DE2743445C2

DE2743445C2 - Immunchemisches Haptenmeßverfahren durch Agglutinationshemmung

Info

Publication number: DE2743445C2
Application number: DE2743445A
Authority: DE
Inventors: Takashi Tokyo Kudo; Ei Tokyo Mochida; Nobuhisa Omiya Saitama Ogawa; Hiroyuki Kawagoe Saitama Shinkai
Original assignee: Mochida Seiyaku Kk Tokyo Jp
Current assignee: Mochida Seiyaku Kk Tokyo Jp
Priority date: 1976-09-29
Filing date: 1977-09-27
Publication date: 1982-07-08
Also published as: NL178280B; US4308026A; JPS5734904B2; FR2366569B1; NL178280C; FR2366569A1; GB1586506A; DE2743445A1; NL7710666A; JPS5341420A

Description

In neuerer Zeit ist eine klinische Testmethode oder Diagnose in den Vordergrund getreten, bei welcher der pathologische Zustand oder die pathologische Prognose eines Patienten beurteilt oder die Arzneimitteldosis, die an den Patienten verabreicht werden soll, in der Weise bestimmt wird, dass der Gehalt des Urins oder des Blutes an einer physiologisch aktiven Substanz mit niederem Molekulargewicht gemessen wird, die in seinem Körper als Hapten sowie seiner Metaboliten oder eines an den Patienten verabreichten Arzneimittels sowie seiner Metaboliten vorliegt.

Die bei der Durchführung dieser klinischen Testmethode oder Diagnose zu messenden Haptene sind beispielsweise folgende: Androgene, wie Testosteron, Dehydroepiandrosteron, Androsteron, Glucocorticoide, wie Cortison, Cortisol, Corticosteron, Mineralcorticoide, wie Aldosteron, Progestogene, wie Progesteron, Östrogene, wie Östriol, Östradiol, Thyroidhormone, wie Thyroxin, Trijodthyronin, Prostaglandin, physiologisch aktive Amine, wie L-Dopa, Epinephrin, Norepinephrin, Histamin sowie ihre Metabolite.

Die bei dieser Testmethode oder Diagnose zu messenden Arzneimittel sind folgende: Arzneimittel, deren Dosis mit äußerster Vorsicht ermittelt werden sollte, und deren Wirkungen eine Beziehung zu ihrer Konzentration in dem Blut oder Urin aufweisen, beispielsweise Digitaliszubereitungen, Antibiotika, wie Tetracyclin, psychotrope Mittel, wie Amphetamin, Narkotika, wie Morphin, Blutkoagulationsmittel sowie Antikoagulationsmittel.

Unter dem Begriff "Hapten" ist erfindungsgemäß eine physiologisch aktive Substanz mit niederem Molekulargewicht zu verstehen, die in dem menschlichen Körper vorliegt, sowie ihre Metabolite, oder ein Arzneimittel, das an den menschlichen Körper verabreicht wird, sowie seine Metabolite, wobei eine derartige Substanz allein nicht in der Lage ist, einen Antikörper zu erzeugen und dann, wenn sie an eine Trägersubstanz gebunden ist, die selbst ein Antigen ist, wie ein Protein, Polysaccharid oder Glycoprotein, einen Antikörper zu erzeugen vermag.

Gewöhnlich treten die Haptene in Spurenmengen auf, wobei sie als komplexgebundene oder konjugierte Formen in Blut oder Urin mit komplizierter Zusammensetzung vorliegen. Daher ist ein aufwendiges und zeitraubendes Verfahren zu ihrer Ermittlung und Messung erforderlich.

Um diese Haptene zu messen, kann man sich verschiedener Methoden bedienen, und zwar physikalisch-chemischer Verfahren, immunchemischer Verfahren oder konkurrierender Proteinbindeverfahren.

Immunchemische Verfahren sind mittlerweile bezüglich der Reaktionsspezifität und der Meßempfindlichkeit dem physikalisch-chemischen Verfahren überlegen. Derzeit sind zahlreiche immunchemische Methoden zur Messung von Haptenspuren im menschlichen Körper bekannt, beispielsweise Agglutinationshemmungsverfahren, der Radioimmunoassay (nachfolgend als RIA abgekürzt) sowie der Enzymimmunoassay (nachfolgend als EIA bezeichnet). Bei einem bekannten EIA-Verfahren werden mit dem Antikörper zu dem zu messenden Hapten sensibilisierte Teilchen und ein Kopplungsprodukt des Haptens mit einer Trägersubstanz verwendet (DE-OS 21 55 658).

Bei der Durchführung eines Agglutinationshemmungsverfahrens wird ein Kopplungsprodukt aus einem Hapten, welches das gleiche Hapten wie das zu messende Hapten darstellt und Trägersubstanz, wie einem Protein, einem Polysaccharid oder einem Glykolprotein, gebunden an feste Teilchen, z.B. Blutzellen oder Latex mit hohem Molekulargewicht als Antigen verwendet. Ein Antikörper zu dem zu messenden Hapten wird aus einem Antiserum erhalten, das aus Säugetieren gewonnen wird, beispielsweise Meerschweinchen, Kaninchen oder Schafen, die mit dem Kopplungsprodukt aus dem Hapten und der Trägersubstanz immunisiert worden sind.

