DE2744835A1

DE2744835A1 - Immunchemisches messverfahren

Info

Publication number: DE2744835A1
Application number: DE19772744835
Authority: DE
Inventors: Masakatsu Hashimoto; Ei Mochida; Nobuhisa Ogawa; Hrioyuki Shinkai
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1976-10-07
Filing date: 1977-10-05
Publication date: 1978-04-13
Also published as: DE2744835B2; DE2744835C3; JPS604422B2; US4185084A; JPS5347520A

Description

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Beschreibung

Antigensubstanzen, wie Insulin, Choriumgonadotropin, Wachstumshormon sowie Iminunoglubolin, zeichnen sich durch eine Spezifizität und Empfindlichkeit aus, mit welcher sie sich mit ihren Antikörpern verbinden. Unter Ausnützung dieser Tatsache wurden viele Versuche unternommen, derartige Antigensubstanzen oder ihre Antikörper zu messen. Derzeit wird eine Reihe von derartigen Meßverfahren angewendet. Beispielsweise seien folgende Verfahren erwähnt: Die Immundiffusionsmethode, bei deren Durchführung das Antigen und der Antikörper miteinander in einem Agargel umgesetzt werden, die Agglutinierungsreaktions- und Agglutinierungsinhinbierungsreaktionsmethode, bei deren Durchführung Blutzellen oder feine Teilchen, wie Polystyrollatex, als Träger für.Antigen oder Antikörper verwendet werden, sowie die Radioimmunoassay (RIA), bei deren Durchführung Radioisotope zur Markierung des Antigens oder des Antikörpers eingesetzt werden.

In neuerer Zeit wurden Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, wie Steroide, Tyroidhormone sowie aktive Amine, deren Antikörperherstellung schwierig ist, zu messen nach der konkurrierenden Methode unter Ausnützung der Bindereaktion des Rezeptorproteins oder des Bindeproteins, das in spezifischer Weise sich mit diesen Substanzen verbindet, verwendet. In jüngerer Zeit konnten jedoch die Antikörper dieser Substanzen relativ einfach hergestellt werden, so daß sie nunmehr in der gleichen Weise wie die vorstehend erwähnten Antigensubstanzen gemessen werden können.

Diese Methoden werden in breitem Umfange angewendet. Beispielsweise wird die RIA, die bezüglich der Empfindlichkeit und der quantitativen Genauigkeit der Messung hervorragend ist, in breitem Umfange eingesetzt. Die Substanzen, die nach · dieser Methode meßbar sind, bestehen aus einer Vielzahl hochmolekularer Substanzen, wie Immunoglobulin, Viren oder Pro-

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teinhormonen, sowie Substanzen mit niederem Molekulargewicht, wie Peptiden oder Steroiden.

Eine RIA unter Einsatz von Radioisotopen erfordert jedoch große Kenntnisse und Geschick des eingesetzten Personals. Ferner sind kostspielige Instrumente und Vorrichtungen nötig. Darüber hinaus ist diese Methode im Hinblick auf die ümweltverseuchung vielen Einschränkungen unterzogen. Aus diesen Gründen wird sie in der klinischen Praxis nur in begrenztem Umfange eingesetzt. Ist eine mit einem Radioisotop zu markierende Substanz beispielsweise eineVerbindung mit einem niederen Molekulargewicht, wie ein Steroid oder eine instabile Substanz, wie menschliches Placentalactogen, dann ist es schwierig, die Substanz direkt zu markieren. Auch dann, wenn die Markierung möglich ist, ist die Substanz praktisch infolge einer Verminderung oder eines Verlustes ihrer immunologischen Aktivität schlecht einsetzbar.

Zur Vermeidung dieser Nachteile wurden in neuerer Zeit neue Verfahren entwickelt, wie beispielsweise die EIA (Enzymimmunoassay) unter Verwendung eines Enzyms sowie die FIA (Floureszenzimmunoassay), die unter Einsatz eines fluoreszierenden Materials anstelle eines Radioisotops arbeitet. Diese Verfahren zeichnen sich durch eine hohe Empfindlichkeit und quantitative Meßgenauigkeit aus, wobei diese Eigenschaften ungefähr denjenigen der RIA entsprechen.

Die RIA, EIA und FIA arbeiten auf dem gleichen Prinzip, d. h. auf der Grundlage von zwei Methoden, und zwar der konkurrierenden Methode und der Sandwichmethode. Das Prinzip läßt sich anhand des Falles eines Antigens, das als zu messende Substanz eingesetzt wird, sowie eines Antikörpers, der als Substanz verwendet wird, die sich in spezifischer Weise mit der zu messenden Substanz verbinden (nachfolgend als bindefähige Substanz bezeichnet) erläutern.

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1) Konkurrierende Methode:

Läßt man eine unbekannte Menge eines nichtmarkierten Antigens sowie eine gegebene Menge eines markierten Antigens miteinander konkurrierend mit einer gegebenen Menge ihres Antikörpers reagieren, dann verbinden sich das nichtmarkierte Antigen und das markierte Antigen mit dem Antikörper im Verhältnis ihrer jeweiligen Mengen. Daher ist die Menge an markiertem Antigen, die mit dem Antikörper verbunden wird, umgekehrt proportional zu der Menge des nichtmarkierten Antigens. Durch geeignete Maßnahmen werden das markierte Antigen, das sich mit dem Antikörper verbunden hat, und das markierte Antigen, das keine Bindung eingegangen ist, getrennt.

Die Aktivität entweder des an den Antikörper gebundenen markierten Antigens oder des nicht an den Antikörper gebundenen Antigens wird gemessen. In der Zwischenzeit v/ird eine Verdünnungsreihe von Bezugssubstanzen, deren Konzentration bekannt ist, hergestellt, wobei in der vorstehend beschriebenen Weise die Aktivität des Markierungsmittels gemessen wird. Eine Standardkurve, die durch Auftragen der gemessenen Aktivitäten erhalten wird, wird zur Bestimmung der Menge der zu messenden Substanz verwendet.

