DE2744835B2

DE2744835B2 - Immunchemisches Meßverfahren

Info

Publication number: DE2744835B2
Application number: DE2744835A
Authority: DE
Inventors: Masakatsu Tokio Hashimoto; Ei Tokio Mochida; Nobuhisa Omiya Ogawa; Hiroyuki Kawagoe Shinkai
Original assignee: Mochida Seiyaku Kk Tokio
Current assignee: Mochida Seiyaku Kk Tokio
Priority date: 1976-10-07
Filing date: 1977-10-05
Publication date: 1980-12-11
Also published as: US4185084A; DE2744835C3; JPS604422B2; JPS5347520A; DE2744835A1

Description

Antigensubstanzen, wie Insulin. Choriumgonadotropin, Wachstumshormon sowie Immunogliibolin, zeich- f>5 nen sich durch eine Spezifizität und Empfindlichkeit aus, mit welcher sie sich mit ihren Antikörpern verbinden. Unter Ausnutzung dieser Tat-κ he wurden viele Versuche unternommen, derartige Antigensubstanzen oder ihre Antikörper zu messen. Derzeit wird eine Reihe von derartigen Meßverfahren angewendet Beispielsweise seien folgende Verfahren erwähnt: Die Immundiffusionsmethode, bei deren Durchführung das Antigen und der Antikörper miteinander in einem Agargel umgesetzt werden, die Agglutinierungsreaktions- und Agglutinierungsinhinbierungsreaktionsmethode, bei deren Durchführung Blutzellen oder feine Teilchen, wie Polystyrollatex, als Träger für Antigen oder Antikörper verwendet werden sowie der Radioimmunoassay (RIA), bei deren Durchführung Radioisotope zur Markierung des Antigens oder des Antikörpers eingesetzt werden.

In neuerer Zeit wurden Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, wie Steroide, Tyroidhormone sowie aktive Amine, deren Antikörperherstellung schwierig ist, zu messen nach der konkurrierenden Methode unter Ausnützung der Bindereaktion des Rezeptorproteins oder des Bindeproteins, das in spezifischer Weise sich mit diesen Substanzen verbindet, verwendet In jüngerer Zeit konnten jedoch die Antikörper dieser Substanzen relativ einfach hergestellt werden, so daß sie nunmehr in der gleichen Weise wie die vorstehend erwähnten Antigensubstanzen gemessen werden können.

Diese Methoden werden in breitem Umfange angewendet Beispielsweise wird der RIA, der bezüglich der Empfindlichkeit und der quantitativen Genauigkeit der Messung hervorragend ist in breitem Umfange eingesetzt Die Substanzen, die nach dieser Methode meßbar sind, bestehen aus einer Vielzahl hochmolekularer Substanzen, wie Immunoglobulin, Viren oder Proteinhormonen sowie Substanzen mit niederem Molekulargewicht wie Peptiden oder Steroiden.

Ein RIA unter Einsatz von Radioisotopen erfordert jedoch große Kenntnisse und Geschick des eingesetzten Personals. Ferner sind kostspielige Instrumente und Vorrichtungen nötig. Darüber hinav.s ist diese Methode im Hinblick auf die Umweltverseuchung vielen Einschränkungen unterzogen. Aus diesen Gründen wird sie in der klinischen Praxis nur in begrenztem Umfange eingesetzt. Ist eine mit einem Radioisotop zu markierende Substanz beispielsweise eine Verbindung mit einem niederen Molekulargewicht, wie ein Steroid oder eine instabile Substanz, wie menschliches Placentalactogen, dann ist es schwierig, die Substanz direkt zu markieren. Auch dann, wenn die Markierung möglich ist, ist die Substanz praktisch infolge einer Verminderung oder eines Verlustes ihrer immunologischen Aktivität schlecht einsetzbar.

Zur Vermeidung dieser Nachteile wurden in neuerer Zeit neue Verfahren entwickelt, wie beispielsweise der ElA (Enzymimmunoassay) unter Verwendung eines Enzyms sowie der FIA (Fluoreszenzimmunoassay), der unter Einsatz eines fluoreszierenden Materials anstelle eines Radioisotops arbeitet. Diese Verfahren zeichnen sich durch eine hohe Empfindlichkeit und quantitative Meßgenauigkeit aus, wobei diese Eigenschaften ungefähr denjenigen des RlA entsprechen.

RIA, EIA und FlA arbeiten auf dem gleichen Prinzip, d. h. auf der Grundlage von zwei Methoden, und zwar der konkurrierenden Methode und der Sandwichmethode. Das Prinzip läßt sich anhanü des Falles eines Antigens, das als zu inessende Substanz eingesetzt wird sowie eines Antikörpers, der als Substanz verwendet wird, die sich in spezifischer Weise mit der zu messenden Substanz verbinden, erläutern.

1. Konkurrierende Methode

Läßt man eine unbekannte Menge eines niehtmarkierten Antigens (nachfolgend als »Ag 1« bezeichnet) sowie eine gegebene Menge eines markierten Antigens (nachfolgend als »markiertes Ag 1« bezeichnet) miteinander konkurrieren mit einer gegebenen Menge eines Antikörpers (nachfolgend als »Ab 1« bezeichnet) reagieren, dar./i verbinden sich das Ag 1 und das markierte Ag 1 mit dem Ab 1 im Verhältnis ihrer jeweiligen Mengen. Datier ist die Menge an markiertem Ag 1, die mit dem Ab 1 verbunden wird, umgekehrt proportional zu der Menge des Ag 1. Durch geeignete Maßnahmen werden das markierte Ag 1, das sich mit dem Ab 1 verbunden hat, und das markierce Ag 1, das keine Bindung eingegangen ist, getrennt

Die Aktivität des Markierungsrnittels des markierten Ag 1, das an den Ab 1 gebunden bzw. nicht gebunden ist, wird gemessen. In der Zwischenzeit wird eine Verdünnungsreihe von Bezugssubstanzen, deren Konzentration bekannt ist, hergestellt, wobei in der vorstehend beschriebenen Weise die Akivität des Markierungsmittels gemessen wird. Eine Standardkurve, die durch Auftragen der gemessenen Aktivitäten erhalten wird, wird zur Bestimmung der Menge des zu messenden Ag 1 verwendet

