohen Konzentrationen im Blutstrom eines Patienten vorhanden. Hämoglobin geht in Hämoglobin A1-C über, wenn es im Blutstrom des Patienten mit Glucose modifiziert wird. Eine Komponente der Erfindung ist in der Lage, einen Bruchteil der gesamten Hämoglobinmoleküle (Hämoglobin und Hämoglobin A1-C) zu isolieren, und eine zweite Komponente ist in der Lage, eines der verwandten Moleküle (beispielsweise Hämoglobin A1-C) zu isolieren, um das Verhältnis dieser verwandten Moleküle auch dann zu ermitteln, wenn diese in einer Probe in hohen Konzentrationen vorhanden sind. Diese Anwendung der hierin beschriebenen Verfahren ist für Diabetiker geeignet, da Hämoglobin A1-C die durchschnittliche Blutzuckerkonzentration über Zeitspannen hinweg repräsentiert, die länger als einen Tag dauern. Da Diabetiker aufgrund von abweichenden Messwerten, die mittels der ihnen gegenwärtig verfügbaren Techniken abgelesen werden, häufig nicht in der Lage sind, ihren Blutzuckerspiegel genau zu ermitteln, ermöglichen die Verfahren und Ausrüstungssätze der Erfindung Diabetikern, den durchschnittlichen Blutzuckerspiegel genau und rasch zu ermitteln.
  • Gemäß einem ersten Aspekt beinhaltet die Erfindung daher Merkmale eines Verfahrens zum Ermitteln eines Lösungsverhältnisses biologischer Moleküle. Zu dem Verfahren gehören die Schritte: (a) Zusammenbringen der biologischen Moleküle mit (i) einer ersten Komponente, die spezifische Bindungsaffinität gegenüber jedem der biologischen Moleküle aufweist, wobei die biologischen Moleküle an die erste Komponente in einem Bindungsverhältnis binden, das in Beziehung zu dem Lösungsverhältnis der biologischen Moleküle steht; (ii) Zusammenbringen der biologischen Moleküle mit einer zweiten Komponente, die spezifische Bindungsaffinität für eines der biologischen Moleküle aufweist; und (b) Ermitteln der vorhandenen Menge eines Komplexes, der das biologische Molekül, die erste Komponente und die zweite Komponente aufweist, als ein Maß des Lösungsverhältnisses.
  • Der Begriff "biologische Moleküle" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf zwei oder mehr Moleküle, die auf natürliche oder künstliche Weise in einem biologischen Organismus oder Fluid oder einer Umweltprobe vorhanden sind. Das Verhältnis wird vorzugsweise für vier oder mehr biologische Moleküle gemessen, eher bevorzugt für drei biologische Moleküle gemessen, und am meisten vorzuziehen für zwei biologische Moleküle gemessen. Die biologischen Moleküle können miteinander verwandt oder nicht verwandt sein. Biologische Moleküle können aufgrund einer Modifikation eines der biologischen Moleküle verwandt sein. Verwandte Moleküle können daher als ein nicht modifiziertes Molekül und ein modifiziertes Molekül vorliegen.
  • Ein biologisches Molekül kann auf mindestens zwei Weisen modifiziert sein: (i) kovalent modifiziert auf eine intermolekulare oder intramolekulare Weise, oder (ii) mit einem Molekül hoher Affinität reversibel modifiziert. Das Molekül kann kovalent modifiziert werden, indem eine weitere chemische Komponente hinzugefügt wird (beispielsweise Hämoglobin, das durch einen Glucoseanteil modifiziert wird). Ein Beispiel eines Moleküls, das durch ein Affinitätmolekül mit reversibler Bindung modifiziert ist, ist ein durch einen Affinitätsliganden gebundener freier Rezeptor. Der Ligand kann ein natürlich auftretendes Bindungsmolekül des freien Rezeptors sein, oder kann alternativ ein synthetischer Ligand sein.
  • Wenn die interessierenden biologischen Moleküle in einer Probe nicht vorliegen, können das Verfahren und Ausrüstungssätze der Erfindung erfassen, dass die biologischen Moleküle nicht in der Probe vorhanden sind. Diese Arten von Ergebnisse enthalten häufig nützliche Informationen. Bei spielsweise könnte ein Erfassen, dass eine Blutprobe vernachlässigbare Mengen an oxidiertem Troponin I enthält, anzeigen, dass der Patient, von dem die Blutprobe entnommen wurde, keinen myokardiale Infarktbildung erlitten hat. Dieser Typ von Ergebniss könnte einer Klinik und einem Patienten erhebliche Ausgaben für eine medizinische Behandlung eines Zustands ersparen, der zu keinem Zeitpunkt bestanden hat. Dementsprechend sind die durch das Verfahren und Ausrüstungssätze der Erfindung gewonnenen Ergebnisse auch dann von Nutzen, wenn das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu einem negativen Ergebnis kommt.
  • Beispiele biologischer Moleküle umfassen, ohne jedoch darauf beschränken zu sein, organische und anorganische Moleküle, Medikamente, Peptide, Nucleinsäuren, Rezeptoren, Zellen und Proteine.
  • Der Begriff "Rezeptor" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf eine nicht auf Protein basierende Proteinkomponente oder auf eine Proteinkomponente, die spezifisch oder nicht spezifisch an ein Molekül bindet. Zu Beispielen von Rezeptoren gehören, ohne jedoch darauf beschränken zu sein, Zellenoberflächenrezeptoren, Antikörper, Bindungsproteine, Bindungsfragmente, Avidin, nicht auf Protein basierende Matrizen und biomimetische Rezeptoren.
  • Der Begriff "Komponente" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf ein Molekül, das spezifisch an ein oder mehrere der biologischen Moleküle bindet. Die Komponente weist vorzugsweise ein Protein oder Polypeptid oder Peptid auf, eher bevorzugt weist sie eine peptidnachahmende oder organische Verbindung auf, und am meisten vorzuziehen enthält sie einen Antikörper.
  • Der Begriff peptidnachahmend in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf ein peptidähnliches Molekül, das nicht hydrolysierbare chemische Komponenten enthält anstelle einer oder mehrerer hydrolysierbarer Komponenten, die in natürlich auftretenden Peptiden vorhanden sind. Dementsprechend sind in einem Peptidnachahmer hydrolysierbare Regionen eines Peptids, z.B. Karboxylkomponenten, gegen nicht hydrolysierbare Komponenten, z.B. Methylenkomponenten, ersetzt.
  • Der Begriff "Antikörper" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf einen monoclonalen Antikörper, einen polyclonalen Antikörper, ein Bindungsfragment eines Antikörpers und einen rekombinanten Antikörper. Der Begriff "Antikörper" kennzeichnet außerdem ein Rezeptorprotein, das in der Lage ist, spezifisch an ein Zielobjekt zu binden.
  • Die Begriffe "spezifische Bindungsaffinität" oder "bindet spezifisch" oder "spezifisch gebunden" beschreiben in dem hier verwendeten Sinne eine Komponente der Erfindung, die vorzugsweise einen Antikörper enthält, sich aus diesem zusammensetzt oder sich weitgehend aus diesem zusammensetzt, der unter spezifizierten Bedingungen an ein oder mehrere biologische Moleküle mit größerer Affinität bindet als an andere Moleküle. Beispielsweise kann eine erste Komponente der Erfindung einen Bindungsanteil enthalten, der spezifische Bindungsaffinität für Hämoglobin und Hämoglobin A1-C aufweist; der Bindungsanteil wird nicht ausreichend an Moleküle binden, die nicht Hämoglobin oder Hämoglobin A1-C sind. Vorzugsweise bindet eine Komponente der Erfindung an ein spezifische Bindungsaffinität aufweisendes Molekül mit einer wenigstens 5 mal höheren Affinität als an andere Moleküle, eher bevorzugt mit einer 10 mal oder 50 mal höheren Affinität als an andere Moleküle und am meisten vorzuziehen mit einer 100 mal höheren Affinität als an andere Moleküle.
  • Der Begriff "Bindungsanteil" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf ein Molekül, das eine Komponente der Erfindung enthält, die spezifische Bindungsaffinität für ein biologisches Molekül oder einen aus einem biologischen Molekül/und einer ersten Komponente aufgebauten Komplex aufweist. Der Bindungsanteil ist vorzugsweise ein Protein, Polypeptid oder Peptid, eher bevorzugt eine peptidnachahmende oder organische Verbindung, und am meisten vorzuziehen ein Antikörper.
  • Verfahren zum Binden und Ermitteln der Menge von Antikörpern, die in einer Probe an ein Zielobjekt gebunden sind, sind in der Fachwelt hinlänglich bekannt. Harlo & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratories. Die Komponenten, die an die biologischen Moleküle der Erfindung binden, lassen sich mittels in der Fachwelt bekannter Techniken beobachten. Zu diesen Techniken zählen manuelle Anwendungen und solche, die ein mechanisches und elektronisches Instrumentarium einbeziehen.
  • Die erste Komponente der Erfindung kann an die biologischen Moleküle in einem Bindungsverhältnis binden, das dem Lösungsverhältnis der biologischen Moleküle entspricht. Der Begriff "verwandt" kennzeichnet Lösungsverhältnisse und Bindungsverhältnisse, die übereinstimmen oder nahezu übereinstimmen. Das Lösungsverhältnis und das Bindungsverhältnis stimmen nahezu überein, wenn das Verhältnis des Lösungsverhältnisses gegenüber dem Bindungsverhältnis zwi schen 0,1 und 10, vorzugsweise zwischen 0,2 und 5, eher bevorzugt zwischen 0,5 und 2 liegt, und am meisten vorzuziehen gleich 1 ist.
  • Das Lösungsverhältnis steht außerdem mit dem Bindungsverhältnis der biologischen Moleküle in Beziehung, wenn (i) zu einem Zeitpunkt nur eines der biologischen Moleküle in der Lage ist, an die erste Komponente zu binden, und (ii) jedes biologische Molekül eine ähnliche "ON-Rate" und eine ähnlichen Gleichgewichtskonstante beim Binden an die erste Komponente aufweist. Somit schließt die Bindung eines der biologischen Moleküle die Bindung eines weiteren biologischen Moleküls aus, das ebenfalls die spezifische Bindungsaffinität gegenüber der ersten Komponente aufweist. Diese Eigenschaft der Erfindung erlaubt es der ersten Komponente, die interessierenden biologischen Moleküle in demselben oder dem verwandten Verhältnis zu binden, wie die Moleküle in der mit den Komponenten der Erfindung getesteten Probe vorhanden sind. Diese Eigenschaften ermöglichen es, dass das Verhältnis der entstandenen Bindungen denselben oder einen verwandten Wert wie das Lösungsverhältniss aufweist. Der Begriff "Komplex" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf zwei oder mehr einzelne Moleküle, die in einer nicht kovalenten Weise aneinander gebunden sind. Ein Komplex kann dementsprechend beispielsweise ein biologisches Molekül enthalten, das an eine erste Komponente der Erfindung gebunden ist. Der Komplex kann auch ganz oder weitgehend aus der an ein biologisches Molekül gebundenen ersten Komponente zusammengesetzt sein. Darüber hinaus kann ein Komplex vorliegen, der ein biologisches Molekül und eine erste Komponente enthält, sich aus diesen zusammensetzt oder weitgehend aus diesen zusammensetzt. Außerdem kann ein Komplex vorliegen, der ein biologisches Molekül, eine erste Komponente und eine zweite Komponente enthält, sich aus diesen zusammensetzt oder aus diesen im Wesentlichen aufgebaut ist. Falls die erste Komponente einen Antikörper enthält, kann die erste Komponente einen Komplex bilden, der aufgrund der dualen Bindungskapazität von Antikörpern die erste Komponente und zwei unterscheidbare Arten biologischer Moleküle enthält, sich aus diesen zusammensetzt oder weitgehend aus diesen zusammensetzt.
  • In ähnlicher Weise kann die erste Komponente, falls diese ein Antikörper ist, einen Komplex bilden, der die erste Komponente, zwei unterscheidbare Arten biologischer Moleküle und eine zweite Komponente aufweist, weitgehend aus diesen zusammengesetzt ist oder ganz aus diesen zusammengesetzt ist. Ein Antikörper kann außerdem zwei Moleküle desselben Typs eines biologischen Moleküls binden. D.h. der Komplexe kann zwei Moleküle desselben Typs eines biologischen Moleküls enthalten.
  • Ein Komplex kann hinsichtlich einer Verdünnung der den Komplex enthaltenden freien Moleküle, stabil sein, wenn die den Komplex enthaltenden Moleküle mit hoher Affinität aneinander binden. Wechselwirkungen hoher Affinität zwischen den Molekülen des Komplexes können durch nicht kovalente Wechselwirkungen erreicht werden, beispielsweise durch elektrostatische Wechselwirkungen, hydrophobe Wechselwirkungen, Van-der-Waal'sche-Wechselwirkungen und Wasserstoffbrückenwechselwirkungen.
  • Der Begriff "Menge" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf die Anzeige der Anwesenheit eines Komplexes, der ein biologisches Molekül, eine erste Komponente und eine zweite Komponente aufweist, aus diesen zusammengesetzt ist, oder im Wesentlichen aus diesen zusammengesetzt ist. Die Menge kann beispielsweise als eine Absorptionänderung oder eine Veränderung der Fluoreszenzemission ausgedrückt werden, die bei einer oder mehreren Wellenlängen im ultravioletten, sichtbaren oder infraroten Wellenlängenbereich gemessen wird. Eine optische Dichte oder ein Fluoreszenzmesswert kann mittels einer Standardkurve der Erfindung, wie sie hier anhand eines Beispiels beschrieben ist, in ein Verhältnis umgerechnet werden. Die Menge kann unmittelbar anhand eines Signals bewertet werden, das von einer der Komponenten selbst oder durch eine gesonderte Komponente erzeugt wird, die spezifisch an den Komplex bindet, der ein biologisches Molekül, eine erste Komponente und eine zweite Komponente aufweist, sich aus diesen zusammensetzt, oder im Wesentlichen aus diesen aufgebaut ist.
  • Der Begriff "Verhältnis" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf den Bruchteil biologischer Moleküle. Das Verhältnis kann beispielsweise die Fraktion modifizierter Moleküle zu nicht modifizierten Molekülen repräsentieren. Das Verhältnis dieser biologischen Moleküle kann durch die folgenden Brüche ausgedrückt werden:
    [nicht modifiziertes Molekül]/[modifiziertes Molekül];
    [modifiziertes Molekül]/[nicht modifiziertes Molekül];
    [nicht modifiziertes Molekül]/[modifiziertes Molekül + nicht modifiziertes Molekül]; und
    [modifiziertes Molekül]/[modifiziertes Molekül + nicht modifiziertes Molekül).
  • Das Verhältnis kann auch für mehrere biologische Moleküle ermittelt werden. Beispielsweise könnte ein Verhältnis eines biologischen Moleküls A gegenüber drei anderen biologischen Moleküle B, C und D ermittelt werden. Dieses Ver hältnis könnte durch die Verwendung einer ersten Komponente ermittelt werden, die an jedes der Moleküle A, B, C und D bindet, wobei die Bindung eines beliebigen der Moleküle A, B, C oder D die Bindung an ein beliebiges der übrigen ausschließt. Die zweite Komponente würde spezifische Bindungsaffinität gegenüber A aufweisen. Das Verhältnis könnte ausgedrückt werden durch: [A]/[B + C + D]oder[A]/[A + B + C + D].
  • Desgleichen lässt sich das Verhältnis eines biologischen Moleküls B zu den biologischen Molekülen A, C und D mittels einer zweiten Komponente messen, die spezifische Bindungsaffinität für B aufweist. Das Verhältnis für diese Beziehung kann ausgedrückt werden durch: [B]/[A + C + D]oder[B]/[A + B + C + D]
  • Im Allgemeinen lässt sich das Verhältnis von zwei oder mehr biologischen Molekülen mittels der hier beschriebenen neuen Anleitung ermitteln.
  • Der Begriff "Lösungsverhältnis" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf das Verhältnis der biologischen Moleküle, wie sie in Lösung vorliegen. Das Lösungsverhältnis kann mit dem Verhältnis der an die erste Komponente gebundenen biologischen Moleküle übereinstimmen oder sich von diesem unterscheiden.
  • Der Begriff "Bindungsverhältnis" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf das Verhältnis der an die erste Komponente gebundenen biologischen Moleküle der Erfindung. Die biologischen Moleküle können an die erste Komponente in demselben oder in anderen Verhältnissen binden, wie sie in der Probe vorliegen. Folglich kann das Bindungsverhältnis der biologischen Moleküle mit dem Lösungsverhältnis der biologischen Moleküle übereinstimmen oder sich davon unterscheiden.
  • Das Lösungsverhältnis ähnelt außerdem dem Bindungsverhältnis der biologischen Moleküle, wobei (i) zu jedem Zeitpunkt jeweils eines der biologischen Moleküle in der Lage ist, an nur eine Molekül der ersten Komponente zu binden, und (ii) die biologischen Moleküle an die erste Komponente mit einer ähnlichen ON-Rate und einer ähnlichen Gleichgewichtskonstante für das Binden der ersten Komponente binden. Somit schließt die Bindung eines der biologischen Moleküle die Bindung eines weiteren biologischen Moleküls aus, das ebenfalls die spezifische Bindungsaffinität gegenüber der ersten Komponente aufweist.
  • Der Begriff "ähnliche Gleichgewichtskonstante" bezeichnet Gleichgewichtsdissoziationskonstanten für das erste Molekül, an jedes der biologischen Moleküle innerhalb einer fünffachen Differenz relativ zueinander zu binden.
  • Dieses Merkmal der Erfindung erlaubt es der ersten Komponente die interessierenden biologischen Moleküle in demselben oder in unterschiedlichen Verhältnissen zu binden, in denen die Moleküle in der mit den Komponenten der Erfindung getesteten Probe vorhanden sind. Diese Bedingungen ermöglichen es, dass das Bindungsverhältnis gegenüber dem Lösungsverhältnis denselben Wert oder einen ähnlichen Wert aufweist.
  • Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist es möglich, dass eine oder mehrere Komponenten eine spezifische Bindungsaffinität für ein Epitop aufweisen, das aus einem Abschnitt eines biologischen Moleküls und einem Abschnitt einer weiteren Komponente zusammengesetzt ist oder im Wesentlichen daraus zusammengesetzt ist. Beispielsweise kann die zweite Komponente in 1A eine spezifische Bindungsaffinität für einen Abschnitt von Molekül B und einen Abschnitt von Komponente 1 aufweisen. Dieses Beispiel ist auch auf 1B und 1C anwendbar. Beispiele von Komponenten, z.B. Antikörpern, die spezifische Bindungsaffinität für ein Epitop aufweisen, das eine Bindungsgrenzfläche für zwei andere Moleküle enthält, sind aus dem Stand der Technik hinlänglich bekannt.
  • Der Begriff "Epitop" in dem hier verwendeten Sinne kann sich auf eine Oberfläche beziehen, bezüglich der eine Komponente der Erfindung spezifische Bindungsaffinität aufweist. Ein Epitop kann ein Abschnitt eines Moleküls beliebiger Abmessung sein. Ein Epitop kann auch ein Abschnitt eines Moleküls und ein Abschnitt eines anderen Moleküls sein, wobei die beiden Moleküle in einem Komplex aneinander binden. Ein Epitop auf einem derartigen Komplex kann aus einer Region eines Moleküls und einer Region eines weiteren Moleküls aufgebaut sein, die einander benachbart und an einer Bindungsgrenzfläche der beiden Moleküle angeordnet sind.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei das Verfahren ferner eine oder mehrere andere unterscheidbare erste Kompo nenten enthält, die spezifische Bindungsaffinität gegenüber anderen unterscheidbaren biologischen Molekülen aufweisen.