2) Sandwich-Methode:

Werden eine unbekannte Menge eines nichtmarkierten Antigens sowie seines Antikörpers, der unlöslich gemacht worden ist, miteinander umgesetzt, dann verbindet sich das Antigen mit dem Antikörper unter Bildung eines Antigen/Antikörper-Komplexes. Dieser Komplex wird von der Reaktionsmischung abgetrennt und mit einer gegebenen Menge eines markierten Antikörpers umgesetzt. Dieser markierte Antikörper verbindet sich mit dem Komplex, ein Teil des markierten Antikörpers, welcher die Bindefähigkeit des Komplexes übersteigt, verbleibt in freiem Zustand in der Lösung. Dann werden der "gebundene" markierte Antikörper und der "freie" markierte

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Antikörper voneinander getrennt. Die Aktivität entweder des "gebundenen" oder des "freien" Markierungsmittels wird gemessen. Nach der im Zusammenhang mit der vorstehend beschriebenen konkurrierenden Methode beschriebenen Weise wird eine Standardkurve hergestellt, die zur Bestimmung der unbekannten Menge des nichtmarkierten Antigens verwendet werden kann.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines immunchemischen Verfahrens zur Messung von physiologisch aktiven Substanzen. Durch die Erfindung soll ein Meßverfahren geschaffen werden, bei dessen Durchführung Substanzen mit niederem Molekulargewicht sowie schwach antigene Substanzen mit hoher Empfindlichkeit gemessen werden können. Ferner sollen durch die Erfindung Reagentien für ein derartiges immunchemisches Verfahren zum Messen von physiologisch aktiven Substanzen zur Verfügung gestellt werden.

Die Erfindung wird durch die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine Standardkurve für die Insulinmessung in dem

Vergleichsfall 1;
Fig. 2 eine Standardkurve für die Insulinmessung im Falle des Ausführungsbeispiels 1.

Die Erfindung betrifft ein neues immunchemisches Meßverfahren, das eine Kombination aus der konkurrierenden Methode und der Sandwich-Methode darstellt. Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf ein Beispiel beschrieben, bei dessen Ausführung ein Antigen sowie sein Antikörper eingesetzt werden.

Eine unbekannte Menge eines zu messenden nichtmarkierten Antigens und eine gegebene Menge eines Antigenkonjugats, d. h. des nichtmarkierten Antigens, das sich mit einer anderen Antigensubstanz verbunden hat (nachfolgend als zweites Antigen bezeichnet) läßt man konkurrierend mit einer gegebenen Menge des Antikörpers zu dem Antigen, das gemessen

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werden soll, reagieren. Da das zu messende Antigen und das Antigenkonjugat sich mit dem Antikörper proportional zu ihren jeweiligen Mengen verbinden, ist die Menge des Antigenkonjugats, das mit dem Antikörper verbunden ist, umgekehrt proportional zu der Menge des zu messenden Antigens, Anschließend werden das zu messende Antigen und das Antigenkonjugat zu der Fraktion B (der Menge, die sich mit dem Antikörper verbunden hat) und der Fraktion F (der Menge, die nicht gebunden ist) aufgetrennt. Eine dieser Fraktionen läßt man mit einer gegebenen Menge eines markierten Antikörpers zu dem zweiten Antigen umsetzen. Der markierte Antikörper verbindet sich mit dem zweiten Antigen in der Fraktion B oder F, der Teil des markierten Antikörpers, welcher die Bindefähigkeit übersteigt, bleibt frei in der Reaktionsmischung zurück. Der markierte Antikörper in der Reaktionsmischung wird dann zu "gebundenem" markierten Antikörper und "freiem" markiertem Antikörper aufgetrennt. Die Aktivität des markierten Antikörpers entweder in der "gebundenen" Fraktion oder in der "freien" Fraktion wird gemessen. Aus einer Standardkurve, die aus einer Bezugssubstanz anhand eines parallelen Versuchs aufgetragen worden ist, wird die unbekannte Menge des nichtmarkierten zu messenden Antigens bestimmt.

Im vorstehenden Falle ist die zu messende Substanz ein Antigen und die bindefähige Substanz ihr Antikörper. Die Erfindung ist jedoch auch auf den Fall anwendbar, daß die zu messende Substanz ein Antikörper und die bindefähige Substanz sein Antigen ist. Die Erfindung ist sogar auf das Hapten/Antikörper-System oder ein System aus physiologisch aktiver Substanz und Rezeptorprotein oder Bindeprotein sowie auf ein vollständiges Antigen/Antikörper-System anwendbar.

Verschiedene Tierserumproteine, wie Albumin oder Globulin, * sowie stark antigene Substanzen, wie menschliches Choriumgonadotropin (HCG), Hämoglobin, Tetanustoxoid, pneumokokka-

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le Polysaccharide, oder Glutaminsäure/Lysin/Tyrosin-Copolymere sind als zweites Antigen, das mit der zu messenden Substanz verkuppelt werden kann, verfügbar, es ist jedoch vorteilhaft, wie nachfolgend noch näher erläutert wird, ein Glycoprotein, wie IKG, einzusetzen.

Die Methode zur Herstellung eines zweiten Antigens, das an die zu messende Substanz gekuppelt ist, schwankt in Abhängigkeit von den Eigenschaften der zu messenden Substanz und dem zweiten Antigen. Beispielsweise kann man das zweite Antigen nach verschiedenen Methoden an das Protein kuppeln, beispielsweise nach Methoden unter Verwendung einer Proteinaminogruppe als Bindestelle (Diisocyanatmethode, Maleinsäureanhydridmethode, Glutaraldehydmethode, Ameisensäureanalogonmethode), ferner kann man auf eine Methode zurückgreifen, die sich einer SH-Gruppe als Bindestelle bedient (divalente Quecksilberverbindungmethode) . Erwähnt sei ferner eine Methode unter Verwendung einer Tyrosin- oder Kistidingruppe als Bindestelle (Diazoverbindung-Methode) oder eine Methode unter Einsatz einer Carboxylgruppe als Bindestelle (Carbodiimidmethode). Zum Verkuppeln des zweiten Antigens mit einem Hapten, wie einem Steroid, ist die Henisuccinatmethode oder Oximmethode verfügbar. Wird ein Glycoprotein, wie HCG, als zweites Antigen verwendet, dann ist es möglich, die Kupplung unter Verwendung einer Aldehydgruppe durchzuführen, die durch Oxidation ihrer Zuckerkette erhalten worden ist. Diese Methode ist besonders zufriedenstellend, da sie einen guten Bindungsgrad ermöglicht und nur eine geringe Beschädigung der Substanz bedingt, die mit dem zweiten Antigen verkuppelt wird.