Wird der Antikörper mit den feinen Teilchen, an welche Haptenträgerkonjugate gekoppelt sind, vermischt, dann erfolgt eine Agglutinationsreaktion zwischen diesen zwei Komponenten. Die Agglutinierungsreaktion wird bei Vorliegen des zu messenden Haptens in der Probe inhibiert. Dieses Verfahren ist ein äußerst einfaches Verfahren, das in der Lage ist, das in Form eines Komplexes oder Konjugates in Blut oder Urin vorliegende Hapten zu messen, ohne dass dabei komplizierte Verfahrensmaßnahmen, wie eine Hydrolyse oder Chromatographie, erforderlich sind. Die Empfindlichkeit dieses Verfahren beträgt ungefähr 100 mg/ml, und zwar auch dann, wenn Blutzellen als Teilchen verwendet werden. Da aber die meisten Haptene, deren Messung im menschlichen Körper von Interesse ist, in einer Menge zwischen 500 pg/ml und 50 ng/ml vorliegen, müssen sie zur Durchführung einer erfolgreichen Messung konzentriert werden.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines neuen immunchemischen Haptenmeßverfahrens durch Agglutinationshemmung, das eine höhere Meßempfindlichkeit als die bekannte Methode aufweist.

Diese Aufgabe wird durch die im Anspruch 1 gekennzeichnete Erfindung gelöst.

Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Patentansprüchen 2 bis 5 beschrieben.

Während bei der herkömmlichen Agglutinationshemmungsmethode mit einem mit dem Träger gekoppelten Hapten sensibilisierte Teilchen verwendet werden, werden erfindungsgemäß mit dem Antikörper zu dem Hapten sensibilisierte Teilchen verwendet. Das mit dem Träger gekoppelte Hapten braucht nicht an Teilchen gebunden zu sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist es jedoch ebenfalls an feine Teilchen gebunden.

Zur Durchführung der Erfindung wird gewöhnlich ein bestimmtes Volumen der Körperflüssigkeit oder des Exkretes, welche bzw. welches das zu messende Hapten enthält, entnommen und direkt als Testlösung eingesetzt oder entsprechend auf verschiedene Konzentrationsgrade verdünnt, worauf man die Reaktion zwischen einem gegebenen Volumen der Testlösung und einem gegebenen Volumen einer mit dem Antikörper sensibilisierten Teilchensuspension ablaufen lässt. Dann wird ein gegebenes Volumen des mit dem Träger gekoppelten Haptens dieser Reaktionsmischung zugesetzt. Nach einer bestimmten Reaktionszeitspanne wird das Agglutinationshemmungsmuster ermittelt. Aus dem Verdünnungsfaktor der Testlösung und der Meßempfindlichkeit dieses Verfahrens wird der Haptengehalt in der Testlösung bestimmt.

Die Antikörper zu dem Hapten werden in bekannter Weise wie folgt erhalten: Ein Hapten wird an eine Trägersubstanz gekoppelt. Ein Antiserum wird aus einem Tier erhalten, das nach einer Routinemethode mit dem mit dem Träger gekoppelten Hapten als Antigen erhalten worden ist. Die Antikörper zu dem Hapten werden in der Weise gewonnen, dass durch Absorption die anderen Antikörper, d.h. die Antikörper zu dem Träger und/oder der konjugierten Stelle zwischen dem Träger und dem Hapten entfernt werden. Als Trägersubstanzen kann man beliebige Materialien verwenden. Gute Ergebnisse werden erhalten, wenn die Trägersubstanzen eine hohe Antigenwirkung aufweisen. Erwähnt seien beispielsweise Rinderserumalbumin (abgekürzt als BSA), menschliches Serumalbumin (HSA), Rinder-kleines Gamma-globulin (BGG), Tetanustoxoid, Glutaminsäure/Lyson/Tyrosin-Copolymere oder pneumokokkale Polysaccharide.

Als zu sensibilisierende Teilchen sind feinteilige Träger, wie sie normalerweise zur Durchführung von immunchemischen Agglutinationsreaktionen oder Agglutinationshemmungsreaktionen eingesetzt werden, wie Blutzellen, hochmolekulares Latex, Kaolinit, Bentonit oder Aktivkohle verfügbar. Zur Sensibilisierung dieser Teilchen werden der Antikörper zu dem nach den vorstehend beschriebenen Methoden erhaltenen Hapten in Form einer 0,001- bis 1,0%igen Lösung mit einer 2- bis 20%igen Suspension der zu sensibilisierenden Teilchen in gleichen Mengen vermischt und zu einer Umsetzung während einer Zeitspanne von 30 bis 90 Minuten bei 25 bis 56°C gebracht.

Das zur Erzeugung eines Antikörpers zu dem Hapten eingesetzte mit dem Träger gekoppelte Hapten sowie das mit dem Träger gekoppelte Hapten, das im Meßverfahren verwendet wird, können voneinander in dem Trägerteil und/oder an der Kopplungsstelle zwischen der Trägersubstanz und dem Hapten verschieden sein. Das Hapten in dem mit dem Träger gekoppelten Hapten zur Gewinnung eines Antikörpers zu dem Hapten und das Hapten in dem im Meßverfahren verwendeten mit dem Träger gekoppelten Hapten sind nicht in notwendiger Weise auf das gleiche zu messende Hapten beschränkt, vorausgesetzt, dass die Spezifität der Messung beibehalten wird. Es kann sich um verschiedene Substanzen handeln, die eine immunchemische Querreaktion zeigen.

Die erfindungsgemäß zu messenden Haptene sind beispielsweise die nachstehend erwähnten Haptene: Androgene, Östrogene, Progestogene, Corticoadrenalhormone, Thyroidhormone, physiologisch aktive Amine, wie Epinephrin, Histamin oder Serotonin sowie ihre Metabolite, Arzneimittel, wie Morphin, luteinisierende Hormone freisetzende Hormone, Diphenylhydantoin sowie ihre Metabolite.

Im Vergleich zu der herkömmlichen Methode bietet die Erfindung eine außergewöhnlich hohe Meßempfindlichkeit. Diese hohe Empfindlichkeit geht, wie man annimmt, obwohl ihr Mechanismus noch nicht restlos aufgeklärt ist, auf die Tatsache zurück, dass der Hapten-Antikörper, mit dem das Teilchen sensibilisiert worden ist, als multivalente Bindung wirkt.