  • Durch die Verwendung mehrerer unterscheidbarer erster Komponenten schafft die Erfindung ein Verfahren zum Ermitteln von zwei oder mehr Verhältnissen biologischer Moleküle. Beispielsweise lässt sich eine erste Komponente nutzen, um das Verhältnis biologischer Moleküle A und B in einer Probe zu messen, und eine unterschiedliche erste Komponente kann in derselben Probe das Verhältnis biologischer Moleküle C und D bestimmen. Dieses Beispiel lässt sich ohne weiteres durch einen Fachmann modifizieren, um ein Messen mehrerer Verhältnisse biologischer Moleküle mittels mehrerer erster Komponenten der Erfindung einzuschließen.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei das Verfahren ferner eine oder mehrere andere unterscheidbare zweite Komponenten enthält, von denen jede spezifische Bindungsaffinität für unterscheidbare biologische Moleküle aufweist. Jede unterscheidbare zweite Komponente weist für lediglich ein biologisches Molekül eine spezifische Bindungsaffinität auf. Mehrere zweite Komponenten lassen sich in Verbindung entweder mit einer ersten Komponente oder mit mehreren ersten Komponenten nutzen. Ein Beispiel der vorherigen Anwendung ist hier als ein Beispiel mit Blick auf ein Messen von Verhältnissen biologischer Moleküle erläutert, die für die Blutgerinnung von Bedeutung sind. Eine Darstellung der Verwendung mehrerer zweiter Komponenten in Verbindung mit einer ersten Komponente ist in 1D veranschaulicht.
  • Hier ist anhand eines Beispiels ein Protokoll erläutert, dass die Verwendung einer ersten Komponente in Verbindung mit zwei oder drei zweiten Komponenten erfordert. Eine Darstellung der Verwendung mehrerer zweiter Komponenten in Verbindung mit mehreren ersten Komponenten ist in 1C veranschaulicht.
  • Falls das Verhältnis von drei oder mehr biologischen Molekülen lediglich mittels einer ersten Komponente gemessen wird, stimmen das Lösungsverhältnis und die Bindungsverhältnisse nahezu überein, wenn das Verhältnis des Lösungsverhältnisses gegenüber dem Bindungsverhältnis zwischen 0,1 und 10, vorzugsweise zwischen 0,2 und 5, eher bevorzugt zwischen 0,5 und 2 liegt, und am meisten vorzuziehen gleich 1 ist.
  • Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei mindestens eine der Komponenten einen Antikörper aufweist. In diesem bevorzugten Ausführungsbeispiel kann die erste Komponente einen Antikörper aufweisen, die zweite Komponente einen Antikörper aufweisen, oder die erste Komponente und die zweite Komponente können Antikörper aufweisen. Dementsprechend kann das Verfahren eine erste Komponente, die einen Antikörper aufweist, und eine zweite Komponente verwenden, die einen anderen Typ eines Polypeptids oder organischen Moleküls aufweist. Alternativ kann das Verfahren zwei Komponenten betreffen, die Antikörper aufweisen.
  • Gemäß noch einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei mindestens eine der Komponenten ein Reportermolekül aufweist. In diesem bevorzugten Ausführungsbeispiel kann die erste Komponente ein Reportermolekül aufweisen, die zweite Komponente kann ein Reportermolekül aufweisen, oder die erste Komponente und die zweite Komponente können Reportermoleküle aufweisen. Falls beide Komponenten Reportermoleküle aufweisen, können die Reportermoleküle von denselben Arten von Molekülen oder vorzugsweise unterschiedliche Arten von Reportermolekülen sein.
  • Der Begriff "Reportermolekül" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf einen Signalerzeuger oder ein signalerzeugendes Element. Diese Begriffe können sich auf eine Reihe von Elementen beziehen: Enzyme und deren resultierende Wirkungen auf ein Substrat, kolloidale Metallpartikel, Latex und Silikapartikel, die einen eingegliederten Farbstoff enthalten, und Farbstoffpartikel sind Beispiele für Signalerzeuger. Ein Enzym kann den Umsatz eines Substrats katalysieren, um ein Produkt hervorzubringen, das sich beispielsweise durch Absorptions- oder Fluoreszenztechnologien (die z.B. ultraviolettes, sichtbares oder infrarotes Licht verwenden) oder durch Änderungen des pH-Werts nachweisen lässt. Reportermoleküle können an Komponenten der Erfindung, insbesondere an Antikörper, durch in der Fachwelt hinlänglich bekannte Techniken angehängt werden. Beispiele von Verfahren, die verwendet werden, um Reportermoleküle an Antikörper und andere Proteine zu binden, sowie Beispiele vielfältiger Reportermoleküle, die gewöhnlich durch den Fachmann eingesetzt werden, sind z.B. Harlo & Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratories zu entnehmen. Die Anbindung kann eine chemische Komponente von sich verändernder Länge sein. Die Komponenten der Erfindung können mit einem Reportermolekül modifiziert werden, und zwar entweder vor einem Hinzufügen der Komponenten zu einer Probe, die die zu untersuchenden biologischen Moleküle enthält, oder alternativ, nach einem Hinzufügen der Komponenten zu der Probe, die mit den Komponenten der Erfindung getestet wird.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei wenigstens eine Komponente einen spezifischen Erkennungsanteil aufweist. In diesem bevorzugten Ausführungsbeispiel kann die erste Komponente einen spezifischen Erkennungsanteil aufweisen, die zweite Komponente kann einen spezifischen Erkennungsanteil aufweisen, oder die erste Komponente und die zweite Komponente können spezifische Erkennungsanteile aufweisen.
  • Falls beide Komponenten spezifische Erkennungsanteile aufweisen, können die spezifischen Erkennungsanteile sich voneinander unterscheiden oder der gleiche Erkennungsanteil sein.
  • Der Begriff "spezifischer Erkennungsanteil" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf ein kovalent an eine Komponente der Erfindung angehängtes Molekül, das durch ein anderes Bindungsmolekül erkannt werden kann. Der spezifische Erkennungsanteil kann ein Peptid, Polypeptid, Protein oder ein Molekül sein, das kein Peptid ist. Ein Beispiel eines derartigen spezifischen Erkennungsanteils ist eine von dem Hämagglutininprotein stammende Peptidkomponente, die in der Lage ist, im Handel erhältliche Antikörper mit hoher Affinität zu binden. Der Anti-Hämagglutininpeptid-Antikörper, oder mehr im Allgemeinen, ein Bindungsanteil, der in der Lage ist spezifisch an das spezifische Erkennungsanteil zu binden, kann frei in Lösung vorliegen oder kann an einen festen Träger gebunden werden.
  • Der Begriff "fester Träger" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf eine Matrix, die auf einem Material basiert, das sich nicht in wässerigen Lösungen auflöst. Der feste Träger kann aus Materialien wie Kohlenhydraten und Kunststoffen zusammengesetzt sein. Dem Fachmann stehen viele Beispiele von im Handel erhältlichen festen Trägern zur Verfügung. Beispiele fester Träger sind Latex und Silikapartikel, Kunststoffe, Agarose, Zellulose und Polyethylen. Da feste Träger, die reaktive chemische Komponenten auf ihren Oberflächen aufweisen, im Handel erhältlich sind oder sich mittels aus dem Stand der Technik hinlänglich bekannter Techniken chemisch synthetisieren lassen, können Komponenten der Erfindung entweder vor oder nach einem Hinzufügen der Komponenten zu der Probe, die zu untersuchende biologische Moleküle enthält, an den festen Träger angehängt werden.
  • Die Komponenten der Erfindung können entweder unmittelbar oder über ein Spacermolekül an den Träger angehängt werden. Beispiele von chemischen Anbindungen zwischen festen Trägern und anderen Moleküle sind der Fachwelt wohl bekannt (diesbezügliche Daten lassen sich z.B. dem Pierce-Katalog entnehmen). Darüber hinaus lassen sich gereinigte Formen biologischer Moleküle selbst mittels in der Fachwelt allgemein bekannter Techniken an feste Träger anhängen.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei mindestens eine der Komponenten eine Anbindung an einen festen Träger aufweist. In diesem bevorzugten Ausführungsbeispiel kann die erste Komponente eine Anbindung an einen festen Träger aufweisen, die zweite Komponente kann eine Anbindung an einen festen Träger aufweisen, oder sowohl die erste als auch die zweite Komponente können Anbindungen an feste Träger aufweisen. Falls beide Komponenten Anbindungen an feste Träger aufweisen, können die festen Träger unterschiedliche Arten von festen Trägern sein, oder feste Träger desselben Typs sein, allerdings ist jeder Typ einer Komponente an diskrete Feststoffträgergebilde angehängt. Der Begriff "diskrete Feststoffträgergebilde" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf eine Komponente, die an einen festen Träger angehängt ist, und auf einen weiteren Typ einer Komponente, die an einen weiteren festen Träger angehängt ist, wobei die Zusammensetzungen der festen Träger übereinstimmen können oder verschieden sein können.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei die zweite Komponente spezifische Bindungsaffinität für einen Komplex aufweist, der ein biologisches Molekül und die erste Komponente enthält, aus diesen zusammengesetzt ist oder im Wesentlichen aus diesen zusammengesetzt ist. Die Erfindung wird vorzugsweise in der durch dieses bevorzugte Ausführungsbeispiel dargelegten Weise durchgeführt, wenn die Konzentration des biologischen Moleküls die Konzentration der zweiten Komponente überschreitet, an die das biologische Molekül spezifisch bindet. Die zweite Komponente kann einen Komplex aus zwei oder mehr Molekülen binden, wenn eine Bindungsregion der zweiten Komponente spezifische Bindungsaffinität zu einer Region auf einem biologischen Molekül und einer benachbarten Region auf der ersten Komponente aufweist.
  • Beispiele bifunktionaler organisch synthetisierter Moleküle sowie von Antikörpern, die Komplexe binden, existieren nach dem Stand der Technik. Siehe beispielsweise die US-Patentschrift 5 480 792, eingereicht am 1. Juni 1993 und die US-Patentschrift 5 985 579, eingereicht am 2. Juni 1995.
  • Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei die erste Komponente einen Bindungsanteil enthält, der spezifische Bindungsaffinität für jedes der interessierenden biologischen Moleküle aufweist. Jedes der Moleküle bindet an die erste Komponente in einem Anteilsverhältnis, das zu seinem Lösungsanteil in Beziehung steht. Beispielsweise kann ein Bindungsanteil spezifische Bindungsaffinität für ein modifiziertes Molekül und für dessen verwandte nicht modifizierte Form aufweisen: ein Bindungsanteil kann spezifische Bindungsaffinität für Hämoglobin und dessen modifizierte Form Hämoglobin A1-C aufweisen. Der Bindungsanteil kann an die modifizierten und nicht modifizierten Formen biologischer Moleküle mit gleicher Affinität oder ungleicher Affinität binden.
  • Falls die beiden Formen der biologischen Moleküle an die erste Komponente mit ungleicher Affinität binden, lässt sich ein Normalisierungsfaktor ermitteln, um das tatsächliche Verhältnis der an die erste Komponente gebundenen biologischen Moleküle zu korrigieren. Alternativ kann das Verhältnis einfach mittels einer Standardkurve ermittelt werden, die, wie hier anhand eines Beispiels beschrieben, konstruiert wird. Es kann vorteilhaft sein, Antikörper mit gegenüber den biologischen Molekülen ungleicher Affinität auszuwählen, falls es vorgezogen wird, bevorzugt eines der biologischen Moleküle zu binden. Beispielsweise kann ein größerer dynamischer Bereich erreicht werden, wenn die Konzentration des einen biologischen Moleküls halb so groß oder kleiner als die Konzentration des anderen biologischen Moleküls ist.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei die erste Komponente folgendes enthält: (a) einen ersten Bindungsanteil, der spezifische Bindungsaffinität für ein biologisches Molekül aufweist; und (b) einen zweiten Bindungsanteil, der spezifische Bindungsaffinität für ein weiteres der interessierenden biologischen Moleküle aufweist. In diesem bevorzugten Ausführungsbeispiel kann die erste Komponente an jedes der interessierenden biologischen Moleküle binden, ist so geeignet konstruiert, dass jedes der biologischen Moleküle hinsichtlich der Bindung an die erste Komponente konkurrieren. Insbesondere kann die erste Komponente lediglich an eines der interessierenden biologischen Moleküle gleichzeitig binden. Die Erfindung kann ferner eine erste Komponente betreffen, in der der erste Bindungsanteil spezifische Bindungsaffinität für ein biologisches Molekül aufweist, und ein zweiter Bindungsanteil spezifische Bindungsaffinität für ein oder mehrere andere biologischen Moleküle aufweist.
  • Auf diese Weise lässt sich, falls gewünscht, für ein Molekül ein Verhältnis in Bezug auf eine Familie von Molekülen ermitteln. Vorzugsweise wird für ein biologisches Molekül das Verhältnis bezüglich eines anderen biologischen Moleküls bestimmt.
  • Gemäß anderen bevorzugten Ausführungsbeispielen betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei ein oder mehrere der Bindungsanteile der ersten Komponente oder der zweiten Komponente Antikörper sind.
  • Gemäß noch einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei die biologischen Moleküle besetzte Rezeptoren oder freie Rezeptoren sind.
  • Der Begriff "freier Rezeptor" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf ein Molekül, das seine Funktion durch Binden eines weiteren Moleküls erfüllt. Ein freier Rezeptor ist ein Rezeptormolekül, das nicht an einen Liganden gebunden ist. Ein Rezeptormolekül kann an der Oberfläche einer Zelle oder innerhalb der Zelle vorhanden sein. Beispiele von auf der Oberfläche von Zellen vorzufindenden Rezeptoren sind Mitose auslösende Rezeptoren (beispielsweise Epidermiswachstumsfaktorrezeptoren und von Thrombozyten abgeleitete Wachstumsfaktorrezeptoren), metabolische Rezeptoren (beispielsweise Insulinrezeptoren und Transferrinrezeptoren), Thrombozytenaggregationsrezeptoren (beispielsweise der Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor), Steroidrezeptoren und Hormonrezeptoren.
  • Der Begriff "besetzter Rezeptor" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf einen Rezeptor, der durch einen Liganden gebunden ist. Der Begriff "Ligand" bezeichnet ein Molekül, das mit hoher Affinität an den Rezeptor bindet. Beispiele natürlich auftretender Liganden von Rezeptoren sind beispielsweise Eisen für den Transferrinrezeptor, Epi dermiswachstumsfaktor für den Epidermiswachstumsfaktorrezeptor und Fibrinogen oder spezielle medizinische Wirkstoffe, z.B. Reopro®, zum Binden an den Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor.
  • Der Ligand kann auch ein synthetischer Ligand sein, der mit hoher Affinität an den Rezeptor bindet. Der Begriff "hohe Affinität" in dem hier mit Bezug auf eine Wechselwirkung zwischen Rezeptor und Ligand verwendeten Sinne bezeichnet eine Dissoziationsgleichgewichtsbindungskonstante zwischen 1 μM und 0,01 pM.
  • Ein Beispiel eines freien/besetzten Rezeptor verwendenden pharmazeutisch maßgebenden Systems betrifft den Rezeptor Glycoprotein-IIbIIIa und dessen Rolle in der Blutgerinnung. Blutgerinnung bezeichnet den Vorgang, bei dem rote Blutkörperchen auf ein Binden von Fibrinogen hin einen Klumpen bilden. Vielfältige bereits auf dem Markt vorhandene oder vor deren Einführung stehende medizinische Wirkstoffe sind in der Lage, an den Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor zu binden und den Koagulationsprozess zu blockieren. Im vorliegenden dargelegte Verfahren sind in der Lage, die für eine wirksame Blockierung des Koagulationsprozesses erforderliche Menge eines Blutgerinnungshemmstoffs zu ermitteln.
  • Gemäß noch einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei die biologischen Moleküle Hämoglobin und Hämoglobin A1-C sind.
  • Der Begriff "Hämoglobin" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf ein Proteinmolekül, das im Blut von Orga nismen Sauerstoff transportiert. Hämoglobin ist in hohen Konzentrationen im Blut von Organismen vorhanden.
  • Der Begriff "Hämoglobin A1-C" bezeichnet Hämoglobin, das modifiziert wird, wenn die Glucosekonzentration im Blutstrom eines Organismus hoch ist. Hämoglobin wird durch Glucoseanteile modifiziert, wenn die Konzentration von Glucose im Blutstrom eines Organismus eine kritische Konzentration erreicht.
  • Hämoglobin wird in Diabetikern im Vergleich zu Nichtdiabetikern bei höheren Spiegeln glykosyliert, da das Blut von Diabetikern abnormal hohe Konzentrationen von Glucose aufweist.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei die biologischen Moleküle oxidiertes Troponin I und reduziertes Troponin I sind.
  • Der Begriff "reduziertes Troponin I" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf Troponin I, das zwei Cysteinkomponenten enthält, die in der Lage sind, die intramolekulare Oxidation zu erfahren. Die Cysteinaminosäuren weisen Seitenketten der Form -CH2-SH auf. Reduziertes Troponin I kann mindestens zwei Cysteinresiduen enthalten. Komponenten der Erfindung können für die reduzierte Form von Troponin I spezifisch sein, da diese in einer anderen Proteinkonformation vorliegt als die oxidierte Form von Troponin I.
  • Der Begriff "oxidiertes Troponin I" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf Troponin I, das eine oder mehrere Cysteinkomponenten in einer oxidierten Form enthält. Oxidierte Cysteinaminosäuren weisen Seitenketten der Form -CH2-S– auf. Oxidiertes Troponin I kann mindestens ein Cysteinresiduum enthalten, das ist in einer oxidierten Form vorliegt.
  • Gemäß noch einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei die erste Komponente sowohl für besetzte Rezeptoren als auch für freie Rezeptoren spezifisch ist, und wobei die zweite Komponente spezifisch ist für: (a) besetzte Rezeptoren; (b) freie Rezeptoren; (c) einen Komplex, der wenigstens einen besetzten Rezeptor und die erste Komponente aufweist, aus diesen weitgehend zusammengesetzt ist oder ganz aus diesen zusammengesetzt ist; oder (d)) einen Komplex, der wenigstens einen freien Rezeptor und die erste Komponente aufweist, sich aus diesen zusammensetzt oder weitgehend aus diesen zusammensetzt ist.
  • Wie hier beschrieben, kann sich der freie Rezeptor auf Glycoprotein IIbIIIa beziehen, und der besetzte Rezeptor kann sich auf an ein Medikament gebundenes Glycoprotein IIbIIIa beziehen.
  • Der Ausdruck "spezifisch sowohl für besetzte Rezeptoren als auch für freie Rezeptoren" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf eine Komponente, vorzugsweise einen Antikörper, der Erfindung, die bzw. der in der Lage ist, an einen Rezeptor oder an eine Komponente zu binden, die den Rezeptor aufweist, unabhängig davon, ob dieser frei oder besetzt ist. Dieser Typ einer Komponente unterscheidet nicht zwischen einem freien oder einem besetzten Rezeptor. Diese Komponente bindet jedoch mit höherer Affinität an einen Rezeptor als an andere Moleküle.
  • Die erste Komponente, die sowohl an die freie als auch die besetzte Form eines Rezeptors bindet, unterscheidet sich von der zweiten Komponente, die spezifisch an eine der Formen des Rezeptors in einem nicht gebundenen Zustand oder in einem gebundenen Zustand, oder an eine der Formen des in einem Komplex mit der ersten Komponente befindlichen Rezeptors bindet. Eine zweite Komponente, die an einen Komplex spezifisch bindet, der einen freien Rezeptor und die erste Komponente aufweist, weitgehend aus diesen zusammengesetzt ist oder ganz aus diesen zusammengesetzt ist, wird beispielsweise nicht spezifisch an einen Komplex binden, der einen besetzten Rezeptor und die erste Komponente aufweist, weitgehend aus diesen zusammengesetzt ist oder ganz aus diesen zusammengesetzt ist.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei die erste Komponente sowohl für Hämoglobin als auch für Hämoglobin A1-C spezifisch ist, und wobei die zweite Komponente spezifisch ist für: (a) Hämoglobin; (b) Hämoglobin A1-C; (c) einen Komplex, der Hämoglobin und die erste Komponente aufweist, weitgehend aus diesen zusammengesetzt ist oder ganz aus diesen zusammengesetzt ist; oder (d) ein Komplex, der Hämoglobin A1-C und die erste Komponente aufweist, weitgehend aus diesen zusammengesetzt ist oder ganz aus diesen zusammengesetzt ist.
  • Der Ausdruck "spezifisch sowohl für Hämoglobin als auch für Hämoglobin A1-C" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf eine Komponente der Erfindung, vorzugsweise einen Antikörper, der an Hämoglobin bindet, unabhän gig davon, ob dieser durch Glucose modifiziert ist oder durch Glucose nicht modifiziert ist. Dieser Typ einer Komponente unterscheidet nicht zwischen Hämoglobin, das durch Glucose nicht modifiziert ist, und Hämoglobin, das durch Glucose modifiziert ist. Diese Komponente bindet jedoch an Hämoglobin mit höherer Affinität als an andere Proteine.