2. Sandwich-Methode

Werden eine unbekannte Menge eines Ag 1 sowie seines Ab 1, der unlöslich gemacht worden ist, miteinander umgesetzt, dann verbindet sich das Ag 1 mit dem Ab 1 unter Bildung eines Ag 1—Ab 1-Komplexes. Dieser Komplex wird von der Reaktionsmischung abgetrennt und mit einer gegebenen Menge eines markierten Ab 1 umgesetzt Dieser markierte Ab 1 verbindet sich mit dem Komplex unter Bildung eines sandwichartigen Ab 1—Ag 1—Ab 1-Komplexes, wobei ein Teil des markierten Ab 1, der die Bindefähigkeit des Komplexes übersteigt, in freiem Zustand in der Lösung verbleibt Dann werden der »gebundene« markierte Ab 1 und der »freie« markierte Ab 1 voneinander abgetrennt Die Aktivitäten entweder des »gebundenen« oder des »freien« Markierungsmittels wird gemessen. Nach der im Zusammenhang mit der vorstehend beschriebenen konkurtierenden Methode beschriebenen Weise wird eine Standardkurve hergestellt, die zur Bestimmung der unbekannten Menge des nichtmarkierten Antigens verwendet werden kann.

Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, ein immunchemisches Meßverfahren zur Messung von physiologischen aktiven Substanzen zu schaffen, bei dessen Durchführung Substanzen mit niederem Molekulargewicht sowie schwach antigene Substanzen mit hoher Empfindlichkeit gemessen werden können. Außerdem soll ein Reagens zur Durchführung eines derartigen Verfahrens zur Verfügung gestellt werden.

Diese Aufgabe wird durch die im Anspruch 1 gekennzeichnete Erfindung gelöst

Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und Reagenzien zu seiner Durchführung ergeben sich aus den Ansprüchen 2 bis 6.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt Merkmale der konkurrierenden Methode und der Sandwich-Methode. Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf ein Beispiel, bei dessen Ausführung ein Antigen sowie sein Antikörper eingesetzt werden, näher erläutert

Eine unbekannte Menge eines zu r essenden Ag 1 und eine gegebene Menge eines Ag 1—Ag 2-Konjugats, in welchem Ag 2 eine andere stark antigene Substanz ist, läßt man konkurrierend mit einer gegebenen Menge des Ab 1 zu dem Ag 1 reagieren. Da das Ag 1 und aas Ag 1 —Ag 2-Konjugat sich mit dem Ab 1 proportional zu ihren jeweiligen Mengen verbinden, ist die Menge des Ag 1 —Ag 2-Konjugats, das sich mit dem Ab 1 verbindet, umgekehrt proportional zu der Menge des Ag 1. Nach der Abtrennung des Ab 1 —Ag 1 —Ag .'',-Komplexes, der bei der vorstehenden Reaktion gebildet worden ist, läßt man den Komplex mit einer gegebenen Menge eines markierten Antikörpers (nachfolgend als »markierter Ab 2« bezeichnet) zu dem Ag 2 reagieren. Der markierte Ab 2 verbindet sich mit dem Ab 1 —Ag 1 — Ag 2-Komplex und bildet eine sandwichartige Konfiguration Ab 1—Ag 1—Ag 2 — markierter Ab 2. Der markierte Ab 2 in der Reaktionsmischung wird dann zu dem »gebundenen« markierten Ab 2 und dem »freien« markierten Ab 2 aufgetrennt Die Aktivität des Markierungsmittels des markierten Ab 2 entweder in der »gebundenen« Fraktion oder in der »freien« Fraktion wird gemessen. Aus einer Standardkurvc, die aus einer Bezugssubstanz anhand einer- parallelen Versuchs aufgetragen worden ist, wird die unbekannte Menge des zu messenden Ag 1 bestimmt.

In dem folgenden Schema sind die Stufen der konkurrierenden Methode, der Sandwich-Methode sowie der erfindungsgemäßen Methode zusammengefaßt:

a) Konkurrierende Methode
AbI
+ Abi—AgI

AgI > +

+ (konkurrierende

Reaktion) Ab 1 —markiertes Ag 1

markiertes Ag 1 + Ab 2 zu Ab

(insoiubilisiert)

b) Sandwich-Methode

-» Ab 2—Ab 1—markiertes Ag I

AbI
(insoiubilisiert)

AeI

AbI AgI

— > Ab I AgI markierter Ab I

-i markierter Ab I (Sandwich)

c) Erfindungsgemäßes Verfahren

AbI
(insolubilisiert)

Agi

Abi—AgI ■f

(konkurrierende
Reaktion) Ab I —Ag 1 —Ag 2

Ag 1—Ag 2

, _Ab , „_Ag ι _Ag

^ markierter Ab 2 (Sandwich)
zu Ag 2

markierter Ab 2

Verschiedene Tierserumproteine, wie Albumin oder Globulin sowie stark antigene Substanzen, wie mensch liches Choriumgonadotropin (HCG), Hämoglobin (Hb). ι-, Tetanustoxoid, pneumokokkale Polysaccharide oder GIutaminsäure/Lysin/Tyrosin-Copolymere sind als Ag 2, das mit dem Ag I verkoppelt werden kann, verfügbar, es ist jedoch vorteilhaft, wie nachstehend noch näher erläutert werden wird, ein Glycoprotein. wie HCG. >n einzusetzen.