Der Antikörper zu einem zweiten Antigen kann nach einer Routinemethode durch Immunisieren eines Kaninchens oder einer Ziege hergestellt werden.

Als Mittel zur Markierung des Antikörpers stehen folgende

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Materialien zur Verfügung: Radioisotope (beispielsweise

J, J, H, C), Enzyme (beispielsweise Meerrettichperoxidase, ß-D-Galactosidase, alkalische Phosphatase, Glucoseoxidase, Glucoamylase) oder fluoreszierende Materialien (beispielsweise Fluoreszeinisothiocyanat, Rhodamin).

Zum Markieren des Antikörpers mit derartigen Mitteln sind folgende Methoden anwendbar: Die Chloramin T-Methode (F. C. Greenwood und W. M. Hunter, Nature, 194, 495 (1962)), die Perjodatmethode (P. Nakane und A. Kawaoi, J. Histochem. Cytochem., 22, 1084 (1974)) oder andere Methoden.

Zur Abtrennung eines Antigenkonjugats, das sich mit dem Antikörper verbunden hat, von einem Antigenkonjugat, das keine derartige Bindung eingegangen ist, oder zur Abtrennung eines markierten Antikörpers, der sich mit dem Antigenkonjugat verbunden hat, von einem markierten Antikörper, der keine derartige Bindung eingegangen ist, stehen viele bekannte Methoden zur Verfügung, beispielsweise Chromatographiemerhoden, eine Elektrophorese, ein Aussal-'zen, eine alkoholische Ausfällung, eine Gelfiltration, eine Festphasenmethode sowie die Methode des doppelten Antikörpers. Aus Gründen einer einfachen Arbeitsweise ist es vorteilhaft, die Methode der festen Phase anzuwenden, bei deren Durchführung ein Antikörper an einen unlöslichen Träger gebunden wird.

Im Vergleich zu den herkömmlichen Methoden zeichnet sich die Erfindung durch folgende herausragende Merkmale aus:

Es ist bekannt, daß Substanzen mit relativ niedrigem Molekulargewichten, wie Insulin, Adrenocorticotropin, Glucagon oder Gastrin, schwach antigen sind. Aufgrund einer geringen Reaktivität bezüglich des markierten Antikörpers binden diese Substanzen nur eine geringe Menge des markierten Antikörpers. Zur Erhöhung der gebundenen Menge an dem markierten Antikörper wird erfindungsgemäß

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eine stark antigene Substanz mit der zu messenden Substanz verkuppelt. Dabei kann man die zu messende Substanz veranlassen, eine große Menge des markierten Antikörpers infolge der hohen Bindefähigkeit des zweiten Antigens zu binden. Erfindungsgemäß kann daher die Messung mit einer höheren Empfindlichkeit als nach der Durchführung der herkömmlichen Methode durchgeführt werden, und zwar auch dann, wenn die Menge der zu messenden Substanz extrem niedrig ist.

Darüber hinaus hat die Erfindung den Vorteil, daß dann, wenn das zweite Antigen, das mit der zu messenden Substanz verkuppelt wird, auf ein einziges Material beschränkt ist, das die beste Messung bedingt, nur eine Art eines markierten Antikörpers ausreicht, so daß es nicht mehr erforderlich ist, verschiedene markierte Antikörper entsprechend den verschiedenen zu messenden Substanzen herzustellen.

Die erfindungsgemäß meßbaren Substanzen sind beispielsweise Substanzen mit niederem Molekulargewicht, z. B. Steroide, wie Testosteron, Setriol, Progesteron, Corticosteron oder Aldosteron, Thyroidhormone, wie Thyroxin oder Trijodthyronin, physiologisch aktive Peptide, wie Bradykinin oder Angiotensin, Thyroidhormone freisetzende Hormone, luteinisierende Hormone freisetzende Hormone, physiologisch aktive Amine, wie Epinephrin, Norepinephrin, Histamin, Serotonin oder Prostglandin, Substanzen mit relativ niedrigem Molekulargewicht, beispielsweise Insulin, Glucagon, Adrenocorticotropin oder Gastrin, sowie Substanzen mit hohem Molekulargewicht, beispielsweise menschliches Choriumgonadotropin. Wachstumshormon, menschliches Placentalactogen, Immunoglobulin S₁CX -Fötoprotein oder Hepatitis-B-Antigen.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen und Vergleichsbeispielen näher erläutert.