  • Eine erste Komponente, die sowohl an Hämoglobin als auch an Hämoglobin A1-C spezifisch bindet, unterscheidet sich von einer zweiten Komponente, die spezifisch an einen Komplex bindet, der Hämoglobin A1-C und die erste Komponente aufweist, weitgehend aus diesen zusammengesetzt ist oder ganz aus diesen zusammengesetzt ist. Darüber hinaus wird eine zweite Komponente, die spezifisch einen Komplex bindet, der Hämoglobin und die erste Komponente aufweist, weitgehend aus diesen zusammengesetzt ist oder ganz aus diesen zusammengesetzt ist, beispielsweise nicht spezifisch an einen Komplex binden, der Hämoglobin A1-C und die erste Komponente aufweist, weitgehend aus diesen zusammengesetzt ist oder ganz aus diesen zusammengesetzt ist.
  • Gemäß noch einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei die erste Komponente sowohl für oxidiertes Troponin I als auch für reduziertes Troponin I spezifisch ist, und wobei die zweite Komponente spezifisch ist für: (a) oxidiertes Troponin I; (b) reduziertes Troponin I; (c) einen Komplex, der oxidiertes Troponin I und die erste Komponente aufweist, weitgehend aus diesen zusammengesetzt ist oder ganz aus diesen zusammengesetzt ist; oder (d) einen Komplex, der reduziertes Troponin I und die erste Komponente aufweist, weitgehend aus diesen zusammengesetzt ist oder ganz aus diesen zusammengesetzt ist.
  • Der Ausdruck "spezifisch sowohl für oxidiertes Troponin I als auch für reduziertes Troponin I" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf eine Komponente der Erfindung, vorzugsweise einen Antikörper, der an Troponin I unabhängig davon bindet, ob dieses oxidiert oder reduziert ist. Dieser Typ Komponente unterscheidet nicht zwischen oxidiertem oder reduziertem Troponin I. Diese Komponente bindet jedoch an Troponin I mit höherer Affinität als an andere Proteine.
  • Eine erste Komponente, die spezifisch sowohl an oxidiertes als auch an reduziertes Troponin I bindet, unterscheidet sich von einer zweiten Komponente, die spezifisch einen Komplex bindet, der oxidiertes Troponin I und die erste Komponente aufweist, weitgehend aus diesen zusammengesetzt ist oder ganz aus diesen zusammengesetzt ist. Darüber hinaus wird eine zweite Komponente, die spezifisch einen Komplex bindet, der oxidiertes Troponin I und die erste Komponente aufweist, weitgehend aus diesen zusammengesetzt ist oder ganz aus diesen zusammengesetzt ist, beispielsweise nicht spezifisch an einen Komplex binden, der reduziertes Troponin I und die erste Komponente aufweist, weitgehend aus diesen zusammengesetzt ist oder ganz aus diesen zusammengesetzt ist.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung. ein Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, ferner mit dem Schritt, die biologischen Moleküle mit einer dritten Komponente zusammen zu bringen. Die dritte Komponente wird vorzugsweise einer Probe hinzugefügt, die die biologischen Moleküle enthält, nachdem der Probe die erste und die zweite Komponente hinzugefügt wurden, wird jedoch hinzugefügt, bevor die freien Moleküle weggespült werden, oder bevor das Verhältnis der biologischen Moleküle bestimmt wird.
  • Die dritte Komponente weist spezifische Bindungsaffinität für einen Komplex auf, der das erste biologische Molekül und die zweite Komponente enthält.
  • Die dritte Komponente kann an einen Komplex binden, der das erste biologische Molekül und die zweite Komponente enthält, wenn die dritte Komponente an benachbarte Regionen bindet, die auf dem ersten biologischen Molekül und der zweiten Komponente angeordnet sind.
  • Gemäß noch einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei die dritte Komponente einen spezifischen Erkennungsanteil enthält. Dieser spezifische Erkennungsanteil lässt sich nutzen, um den Komplex an einen festen Träger zu binden. Beispiele spezifischer Erkennungsanteile sind hier offenbart. Der an die dritte Komponente angehängte spezifische Erkennungsanteil kann der gleiche Anteil sein wie der spezifische Erkennungsanteil, der möglicherweise an die zweite Komponente angehängt wird, ist jedoch vorzugsweise ein unterschiedlicher Anteil gegenüber dem Erkennungsanteil, der möglicherweise an die zweite Komponente angehängt wird.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, ferner mit dem Schritt, vor einem Ermitteln der Menge des Komplexes, der ein biologisches Molekül, eine erste Komponente und eine zweite Komponente aufweist, Moleküle zu entfernen, die nicht an diesen Komplex gebunden sind.
  • Der Begriff "Entfernen" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf ein Verfahren zum Trennen von Molekülen von jenen, die in einem Komplex vorhanden sind, der ein biologisches Molekül, eine erste Komponente und eine zweite Komponente aufweist, weitgehend aus diesen zusammengesetzt ist oder ganz aus diesen zusammengesetzt ist. Dieses Verfahren kann durch Anhängen der ersten oder der zweiten Komponente an einen festen Träger und Wegspülen von Molekülen erreicht werden, die weder an die erste noch die zweite Komponente gebunden sind. Diese Techniken sind in der Fachwelt hinlänglich bekannt. Siehe z.B. Harlo and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratories.
  • Ein Fachmann kann die Konzepte und Komponenten der Erfindung ohne weiteres an ein Verfahren anpassen, das keine festen Träger benötigt. Im Stand der Technik sind Homogenassayverfahren beschrieben, bei denen sich die Menge eines vorgegebenen biologischen Moleküls durch die Änderung der Fluoreszenzpolarisation einer Komponente ermitteln lässt, an die das biologische Molekül bindet. Einige auf diese Erfindung anwendbare Homogenassaytechniken sind in der WO94/24559, den US-Patenten 3 817 837 und 3 935 074 und in Clin. Chem. 32, 1637–1641, (1986) beschrieben. Somit könnten Änderungen der physikalischen Parameter der Komponenten der Erfindung (z.B. Fluoreszenzpolarisation oder Absorption oder Wellenlänge) überwacht werden, wenn biologische Moleküle an diese binden. Diese Änderungen der physikalischen Parameter können verwendet werden, um das Verhältnis biologischer Moleküle unmittelbar und ohne den Einsatz eines festen Trägers zu ermitteln.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle ferner mit dem Schritt, die Menge des Komplexes, der ein biologisches Molekül, eine erste Komponente und eine zweite Komponente aufweist, mit einer Standardkurve zu vergleichen, wobei die Standardkurve die Menge dieses Komplexes zu dem Verhältnis der biologischen Moleküle in Beziehung setzt. Dieser Komplex könnte ferner eine dritte Komponente aufweisen, wobei die dritte Komponente spezifische Bindungsaffinität für einen Komplex aufweist, der das erste biologische Molekül und die zweite Komponente enthält. Darüber hinaus kann die dritte Komponente einen spezifischen Erkennungsanteil aufweisen.
  • Der Begriff "Standardkurve" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf eine gemessene Beziehung zwischen dem Verhältnis biologischer Moleküle bezüglich der Menge des Komplexes, der eine erste Komponente und eine zweite Komponente eines biologischen Moleküls aufweist. Dieser Komplex könnte ferner eine dritte Komponente aufweisen, wobei die dritte Komponente eine spezifische Bindungsaffinität für einen Komplex aufweist, der das erste biologische Molekül und die zweite Komponente enthält. Darüber hinaus kann die dritte Komponente einen spezifischen Erkennungsanteil aufweisen. Die Menge des Komplexes kann durch ein Signal quantifiziert werden, das durch ein Reportermolekül erzeugt wird, das an eine der Komponenten der Erfindung angehängt ist. Die Beziehung zwischen dem Verhältnis und dem Signal in einer Standardkurve kann beispielsweise linear sein oder einer nicht linearen Funktion folgen. Die Standardkurve kann durch Messen des Signals erzeugt werden, das durch das Verfahren der Erfindung für Proben erzeugt wird, die biologischer Moleküle in bekannten Verhältnissen enthalten. Diese Verfahren werden hier anhand von Beispielen beschrieben.
  • Der Begriff "Signal" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf eine spektroskopische oder chemische Änderung, die durch ein Reportermolekül hervorgerufen wird, das entweder an eine Komponente der Erfindung oder an eine andere Komponente gebunden wird, die verwendet wird, um einen Komplex zu erfassen, der ein biologisches Molekül, eine erste Komponente und eine zweite Komponente aufweist. Wie hier beschrieben, kann das Signal beispielsweise als Fluo reszenzemission, Veränderung der Wellenlänge einer Fluoreszenzemission, Absorptionmesswerts, Veränderung der Infrarotwellenlänge oder Veränderung des pH-Werts der Lösung vorliegen.
  • Der Begriff "vergleichen" in dem hier mit Bezug auf eine Standardkurve verwendeten Sinn, bezeichnet ein Extrapolieren des Verhältnisses biologischer Moleküle anhand einer Standardkurve, indem die Menge der zweiten Komponente verwendet wird, die an die interessierenden biologischen Moleküle gebunden ist. Da die Standardkurve das Verhältnis biologischer Moleküle zu dem durch das Verfahren der Erfindung erzeugten Signal in Beziehung setzt, kann ein Anwenden eines Signalmesswerts auf die Standardkurve ein geschätzes Verhältnis der biologischen Moleküle liefern.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, ferner mit dem Schritt, das von einem Reportermolekül erzeugte Signal mit einer Standardkurve zu vergleichen. Die Standardkurve kann die Menge des Reportermolekül zu dem Verhältnis der biologischen Moleküle in Beziehung setzen.
  • Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen eines oder mehrerer Lösungsverhältnisse von drei oder mehr biologischen Molekülen. Zu diesem Verfahren zum Bestimmen der Lösungsverhältnisse eines oder mehrerer biologischer Moleküle gehören die Schritte:
    • (a) Zusammenbringen der biologischen Moleküle mit
    • (i) einer ersten Komponente, die spezifische Bindungsaffinität gegenüber jedem der biologischen Moleküle aufweist, wobei die biologischen Moleküle an die erste Komponente in einem Bindungsver hältnis binden, das in Beziehung zu dem Lösungsverhältnis der biologischen Moleküle steht;
    • (ii) einer zweiten Komponente, die für ein erstes biologisches Molekül der biologischen Moleküle spezifische Bindungsaffinität aufweist;
    • (iii) einer unterschiedlichen zweiten Komponente, die spezifische Bindungsaffinität für ein zweites biologisches Molekül der biologischen Moleküle aufweist; und
    • (b) Ermitteln der Menge eines Komplexes, der das erste biologische Molekül, die erste Komponente und die zweite Komponente enthält, oder der Menge eines Komplexes, der das zweite biologische Molekül, die erste Komponente und die unterschiedliche zweite Komponente enthält, als Maß des Lösungsverhältnisses.
  • Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln der Verhältnisse von drei oder mehr biologischen Molekülen, wobei wenigstens eine der Komponenten einen Antikörper aufweist.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln der Verhältnisse von drei oder mehr biologischen Molekülen, wobei wenigstens eine der Komponenten einen spezifischen Erkennungsanteil aufweist.
  • Gemäß noch einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln der Verhältnisse von drei oder mehr biologischen Molekülen, wobei wenigstens eine der Komponenten eine Bindung an einen festen Träger aufweist.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln der Verhältnisse von drei oder mehr biologischen Molekülen, wobei wenigstens eine der Komponenten ein Reportermolekül aufweist.
  • Gemäß noch einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln der Verhältnisse von drei oder mehr biologischen Molekülen, wobei die biologischen Moleküle aktivierte Thrombozyten, freier Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor, besetzter Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor und P-Selektin sind.
  • Der Begriff "aktivierte Thrombozyten" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf biologische Prozesse zum Bilden eines Thrombus. Inaktive Thrombozyten und aktivierte Thrombozyten exprimieren das Protein Glycophorin auf der Zelloberfläche. Inaktive Thrombozyten exprimieren ferner freien Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor. Dieser Rezeptor kann Fibrinogen binden, das die Thrombozyten aktiviert und diese dazu anregt, einen Thrombus zu bilden. Aktivierte Thrombozyten exprimieren das Protein P-Selektin auf der Zellenoberfläche, während inaktive Thrombozyten dies nicht tun. Moleküle die den Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor binden und besetze, sind in der Lage das Binden von Fibrinogen an den Rezeptor zu blockieren und verhindern dadurch die Aktivierung von Thrombozyten sowie die Bildung von Thrombinklumpen. Die hier exemplarisch unterbreiteten Verfahren ermöglichen es, das Verhältnis von besetztem zu freiem Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor und das Verhältnis von aktivierten gegenüber inaktiven Thrombozyten zu ermitteln.
  • Der Begriff "inaktive Thrombozyten" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf Thrombozyten, die das Potential aufweisen, aktiviert zu werden, die jedoch noch nicht aktiviert wurden, da das geeignete Aktivierungsignal diese nicht aktiviert hat, oder da an den Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor ein Medikament gebunden ist und das Aktivierungsignal sperrt.
  • Der Begriff "freier Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf den Rezeptor, der nicht durch Fibrinogen oder durch irgendwelche Moleküle eines Medikaments besetzt ist.
  • Der Begriff "besetzter Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf Rezeptoren, die durch Fibrinogen oder durch Medikamentmoleküle besetzt sind, die die Aktivierung von Thrombozyten verhindern.
  • Der Begriff "Glycophorin" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf ein Protein, das auf der Oberfläche von sowohl inaktiven als auch aktivierten Thrombozyten exprimiert wird.
  • Der Begriff "P-Selektin" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf ein Protein, das auf der Oberfläche von aktivierten Thrombozyten exprimiert wird.
  • Gemäß anderen bevorzugten Ausführungsbeispielen betrifft die Erfindung das Verfahren zum Bestimmen des Verhältnisses von drei oder mehr biologischen Molekülen, wobei die Menge des Komplexes, der das erste biologische Molekül, die erste Komponente und die zweite Komponente enthält, ein Maß für das Lösungsverhältnis von freiem Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor zu besetztem Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor ist. Darüber hinaus ist die Menge des Komplexes, der das zweite biologische Molekül, die erste Komponente und die unterschiedliche zweite Komponente enthält, ein Maß für das Lösungsverhältnis von aktivierten Thrombozyten gegenüber inaktiven Thrombozyten. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln der Verhältnisse von drei oder mehr biologischen Molekülen, wobei die zweite Komponente spezifische Bindungsaffinität für entweder freien Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor oder besetzten Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor aufweist, und die unterschiedliche zweite Komponente spezifische Bindungsaffinität für P-Selektin aufweist.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln der Verhältnisse von drei oder mehr biologischen Molekülen, wobei das Verfahren ferner eine weitere unterschiedliche zweite Komponente beinhaltet, die spezifische Bindungsaffinität für ein drittes biologisches Molekül aufweist. Diese weitere unterschiedliche zweite Komponente kann einen spezifischen Erkennungsanteil aufweisen.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln der Verhältnisse von drei oder mehr biologischen Molekülen, wobei die erste Komponente für Glycophorin spezifisch ist, wobei die zweite Komponente spezifische Bindungsaffinität für freien Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor aufweist, wobei die unterschiedliche zweite Komponente spezifische Bindungsaffinität für P-Selektin aufweist, und wobei die weitere unterschiedliche zweite Komponente spezifische Bindungsaffinität für besetzten Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor aufweist.
  • Gemäß einem Aspekt, der auf den vorhergehenden Ausführungsbeispielen und Aspekten der Erfindung aufbaut, können Komponenten der Erfindung spezifische Bindungsaffinität zu zwei oder mehr biologischen Molekülen aufweisen, wobei die biologischen Moleküle (a) verwandt, (b) nicht verwandt oder (c) verwandt und nicht verwandt sind.
  • Beispiele von Komponenten, die spezifische Bindungsaffinität für biologische Moleküle aufweisen, die nicht verwandt sind, sind in 2 veranschaulicht. 2A stellt eine Komponente dar, die einen einzigen Antikörper aufweist, wobei der Antikörper spezifische Bindungsaffinität für Molekül A und Molekül B aufweist. Molekül A und Molekül B sind möglicherweise nicht verwandt und ein Binden von Molekül A verhindert ein Binden von Molekül B.
  • In ähnlicher Weise verhindert ein Binden von Molekül B ein Binden von Molekül A an die Komponente.
  • 2B veranschaulichen eine weitere Komponente, die in der Lage ist, biologische Moleküle zu binden, die nicht verwandt sind, wobei die Komponente zwei Antikörper aufweist, von denen jeder spezifische Bindungsaffinität für ein biologisches Molekül aufweist, und zwar entweder für Molekül A oder für Molekül B. Die Antikörper der Komponente lassen sich räumlich so anordnen, dass ein Binden von Molekül A an die Komponente die Bindung von Molekül B an die Komponente verhindert und ein Binden von Molekül B ein Binden von Molekül A verhindert.
  • Der Begriff "verwandte biologische Moleküle" in dem hier verwendeten Sinne kann sich auf biologische Moleküle beziehen, die eine wesentliche strukturelle Ähnlichkeit untereinander aufweisen. Solche verwandten Moleküle können eine wesentliche Aminosäuresequenzidentität untereinander aufweisen oder können eine wesentliche Nucleinsäuresequenzidentität untereinander aufweisen. Aminosäuresequenzidentität und Nucleinsäuresequenzidentität sind aus dem Stand der Technik hinlänglich bekannt. Beispiele verwandter biologischer Moleküle sind Isoformen eines vorgegebenen biologischen Proteins, z.B. Hämoglobin und Hämoglobin A1-C, oxidiertes und reduziertes Troponin I, besetzte und nicht besetzte Zellenoberflächenrezeptoren, oder besetzte und nicht besetzte Zellenrezeptoren.
  • Biologische Moleküle, die nicht verwandt sind, können sich strukturell unterscheiden. Solche strukturellen Unterschiede können sich in Aminosäuresequenzidentitäten und Nucleinsäuresequenzidentitäten widerspiegeln, die weniger ausgeprägt sind, als jene von verwandten biologischen Molekülen. Beispiele biologischer Moleküle, die nicht verwandt sind, sind Hämoglobin und Troponin I, oder Myoglobin und Troponin I.
  • Diese Beispiele sind nicht als beschränkend zu bewerten, und die Erfindung betrifft beliebige biologische Moleküle, die nicht verwandt sind.
  • In 1A, 1B, 1C und 1D können die Moleküle A, B, C und D verwandt, nicht verwandt oder eine Mischung davon sein. In Anwendungen der Erfindung, die die Bestimmung eines oder mehrerer Verhältnisse von nicht verwandten Molekülen betreffen, lassen sich in 2 veranschaulichte Komponenten nutzen, um beliebige nicht verwandte biologische Moleküle zu binden. Solche in 2 veranschaulichten Komponenten lassen sich als Komponenten zum Binden nicht verwandter biologischer Moleküle in einer beliebigen der in 1A, 1B, 1C und 1D dargestellten Konfigurationen verwenden. Beispielsweise kann in Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses von nicht verwandten biologischen Molekülen, eine Komponente 1 nach 1A der in 2 veranschaulichten Komponente ähneln, wobei die Komponente in der Lage ist, ein beliebiges der nicht verwandten biologischen Moleküle zu binden, und wobei ein Binden eines Moleküls die Bindung eines weiteren, nicht verwandten Moleküls verhindert.
  • Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung einen Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses biolo gischer Moleküle. Der Ausrüstungssatz weist die folgenden Elemente auf:
    • (a) eine erste Komponente, die gegenüber den biologischen Molekülen spezifische Bindungsaffinität aufweist, wobei. die biologischen Moleküle an die erste Komponente in einer Menge binden, die zu deren Verhältnis in der Probe für die erste Komponente proportional ist; und
    • (b) eine zweite Komponente, die für ein oder mehrere der biologischen Moleküle spezifische Bindungsaffinität aufweist. Der Ausrüstungssatz kann ebenfalls ein Label oder ein von der Food and Drug Administration (Ministerium für Ernährung und Gesundheit) zugelassenes Protokoll aufweisen, das die Schritte zum Ermitteln des Verhältnisses angibt.