Die Methode zur Herstellung eines Ag 2. das an das Ag 1 gekoppelt ist. schwankt in Abhängigkeit von den Eigenschaften des Ag I und des Ag 2. Beispielsweise kann man das Ag 2 nach verschiedenen Methoden an r> das Protein koppeln, beispielsweise nach Methoden unter Verwendung einer Proteinaminogruppe als Bindestelle (Diisocyanatmethode. Maleinsäureanhydridmethode, Glutaraldehydmethode, Chlorcarbonatmethode), ferner kann man auf eine Methode zurück- ;n greifen, die sich einer SH-Gruppe als Bindestelle bedient (divalente Quecksilberverbindungsmethode). Erwähnt sei ferner eine Methode unter Verwendung einer Tyrosin- oder Histidingruppe als Bindestelle (Diazoverbindung-Methode) oder eine Methode unter r, Einsatz einer Carboxylgruppe als Bindestelle (Carbodiimidmethode). Zum Verkoppeln des Ag 2 mit einem Hapten. wie einem Steroid, ist die Hemisuccinatmethode oder Oximmethode verfügbar. Wird ein Glycoprotein. wie HCG als Ag 2 verwendet, dann ist es möglich -w die Kupplung unter Verwendung einer Aldehydgruppe durchzuführen, die durch Oxidation ihrer Zuckerkette erhalten worden ist. Diese Methode ist besonders zufriedenstellend, da sie einen guten Bindungsgrad ermöglicht und nur eine geringe Beschädigung der Substanz bedingt, die mit dem Ag 2 verkoppelt wird.

Der Ab 2 kann nach einer Routinemethode durch Immunisieren eines Kaninchens oder einer Ziege hergestellt werden.

Als Mittel zur Markierung des Ab 2 stehen folgende Materialien zur Verfügung: Radioisotope (beispielsweise 125j. 131|, 3h, Hc), Enzyme (beispielsweise Meerrettichperoxidase, 0-D-Galactosidase, alkalische Phosphatase, Glucoseoxidase, Glucoamylase) oder fluoreszierende Materialien (beispielsweise Fluoreszeinisothiocyanat, Rhodamin).

Zum Markieren des Ab 2 mit derartigen Mitteln sind folgende Methoden anwendbar: Die Chloramin-T-Methode (F. C. Greenwood und W. M. Hunter, Nature, 194, 495 [1962]), die Perjodatmethode (P. Nakane und A. Kawaoi, J. Histochem. Cytochem, 22, 1084 [1974]) oder andere Methoden.

Zur Abtrennung eines Ag 1—Ag 2-Konjugats, das sich mit dem Ab 1 verbunden hat, von einem Ag 1 —Ag 2-Konjugat, das keine derartigen Bindungen eingegangen ist, oder zur Abtrennung eines markierten Ab 2, der sich mit dem Ag 1 —Ag 2-Konjugat verbunden hat, von einem markierten Ab 2, der keine derartige Bindung eingegangen ist. stehen viele bekannte Methoden zur Verfugung, beispielsweise Chromatographiemethoden, eine Elektrophorese, ein Aussalzen, eine alkoholische Ausfällung, eine Gelfiltration, eine Fesiphasenmethode sowie die Methode des doppelten Antikörpers. Aus Gründen einer einfachen Arbeitsweise ist es vorteilhaft, die Methode der festen Phase anzuwenden, bei deren Durchführung ein Antikörper an einen unlöslichen Träger gebunden wird.

Im Vergleich zu den herkömmlichen Methoden zeichnet sich die Erfindung durch folgende herausragende Merkmale aus: Es ist bekannt, daß Substanzen mit relativ niedrigen Molekulargewichten, wie Insulin, Adrenocorticotrop^. Glucagon oder Gastrin, schwach antigen sind. Aufgrund einer geringen Aktivität bezüglich des markierten Antikörpers binden diese Substanzen nur eine geringe Menge desselben. Zur Erhöhung der gebundenen Menge an dem markierten Antikörper wird crfindungsgemaß eine stark antigene Substanz (Ag 2) mit der zu messenden Substanz (Ag I) verkoppelt. Dabei kann man die zu messende Substanz veranlassen, eine große Menge des markierten Antikörpers infolge des hohen Bindevermögens des Ag 2 zu binden. Erfindungsgemäß kann daher die Messung mit einer höheren Empfindlichkeit als bei der Durchführung der herkömmlichen Methode durchgeführt werden, und zwar auch dann, wenn die Menge des zu messenden Ag 1 extrem niedrig ist.

Darüber hinaus hat die Erfindung den Vorteil, daß dann, wenn das mit dem Ag 1 zu verkoppelnde Ag 2 auf ein einziges Material beschränkt ist, welches die beste Messung bedingt, nur eine Art eines markierten Ab 2 ausreicht, so daß es nicht mehr erforderlich ist. verschiedene markierte Antikörper entsprechend den verschiedenen zu messenden Substanzen herzustellen.

Die erfindungsgemäß meßbaren Substanzen sind beispielsweise Substanzen mit niederem Molekulargewicht, z. B. Steroide, wie Testosteron, Setriol, Progesteron, Corticosteron oder Aldosteron, Thyroidhonnone. wie Thyroxin oder Trijodthyronin. physiologisch aktive Peptide, wie Bradykinin oder Angiotensin, Thyroidhormone freisetzende Hormone, luteinisierende Hormone freisetzende Hormone, physiologisch aktive Amine, wie Epinephrin, Norepinephrin, Histamin, Serotonin oder Prostglandin, Substanzen mit relativ niedrigem Molekulargewicht, beispielsweise Insulin, Glucagon, Adrenocorticotropin oder Gastrin, sowie Substanzen mit hohem Molekulargewicht, beispielsweise menschliches Choriumgonadotropin, Wachstumshormon, menschliches Placentalactogen, Immunoglobulin εΑ-Fötoprotein oder Hepatitis-B-Antigen.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen und Vergleichsbeispielen näher erläutert. Dabei wird auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen. Es zeigt

F i g. 1 eine Standardkurve für die bekannte Insulin-

messung gemäß Vergleichsbeispiel I,

F' i g. 2 eine Standardkurve für eine erfindungsgemäße Insiilinmessiinp gemäß Ausführungsbeispiel I.