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Vergleichsfall 1: Messung von Insulin (konkurrierende Methode)·

a) Herstellung einer Standard-Insulin-Lösung

Kristallines Rinderinsulin (Sigma Chemical, 25 IU/mg) wird

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bis zu Konzentrationen von 10 , 10 , 320, 80, 20 und 0 μΐϋ/ml in einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS, pH 6,4) die
0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) enthält, aufgelöst.

b) Herstellung des Antiinsulinantikörpers

In einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiertes kristallines Rinderinsulin wird durch Zugabe von 0,1 η Chlorwasserstoff säure, Tropfen für Tropfen, aufgelöst. Es wird eine
Konzentration von 2 mg/ml eingestellt. Die Insulinlösung
wird mit Aktivkohlepulver (Wako Pure Chemical) in einer Menge von 10 mg pro 1 ml der Insulinlösung vermischt. Auf diese Weise wird das Insulin an der Aktivkohle adsorbiert. Die Aktivkohle mit adsorbierrein Insulin wird durch Zentrifugieren
abgetrennt. Durch Zugabe von 0,5 ml einer physiologischen
Kochsalzlösung zu 10 mg dieser Aktivkohle erhält man eine
Suspension aus Aktivkohle mit adsorbiertem Insulin. Ein
Meerschweinchen wird jede Woche mit einer Mischung aus 0,25
ml dieser Suspension und 0,25 ml eines vollständigen Freund¹ sehen Adjuvanses (Freund¹s complete adjuvant) gespritzt. Die Injektion wird zehnmal wiederholt. Eine Woche nach der letzten Injektion wird das Blut aus dem Karotid des Tieres gesammelt, wobei ein Meerschweinchenantiinsulinserum erhalten wird. Das auf diese Weise erhaltene Antiserum wird zweimal mit Natriumsulfat ausgesalzen, wobei der Antiinsulinantikörper erhalten wird.

c) Herstellung eines Insulin-Meerrettichperoxidasekonjugats

Nach der Perjodat-Methode von P. Nakane und A. Kawaoi wird
kristallines Rinderinsulin mit Meerrettichperoxidase verbunden. 5 g Meerrettichperoxidase (HRP) werden in 1 ml einer

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0,3m Natrium.bicarbonatlösung aufgelöst, worauf sich die Zugabe von 0,1 ml eines 1 %igen 2,4-Dinitroflourbenzols anschließt. Die erhaltene Mischung wird während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wird 1 ml einer 0,08m Natriumperjodatlösung zugesetzt und während einer Zeitspanne von 30 Minuten bei Zimmertemperatur eingemischt, worauf sich die Zugabe von1 ml einer 0,16m Äthylenglykols und ein Mischen während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur anschließen. Die erhaltene Lösung wird über Nacht gegen einen 0,01m Natriumcarbonatpuffer mit einem pH von 9,5 dialysiert. Dann wird 1,0 ml einer Insulinlösung zugesetzt, die durch Auflösung von kristallinem Rinderinsulin zur Erzielung einer Konzentration von 5 mg/ml in einer 0,01m Natriumcarbonatpufferlösung mit einem pH von 9,5 erhalten worden ist. Nach einer dreistündigen Reaktion bei Zimmertemperatur werden 5 mg Natriumborhydrid der Reaktionsmischung zugesetzt, worauf man die Mischung weitere 3 Stunden bei 4°C stehenläßt. Nach der Reaktion wird über Nacht eine Dialyse gagen PBS mit einem pH von 7,2 durchgeführt, worauf sich eine Fraktionierung und Reinigung mit Sephadex G-200 und ein Gefriertrocknen anschließt. Dabei erhält man ein Insulin-Meerrettich-Peroxidasekonjugat (INS-HRP) .

d) Herstellung einer Kaninchen-Antimeerschweinchen -qglobulinantikörper-gekuppelten Cellulose

Ein gesundes Meerschweinchenserum wird durch Aussalzen und DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie gereinigt, wobie eine /'-Globulinfraktion erhalten wird. Die erhaltene Meerschwein chen- <j -globulinfraktion wird zur Einstellung einer Konzentration von 2 mg/ml in einer physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst. 0,5 ml der erhaltenen Lösung werden mit 0,5 ml eines vollständigen Freund'sehen Adjuvanses vermischt. Die Mischung wird fünfmal in ein Kaninchen . einmal pro Woehe eingespritzt. Eine Woche nach der letzten Injektion wird das Blut aus dem Kaninchen gesammelt. Auf diese

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Weise wird das Kaninchenantimeerschweinchen-^-globulinserum erhalten. Das erhaltene Antiserum wird durch Aussalzen gereinigt, wobei der Kaninchenantimeerschweinchen- 1T~ globulinantikörper erhalten wird.

8 g Cellulosepulver (Merk Chemical) werden zu 320 ml eines 2,5 %igen Bromcyans gegeben. Die Suspension wird auf einen pH von 10 bis 11 durch eine 1n Natriumhydroxidlösung eingestellt, worauf sich eine Umsetzung während einer Zeitspanne von 2 Minuten unter Rühren anschließt. Dann wird die Suspension durch ein Glasfilter geschickt und mit einer 0,1 η Natriumbicarbonatlösung gewaschen, wobei eine aktivierte Cellulose erhalten wird. Die aktivierte Cellulose wird in 32 ml einer 0,1m Natriumbicarbonatlösung suspendiert! Dieser Suspension werden 8 mg des Kaninchenantimeerschweinchen- $-globulinantikörpers zugesetzt, worauf sich ein Stehenlassen während einer Zeitspanne von 22 Stunden bei A-*'C unter Rühren anschließt. Nach der Umsetzung wird die Suspension mit PBS mit einem pH von 6,4 und einer Mischung eines 8 molaren Harnstoffs und eines 0,2 molaren Glycins mit einem pH von 7,0 gewaschen und zur Erzielung einer Konzentration von 10 % in PBS mit einem pH von 6,4, enthaltend 1 % BSA, suspendiert.

e) Insulinmessung

0,1 ml einer Standardinsulinlösung mit der jeweils gemäß a) erhaltenen Konzentration werden in ein Reagensglas eingefüllt, Dann werden 0,1 ml des Antiinsulinantikörpers gemäß b) als Lösung, die auf das 16000-fache mit PBS verdünnt ist, zugesetzt. Dann wird während einer Zeitspanne von 50 Minuten bei 2iTEHnertempera-tur bebrütet. Die Lösung wird dann iait Q_f1 ml INS-HRP gemäß c) in Form einer 30-fach verdünnten Lösung mit PBS versetzt, worauf während einer Zeitspanne von 4 0 Minuten bei Zimmertemperatur bebrütet wird. Dann werden 0,1 ml einer 10 %igen Suspension der Kaninchenantimeerschweinchen- /-globulinantikörper-gekuppelten Cellulose gemäß d) zugesetzt. Die Suspension wird während einer Zeitspanne von