Dies lässt sich auch aufgrund der Tatsache erklären, dass die Meßempfindlichkeit noch weiter erhöht werden kann, wenn auch das Haptenträgerkonjugat an feine Teilchen gebunden ist. Erfindungsgemäß ist die Beurteilung einfach, da die Muster der Agglutination sowie der Agglutinationshemmung deutlich verschieden sind, was ebenfalls auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass der Antikörper zu dem Hapten als multivalente Bindung wirkt.

Erfindungsgemäß sind nur kleine Mengen an dem Antikörper zu dem Hapten und dem mit dem Träger gekoppelten Hapten erforderlich. Diese Substanzen lassen sich daher ökonomisch einsetzen. Beispielsweise kann der Verbrauch an einem bestimmten mit dem Träger gekoppelten Hapten, und zwar Östriolglucuronid-BSA, das schwierig herzustellen und daher teuer ist, auf ungefähr 1/100 bis 1/1000 der Menge herabgesetzt werden, die zur Durchführung der herkömmlichen Methode erforderlich ist.

Im Gegensatz zu der herkömmlichen Methode ermöglicht die Erfindung die Verwendung von Antikörpern zu dem Hapten mit niedrigem Titer. Im allgemeinen sind die Antikörper zu dem Hapten schwierig herzustellen, insbesondere Antikörper zu dem Hapten mit einem hohen Titer. Werden Antikörper zu dem Hapten mit einem niedrigen Titer verwendet, dann kann infolge einer bewirkten nichtspezifischen Agglutinierungsreaktion die Messung selbst nicht durchgeführt werden. Auch dann, wenn sie durchgeführt werden kann, ist die Meßempfindlichkeit niedrig. Erfindungsgemäß wird dagegen sogar bei Verwendung von Antikörpern zu dem Hapten mit einem niedrigen Titer die Meßempfindlichkeit nicht geringer. Darüber hinaus können, da die Antikörper zu dem Hapten wirtschaftlich eingesetzt werden können, bei der Herstellung guter Antikörper zu dem Hapten diese während einer langen Zeitspanne eingesetzt werden (die gleichen Antikörper werden zur Herstellung einer großen Zahl von Kits verwendet), so dass ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in reproduzierbarer Weise mit guter Qualität herstellbar ist.

In Abhängigkeit von der Art und der Menge des zu messenden Haptens sowie in Abhängigkeit von dem Meßzweck kann somit die Empfindlichkeit des Kits durch Steuerung der Menge an Antikörper auf den sensibilisierten Teilchen und/oder des mit dem Träger gekoppelten Haptens oder durch Auswahl von bestimmten
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durch Zugabe einer

Substanz, wie HSA, BSA, RSA (Kaninchenserumalbumin) oder eines grenzflächenaktiven Mittels oder durch eine Kombination einiger dieser Stufen eingestellt werden.

Die Mengen an gekoppeltem Östrogen, Antikörper zu dem Östrogen und die Empfindlichkeit der herkömmlichen Methode zur Messung von Urinöstrogen wurden mit den entsprechenden erfindungsgemäßen Parametern verglichen. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle I hervor.

In der Tabelle I bedeutet "Antikörper zu dem Östrogen" einen Antiöstriolantikörper, der durch Tiere erzeugt wird, die mit Östriol-16,17-dihemisuccinat-BSA immunisiert worden sind. Unter "gekoppelten Östrogen" ist Östron-17-(o-carboxymethyl)oxim-BSA oder Östriol-16,17-dihemisuccinat zu verstehen. Als mit dem Antikörper zu dem Östrogen oder dem gekoppelten Östrogen zu sensibilisierende Teilchen wurden Blutzellen von Schafen sowie Polystyrollatex verwendet.

Tabelle I

Wie aus der Tabelle I hervorgeht, ist die erfindungsgemäße Methode 50mal empfindlicher bei der Östrogenmessung als die herkömmliche Methode, wobei die Menge an gekoppelten Östrogen auf 1/100 bis 1/1300, die Menge an Antikörper zu dem Östrogen auf 1/10 der Menge, die bei der Durchführung der herkömmlichen Methode eingesetzt wird, herabgesetzt werden kann.

Werden Blutzellen von Schafen als Teilchen für das gekoppelte Östrogen oder den Antikörper zu dem Östrogen verwendet, dann kann die Messung empfindlicher sein, dauert jedoch länger. Wird jedoch Polystyrollatex verwendet, dann nimmt die Empfindlichkeit auf 1/5 ab, die erforderliche Zeit kann jedoch auf 1/20 verkürzt werden. Daher können geeignete Teilchen, die den Meßzweck erfüllen, ausgewählt werden.

Als nächstes wurde der Unterschied der Agglutinations- und Agglutionationshemmungsmuster im Falle des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie des herkömmlichen Verfahrens verglichen. Verschiedene Konzentrationen an Östriol-16 kleines Alpha-glucoronid in Glycin/Puffer-Salzlösung gemäß Tabelle II wurden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und der herkömmlichen Methode unter Verwendung von Polystyrollatex als Teilchen für Antikörper zu dem Östrogen oder gekoppeltes Östrogen gemessen.

Bei diesem Vergleich wurde die Empfindlichkeit in beiden Fällen auf 10 µg/ml eingestellt, so dass nur der Unterschied der Agglutinations- und Agglutinationshemmungsmuster untersucht werden konnte, und zwar frei von dem Einfluß der Empfindlichkeit.

Die Agglutination und die Agglutinationshemmung wurden nach folgenden Kriterien durch Beobachtung mit dem bloßen Auge beurteilt:

-: Agglutination vollständig gehemmt.