  • Der Begriff "Ausrüstungssatz" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf ein zu einem Paket zusammengefasstes Produkt, das Komponenten der Erfindung enthält, die verwendet werden, um das Verhältnis biologischer Moleküle zu ermitteln. Zu dem Ausrüstungssatz gehört vorzugsweise eine Box oder ein Behälter, der die Komponenten des Ausrüstungssatzes aufnimmt. Die Box oder der Behälter ist mit einem Label oder einem von der Food and Drug Administration zugelassenen Protokoll versehen. Die Box oder der Behälter nimmt Komponenten für die Erfindung auf, die vorzugsweise in Kunststoff-, Polyethylen-, Polypropylen-, Ethylen- oder Propylengefäßen untergebracht sind. Die Gefäße können mit Kappen versehene Röhrchen oder Flaschen sein.
  • Der Begriff "Label" in dem hier verwendeten Sinne kann sich auf einen Indikator an der Außenseite eines Ausrüstungssatzes beziehen. Das Label kann auf einem Material oder auf einem weiteren Material beispielsweise Kunststoff basieren.
  • Alternativ kann der Begriff "Label" in dem hier verwendeten Sinne verwendet werden, um einen "Signalgenerator" oder ein "signalerzeugendes Element" oder ein "Reportermolekül" zu bezeichnen.
  • Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung den Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei mindestens eine der Komponenten einen Antikörper aufweist. In diesem bevorzugten Ausführungsbeispiel kann die erste Komponente einen Antikörper aufweisen, die zweite Komponente einen Antikörper aufweisen, oder die erste Komponente und die zweite Komponente können Antikörper aufweisen. Dementsprechend kann das Verfahren eine erste Komponente, die einen Antikörper aufweist, und eine zweite Komponente verwenden, die einen anderen Typ eines Polypeptids oder organischen Moleküls aufweist. Alternativ kann das Verfahren zwei Komponenten betreffen, die Antikörper aufweisen.
  • Gemäß noch einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung das Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei mindestens eine der Komponenten ein Reportermolekül aufweist. In diesem bevorzugten Ausführungsbeispiel kann die erste Komponente ein Reportermolekül aufweisen, die zweite Komponente kann ein Reportermolekül aufweisen, oder die erste Komponente und die zweite Komponente können Reportermoleküle aufweisen. Falls beide Komponenten Reportermoleküle aufweisen, können die Reportermoleküle von denselben Arten von Molekülen sein, oder vorzugsweise unterschiedliche Arten von Reportermolekülen sein.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung den Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei wenigstens eine Komponente einen spezifischen Erkennungsanteil auf weist. In diesem bevorzugten Ausführungsbeispiel kann die erste Komponente einen spezifischen Erkennungsanteil aufweisen, die zweite Komponente kann einen spezifischen Erkennungsanteil aufweisen, oder die erste Komponente und die zweite Komponente können spezifische Erkennungsanteile aufweisen. Falls beide Komponenten spezifische Erkennungsanteile aufweisen, können die spezifischen Erkennungsanteile sich voneinander unterscheiden oder können der gleiche Erkennungsanteil sein.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung den Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei mindestens eine der Komponenten eine Anbindung an einen festen Träger aufweist. In diesem bevorzugten Ausführungsbeispiel kann die erste Komponente eine Anbindung an einen festen Träger aufweisen, die zweite Komponente kann eine Anbindung an einen festen Träger aufweisen, oder sowohl die erste als auch die zweite Komponente können Anbindungen an feste Träger aufweisen. Falls beide Komponenten Anbindungen an feste Träger aufweisen, können die festen Träger unterschiedliche Arten von festen Trägern oder feste Träger desselben Typs sein, allerdings ist jeder Typ einer Komponente an diskrete Feststoffträgergebilde angehängt. Der Begriff "diskrete Feststoffträgergebilde" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf eine Komponente, die an einen festen Träger angehängt ist, und auf einen weiteren Typ einer Komponente, die an einen weiteren festen Träger angehängt ist, wobei die Zusammensetzungen der festen Träger übereinstimmen können oder verschieden sein können.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung den Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei die zweite Komponente spezifische Bindungsaffinität für einen Komplex aufweist, der ein biologisches Molekül und die erste Kompo nente enthält, aus diesen zusammengesetzt ist oder im Wesentlichen aus diesen zusammengesetzt ist. Die Erfindung wird vorzugsweise in der durch dieses bevorzugte Ausführungsbeispiel dargelegten Weise durchgeführt, wenn die Konzentration eines ungebundenen biologischen Moleküls die Konzentration der zweiten Komponente überschreitet, an die das biologische Molekül spezifisch bindet. Die zweite Komponente kann einen Komplex aus einem oder mehreren Molekülen binden, wenn eine Bindungsregion der zweiten Komponente spezifische Bindungsaffinität zu einer Region auf einem biologischen Molekül und einer benachbarten Region auf der ersten Komponente aufweist. Beispiele bifunktionaler organisch synthetisierter Moleküle sowie von Antikörpern, die Komplexe binden, existieren nach dem Stand der Technik.
  • Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung den Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei die erste Komponente einen Bindungsanteil enthält, der spezifische Bindungsaffinität für jedes der interessierenden biologischen Moleküle aufweist. Jedes der Moleküle bindet an die erste Komponente in einem Verhältnis, das zu seinem Lösungsverhältnis in Beziehung steht. Beispielsweise kann ein Bindungsanteil spezifische Bindungsaffinität für ein modifiziertes Molekül und für dessen verwandte nicht modifizierte Form aufweisen: ein Bindungsanteil kann spezifische Bindungsaffinität für Hämoglobin und dessen modifizierte Form Hämoglobin A1-C aufweisen. Der Bindungsanteil kann an die modifizierten und nicht modifizierten Formen biologischer Moleküle mit gleicher Affinität oder ungleicher Affinität binden.
  • Falls die beiden Formen der biologischen Moleküle an die erste Komponente mit ungleicher Affinität binden, lässt sich ein Normalisierungsfaktor ermitteln, um das tatsächliche Verhältnis der an die erste Komponente gebundenen biologischen Moleküle zu korrigieren. Alternativ kann das Verhältnis einfach mittels einer Standardkurve ermittelt werden, die, wie hier anhand eines Beispiels beschrieben, konstruiert wird.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung den Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei die erste Komponente folgendes enthält:
    • (a) einen ersten Bindungsanteil, der spezifische Bindungsaffinität für ein biologisches Molekül aufweist; und
    • (b) einen zweiten Bindungsanteil, der spezifische Bindungsaffinität für ein weiteres der interessierenden biologischen Moleküle aufweist. In diesem bevorzugten Ausführungsbeispiel kann die erste Komponente jedes der interessierenden biologischen Moleküle binden, ist jedoch geeignet konstruiert, so dass jedes der biologischen Moleküle hinsichtlich der Komponente konkurrieren. Insbesondere können die biologischen Moleküle zu einem Zeitpunkt lediglich an eines der interessierenden biologischen Moleküle binden. Die Erfindung kann ferner eine erste Komponente betreffen, in der der erste Bindungsanteil spezifische Bindungsaffinität für ein biologisches Molekül aufweist, und ein zweiter Bindungsanteil spezifische Bindungsaffinität für ein oder mehrere andere biologischen Moleküle aufweist.
  • Auf diese Weise lässt sich, falls gewünscht, für ein Molekül ein Verhältnis in Bezug auf eine Familie von Molekülen ermitteln. Vorzugsweise wird für ein biologisches Molekül das Verhältnis gegenüber einem anderen biologischen Molekül bestimmt.
  • Gemäß anderen bevorzugten Ausführungsbeispielen be trifft die Erfindung den Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei ein oder mehrere der Bindungsanteile der ersten Komponente oder der zweiten Komponente Antikörper sind.
  • Gemäß noch einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung den Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei die erste Komponente sowohl für besetzte Rezeptoren als auch für freie Rezeptoren spezifisch ist, und wobei die zweite Komponente spezifisch ist für: (a) besetzten Rezeptor; (b) freien Rezeptor; (c) einen Komplex, der den besetzten Rezeptor und die erste Komponente aufweist, aus diesen weitgehend zusammengesetzt ist oder ganz aus diesen zusammengesetzt ist; oder (d)) einen Komplex, der den freien Rezeptor und die erste Komponente aufweist, sich aus diesen zusammensetzt oder weitgehend aus diesen zusammensetzt ist.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung den Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei die erste Komponente sowohl für Hämoglobin als auch für Hämoglobin A1-C spezifisch ist, und wobei die zweite Komponente spezifisch ist für:
    • (a) Hämoglobin;
    • (b) Hämoglobin A1-C;
    • (c) einen Komplex, der Hämoglobin und die erste Komponente aufweist, weitgehend aus diesen zusammengesetzt ist oder ganz aus diesen zusammengesetzt ist; oder
    • (d) ein Komplex, der Hämoglobin A1-C und die erste Komponente aufweist, weitgehend aus diesen zusammengesetzt ist oder ganz aus diesen zusammengesetzt ist.
  • Gemäß noch einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung den Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei die erste Komponente sowohl für oxidiertes Troponin I als auch für reduziertes Troponin I spezifisch ist, und wobei die zweite Komponente spezifisch ist für: (a) oxidiertes Troponin I; (b) reduziertes Troponin I; (c) einen Komplex, der oxidiertes Troponin I und die erste Komponente aufweist, weitgehend aus diesen zusammengesetzt ist oder ganz aus diesen zusammengesetzt ist; oder (d) einen Komplex, der reduziertes Troponin I und die erste Komponente aufweist, weitgehend aus diesen zusammengesetzt ist oder ganz aus diesen zusammengesetzt ist.
  • Ein weiteres bevorzugtes Ausführungsbeispiel betrifft den Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, ferner mit einer dritten Komponente, wobei die dritte Komponente spezifische Bindungsaffinität für einen Komplex aufweist, der das erste biologische Molekül und die zweite Komponente enthält. Die dritte Komponente kann einen spezifischen Erkennungsanteil aufweisen.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung den Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei zu dem Ausrüstungssatz ferner eine unterschiedliche zweite Komponente gehört, und wobei die unterschiedliche zweite Komponente spezifische Bindungsaffinität für ein zweites biologisches Molekül aufweist. Die unterschiedliche zweite Komponente kann einen spezifischen Erkennungsanteil aufweisen.
  • Gemäß noch einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung den Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei der Ausrüstungssatz ferner eine weitere unterschiedliche zweite Komponente enthält, und wobei diese weitere unterschiedli che zweite Komponente für ein drittes biologisches Molekül spezifische Bindungsaffinität aufweist. Diese weitere unterschiedliche zweite Komponente kann einen spezifischen Erkennungsanteil aufweisen.
  • Gemäß einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung den Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei die erste Komponente für Glycophorin spezifisch ist, wobei die zweite Komponente spezifische Bindungsaffinität für entweder freien Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor oder besetzten Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor aufweist, und wobei die dritte Komponente spezifische Bindungsaffinität für P-Selektin aufweist.
  • Ein weiteres bevorzugtes Ausführungsbeispiel betrifft den Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei der Ausrüstungssatz selbst ferner die biologischen Moleküle enthält. Die biologischen Moleküle stehen in einer gereinigten Form zur Verfügung, die sich dazu eignet, das Verhältnis der biologischen Moleküle zu ermitteln.
  • Der Begriff "gereinigte Form" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf den Grad der Heterogenität der biologischen Moleküle. Vielfältige Reinigungsprozesse sind in der Fachwelt bekannt. Ein Beispiel eines Reinigungsprozesses ist die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, die Ionaustausch-, Größenausschluss- und hydrophobe Techniken verwendet. Diese Prozesse lassen sich auf proteinartige Moleküle sowie auf organische Moleküle anwenden.
  • Der Begriff "geeignet zum Ermitteln des Verhältnisses" in dem hier verwendeten Sinne bezieht sich auf eine gereinigte Form der biologischen Moleküle, die reproduzierbare Ergebnisse des auf dem Label des Ausrüstungssatzes be schriebenen Verfahrens erbringt. Der Begriff bezeichnet einen geeigneten Reinheitsgrad, so dass andere Moleküle die Bindung zwischen den Komponenten der Erfindung und den biologischen Molekülen der Erfindung nicht wesentlich beeinträchtigen.
  • Gemäß noch einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung einen Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei die biologischen Moleküle besetzter Rezeptor und freier Rezeptor sind.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung einen Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei die biologischen Moleküle Hämoglobin und Hämoglobin A1-C sind.
  • Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung einen Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei die biologischen Moleküle oxidiertes Troponin I und reduziertes Troponin I sind.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die Erfindung den Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle, wobei die biologischen Moleküle Glycophorin, freier Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor, besetzter Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor und P-Selektin sind.
  • Die obige Kurzbeschreibung der Erfindung ist nicht beschränkend, und andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden anhand der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung und anhand der Ansprüche offenkundig.
  • KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 veranschaulicht zwei Ausführungsbeispiele der Erfindung.
  • Teil A veranschaulicht ein Ausführungsbeispiel, bei dem eine erste Komponente der Erfindung, die an ein Reportermolekül angehängt ist, biologische Moleküle A und B in einer Fluidprobe in einem Bindungsverhältnis bindet, das mit dem Lösungsverhältnis von A und B in Beziehung steht.
  • Die Konzentration der ersten Komponente in der Fluidprobe ist geringer als die Konzentration der biologischen Moleküle. Eine zweite Komponente der Erfindung, die mit einem festen Träger verbunden ist, bindet spezifisch lediglich an biologisches Molekül B. Die Konzentration der zweiten Komponente in der Fluidprobe ist größer, gleich oder geringer als die Konzentration der ersten Komponente. Nicht gebundene Moleküle werden von dem festen Träger weggespült, und der Komplex, der die erste Komponente, die zweite Komponente und biologisches Molekül B enthält, wird mittels des Signals erfasst, das von dem Reportermolekül erzeugt wird, das an die erste Komponente angehängt ist. Das Signal steht mit dem Verhältnis von biologischen Molekülen A und B in der Fluidprobe in Beziehung.
  • Teil B der 1 veranschaulicht ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung, wobei eine dritte Komponente verwendet wird, um das Verhältnis der biologische Moleküle in einer Fluidprobe zu ermitteln. Die Konzentration der dritten Komponente ist höher als die Konzentration der zweiten Komponenten. Anders als im Fal le des anhand Teil A beschriebenen Ausführungsbeispiels, ist die zweite Komponente nicht an einem festen Träger angehängt. Die dritte Komponente, die an einem festen Träger angehängt sein kann, weist spezifische Bindungsaffinität für den Komplex auf, der die zweite Komponente und das biologische Molekül B enthält. Das Verhältnis wird anschließend ermittelt, nachdem nicht gebundene Moleküle von dem festen Träger weggespült sind, und das Signal gemessen ist, das von dem Komplex erzeugt wurde, der die erste Komponente, die zweite Komponente, die dritte Komponente und das biologisches Molekül B enthält.
  • Teil C von 1 veranschaulicht ein Ausführungsbeispiel der Erfindung, in dem mehrere erste Komponenten und mehrere zweite Komponenten verwendet werden, um zwei oder mehr Verhältnisse mehrerer biologischer Moleküle zu messen.
  • Die Konzentrationen der ersten Komponenten sind geringer als die jeweiligen Konzentrationen der biologischen Moleküle, an die sie jeweils binden, und die Konzentrationen der zweiten Komponente sind geringer, gleich oder größer als die Konzentrationen der ersten Komponenten.
  • Teil D von 1 veranschaulicht ein Ausführungsbeispiel der Erfindung, in dem eine erste Komponente in Verbindung mit mehreren zweiten Komponenten der Erfindung verwendet wird. Die Konzentration der ersten Komponente ist geringer als die Konzentration der biologischen Moleküle und die Konzentrationen der zweiten Komponenten sind kleiner, gleich oder größer als die Konzentration der ersten Komponente.
  • Die Ausführungsbeispiele der anhand von 1 beschriebenen ersten Komponente werden als nützlich erachtet, um das Verhältnis biologischer Moleküle in Fällen zu messen, wo die biologischen Moleküle, die an die erste Komponente binden, das gleiche oder ein ähnliches Epitop aufweisen.
  • 2 veranschaulicht zwei die erste Komponente betreffende Ausführungsbeispiele der Erfindung.
  • Teil A veranschaulicht eine erste Komponente, die einen Antikörper aufweist, der an ein Reportermolekül angehängt ist. Die erste Komponente kann mehrere Reportermoleküle oder mehrere Antikörper aufweisen. Die Konzentration der ersten Komponente in der Fluidprobe ist geringer als die Konzentration der biologischen Moleküle. Die Bindungsanteile des Antikörpers in diesem Ausführungsbeispiel sind in der Lage, unabhängig spezifisch an jedes der biologischen Moleküle A und B zu binden, jedoch schließt die Bindung entweder von A oder von B die Bindung des jeweilig anderen aus.
  • Wenn beispielsweise einmal ein A Molekül an einen Bindungsanteil des Antikörpers gebunden hat, kann ein Molekül der Sorte B die Position nicht mehr gleichzeitig besetzen.
  • Teil B veranschaulicht eine erste Komponente, die zwei unterscheidbare Antikörper aufweist, die an ein Reportermolekül angehängt sind. Die erste Komponente kann mehrere Reportermoleküle oder mehrere Moleküle eines beliebigen Typs eines Antikörpers aufweisen. Die Konzentration der ersten Komponente in der Fluidprobe ist geringer als die Konzentration der biologischen Moleküle. Einer der unterscheidbaren Antikörper bindet spezifisch an ein biologisches Molekül A und einer der unterscheidbaren Antikörper bindet spezifisch an ein biologisches Molekül B. Die unterscheidbaren Antikörper sind so angeordnet, dass das Binden an A oder B eine Bindung des jeweilig anderen ausschließt. Wenn beispielsweise einmal ein A Molekül an einen Bindungsanteil auf einem der unterscheidbaren Antikörper bindet, kann ein Molekül B nicht gleichzeitig an einen benachbarten Bindungsanteil binden.
  • Die anhand von 2 beschriebenen Ausführungsbeispiele der ersten Komponente werden als nützlich erachtet, um das Verhältnis biologischer Moleküle beispielsweise in Fällen zu messen, wo die biologischen Moleküle, die an die Komponente binden, unterscheidbare Epitope aufweisen. Darüber hinaus können die biologischen Moleküle, die an die Komponente binden, unterschiedliche Epitope auf den gleichen oder ähnlichen biologischen Molekülen oder unterschiedliche Epitope auf unterschiedlichen biologischen Molekülen aufweisen.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft unter anderem ein neues Verfahren zum raschen Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle ohne ein Quantifizieren der Konzentrationen eines jeden biologische Moleküls des Verhältnisses.
  • Die Erfindung betrifft unter anderem ferner einen Ausrüstungssatz zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle.
  • Existierende Verfahren zum Ermitteln von Verhältnissen biologischer Moleküle verwenden mehrere Schritte und lassen sich auf eine Reihe von Systemen nicht anwenden. Diese bestehenden Verfahren erfordern mehrere Schritte, da sie wenigstens eine Komponente, gewöhnlich einen Antikörper, verwenden, der für jeden einzelnen der biologischen Moleküle spezifisch ist. Somit sind in den meisten Fällen mindestens zwei Tests erforderlich, um das Verhältnis biologischer Moleküle zu ermitteln. Aus diesem Grunde verlängern die meisten dieser bestehenden Systeme die zum Ermitteln des Verhältnisses erforderliche Zeit und steigern darüber hinaus die Kosten für Reagenzien.
  • Außerdem verwenden die bestehenden Verfahren zum Ermitteln der Verhältnisse biologischer Moleküle wenigstens eine Komponente, gewöhnlich einen Antikörper, der gegenüber den biologischen Molekülen in der Probe überschüssig vorhanden ist. Da manche betreffende biologische Moleküle, z.B. Hämoglobin und Zellenrezeptoren, in biologischen Fluiden in hohen Konzentrationen vorliegen, lassen sich die bestehenden Verfahren, die Komponenten im Überschuss gegenüber den biologischen Molekülen verwenden, nur beschränkt anwenden.
  • Die vorliegende Erfindung steigert die Geschwindigkeit im Falle der Ermittlung von Verhältnissen verwandter biologischer Moleküle mittels einer Komponente, die an jedes der biologischen Moleküle bindet, und einer weiteren Komponente, die spezifisch lediglich an eines der biologischen Moleküle bindet. Diese beiden Komponenten können gemeinsam der Probe hinzugefügt werden, die die biologischen Moleküle in demselben Reaktionsgefäß gleichzeitig enthält.
