JPS58117456A - 特定の結合活性を持つ蛋白質とこれに対応して結合する物質との反応の一つの成分を検出及び定量する試薬セツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

特定の結合活性を持つ蛋白質（ａ　ｍｐ＠ｅｌｆ１ｅｂ
ｉｎｄｌｎｇ　ｐｒｏｔ＠１ｍ　）とそれに対応して結
合する物質（ｔｈｅ　ｅｏｒｒｅｓｐｏｎｔｌｎｇ　ｂ
ｌｔ＋ｄａｂｌｅ　　５ｕｂｓｔａｎｃｅ　）との反応
の一つの成分Ｙ検出および測定するために、標識剤（ａ
ａｒｋ＠ｒ　）でラベルして指定した成分の一つを、少
なくとも相手の成分を含有する反応混合物中でインキニ
ベートシ、その結合スル相手の物質に結びついた標識成
分と、結びつかない標識成分とを分離して、最後に得ら
れた２つの画分のうちの少なくとも一方化含才れる標識
剤な測定することが知られている。標識成分の２つの画
分への分布が、試料中に存在する測定すべき物質の量の
目安となる。かかる方法を行なうことのできる３種の系
をあげると次のとおりである。 （ａｔ　　特定の結合活性を持つ蛋白質としての抗体と
。 結合する物質としての対応する抗原。とりわけこの系で
測定可能な物質としては、蛋白ホルモン類及びそれらの
抗体、才たはビールス抗原とそれらの抗体である； （ｂ）　　特定の結合活性Ｖもつ蛋白質としての抗体と
。 結合する物質としてのハプテン。ここでハプテンとは、
抗体と反応するがそれらを誘導しない非蛋白物質（ｐｒ
ｏｔ＠１ｎ−ｆｒｅｅ　５ｕｂｓｔａｎｅ＊）と定義す
る。 とりわけこの系で測定可能な物質はステロイドホルモン
とビタンン類である； （ｃｌ　　４Ｉ定の結合活性Ｙ持つ蛋白質として、生体
中で受容体（ｒ＊ｏ＠ｐｔｏｒ　）　　あるいは輸送分
子（ｔｒａｎｇｐ・ｏｒｔ　ｍｏｌｅｃｕｌ＠ｓ　）と
して作用する蛋白質、及び結合する物質としては該蛋白
質と結合する物質。この系は例えばステロイドホルモン
の測定に適しているが、またチロキシンやトリヨードチ
ロ中シン、ビタきンＢ１２．内生因子（ｉｎｔｒｉｎｓ
ｌｅｆａｓｔｅｒ）　及び副腎皮質刺激ホルモンの−ｊ
定にも適している。 上記の測定法で最も重要な点は、標識剤Ｖ＊用すること
及び標識された成分ケ対応する成分に結合した画分と結
合しない画分とに分離することである。 現在才で番こ実際に用いられている方法では、放射性原
子のみが標識剤として用いられてきた（例えば１１１１
，１″勝１．１４　Ｃ，、Ｍ　Ｈ，Ｉ？　Ｃｏ　）。こ
の方法は高感度の故にすぐれている。しかしながら、こ
の方法を用いるのは、市販の特別な装置な有する研究所
に限定される。 分離方法は以下のように分けることができる。 すなわち、 （１）結合していない標識成分とその対応する成分に結
合した複合体の閣の物理的性質の差を利用する方法（例
えばデルｐ過、電気泳動、塙沈澱、及びデキストランで
被った活性炭への吸着！利用する方法）； ｆｂｌ　　前もって一方の成分ン固型担体に架橋ｔたは
共有結合または物理吸着させて不溶な形態にしておく、
いわゆる固相法。 （ｅｌ　　いわゆる二抗体法、すなわち、生じた複合体
（抗原−抗体ｔたはへブテンー抗体の蓼合体）Ｖ該複合
体中の抗体に対する抗体の助けで沈澱させる方法で、本
方法は、抗体が関与する系にのみ公知である。 （１）と（ｅｌの方法は笑施が比較的画調であり、（ｂ
）の方法は、反応成分を不溶の形態にする結果、その反
応の相手に対する親和性が通常減少するという不利益が
ある。通常、高い親和性は高感度の系の試験を実現させ
るのに必須である。 特定の結合活性を持つ蛋白質とこれに対応して結合する
物質との反応の一つの成分を検出及び定量する方法が今
や明らかとなった。すなわち、そのような成分の他に対
する既知の結合親和力を用いる方法で、結合する物質と
酵素とのカップリング生成物の一定量と、特定の結合活
性な持つ蛋白に対する抗体とを用いて不溶の形にし、反
応後反応混合物中の液相または固相の酵素活性を定量す
ることにより、測定しようとしている成分の定量ケ行な
うことを特徴とする方法である。 この方法は、特定の結合活性を持つ蛋白質として抗体な
、それに対応して結合する物質として抗原またはハプテ