Vergleichsbeispiel I

Viessung von Insulin (konkurrierende Methode)
a) Herstellung einer Standard-Insulin-Lösung

Kristallines Rinderinsulin (Sigma Chemical, 25 IU/mg) wird bis zu Konzentrationen von 10⁴, 10', 320, 80, 20 und Ομΐυ/ml in einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS. pH 6.4) die 0.1% Rinderserumalbtimin (BSA) enthält, aufgelöst.

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b) Hcrstel'ung des Antiinsulinantikörpers

In einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiertes kristallines Rinderinsulin wird durch Zugabe von 0,1 n-Chlorwasserstoffsäure, Tropfen für Tropfen, aufgelöst Es wird eine Konzentration von 2 mg/ml eingestellt. Die Insulinlösung wird mit Aktivkohlepulver (Wiiko Pure Chemical) in einer Menge von 10 mg pro 1 ml der Insulinlösung vermischt. Auf diese Weise wird das Insulin an der Aktivkohle adsorbiert. Die Aktivkoh- y-, Ie mit adsorbiertem Insulin wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Durch Zugabe von 0.5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung zu 10 mg dieser Aktivkohle erhalt man eine Suspension aus Aktivkohle mit adsorbiertem Insulin. Ein Meerschweinchen wird jede so Wuohp mit einer Mischung aus 0,25 ml dieser Suspension und 0,25 ml eines vollständigen Freundschen Adj ivanses (Freunds complete adjuvant) gespritzt. Die Injektion wird zehnmal wiederholt. Eine Woche nach der letzten Injektion wird das Blut aus dem Karotid des 3 j Tieres gesammelt, wobei ein Meerschweinchenantiinsulinstrum erhalten wird. Das auf diese Weise erhaltene Ant serum wird zweimal mit Natriumsulfat ausgesalzen, wobei der Antiinsulinantikörper erhalten wird.

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c) Herstellungeines Insulin-Meerrettich-

peroxidasekonjugats

Nach der Perjodat-Methode von P. Nakane und A. Kawaoi wird kristallines Rinderinsulin mit Meerrettichperc xidase verbunden. 5 g Meerrettichperoxidase (HRP) werden in 1 ml einer 03 m-Natriumbicarbonatlösung aufgelöst, worauf sich die Zugabe von 0,1 ml eines l°/oigen 2,4-Dinitrofluorbenzols anschließt. Die erhaltene Mischung wird während einer Zeitspanne von 1 Sturde bei Zimmertemperatur gerührt Dann wird 1 ml einer 0,08 m-Natriumperjodatlösung zugesetzt und während einer Zeitspanne von 30 Minuten bei Zimmertemperatur eingemischt, worauf sich die Zugabe von 1 ml eines 0,16 m-Äthyienglykois und ein Mischen während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur anschließen. Die erhaltene Lösung wird über Nacht gegen einen 0,01 m-Natriumcarbonatpuffer mit einem pH von 9,5 dialysiert Dann wird 1,0 ml einer Insulinlösung zugesetzt, die durch Auflösung von kristallinem Rinderinsulin zur Erzielung einer Konzentration von 5 mg/ml in einer 0,01 m-Natriumcarbonatpufferlösung mit einem pH von 9,5 erhalten worden ist Nach einer dreistündigen Reaktion bei Zimmertemperatur werden 5 mg Natriumborhydrid der Reaktionsmischung zugesetzt, worauf man die Mischung weitere 3 Stunden bei 4° C stehenläßt Nach der Reaktion wird über Nacht eine Dialyse gegen PBS mit einem pH von 7,2 durchgeführt, worauf sich eine Fraktionierung und Reinigung mit Sephadex G-200 und ein Gefriertrocknen anschließt. Dabei erhält man ein Insulin-Meerrettich-Peroxidasekonjugat (INS-HRP).

d) Herstellung einer Kaninchen-Antimeerschweincheny-globulinantikörper-gekuppehen Cellulose

Ein gesundes Meerschweinchenserum wird durch Aussalzen und DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie gereinigt, wobei eine y-Globulinfraktion erhalten wird. Die erhaltene Meerschweinchen-y-globulinfraktion wird zur Einstellung einer Konzentration von 2 mg/ml in einer physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst. 0,5 ml der erhaltenen Lösung werden mit 0,5 ml eines vollständigen Freundschen Adjuvanses vermischt. Die Mischung wird fünfmal in ein Kaninchen einmal pro Woche eingespritzt. Eine Woche nach der letzten Injektion wird das Blut aus dem Kaninchen gesammelt. Auf diese Weise wird das Kaninchenantimeerschweinchen-y-globulinserum erhalten. Das erhaltene Antiserum wird durch Aussalzen gereinigt, wobei der Kaninchenantimeerschweinchen-y-globulinantikörper erhalten wird.

8 g Cellulosepulver (Merk Chemical) werden zu 320 ml eines 2,5%igen Bromcyans gegeben. Die Suspension wird auf einen pH von 10 bis 11 durch eine 1 n-Natriumhydroxidlösung eingestellt, worauf sich eine Umsetzung während einer Zeitspanne von 2 Minuten unter Rühren anschließt. Dann wird die Suspension durch ein Glasfilter geschickt und mit einer 0,1 n-Natriumbicarbonatlösung gewaschen, wobei eine aktivierte Cellulose erhalten wird. Die aktivierte Cellulose wird in 32 ml einer 0,1 m-Natriumbicarbonatlösung suspendiert. Dieser Suspension werden 8 mg des Kaninchenantimeerschweinchen-y-globulinantikörpers zugesetzt, worauf sich ein Stehenlassen während einer Zeitspanne von 22 Stunden bei 4°C unter Rühren anschließt. Nach der Umsetzung wird die Suspension mit PBS mit einem pH von 6,4 und einer Mischung eines 8molaren Harnstoffs und eines 0,2mo!aren Glycins mi einem pH von 7,0 gewaschen und zur Erzielung einer Konzentration von 10% in PBS mit einem pH von 6,4. enthaltend 1 % BSA, suspendiert.

