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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Detektieren des Endes
einer Schwangerschaft durch vorzeitige Wehen und richtet sich insbesondere
auf Tests, die das Einsetzen von Wehen durch Detektion von Hormonspiegeln
vorhersagen.
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Östrogene,
die 18-Kohlenstoff-Steroide mit einem aromatischen A-Ring darstellen,
wobei an Position 3 des A-Rings eine phenolische Hydroxygruppe und
an Position 17 des D-Rings eine funktionelle Sauerstoffgruppe (entweder
Hydroxy oder Carbonyl) angeordnet ist, besitzen verschiedenste Auswirkungen
auf spezifische Zielorgane sowie auf den Körper als Ganzes und wirken
entweder alleine oder in Kombination mit anderen Hormonen. Die meisten Östrogen-Studien
haben sich auf Östradiol
(manchmal als E2 bezeichnet, was auf das
Vorhandensein von zwei Hydroxygruppen hinweist) konzentriert, das
als das wichtigste aktive Östrogen
betrachtet wurde. Östradiol
ist jedoch kein nützlicher
Indikator für
das Einsetzen von Wehen bei schwangeren Frauen, wie dies von Block
et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 150, 716–22 (1984), erläutert wird,
wo kurz und bündig
berichtet wird, dass eine vorzeitige Entbindung nicht durch serielle Östradiol-
(oder Progesteron-) Plasma-Konzentrationsmessungen vorhergesagt
werden kann.
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Östriol (E3) wurde anfänglich als ein oxidatives Abbauprodukt
des Östradiolmetabolismus
betrachtet, obwohl Studien nun gezeigt haben, dass das Auftreten
von biologischen Auswirkungen in Verbindung mit Östriol nicht mit Östradiol
in Zusammenhang stehen. Es ist z. B. bekannt, dass die Östriolproduktion
bei schwangeren Frauen (zumindest teilweise) mit der Plazenta in
Zusammenhang steht. Das Vorhandensein von fremdem Östriol aus
dem Östradiolmetabolismus
hat jedoch die Verwendung von Östriol
als Maß für die Hormonaktivität verhindert. Andererseits
macht die im Verhältnis
zu Östradiol
erhöhte
Löslichkeit
von Östriol
in Körperflüssigkeiten und
dessen daraus resultierende Auftreten in unkonjugierter Form in
einer Vielzahl von Körperflüssigkeiten
dieses Hormon zu einem wünschenswerten
Analyseziel, sobald der Zusammenhang zwischen Östriol und der biologischen
Aktivität
gründlich
erforscht worden ist.
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Die
Beziehung zwischen Östriol
im Speichel und Serumöstriol
während
einer normalen Schwangerschaft wurde von Fischer-Rasmussen et al.,
Acta Obst. Gynecol. Scand. 60, 417–420 (1981), untersucht. In
einer anderen Studie wurden Östriol-
und Progesteronkonzentrationen im Speichel gemessen, um zu ermitteln,
ob sich ein Absinken des Progesteronspiegels oder eine Erhöhung des Östrogen/Progesteron-Verhältnisses
vor Beginn der ersten Wehenphase verändert (siehe Lewis et al.,
J. Endocr. 115, 177–181
(1987)). Diese Studie kam zu dem Schluss, dass die Konzentration
keines der Hormone vor Beginn der ersten Wehenphase abnimmt und dass
das Verhältnis
von Östriol
zu Progesteron für die
letzten zwei Schwangerschaftswochen unverändert bleibt, was die Behauptungen
anderer, dass bei Frauen vor der Geburt ein deutlicher Abfall in
der Progesteronkonzentration auftritt, nicht unterstützt. Evans
et al. beschreiben in Clinical Chemistry 30, 120–121, die Speichelöstriolkonzentrationen
während
normaler Schwangerschaften und einen Vergleich mit Plasmaöstriol.
Die Messung von Plasmaöstriol
während
der Schwangerschaft wird als weithin verbreitetes Verfahren zum Überwachen
des Gesundheitszustands des Fötus
beschrieben, und die Studie wurde durchgeführt, um zu ermitteln, ob Östriolkonzentrationen
in Speichel und Plasma zu obigem Zweck durchgeführte Urinöstriolmessungen ersetzen könnten. Es
liegen jedoch keine Hinweise vor, dass Östriolkonzentrationen mit anderen
klinischen Zwecken als dem Gesundheitszustand des Fötus in Zusammenhang
stehen. Darne et al., British Medical Journal 294, 270–272 (1987),
legen nahe, dass ein erhöhtes Östriol/Progesteron-Verhältnis im
Speichel ein mögliches
Anzeichen für
vorzeitige Wehen sein könnte.
Die komplexe Wechselwirkung dieser zwei Hormone verhindert jedoch
die Nutzung dieser Messung in einem einfachen Test.
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Dementsprechend
ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die Beziehung zwischen Östriolkonzentrationen
in verschiedenen Körperflüssigkeiten
und den zugrundeliegenden biologischen Funktionen umfassend zu erforschen
und diagnostische Tests für Östriol zu
verwenden, um den gegebenen und/oder potentiellen biologischen Zustand
der Patientin, von der die Östriolprobe
entnommen wurde, zu bewerten.