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90 Minuten bebrütet. Die feste Phase wird nach einem Abtrennen der flüssigen Phase zweimal mit einer physiologischen Kochsalzlösung, die Tween 20 enthält, gewaschen. Dann werden 3 ml einer Substratlösung, die 5-Aminosalicylsäure (60 mg/dl) sowie 3 %iges Wasserstoffperoxid (100 μΐ/dl) enthält, zugesetzt, worauf während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur bebrütet wird. Nach einer Zugabe von 2 Tropfen einer 1,6 %igen Natriumazidlösung wird das Absorptionsvermögen bei 465 nm gemessen. Die dabei erzeugte Standardkurve geht aus der Fig. 1 hervor. Aus Fig. 1 können 50 μΐϋ/ml Insulin gemessen werden.

Vergleichsfall 2: Insulinmessunq (Sandwich-Methode)

a) Herstellung eines Antikörper-sensibilisierten Polystyrolreagensglases

Der gemäß 1 b) erhaltene Antiinsulinantikörper wird zur Erzielung einer Konzentration von 100 μg/ml in einem Glycinpuffer mit einem pH von 8,2 aufgelöst. 1 ml der Lösung wirdin ein Polystyrolreagensglas mit einem inneren Durchmesser von 1,5 cm und einer Länge von 10 cm eingefüllt. Das Reagensglas wird während einer Zeitspanne von 3 Stunden bei 37⁹C bebrütet. Das Reagensglas wird in einerphysiologischen Kochsalzlösung gewaschen, worauf ein 1 %iges normales Meerschweinchenserum-PBS zugesetzt wird. Man läßt die Mischung bei 4°C über Nacht stehen. Dabei wird ein Antiinsulinantikörpersensibilisiertes Polystyrolreagensglas erhalten.

b) Herstellung eines AntiinsulinantikÖrper-HRP-Konjugats

Nach der unter 1 c) beschriebenen Methode wird eine Reaktion zwischen 5 mg des Antiinsulinantikörpers gemäß 1 a) und 5 mg HRP durchgeführt, wobei ein Antiinsulinantikörper-HRP-Konjugat erhalten wird.

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c) Insulinmessung

Das Antiinsulinantikörper-sensibilisierte Polystyrolreagensglas, das gemäß a) hergestellt worden ist, wird mit 0,1 ml der Standardinsulinlösung mit der jeweils gemäß 1 a) erzielten Konzentration gefüllt und dann während einer Zeitspanne von 1 Stunde bebrütet. Nach dem Verwerfen der Üösung wird das Reagensglas mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Nachdem 0,1 ml des gemäß b) hergestellten Antiinsulinantikörper-HRP-Konjugats in das Reagensglas eingefüllt worden sind, wird dieses während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehengelassen. Nach der Reaktion wird das Reagensglas mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Dann werden 3 ml einer Substratlösung, die 5-Aminosalicylsäure (60 mg/dl) und 0,3 %iges Wasserstoffperoxid (1 ml/dl) enthält, zugesetzt, worauf man die Mischung während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehenläßt. Anschließend wird das Absorptionsvermögen bei 465 ran gemessen. Aus der dabei erzeugten Standardkurve lassen sich 20 bis 30 μΐϋ/ml Insulin messen.

Ausführungsbeispiel 1: Insulinmessung

a) Herstellung des Insulin-HCG-Konjugats

5 mg HCG werden in 1 ml einer 0,3m Natriumbicarbonatlösung aufgelöst und mit 0,1 ml eines 1 %igen 2,4-Dinitrofluorbenzols vernetzt, worauf man die Mischung während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehenläßt. Anschließend wird nach der Methode gemäß 1 c) ein Insulin-HCG-Konjugat (INS-HCG) erhalten.

b) Herstellung von Anti-HCG-Antikörper

HCG wird in ein Kaninchen in üblicher Weise zur Gewinnung des Kaninchen-Anti-HCG-Serums injiziert. Das Antiserum wird· durch Natriumsulfat ausgesalzen, wobei man einen Anti-HCG-

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Antikörper erhält.

c) Herstellung von Anti-HCG-Antikörper-HRP-Konjugat

Nach der Methode gemäß 1 c) wid eine Reaktion zwischen 5 mg Anti-HCG-Antikörper, erhalten gemäß b), und 5 mg HRP durchgeführt, wobei ein Anti-HCG-Antikörper-HRP-Konjugat erhalten wird.

d) Herstellung von Antiinsulinantikörper-sensibilisiertem Polystyrolreagensglas

Der gemäß 1 b) hergestellte Antiinsulinantikörper wird zur Erzielung einer Konzentration von 20 μg/ml in Glycinpuffer (pH 8,2) aufgelöst. In ein Polystyrolreagensglas wird 1 ml der Lösung eingefüllt, worauf eine Bebrütung während einer Zeitspanne von 30 Minuten in einem Wasserbad mit einer Temperatur von 56⁰C durchgeführt wird. Auf diese Weise wird ein Antiinsulinantikörper-sensibilisiertes Polystyrolreagensglas hergestellt.

e) Insulinmessung

In das gemäß d) hergestellte Antiinsulinantikörper-sensibilisierte Polystyrolreagensglas werden 0,4 ml jeweils der in 1 a) angegebenen Standardinsulinlösung eingefüllt, worauf 0,3 ml BSA (0,5 %ig) zugesetzt werden. Die Mischung wird während einer Zeitspanne von 18 Stunden bei 4⁰C bebrütet. Dann werden 0,1 ml der gemäß a) erhaltenen INS-HCG-Lösung zugesetzt, worauf sich eine Bebrütung während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei 37⁰C anschließt. Nach der Bebrütung wird die Lösung in dem Reagensglas entfernt, worauf das Reagensglas mit Phosphatpuffer gewaschen wird. Dann werden 0,1 ml des gemäß c) erhaltenen Anti-HCG-Antikörper-HRP-Konjugats und 0,7 ml BSA (0,5 %ig) zugesetzt, worauf die Mischung während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei 37⁰C bebrütet wird. Nach einem Waschen des Reagensglases werden