e) Insulinmessung

0,1 ml einer Standardinsulinlösung mit der jeweils gemäß a) erhaltenen Konzentration werden in ein Reagensglas eingefüllt. Dann werden 0,1 ml des Antiinsulinantikörpers gemäß b) als Lösung, die auf das 16 OOOfache mit PBS verdünnt ist, zugesetzt. Dann wird während einer Zeitspanne von 50 Minuten bei Zimmertemperatur bebrütet- Die Lösung wird dann mit 0,1 ml INS-HRP gemäß c) in Form einer 30fach verdünnten Lösung mit PBS versetzt, worauf während einer Zeitspanne von 40 Minuten bei Zimmertemperatur bebrütet wird. Dann werden 0,1 ml einer 10%igen Suspension der Kaninchenantimeerschweinchen-y-globulinantikörper-gekuppelten Cellulose gemäß d) zugesetzt Die Suspension wird während einer Zeitspanne von 90 Minuten bebrütet Die feste Phase wird nach einem Abtrennen der flüssigen Phase zweimal mit einer physiologischen Kochsalzlösung, die Tween 20 enthält, gewaschen. Dann werden 3 ml einer Substratlösung, die 5-Aminosalicylsäure (60 mg/dl) sowie 3%iges Wasserstoffperoxid (lOOuI/dl) enthält zugesetzt worauf während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur bebrütet wird. Nach einer Zugabe von 2 Tropfen einer l,6%igen Natriumazidlösung wird das

Absorptionsvermögen bei 465 ;im gemessen. Die dabei erzeugte Standardkurve geht aus der F i g. 1 hervor. Aus F i g. 1 können 50 μΐυ/ml Insulin gemessen werden.

Vergleichsbeispiel II ■,

Insulinmessung (Sandwich-Methode)
a) Herstellung eines Antikörper-sensibilisierten
Polystyrolreagensglases

Der gemäß Ib) erhaltene Antiinsulinantikörper wird in zur Erzielung einer Konzentration von l(X^g/ml in einem Glycinpuffer mit einem pH von 8,2 aufgelöst. 1 ml der Lösung wird in ein Polystyrolreagensglas mit einem inneren Durchmesser von 1,5 cm und einer Länge von I Ocm eingefüllt. Das Reagensglas wird während einer π Zeitspanne von 3 Stunden bei 37°C bebrütet. Das Reagensglas wird in einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen, worauf ein l%iges normales Meerscnweincnenserum-PBS zugesetzt wird, Man iäßi die Mischung bei 4⁰C über Nacht stehen. Dabei wird ein :n Antiinsulinantikörper-sensibilisiertes Polystyrolreagensglaserhalten.

b) Herstellung eines Antiinsulinantikörper-

HRP-Konjugats ,.

Nach der unter Ic) beschriebenen Methode wird eine Reaktion zwischen 5 mg des Antiinsulinantikörpers gemäß Ia) und 5 mg HRP durchgeführt, wobei ein Antiinsulinantikörper-HRP-Konjugat erhalten wird.

c) Insulinmessung

Das Antiinsulinantikörper-sensibilisierte Polystyrolreagensglas, das gemäß a) hergestellt worden ist, wird mit 0,1 ml der Standardinsulinlösung mit der jeweils gemäß Ia) erzielten Konzentration gefüllt und dann während einer Zeitspanne von 1 Stunde bebrütet. Nach dem Verwerfen der Lösung wird das Reagensglas mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Nachdem 0,1 ml des gemäß b) hergestellten Antiinsulinantikörper-HRP-Konjugats in das Reagensglas eingefüllt worden sind, wird dieses während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimitfertemperatur stehengelassen. Nach der Reaktion wird das Reagensglas mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Dann werden 3 ml einer Substratlösung, die 5-Aminosalicylsäure (60 mg/dl) und 0,3%iges Wasserstoffperoxid (1 ml/dl) enthält, zugesetzt, worauf man die Mischung während einer Zeitspanne von 1 Stunue bei Zimmertemperatur stehenläßt. Anschließend wird das Absorptionsvermögen bei 465 nm gemessen. Aus der dabei so erzeugten Standardkurve lassen sich 20 bis 30 μΐυ/ml Insulin messen.

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Ausführungsbeispiel 1
Insulinmessung

a) Herstellung des Insulin-HCG-Konjugats

5 mg HCG werden in 1 ml einer 03 m-Natriumbicarbonatlösung aufgelöst und mit 0,1 ml eines l°/oigen 2,4-Dinitrofluorbenzols vernetzt worauf man die Mischung während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehenläßt Anschließend wird nach der Methode Ic) ein Insulin-HCG-Konjugat (INS-HCG) erhalten.

b) Herstellung von Anti-HCG-Antikörper
HCG wird in ein Kaninchen in üblicher Weise zur

Gewinnung des Kaninchen-Anti-HCG-Serums injiziert Das Antiserum wird durch Natriumsulfat ausgesalzen, wobei man einen Anti-HCG-Antikörper erhält.

c) Herstellung von Anti-HCG-Antikörper-

HRP-Konjugat

Nach der Methode gemäß Ic) wird eine Reaktion zwischen 5 mg Anti-HCG-Antikörper, erhalten gemäß b), und 5 mg HRP durchgeführt, wobei ein Anti-HCG-Antikörper-HRP-Konjugat erhalten wird.

d) Herstellung von Antiinsulinantikörpersensibilisiertem Polystyrolreagensglas

Der gemäß Ib) hergestellte Antiinsulinantikörper wird zur Erzielung einer Konzentration von 20 μg/ml in Glycinpuffer (pH 8,2) aufgelöst. In ein Polystyrolroagensglas wird 1 ml der Lösung eingefüllt, worauf eh.2 Bebrütung während einer Zeitspanne von 30 Minuten in einem Wasserbad mit einer Temperatur von 56" C uuri'iigciüiit i wii'ü. Aüi uicsc ττ eise "wiTu ein AruiiriSuiinantikörper-sensibilisiertes Polystyrolreagensglas hergestellt.

