KR100869814B1

KR100869814B1 - 내피세포 특이성을 나타내는 프로모터 및 이를 이용하는 방법

Info

Publication number: KR100869814B1
Application number: KR1020037006728A
Authority: KR
Inventors: 하라츠드로
Original assignee: 바스큘라 바이오제닉스 리미티드
Priority date: 2000-11-17
Filing date: 2001-11-15
Publication date: 2008-11-25
Also published as: EP2186530A1; KR20040048370A; KR100917854B1; CN100457190C; AU2010202660A1; CN1592638A; PT2186530E; AU2400202A; EP1443970B1; CA2429342C; JP2004534509A; EP2386319B1; KR20080083031A; ES2425321T3; MXPA03004325A; WO2002040629A2; DK2386319T3; EP1443970A2; CA2429342A1; HK1143082A1

Abstract

진핵 세포에서 프로모터로서 기능하는 분리된 폴리뉴클레오티드가 개시되어 있다. 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 상세히 기재되어 있는 바와 같이 내피세포 특이적 증강인자 요소를 포함한다. 또한, 내피세포에서 관심대상 핵산 서열을 발현시키는 방법이 개시되어 있다.

내피세포, 프로모터, 특이성, 저산소증, 혈관신생

Description

내피세포 특이성을 나타내는 프로모터 및 이를 이용하는 방법 {PROMOTERS EXHIBITING ENDOTHELIAL CELL SPECIFICITY AND METHODS OF USING SAME}

본 발명은 내피세포 특이적 프로모터 활성을 나타내는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열, 및 그의 이용 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 내피세포에서 증가된 활성 및 특이성을 나타내는 변형-프리프로엔도셀린-1(modified-preproendothelin-1(PPE-1)) 프로모터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 저산소증(hypoxia) 및 혈관신생(angiogenesis)을 포함하는 생리학적 이상 상태에 반응하여 그 발현을 강화하는 PPE 프로모터의 변형체에 관한 것이다.

유전자 치료는 선천성 및 후천성 인간 질환을 치료하기 위한 새로운 형태의 치료 방법이다. 암, 심혈관 및 말초 혈관 질환에 대한 유전자 치료 방법을 개발하기 위해 많은 노력들이 기울여지고 있지만, 효과적이고 특이적인 유전자 전달에 여전히 주요 장애물이 존재한다. 일반적으로, 왕복체(suttle)로서 재조합 바이러스 벡터를 사용하여 관심대상 유전자로 인한 유전자 치료의 주요한 한정 요소는 관심대상 유전자를 표적 조직으로 특이적으로 이동시킬 수 있는 능력이다. 이러한 목적을 위해 사용되는 아데노바이러스는 상이한 친화성(affinity)을 가진 다수의 세포를 세포 감염시킬 수 있다. 실제로, 비-조직 특이적 프로모터를 사용하면, 간에서 관심대상 유전자 발현의 95%까지 유도한다; 따라서, 발현 조절이 상당히 요구된다. 또한, 현재 유전자를 표적으로 한 경우 성장 중의 종양에서 확장하는 혈관 내피세포 및 정상 혈관 내피세포를 구별화할 수 없다.

암 확장 및 혈관 질환에 있어서, 새로운 혈관을 생성하는 혈관신생은 중요한 역할을 수행한다. 따라서, 혈관 내피세포에 대한 유전자 치료에 의한 이러한 진행과정의 조절은 상기 질환들에 대한 표적 치료를 유도하는데 있어 상당히 중요할 수 있다.

레트로바이러스 벡터에 의해 전달된 인간 프리프로엔도셀린-1(PPE-1)은 내피세포(EC)에서 시험관 내 및 형질 전환 동물 모델에서 얻어졌다. 그러나, 종래 기술은 생체 내 유전자 치료를 위한 이러한 프로모터의 용도를 개시하고 있지 않다. 인간 PPE-1은 다른 동물들, 특히 마우스의 PPE-1 유전자에서 발견되는 조절 요소(regulatory element)가 부족하다.

미국 특허 제 5,747,340호는 쥐 PPE-1 프로모터 및 그 일부의 사용을 개시하고 있다. 그러나, 상기 특허는 내피세포-특이적 증강인자(enhancer)가 내피세포의 특이성을 유지하면서 PPE 프로모터에 의해 달성되는 발현 수준을 증가시키기 위해 사용될 수 있다는 어떠한 암시 또는 제시도 하고 있지 않다. 또한, 상기 특허는 PPE-1 프로모터가 저산소 상태에서 보다 높은 전사(transcription) 수준으로 유도됨을 개시하고 있지 않다.

따라서, 향상된 내피세포 특이적 프로모터, 이들의 사용방법 및 상기 제약이 없이 이들에 의해 변형된 세포에 대한 광범위한 인식의 필요성이 있어 왔으며, 이들을 얻는다는 것은 매우 유리할 것이다. 본 발명은 이미 공지된 상황에 대해 혈관 질환, 암 및 상처 치유에 있어서 부가된 용도를 설명해 줄 것으로 기대된다.