ンン用いる場合しばしば用いられ、良い結果Ｙ示す。 本文中「結合体Ｊ　（ｅａｎｊｕｇａｔ・）及び「酵素
結合体Ｊ　（＊ｕｚｙｔｎｅ　ｅｏｎｊｕｇａｔｅ　）
　　という語は、結合する物質と酵素とのカップリング
生成物と同義に用いる。 結合する物質の検出及び測定は次の如く行なうことがで
きる。未知の試料才たはその一連の希釈物ｖ、ｍ定しよ
うとする物質と酵素との結合体の既知量と特定の結合活
性を持つ蛋白質の添加した酵素結合体の量に依存する一
定量とに合する。次に特定の結合活性を持つ蛋白質に対
する不溶化にした抗体の一定量（望ましくは過剰量）Ｖ
添加して、蚊結合活性Ｙ持つ蛋白質と反応した全ての酵
素結合体を、この蛋白質を通じて、これらの不溶性の抗
体に結合させる。試料中に結合する物質の量が多くなれ
ばなるほど、特定の結合活性をもつ蛋白質と反応し且つ
最終的に不溶の相になる酵素結合体は少なくなる。その
ため、液相に多くの結合していない酵素結合体が残り、
このものが単に定量されることになる。 特定の結合活性を持つ蛋白質の測定は、試料才たはその
一連の希釈物を、酵素結合体の既知量及び特定の結合活
性を持つ蛋白質に対する抗体の不溶化したものとインキ
ュベートすることにより行なうことができる。結合体が
特定の結合活性を持つ蛋白質と反応したとすれば、酵素
活性は不溶の相に移り、特定の結合活性な持つ蛋白質が
試料中に多ければそれだけ、液相に残る結合する酵素結
合体が少なくなる。 上述の試薬系の感度は試薬の量を変えて（同じ比膝でも
、それ以外でもよい）変化させることができる。しかし
、用いることのできる酵素結合体のｉＩは、その酵素活
性を無理なく測定できなければならないという点で、下
限があり、従って試験系の感度には限度がある。とりわ
け、測定可能な酵素活性の最少値は、カップリングに用
いる酵素の性質と基質の性質、及び酵素反応のインキュ
ベーション時間に依存している。更に、特定の結合活性
を持つ蛋白質の親和性は測定の感度に大きな影１ｍ１Ｙ
与える。高感度で測定ケ行なうには、高い親和性を持つ
特定の結合活性を持つ蛋白質が必要である。 測定に必要な試薬の量は経験的に確定する。 結合する物質の測定のため、酵素結合体の量を酵素活性
の助けなかりて測定し、この量を特定の結合活性を持つ
蛋白質の一連の希釈物とインキュベートしてこの蛋白質
の必要量を測定する。好ましくは、酵素結合体の５Ｏ−
９０Ｘと結合する特定の結合活性を持つ蛋白質の一定量
Ｙ選ぶ。最終的に、所望の感度が本当に得られたかどう
かＹ、この系の試験のもとてその物質の一連の希釈物な
試験して調べる。特定の結合活性ケ持つ蛋白質の測定に
は、酵素結合体の量に関してもう一つ考えねばならぬこ
とがあり、それはその感度である。 その感度は無理なく測定できるようでなければならない
。 特定の結合活性を持つ蛋白質に対する不溶にした抗体は
この２つの測定タイプにおいては望ましくは過剰に添加
する。その量は予備試験で測定しておく。 本方法のすぐれた点は、 （ａｔ　　放射性同位元素による実施を酵素を用いるや
り方に置きかえることができる。このことけ実験の施設
や装置Ｖ可成り小規模にするが、実験を行なう人間も高
度の技術な必要としない。その上、放射性同位元素を用
いる仕事は法律上極めて制限Ｙ受けている。更に１本発
明による試薬は長い貯絨に耐え、安全性も増大している
。 （ｂｌ［二抗体法Ｊ　（Ｄｏｕｂｌ＠Ａｎｔｉｂｏｄｙ
　）と［固相法Ｊ　（Ｓａｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　）　　
’に組み合わせた方法（以下単にＤＡＭＰ法と呼ぶ）は
視在用いられている方決に対していくつかの優れた利点
Ｙ持つ。 すなわち、この新たに見出された方法の実施（すなわち
、％足の結合活性？持つ蛋白質に対する抗体の不溶にし
たものの紛加、インキュベーション。 遠心分離及び測′ｉＥ）は非常に簡単である。便用量は
固相法に比してそれ程正確でなくてよい。イー」故なら
固相法では正確な量の不溶材料を用いねばならないのに
対し１本方法では過剰量のそれ？用いればよいからであ
る。その上、結合する物質に対する結合活性Ｙ持つ蛋白