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Furuhashi
et al. (Chem. Abs. 102, 106522m (1985)) bestimmten Serumhormonspiegel
vom Einsetzen spontaner Wehen an und bei normaler, weit fortgeschrittener
Schwangerschaft. Sie legten nahe, dass die Bestimmung von laktogenem
Hormon der Plazenta (HPL) und unkonjugiertem Östriol zur Vorhersage von Wehen
herangezogen werden könnte.
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Darne
et al. (British Med. J. 294, 270–272 (1987)) legten nahe, dass
das Verhältnis
von Östriol zu
Progesteron im Speichel nützlich
sein könnte,
um vorzeitige Wehen vorherzusagen.
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Lachelin
et al. (Brit. J. Obs. and Gyn. 91, 1203–1209 (1984)) beschreiben eine
Untersuchung der Östriolmengen
während
einer normalen Schwangerschaft.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Screenen auf das
potentielle Einsetzen vorzeitiger Wehen bei einer schwangeren Frau
bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
- (a)
das Analysieren einer Körperflüssigkeitsprobe von
der schwangeren Frau, um die Konzentration an unkonjugiertem Östriol in
der Körperflüssigkeit zu
bestimmen;
- (b) das Korrelieren der in Schritt (a) bestimmten Konzentration
mit
- (1) einer vorbestimmten Standard-Konzentration an unkonjugiertem Östriol in
der Körperflüssigkeit bei
normalen Schwangeren, oder
- (2) einer zuvor gemessenen Konzentration an unkonjugiertem Östriol in
der Körperflüssigkeit
der schwangeren Frau, um eine Steigerungsrate der Konzentration
an unkonjugiertem Östriol
in der Körperflüssigkeit
der Schwangeren zu bestimmen; und
- (c) das Herstellen einer Beziehung zwischen einer höheren Konzentration
an unkonjugiertem Östriol in
der Körperflüssigkeit
der Schwangeren und der vorbestimmten Standard-Konzentration an
unkonjugiertem Östriol
oder das Herstellen einer Beziehung zwischen einer erhöhten Steigerungsrate der
Konzentration an un konjugiertem Östriol
in der Körperflüssigkeit
der Schwangeren mit einer Steigerungsrate an unkonjugiertem Östriol bei normalen
Schwangeren als Indikator für
das potentielle Einsetzen vorzeitiger Wehen bei der Schwangeren,
worin beim Herstellen der Beziehung die Progesteron-Konzentration
in der Körperflüssigkeit
nicht berücksichtigt
wird.
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Dies
kann vor der 30. Schwangerschaftswoche durchgeführt werden.
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Dies
kann von der 20. bis zur 36. Schwangerschaftswoche durchgeführt werden.
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Die
Anwendung dieses Verfahrens erfordert keine Bestimmung eines Östriol/Progesteron-Konzentrationsverhältnisses
in der getesteten Körperflüssigkeit,
was vormals als notwendig erachtet worden war, um Östriolkonzentrationen
für die
Bewertung biologischer Zustände
verwenden zu können.
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BESCHREIBUNG
SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Detektieren des Einsetzens
vorzeitiger Wehen bei einer schwangeren Frau bereit, bei dem einfach
die Östriolkonzentration
einer Körperflüssigkeit gemessen
wird. Dieses Verfahren ist einfacher als frühere Verfahren und stellt einen
Test bereit, der von einer Patientin zu Hause durchgeführt werden
kann, wodurch das Bereitstellen von Proben an ein professionelles
Labor, das nicht in der Nähe
der Patientin liegt, umgangen und die daraus resultierende Verzögerung verhindert
werden kann. Der Test kann beispielsweise unter Anwendung eines
einfachen Diagnosesets mit einer Enzymmarkierung an einer einzigen
Speichelprobe durchgeführt
werden. Ähnliche Tests
stehen mittlerweile für
andere Substanzen zur Verfügung,
und ein Labortest aus Östriol,
der radioaktive Markierungen verwendet, ist im Handel erhältlich.
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Bei
dieser Erfindung bestehen keine Beschränkungen hinsichtlich des Testtyps,
der zur Messung von Östriol
verwendet wird. Jeder der derzeit verfügbaren Östrioltests kann verwendet
werden, und es können
auch in Zukunft entwickelte Tests verwendet werden. Beispiele für Östrioltests
sind untenstehend detailliert beschrieben.
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Der
Test kann anhand einer beliebigen Körperflüssigkeitsprobe durchgeführt werden,
wie z. B. Blut (oder Blutbestandteile, insbesondere Serum oder Plasma),
Urin, Zervix- oder Vaginalsekret, Schweiß oder Speichel. Östriol ist
ausreichend wasserlöslich,
so dass es in Flüssigkeiten
im ganzen Körper
verteilt ist. Speichel wird bevorzugt, da eine Probe davon problemlos
entnommen werden kann und da die Detektion, anders als bei Urin,
durch das Vorhandensein von Östrogenkonjugaten
nicht verkompliziert wird.