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3 ml einer Substratlösung, die 5-Aminosalicylsäure (60 mg/dl) enthält sowie 3 %iges Wasserstoffperoxid (100 μΐ/dl) enthält, zugesetzt, worauf eine Reaktion während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur ausgeführt wird. Dann wird das Absorptionsvermögen bei 4 65 nm gemessen. Die dabei hergestellte Standardkurve geht aus Fig. 2 hervor. Man sieht, daß eine Insulinmessung zur Ermittlung eines Wertes von 10 μΐϋ/ml aus Fig. 2 möglich ist. Diese Messung ist um das 3- bis 5-fache empfindlicher als diejenige der herkömmlichen Methode.

Ausführungsbeispiel 2: Insulinmessung

a) Herstellung eines Insulin-BSA-Konjugats

10 mg kristallines Rinderinsulin und 12,8 mg BSA werden jeweils in 10 ml eines 0,4m Boratpuffers mit einem pH von 9,0 aufgelöst. Diese zwei Lösungen werden vermischt. Die erhaltene Mischung wird mit 0,37 ml eines 0,01m Bisdiazobenzidins vermischt, worauf man die Mischung während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur unter Rühren stehenläßt. Nach der Reaktion wird die Lösung unter Anwendung einer Ultrafiltrationsmethode konzentriert, worauf sich eine Reinigung mit Sephadex G-150 anschließt. Dabei wird ein Insulin-BSA-Konjugat erhalten.

b) Herstellung eines mit radioaktivem Jod markierten Anti-BSA-Antikörpers

In ein kleines Reagensglas werden 0,025 ml einer 0,5m Phosphatpufferlösung eingefüllt. Dann werden 2 mCi radioaktives Natriumjodid (NA J) eingefüllt. Anschließend werden 0,025 ml einer 400 μg/ml Anti-BSA-Antikörperlösung hergestellt und auf herkömmliche Weise gereinigt. 0,02 ml 4 mg/ml Chloramin T werden zugesetzt, worauf während einer Zeitspanne von 1 Minute vermischt wird. Dann werden 0,1 ml 24 mg/ml Natriummetabisulfit und 0,4 ml 10 mg/ml Kaliumjodid zuge-

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setzt. Die Reaktionsmischung wird mit Sephadex G-50 gereinigt, wobei ein . J-Anti-BSA-Antikörper erzeugt wird.

c) Insulinmessung

In ein gemäß 2 a) hergestelltes Antiinsulinantikörper-sensibilisiertes Polystyrolreagensglas werden jeweils 0,1 ml einer gemäß 1 a) erhaltenen Standardinsulinlösung und 0,6 ml PBS-Lösung von 0,1 % Kaninchen-S-globulin (RGG) gegeben, worauf während einer Zeitspanne von 18 Stunden bei 4⁰C bebrütet wird. Dann werden 0,1 ml des gemäß a) erhaltenen Insulin-BSA-Konjugats zugesetzt, worauf sich eine Bebrütung während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei 37⁰C anschließt. Nach der Bebrütung wird die Lösung entfernt, worauf das Reagensglas mit Phosphatpuffer dreimal gewaschen wird. Dann werden 0,1 ml einer mit radioaktivem Jod markierten Anti-BSA-Antikörperlösung, erhalten gemäß b) sowie 0,7 ml PBS, enthaltend 0,1 % RGG, zugesetzt..Die Mischung wird während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei 37⁰C bebrütet. Nach der Entfernung der Reaktionsmischung wird das Reagensglas gewaschen, worauf unter Verwendung eines Szintillationszählers die Restradioaktivität in dem Reagensglas gemessen wird. Nach dieser Methode können 1 μΐϋ/ml Insulin gemessen werden.

Ausführungsbeispiel 3: Messung von menschlichem Placentalactoqen (HPL)

a) Herstellung von einer Standard HPL-Lösung

Nach der Methode von H. Morikawa et al. (Jap. J. Endocrinol., 49, 882 (1973)) wird HPL aus der Placenta einer normalen schwangeren Frau extrahiert und gereinigt und zur Erzielung von Konzentrationen von 100, 10, 2,5, 0,6, 0,15 und 0 ng/ml in PBS mit einem pH von 6,4, enthaltend 0,1 % BSA, aufgelöst.

b) Herstellung von HPL-HCG-Konjugat

Nach der Methode gemäß 1 c) werden 5 mg HCG und 5 mg HPL

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miteinander umgesetzt, wobei ein HPL-HCG-Konjugat erhalten wird.

c) Herstellung einer Anti-HPL-Antikörper-gekuppelten Cellulose

Ein Kaninchenanti-HPL-Serum, das aus einem Kaninchen erhalten wird, das gegen HPL immunisiert ist, wird durch Aussalzen zur Erzeugung eines Anti-HPL-Antikörpers gereinigt. Nach der Methode gemäß 1 d) wird der auf diese Weise erhaltene Antikörper mit Cellulose umgesetzt, wobei eine Anti-HPL-Antikörper-gekuppelte Cellulose erhalten wird, die dann gefriergetrocknet wird.

d) HPL-Messung

0,5 ml einer 1 %igen Suspension der gemäß c) erhaltenen Anti-HPL-Antikörper-gekuppelten Cellulose und 0,1 ml jeweils der gemäß a) erhaltenen Standard-HPL-Lösung werden zusammen in ein Reagensglas eingefüllt. Die Mischung wird während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei 37⁰C bebrütet. Dann wird die Mischung mit 0,1 ml HPL-HCG-Konjugat, erhalten gemäß b) versetzt, worauf während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei 37°C bebrütet wird. Nach der Bebrütung wird die Anti-HPL-Antikörper-gekuppelte Cellulose abgetrennt und mit Phosphatpuffer gewaschen. Dann werden 0,1 ml des Anti-HCG-Antikörper-HRP-Konjugats, erhalten gemäß Beispiel 1 c), und 0,6 ml BSA, 0,5 %ig, zugesetzt, worauf sich eine Bebrütung während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei 37°C anschließt. Anschließend erfolgt ein Waschen mit einem Phosphatpuffer, worauf 3 ml einer Substratlösung zugesetzt werden, die 5-Aminosalicylsäure (60 mg/dl) und 0,3 %iges Wasserstoffperoxid (1 ml/dl) enthält. Die Mischung läßt man während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Dann wird das Absorptionsvermögen bei 4 65 nm gemessen. Nach dieser Methode können 0,5 bis 1 ' ng/ml HPL gemessen werden.