  • Dieses Merkmal verbessert die Geschwindigkeit, mit der das Verhältnis bestimmt wird, indem die Anzahl von an dem Verfahren beteiligten Schritten reduziert wird.
  • Die rasche Geschwindigkeit einer Ermittlung des Verhältnisses biologischer Moleküle kann die Gesundung von Patienten beschleunigen, die unter medizinischen Symptomen leiden. Eine geeignete Behandlung dieser Zustände kann daher beschleunigt werden, da durch die hier offenbarten Verfahren rasch Diagnoseergebnisse erlangt werden. Insbesondere betreffen Anwendungen der hier beschriebenen Verfahren und Ausrüstungssätze unter anderem eine Steigerung der Effizienz der Überwachung einer Medikamentenverabreichung, der Überwachung des Blutzuckerspiegels von Diabetikern und der Überwachung des Zeitpunkts einer myokardialen Infarktbildung.
  • Im Falle von Herzinfarkten wird beispielsweise eine rasche Ermittlung des Verhältnisses von oxidiertem gegenüber reduziertem Troponin I die Bestimmung des Zeitpunkts einer myokardialen Infarktbildung beschleunigen und es dadurch ermöglichen, dem Patienten eine geeignete Behandlung rasch zukommen zu lassen. Ein beschleunigtes Einsetzen der Behandlung eines Patienten führt zu einer rascheren Erholung des betreffenden Patienten von einer myokardialen Infarktbildung.
  • Das rasche Ermitteln des Verhältnisses von verwandten biologischen Molekülen kann außerdem die Verabreichung eines therapeutischen Medikaments an einen Patienten verbessern. Im Falle eines Medikaments, das an einen Zelloberflächenrezeptor bindet und blockiert, kann eine rasche Ermittlung des Verhältnisses von freien zu besetzten Rezepto ren bestimmen, ob im Sinne einer effizienten Therapie dem Patienten eine höhere oder geringere Dosis des Medikaments zu verabreichen ist.
  • Außerdem ermöglicht die Erfindung das Bestimmen von Verhältnissen von verwandten biologischen Molekülen, die in einer Probe in hohen Konzentrationen vorliegen. Beispielsweise ist Hämoglobin in hohen Konzentrationen im Blutstrom eines Patienten vorhanden. Hämoglobin verwandelt sich in Hämoglobin A1-C, wenn es in Anwesenheit von hohen Glucosekonzentrationen in dem Blutstrom des Patienten mit Glucoseanteilen modifiziert wird. Eine Komponente der Erfindung ist in der Lage, eine Fraktion der gesamten Hämoglobinmoleküle (Hämoglobin und Hämoglobin A1-C) zu isolieren, die das Verhältnis von Hämoglobin und Hämoglobin A1-C in der Probe enthält, und eine zweite Komponente ist in der Lage, eines der verwandten Moleküle (beispielsweise Hämoglobin A1-C) zu isolieren, um das Verhältnis dieser verwandten Moleküle auch dann zu ermitteln, wenn diese in einer Probe in hohen Konzentrationen vorhanden sind. Diese Anwendung der hierin beschriebenen Verfahren ist für Diabetiker geeignet, da Hämoglobin A1-C die durchschnittliche Blutzuckerkonzentration für Zeitspannen repräsentiert, die länger als ein Tag sind. Da Diabetiker aufgrund von abweichenden Messwerten, die mittels der ihnen gegenwärtig verfügbaren Techniken abgelesen werden, häufig nicht in der Lage sind, ihren Blutzuckerspiegel genau zu ermitteln, ermöglichen die Verfahren und Ausrüstungssätze der Erfindung Diabetikern, den durchschnittlichen Blutzuckerspiegel genau und rasch zu ermitteln.
  • I. Komponenten der Erfindung
  • Einem Fachmann ist es mittels der Verfahren der Erfindung möglich, das Verhältnis biologischer Moleküle rasch zu ermitteln. Die Verfahren der Erfindung beinhalten einen Typ von Bindungsmolekülen, vorzugsweise Antikörpern, die jedes der biologischen Moleküle in einer Probe erkennen, und einen weiteren Typ von Komponenten, die lediglich eines der biologischen Moleküle binden.
  • 1, die ein Ausführungsbeispiel der Erfindung veranschaulicht, dient als ein Beispiel zur Veranschaulichung der raschen Ermittlung des Verhältnisses biologischer Moleküle. Die Anzahl von Schritten wird verringert, indem eine Probe mit einer ersten Komponente getestet wird, die eine Fraktion eines jeden der interessierenden biologischen Moleküle bindet. Die Konzentration der ersten Komponente ist geringer als die Konzentration der biologischen Moleküle. Zusätzlich zu einem Binden an eine Fraktion von jedem der biologischen Moleküle schließt die Bindung an eines der biologischen Moleküle an die erste Komponente die Bindung der anderen aus, obwohl die erste Komponente die Kapazität aufweist, an jedes der Moleküle unabhängig voneinander zu binden.
  • Diese beiden Merkmale der ersten Komponente, nämlich das Merkmal einer Mehrfachbindung und das Merkmal einer ausschließenden Bindung, ermöglichen es der ersten Komponente, an die biologischen Moleküle in einem Verhältnis zu binden, das zu deren Verhältnis in der Probe proportional ist. Falls beispielsweise die erste Komponente in der Lage ist, jedes der Moleküle A und B zu binden, und A und B in der Probe in einem Verhältnis von 3 zu 1 vorliegen, kann die erste Komponente A und B ebenfalls in einem Verhältnis von 3 zu 1 oder nahezu in diesem Verhältnis binden. Biologische Moleküle A und B binden an die erste Komponente in einem ähnlichen Verhältnis, wie sie in der Lösung zueinander stehen, wenn die erste Komponente A und B mit hohe Affinität bindet (wenn die Gleichgewichtsdissoziationskonstante geringer ist als die Konzentrationen von A und B und von der ersten Komponente) und/oder wenn A und B die erste Komponente mit gleicher Affinität binden. Somit kann das Verhältnis von A zu B an die erste Komponente in einem Verhältnis gebunden sein, das dem Verhältnis von A zu B ähnelt, das in einer mit der ersten Komponente getesteten Probe vorhanden ist.
  • Die zweite Komponente der Erfindung, deren Konzentration größer, gleich oder kleiner sein kann als die Konzentration der ersten Komponente, detektiert den Komplex, der zwischen der ersten Komponente und einem der biologischen Moleküle gebildet wird. Dieser Komplex kann detektiert werden, wenn die zweite Komponente lediglich an eines der biologischen Moleküle, z.B. A oder B, bindet, oder falls die zweite Komponente an den Komplex bindet, der zwischen einem der biologischen Moleküle und der ersten Komponente gebildet wird. Die letztere Ausprägung kann von Vorteil sein, falls die biologischen Moleküle bezüglich der Konzentration der zweiten Komponente mit hohen Konzentrationen in der Probe vorliegen, da die zweite Komponente den Komplex, der ein biologisches Molekül und die erste Komponente aufweist, und nicht das ungebundene biologische Molekül binden wird.
  • Sobald die zweite Komponente den Komplex bindet, der die erste Komponente und ein biologisches Molekül enthält, kann ein Signal von einem Reportermolekül gemessen werden, das an eine der Komponenten der Erfindung angehängt ist. Dieses Signal lässt sich auf eine Standardkurve anwenden, die das Signal mit einem Verhältnis der biologischen Moleküle in Beziehung setzt. Die Standardkurve kann unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren durch Messen des Signals für Proben vorbereitet werden, die mit bekannten Verhältnissen der biologischen Moleküle zubereitet wurden.
  • Wenn biologische Moleküle nicht mit der gleichen Affinität an die erste Komponente binden, können Standardkurven, die das Verhältnis mit einem Signal in Beziehung set zen, das durch eine der Komponenten, vorzugsweise die erste Komponente, erzeugt wurde, verwendet werden, um das Verhältnis von A zu B in der Probe zu ermitteln. Darüber hinaus lassen sich Normalisierungsfaktoren einsetzen, um das Verhältnis von A zu B in einer Probe zu ermitteln.
  • Außerdem ermitteln die Komponenten der Erfindung das Verhältnis biologischer Moleküle, wenn diese in Konzentrationen vorliegen, die größer sind als die Konzentrationen der ersten Komponente in einer Probe. Auf diese Weise lässt sich das Verhältnis biologischer Moleküle in praktisch nur einem Schritt rasch ermitteln. Diese Eigenschaft bedeutet eine Verbesserung gegenüber vielen bestehenden Verfahren, beispielsweise Sandwichimmunoassays oder nicht konkurrierende Immunoassays, die zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle dienen, da die bestehenden Verfahren voraussetzen, dass die Konzentrationen der ersten und zweiten Komponenten größer sind als die Konzentrationen der biologischen Moleküle. Bei Verwendung bestehender Verfahren, beispielsweise konkurrierende und nicht konkurrierender Immunoassays, wird das Verhältnis der biologischen Moleküle bestimmt, nachdem die Konzentrationen beider biologischen Moleküle gemessen wurden. Die vorliegende Erfindung misst das Verhältnis unmittelbar, wobei die Notwendigkeit umgangen wird, die einzelnen Konzentrationen der biologischen Moleküle zu messen, die das oder die Verhältnisse aufweisen. Der Fachmann wird erkennen, dass es möglich ist, die relativen Konzentrationen von mehr als zwei biologischen Molekülen durch das Verfahren der Erfindung zu ermitteln.
  • Die Komponenten der Erfindung können mittels in der Fachwelt hinlänglich bekannter Techniken konstruiert werden. Reportermoleküle können an ein oder mehrere Proteine oder Antikörper mittels herkömmlicher Techniken angehängt werden, wie dies in dem Handbuch Harlo and Lane, Antibo dies, a Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratories erläuter ist. Dieses Handbuch berichtet außerdem über Techniken zum Anbinden von Antikörpern und anderen Proteinmolekülen an feste Träger.
  • Alternativ sind chemische Synthesetechniken in der Fachwelt hinlänglich bekannt, die sich dazu eignen Reportermoleküle und/oder feste Träger an Komponenten der Erfindung anzufügen.
  • II. Biologische Moleküle der Erfindung
  • Die Verfahren der Erfindung können eine Vielfalt biologischer Moleküle betreffen. Die Verfahren der Erfindung sind insbesondere dazu eingerichtet, das Verhältnis von Proteinen oder Peptiden in einer biologischen Probe zu messen. Zu jenen Proteinen oder Polypeptiden gehören Hormone, Wachstumsfaktoren, Enzyme, Koagulationsfaktoren, strukturelle Proteine, Muskelproteine, Blutproteine, Rezeptorproteine, Apolipoproteine, Rezeptoren, medizinische Wirkstoffe, Onkogene, Tumor-Antigene, Tumorhemmstoffe, Zytokine, virale Antigene, parasitäre Antigene, bakterielle Antigene und chemisch synthetisierte Polymere sowie Polymere, die durch chemische, zelluläre und/oder enzymatische Prozesse biosynthetisch hergestellt und/oder modifiziert sind. Zu speziellen Beispielen dieser Verbindungen gehören oxidiertes Troponin I, reduziertes Troponin I, Glycophorin, Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor, Hämoglobin, Hämoglobin A1-C, Pro-Insulin, Insulin, Wachstumshormon, Androgenrezeptoren, Insulin ähnelnder Wachstumsfaktor I, Insulin ähnelnder Wachstumsfaktor II, Insulinwachstumsfaktorbindungsproteine, Epidermiswachstumsfaktor, TGF-α, TGF-β, Dermalwachstumsfaktor (PDGF), Gefäßbildungsfaktoren (Wachstumsfaktor säurehaltiger Fibroblasten, basischer Fibroblastwachstumsfak tor und Angiogenin), Matrixproteine (Typ IV Kollagen, Typ VII Kollagen, Laminin), Onkogene (ras, fos, myc, erb, src, sis, jun), E6- oder E7-Transformierungssequenz, p53-Protein, Zytokinrezeptor, IL-1, IL-6, IL-8, IL-2, α-, β- oder γ-IFN, GMCSF, GCSF, Virushüllprotein und Proteine aus viralen, bakteriellen und parasitären Organismen.
  • Zu andere speziellen Proteinen oder Polypeptiden, die exprimiert werden können, gehören: Phenylalaninhydroxylase, α-1-Antitrypsin, Cholesterol-7α-Hydroxylase, verkürztes Apolipoprotein B, Lipoproteinlipase, Apolipoprotein E, Apolipoprotein A1, LDL-Rezeptor, Spülungsrezeptor für oxidierte Lipoproteine, molekulare Abwandlungen von diesen, VEGF und Kombinationen von diesen. Andere Beispiele sind Koagulationsfaktoren, Apolipoproteine, medizinische Wirkstoffe, Tumor-Antigene, virale Antigene, parasitäre Antigene und bakterielle Antigene. Der Fachmann wird ohne Weiteres erkennen, dass diese Proteine zu vielfältigen Klassen von Proteinen gehören, und dass auch andere Proteine innerhalb dieser Klassen sowie medizinische Wirkstoffe und organische Verbindungen verwendet werden können. Diese dienen lediglich als Beispiele und sind keinesfalls als beschränkend zu bewerten.
  • III. Verfahren zum Bestimmen des Zeitpunkts einer myokardialen Infarktbildung mittels Komponenten der Erfindung
  • Myokardiale Infarktbildung ist eine der führenden Todesursachen in den USA. Die Zahl von Personen, die einen Brustschmerz erfahren, wird in Kliniken in den gesamten Vereinigten Staaten auf etwa 5 Millionen jährlich geschätzt. Allerdings ergab sich in der Folge bei weniger als dreißig Prozent dieser Patienten, dass diese tatsächlich einen Myokardinfarkt erlitten hatten. Die genaue und rasche Diagnose eines Myokardinfarkts ist für den Patienten, der an einer myokardialen Infarktbildung leidet und für das Gesundheitsvorsorgesystem von großer Bedeutung. Durch ein rasches Identifizieren von Patienten, die auf jeden Fall einer Behandlung bedürfen, kann das Gesundheitsvorsorgesystem Kosten einsparen, die durch Therapien an Patienten entstehen, die niemals an einem Myokardinfarkt litten.
  • Darüber hinaus kann ein rasches Ermitteln des Zeitpunkts einer Myokardinfarktbildung bei Patienten, die tatsächlich einen Herzanfall erlitten hatten, deren Behandlung beschleunigen und dadurch die Genesung beschleunigen.
  • Die Diagnose einer Myokardinfarktbildung wird gegenwärtig in der Notfallabteilung einer Klinik ausgeführt. Eine Patient, der die Symptome eines Myokardinfarkts aufweist, wird abhängig von seinem augenscheinlichen Zustand auf unterschiedlichen Wegen behandelt. Im Allgemeinen wird ein Elektrokardiogramm erstellt, um den Zustand des Herzes zu bewerten; jedoch ergibt sich bei etwa fünfzig Prozent der Patienten, die einen Myokardinfarkt erfahren haben, ein nicht-diagnostisches Elektrokardiogramm. Der Arzt steht dann vor dem Problem, den Patienten zu diagnostizieren und zu behandeln, der in dem Verdacht steht, einen Myokardinfarkt erlitten zu haben. Im Falle von Patienten, bei denen eine Myokardinfarkt vermutet wird, jedoch nichtdiagnostische Elektrokardiogramme vorliegen, ist somit eine Diagnose problematisch.
  • Die Weltgesundheitsorganisation hat Richtlinien für das Diagnostizieren eines Myokardinfarkts aufgestellt. Die se Richtlinien stellen fest, dass der Patient zwei der folgenden drei Kriterien erfüllen muss: (1) Vorhandensein von Brustschmerz oder eine Vorgeschichte einer kardialen Erkrankung; (2) ein diagnostisches Elektrokardiogramm; und (3) erhöhte Spiegel von Kreatinkinase oder Kreatinkinase MB Isoenzym. Bei den fünfzig Prozent der mit Verdacht auf Myokardinfarkt in eine Klinik eingelieferten Patienten, die ein nicht diagnostisches Elektrokardiogramm aufweisen, muss sich der Arzt daher auf Symptome von Brustschmerz und erhöhte Kreatinkinasespiegel stützen, um einen Myokardinfarkt zu diagnostizieren.
  • Der Kreatinkinaseassay wird im Allgemeinen in Kliniklabors mittels eines hochentwickelten, kostspieligen und ausgeklügelten Instrumentariums ausgeführt. Die Tests umfassen Enzymtests und Immunoassays, die die Aktivität oder Menge von in Blutproben vorhandener Kreatinkinase erfassen. Es besteht daher ein Bedarf nach einer einfacheren und rascheren Technik für ein effizientes und präzises Diagnostizieren eines Myokardinfarkts.
  • Das Messen des Verhältnisses von oxidiertem gegenüber reduziertem Troponin I stellt eine derartige effiziente und genaue Technik zum Abschätzen des Zeitpunkts eines Myokardinfarkts dar. Während eines Myokardinfarkts sterben Herzmuskelzellen ab und geben ihren Inhalt in den Blutstrom frei. Troponin I ist ein derartiger in das Blut nach einem Myokardinfarkt freigegebener Muskelinhaltsstoff. Darüber hinaus wird nach einem Myokardinfarkt Kreatininkinase in den Blutstrom freigegeben. Die Konzentrationen von Troponin I sowie Kreatinkinase steigen nach einem Myokardinfarkt über einen ansonsten im Blut vorhandenen normalen Wert hinaus an. Die Anwesenheit dieser Moleküle im Blutstrom kann einen Myokardinfarkt diagnostisch angezeigt erscheinen lassen. Es zeigte sich in letzter Zeit, dass Troponin I für ein Diagnostizieren eines Myokardinfarkts spezifischer ist als Kreatinkinase. (Circulation 83, 902912, 1991); Clin. Chem., 40, 1291–1295 (1994). Die Verwendung von Troponin I als diagnostischen Marker für Myokardinfarkt scheint außerdem vielen der klinischen Anforderungen zu entsprechen. Clin. Chem. 40, 1291–1295 -1994-; Clin. Chem. 41, 312–317 (1995).
  • Ein Verfahren zum Ermitteln des Zeitpunkts eines Myokardinfarkts nutzt das Verhältnis von oxidiertem gegenüber reduziertem Troponin I in einer aus einem Patienten entnommenen Probe. Vorzugsweise werden vor einer Analyse des Verhältnisses einem Patienten Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Serum und/oder Plasma, entnommen. Der Grad, bis zu dem Troponin I in der Blutprobe oxidiert ist, ist diagnostisch kennzeichnend für den Zeitpunkt des Myokardinfarkts. Die PCT-Veröffentlichung WO 96/33415 gibt an, dass Troponin I in vielfältigen Konformationen im Blut vorliegen kann, die mit dessen nativer Konformation und Muskelgewebe übereinstimmen oder sich davon unterscheiden können. Die vielfältigen Konformationen des Troponin I können in unterschiedlicher Weise mit Komponenten der Erfindung reagieren.
  • Die Komponenten der vorliegenden Erfindung ermöglichen eine rasche Ermittlung des Verhältnissen von oxidiertem gegenüber reduziertem Troponin I. Eine Blutprobe kann gleichzeitig mit den ersten und zweiten Komponenten der Erfindung getestet werden. Die erste Komponente kann in einer von dem Verhältnis abhängigen Weise sowohl an oxidiertes als auch an reduziertes Troponin I, spezifisch binden. Die zweite Komponente der Erfindung kann oxidiertes Troponin I oder reduziertes Troponin I oder Komplexe spezifisch binden, die zwischen einer der Formen von Troponin I und der ersten Komponente gebildet werden. Die zweite Komponente bildet einen Komplex, der eine der Formen von Troponin I aufweist, nämlich die erste Komponente, und die zweite Komponente bestimmt das Verhältnis von oxidiertem Troponin I zu reduziertem Troponin I, wie es anhand einer Standardkurve gemessen wird, die zuvor mittels bekannten Verhältnissen von oxidiertem und reduziertem Troponin I erzeugt wurde.
  • Die Standardkurve kann jedes Signal, das durch ein Reportermolekül erzeugt wird, das an eine der Komponenten der Erfindung angehängt ist, zu dem Verhältnis von oxidiertem gegenüber reduziertem Troponin I in Beziehung setzen.