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Eine „Probe" ist das zu analysierende
Material und ist normalerweise von direktem biologischen Ursprung,
obwohl durch die Vorbehandlung manche der normalen biologischen
Verbindungen, die üblicherweise
mit dem Analyten in Zusammenhang stehen (wie z. B. rote Blutkörperchen,
die bei einer Gesamtblutprobe vom Plasma getrennt werden), entfernt
sein können.
Tests zielen auf die Detektion von freiem Östriol ab, da konjugiertes Östriol eine
verringerte biologische Aktivität
aufweist. Im Speichel liegen etwa 92% des Östriols in freier Form vor,
während
ein Großteil
des Östriols
im Urin als Konjugat vorliegt. Wie Fachleute auf dem Gebiet des
Steroidmetabolismus wissen, ist ein Östriolkonjugat eine Verbindung,
die durch die Bildung einer kovalenten Bindung einer nichtsteroidalen
Verbindung zu Östriol entsteht.
Die Bindung erfolgt üblicherweise über eine Hydroxygruppe
des Steroid-Ringsystems. Die nichtsteroidale Komponente kann anorganisch
(z. B. eine Sulfatgruppe) oder organisch (z. B. eine Glucuronidgruppe)
sein.
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Im
weiteren Sinne der Erfindung gibt es keine Beschränkungen
bezüglich
des Ziehens und Handhabens von Proben, solange Konsistenz beibehalten
wird. Bei manchen Körperflüssigkeiten,
wie z. B. Speichel und Plasma, gibt es nur geringe Tages schwankungen
im Östriolspiegel.
Bei anderen Flüssigkeiten,
v. a. Urin, treten Schwankungen auf, und es wird bevorzugt, die
Schwankungen so gut wie möglich
zu eliminieren, beispielsweise durch das Ziehen von Proben zur gleichen
Tageszeit. Auch andere Verfahren können jedoch angewandt werden,
um die Messkonsistenz von Analyten in klinischen Flüssigkeiten
sicherzustellen. Beispielsweise kann Kreatinin gleichzeitig mit Östriol im
Urin gemessen werden. Kreatinin wird mit einer konstanten Rate in
den Nieren produziert, und die Messung der Kreatininkonzentration
ermöglicht
die Korrektur von Volumsfehlern in Urinproben, wie auf dem Gebiet
weithin bekannt ist.
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Falls
gewünscht
(jedoch nicht erforderlich bei den am breitesten gefassten Anwendungen
der Erfindung) und je nach Quelle der zu untersuchenden Flüssigkeit
kann freies Östriol
von Östriolkonjugaten getrennt
werden. Verfahren für
derartige Trennungen sind auf dem Gebiet bekannt. Siehe z. B. Evan,
N. Z. Med. Lab. Tech. 33, 86 (1979), wo derartige Trennungen sowie
zwei Radioimmuntests beschrieben werden, die zur Messung von Plasmaöstriol dienen.
Diese Trennungen sind im Allgemeinen jedoch schwierig durchzuführen, und
Tests, bei denen keine Trennung erforderlich ist – entweder
aufgrund der Verwendung von spezifischen Antikörpern oder anderen bindenden
Verbindungen, die zwischen freiem und konjugiertem Östriol unterscheiden,
oder da die Probe von einer Quelle stammt, die größtenteils
freies Östriol enthält, wie
z. B. Speichel –,
werden bevorzugt.
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Die Östriolkonzentration
in der untersuchten Flüssigkeit
wird mit einem Standard-Wert
korreliert, um zu bestimmen, wenn Wehen unmittelbar bevorstehen.
Der Standard-Wert ist entweder (1) ein vorbestimmter Bereich von Östriolkonzentrationen
für dieselbe
Körperflüssigkeit
bei normalen Schwangeren in der allgemeinen Bevölkerung, entweder zum entsprechenden
Zeitpunkt der Schwangerschaft oder zu einem spezifischen Zeitpunkt
relativ zum normalen Schwangerschaftsende, oder (2) eine vorher
gemessene Östriolkonzentration
derselben Körperflüssigkeit
bei derselben schwangeren Frau. Eine im Verhältnis zum Standardwert höhere gemessene Östriol konzentration
ist ein Anzeichen für
das potentielle Einsetzen vorzeitiger Wehen. Das Verfahren der Erfindung
erfordert weder die Messung irgendeiner anderen Substanz, wie z.
B. der Progesteronkonzentration in der Körperflüssigkeit, noch ist die Messung
der gesamten Östriolproduktion über einen
Zeitraum notwendig. Messungen des gesamten Östriols über einen gegebenen Zeitraum,
wie z. B. 24 h, können
jedoch, falls gewünscht,
zusammen mit dem Urin verwendet werden.
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„Unmittelbar
bevorstehend" bedeutet
hierin, dass eine Frühgeburt
wahrscheinlich ist. Es ist jedoch nicht möglich, genau zu bestimmen,
wann die Entbindung stattfinden wird, wenn nicht eingegriffen wird.