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Ausführungsbeispiel 4: östriolmessung

a) Herstellung einer Standardöstriollösung

östriol (Sigma Chemical) wird zur Erzielung von Konzentrationen von 640, 160, 40, 10, 2,5 und 0 ng/ml in PBS mit einem pH von 6,4, enthaltend 0,1 % 3SA, aufgelöst.

b) Herstellung von östriol-iöi^-dihemisuccinat-BSA-Konjugat

600 mg östriol-16,17-dihemisuccinat (Am. J. Obstet. Gynecol., 109, 8-97, (1971)) werden in 12 ml Dioxan aufgelöst, worauf 0,3 ml Tri-n-butylamin der Lösung zugesetzt werden. Nach einer Abkühlung auf 12°C wird die Lösung mit 0,17 ml Isobutylchlorcarbonat versetzt, worauf durch Rühren gut vermischt wird. Die auf diese Weise erhaltene Mischung wird mit einer Lösung vermischt, die durch Auflösen von 1,70 g BSA in 4 0 ml destilliertem Wasser erhalten worden ist. Der pH der Lösung wird unter Verwendung von 1n Natriumhydroxid auf 12,0 eingestellt, worauf 4 0 ml Dioxan zugesetzt werden. Die Mischung läßt man dann bei 12⁰C stehen. Nach der Umsetzung während einer Zeitspanne von 4 Stunden unter Rühren werden nichtumgesetzte Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, wie östriol-16,17-dihemisuccinat und Tri-n-butylamin, unter Verwendung von Sephadex G-25 abgetrennt. Die Fraktion mit hohem Molekulargewicht wird gefriergetrocknet, wobei ein östriol-16,17-dihemisuccinat-BSA-Konjugat erhalten wird.

c) Herstellung von östron-17-oxim-hämoglobin-Konjugat

In 20 ml Dioxan werden 687 mg östron-17-oxim (Erlanger, B. F., J. Biol. Chem., 234, 1090 (1959)) aufgelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 0,9 ml Tri-n-butylamin versetzt. Nach einem Abkühlen auf 11⁰C werden der Lösung 0,27 ml Isobutylchlorcarbonat zugesetzt, worauf cferührt wird. Dieser Mischung wird eine Lösung zugesetzt, die durch Auflösen von 2,42 g Hämoglobin (Hb) in 70 ml destilliertem Wasser erhal-

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ten worden ist. Der pH wird auf 9,5 eingestellt, worauf 70 ml Dioxan zugegeben werden. Dann hält man die Mischung bei 11⁰C. Nach einer Umsetzung während einer Zeitspanne von 4 Stunden unter Rühren werden nichtumgesetzte Substanzen mit niederem Molekulargewicht unter Verwendung von Sephadex G-25 abgetrennt. Die Fraktion mit hohem Molekulargewicht wird gefriergetrocknet, wobei ein östron-17-oxim-Hb-Konjugat erhalten wird.

d) Herstellung von Anti-Hb-Antikörper-HRP-Konjugat

Eine Ziege wird mit jeweils 20 mg Hb zusammen mit vollständigem Freund 'schein Adjuvans drei- bis viermal pro Woche gespritzt. Nach der Methode gemäß 1 b) wird ein Anti-Hb-Antikörperglobulin erhalten. Die Umsetzung zwischen 5 mg dieses Anti-Hb-Antikörperglobulins und 5 mg HRP erfolgt nach der Methode 1 c), wobei ein Anti-Hb-Antikörper-HRP-Konjugat erhalten wird.

e) Herstellung von Äntiöstriolantikörper

Das gemäß b) erhaltene östriol-16,17-dihemisuccinat-BSA-Konjugat wird in einer physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst. Die Lösung wird zusammen mit vollständigem Freund' sehen Adjuvans wiederholt subkutan in das Hinterteil eines erwachsenen Kaninchens injiziert, wobei jeweils 2 mg des Konjugats eingespritzt werden. Nachdem ein Anstieg des Antikörpertiters festgestellt worden ist, wird das Blut gesammelt, wobei nach der Methode gemäß 1 b) ein Antiöstriol-16,17-dihemisuccinat-BSA-Antikörper erhalten wird. Unter Verwendung von BSA, gekuppelt mit Sepharose durch Bromcyan, wird der Anti-BSA-Antikörper aus diesem Antikörper entfernt. Nach Zugabe von BSA-gekuppelter Sepharose in einer Menge von 25 ml bis 50 ml der Antikörperlösung läßt man die Suspension während einer Zeitspanne von 30 Minuten¹ bei 37⁰C stehen, worauf sich eine Bebrütung über Nacht bei 4⁰C anschließt. Dann wird die Suspension während einer Zeitspanne

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von 10 Minuten bei 4⁰C zentrifugiert, wobei ein spezifischer Antikörper zu östriol erzeugt wird.

f) östriolmessung

In ein nach der Methode 2 a) hergestelltes Antiöstriol-Antikörper-sensibilisiertes Poly.styrölreagensglas werden 0,6 ml BSA (0,1 %ig) und 0,1 ml der Standardostriollösung gemäß a) zusammen eingefüllt und während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur bebrütet. Dann werden 0,1 ml des gemäß c) hergestellten östron-17-oxim-Hb-Konjugats der Lösung zugesetzt, worauf während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur bebrütet wird. Nach der Reaktion erfolgt ein Waschen mit Phosphatpuffer. Anschließend werden 0,1 ml des gemäß d) erhaltenen Anti-Hb-Antikörper-HRP-Konjugats und 0,5 ml BSA (0,1 %ig) zugesetzt, worauf während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur bebrütet wird. Anschließend wird gewaschen. Dann werden 3 ml einer Substrat lösung gerr.äS Beispiel 1 zugesetzt, worauf man die Mischung während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehenläßt. Dann wird das Absorptionsvermögen bei 465 ηπ gemessen. Nach dieser Methode kann 1 mg/ml östriol gemessen werden.