+/-: Nicht unterscheidbar als Agglutination oder als Agglutinationshemmung.

+: Unterscheidbar als Agglutination durch Untersuchung.

++: Deutliche Agglutination.

Tabelle II

Wie aus der Tabelle II hervorgeht, erfordert bei der Durchführung der herkömmlichen Methode eine Änderung der Agglutinationsmuster von (++) zu (-) einen Konzentrationsunterschied von 17,5 µg/ml, d.h. von 2,5 µg/ml auf 20 µg/ml, während im Falle des erfindungsgemäßen Verfahrens sich das Muster von (++) nach (-) mit einem Konzentrationsunterschied von 5 µg/ml verändert, d.h. von 10 µg/ml auf 15 µg/ml. Im Falle von engen Bereichen von (+/-) und (+), bei denen eine Beurteilung schwierig ist, ob das Muster eine Agglutination oder Agglutinationshemmung ist, begünstigt das erfindungsgemäße Verfahren die Beurteilung und ist daher praktisch von erheblichem Vorteil.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Messung von Östrogen im Urin einer normalen Frau

A) Synthese von Östriol-16,17-dihemisuccinat-BSA

600 mg Östriol-16,17-dihemisuccinat werden in 12 ml Dioxan aufgelöst. Die Lösung von 600 mg Östriol-16,17-dihemisuccinat in 12 ml Dioxan wird mit 0,3 ml

Tri-n-butylamin versetzt. Nachdem die Mischung auf ungefähr 11°C abgekühlt ist, werden 0,17 ml Isobutylchlorcarbonat zugesetzt, worauf gründlich gerührt wird. In der Zwischenzeit werden 40 ml Dioxan der BSA-Lösung zugesetzt, die aus 1,7 g BSA in 40 ml destilliertem Wasser besteht. Der pH wird auf 12 unter Verwendung von 1 n Natriumhydroxid eingestellt. Dann wird die Mischung auf 11°C abgekühlt. Die zuerst genannte Lösung wird mit dieser letzteren Lösung vermischt, worauf die Mischung während einer Zeitspanne von 4 Stunden gerührt wird. Dann werden die Substanzen mit niederem Molekulargewicht, wie nichtumgesetztes Östriol-16,17-dihemisuccinat und Tri-n-butylamin, durch Gelfiltration (Sephadex G-25, Warenzeichen der Pharmacia Co. in Schweden) abgetrennt. Östriol-16,17-dihemisuccinat-BSA wird gegen destilliertes Wasser dialysiert, das 0,1% Natriumazid enthält und gefriergetrocknet.

B) Synthese von Östron-17-(O-carboxymethyl)oxim-BSA

Östron-17-(O-carboxymethyl)oxim-BSA wird unter Verwendung von Östron-17-(O-carboxymethyl)oxim und BSA nach der unter A) beschriebenen Methode erhalten.

C) Herstellung von Antiöstriol-16,17-dihemisuccinatantikörper

2 mg Östriol-16,17-dihemisuccinat-BSA in 1 ml einer Salzlösung werden mit 1 ml eines vollständigen Freund'schen Adjuvanses emulgiert und subkutan in Kaninchen injiziert. Die Injektion wird fünfmal alle 2 Wochen wiederholt. Nachdem eine Zunahme des Antikörpertiters feststeht, wird das Kaninchen zur Gewinnung von Antiserum ausbluten gelassen. Nach der Absorption durch BSA wird dieses Antiserum mittels eines Aussalzverfahrens unter Verwendung von wasserfreiem Natriumsulfat zur Gewinnung von Antiöstriol-16,17-dihemisuccinatantikörper gereinigt.

D) Herstellung von Antiöstriol-16,17-dihemisuccinatantikörper-sensibilisierten Blutzellen.

Mit Formalin fixierte Blutzellen von Schafen werden mit einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) bei einem pH von 7,4 gewaschen. Dann erfolgt eine Suspendierung in PBS in einer 4%igen Konzentration und ein Vermischen mit einem gleichen Volumen von 0,1% Gerbsäure in PBS. Anschließend wird eine Reaktion bei 56°C während einer Zeitspanne von 30 Minuten durchgeführt. Anschließend an diese Reaktion werden die Blutzellen durch Zentrifugieren abgetrennt, mit PBS gewaschen und erneut in einer 4%igen Konzentration suspendiert. Die erhaltene Suspension wird mit einem gleichen Volumen von 0,02% der Antiöstriol-16,17-dihemisuccinatantikörperlösung, erhalten gemäß C), in PBS vermischt. Nach einer Umsetzung bei 56°C während einer Zeitspanne von 30 Minuten erfolgt ein Waschen mit PBS und eine Suspendierung in einer Konzentration von 2 %. Es wird eine Suspension von Antiöstriol-16,17-dihemisuccinatantikörper-sensibilisierten Blutzellen erhalten. Dann werden 0,1 ml der Suspension in eine Ampulle eingefüllt und gefriergetrocknet.

E) Messung von Urinöstrogen

Der Urin einer normalen Frau wird in jeder Periode ihres Menstruationszyklus gesammelt. Die Probe wird auf das 5-, 10-, 20-, 40- und 80fache in Salzlösung verdünnt. 0,1 ml der Verdünnungen werden in Ampullen mit runden Böden eingefüllt. Die gemäß D) hergestellten Antiöstriol-16,17-dihemisuccinatantikörper-sensibilisierten Blutzellen werden mit 0,3 ml PBS pro Ampulle suspendiert. Die ganzen Mengen dieser Suspension werden in die vorstehend erwähnten Ampullen mit Rundboden eingefüllt und gut vermischt. Es werden 0,1 ml der 5 ng/ml-Lösung des Östron-(O-carboxymethyl)oxim-BSA, erhalten gemäß B), der gleichen Ampulle zugesetzt. Die Ampullen werden dann während einer Zeitspanne von 2 Stunden ohne Rühren stehengelassen. Man stellt eine Ringsedimentation der Blutzellen am Boden der Ampullen fest. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle III hervor.