Die Entbindung tritt im Allgemeinen innerhalb von sechs Wochen nach
dem ersten abnormal hohen Östriolspiegel
auf, wobei die meisten Patientinnen ohne Behandlung wahrscheinlich
in zwei bis drei Wochen gebären.
In manchen Fällen
kann die Entbindung um mehrere weitere Wochen verzögert sein. Eine
statistisch signifikante Erhöhung
in der Östriolkonzentration
einer Körperflüssigkeit
stellt für
einen Arzt jedoch, selbst in Abwesenheit von klinischen Symptomen,
eine frühzeitige
Warnung dar, dass die Wehen wahrscheinlich einsetzen, so dass klinische Symptome
genau überwacht
und/oder das Verhalten der Patientin geändert werden kann (z. B. durch
Vermeiden, dass über
längere
Zeit keine ärztliche
Betreuung erfolgt, oder – bei
hoher bevorstehender Gefahr – durch
Hospitalisierung der Patientin).
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Der
erste allgemeine oben erläuterte
Standard-Wert, nämlich
ein vorbestimmter Bereich von Östriolkonzentrationen
für dieselbe
Körperflüssigkeit bei
normalen Schwangeren im Allgemeinen, wird üblicherweise durch Anwendung
desselben Testverfahrens erhalten, das bei der Anwendung des Verfahrens
auf eine zu untersuchende Einzelperson herangezogen wird, um eine
höchstmögliche Korrelation sicherzustellen.
Bei schwangeren Frauen aus der Normalbevölkerung werden ausreichend
Messungen durchgeführt,
um einen statistisch signifikanten Bereich von Normalwerten für den Wert,
der einem Vergleich unterzogen wird, zu erhalten, wobei die Messungen üblicherweise
in vorbestimmten Zeitintervallen während einer normalen Schwan gerschaft
erfolgen. Obwohl der Vergleich oft mit einer Zeit unmittelbar vor
der normalen Geburt (38. bis 40. Woche) durchgeführt wird, können auch andere Zeiträume herangezogen
werden. Beispielsweise können Östriolmengen
während
einer bestimmten Woche einer individuellen Schwangerschaft (d. h.
der der jeweiligen Patientin) mit dem normalen Konzentrationsbereich
für denselben
Zeitraum (z. B. in der 20. Woche) verglichen werden. Im Allgemeinen
sollte die Minimalkonzentration, die den möglichen Beginn der Wehen anzeigt,
zumindest eine, vorzugsweise zumindest zwei, noch bevorzugter zumindest
drei und insbesondere zumindest vier Standardabweichungen über der
für eine
bestimmte für
den Vergleich ausgewählte
Körperflüssigkeit
mittleren Östriolkonzentration
liegen, wie z. B. für
eine Zeit unmittelbar vor dem Einsetzen der Wehen bei normalen Schwangeren.
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Für Fachleute
auf dem Gebiet der Statistik ist es offensichtlich, dass die Anzahl
der Standardabweichungen, die als Anzeichen für Komplikationen bei der Schwangerschaft
herangezogen werden, mit einem geeigneten Diagnoseziel im Hinterkopf
ausgewählt
werden. Ein Bereich von einer Standardabweichung über und
unter dem Mittelwert würde
z. B. etwa 68% der normalen Proben umfassen, d. h. es würde erwartet
werden, dass 32% der normalen Proben außerhalb der durch eine Standardabweichung vom
Mittelwert festgelegten unteren und oberen Grenzwerte liegen (16
würden
erwartungsgemäß über der
Auswahlgrenze liegen). Eine Standardabweichung über dem normalen Mittelwert
wird somit nicht für
eine definitive Analyse verwendet, da dabei zu viele fälschlich
positive Werte eingeschlossen wären.
Eine Standardabweichung ist jedoch für einen Test geeignet, durch
den sämtliche
mögliche
Patientinnen, bei denen es zu vorzeitigen Wehen kommen kann, für weitere
Untersuchungen herausgefiltert werden sollen, oder dieser Grenzwert
kann für
Patientinnen gewählt
werden, die bekannterweise normale oder niedrige Östriolwerte
und relativ geringe Schwankungen zwischen den Proben aufweisen. Eine
Standardabweichung kann auch bei einer Patientin gewählt werden,
die bekannterweise Probleme mit vorzeitigen Wehen hat, um zu bestimmen,
wann die Patientin unter kontrollierten Bedingungen genauer überwacht
werden soll (wie z. B. durch Einweisen der Patientin in ein Krankenhaus
zur konstanten Überwachung).
Zwei Standardabweichungen vom Mittelwert würden etwa 95% der normalen
Proben umfassen, drei Standardabweichungen etwa 99% und vier Standardabweichungen
mehr als 99%. Diese Werte eignen sich besser für allgemeine Zwecke, insbesondere
für Patientinnen,
deren Östriolspiegel bekannterweise
normal oder leicht über
dem Normalwert liegt oder von Probe zu Probe schwankt, sowie für Tests
mit hoher Varianz. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Östriolmengen,
die bei oder über
einem vorbestimmten erhöhten
Grenzwert liegen (für
z. B. mehr als zumindest 12 h, vorzugsweise zumindest 24 h, insbesondere
zumindest 72 h) bevorzugt als Anzeichen für das wahrscheinliche Einsetzen
der Wehen herangezogen.