質の親和性は、同相法で行なう場合のように担体に結合
することで弱められることはない。本方法の別の利点は
１％定の結合活性を持つ蛋白質とそれに結合する物質（
両方共溶液）の間の反応が迅速に平衡に：Ｓするという
ことである。更には、ＤＡＳＰ法では、不溶にした抗体
（以Ｆ免疫吸着剤と呼ぶ）ｖ、抗体Ｖ％足の結合活性を
有する蛋白として用いる全ての糸（但しこれらの抗体が
同役の動物から製造したものである場合）で用いること
ができるという利点がある。他方、面相法で抗原才たは
ハプテン′１ｉｒ−測定する場合は、抗体は不溶にしな
ければならない。 二抗体法は塩濃度、ｐＩｌｌ等の比較的小さな変化にも
極めて鋭敏である。従ってこれらの条件の厳しい調整が
必要とされる。その上、この方法は「担体」（ｅａｒｒ
ｌ＠ｒ　）　ｒ−グロブリンＶめ加しなけれはならす、
結果的に免疫沈＃ン得るのに多量の第２の抗体Ｖ必要と
する。操作が簡単であるのみならず、ＤＡＳＰ法は「担
体」ｒ−グロブリンＹ必簀とせず、而して材料を節約す
ることができる。更に、この目的に利用できる適尚な担
体蛋白質がないので、輸送才たは受容蛋白質に対して行
なう二車抗体様の分−は可能ではないということを付は
加えることができよう。故に本発明の方法はこの印で従
来見られなかった可能性を提供するものであろう。 （ｅ）　　本発明の方法は藺単に自動化できる。原理的
には１反応酸分ｔ−直に一緒にするかまたはそれらな任
意の層厚で系の中に加えることも可能である。しかし、
免疫吸着剤を他の反応成分のインキュば一ジョンの後で
加えるなら、測定に高い感度が得らｎることが判明した
。 本発明に必要な試Ｓ（抗原、ハプテンの結合する物質と
酵素とのカップリング生成物）１公知の方法で製造でき
る。一つの物質が一つまたはそれ以上の丁ミノ基な持ち
、他の物質が一つまたはそれ以上のカルボキシル基を持
つ時、これらの方法は。 ハブテンまたは低分子の結合する物質を酵素に結合する
のにも用いることができる。もし後者がカルボキシル基
な持たないならば、所望の基を分子に導入して、公知の
有機化学反応な用いて力゛ンプリンダさせることができ
る。また、架橋結合（ｂｒｉｄｇ・）を導入するかまた
はそうしないで、１１７着またはカルボキシル基な一緒
に結合する方法が知られている。また、ダルタールアル
デヒド、ジフルオルジ二ト口フェニルスルフオン及びジ
及びトリクロル−８−トリアジンのような化合物が間−
のカップリングにしばしば用いることができる。製造し
た＃素紹合体な、変換されていない物質または不活性に
なった物質から分離することは必要である。この目的の
ため、公知の生化学的方法、すなわちＭ機溶媒による沈
澱、ゲル濾過。 及び密度勾配での遠心分＃Ｉ１１を用いることができる
。 カップリング生成物に変換される酵素の選択は、その＃
ｌ木の多くの性質により決まる。もちろん、その酵素が
他の分子とのカップリングに対し抵抗性がある（すなわ
ち１つまたはそれ以上の丁ミノａＩｌＩ鎖の変更）とい
うことは必須である。また非常に１要なものに＃累の比
活性がある。＃ｊ定可能な酵素の効果を得るために必螢
な酵素結合体量が′り）くなればそれだけ、試験系の感
度は高くなる９更に、活性の測定が簡単にでき全酵素が
好まれ１弟−に、これらの酵素は比色的に１分光光度的
に。 または螢光的に測定が可能であると考えられる。 この檜の測定は、自動化に適しており、これが付加的な
利点である。 比色的には、これらの＃累は、一番目のあるいは二番目
の反応のどちらかで１色のついた物質が現れたり消えた
りする反応を触媒することで測定できる。 結合体中で＃素的に活性のある成分として働くと考えら
れる＃木としては、カタラーゼ、ノ々−オキシターセ、
β−グルコロニダーゼ、β−Ｄ−／’ルコシダーゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ダルコースオキ
シ〆−ゼ、ガラクトースオキシ〆−ゼ及びアルカリフォ
スファターゼがあ成分と試薬との間の反応のｉＩｋ後に
反応混合瞼の液相または固相の、または両相の酵素活性
ｔ′ｓ足することができる。しかし、最も簡単なものは