In dem vorliegenden Beispiel ist die Empfindlichkeit auf 2 ng/ml eingestellt. Die Gehalte an Harnöstrogen in jeder Periode gehen aus der Spalte C) der Tabelle III hervor.

Tabelle III

Beurteilung:

-: Deutliche Agglutination (Hinweis, dass der Gehalt an Urinöstrogen unterhalb der Empfindlichkeit liegt).

++: Agglutination vollständig gehemmt (Hinweis, dass die Menge an Urinöstrogen oberhalb der Empfindlichkeit liegt).

Beispiel 2

Messung des Urinöstrogens von schwangeren Frauen

A) Herstellung von Antiöstriol-16,17-dihemisuccinatantikörper-sensibilisiertem Polystyrollatex

Gemäß Beispiel 1 C) hergestellter Antiöstriol-16,17-dihemisuccinatantikörper wird in glycingepufferter Salzlösung (GBS) auf einen pH von 8,2 zur Einstellung einer Konzentration von 0,08% aufgelöst. 5 ml der erhaltenen Lösung werden mit 5 ml einer 10%igen Polystyrollatexsuspension vermischt, worauf die Mischung bei 45°C während einer Zeitspanne von 1 Stunde bebrütet wird. Anschließend wird der Polystyrollatex durch Zentrifugieren abgetrennt und in 50 ml GBS, enthaltend 0,1% BSA, suspendiert. Dabei erhält man Antiöstriol-16,17-dihemisuccinatantikörper-sensibilisierten Polystyrollatex.

B) Messung des Urinöstrogens

Drei Urinproben von schwangeren Frauen werden auf das 25-, 50-, 100- bzw. 200fache verdünnt. Jeder verdünnte Urin wird auf ein Diapositivglas aufgetropft (jeder Tropfen entspricht einer Menge von 0,025 ml), wobei eine Titrationspipette verwendet wird. Ferner wird ein Tropfen GBS und ein Tropfen des Antiöstriol-16,17-dihemisuccinatantikörper-sensibilisierten Polystyrollatex, erhalten gemäß A), auf dieses Diapositivglas unter Verwendung von Titrationspipetten aufgetropft. Diese drei Bestandteile werden auf dem Diapositivglas gut vermischt. Ein Tropfen einer 2 µg/ml-Lösung von Östriol-16,17-dihemisuccinat-BSA, erhalten gemäß Beispiel 1 A), wird zugesetzt. Nach 3 Minuten dauerndem Vermischen wird das Agglutinationsmuster des Latex unter Beleuchtung mit dem bloßen Auge ermittelt.

Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle IV hervor. In diesem Beispiel wird die Empfindlichkeit auf 200 ng/ml eingestellt. Die Gehalte an Harnöstrogen in jeder von schwangeren Frauen gewonnenen Probe gehen aus der Spalte (C) der Tabelle IV hervor. Die Beurteilung ist die gleiche wie im Falle der Tabelle III.

Tabelle IV

(A) Anzahl der (B) Verdünnung, x-fach (C) Gehalte an

Urinproben _____________________________ Harnöstrogen,

x25 x50 x100 x200 µg/ml

______________________________________________________________________

1 ++ - - - 5

2 ++ - - - 5

3 ++ ++ - - 10

______________________________________________________________________

Beispiel 3

Messung des Urinpregnandiols von schwangeren Frauen

A) Synthese von Pregnandiol-3-glucuronid-BSA

Pregnandiol-3-glucuronid wird unter Verwendung von Pregnandiol-3-glucuronid und BSA nach der in Beispiel 1 A) beschriebenen Weise erhalten.

B) Herstellung eines Antipregnandiol-3-glucuronidantikörpers

Antiserum wird aus einem Kaninchen erhalten, das mit dem gemäß A) nach der in Beispiel 1 C) beschriebenen Weise erhaltenen Pregnandiol-3-glucuronid-BSA immunisiert worden ist.

C) Herstellung des Antipregnandiol-3-glucuronidantikörper-sensibilisierten carboxylierten Polystyrollatex

Ein Antipregnandiol-3-glucuronidantikörper-sensibilisierter carboxylierter Polystyrollatex wird nach der in Beispiel 2 A) beschriebenen Methode hergestellt.

D) Messung des Urinpregnandiols

Unter Verwendung von drei verdünnten Urinproben von schwangeren Frauen, hergestellt gemäß Beispiel 2 B), sowie des gemäß A) und C) erhaltenen Pregnandiol-3-glucuronid-BSA sowie Antipregnandiol-3-glucuronidantikörper-sensibilisierten carboxylierten Polystyrollatex wird der Gehalt an Urinpregnandiol nach der in Beispiel 2 B) beschriebenen Weise bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle V zusammengefasst.

In diesem Beispiel wird die Empfindlichkeit auf 200 ng/ml eingestellt. Die Gehalte an Urinpregnandiol der schwangeren Frauen gehen aus Spalte (C) der Tabelle V hervor.

Tabelle V

(A) Anzahl der (B) Verdünnung, x-fach (C) Gehalte an

Urinproben _____________________________ Urinpregnandiol,

x25 x50 x100 x200 µg/ml

_________________________________________________________________________

1 ++ - - - 5

2 ++ ++ - - 10

3 ++ ++ ++ - 20

_________________________________________________________________________

Beurteilung:

-: Deutliche Agglutination (Hinweis, dass der Gehalt an Urinpregnandiol unterhalb der Empfindlichkeit liegt).