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Es
ist nicht erforderlich, die Untergrenze für den Hinweis auf Wehen (Obergrenze
des Normalbereichs) in Standardabweichungen auszudrücken. Es kann
ein beliebiges anderes System, das einen statistisch signifikanten
Hinweis auf das wahrscheinliche Einsetzen von Wehen bereitstellt,
verwendet werden. Der Grenzwert kann z. B. so festgesetzt werden,
dass er einer Konzentration entspricht, die zumindest so hoch wie
die 95. Perzentil-Konzentration bei normalen Patientinnen für dieselbe
Körperflüssigkeit
für eine
normale Schwangerschaft ist. In vielen Fällen wird vorzugsweise ein
Normalwert von der 38.–42.
Woche bei normalen Schwangerschaften, noch bevorzugter von der 40.
Woche, ausgewählt und
die Konzentration beginnend mit der 30. Woche oder noch früher überwacht.
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Aufgrund
der zahlreichen unterschiedlichen möglichen klinischen Ziele wird
der tatsächliche Östriolspiegel,
der auf das wahrscheinliche Einsetzen vorzeitiger Wehen hinweist,
am besten vom behandelnden Arzt gewählt, nachdem dieser die Daten
von mehreren Proben der Patientin während des Anfangs der Schwangerschaft
gesammelt hat und den Zeitpunkt, an dem die Messung erfolgt ist,
berücksichtigt hat.
Bei einer normalen Schwangerschaft in der 30. Woche ist z. B. die
bei der Östriolkonzentration
vor dem Beginn der Wehen zu erwartende Veränderung geringer als zwei Standardabweichungen
von der mittleren Östriolkonzentration
in der 30. Woche.
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Während also
bei Tests im ersten Schwangerschaftsabschnitt (vor der 30. Woche)
drei oder vier Standardabweichungen als Anzeichen für das Einsetzen
der Wehen verwendet werden können, wären zu einem
späteren
Zeitpunkt der Schwangerschaft (z. B. nach der 30. Woche), je nach
Gesundheitszustand der Patientin, anderen klinischen Anzeichen bei
der Mutter, die dem behandelnden Arzt bekannt sind, und Gesundheitszustand
des Fötus, zwei,
eineinhalb oder sogar nur eine Standardabweichung ausreichend. Es
ist natürlich
die früheren
Stadien einer Schwangerschaft, denen aufgrund der fehlenden Entwicklung
des Fötus
und des hohen Risikos des Kindstods nach dem Wochenbett besondere
Beachtung geschenkt werden muss, um vorzeitige Wehen zu verhindern.
Als vorzeitige Wehen werden somit jegliche Wehen vor Ende der 40.
Schwangerschaftswoche, vorzugsweise vor dem Beginn der 38. Woche
nach der Empfängnis,
bezeichnet. Das Verfahren der Erfindung wird vorzugsweise für Schwangerschaften
in der 20. bis 36. Woche verwendet, wenn das Verlängern der
Schwangerschaft selbst für einen
kurzen Zeitraum äußerst wirksam
ist, um die Auswirkungen einer Frühgeburt zu verringern.
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Auf ähnliche
Art und Weise und unter denselben Einschränkungen wie oben erwähnt kann
eine Testkonzentration von zumindest 1, vorzugsweise zumindest 2,
noch bevorzugter zumindest 3 und insbesondere zumindest 4 Standardabweichungen über der
mittleren normalen Konzentration für dasselbe Schwangerschaftsstadium
auch als Anzeichen für eine
abnormale Schwangerschaft und somit als Anzeichen eines möglichen
Einsetzens von Wehen verwendet werden, obwohl die Wahrscheinlichkeit
geringer ist, wenn die gemessene Menge den für die 38. – 42. Woche als normal erachteten
Wert nicht erreicht.
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Standardwerte
variieren in Abhängigkeit
von der jeweiligen Körperflüssigkeit,
deren Konzentration gemessen wird, und dem spezifischen verwendeten Testverfahren
(jedoch mit einem geringeren Ausmaß). Typische Minimalwerte,
die das Einsetzen von Wehen anzeigen, sind für Tests, die das unkonjugierte Östriol messen,
für die
jeweiligen Körperflüssigkeiten
(sämtliche
Konzentrationen sind in nM angegeben) wie folgt: Speichel zumindest
3, vorzugsweise zumindest 5, noch bevorzugter zumindest 7; Serum 30,
vorzugsweise zumindest 35, noch bevorzugter zumindest 45.
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Als
Alternative zum Vergleich von Östriolkonzentrationen
mit denen der normalen Bevölkerung kann
eine vorher in derselben Körperflüssigkeit
derselben Schwangeren gemessene Östriolkonzentration
als Vergleichsstandard herangezogen werden. Hierbei wird normalerweise
die Steigerungsrate der Östriolkonzentration
in der untersuchten Flüssigkeit ermittelt.