Ausführungsbeispiel 5; Insulinmessung

a) Herstellung von Rattenleberinsulinrezeptor

Rattenleberinsulinrezeptor wird nach der Methode von K. Suzuki et al. (Saishin Igaku, 30, 591 (1975)) hergestellt.

b) Herstellung von Insulin-HCG-Konjugat

Nach der Methode gemäß Beispiel 1 a) wird ein Insulin-HCG-Konjugat erhalten.

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c) Herstellung von mit J markiertem Anti-HCG-Antikörper

Der gemäß Beispiel 1 b) erhaltene Anti-HCG-Antikörper wird

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mit J nach der Chloramin T-Methode markiert. Der markierte Antikörper wird mit Sephadex G-50 gereinigt, wobei ein

J-Anti-HCG-Antikörper erhalten wird.

d) Insulinmessung

In ein Reagensglas werden 0,1 ml der Standardinsulinlösung gemäß 1 a), 0,5 ml BSA (0,5 %ig) und 0,1 ml der Rezeptorsuspension gemäß a) eingefüllt, worauf sich eine Bebrütung während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei 4⁰C anschließt. Dann werden 0,1 ml des Insulin-HCG-Konjugats gemäß b) zugesetzt, worauf man die Mischung über Nacht bei 4⁰C stehenläßt. Dann wird die Reaktionsmischung zentrifugiert, worauf der ausgefallene Rezeptor mit einem kalten Phosphatpuffer gewaschen wird. Dann werden in das Reagensglas 0,5 ml BSA (0,5 %ig)

1 2^C

und 0,1 ml der J-Anti-HCG-Antikörperlösung eingefüllt, worauf die Mischung über Nacht bei 4⁰C stehengelassen wird. Nach einem Zentrifugieren und einem Waschen mit Phosphatpuffer wird die Radioaktivität des ausgefällten Rezeptors gemessen. Nach dieser Methode können mehr als 5 ng/ml Insulin gemessen werden.

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Le s.

erseite

Claims

MÜLLER-BORE · DEUFEL · SCKÖX · HEHT3L ?

DR. WOLFGANG MÜLLER-BORE (PATENTANWALT VON 1927- I»75) DR. PAUL DEUFEL. DIPL.-CHEM. DR. ALFRED SCHÖN. DIPL.-CHEM. WERNER HERTEL. DIPL.-PHYS.

M 2520

MOCHIDA SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA, 7-banchi, 1-chome, Yotsuya, Shinj uku-ku, Tokyo, Japan.

Irnniunchemisches Meßverfahren

Patentansprüche

Immunchemisches Meßverfahren, gekennzeichnet durch die Verwendung einer bindefähigen Substanz, die sich in spezifischer Weise mit einer zu messenden Substanz verbindet, eines Antigenkonjugats, d. h. der selben Substanz wie die zu messende Substanz, die sich mit einer Substanz mit einer hohen Antigenizität (zweites Antigen) verbunden hat sowie eines markierten Antikörpers zu dem zweiten Antigen.
2. Immunchemisches Meßverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu messende Substanz aus einer Substanz mit niederem Molekulargewicht, aus einer Substanz mit einem relativ niedrigem Molekulargewicht

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MÜNCHEN 8β · BISBSKTSTK. * · POSTFACH 880720 · KABEL·: ItTTEBOPAT · TEL·. <08»> 474003 · TELEX 3-2*283

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sowie aus einer Substanz mit einem hohem Molekulargewicht besteht.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Antigen aus Rinderserumalbumin, menschlichem Serumalbumin, Kaninchen- ö -globulin, menschlichem Choriumgonadotropin, Hämoglobin, Tetanustoxoid, einem pneumokokkalen Polysaccharid oder einem Glutaminsäure/Lysin/Tyrosin-Copolymeren besteht.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Markierungsmittel ein Radioisotop, ein Enzym oder ein floureszierendes Material ist.
5. Reagens zur Durchführung einer immunchemischen Messung, gekennzeichnet durch eine bindefähige Substanz, die in spezifischer Weise sich mit einer zu messenden Substanz verbindet, ein Antigenkonjugat, d. h. die gleiche Substanz wie die zu messende Substanz, die sich mit einer Substanz mit einer hohen Antigenizität verbunden hat, und einen markierten Antikörper, d. h. einen Antikörper zu der Substanz mit einer hohen Antigenizität.
6. Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die zu messende Substanz aus einer Substanz mit niederem Molekulargewicht, einer Substanz mit einem relativ niederem Molekulargewicht sowie einer Substanz mit einem hohen Molekulargewicht besteht.
7. Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz mit einer hohen Antigenizität aus Rinderserumalbumin, menschlichem Serumalbumin, ^Globulin, menschlichem Choriumgonadotropin, Hämoglobin, Tetanustoxoid, einem pneumokokkalen Polysaccharid oder einem Glutaminsäure/Lysin/Tyrosin-Copolymeren besteht.

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8. Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Markierungsmittel aus einem Radioisotop, Enzym oder fluoreszierenden Material besteht.
9. Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die bindefähige Substanz, das Antigenkonjugat sowie der markierte Antikörper gefriergetrocknet sind.

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