  • IV. Verfahren zum Verbessern der therapeutischen Wirkung eines an einen Patienten verabreichten Medikaments mittels Komponenten der Erfindung
  • Die rasche Ermittlung des Verhältnisses biologischer Moleküle, wie sie hier beschrieben sind, kann die effektive Verabreichung eines therapeutischen Medikaments verbessern. Im Falle eines Medikaments, das einen Zellenoberflächenrezeptor bindet, kann eine rasche Bestimmung des Verhältnisses von freiem zu besetztem Rezeptor ermitteln, ob dem Patienten für eine wirkungsvolle Therapie eine höhere oder geringere Dosis des Medikaments zu verabreichen ist. Das Medikament kann ein natürlich vorkommender Ligand oder alternativ ein synthetisches Molekül sein, das den Rezeptor mit hoher Affinität bindet. In einer derartigen Anwendung wird, nachdem einem Patient ein Medikament verabreicht ist, mittels des Verfahrens der Erfindung eine Fluidprobe hinsichtlich des Verhältnisses von freiem Rezeptor zu besetztem Rezeptor untersucht.
  • Ein Beispiel eines pharmazeutisch bedeutenden Systems freier/besetzter Rezeptoren betrifft Rezeptorglycoprotein IIbIIIa und seine Rolle bei der Blutgerinnung. Blutgerinnung ist der Prozess, in dem die roten Blutkörperchen auf ein Binden von Fibrinogen hin einen Klumpen bilden. Unterschiedlich medizinische Wirkstoffe, die bereits im Handel erhältlich sind oder gerade eingeführt werden, können an den Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor binden und den Koagulationsprozess blockieren.
  • Die hier dargelegten Verfahren messen zwei Gegebenheiten, die einer Aggregation zugeordnet sind. Die erste ist der Grad der Belegung des Rezeptorglycoproteins IIbIIIa. Die zweite ist der Grad der Aktivierung der Thrombozyten. Die relativen Grade einer Rezeptorbelegung auf Thrombozyten und einer Thrombozytenaktivierung lassen sich, wie in Beispiel 2 beschrieben, gleichzeitig erfassen. Diese Parameter sind wichtig für ein Verständnis der Ereignisse, die zu einer Blutgerinnung führen und außerdem für das Dosieren von Medikamenten, die Blutgerinnung verhindern, indem sie an das Glycoprotein IIbIIIa binden. Ein Verfahren zum Bestimmen der Konzentration eines einem Patienten zu verabreichenden Medikaments durch Überwachen dieser Ereignisse ist hier anhand eines Beispiels beschrieben.
  • Die erste Komponente der Erfindung, die spezifisch ist für besetzten und freien Rezeptor oder für ein Epitop der Komponente, die den besetzten und freien Rezeptor definiert, und die zweite Komponente der Erfindung, die für entweder den freien Rezeptor oder den besetzten Rezeptor spezifisch ist, kann zu einer von dem Patienten entnommenen zubereiteten Probe hinzugefügt werden. Das anhand der Probe erzeugte Signal bestimmt das Verhältnis von besetztem zu freiem Rezeptor, wie es anhand einer zuvor erstellten Standardkurve extrapoliert wird.
  • Ein großes Verhältnis von freiem zu besetztem Rezeptor würde nahelegen, dass dem Patienten bei der nächsten Verabreichung eine höhere Dosis des Medikaments zu verabreichen ist. Alternativ würde ein kleines Verhältnis von freiem zu besetztem Rezeptor zeigen, dass dem Patienten für die nächste Verabreichung die gleiche oder eine geringere Konzentration des Medikaments verabreicht werden sollte.
  • Es bleibt ein großer Bedarf nach einem Verfahren zum raschen Ermitteln eines Verhältnisses von freiem Rezeptor zu besetztem Rezeptor. Eine zunehmende Zahl von Medikamente, die Rezeptoren mit hoher Affinität binden, werden gegenwärtig auf dem Markt eingeführt. Eine effiziente Verabreichung dieser Arten von Medikamenten verlangt eine rasche Bestimmung des Verhältnisses von freiem Rezeptor zu besetztem Rezeptor, wie sie hier ermöglicht wird.
  • V. Verfahren zum Behandeln von Diabetes mittels Komponenten der Erfindung
  • Diabetes mellitus ist eine heterogene primäre Störung des Kohlehydratmetabolismus, die mehrere ätiologische Faktoren aufweist, die im Allgemeinen Insulinmangel oder Insulinresistenz, oder beides mit sich bringen. Typ I, oder juveniler, oder insulinabhängiger Diabetes mellitus liegt bei Patienten vor, die wenig oder gar keine Kapazität zur endogenen Insulinsezernierung aufweisen. Diese Patienten entwickeln eine extreme Hyperglykämie und sind für ihr un mittelbares Überleben völlig auf eine exogene Insulintherapie angewiesen. Typ II, oder Alters-, oder nicht insulinabhängiger Diabetes mellitus liegt bei Patienten vor, die noch eine gewisse endogene Insulinsezernierungskapazität behalten haben, jedoch leidet die große Mehrheit derselben sowohl unter Insulinmangel als auch Insulinresistenz. Insulinresistenz kann auf eine unzureichende Insulinrezeptorexprimierung, auf eine reduzierte Insulinbindungsaffinität oder auf eine beliebige Anomalie zurückzuführen sein, die auf irgendeiner Stufe entlang des Insulinsignalübertragungspfad vorliegt. Olefsky, 1988, Cecil Textbook of Medicine, 18. Ausgabe, 2: 1360–1381.
  • In den USA beträgt die Verbreitung von Diabetes insgesamt vermutlich zwischen zwei und vier Prozent, wobei Typ I sieben bis zehn Prozent sämtlicher Fälle betrifft. Sekundäre Komplikationen von Diabetes haben ernste klinische Folgen. Etwa fünfundzwanzig Prozent sämtlicher neuen Fälle eines Nierenversagens im Endstadium treten bei Patienten mit Diabetes auf. Über zwanzigtausend Amputationen (in erster Linie von Zehen, Füßen und Beinen) werden an Patienten mit Diabetes durchgeführt, d.h. etwa die Hälfte der in den USA vorgenommen nicht traumatischen Amputationen.
  • Außerdem ist Diabetes die führende Ursache von neuen Fällen einer Erblindung, wobei jedes Jahr etwa fünftausend neue Fälle auftreten.
  • Insulin bildet den hauptsächlichen Therapiemodus bei sämtlichen Patienten mit Typ I und bei vielen Patienten mit Diabetes Typ II. In Abhängigkeit von der Anzahl von Injek tionen und dem (den) verwendeten Typ(en) von Insulin, die pro Tag gesetzt werden, können die Behandlungsvorgaben mehr oder weniger intensiv sein. Die intensivste beinhaltet eine konstante Insulinzufuhr an einer subkutanen Stelle in der abdominalen Wand über ein ohne Rückführung arbeitendes Dosierungsgerät, das auf einer kleinen Insulinpumpe basiert, die von dem Patient im Wesentlichen vierundzwanzig Stunden pro Tag getragen werden muss. Oral einzunehmende hypoglykämische Wirkstoffe, beispielsweise Sulfonylharnstoffe, sind bei Typ II Patienten effizient einzusetzen, jedoch sprechen etwa zehn bis zwanzig Prozent der Patienten nicht auf eine Behandlung an oder hören zwölf bis vierundzwanzig Monate nach dem Beginn der Behandlung auf, darauf anzusprechen.
  • Eine wirksame Kontrolle des Blutzuckerspiegels über einen längeren Zeitraum ist sogar mit dem genauesten Modus einer Insulintherapie bei sehr motivierten Patienten schwierig zu erreichen. An einer potentiellen Behandlung durch eine Transplantation des Pankreas oder von Inselzellen, die normalerweise Insulin produzieren, wird weiterhin extensiv geforscht. Außerdem werden die Bemühungen in Richtung einer Entwicklung modernerer und besserer externer oder implantabler Insulinzufuhrgeräte fortsetzt, in die ein Glucosesensor integriert ist. Da diese Verfahren allerdings noch nicht verfügbar sind, besteht auf dem Gebiet der medizinischen Praxis weiter ein Bedarf nach einem Verfahren, das genau den durchschnittlichen Glucosespiegel im Blutstrom eines Patienten über die Zeit hinweg erfasst.
  • Das Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses von Hämoglobin A1-C und Hämoglobin stellt ein Verfahren zur raschen Ermittlung der durchschnittlichen Konzentration von Glucose im Blutstrom eines Patienten dar. Hämoglobin ist im Blutstrom eines Patienten in hohen Konzentrationen vorhanden. Hämoglobin verwandelt sich in Hämoglobin A1-C, wenn es mit Glucoseanteilen mit Glucose in dem Blutstrom des Patienten modifiziert wird. Die roten Blutkörperchen enthalten bei jedem Menschen einen geringen Anteil an Hämoglobin A1-C. Die Rate dessen Bildung ist proportional zu dem Zuckerspiegel, mit der Folge, dass Diabetiker einen höheren Anteil an Hämoglobin A1-C aufweisen als gesunde Personen. (Sechs bis fünfzehn Prozent, im Vergleich zu drei bis fünf Prozent). Der Spiegel von Hämoglobin A1-C deckt das Integral der Blutzuckerkonzentration über eine Zeitdauer von einigen Wochen auf. Periodische Messungen von Hämoglobin A1-C als Prozentsatz an dem gesamten Hämoglobin im Abstand von einigen Wochen sind daher von großem Nutzen bei der Ermittlung, ob der Blutzuckerspiegel eines Diabetikers angemessen eingestellt wurde. Somit repräsentieren die Methoden zum Messen des Verhältnisses von Hämoglobin A1-C zu Hämoglobin, wie sie hier beschrieben sind, ein rasches und genaues Verfahren zum Regulieren der Glucosekonzentration im Blut von Diabetikern.
  • Das Verhältnis von Hämoglobin A1-C zu Hämoglobin lässt sich mittels der Verfahren und Ausrüstungssätze der Erfindung rasch messen. Die erste Komponente, die spezifisch Hämoglobin und Hämoglobin A1-C bindet, und die zweite Komponente, die spezifisch an eine dieser Formen von Hämoglobin oder an einen Komplex bindet, der zwischen einem dieser Formen von Hämoglobin und der ersten Komponente gebildet wird, werden der Blutprobe eines Patienten in einem einzigen Schritt addiert.
  • Das Signal, das von einem Komplexes geliefert wird, der eine der Formen von Hämoglobin, die erste Komponente und die zweite Komponente aufweist, bestimmt anhand einer Standardkurve unmittelbar das Verhältnis von Hämoglobin A1-C zu Hämoglobin.
  • VI. Verfahren zum Bestimmen des Verhältnisses von biologischen Molekülen
  • Zu dem Verfahren der Erfindung, das das Verhältnis biologischer Moleküle ermittelt, gehören die Schritte, die biologischen Moleküle mit einer ersten Komponente in Berührung zu bringen, die spezifische Bindungsaffinität gegenüber beiden biologischen Molekülen aufweist, und gleichzeitig die biologischen Moleküle mit einer zweiten Komponente in Berührung zu bringen, die spezifische Bindungsaffinität für eines der biologischen Moleküle als ein Maß des Verhältnisses aufweist. Die Komponenten der Erfindung können auf Peptid basierende Moleküle, organische Moleküle oder vorzugsweise Antikörper enthalten. Die biologischen Moleküle können, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, auf organischen Molekülen, Peptiden, Nucleinsäuren, Antikörpern, Rezeptoren, Zellen, Zelloberflächen und Proteinen basieren.
  • Es kann entweder die erste Komponente oder die zweite Komponente oder es können beide Komponenten mit einer Feststoffträgermatrix verbunden sein. Dieser feste Träger kann aus einer Anzahl von Materialien zusammengesetzt sein, beispielsweise aus Agarose, Zellulose, Polystyrol oder einer Kunststoffmatrix. Vorzugsweise ist die zweite Komponente an einen festen Träger durch eine unmittelbare Anbindung oder durch einen Linker zwischen der zweiten Komponente und dem festen Träger angehängt.
  • Eine der beiden Komponenten oder beide Komponenten können ferner ein Reportermolekül aufweisen. Das Reportermolekül kann ein signalerzeugendes Element sein, zu dem eine Anzahl von Elementen gehören: Enzyme und deren resultierende Wirkungen auf ein Substrat, kolloidale Metallpartikel, Latex und Silikapartikel mit eingegliedertem Farbstoff und Farbstoffpartikel.
  • Ein Enzym kann den Umsatz eines Substrats katalysieren, um ein Produkt hervorzubringen, das sich beispielsweise durch eine Wellenlängenverschiebung nachweisen lässt, die durch Absorption- oder Fluoreszenztechniken (z.B. im ultravioletten, sichtbaren, infraroten Bereich) erfasst wird. Das mittels eines Enzyms katalysierte Produkt kann auch durch eine Verschiebung des pH-Werts eines Mediums nachweisbar sein. Die von dem Reportermolekül erzeugten Signale können unmittelbar das Verhältnis der durch das Verfahren der Erfindung getesteten biologischen Moleküle reflektieren oder können verwendet werden, um die Konzentration der biologischen Moleküle unmittelbar zu berechnen.
  • Die ersten Komponenten der Erfindung können an die biologischen Moleküle mit gleicher Affinität oder mit ungleicher Affinität binden. Falls die Komponenten der Erfindung mit ungleicher Affinität an die biologischen Moleküle binden, kann anhand von Versuchen, die die Fraktion der Komponenten ermitteln, die an gereinigte Formen der biologischen Moleküle binden, ein Normalisierungsfaktor berechnet werden. Der Normalisierungsfaktor lässt sich in den Verfahren der Erfindung nutzen, um die Anzahl von Schritten zu minimieren, die für die Ermittlung des Verhältnisses biologischer Moleküle erforderlich sind.
  • Falls als Komponenten in der Erfindung Antikörper verwendet werden, sind in der Fachwelt viele Techniken zum Herstellen von Antikörpern und Modifizieren von Antikörpern mit Reportermolekülen hinlänglich bekannt. Diese Techniken sind in der WO 96/33415 erläutert. Detaillierte Beschreibungen der Verfahren, die verwendet werden, um das Signal eines Reportermoleküls zu erfassen, ein Reportermolekül an einen Antikörper zu binden, einen Antikörper an einen festen Träger anzuhängen, und andere allgemeine Verfahren zum Erzeugen spezifischer Antikörper sind in Harlo & Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratories beschrieben.
  • Das Verfahren der Erfindung kann mittels einer Vielfalt von biologischen Proben durchgeführt werden. Die Proben können von einem Patienten abgenommen, in einer passenden Lösung geeignet gelagert, um einen Zerfall von Komponenten zu verhindern, und zu einem späteren Zeitpunkt untersucht werden. Alternativ können die Proben fortlaufend mittels einer kontinuierlich arbeitenden Strömungsvorrichtung beobachtet werden, die Körperfluide des Patienten durch ein Instrument zirkulieren lässt, das dazu dient, das Verhältnis biologischer Moleküle zu ermitteln. Diese einen kontinuierlichen Fluss verwendende Anwendung würde einen mit Rückführung arbeitenden Regelungsmechanismus bereitstellen, der sich besonders für die Verabreichung von therapeutischen Verbindungen an einen Patienten eignet. Diese Anwendung ist hier mit Bezug auf ein Ermitteln des Verhältnisses von freiem Rezeptor zu besetztem Rezeptor beschrieben. Darüber hinaus können die Verfahren der Erfindung Proben verwenden, die aus dem Gewebe eines Patienten zubereitet wurden. Ein geringes Quantum an Gewebe kann einem Patienten abgenommen, in einer geeigneten Lösung, beispiels weise einer physiologischen Kochsalzlösung homogenisiert, gefiltert und anschließend mittels der Verfahren der Erfindung untersucht werden. Verfahren zum Zubereiten von Fluidproben und Gewebeproben sind in der Fachwelt hinlänglich bekannt.
  • Die Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses biologischer Moleküle können in Standardformaten eines heterologen Enzym-Immunoassays (ELISA = Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay) durchgeführt werden, der Mikrotiterplatten verwendet. Alternativ können die Verfahren der Erfindung mittels eines tragbaren Instruments durchgeführt werden, das speziell für diese Art von Verfahren unter Verwendung von Techniken homogener Immunoassays konstruiert ist, wie sie beispielsweise in der WO 95/06877 und den US-Patenten 3 817 837, 3 935 074 und in Clin. Chem. 32, 1637–1641 (1986) beschrieben sind.
  • Nachdem die verwandten biologischen Moleküle mit den beiden Komponenten der Erfindung in Berührung gebracht wurden, lässt sich der Komplex, der ein biologisches Molekül, die erste Komponente und die zweite Komponente aufweist, mittels herkömmlicher in der Fachwelt bekannter Techniken nachweisen. Diese Techniken beinhalten gewöhnlich ein Entfernen der Lösung, die die Komponenten der Erfindung und die biologischen Moleküle in der Probe enthält, die nicht Teil des Komplexes sind, der das biologische Molekül, die erste Komponente und die zweite Komponente enthält, und ein anschließendes gründliches Spülen der Reaktion entweder in mehreren Schritten oder durch einen kontinuierlichen Strom mit einer Lösung, die die Komponenten der Erfindung oder die untersuchten biologischen Moleküle nicht enthält. Das Signal, das das Verhältnis der biologischen Moleküle be stimmt, lässt sich ohne einen Spülschritt erfassen, falls die an die Komponenten der Erfindung angehängten Reportermoleküle oder die Komponenten selbst ihre Fluoreszenzdepolarisation, Emissionswellenlänge, Infrarotwellenlänge oder eine beliebige andere Eigenschaft ändern, nachdem der aus biologischem Molekül/erster Komponente/zweiter Komponente basierende Komplex gebildet ist.
  • Nach dem gegebenenfalls erforderlichen Schritt des Waschens wird das Verhältnis der biologischen Moleküle gewöhnlich durch Messen des durch ein Reportermolekül erzeugten Signals ermittelt. Das Reportermolekül kann an die Komponenten selbst angehängt sein oder an ein Molekül angehängt sein, z.B. einen Antikörper, der den Komplex detektiert, der ein biologisches Molekül, eine erste Komponente und eine zweite Komponente aufweist. Vorzugsweise ist das Reportermolekül an die erste Komponente der Erfindung angehängt.
  • Das Verhältnis der verwandten biologischen Moleküle lässt sich anhand eines Signals bestimmen, das durch ein Reportermolekül erzeugt wird, das an eine oder beide Komponenten der Erfindung angehängt ist. Die mittels des Verfahrens der Erfindung erzeugten Signale lassen sich durch ein Extrapolieren des Verhältnisses anhand einer Standardkurve in das Verhältnis der biologischen Moleküle übersetzen.
  • Eine Standardkurve kann durch die Verwendung bekannter Mengen jeder der zu untersuchenden Komponenten erzeugt werden. Beispielsweise kann unter Verwendung bekannter Konzentrationen der biologischen Moleküle, für die das Verhältnis ermittelt wird, ein Signal gemessen werden, das von einem Komplex stammt, der ein biologisches Molekül, eine erste Komponente und eine zweite Komponente aufweist. Die Proben, die bekannte Mengen biologischer Moleküle enthalten, können isoliert werden, indem die Moleküle aus kommerziellen Quellen erworben werden, oder indem die biologischen Moleküle mittels in der Fachwelt hinlänglich bekannter Techniken gereinigt werden. Die Standardkurve kann anhand gereinigter biologischer Moleküle erzeugt werden, die zubereitet sind in Form von: (a) einfachen in vitro gepufferten Lösungen, (b) in vitro Lösungen, die Blutbedingungen nachahmen, oder (c) in vivo Proben, die bekannte Verhältnisse von speziellen biologischen Molekülen aufweisen, wie sie durch die Konzentrationen von jedem der biologischen Moleküle, die das Verhältnis beinhalten, ermittelt sind.
  • Die Konzentrationen von jedem der biologischen Moleküle lassen sich anhand von aus dem Stand der Technik vorhandenen Techniken bestimmen. Das aus der Probe eines Patienten sich ergebende Verhältnis biologischer Moleküle wird anschließend anhand einer Standardkurve extrapoliert, indem das an der Probe gemessene Signal auf die Standardkurve angewendet wird.