液相の＃素話性を副足することである。 特定の結合活性を持つ蛋白質に対する不溶にした抗体（
これもまた本発明の方法に必須の試薬である）もまた公
知の方法で製造できる。この抗体は、特定の結合活性を
持つ蛋白質または、少なくも一部は上記蛋白質と同じ抗
原性を持つ蛋白質ｔｎＲし、それを公知の方法でそれを
得た動物以外の他の動切に注射して製造できる。処理し
た動物の血清またはそれらのガンマグロゾリン画分Ｖ。 ダルタールアルデヒド、クロロフォルミル績エチルエス
テルのような化合物で架橋するか、ｔたは固型担体粒子
に物理的に吸着させるかまたは共有結合の形成により化
学的に結合させて不溶化することができる。固体担体と
してはセルローズ（変性してあってもなくてもよいン、
アガロース、架橋デキストラン、ポリスチレン等の物質
がある。 これらの物質に抗体を共有結合させるには、カルボジイ
ミｒ、ジ及びトリクロル−８−トリアジン。 ！ルタールアルデヒド、シアノゲンプロマイドのよ５な
りＩＪ買を用いて１例えば、ジアゾ化（ｄｉａｚｏ−１
ａｔｌｏｎ　）で行なうと効果的である。 本発明の方法の利点呼、養定の結合活性を持つ蛋白質が
元金に固相に移るように、過剰の不溶性抗体を世いた場
合、充分証明される。 試薬が用いられる形態はいろいろある１反応系の酵素結
合体成分は凍結乾燥するか、ノ層ツフア−に溶解するこ
とができる。また固体担体として。 例えば結合体をしみこませた細長い紙ン用いることがで
きる。これは、必要な特定の結合活性を持つ蛋白質にも
同じように適用することができる。 不溶成分は異なる寸法の粒子の形（すなわち顆粒、薄片
、桿状）またはある担体物質のａ炎い小片の彫りにする
ことができる。 本発明の操作を実施するのには、試薬セット（ｔｉｔ　
ｐａｃｋ　）の形−で適用するのが好ましい。 これは主Ｉζ次のものからなっている：

【１】抗原、ハ
プテンまたは低分子の結合可能な物質と＃素との、Ｒ知
量の結合体。 （２）　　対応する量の特定の結付活性！持つ蛋白質（
抗体または、輸送蛋白質あるいは受容蛋白質）。 （３）用いた特定の結合活性を持つ蛋白質に対する抗体
の不溶化したものの既知量。 試薬セットには、更に酵素側足に必’ｌｔｋ試薬と、ま
た試験を行うのに必要な補助的な手段、すなわち試験管
、ピはット及び希釈溶液を入れた容器ｔも含有させても
よい。このような試薬セットは結合する物質の欄足に適
しているが、また特定の結合活性を持つ蛋白質の測定に
も適しており、この場合このセットに含有されている特
定の結合活性をもつ蛋白質は用いる必要がない。 試薬セットは抗原またはハプテンの検出及び側１足ニ肴
にしばしば便利に利用され、この目的のため主番こ次の
ものを金層している； （鳳）抗原またはハプテンと＃Ｘとの既知量の結合体、 （ｂｌ　　対応する童の対応する抗体 ｌｅｔ　　用いた抗体に対する抗体の不溶化したものの
既知量。 抗体の検出及び＃１足に試薬セットを用いる場合曇れ（
ｂｌに述べた抗体は不要である。 本発明による試薬セットの重要な具体例は゛ｔｔｌｌ＊
刺鮭ルモンの測定、そして特にＨＣＧ（ヒト絨毛性ゴナ
ビトロピン：　Ｈｕｍａｎ　Ｃｈｏｒｌｏｎｉｅ　Ｇｏ
ｎａｄｏ　−ｔｒｏｐｌｎ　）　Ｖ測定して非常に早い
時期に妊娠を診断するのに用いる試薬セットである。こ
の試薬セットはアンプル、試験管、必須成分として庫結
乾罐した層分−した。あらかじめ定められた下記の物質
ン含有するピンまたは他の容器から成っている。すなわ
ち、 （ａ）ＨＣＧと酵素の結合体１例えばＨＣＧ−ノぞ一オ
キシダーゼ。 −）抗−ＨＣＧ。 （ｅ）　　抗ＨＣＧに対する抗体の不溶化したもの、（
ｄｉ　　バッフ丁−のような他の成分。 妊娠していると思われる婦人の腋のある量をこの試験用
キットに添加し、このキットの成分と共にインキ二に一
トすると、不溶性物質の混合物が生成する。上澄は残存
する可溶性ＨＣＧ−酵素結合体を含有する。この残存す
る可溶性ＨＣＧ−酵素結合体の量は、試験される尿中に
含まれるＨＣＧの量に依存する。この残存するＨＣＧ−
酵素結合体の酵素活性を測定すると、その尿が妊娠した
婦人のものか否かを判定することができる。 酵素活性の測定に用いる好ましい方法は、＃素賦ＡＹ含