e) Insulinmessung

In das gemäß d) hergestellte Antiinsulinantikörper· sensibilisierte Polystyrolreagensglas werden 0,4 ml jeweils der in la) angegebenen Standardinsulinlösung eingefüllt, worauf 0,3 ml BSA (O,5°/oig) zugesetzt werden. Die Mischung wird während einer Zeitspanne von 18 Stunden bei 4⁰C bebrütet. Dann werden 0,1 ml der gemäß a) erhaltenen INS-HCG-Lösung zugesetzt, worauf sich eine Bebrütung während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei 37° C anschließt. Nach der Bebrütung wird die Lösung in dem Reagensglas entfernt, worauf das Reagensglas mit Phosphatpuffer gewaschen wird. Dann werden 0,1 ml des gemäß c) erhaltenen Anti-HCG-Antikörper-HRP-Konjugats und 0,7 ml BSA (0,5%ig) zugesetzt, worauf die Mischung während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei 37°C bebrütet wird. Nach einem Waschen des Reagensglases werden 3 ml einer Substratlösung, die 5-Aminosalicylsäure (60 mg/dl) enthält sowie 3%iges Wasserstoffperoxid (ΙΟΟμΙ/dl) enthält, zugesetzt, worauf eine Reaktion während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur ausgeführt wird. Dann wird das Absorptionsvermögen bei 465 nm gemessen. Die dabei hergestellte Standardkurve geht aus F i g. 2 hervor. Man sieht, daß eine Insulinmessung zur Ermittlung eines Wertes von 10 μΐυ/ml aus F i g. 2 möglich ist. Diese Messung ist um das 3- bis 5fache empfindlicher als diejenige der herkömmlichen Methode.

Ausführungsbeispiel 2

Insulinmessung

a) Herstellung eines Insulin-BSA-Konjugats
10 mg kristallines Rinderinsulin und 12,8 mg BSA werden jeweils in 10 ml eines 0,4 m-Boratpuffers mit einem pH von 9,0 aufgelöst Diese zwei Lösungen werden vermischt Die erhaltene Mischung wird mit 037 ml eines 0,01 m-Bisdiazobenzidins vermischt worauf man die Mischung während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur unter Rühren stehenläßt Nach der Reaktion wird die Lösung unter Anwendung einer ültrafiltrationsmethode konzentriert worauf sich eine Reinigung mit Sephadex G-150 anschließt Dabei wird ein Insulin-BSA-Konjugat erhalten.

b) Herstellung eines mit readioaktivem Jod markierten Anti-BSA-Antikörpers

In ein kleines Reagensglas werden 0,025 ml einor 0,5 m-Phosphatpufferlösung eingefüllt. Dann werden 2 > m-Ci radioaktives Natriumjodid (NA¹³¹J) eingefüllt. Anschließend werden 0,025 ml einer 400 μg/ml Anti-BSA-Antikörperlösung hergestellt und auf herkömmliche Weise gereinigt. 0,02 ml 4 mg/ml Chloramin T werden zugesetzt, worauf während einer Zeitspanne in von 1 Minute vermischt wird. Dann werden 0,1 ml 24 mg/ml Natriummetabisulfit und 0,4 ml 10 mg/ml Kaliumjodid zugesetzt. Die Reaktionsmischung wird mit Sephadex G-50 gereinigt, wobei ein '^!! J-Anti-BSA Antikörper erzeugt wird. r>

c) Insulinmessung

in ein gcniäß i!ä) nci gcSicliicS Anüii'isüiiMdMuküipcr-

sensibilisiertes Polystyrolreagensglas werden jeweils 0,1 ml einer gemäß Ia) erhaltenen Standardinsulinlösung und 0,1 ml einer gemäß Ia) erhaltenen Standardinsuiinlösung und 0,6 ml PBS-Lösung von 0,1% Kaninchen-yglobulin (RGG) gegeben, worauf während einer Zeitspanne von 18 Stunden bei 4°C bebrütet wird. Dann werden 0,1 ml des gemäß a) erhaltenen Insulin-BSA-Konjugats zugesetzt, worauf sich eine Bebrütung während einer Zeitspanne von I Stunde bei 37° C anschließt. Nach der Bebrüt ng wird die Lösung entfernt, worauf das Reagensglas mit Phosphatpuffer so dreimal gewaschen wird. Dann werden 0,1 ml einer mit radioaktivem Jod narkierten Anti-BSA-Antikörperlösung, erhalten gemäß b) sowie 0,7 ml PBS, enthaltend 0,1% RGG, zugesetzt. Die Mischung wird während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei 37⁰C bebrütet. Nach r> der Entfernung der Reaktionsmischung wird das Reagensglas gewaschen, worauf unter Verwendung eines Szintillationszähiers die Restradioaktivität in dem Reagensglas gemessen wird. Nach dieser Methode können 1 μΐυ/ml Insulin gemessen werden.

Ausführungsbeispiel 3

Messung von menschlichem Placentalactogen (HPL) a) Herstellung von einer Standard-HPL-Lösung

Nach der Methode von H.Morikawa et al. (Jap. J. Endocrinol, 49, 882 [1973]), wird HPL aus der Placenta einer normalen schwangeren Frau extrahiert und gereinigt und zur Erzielung von Konzentrationen von 100, 10, 24, 0,6, 0,15 und 0 ng/ml in PBS mit einem pH von 6,4, enthaltend 0,1 % BSA, aufgelöst.

b) Herstellung von HPL-HCG-Konjugat

Nach der Methode gemäß Ic) werden 5 mg rICG und 5 mg HPL miteinander umgesetzt, wobei ein HPL-HCG-Konjugat erhalten wird.

c) Herstellung einer Anti-HPL- Antikörpergekuppehen Cellulose

Ein Kaninchenanti-HPL-Serum, das aus einem Kaninchen erhalten wird, das gegen HPL immunisiert ist, wird durch Aussalzen zur Erzeugung eines Anti-HPL-Antikörpers gereinigt Nach der Methode gemäß Id) wird der auf diese Weise erhaltene Antikörper mit Cellulose umgesetzt, wobei eine