  • VII. Auf Antikörpern basierendes Verfahren und Ausrüstungssatz zum Bestimmen des Verhältnisses verwandter biologischer Moleküle
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet ein Verfahren zum Ermitteln des Verhältnisses von verwandten biologischen Molekülen in einer Probe. Zu dem Verfahren können die Schritte gehören: Inkubieren einer Prüfprobe mit einem oder mehreren der Antikörper der vorliegenden Erfindung und Testen, ob der Antikörper an die Analyte bindet. Veränderte Spiegel des Verhältnisses, wie es in Proben eines Patienten im Vergleich zu dem bei normalen Patienten ermittelten Verhältnis gemessen wird, können anzeigen, dass eine ungewöhnliche Bedingung bei dem betreffenden Patienten vorliegt. Beispielsweise weisen erhöhte Verhältnisse von Hämoglobin A1-C zu Hämoglobin im Körper eines Patienten darauf hin, das der Patient möglicherweise Diabetiker ist, und/oder dass eine wirkungsvollere Überwachung des Blutzuckerspiegels des Patienten erforderlich ist.
  • Wie einem durchschnittlich ausgebildeten Fachmann klar ist, können Bedingungen für ein Inkubieren eines Antikörpers mit einer Prüfprobe variieren. Beispielsweise hängen Inkubationsbedingungen von dem in dem Versuch verwendeten Format, den eingesetzten Detektionsverfahren und dem Typ und der Art des in dem Versuch verwendeten Antikörpers ab. Der Fachmann wird erkennen, dass ein beliebiges der allgemein verfügbaren immunologischen Assayformat (beispielsweise Radioimmunoassays, heterologe Enzym-Immunoassays, auf Diffusion basierende homogene Ouchterlony-Immunoassays oder Rocket-Immunofluoreszenzassays) sich ohne weiteres anpassen lassen, um die Antikörper der vorliegenden Erfindung verwenden zu können.
  • Beispiele solcher Tests sind z.B. zu entnehmen in: Chard, "An Introduction to Radio Immunoassay and Related Techniques", Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1986); Bullock et al., "Techniques in Immuno Chemistry", Academic Press, Orlando, Florida Vol. I (1982), Volume II (1983), Volume III (1985); Tijssen, "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1985).
  • Ein erfindungsgemäßer Ausrüstungssatz enthält sämtliche der erforderlichen Reagenzien, um das Verfahren der Erfindung auszuführen. Beispielsweise kann in dem Ausrüstungssatz enthalten sein: (1) eine erster Behälter, der einen hier beschrieben Antikörper enthält, (2) ein zweiter Behälter, der ein Konjugat enthält, das einen Bindungspartner des Antikörpers aufweist, und (3) ein Label und/oder ein Protokoll der Food and Drug Administration (Ministerium für Ernährung und Gesundheit), das an der Außenseite des Behälters des Ausrüstungssatzes angebracht ist. In einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel gehören zu dem Ausrüstungssatz ferner ein oder mehrere weitere Behälter, die eine oder mehrere der folgenden Posten enthalten: Waschreagenzien und Reagenzien/Materialien, die in der Lage sind, die Anwesenheit von gebundenen Komponenten oder Antikörpern der Erfindung zu detektieren.
  • Zu Beispielen von Nachweis-Reagenzien/Materialien gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, markierte sekundäre Antikörper, die in der Lage sind, spezifisch an Antikörper der Erfindung zu binden, oder alternativ, falls der primäre Antikörper markiert ist, die chromophoren, enzymatischen, Antikörper-Bindungsreagenzien, die in der Lage sind, mit markiertem Antikörper zu reagieren, oder Nachweismodalitäten, die in der Lage sind den Grad der Radioaktivität zu ermitteln.
  • Der Fachmann wird ohne weiteres erkennen, dass die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Antikörper ohne weiteres in einem der bestehenden Ausrüstungssatzformate verwendet werden können, die aus dem Stand der Technik hinlänglich bekannt sind.
  • Der Ausrüstungssatz kann ferner gereinigte Formen von jedem der in dem Ausrüstungssatz untersuchten biologischen Moleküle einschließen. Diese gereinigten Standardmoleküle können von dem Fachmann eingesetzt werden, um mittels des Ausrüstungssatzes eine Standardkurve zu erzeugen. Die Standardkurve kann mittels der gereinigten Moleküle in Verbindung mit den zwei oder drei Komponenten der Erfindung erzeugt werden.
  • Eine Standardkurve kann mittels der zwei oder drei Komponenten der Erfindung in Verbindung mit den gereinigten biologischen Molekülen erzeugt werden. Bekannte Verhältnisse der biologischen Moleküle können getrennt zubereitet und mit den zwei oder drei Komponenten der Erfindung getestet werden. Ein Signal, das von dem Reportermolekül erzeugt wird, das an eine der Komponenten in dem Komplex angehängt ist, der das erste biologische Molekül, die erste Komponente, die zweite Komponente und optional die dritte Komponente der Erfindung aufweist, kann für jedes Verhältnis der getesteten biologischen Moleküle erzeugt werden. Jedes Signal kann mit Bezug auf die Verhältnisse in einem Graph aufgetragen werden, und es kann eine Kurve durch die Datenpunkte mathematisch angepasst werden. Diese Standardkurve kann daher für jedes in einer biologischen Probe gemessene Signal einen Bezug zu dem Verhältnis der gewünschten biologischen Moleküle in der Probe herstellen. Weitere Verfahren im Zusammenhang mit der Erfindung sind anhand von hier offenbarten Beispielen beschrieben.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele sind nicht beschränkend und dienen lediglich einer Veranschaulichung vielfältiger Aspekte und Merkmale der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele veranschaulichen Verfahren eines Ermittelns der Verhältnisse biologischer Moleküle. Darüber hinaus stellen die Beispiele Verfahren zum Erzeugen einer Standardkurve zur Verfügung, die für das Verfahren der Erfindung verwendet wird, sowie Verfahren zum Erzeugen von Normalisierungsfaktoren, die ebenfalls von dem Fachmann verwendet werden können, um die Verfahren der Erfindung auszuführen.
  • BEISPIEL 1: VERFAHREN ZUM BESTIMMEN DES VERHÄLTNISSES VON FREIEM REZEPTOR ZU BESETZTEM REZEPTOR
  • Die folgenden Verfahren können durch den Fachmann nachvollzogen werden, um das Verhältnis von freiem Rezeptor zu besetztem Rezeptor in einer Probe zu ermitteln. Das Verhältnis von freiem Rezeptor zu besetztem Rezeptor lässt sich unter Verwendung zweier unterschiedlicher Verfahren ermitteln. Verfahren A verwendet zwei Komponenten und Verfahren B verwendet drei Komponenten. Das Verfahren B hat Vorteile, wenn die Konzentration des biologischen Moleküls, das die zweite Komponente spezifisch bindet, größer ist als die Konzentration der zweiten Komponente in einer Probe.
  • Verfahren A
    • 1. Bereite eine wässerige biologische Probe zu. Die Probe kann eine Fluidprobe, die einem Patienten abgenommen wurde, eine Fluidprobe, die von dem Patienten zu einer Maschine und zurück zu dem Patient zirkuliert, oder eine Gewebeprobe sein.
    • 2. Bringe die biologische Probe mit der ersten und zweiten Komponente der Erfindung zusammen. Die erste Kompo nente weist spezifische Bindungsaffinität sowohl für freien Rezeptor als auch für besetzten Rezeptor auf, und ihre Konzentration ist geringer als die Gesamtkonzentration der biologischen Moleküle in der Fluidprobe. Die zweite Komponente ist lediglich für freien Rezeptor oder besetzten Rezeptor spezifisch, und ihre Konzentration in der Fluidprobe kann größer, gleich oder geringer sein als die Konzentration der ersten Komponente. Falls die ersten oder zweiten Komponenten nicht an eine Feststoffträgermatrix gebunden ist, kann in diesem Schritt eine der Komponenten an einen festen Träger gebunden werden.
    • 3. Wasche den festen Träger mit einem geeigneten Puffer, z.B. Phosphatpufferkochsalzlösung.
    • 4. Miss ein Signal, das von dem signalerzeugenden (Reporter-) Molekül ausgeht, das vorzugsweise an die erste Komponente der Erfindung angehängt ist.
    • 5. Extrapoliere das Verhältnis von freiem Rezeptor zu besetztem Rezeptor anhand der Standardkurve.
  • Verfahren B
    • 1. Bereite eine wässerige biologische Probe zu. Die Probe kann eine Fluidprobe, die einem Patienten abgenommen wurde, eine Fluidprobe, die von dem Patienten zu einer Maschine und zurück zu dem Patient zirkuliert, oder eine Gewebeprobe sein.
    • 2. Bringe die biologische Probe mit der ersten, zweiten und dritten Komponente der Erfindung zusammen. Die erste Komponente weist spezifische Bindungsaffinität sowohl für freien Rezeptor als auch für besetzten Rezeptor auf, und ihre Konzentration ist geringer als die Gesamtkonzentration der Rezeptormoleküle in der Fluidprobe. Die zweite Komponente ist lediglich für freien Rezeptor oder besetzten Rezeptor spezifisch, und ihre Konzentration in der Fluidprobe kann größer, gleich oder geringer sein als die Konzentration der ersten Komponente. Die dritte Komponente weist spezifische Bindungsaffinität für den Komplex auf, der die zweite Komponente und entweder freien Rezeptor oder besetzten Rezeptor enthält. Die dritte Komponente kann unmittelbar an einen festen Träger angebunden werden, oder sie kann frei in Lösung sein und ein spezifisches Erkennungsmolekül aufweisen, beispielsweise eine Biotin- oder Hämagglutininmarkierung, die an einen Avidin- bzw. Anti-Hämagglutinin-Antikörper bindet, der an einen festen Träger gebunden ist. Die Konzentration der dritten Komponente ist größer als die Konzentration der zweiten Komponente.
    • 3. Wasche den festen Träger mit einem geeigneten Puffer, z.B. Phosphatpufferkochsalzlösung.
    • 4. Miss ein Signal, das von dem signalerzeugenden (Reporter-) Molekül ausgeht, das vorzugsweise an die erste Komponente der Erfindung angehängt ist.
    • 5. Extrapoliere das Verhältnis von freiem Rezeptor zu besetztem Rezeptor anhand der Standardkurve.
  • BEISPIEL 2: VERFAHREN ZUM BESTIMMEN DES PROZENTSATZES DES DURCH DAS MEDIKAMENT GEBUNDENEN GLYCOPROTEIN-REZEPTOR-IIBIIIA UND DES PROZENTSATZES VON THROMBOZYTEN, DIE AKTIVIERT SIND
  • Das folgende Verfahren kann von einem Fachmann verwendet werden, um das Verhältnis von freiem Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor zu besetztem Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor und das Verhältnis von aktivierten Thrombozyten gegenüber inaktiven Thrombozyten zu ermitteln. Die Schritte des Verfahrens sind wie folgt:
    • 1. Füge einer Blutprobe eine erste, eine zweite und eine unterschiedliche zweite Komponente hinzu. Die erste Komponente ist ein Label-Antikörperkonjugat. Die Konzentration der ersten Komponente ist geringer als die Konzentration von Thrombozyten, so dass sämtliche Thrombozytenarten (beispielsweise Thrombozyten mit Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor, der mit einem Medikament besetzt ist, Thrombozyten mit einem nicht besetzten Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor (inaktive Thrombozyten) und aktivierte Thrombozyten) an die erste Komponente in einer statistischen Verteilung gebunden werden, die direkt proportional zu deren Verhältnis in der Probe ist. Der für die erste Komponente verwendete Antikörper kann ausgewählt sein, um Glycophorin oder ein weiteres Molekül spezifisch auf dem Thrombozyten zu binden, das zwischen den vier Arten invariant ist. Die zweite Komponente ist ein Konjugat aus Anti-Glycoprotein IIbIIIa Antikörper/Tag1. Die zweite Komponente ist spezifisch für entweder den nicht besetzten Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor oder den mit einem Medikament besetzten Glycoprotein-IIbIIIa-Rezeptor. Die unterschiedliche zweite Komponente ist ein Konjugat des Anti-P-Selektin-Antikörper/Tag2. Die unterschiedli che zweite Komponente ist spezifisch für aktivierte Thrombozyten, indem sie beispielsweise P-Selektin spezifisch bindet, das ein auf aktivierten Thrombozyten exprimiertes Protein ist.
    • 2. Inkubiere die Blutprobe für 30 Sekunden.
    • 3. Appliziere das Blut auf ein Gerät, das auf einer festen Phase zwei diskrete Bereiche aufweist, die Anti-Tag1-Antikörper und Anti-Tag2-Antikörper enthalten.
    • 4. Entferne durch Waschen nicht gebundenes Label.
    • 5. Miss die an dem ersten und zweiten Bereich vorhandene Menge an Label (Reportermolekül), die das Maß des an Glycoprotein-IIbIIIa gebundenen Medikaments bzw. das Maß der aktivierten Thrombozyten repräsentiert.
  • BEISPIEL 3: VERFAHREN ZUM BESTIMMEN DES VERHÄLTNISSES VON HÄMOGLOBIN A1-C ZU HÄMOGLOBIN
  • Das folgende Verfahren kann von einem Fachmann nachvollzogen werden, um das Verhältnis von Hämoglobin A1-C zu Hämoglobin in einer Probe zu ermitteln. Das Verhältnis von Hämoglobin A1-C zu Hämoglobin lässt sich unter Verwendung zweier unterschiedlicher Verfahren ermitteln. Verfahren A verwendet zwei Komponenten und Verfahren B verwendet drei Komponenten. Das Verfahren B ist von Vorteil, wenn die Konzentration des biologischen Moleküls, das spezifisch die zweite Komponente bindet, größer ist als die Konzentration der zweiten Komponente in einer Probe.
  • Verfahren A
    • 1. Bereite eine wässerige biologische Probe zu. Die Probe kann eine Fluidprobe, die einem Patienten abgenommen wurde, eine Fluidprobe, die von dem Patienten zu einer Maschine und zurück zu dem Patient zirkuliert, oder eine Gewebeprobe sein.
    • 2. Bringe die biologische Probe mit der ersten und zweiten Komponente der Erfindung in Berührung. Die erste Komponente weist spezifische Bindungsaffinität sowohl für Hämoglobin als auch für Hämoglobin A1-C auf, und seine Konzentration in der Fluidprobe ist geringer als die Gesamtkonzentration von Hämoglobin in der Fluidprobe. Die zweite Komponente ist spezifisch für Hämoglobin A1-C, und ihre Konzentration in der Fluidprobe kann größer, gleich oder geringer sein als die Konzentration der ersten Komponente. Falls die ersten oder zweiten Komponenten nicht an eine Feststoffträgermatrix gebunden sind, kann in diesem Schritt eine der Komponenten an einen festen Träger gebunden werden.
    • 3. Wasche den festen Träger mit einem geeigneten Puffer, z.B. Phosphatpufferkochsalzlösung.
    • 4. Miss ein Signal, das von dem signalerzeugenden (Reporter-) Molekül ausgeht, das vorzugsweise an die erste Komponente der Erfindung angehängt ist.
    • 5. Extrapoliere das Verhältnis von Hämoglobin A1-C zu Hämoglobin anhand einer Standardkurve.
  • Verfahren B
    • 1. Bereite eine wässerige biologische Probe zu. Die Probe kann eine Fluidprobe, die einem Patienten abgenommen wurde, eine Fluidprobe, die von dem Patienten zu einer Maschine und zurück zu dem Patient zirkuliert, oder eine Gewebeprobe sein.
    • 2. Bringe die biologische Probe mit der ersten, der zweiten und der dritten Komponente der Erfindung zusammen. Die erste Komponente weist spezifische Bindungsaffinität sowohl für Hämoglobin als auch für Hämoglobin A1-C auf, und seine Konzentration in der Fluidprobe ist geringer als die Gesamtkonzentration von Hämoglobin in der Fluidprobe. Die zweite Komponente ist spezifisch für Hämoglobin A1-C, und ihre Konzentration in der Fluidprobe kann größer, gleich oder geringer sein als die Konzentration der ersten Komponente. Die dritte Komponente weist spezifische Bindungsaffinität für den Komplex auf, der die zweite Komponente und entweder Hämoglobin oder Hämoglobin A1-C enthält. Die dritte Komponente kann unmittelbar an einen festen Träger angebunden werden oder sie kann frei in Lösung sein und ein spezifisches Erkennungsanteil aufweisen, beispielsweise Biotin oder eine Hämagglutininmarkierung, die an Avidin bzw. an einen Anti-Hämagglutinin-Antikörper bindet, der an einen festen Träger gebunden ist. Die Konzentration der dritten Komponente ist größer als die Konzentration der zweiten Komponente.
    • 3. Wasche den festen Träger mit einem geeigneten Puffer, z.B. Phosphatpufferkochsalzlösung.
    • 4. Miss ein Signal, das von dem signalerzeugenden (Reporter-) Molekül ausgeht, das vorzugsweise an die erste Komponente der Erfindung angehängt ist.
    • 5. Extrapoliere das Verhältnis von Hämoglobin A1-C zu Hämoglobin anhand der Standardkurve.
  • BEISPIEL 4: VERFAHREN ZUM BESTIMMEN DES VERHÄLTNISSES VON OXIDIERTEM TROPONIN I ZU REDUZIERTEM TROPONIN I
  • Das folgende Verfahren kann von einem Fachmann nachvollzogen werden, um das Verhältnis von oxidiertem Troponin I zu reduziertem Troponin I in einer Probe zu ermitteln. Das Verhältnis von oxidiertem Troponin I zu reduziertem Troponin I lässt sich unter Verwendung zweier unterschiedlicher Verfahren ermitteln. Verfahren A verwendet zwei Komponenten und Verfahren B verwendet drei Komponenten. Das Verfahren B ist von Vorteil, wenn die Konzentration des biologischen Moleküls, das spezifisch die zweite Komponente bindet, in einer Probe größer ist als die Konzentration der zweiten Komponente.
  • Verfahren A
    • 1. Bereite eine von einem Patienten stammende Probe zu. Die Probe kann eine Fluidprobe, die einem Patienten abgenommen wurde, eine Fluidprobe, die von dem Patienten zu einer Maschine und zurück zu dem Patient zirkuliert, oder eine Gewebeprobe sein.
    • 2. Bringe die biologische Probe mit den ersten und zweiten Komponenten der Erfindung in Berührung. Die erste Komponente weist spezifische Bindungsaffinität sowohl für oxidiertes als auch für reduziertes Troponin I auf, und ihre Konzentration in der Fluidprobe ist geringer als die Gesamtkonzentration des Troponin I in der Fluidprobe. Die zweite Komponente ist lediglich für oxidiertes oder redu ziertes Troponin I spezifisch, und ihre Konzentration in der Fluidprobe kann größer, gleich oder geringer sein als die Konzentration der ersten Komponente. Falls die ersten oder zweiten Komponenten nicht an eine Feststoffträgermatrix gebunden sind, kann in diesem Schritt eine der Komponenten an einen festen Träger gebunden werden.
    • 3. Wasche den festen Träger mit einem geeigneten Puffer, z.B. Phosphatpufferkochsalzlösung.
    • 4. Miss ein Signal, das von dem signalerzeugenden (Reporter-) Molekül ausgeht, das vorzugsweise an die erste Komponente der Erfindung angehängt ist.
    • 5. Extrapoliere das Verhältnis von oxidiertem Troponin I zu reduziertem Troponin I anhand einer Standardkurve.
  • Verfahren B
    • 1. Bereite eine wässerige biologische Probe zu. Die Probe kann eine Fluidprobe, die einem Patienten abgenommen wurde, eine Fluidprobe, die von dem Patienten zu einer Maschine und zurück zu dem Patient zirkuliert, oder eine Gewebeprobe sein.
    • 2. Bringe die biologische Probe mit der ersten, zweiten und dritten Komponente der Erfindung in Berührung. Die erste Komponente weist spezifische Bindungsaffinität sowohl für oxidiertes als auch für reduziertes Troponin I auf, und ihre Konzentration in dem Fluidprobe ist geringer als die Gesamtkonzentration von Troponin I in der Fluid probe. Die zweite Komponente ist lediglich für oxidiertes oder reduziertes Troponin I spezifisch, und ihre Konzentration in der Fluidprobe kann größer, gleich oder geringer sein als die Konzentration der ersten Komponente. Die dritte Komponente weist spezifische Bindungsaffinität für den Komplex auf, der die zweite Komponente und entweder oxidiertes Troponin I oder reduziertes Troponin I enthält. Die dritte Komponente kann unmittelbar an einen festen Träger angebunden werden, oder sie kann frei in Lösung sein und einen spezifischen Erkennungsanteil aufweisen, beispielsweise Biotin oder eine Hämagglutininmarkierung, die an Avidin bzw. einen Anti-Hämagglutinin-Antikörper bindet, der an einen festen Träger gebunden ist. Die Konzentration der dritten Komponente ist größer als die Konzentration der zweiten Komponente.