浸させた指示剤紙に接触させることからなる。例えばパ
ーオキシダーゼを用いる場合。 Ｈ２Ｏ２−供与体（例えば尿素−Ｈ２０ｇ　）および発
色試４（例えば０−トリジン）をしみこませた指示剤紙
に像醜させる。 試薬の量を各々正しく選択することで、非常に早い時期
の妊−な４１１１定することが可能となり、またこのこ
とを単純で迅速で非常に信−できる方法で熟練していな
い人にも行なうことができるであろう。 メ１男−１ ヒ（毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）の測定（ａ）　　Ｈ
ＣＧ　−ＨＲＰの製造 ＨＣ０５Ｍ９と西洋ワサビノーオキクダーゼ（ＨＲＰ）
２０ダｔ’０．０５Ｍリン酸ノＺツファ一（ｐＨ６，２
）　２−に溶解した。２５％ゲルタールアルデヒド寿ｌ
１１４０μｊ’ｋ”龜加後、混合物ｔ２時間室温で振盪
した。２５０Ｉで５分遠心分−した後、０．０５　Ｍす
７酸Ａ”７７Ｔ−（ｐＨ６，２）　’に用いセフ丁デツ
クスＧ−２００で分画した。鑞も高いパーセントの＃素
話性がＨＣＧに対する抗体に結合している一分を試−系
に用いた。′（ｂ）ＨＣＧに対する抗体の製造 ＨＣＧに対する抗体をシュールズら（５ｃｈｕｕｒｓａ
ｔ　４１．　）の方法（Ａ＠ｔａ　Ｉｎｄｏ＠ｒ、　（
Ｋｂｈ）　５９゜１２０　（１９６８）　）でウサギに
誘発させた。 （ｃ）　　ウサギ−ｒ−グロブリンに対する抗体の製造
つサギーｒ−グロブリンな正常なウサギ血清より　　　
　”１８％Ｗ／Ｖ固体硫酸ナトリウムによる沈澱で単離
した。これに対する抗体な下達の計画によりヒツジを免
疫することで製造した。 日　　　　量　　　　フロイントの補薬　　注射方法０
　　０．５１１１＋　　　　　　１６内内１４　　　０
．５ダ　　　　　　＋　　　　　　　　Ｉ２８　　１　
■　　　　　　＋　　　　　　　　１４２１　　Ｉｌ！
Ｐ　　　　　　　　　　　静脈内５６　　１　　■　　
　　　−ｌ ７０日０にこのヒ゛ンジを採血した。 （ｄｌ　　免疫吸着剤〔ヒツジ−抗−（ウサギ−ｒ−グ
ロブリン）〕セルローズの製造 （ｅ）に述べたヒツジ血清のｒ−グロブリン画分な１６
％Ｗ／Ｖ固体硫鐵す）　ＩＪウムで沈澱させて一一シた
。洗った後、沈澱物を、蛋白の歳終一度が１０ａｇ／−
になるようにｐＨ８，６の０．０５Ｍホウ酸ノ署ツフア
−にとった。ｍ−アミノはンジルオキシメチルセルロー
ズ３５０Ｍ９Ｖ蒸留水５０山こ懸濁させ、３６％塩ｆｌ
！ｉｏ＊Ｙ加え、０℃で１０％ＮａＮＯ２１ｆｊ＊　１
０　Ｍ’に滴下してジアゾ化した。 旙瀾物を遠心分−し、洗い、そして沈澱物ＹＰＨ８，６
の０．０５　Ｍホウ酸ナトリウム４３−に再び懸濁させ
た。それからｌｉＩ製したｒ−グロブリンの滴ＩＩ［７
１１１を添加した。混合物Ｙ２６時間４℃で攪拌し、而
して遠心分離し、ｐＨ６，０の０．０２　Ｍリン酸）２
ツフアーで洗った。 神）ＨＣＧの測定 ＨＣＧｔ’ｐＨ６，０の０．０２　Ｍリン咳バッファー
に希釈した一連の希釈物（３２−１６−８−４−２−１
−０，５−０１Ｕ／　’　）　’ｔｌｌｌｌｌシタｏ　
コｔＬは２％Ｗ／Ｖの正常なヒツジ血清を含有している
。 ＨＣＧｔ−含有する試料それぞれｏ、ａＪｖ、ウサギ−
（抗−ＨＣＧ）血清０．１−及びＨＣＧ−ＨＲＰ結合体
０．１１１７　（両方共適当に希釈する）と共に室温で
３０分間インキュは一トした。それから（ｄ）に従って
調製した免疫吸着剤（１０ｙ／７）０．３ｍを添加し、
生成した混合物を室温で１時間回転させる。遠心分離後
、上澄液の酵素活性を調べるために、上澄液０．５１１
７に基質（３０％ａ、ｏ２１０μｊ及び５−アミノサリ
チル＠２０＃ＶｐＨ６，０のα０２ｙリン酸）之ツファ
−１３０ｉｉｌに溶解したもの）１．５−と混合し、３
０分４ｉｋ２５℃で４６０　ａｍでの吸光１［’ｔｌｌ
定して前記酵素活性を定量した。 この方法では、試料中ＨＣＧの一度が０．５乃至ＩＩυ
／−であってもそれらを検出することができることが判
明した。この方法ではまた尿の試料′ｌｋ′調べること
ができ１本試験は社線の判定に適している。現在用いら
れている試験法、血項凝集反応阻止試−との関係は良好
だった。前もってインキュば−ション処理を行うことで