45 Anti-HPL-Antikörper-gekuppelte Cellulose erhalten wird, die dann gefriergetrocknet wird.

d) HPL-Messung

0,5 ml einer l°/oigen Suspension der gpmr.ß c) erhaltenen Anti-HPL-Antikörper-gekuppelten Cellulose und 0,1 ml jeweils der gemäß a) erhaltenen Standard-HPL-Lösung werden zusammen in ein Reagensglas eingefüllt. Die Mischung wird während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei 37°C bebrütet. Dann wird die Mischung mit 0.1 ml HPL-HCG-Konjugat. erhalten gemäß b) versetzt, worauf während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei 37°C bebrütet wird. Nach der Bebrütung wird die Anti-HPL-Antikörper-gekuppelte Cellulose abgetrennt und mit Phosphatpuffer gewaschen. Dann werden 0,1 ml des Anti-HCG-Antikörptr-HRP-Konjugats, erhalten gemäß Beispiel Ic), und 0,6 ml BSA, 0,5°/oig, zugesetzt, worauf sich eine Bebrütung während eiiiei Zeitspanne vun i Siunuc bei 37"C anschließt. Anschließend erfolgt ein Waschen mit einem Phosphatpuffer, worauf 3 ml einer Substratlösung zugesetzt werden, die 5-Aminosalicylsäure (60 mg/dl) und 0,3%iges Wasserstoffperoxid (1 ml/cil) enthält. Di? Mischung läßt man während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Dann wird das Absorptionsvermögen bei 465 nm gemessen. Nach dieser Methode können 0,5 bis 1 ng/ml HPL gemessen werden.

Ausführungsbeispiel 4

Östriolmessung
a) Herstellung einer Standardöstriollösung

östriol (Sigma Chemical) wird zur Erzielung von Konzentrationen von 640, 160, 40, 10, 2,5 und 0 ng/m! in PBS mit einem pH von 6,4. enthaltend 0,1% BSA, aufgelöst.

b) Herstellung von Östriol-lö.^-dihemisuccinat-

BSA-Konjugat

600 mg Östriol-16,17-dihemisuccinat (Am. J. Obstet. Gynecol., 109, 897 [1971]), werden in 12 ml Dioxan aufgelöst, worauf 0,3 ml Tri-n-butylamin der Lösung zugesetzt werden. Nach einer Abkühlung auf 12"C wird die Lösung mi; 0,17 ml Isobutylchlorcarbonat versetzt, worauf durch Rühren gut vermischt wird. Die auf diese Weise erhaltene Mischung wird mit einer Lösung vermischt, die durch Auflösen von 1,70 g BSA in 40 ml destilliertem Wasser erhalten worden ist. Der pH der Lösung wird unter Verwendung von 1 n-Natriumhydroxid auf 12,0 eingestellt, worauf 40 ml Dioxan zugesetzt werden. Die Mischung läßt man dann bei 12° C stehen. Nach der Umsetzung während einer Zeitspanne von 4 Stunden unter Rühren werden nichtumgesetzte Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, wie Östriol-16,17-dihemisuccinat und Tri-n-butylamin, unter Verwendung von Sephadex G-25 abgetrennt Die Fraktion mit hohem Molekulargewicht wird gefriergetrocknet, wobei ein östriol-lö^-diliemisuccinat-BSA-Konjugat erhalten wird.

c) Herstellung von Östron-17-oxim-hämoglobin-

Konjugat

In 2OmI Dioxan werden 687 mg Östron-17-oxim (Erlanger. B. F, J. Biol. Chem, 234, 1090 [1959]), aufgelöst Die erhaltene Lösung wird mit 03 ml Tri-n-butylamin versetzt Nach einem Abkühlen auf 1 TC werden der Lösung 0,27 ml Isobutylchlorcarbonat

zugesetzt, worauf gerührt wird. Dieser Mischung wird eine Lösung zugesetzt die durch Auflösen von 2,42 g Hämoglobin (Hb) in 70 ml destilliertem Wasser erhalten worden ist Der pH wird auf 9,5 eingestellt worauf 70 ml Dioxan zugegeben werden. Dann hält man die Mischung bei H⁰C Nach einer Umsetzung während einer Zeitspanne von 4 Stunden unter Rühren werden nichtumgesetzte Substanzen mit niederem Molekulargewicht unter Verwendung von Sephadex G-25 abgetrennt Die Fraktion mit hohem Molekulargewicht wird gefriergetrocknet wobei ein östror.-17-oxim-Hb-Konjugat erhalten wird.

d) Herstellung von Anti-Hb-Antikörper-HRP-Konjugat

Eine Ziege wird mit jeweils 20 mg Hb zusammen mit vollständigem Freundschem Adjuvans drei- bis viermal pro Woche gespritzt Nach der Methode gemäß Ib) wird ein Anti-Hb-Antikörperglobulin erhalten. Die Umsetzung zwischen 5 mg dieses Anti-Hb-Antikörperglobu- lins und 5 mg HRP erfolgt nach der Methode Ic), wobei ein Anti-Hb-Antikörper-HRP-Konjugat erhalten wird;

e) Herstellung von Antiöstriolantikörper

Das gemäß b) erhaltene Östriol-ie.tf-dihemisucctnat-BSA-Konjugat wird in einer physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst Die Lösung wird zusammen mit vollständigem Freundschen Adjuvans wiederholt subkutan in das Hinterteil eines erwachsenen Kaninchens injiziert, wobei jeweils 2 mg des Konjugats eingespritzt werden. Nachdem ein Anstieg des Antikörpertiters festgestellt worden ist, wird das Blut gesammelt wobei nach der Methode gemäß Ib) ein Antiöstriol-16,17-dihemisuccinat-BSA-Antikörper erhalten wird. Unter Verwendung von BSA, gekuppelt mit Sepharose durch Bromcyan, wird der Anti-BSA-Antikörper aus diesem Antikörper entfernt Nach Zugabe von BSA-gekuppelter Sepharose in einer Menge von 25 ml bis 50 ml der Antikörperlösung läßt man die Suspension während einer Zeitspanne von 30 Minuten bei 37° C stehen, worauf sich eine Bebrütung über Nacht bei 4° C anschließt Dann wird die Suspension während einer Zeitspanne von 10 Minuten bei 4" C zentrifugiert, wobei ein spezifischer Antikörper zu Östriol erzeugt wird.