Ein positiver Test (d. h. ein Anzeichen, dass das Einsetzen von
Wehen unmittelbar bevorsteht) liegt dann vor, wenn die gemessene
Konzentration eine vorher gemessene Östriolkonzentration, die in derselben
Körperflüssigkeit
derselben schwangeren Frau bestimmt wurde, innerhalb von einer Woche
um 50%, vorzugsweise 75%, noch bevorzugter 100%, übersteigt.
Wiederum wird die Auswahl einer bestimmten Steigerungsrate, die
als Untergrenze für das
Einsetzen von Wehen angenommen wird, am besten vom behandelnden
Arzt für
den jeweiligen erwünschten
Zweck durchgeführt.
Ein Screening-Test z. B., durch den potentielle Problempatientinnen
herausgefiltert werden sollen, um im Krankenhaus weiterer Beobachtungen
und Untersuchungen unterzogen zu werden, könnte eine 50%ige Steigerung
als Grenze auswählen,
damit fälschlich
negative Ergebnisse verhindert werden, während die Probleme in Zusammenhang
mit dem Einschließen
einer relativ großen
Anzahl an fälschlich
positiven Ergebnisse akzeptiert werden. Höhere Prozentzuwächse als
das minimale positive Anzeichen sind für Heimtests und dergleichen
besser geeignet, und zwar auf dieselbe Art wie oben beschrieben
als Standardabweichungen vom normalen Bevölkerungsmittelwert. Steigerungen
in der Östriolkonzentration,
die die Standards dieses Absatzes erfüllen und zudem Werte erreichen,
die vorhergehend als Anzeichen für
das Einsetzen von Wehen bei normalen Patientinnen angegeben wurden,
weisen mit hoher Wahrscheinlichkeit auf das unmittelbar bevorstehende
Einsetzen von Wehen hin.
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Es
versteht sich für
Fachleute auf dem Gebiet der klinischen Analyse, dass Tests auf
einen gegebenen Analyten, einschließlich dieses Östrioltests, vom
behandelnden Arzt nicht ohne zusätzliche
Information durchzuführen
oder zu interpretieren sind. Zudem sind die Ergebnisse jedes Tests
am besten als Anzeichen für
die Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins eines klinischen Zustands
anzusehen und nicht als absoluter Beweis. Dasselbe gilt bei der
vorliegenden Erfindung. Ein Anzeichen für eine erhöhte Wahrscheinlichkeit des
Einsetzens der Wehen ist trotzdem eine klinisch wertvolle Information
und kann von einem medizinischen Fachmann in Kombination mit weiterer
Information für
die bessere Pflege von Patientinnen verwendet werden, als dies möglich wäre, wenn
diese Information nicht verfügbar
wäre.
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Ein
bevorzugter Test zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung wird
in der WO 93/20448 beschrieben. Dieser Test verwendet eine Enzym-markierte
Komponente (hierin ein markiertes Östriolmolekül oder ein Derivat davon) in
einem kompetitiven Bindungsassay auf Östriol. Der Test ist ein nichtinstrumentierter
Enzym-Immuntest, der „vorhanden/nicht vorhanden"- oder „Schwellenwert"-(+/–)-Analysewerte
bei einem vorbestimmten Grenzwert bereitstellt und somit für die Verwendung
in der vorliegenden Erfindung gut geeignet ist.
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In
einem typischen Test unter Verwendung dieses Verfahrens umfasst
die Enzym-markierte, kompetitive
Bindungsverbindung Östriol
(oder den Abschnitt davon, der verwendet wird, um den im Test verwendeten
Antikörper
zu erzeugen), das an das Immunogen gebunden ist, das verwendet wird,
um den Antikörper
des Tests zu erzeugen. Eine Enzym-Markierung ist an diese Gruppierung
gebunden, und zwar vorzugsweise durch einen sterisch anspruchsvollen
Linker wie einen Avidin-Biotin-Komplex. Die Verwendung einer solchen
kompetitiven Bindungsverbindung ermöglicht den Einsatz von Antikörpern, ohne
dass die Bindungsaffinität
des Antikörpers
an den Konkurrenten manipuliert wird, während dennoch die für eine „+/–"-Analyse notwendige steile
kompetitive Bindungskurve bereitgestellt wird.
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Bei
einem typischen Test ist ein Antikörper auf einer festen Oberfläche, wie
z. B. einem Mikrotiterplatten-Napf, einem Reagenzglas oder einem
porösen
Reagensstrei fen (wie z. B. Cellulose- oder Glasfasern), aufgebracht.