    • 3. Wasche den festen Träger mit einem geeigneten Puffer, z.B. Phosphatpufferkochsalzlösung.
    • 4. Miss ein Signal, das von dem signalerzeugenden (Reporter-) Molekül ausgeht, das vorzugsweise an die erste Komponente der Erfindung angehängt ist.
    • 5. Extrapoliere das Verhältnis von oxidiertem Troponin I zu reduziertem Troponin I anhand der Standardkurve.
  • BEISPIEL 5: ERZEUGUNG EINER STANDARDKURVE
  • Das folgende Protokoll kann verwendet werden, um eine Standardkurve zu erzeugen, die dazu dient, in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden.
    • 1. Bereite Dilutionen jedes biologischen Moleküls in einem geeigneten Puffer zu, z.B. Phosphatpufferkochsalzlösung Plasma, Serumvollblut oder Urin. Die verdünnten Lösungen sollten in einem breiten Bereich von Konzentrationen der biologischen Moleküle zubereitet werden. Dieses in vitro Verfahren lässt sich in Verbindung mit einfachen Puffern als das Verdünnungsmittel oder mit Elementen aus biologischen Fluidproben verwenden. Alternativ können für die Erzeugung einer Standardkurve in vivo Proben verwendet werden, in denen das Verhältnis der biologischen Moleküle vorher mit den aus dem Stand der Technik vorhandenen langsameren Verfahren ermittelt wurde.
    • 2. Füge jeder verdünnten Probe eines biologischen Moleküls die erste Komponente, die zweite Komponente und optional die dritte Komponente der Erfindung hinzu. Die Konzentration der ersten Komponente ist geringer als die Konzentration der biologischen Moleküle. Die Konzentration der zweiten Komponente ist größer, gleich oder geringer als die Konzentration der ersten Komponente. Die Konzentration der dritten Komponente, falls diese verwendet wird, ist größer als die Konzentration der zweiten Komponente.
    • 3. Falls eine oder beide der Komponenten noch nicht an einen festen Träger gebunden sind, hänge eine der Komponenten mittels des hier beschriebenen Verfahrens an einen festen Träger an.
    • 4. Entferne nicht gebundene Moleküle durch Waschen. Das Waschen kann durchgeführt werden, indem die Reaktionsflüssigkeit von dem festen Träger entfernt wird und der feste Träger mit einem geeigneten Puffer, z.B. Phosphatpufferkochsalzlösung, gespült wird.
    • 5. Miss das Signal, das von einem signalerzeugenden Molekül stammt, das vorzugsweise an die erste Komponente der Erfindung angehängt ist.
    • 6. Trage das gemessene Signal gegenüber dem vorher bestimmten Verhältnis der biologischen Moleküle für jede Probe graphisch auf.
    • 7. Ermittle die mathematische Funktion, die am besten zu den in der graphische Darstellung erzeugten Datenpunkten passt. Die mathematischen Funktionen können eine gerade, exponentielle oder hyperbolische Funktion beinhalten.
  • BEISPIEL 6: BESTIMMUNG VON NORMALISIERUNGSFAKTOREN
  • Die folgenden Verfahren können verwendet werden, um Normalisierungsfaktoren zu ermitteln, die bei einem Ermitteln des Verhältnisses von verwandten biologischen Molekülen verwendet werden, wenn die erste Komponente an beide biologische Moleküle nicht mit gleicher Affinität bindet.
    • 1. Hänge ein gereinigtes biologisches Molekül an einen festen Träger an. Hänge in einem anderen Behälter ein weiteres biologisches Molekül, für das das Verhältnis zu ermitteln ist, an einen festen Träger an. Für dieses Beispiel seien die biologischen Moleküle, die das Verhältnis aufweisen, als Moleküle A und B bezeichnet.
    • 2. Bringe jedes der biologischen Moleküle, die an die festen Träger gebunden sind, in Kontakt mit der ersten Komponente der Erfindung.
    • 3. Spüle nicht gebundenes Material von dem festen Träger weg.
    • 4. Ermittle die Menge der ersten Komponente, die an A gebunden ist, und ermittle die Menge der ersten Komponente, die an B gebunden ist. Die Menge der ersten Komponente lässt sich durch ein Reportermolekül ermitteln, das an die erste Komponente selbst angehängt ist, oder durch Binden der ersten Komponente mit einem Bindungsmolekül, das an ein Reportermolekül angehängt ist.
    • 6. Ermittle den Normalisierungsfaktor (NF) mittels des folgenden Ausdrucks: NF = [A]/[B],mit [A] gleich der Menge von A und mit [B] gleich der Menge von B, ausgedrückt als Konzentration oder als Signaleinheiten.
  • Der Normalisierungsfaktor lässt sich als ein Multiplikationsfaktor für die relative Vorspannung einer Antikörperbindung von A gegenüber B verwenden.
  • Sämtliche in der Beschreibung erwähnten Patente und Veröffentlichungen deuten auf die Qualifikation der Fachleuten hin, an die sich die Erfindung wendet.
  • Die hier veranschaulichend beschriebene Erfindung kann in der Abwesenheit eines beliebigen Elements oder von Ele menten, einer Beschränkung oder Beschränkungen, die hier nicht im Speziellen offenbart sind, geeignet verwirklicht werden. Folglich kann beispielsweise in jeder vorliegenden Ausprägung jeder der Begriffe "enthält", "setzt sich weitgehend zusammen aus" und "ist zusammengesetzt aus" durch jeden der beiden anderen Begriffen ersetzt werden. Die hier verwendeten Begriffe und Ausdrücke dienen einer Veranschaulichung und nicht einer Beschränkung, und es besteht keine Absicht, durch die Verwendung derartiger Begriffe und Ausdrücke irgendwelche äquivalenten Formen der gezeigten und beschrieben Merkmale oder Teile derselben auszuschließen, sondern vielmehr anerkannt wird, dass vielfältige Abwandlungen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung möglich sind. Somit sollte es klar sein, dass, obwohl die vorliegende Erfindung speziell anhand von bevorzugten Ausführungsbeispielen und optionalen Merkmalen offenbart wurde, durch den Fachmann auf Modifikation und Veränderung der hier offenbarten Konzepte zurückgegriffen werden kann, und dass derartige Modifikationen und Veränderungen als innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung zu erachten sind, wie er durch die beigefügten Patentansprüche definiert ist.
  • Weitere Ausführungsbeispiele werden von den folgenden Ansprüchen abgedeckt.

Claims (34)

  1. Verfahren zur Bestimmung des Lösungsverhältnisses von biologischen Molekülen mit den Schritten: (a) die biologischen Moleküle werden (i) mit einer ersten Komponenten, die für jedes der biologischen Moleküle eine spezifische Bindungsaffinität aufweisen, wobei die biologischen Moleküle an den ersten Komponenten in einem Bindungsverhältnis binden, das zu dem Lösungsverhältnis der biologischen Moleküle in Beziehung steht und (ii) mit einer zweiten Komponenten zusammengebracht, die für ein erstes biologisches Molekül der biologischen Moleküle eine spezifische Bindungsaffinität aufweist und (b) als Maß für das Lösungsverhältnis wird die Menge an Komplex bestimmt, der das erste biologische Molekül, die erste Komponente und die zweite Komponente enthalten.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem zusätzlich ein oder mehrere andere spezifische erste Komponenten enthalten sind, die für ein anderes spezielles biologisches Molekül eine spezifische Bindungsaffinität aufweisen.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner eine oder mehrere andere spezifische zweite Komponenten umfasst, die für die bestimmten biologischen Moleküle eine spezifische Bindungsaffinität aufweisen.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, bei denen wenigstens eine der Komponenten einen Antikörper umfasst.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem wenigstens eine der Komponenten einen spezifische Erkennungsbaustein umfasst.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem wenigstens eine der Komponenten einen Linker für einen festen Träger umfasst.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem wenigstens eine der Komponenten ein Reportermolekül umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die zweite Komponente eine spezifische Bindungsaffinität für einen Komplex aufweist, der das erste biologische Molekül und die zweite Komponenten auch umfasst.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die erste Komponente einen Bindungsbaustein aufweist, die eine spezifische Bindungsaffinität für jedes der biologischen Moleküle aufweist, wobei die biologischen Moleküle an den ersten Komponenten in einem Bindungsverhältnis binden, das zu dem Lösungsverhältnis der biologischen Moleküle in Beziehung steht.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die erste Komponente umfasst: (a) einen ersten Bindungsbaustein mit einer spezifischen Bindungsaffinität für das erste biologische Molekül und (b) einen zweiten Bindungsbaustein mit einer spezifischen Bindungsaffinität für ein zweites biologisches Molekül der biologischen Moleküle, wobei das biologische Molekül an den ersten Komponenten in einem Bindungsverhältnis bindet, das zu dem Lösungsverhältnis der biologischen Moleküle in Beziehung steht.
  11. Verfahren nach den Ansprüchen 9 und 10, bei dem ein oder mehrere der Bindungsbausteine Antikörper sind.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, gemäß dem die biologischen Moleküle besetzte oder freie Rezeptoren sind.
  13. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die biologischen Moleküle Hämoglobin oder Hämoglobin A1-C sind.
  14. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die biologischen Moleküle oxidiertes Troponin I oder reduziertes Troponin I sind.
  15. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die erste Komponente eine spezifische Bindungsaffinität sowohl für den besetzten Rezeptor als auch für den freien Rezeptor aufweist und bei dem die zweite Komponente eine spezifische Bindungsaffinität für (a) den besetzten Rezeptor; (b) den freien Rezeptor; (c) einen Komplex, der den ersten besetzten Rezeptor und den ersten Komponenten oder (d) einen Komplex aufweist, der den freien Rezeptor und den ersten Komponenten umfasst.
  16. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der erste Komponente eine spezifische Bindungsaffinität sowohl für Hämoglobin als auch für Hämoglobin A1-C aufweist und bei dem die zweite Komponente eine spezifische Bindungsaffinität für (a) Hämoglobin; (b) Hämoglobin A1-C; (c) einen Komplex, der Hämoglobin und den ersten Komponenten oder (d) einen Komplex aufweist, der Hämoglobin A1-C und den ersten Komponenten enthält.
  17. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die erste Komponente eine spezifische Bindungsaffinität sowohl für oxidiertes Troponin I als auch für reduziertes Troponin I aufweist und bei dem die zweite Komponente eine spezifische Bindungsaffinität für (a) reduziertes Troponin I; (b) oxidiertes Troponin I; (c) einen Komplex, der reduziertes Troponin I und den erste Komponenten oder (d) einen Komplex aufweist, der oxidiertes Troponin I und den ersten Komponenten enthält.
  18. Verfahren nach Anspruch 1, das zusätzlich den Schritt umfasst, gemäß dem die biologischen Moleküle mit einer dritten Komponente nach dem Schritt (a) und vor dem Schritt (b) zusammengebracht werden, wobei die dritte Komponente eine spezifische Bindungsaffinität für einen Komplex aufweist, der das erste biologische Molekül und die zweite Komponentn enthält.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem der dritte Komponent eine spezifische Erkennungsbeustein enthält.
  20. Verfahren nach Anspruch 1, zu dem ferner der Schritt gehört, gemäß dem die Moleküle, die nicht an den Komplex gebunden sind, der das erste biologische Molekül, die erste Komponente und die zweite Komponente enthält, entfernt werden.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, bei dem der Komplex ferner eine dritte Komponente enthält, wobei die dritte Komponente eine spezifische Bindungsaffinität für einen Komplex aufweist, der das erste biologische Molekül und die erste Komponente enthält.
  22. Verfahren nach Anspruch 1, zu dem ferner der Schritt gehört, gemäß dem die Menge an Komplex, der das erste biologische Molekül, die erste Komponente und die zweite Komponente enthält, mit einer Standardkurve verglichen wird, wobei die Standardkurve die Menge an Komplex, der das erste biologische Molekül, die erste Komponente und die zweite Komponente enthalten, mit dem Lösungsverhältnis in Beziehung setzt.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem der Komplex ferner eine dritte Komponente enthält, wobei die dritte Komponente eine spezifische Bindungsaffinität für einen Komplex aufweist, der das erste biologische Molekül und die zweite Komponente enthält.
  24. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die Standardkurve ein Signal, das von einem Reportermolekül geliefert wird, zu dem Lösungsverhältnis in Beziehung setzt.
  25. Verfahren zur Bestimmung einer oder mehrerer Lösungsverhältnisse von drei oder mehr biologischen Molekülen mit den Schritten (a) die biologischen Moleküle werden (i) mit einer ersten Komponente mit einer spezifischen Bindungsaffinität für jedes der ersten Moleküle zusammengebracht, wobei die ersten Moleküle an die erste Komponente in einem Bindungsverhältnis binden, das zu dem Lösungsverhältnis der biologischen Moleküle in Beziehung steht; (ii) die biologischen Moleküle werden mit einer zweiten Komponente zusammengebracht, die eine spezifische Bindungsaffinität für ein erstes biologisches Molekül der biologischen Moleküle aufweist; (iii) mit einer unterschiedlichen zweiten Komponente zusammengebracht, die eine spezifischen Bindungsaffinität für ein zweites biologisches Molekül der biologischen Moleküle aufweist, und (b) als Maß für die Lösungsverhältnisse wird die Menge an Komplex bestimmt, der das erste biologische Molekül, die erste Komponente und die zweite Komponente enthält, oder die Menge an Komplex, der das zweite biologische Molekül, die erste Komponente und die unterschiedliche zweite Komponente enthält.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem wenigstens eine der Komponenten einen Antikörper umfasst.
  27. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem wenigstens eine der Komponenten einen spezifische Erkennungsbaustein enthält.
  28. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem wenigstens eine der Komponenten einen Linker für einen Festkörperträger bildet.
  29. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem wenigstens eine der Komponenten ein Reportermolekül enthält.
  30. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem die biologischen Moleküle freie Glycoprotein IIbIIIa Rezeptoren oder besetzte Glycoproteine IIbIIIa Rezeptoren oder aktivierte Plättchen sind.
  31. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem die Menge an Komplex, der das erste biologische Molekül, die erste Komponente und die zweite Komponente enthält, ein Maß für das Lösungsverhältnis von freiem Glycoprotein IIbIIIa Rezeptor zu besetztem Glycoprotein IIbIIIa Rezeptor ist und die Menge an Komplex, der das zweite biologische Molekül, die zweite Komponente und die andere zweite Komponente enthält, ein Maß für das Lösungsverhältnis von aktivierten Plättchen zu inaktiven Plättchen ist.
  32. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem die erste Komponente für Glycophorin spezifisch ist, wobei die zweite Komponente eine spezifische Bindungsaffinität entweder für freie Glycoprotein IIbIIIa Rezeptoren oder besetzte Glyco protein IIbIIIa Rezeptoren aufweist und wobei die andere zweite Komponente eine spezifische Bindungsaffinität für P-Selektin aufweist.
  33. Verfahren nach Anspruch 25, das ferner eine weitere andere zweite Komponente enthält, der eine spezifische Bindungsaffinität für ein drittes biologisches Molekül aufweist.
  34. Verfahren nach Anspruch 32, bei dem die erste Komponente für Glycophorin spezifisch ist, wobei die zweite Komponente eine spezifische Bindungsaffinität für freie Glycoprotein IIbIIIa Rezeptoren aufweist, wobei die unterschiedliche zweite Komponente eine spezifische Bindungsaffinität für P-Selectin und die zusätzliche unterschiedliche zweite Komponente eine spezifische Bindungsaffinität für die besetzten Glycoproteine IIbIIIa Rezeptoren aufweist.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002008722A2 (en) * 2000-07-12 2002-01-31 Werner Naser Direct assessment of relative concentrations of variants of an epitope on a dimeric molecule
WO2002004950A2 (en) * 2000-07-12 2002-01-17 Werner Naser Direct assessment of analyte to reference molecule ratios
AU2002227509A1 (en) * 2000-07-27 2002-02-13 Kyowa Medex Co., Ltd. Method of immunity examination with insoluble carrier particle and reagent therefor
DE10211818B4 (de) * 2002-03-16 2006-07-06 peS Gesellschaft für medizinische Diagnose-Systeme mbH Verfahren zur quantitativen Bestimmung mehrerer Analyten
US20040132092A1 (en) * 2003-01-03 2004-07-08 Stetson Christopher M. Determining the density of functional moieties on polymer reagents
US7396689B2 (en) * 2005-02-04 2008-07-08 Decision Biomarkers Incorporated Method of adjusting the working range of a multi-analyte assay
WO2007053594A2 (en) * 2005-10-31 2007-05-10 Clontech Laboratories, Inc. Large dynamic range proteomic analysis methods and compositions for practicing the same
US8180572B2 (en) * 2007-10-25 2012-05-15 Canon U.S. Life Sciences, Inc. High-resolution melting analysis
US9000769B2 (en) 2009-11-23 2015-04-07 Proxim Diagnostics Controlled electrochemical activation of carbon-based electrodes
US20110306148A1 (en) 2010-06-14 2011-12-15 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Composition for use as an assay reagent
EP2737315B1 (de) 2011-07-25 2022-03-16 Proxim Diagnostics Corporation Kartusche für diagnostische tests
TWI480553B (zh) * 2011-08-15 2015-04-11 Univ Nat Cheng Kung 糖化血紅素之偵測方法
JP2017530356A (ja) 2014-09-26 2017-10-12 ソマロジック, インコーポレイテッドSomaLogic, Inc. 心血管系のリスクイベントの予測及びその使用
FI3756009T3 (fi) 2018-02-23 2023-12-01 Meso Scale Technologies Llc Menetelmiä antigeeniä sitovien molekyylien seulontaan normalisoimalla antigeeniä sitovan molekyylin pitoisuus

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3935074A (en) 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US4690890A (en) * 1984-04-04 1987-09-01 Cetus Corporation Process for simultaneously detecting multiple antigens using dual sandwich immunometric assay
US4737453A (en) * 1984-12-12 1988-04-12 Immunomedics, Inc. Sandwich immunoassay utilizing a separation specific binding substance
US4806468A (en) * 1987-02-05 1989-02-21 Becton, Dickinson And Company Measurement of glycosylated hemoglobin by immunoassay
GB8715282D0 (en) * 1987-06-30 1987-08-05 Unilever Plc Analysis
US5429925A (en) * 1988-01-26 1995-07-04 The Regents Of The University Of California Method for immunodiagnostic detection of dioxins at low concentrations
US5028535A (en) * 1989-01-10 1991-07-02 Biosite Diagnostics, Inc. Threshold ligand-receptor assay
SE9002480D0 (sv) * 1990-07-23 1990-07-23 Hans Lilja Assay of free and complexed prostate-specific antigen
AU658374B2 (en) 1990-09-14 1995-04-13 Biosite Diagnostics Incorporated Antibodies to complexes of ligand receptors and ligands and their utility in ligand-receptor assays
US5196309A (en) * 1990-11-15 1993-03-23 The Scripps Research Institute Characterization of platelet aggregation disorders
US5506983A (en) * 1992-07-06 1996-04-09 Microsoft Corporation Method and system for transactioning of modifications to a tree structured file
US6455288B1 (en) 1993-04-08 2002-09-24 Dade Behring Marburg Gmbh Homogeneous immunoassays using mutant glucose-6-phosphate dehydrogenases
DE69417242T2 (de) 1993-09-03 1999-07-08 Behringwerke Ag Fluoreszenz-sauerstoffkanalisation-immunteste
AU1128195A (en) * 1993-10-26 1995-05-22 Mayo Foundation For Medical Education And Research Direct fluorescence-conjugated immunoassay for platelet activation
US5599677A (en) * 1993-12-29 1997-02-04 Abbott Laboratories Immunoassays for prostate specific antigen
US5763199A (en) * 1994-09-29 1998-06-09 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Platelet blockade assay
US5795725A (en) * 1995-04-18 1998-08-18 Biosite Diagnostics Incorporated Methods for the assay of troponin I and T and selection of antibodies for use in immunoassays
US5947124A (en) * 1997-03-11 1999-09-07 Biosite Diagnostics Incorporated Diagnostic for determining the time of a heart attack

Also Published As

Publication number Publication date
US6670196B1 (en) 2003-12-30
US7202042B2 (en) 2007-04-10
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