++: Agglutination vollständig gehemmt (Hinweis, dass der Gehalt an Urinpregnandiol oberhalb der Empfindlichkeit liegt).

Beispiel 4

Messung von Cortisol in Serum

A) Synthese von Cortisol-21-hemisuccinat-BSA

Unter Verwendung von Cortisol-21-hemisuccinat und BSA wird Cortisol-21-hemisuccinat-BSA nach der in Beispiel 1 A) beschriebenen Weise erhalten.

B) Synthese von Östradiol-17 kleines Beta-hemisuccinat-BSA

Östradiol-17 kleines Beta-hemisuccinat-BSA wird unter Verwendung von Östradiol-17 kleines Beta-hemisuccinat und BSA nach der in Beispiel 1 A) beschriebenen Weise erhalten.

C) Herstellung von Anticortisolantikörper

Antiserum wird aus einem Kaninchen erhalten, das mit dem gemäß A) nach der in Beispiel 1 C) beschriebenen Weise erhaltenen Cortisol-21-hemisuccinat-BSA immunisiert worden ist. Dieses Antiserum wird von dem Östradiol-17 kleines Beta-hemisuccinat-BSA, erhalten gemäß B), absorbiert und dann durch Aussalzen unter Verwendung von wasserfreiem Natriumsulfat gereinigt. Dabei erhält man Anticortisolantikörper.

D) Herstellung von Anticortisolantikörper-sensibilisierten Blutzellen

Der gemäß C) erhaltene Anticortisolantikörper wird der in Beispiel 1 D) beschriebenen Methode unterzogen. Dabei erhält man Anticortisolantikörper-sensibilisierte Blutzellen.

E) Messen von Cortisol im Serum

Fünf Serumproben gesunder Männer werden auf 70°C während einer Zeitspanne von 10 Minuten erhitzt und dann auf das 20-, 30-, 40-, 60- bzw. 80fache in Salzlösung verdünnt. 0,1 ml des verdünnten Urins werden einer mit einem Rundboden versehenen Ampulle zugesetzt. Die gemäß D) hergestellten Anticortisolantikörper-sensibilisierten Blutzellen werden in 0,3 ml PBS pro Ampulle suspendiert. Die gesamten Mengen dieser Suspension werden zu der vorstehend erwähnten Ampulle mit rundem Boden zugesetzt und gründlich vermischt. Dann werden 0,1 ml einer 10 ng/ml-Lösung des gemäß A) erhaltenen Cortisol-21-hemisuccinat-BSA in die gleiche Ampulle eingefüllt. Die Ampullen werden dann während einer Zeitspanne von 2 Stunden ohne Rühren stehengelassen. Man stellt eine Ringsedimentation von Blutzellen am Boden der Ampullen fest. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle VI hervor.

In diesem Beispiel wird die Empfindlichkeit auf 3 ng/ml eingestellt. Die Mengen an Cortisol in jedem Serum gehen aus Spalte (C) der Tabelle VI hervor.

Tabelle VI

(A) Anzahl der (B) Verdünnung, x-fach (C) Gehalte an

Serumproben ____________________________________ Cortisol im Serum,

x20 x30 x40 x60 x80 ng/ml

___________________________________________________________________________

1 ++ ++ - - - 90

2 ++ - - - - 60

3 ++ - - - - 60

4 ++ ++ ++ - - 120

5 ++ ++ - - - 90

___________________________________________________________________________

Bewertung:

-: Deutliche Agglutination (Hinweis, dass der Gehalt an Cortisol in dem Serum unterhalb der Empfindlichkeit liegt).

++: Agglutination vollständig gehemmt (Hinweis, dass der Gehalt an Cortisol in dem Serum oberhalb der Empfindlichkeit liegt).

Beispiel 5

Messung von Serotonin

A) Synthese von Serotonin-p-aminophenylalanin-BSA

50 ml DL-p-Aminophenylalanin werden in 5 ml destilliertem Wasser aufgelöst, worauf 50 mg BSA und 50 mg 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid der Lösung zugesetzt werden. Nach dem Rühren lässt man die Mischung über Nacht stehen. Der Reaktant wird gegen destilliertes Wasser dialysiert und auf einen pH von 1,5 eingestellt. Anschließend werden 100 mg Natriumnitrit in 1 ml destilliertem Wasser sowie 50 mg Ammoniumsulfamat in destilliertem Wasser zugesetzt. Die Reaktionsmischung wird auf einen pH von 8,0 eingestellt. Nach der Zugabe von 10 ml einer 0,1 m Boratpufferlösung, die 100 mg Creatininsulfat von Serotonin enthält, zu der Reaktionsmischung wird diese über Nacht an einem kalten dunklen Platz gerührt. Man erhält Serotonin-p-aminophenylalanin-BSA durch Dialyse gegen destilliertes Wasser.

B) Herstellung von Antiserotoninantikörper

250 µg Serotonin-p-aminophenylalanin-BSA in 0,5 ml Salzlösung wird mit einem gleichen Volumen eines vollständigen Freund'schen Adjuvanses emulgiert. Unter Anwendung der in Beispiel 1 C) beschriebenen Methode wird das Antiserum erhalten. Dieses Antiserum wird durch DL-p-Aminophenylalanin-BSA absorbiert, d.h., es handelt sich um ein Zwischenprodukt bei der Synthese von Serotonin-p-aminophenylalanin-BSA gemäß A), und durch Aussalzen unter Verwendung von wasserfreiem Natriumsulfat zur Gewinnung von Antiserotoninantikörper gereinigt.

C) Herstellung von Antiserotoninantikörper-sensibilisierten Blutzellen

Unter Verwendung des gemäß C) erhaltenen Antiserotoninantikörpers werden Antiserotoninantikörper-sensibilisierte Blutzellen nach der in Beispiel 1 D) beschriebenen Weise hergestellt.