Die mit dem Antikörper
beschichtete feste Fläche
wird dann gleichzeitig mit einer Probe und einer kompetitiven Bindungsverbindung
in Kontakt gebracht. Indem weniger Antikörper-Bindungsstellen bereitgestellt
werden als beim kombinierten Analyt und der kompetitiven Bindungsverbindung
vorhanden sind, wird nur ein Teil der gelösten Moleküle an die feste Oberfläche binden. Wenn
keine Analyt-Moleküle
vorhanden sind, werden alle Bindungsstellen durch die kompetitiven
Bindungsverbindungen eingenommen, so dass eine maximale Enzymmenge
an der festen Oberfläche
haftet. Wenn ein Substrat für
das Enzym mit der festen Fläche
in Kontakt gebracht wird, nachdem die Probe abgewaschen worden ist,
stellt die Reaktion des Enzyms mit dem Substrat ein detektierbares
Signal (normalerweise die Bildung einer Farbe) bereit, das dem Benutzer
anzeigt, dass kein Analyt in der Probe vorhanden ist (ein negatives
Ergebnis). Wenn ein Analyt in der Probe vorliegt, stellt der Analyt
eine Konkurrenz im Kampf um die Bindungsstellen dar, so dass ein
geringerer Anteil des Enzym-markierten Konkurrenten binden kann.
Durch Verwendung einer sterisch anspruchsvollen Bindungsverbindung,
die weniger schnell an den Antikörper
bindet als der Analyt, und durch geeignetes Auswählen der Anzahl an Bindungsstellen
im Verhältnis
zur zugeführten
Probenmenge (was für
Fachleute auf dem Gebiet ein Standardverfahren ist), schließt ein Analyt,
der in einer Konzentration über
einem vorbestimmten Minimalwert vorliegt, aus, dass die kompetitive
Bindungsverbindung und somit das Enzym an das feste Substrat binden.
Ein Beispiel eines solchen Auswahlverfahrens zum Bereitstellen unterschiedlicher
Schwellenwerte ist in der angeführten
Patentanmeldung für Östradiol
erläutert.
Dasselbe Auswahlverfahren kann mit Östriol verwendet werden, um
einen Test der Erfindung durchzuführen. Wenn ausreichend Analyt
in der Probe vorhanden ist, ist somit nach der Reaktion kein Enzym
vorhanden, um eine Farbveränderung hervorzurufen,
und das Reaktionsgemisch bleibt dasselbe (somit ist eine positive
Reaktion unter Verwendung dieses Reaktionsschemas gegeben).
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Es
können
andere Reaktionsschemata verwendet werden, bei denen die Entwicklung
einer Farbe das Vorhandensein des Analyten anzeigt. Das vorherige
Beispiel ist lediglich eine von vielen Arten von kompetitiven Bindungsassays,
mit denen Östriol gemessen
werden kann.
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Die
Antikörperproduktion
zur Verwendung in einem Test für Östradiol
ist ein herkömmliches
Verfahren und wird hierin nicht im Detail beschrieben. Verfahren
zum Produzieren von Antikörpern
sind in der Literatur weithin bekannt, und Beispiele dafür sind die
Publikation „Antibodies:
A Laboratory Manual" (Harlow
und Lane, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratories Press (1988)) sowie
die US-A-4.381.292, 4.451.570 und 4.618.577. Für ein Beispiel der Antikörperproduktion
spezifisch für Östradiol
siehe Lasley et al., Fertility and Sterility 43, 861–867 (1985), und
Munro et al., Abstract, Society for Gynecologic Investigation, San
Diego (März
1989). Dieselben Verfahren können
zur Erzeugung von Antikörpern
gegen Östriol
verwendet werden. Eine kurze Erläuterung allgemeiner
Verfahren zur Produktion von Antikörpern, die spezifisch für Steroide
sind, wird für
Personen, die mit dem Verfahren nicht bekannt sind, angeführt.
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Einem
Tier wird eine Zusammensetzung mit Östriol, das kovalent an ein
Immunogen, üblicherweise
ein Protein, gebunden ist, das wie oben beschrieben hergestellt
ist, injiziert. Mehrere Injektionen oder die Verwendung eines Adjuvans
stellt die maximale Stimulation des Immunsystems und die Produktion von
Antikörpern
sicher. Wenn polyklonale Antikörper erwünscht sind,
können
diese hergestellt werden, indem einfach Blut vom immunisierten Tier
entnommen wird und die Antikörper
durch Standard-Verfahren von
den anderen Blutbestandteilen getrennt werden. Um monoklonale Antikörper zu
erhalten, werden die Milz oder Lymphozyten aus dem immunisierten
Tier entfernt und immortalisiert oder zur Herstellung von Hybridomzellen
durch Zellfusionsverfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt
sind, verwendet. Von den immortalisierten Zellen sekretierte Antikörper werden
gescreent, um die Klone zu ermitteln, die Antikörper der erwünschten
Spezifität
sekretieren. Für
monoklonale Anti-Östriol-Antikörper müssen die Antikörper an Östriol binden.
Zellen, die Antikörper der erwünschten
Spezifität
produzieren, werden selektiert, geklont und gezüchtet, um die erwünschten monoklonalen
Antikörper
herzustellen.