Q östriolmessung

In ein nach der Methode Ha) hergestelltes Anti· östrioI-Antikörper-sensibilisierUs Polystyrolreagensglas werden 0,6 ml BSA (0,1 %ig) und 0,1ml der Standardöstriollösung gemäß a) zusammen eingefüllt und während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur bebrütet Dann werden 0,1 ml des gemäß c) hergestellten östron-17-oxim-Hb-Konjugats der Lösung zugesetzt, worauf während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur bebrütet wird. Nach der Reaktion erfolgt ein Waschen mit Phosphatpuffer. Anschließend werden 0,1 ml des gemäß d) erhaltenen Anti-Hb-Antikörper-HRP-Konjugats und 0,5 ml BSA (0,1 %ig) zugesetzt worauf während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur bebrütet wird. Anschließend wird gewaschen. Dann werden 3 ml einer Substratlösung gemäß Beispiel 1 zugesetzt worauf man die Mischung während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehenläßt Dann wird das Absorptionsvermögen bei 465 nm gemessen. Nach dieser Methode kann 1 mg/ml östriol gemessen werden.

Ausführungsbeispiel 5 Insulinmessung

a) Herstellung von Rattenleberinsulinrezeptor Rattenleberinsulinrezeptor wird nach der Methode von K. Suzuki et aL (Saishin Igaku, 30, 591 [1975J hergestellt

b) Herstellung von Insulin-HCG-Konjugat

Nach der Methode gemäß Beispiel Ia) wird ein Insulin-HCG-Konjugat erhalten.

c) Herstellung von mit ^IJSJ markiertem Anti-HCG-Antikörper

Der gemäß Beispiel Ib) erhaltene Anti-HCG-Antikörper wird mit ¹²⁵J nach der Chloramin-T-Methode markiert Der markierte Antikörper wird mit Sephadex G-50 gereinigt, wobei ein ¹²⁵J-Anti-HCG-Antikörper erhalten wird.

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d) Insulinmessung

In ein Reagensglas werden 0,1 ml der Standardinsulinlösung gemäß Ia), 0,5 ml BSA (0,5%ig) und 0,1 ml der Rezeptorsuspension gemäß a) eingefüllt, worauf sich eine Bebrütung während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei 4° C anschließt Dann werden 0,1 ml des Insulin-HCG-Konjugats gemäß b) zugesetzt, worauf man die Mischung über Nacht bei 4°C stehenläßt Dann wird die Reaktionsmischung zentrifugiert, worauf der ausgefalle-

ne Rezeptor mit einem kalten Phosphatpuffer gewaschen wird. Dann werden in das Reagensglas 0,5 ml BSA (0,5%ig) und 0,1 ml der ' ²⁵J-Anti-HCG-Antikörperlösung eingefüllt, worauf die Mischung über Nacht bei 4°C stehengelassen wird. Nach einem Zentrifugieren und

so einem Waschen mit Phosphatpuffer wird die Radioaktivität des ausgefällten Rezeptors gemessen. Nach dieser Methode können mehr als 5ng/ml Insulin gemessen werden.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche;

1. Immunchemisches Meßverfahren, gekennzeichnetdurch folgende Stufen:

a) Umsetzung eines Antikörpers zu einem zu messenden Antigen (Ab 1) mit dem zu messenden Antigen (Ag 1) und einem Konjugat, das durch Kupplung des zu messenden Antigens an ein zweites Antigen mit einer starken Antigenizität gebildet worden ist (Ag 1 —Ag 2),

b) Abtrennen des durch die vorstehende Reaktion gebildeten Komplexes Ab 1—Ag 1—Ag 2 aus der Reaktionsmischung,

c) Umsetzung des abgetrennten Komplexes Ab 1—Ag 1—Ag 2 mit einem markierten Antikörper zu dem zweiten Antigen (Ab 2),

d) Abtrennen des Komplexes Ab 1—Ag 1—Ag 2 — markiertes Ab 2, der bei der Reaktion gemäß

c) ei^eugt wird, von der Reaktionsmischung, und

e) Messen entweder der Aktivität des Markierungsmittels, aas an die vorstehenden Reaktionsprodukte gebunden ist, oder des Markierungsmittels, das in der Reaktionsrr.ischung zurückbleibt

Verfahren nach Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete zweite Antigen aus

Rinderserumalbumin,

menschlichem Serumalbumin,

Kanincl i/iii-y-Globulin,

menschlichem Choriumgonadotropin,

Hämoglobin, Tetanustoxoid,

einem pneuniokokkafen Pa'vsaccharid oder aus einem GIutaminsäure/Lysin/Tyrosin-

Copolymeren besteht

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte Markierungsmittel ein Radioisotop, Enzym oder ein fluoreszic- rendes Material ist

4. Reagens zur Durchführung einer immunchenr sehen Messung, gekennzeichnet durch ein Konjugat, das durch Kupplung des zu messenden Antigens an ein zweites Antigen mit einer starken Antigenizität gebildet worden ist.

5. Reagens nach Anspruch 4. dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Antigen aus

Albumin, menschlichem Serumalbumin,

y-Globulin, so

menschlichem Choriumgronadotropin,

Hämoglobin, Tetanustoxoid,

einem pneumokokkalem Polysaccharid oder aus

einem Glutaminsäure/Lysin/Tyrosin-

Copolymeren besteht.

6. Reagens nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß es gefriergetrocknet ist

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