D) Messung von Serotonin

Serotonin (Produkt der Wako-junyaku K.K.) wird in einer Salzlösung sowie in Urin ohne Serotonin in verschiedenen Konzentrationen, wie sie in der Tabelle VII zusammengefasst sind, aufgelöst. 0,1 ml einer jeden Lösung wird in eine mit einem runden Boden versehene Ampulle eingefüllt. Die gemäß C) hergestellten Antiserotoninantikörper-sensibilisierten Blutzellen werden mit 0,3 ml PBS pro Ampulle suspendiert. Die Gesamtmengen dieser Suspension werden der vorstehend erwähnten Ampulle mit rundem Boden zugesetzt und gut vermischt. Dann wird 0,1 ml einer 50 ng/ml-Lösung von Serotonin-p-aminophenyalanin-BSA, erhalten gemäß A), der gleichen Ampulle zugesetzt. Die Ampullen lässt man dann während einer Zeitspanne von 2 Stunden ohne Rühren stehen. Man stellt eine Ringsedimentation von Blutzellen am Boden der Ampullen fest. Die Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle VII hervor.

Die Empfindlichkeit beträgt in diesem Beispiel 50 ng/ml und bleibt unbeeinflußt durch den Uringehalt stabil.

Tabelle VII

_____________________________________________________________________________________

(A) Serotonin - (B) Serotoninkonzentration, µg/ml

verdünnungs- 0 0,025 0,05 0,10 0,20

mittel

Salzlösung - - ++ ++ ++

Urin ohne Serotonin - - ++ ++ ++

Beurteilung:

-: Deutliche Agglutination (Hinweis, dass der Gehalt an Serotonin unterhalb der Empfindlichkeit liegt).

++: Agglutination vollständig gehemmt (Hinweis, dass der Gehalt an Serotonin oberhalb der Empfindlichkeit liegt).

Beispiel 6

Messung von luteinisierendem Hormon-freisetzendem Hormon

A) Synthese von luteinisierendem Hormon-freisetzendem Hormon-RSA

Eine Lösung von 40 mg eines luteinisierenden Hormon-freisetzenden Hormons (LH-RH) in 1 ml einer Salzlösung wird mit 1 ml einer 5%igen RSA-Lösung vermischt. 1 ml einer 50%igen Pyridinlösung von 200 mg 1-Cyclohexyl-3-[2-morpholinyl-(4)-äthyl]-carbodiimidmethoxy-p-toluolsulfonat wird dieser Mischung zugesetzt, worauf 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur gerührt wird. LH-RH-RSA wird durch Entsalzen mit Gelfiltration (Sephadex G-25) und dann durch Dialyse gegen PBS erhalten.

B) Herstellung von Anti-LH-RH-Antikörper

20 mg LH-RH werden in 1 ml einer Salzlösung aufgelöst. 4 ml eines 50%igen Polyvinylpyrrolidons in der Salzlösung wird der Lösung zugesetzt, worauf 2 Stunden lang gerührt wird. Nach dem Rühren wird die Mischung mit 5 ml eines vollständigen Freund'schen Adjuvanses emulgiert. Nach der in Beispiel 1 C) beschriebenen Arbeitsweise erhält man Anti-LH-RH-Antikörper.

C) Herstellung von Anti-LH-RH-Antikörper-sensibilisierten Blutzellen

Unter Einsatz des gemäß B) erhaltenen Anti-LH-RH-Antikörpers werden Anti-LH-RH-Antikörper-sensibilisierte Blutzellen nach dem in Beispiel 1 D) beschriebenen Verfahren hergestellt.

D) Messung von LH-RH im Blut

Die Konzentration von LH-RH im Blut eines Patienten mit einem schlecht funktionierenden Hypothalamo-hypophysialsystem, der intravenös mit 100 µg LH-RH gespritzt worden ist, wird gemessen. Dieses Serum wird vor der Injektion gesammelt und 2, 5, 10, 30 und 60 Minuten nach der Injektion auf das 20-, 30-, 40-, 50- bzw. 100-fache verdünnt. 0,1 ml einer jeden verdünnten Lösung werden in eine mit einem runden Boden versehene Ampulle eingefüllt. Die Anti-LH-RH-Antikörper-sensibilisierten Blutzellen, die gemäß C) hergestellt worden sind, werden mit 0,3 ml PBS pro Ampulle suspendiert. Die gesamten Mengen dieser Suspension werden in die vorstehend erwähnte Ampulle mit rundem Boden eingefüllt und gut vermischt. Dann werden 0,1 ml einer 5 ng/ml-PBS-Lösung von LH-RH-RSA, erhalten gemäß A) in die gleiche Ampulle eingefüllt. Die Ampullen werden dann während einer Zeitspanne von 2 Stunden ohne Rühren stehengelassen. Am Boden der Ampullen wird ein Ring aus sedimentierten Blutzellen festgestellt. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle VIII hervor. In diesem Beispiel ist die Empfindlichkeit auf 1 ng/ml eingestellt. Der LH-RH-Gehalt in jedem Serum geht aus der Spalte (C) der Tabelle VIII hervor.

Tabelle VIII

Beurteilung:

-: Deutliche Agglutination (Hinweis, dass der Gehalt an LH-RH unterhalb der Empfindlichkeit liegt).

++: Agglutination vollständig gehemmt (Hinweis, dass der Gehalt an LH-RH oberhalb der Empfindlichkeit liegt).