この系の感！’に上げることができることが判明した。 ここで、漱初に試料だけを抗血清とインキュイージョン
に何し０次にＨＣＧ−ＨＲＰ結合体を添加した。 舊獲性−１ インシュリンと抗インシュリンの測定 （ｍｌ　　インシュリン−（グルコースオキシダーゼ）
の製造 ブタインシュリン５〜とグルコースオキシダーゼ２５１
１１９をｐＨ６，５の０．０５　Ｍリン酸ノＺツファー
２−に溶解した。これに２５％ゲルタールアルデヒド＃
液５μｉｙ添加し、この後この混合物を室温で９０分間
振盪した。混合物Ｙ　ｐＨ６，５の０．０５Ｍリン酸ノ
２ツファー中セファデックスＧ−２００で分画した。高
いノ々−セントの酵素活性がインクニリンに対する抗体
に結合した一分を試験系に用いた０ （ｂ）　　インシュリンに対する抗体の製造モルモット
１０個体に一遍一度完全なフロイントの補薬に溶解した
ブタインシュリン１１ｖづつを４−８週間筋肉内注射し
た。２週間の休止の後。 補薬なしでインシュリン１１％ｌｌづつを静脈注射した
。 それから２週間後実験動物を採血した。ｌＷ１時におこ
る低血糖症はグルコースの腹拌内注射でおさえた０ （ｅ）　　モルモットｒ−グロブリンに対する抗体の製
造 モルモットｒ−グロゾリンＶ、Ｓ和硫酸アンモニウム溶
液１容量をモルモット血清２容量に加えて製造した。生
じた沈澱’［’３３％飽和硫酸アンモニウムｓｉｉで２
ｔＬ洗い、それから生理的食塩水にとった。ヒツジｔ％
Ｇ、５．１及び２ダとｒ−ダ０プリンの投与量を増加さ
せながら免疫した。免疫原は完全なフロイントの補薬と
混ぜ、注射は２週間おきに行なり７：、最後の注射から
２遍間後生農食塩水にｒ−グロブリン２■を溶解したも
のを更に与え、それから１週間後に実線動物を採血した
。 （ｄｌ　　モルモットｒ−グロブリンに対ｊる不溶化抗
体の製造 ミクロ結晶セルローズ１０９を２．５％Ｗ／ｖＣＮＢｒ
溶液４００−に攪拌しながら添加して活性化し、その後
ＩＮ　　ＮａＯＨでｐＨ′Ｙ：ＩＯ，５にし。 このまま２分間おく。それからセルローズを氷水と０．
１　Ｍ　ＮａＨＣＯｓで洗った。ヒツジ−抗（モルモッ
トｒ−グロブリン）血清ｔｏ−ｉこＮ−０４１，６＃’
！添加した。室温で１時間攪拌後洗澱物な遠心分離し、
１６　％Ｗ／　Ｖ　Ｎｍ２８０４１１！［２０１１に４
で２回洗い、次いで０．１　Ｍ　　Ｎ１ＨＣＯ易　１０
−にとる。活性化したセルローズを、０．ＩＭＮ畠ＨＣ
Ｏ。 溶ｆｉ４０−とｒ−グロブリン溶液１０−と混ぜた。 この懸濁液を４℃で４０時間回転させ、つづいて０．５
　Ｍ　Ｎ１ＨＣＯ易　　５００ｗＪで２回、ｐｉｉｌ、
１　　の０．０５　Ｍクエン酸ｆｆ１５００ｍで２ｉａ
ｌ、　ｐａｓ、ｚの０．０５　Ｍリン酸塩５００−で２
回洗う。 （耐　インシュリンに対する抗体の測定適当に希釈した
インシュリン−（グルコースオキτ］１ｌ−−ｆ）　０
．１１１７’に１モルモット抗−インシュリン血清の一
連の希釈物０．４−と４時間インキュは一トした。一連
の希釈物はｐＨ６，０の０．０５　Ｍリン酸バッファー
でｉ、１ｌｌｌした。それから免疫吸着剤（１５■／＋
Ｉｊ）０．３−とバッフ丁−０，２−を添加し、混合物
ｔ−晩４℃で（９）転させた。遠心分離後、上澄の酵素
活性を、このものＱ、５ｉＬｔｖ基質２．５−と３０分
インキュは一トし、４６０ｎｏ＞での吸光ｔ’ｉｘ測っ
て測定した。基質は、ｐＨ６，０の０．０５Ｍリン酸ノ
トンファー２．５−に対してグルコース５０■、パーオ
キシダー４１０戸Ｉ及び５−アミノサリチル酸１１１ｇ
を含有させたものである。 この糸の方法で、異なる血清の抗体の円容盪ン相互に比
較できる。比較する点として、全体の結合できる＃木活
性の５０％が結合する血清の希釈物がある。 （ｆｌ　　インシュリンの測定 一連のインシュリンの希釈物０．２−を抗−インシュリ
ン血清０，４−と２時間インキュベートした。 抗−インシュリン血清は、後で加えられる＃素結合体の
６０％に結合するように希釈されている。 それからインシュリン−（〆ルコースオキシダーゼ）ｏ
、ｉｙを対応する希釈物に添加し、４時間インキュベー
トした。最後に免疫吸着剤（１５■／ＩＩＬｔ）０，３
ｉｕ７添加した。混合物を一晩４℃で回転させた。遠心