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Für die Verwendung
in einem Test der Erfindung können
Antikörper
mittels bekannter Verfahren zum Binden von Proteinmaterial auf einer
festen Oberfläche
aufgebracht werden. Die feste Halterung kann Kunststoffflächen von
Reagenzgläsern
oder Mikrotiterplatten, polymere Beads, Pegelstäbe oder Filtermaterialien einschließen. Die
Bindungsverfahren schließen
die nicht spezifische Adsorption des Proteins durch den Träger und
das kovalente Binden des Proteins, üblicherweise durch eine freie
Aminogruppe, an eine chemisch reaktive Gruppe auf der festen Halterung,
wie z. B. eine aktivierte Carboxy-, Hydroxy- oder Aldehydgruppe,
ein.
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Durch
Detektion des wahrscheinlichen Einsetzens vorzeitiger Wehen, wie
hierin beschrieben wird, kann ein Arzt vorhandene Verfahren zum
Hinauszögern
der Wehen anwenden, um eine Frühgeburt
und das daraus resultierende hohe Risiko des Kindstods zu verhindern.
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Das
folgende Beispiel wird als Illustration angeführt und ist nicht eingrenzend
zu verstehen.
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BEISPIEL
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Erhöhter Östriolspiegel bei einer Patientin,
die später eine
Frühgeburt
hat
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Messungen
des Östriols
im Speichel wurden bei einer Reihe von Patientinnen durchgeführt, die anfänglich asymptomatisch
für eine
Frühgeburt
waren, jedoch aufgrund von früheren
Frühgeburten
oder Gebärmutterabnormalitäten ein
erhöhtes
Risiko für eine
Frühgeburt
aufwiesen. Die Östriolmessung
erfolgte durch Celite-Chromatographie. In dieser Studie wurden 5
nM Östriol
im Speichel als Grenzwert für
den Hinweis auf das wahrscheinliche Einsetzen einer Frühgeburt
angesehen. Das Schwangerschaftsstadium wurde anhand des Datums der
letzten Menstruation ermittelt.
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Bei
mehreren Patientinnen wurde das Kind vollständig ausgetragen. In diesen
Fällen
blieben die Östriolmengen
im Speichel vor der 32. Woche unter 5 nM. Andere Patientinnen wiesen
eine Steigerung über
den angegebenen Grenzwert auf. Diese werden hier jedoch nicht angeführt, da
sie auch klinische Symptome aufwiesen und mit Tocolytika behandelt wurden,
um die Geburt hinauszuzögern.
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Eine
Patientin wurde nicht mit Tocolytika behandelt und hatte eine Frühgeburt
nach der 36. Woche und 5 Tagen. Diese Patientin war manisch-depressiv
und erhielt das anti-psychotische Medikament Haldol. Der Speichel
dieser Patientin wurde nach 25 Wochen und 5 Tagen analysiert und
wies eine Östriolkonzentration
von 2,3 nM auf (im normalen Bereich). Die Patientin zeigte keinen
klinischen Symptome (Gebärmutterkontraktionen,
Zervixveränderungen
oder spontanes Reißen
von Häutchen)
bei der anfänglichen
Untersuchung. Etwa eine Woche später (26
Wochen 4 Tage) stieg der Östriolspiegel
auf 7,7 nM, wiederum ohne klinische Symptome. Das Speichelöstriol war
auch nach 27 Wochen 4 Tagen hoch (6,4 nM), fiel jedoch nach 28 Wochen
6 Tagen auf 3,1 nM. Das Östriol
im Speichel stieg nach 30 Wochen und 4 Tagen wieder auf über 5 nM
(5,2 nM). Die Patientin zeigte nach 31 Wochen 5 Tagen zum ersten Mal
klinische Symptome (unregelmäßige Gebärmutterkontraktionen,
jedoch keine Zervixveränderung und
kein Reißen
von Membranen) und wurde dieses Mal aufgrund schwerer bipolarer
Depressionen hospitalisiert. Die Östriolkonzentration war zu
diesem Zeitpunkt leicht gesunken, und zwar auf 4,3 nM. Nach der
Probe von Woche 31 und 5 Tagen lagen keine Speichelproben zum Bestimmen
des Östriols mehr
vor. Die Patientin hatte nach 36 Wochen und 5 Tagen eine Frühgeburt.
Während
der Zwischenphase, in der die Östriolkonzentration
im Speichel nicht gemessen wurde, zeigte die Patientin normale Symptome
einer bevorstehenden Geburt (z. B. Zervix-Dilatation von 1 cm nach
34 Wochen 5 Tagen und von 2 cm am Tag der Entbindung).
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Wie
aus diesen Daten ersichtlich ist, erfolgte eine Steigerung der Östriolkonzentration
im Speichel mehrere Wochen vor den klinischen Anzeichen einer unmittelbar
bevorstehenden Geburt (26 Wochen 4 Tage für erhöhtes Östriol vs. 31 Wochen 5 Tage
für klinische
Symptome). Eine statistisch signifikante Steigerung der Östriolkonzentration
in einer Körperflüssigkeit
warnt den Arzt vorzeitig vor dem wahrscheinlichen Einsetzen von
Wehen, selbst wenn keine klinischen Symptome vorliegen.