Beispiel 7

Messung von Diphenylhydantoin

A) Synthese von 5-(p-Carboxymethoxyphenyl)-5-phenylhydantoin

400 mg 5-(p-Hydroxyphenyl)-5-phenylhydantoin in 4 ml absolutem Äthanol werden mit 140 mg Chloressigsäure in 3,5 ml 1 n Kaliumhydroxid/Äthanol-Lösung vermischt, worauf die Mischung 22 Stunden lang am Rückfluß gehalten wird. Nach dem Abkühlen wird die Mischung mit 0,33 ml 5 n Chlorwasserstoffsäure angesäuert, worauf zur Entfernung von Äthanol destilliert wird. Dann werden 20 ml destilliertes Wasser zugesetzt, und der pH wird auf 1,0 bis 2,0 mit 5 n Chlorwasserstoffsäure eingestellt. Die erhaltene Lösung wird 4mal mit 5 ml Äthylacetat extrahiert und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Dann wird sie in 2 ml Chloroform/Methanol (2 : 1, Volumen/Volumen) aufgelöst. Die Lösung wird durch eine 2,0 x 40 cm Kieselgelsäule fraktioniert. Die zweite Fraktion wird gesammelt.

5-(p-Carboxymethoxyphenyl)-5-phenylhydantoin (CMPPH) wird durch Eindampfen der gesammelten zweiten Fraktion erhalten und auf Calciumchlorid unter Vakuum getrocknet.

B) Synthese von CMPPH-BGG

CMPPH-BGG wird unter Verwendung von CMPPH und BGG nach der in Beispiel 1 A) beschriebenen Weise erhalten. Dabei wird BGG für die Synthese dreimal soviel verbraucht wie BSA gemäß 1 A).

C) Herstellung von Anti-CMPPH-Antikörper

Unter Verwendung von CMPPH-BGG, erhalten gemäß B), wird Anti-CMPPH-Antikörper nach der in Beispiel 1 C) beschriebenen Weise erhalten.

D) Herstellung von Anti-CMPPH-Antikörper-sensibilisierten Blutzellen

Anti-CMPPH-Antikörper-sensibilisierte Blutzellen werden nach der in Beispiel 1 D) beschriebenen Methode hergestellt.

E) Herstellung von CMPPH-BGG-sensibilisierten Blutzellen

Unter Verwendung von CMPPH-BGG anstelle von Anti-CMPPH-Antikörper werden CMPPH-BGG-sensibilisierte Blutzellen nach dem in Beispiel 1 D) beschriebenen Verfahren erhalten.

F) Messung von Diphenylhydantoin in Blut

Die Gehalte von Diphenylhydantoin in dem Serum eines Patienten, an den Diphenylhydantoin verabreicht worden ist, werden gemessen. Zur Messung wird dieses Serum auf das 10-, 20-, 40-, 60- und 80fache verdünnt. 0,1 ml der jeweils verdünnten Lösungen werden in eine Ampulle mit Rundkolben eingefüllt. Die Anti-CMPPH-Antikörper-sensibilisierten Blutzellen, hergestellt gemäß D), werden mit 0,2 ml PBS pro Ampulle suspendiert. Die gesamten Mengen dieser Suspension werden der vorstehend erwähnten Ampulle mit rundem Boden zugesetzt und gut vermischt. Dann werden die gemäß E) hergestellten CMPPH-BGG-sensibilisierten Blutzellen mit 0,2 ml PBS pro Ampulle suspendiert. Die Gesamtmengen dieser Suspension werden ebenfalls der mit rundem Boden versehenen Ampulle zugesetzt und gut vermischt. Die Ampullen werden dann 2 Stunden lang ohne Rühren stehengelassen. Eine Ringsedimentation von Blutzellen wird am Boden der Ampullen beobachtet. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle IX hervor.

In diesem Beispiel wird die Empfindlichkeit auf 1 µg/ml eingestellt. Die Gehalte an Diphenylhydantoin in jedem Serum gehen aus Spalte (C) der Tabelle IX hervor.

Tabelle IX

(A) Anzahl der (B) Verdünnung, x-fach (C) Gehalte an

Serumproben x10 x20 x40 x60 x80 Diphenylhydantoin

im Serum,

µg/ml

___________________________________________________________________________

1 +/- - - - - weniger als 10

2 ++ ++ ++ - - 40

3 + +/- - - - 10 - 20

4 - - - - - weniger als 10

5 ++ ++ ++ +/- - 40 - 60

___________________________________________________________________________

Beurteilung:

-, +/-: Deutliche Agglutination oder undeutliche Agglutinierung (Hinweis, dass der Gehalt an Diphenylhydantoin unterhalb der Empfindlichkeit liegt).

+, ++: Agglutination vollständig gehemmt (Hinweis, dass der Gehalt an Diphenylhydantoin oberhalb der Empfindlichkeit liegt).

Claims

1. Immunchemisches Haptenmeßverfahren durch Agglutinationshemmung, gekennzeichnet durch die Verwendung eines mit dem Antikörper zu dem zu messenden Hapten sensibilisierten Teilchens und eines Kopplungsproduktes des nachzuweisenden Haptens mit einer Trägersubstanz.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Kopplungsprodukt des Haptens mit der Trägersubstanz an feine Teilchen gebunden ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die feinen Teilchen aus Blutzellen, einem hochmolekularen Latex, Kaolinit, Bentonit oder Aktivkohle bestehen.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper durch Absorption und Entfernung aller übrigen Antikörper mit Ausnahme des Haptenantikörpers aus Antiserum erzeugt wird, das durch Immunisieren eines Tieres mit dem Kopplungsprodukt des Haptens und der Trägersubstanz erhalten wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Trägersubstanz Rinderserumalbumin, Menschenserumalbumin, Rinder-kleines Gamma-globulin, Tetanustoxoid, ein Glutaminsäure/Lyson/Tyrosin-Copolymeres oder ein pneumokokkales Polysaccharid verwendet wird.