分離後上澄の＃素話性ｖｔ＠＞に述べたように測定した
。 測定感度は（これは用いた抗血清によるのだが）ナノダ
ラム（町。Ｐうや）の＊囲で、２０−１００ｎ９　／　
ｍ　、すなわち０．５−２．５ｏｘｔｊ／−であツタ。 秀農遺二」― エストラジオールの＃ｊ定 ｔａ）　　エストラジオール−１７−サクジニルーＨＲ
Ｐの製造 エストラジオール−１７−ヘミサクシネート５０■とト
リーｎ−ブチルアミン０．０８ｍ’！’ジオキサン２．
５１１ｊに溶解した。冷却した溶液（２℃）にインブチ
ルクロロカーボネート１５μｊを添加した。３０分後、
この溶液ｔ、水酸化ナトリウムでｐＨ９，５に合わせた
ジオキサン／水混合物（２：３）７．５１１１７に溶解
した西洋ワサビパーオキシダーゼ（Ｉ（ＢＰ）１００１
ｖと混合した。この浴液奮２℃で４時間攪拌し、それか
ら１８時間透析した。 透析物のｐｇ″Ｉｔ４．６　曇こ合わせた後生じた沈澱
物を遠心分離して洗浄し、ｐＨ８に合わせた蒸留水５−
にとった。この物質ｖｊ！にアセトン１０−で２回沈澱
させてｆｆＪｌｉｌした。最後に得られた生成物を。 ｐＨ７，８ノ０．０５　Ｍす７　酸／＄　’７７７−１
０ｄ中に取出す。 （ｂ）　　エストラジオール−１７−サクジニルーＢ８
Ａの製造 製造は実施例３の（Ａ）に込ぺた混合無水物法で行なっ
た。この調専は、エストラジオール−１７−ヘキサクシ
ネート１００■とウシ血清アルジミン（ＢＳＡ）１５０
〜より出発した。 ｔｅｌ　　エストラジオールに対する抗体の製造ヒツジ
に、完全なフロイントの補薬に溶解したエストラジオー
ル−１７−サクジニルーＢ８ム４ダを４週間に一度注射
した。通常の間隔をおいてヒツジを採血した。血清は不
溶にしたＢＳＡで教会 収させた。 （ｄ）　　ヒツジ−ｒ−グアプリンに対する抗体の製造
ヒツジｒ−グロブリンを実施例１に述べたように、但し
今回はＩＣ％ｗ／ｖ硫酸す）　ＩＪウムで調製した。ウ
サギを１次４ｃ述べる計画に従ってこのヒツジ−ｒ−グ
ロブリンで免疫した。 日　　　　　量　　　　フロイントの補薬　注射法０　
　２００μｇ　　　　　＋　　　　　筋肉内１４　　　
４００ｐＩＩ　　　　　＋　　　　　　　ｙ２８　　　
８００μｇ＋１ ４２　　　８００μ９　　　　　　　　　　静脈内ｉ＆
後の注射から２週間して実験動物を採血した。 （・）免疫吸着剤〔ウサギ−抗（ヒツジ−γ−グロブリ
ン）〕−竜ルローズの製造 （ｄ）に述べた抗血清のγ−グロブリン画分）ｋ、１８
％ｗ／ｖ　Ｎａ２８０４　　で沈澱させて調製した。得
られた生成物を実施例１に述べたガーピッヒ沫（Ｇｕｒ
ｖｉ＠ｈ　ｍ＠ｔｈｏｄ　）でセルローズに結合さ（た
。 ｔｆｌ　　エストラジオールの測定 免疫反応ｔ２％Ｂ８Ａ１に：含有するｐＨ６，０の０゜
０２Ｍりン醸）ζソファ−中で行なった。 試料０．５１１４’ｔ’所望の希釈でヒツジ−抗−エス
トラジオール血清００ｌＩＩ７と混合した。室温で３０
分インキュば−ション後、適当に希釈したエストラジオ
ール−１７−サクジニルーＨＲＰ０．１ｄ１に添加し、
その後も５−［室温で３０分インキュば一トした。それ
から、免疫吸着剤の懸濁液（３０ダ／ｍｌ／）０．３−
を添加し、その混合物を室温で２時間回転させた。それ
から遠心分離で液相と固相ｔそれぞれ分離し、上澄の酵
素活性を実施例１に述べたように測定した。ヒツジ−抗
−エストラジオール血清は、用いるエストラジオール−
１７−サクジニルーＨＲＰの品質により１：１６００乃
至１：１２８００の希釈で用いることができる。 抗血清ｘ：ｘ２．ｓｏｏの希釈では、エストラジオール
＃ｆｌＯｆｉＩｉ／−を試料中ｌこ検出できる。 エストリオールとエストロンはこの系で交叉反応を起こ
ｊ６ 去１け［−１ コルチゾール及びコルチコイド−結合グロブリンの測定 （ａ）　　コルチゾール−２ｌ−（ガラクトースオキシ
ダーゼ）の製造 コルチゾール−２１−ヘミサクシネート５０■とガラク
トースオキシダーゼ１００ＩＩＩＰｋ実施例３の（ｍｌ
に述べた混合無水物法で結合さセる。 （ｂ）　　コルチコイド−結合グロブリン（ＣＢＧ）７
゜ＤＩＡＩ−セルローズと水酸化アパタイトの顔にクロ
マトグラフィーに付して人血清から単離した。 これに対する抗体を、完全なフロイントの補薬に溶かし
たＣＢＧ５００ｐＪを１４日おきにウサギに注射して製
造した。３ケ月後実験動物にＣＢＧＩダな注射し、その
２週間後に採血した。 （ｅ）　　実施例３に述べたように、抗−ＣＢＧ血清の
ｒ−グロブリン画分′Ｉｋ：ｍ−丁ミノはンジルオキシ
メチルセルローズに結合させた。 （ｄ）　　コルチゾールの測定 コルチゾールを含有する試料（＊＄ｆｉｌ’ｆＫ　）　
０．５ｄｙｙ塩化メチレン３−で２回抽出し、抽出−分
【合（て蒸発乾固した。残留物をｐＨ６，２の０．０５
Ｍリン酸）２ツファ−０，５ｄにと９．同じノ２ツフア
−に適当な濃鼻で鋳かしたＣＢＧ溶＠　０．１１１１と
混合し、４℃で３０分インキュベートした。それから、
適当に＃ｒ釈したコルチゾール−２ｌ−（ガラクトース
オキシダーゼ）０．１ｊｌｌｊと、（ｅｌで調製した５
〜／−の１ｉｌ１１度の免疫吸着剤０．３−を添加した
。 得られた混合物ｖ４℃で２時間回転し、遠心分離し、そ
の後上澄の酵素活性を測定した。この目的のため、上記
上澄０６５１を、Ｄ−ガラクトース１００■、５−丁ミ
ノサソチル酸２０ダ及びパーオキシダーゼ１０μ９をｐ
Ｈ６，０の０．０２　Ｍリン酸バッフ丁−１５０−にＳ
解した基質１．５１に添加し、３０分後に４６０　ａｍ
の吸光度を測定した。 ０．４μｇ／−の１ｄ度のＣＢＧと、ステロイド類を添
加しなくとも酵素結合体の８０％が免疫吸着剤に一合す
る根の量のコルチゾール−２ｌ−（ガラクトースオキシ
ダーゼ）′ｆ：用いた場合、３乃至３０ｎ９のコルチゾ
ールが画定可能であることが判明した。 （・）　　ＣＢＧの測だもまた上記の試薬を用いれば可
能である。０−１２８０Ｊ／−に希釈した一連のトラン
スコルチン０．５１１４ｔ−、過当に希釈したコルナシ
−ルー２１−（ガラクトースオキシダーゼ）０．２−と
１５分間インキュベートした。七ｎから免疫吸着剤の懸
濁液（５〜／ｄ　）　０．３ｊｌｊｔ−添加し、その混
合物を１５分間回転した。２つのインキュイージョン処
塩は４℃で行なった。それから上置の酵素活性’ｋ　（
ｄ）に述べたようにして画定した。この試験系の感ｌは
５０　ｒｒ９　／ｄであることが判明した。 実施例　５ ピン容器中に以下の試薬を分離した層に凍結乾燥した。 （１）実施例１の（ａ）に述べた免疫吸着剤の懸濁液（
１０■／ａ（）　０．３−０ （２）１％マンニトール溶液０．１１１１７（３）実施
例１の（ａ）に述べたＨＣＧ−ＨＲＰｏ、１ｉｕ血清０
．ｌ− この凍結乾燥した混合物に、尿試料０．５１と蒸−水０
．５１１１１７Ｙ添加し、１０分後止澄の酵素活性を。 尿素−水素パーオキシダーゼとＯ−）リジンなしみこま
せた細長い紙で画定した。 尿試料が妊娠した婦人のものであれば（）ＺＩｔＪＨＣ
ｖａｔ）　１．５分以内に溶液は實変し、尿が妊娠した
婦人のものでない時は、同じ時間内に変化は起こらない
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１主として。 （ａ）　　４Ｉ定の結合活性をもつ蛋白質に対応して結
   合する物質と＃素との結合体の既知量と、缶）測定しよ
   うとする特定の結合活性をもつ蛋白質に対する抗体の不
   溶化されたものの既知量と、および （ｃ）　　用いる酵素の活性を測定するための基質と を含有する、特定の結合活性を持つ蛋白質を検出及び調
   定するための試薬セット。 （２）　　主として。 （ａ）　　結合する物質と酵素との結合体の既知量（ｂ
   ）　　特定の結合活性をもつ蛋白質の対応する量と。 （ｃ）　　用いる特定の結合活性を持つ蛋白質に対する
   抗体の不溶化されたものの既知量と、および （ｄ）　　用いる酵素の活性をＩＩＩＩ定するための基
   質とを含有する、結合する物質を検出及び測定するため
   の試薬セット。 （３）必須成分として、凍結乾燥した層に（ａ）ＨＣＧ
   と酵素との結合体の一定量と、伽）　抗−ＨＣＧの一定
   量と、および （ｅ）　　抗−ＨＣＧに対する不溶化した抗体の一定量
   と を含有し、液相に残るＨＣＧ−酵素の酵素活性を測定す
   るための基質を組合せて含有する容器からなる＠娠を判
   定するための試薬セット。