본 발명의 요지에 따르면, 진핵 세포에서 프로모터로서 기능하는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 6에 기재되어 있는 서열의 2 이상의 카피(copy)를 포함하는 증강인자(enhancer) 요소를 포함한다.

본 발명의 또 다른 요지에 따르면, 내피세포에서 활성 RNA 분자 또는 효소, 리포터 분자 등과 같은 단백질을 코딩하는 관심대상 핵산 서열을 발현시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 진핵 세포에서 기능하는 프로모터의 조절 제어하에 위치하는 관심대상 핵산 서열을 포함하는 구조체에 투여하는 것을 포함한다. 상기 구조체(construct)는 서열번호: 6에 기재되어 있는 하나 이상의 카피를 포함하는 증강인자 요소를 더 포함한다.

본 발명의 또 다른 요지에 따르면, 조직 내에서 혈관신생을 조절하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) 내피세포 특이적 프로모터; (b) 서열번호: 5에 기재되어 있는 저산소증 반응 요소의 하나 이상의 카피; 및 (c) 프로모터 및 저산소증 반응 요소의 조절 제어하에서 혈관신생 조절 인자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구조체를 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 요지에 따르면, 진핵 세포에서 프로모터로서 기능하는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 7에 기재되어 있는 서열을 포함하는 증강인자 요소를 포함한다.

본 발명의 또 다른 요지에 따르면, 조직에서 혈관신생을 조절하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) 내피세포 특이적 프로모터; (b) 서열번호: 7에 기재되어 있는 서열을 포함하는 증강인자 요소; (c) 서열번호: 5에 기재되어 있는 저산소증 반응 요소의 하나 이상의 카피; 및 (d) 프로모터, 증강인자 요소 및 저산소증 반응 요소의 조절 제어하에서 혈관신생 조절 인자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구조체를 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 요지에 따르면, 서열번호: 8에 기재되어 있는 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 증강인자 요소를 포함하는, 진핵 세포에서 프로모터로서 기능하는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명의 또 다른 요지에 따르면, 진핵 세포에서 기능하는 프로모터의 조절 제어하에 위치하는 관심대상 핵산 서열 및 서열번호: 8에 기재되어 있는 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 증강인자 요소를 포함하는 구조체에 투여하는 것을 포함하는, 내피세포에서 관심대상 핵산 서열을 발현시키는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 요지에 따르면, 서열번호: 8에 기재되어 있는 서열을 포함하는 증강인자 요소를 포함하는, 진핵 세포에서 프로모터로서 기능하는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 증강인자 요소는 서열번호: 6에 기재되어 있는 서열의 3개의 카피를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 서열번호: 6에 기재되어 있는 서열의 2 이상의 카피는 인접해 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 내피세포 특이적 프로모터 요소를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 내피세포 특이적 프로모터 요소는 PPE-1 프로모터의 하나 이상의 카피를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 저산소증 반응 요소를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 저산소증 반응 요소는 서열번호: 5에 기재되어 있는 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 증강인자 요소는 서열번호: 7에 기재되어 있는 것임을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서 또 다른 특징에 따르면, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드 및 상기 분리된 폴리뉴클레오티드의 조절 제어하에 있는 관심대상 핵산 서열을 포함하는 핵산 구조체가 제공된다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 관심대상 핵산 서열은 VEGF, p55 및 PDGF-BB로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서 또 다른 특징에 따르면, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드에 의해 형질 변환된 포유류 세포가 제공된다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 프로모터는 내피세포 특이성을 나타내는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호: 1에 기재되어 있는 PPE-1 프로모터인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 투여는 (i) 전신 생체 내 투여; (ii) 대상체로부터 제거된 세포에 생체 외 투여한 후, 이 세포를 대상체로 재도입; 및 (iii) 국소 생체 내 투여로 이루어지는 군으로부터 선택된 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 핵산 서열 구조체는 서열번호: 6에 기재되어 있는 서열의 2 이상의 카피를 포함하는 증강인자 요소를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 내피세포 특이적 프로모터는 PPE-1 프로모터의 하나 이상의 카피를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서 또 다른 특징에 따르면, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드 및 분리된 폴리뉴클레오티드의 조절 제어하에 있는 관심대상 핵산 서열을 포함하는 핵산 구조체가 제공된다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 증강인자 요소는 서열번호: 6에 기재되어 있는 서열의 하나 이상의 카피를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 증강인자 요소는 서열번호: 8에 기재되어 있는 서열의 하나의 카피 및 서열번호: 6에 기재되어 있는 서열의 2 이상의 카피를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 증강인자 요소는 서열번호: 6에 기재되어 있는 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 하나 이상의 카피는 2개의 카피를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 핵산 구조체는 서열번호: 8에 기재되어 있는 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 증강인자 요소를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 요지에 따르면, (a) 내피세포 특이적 프로모터; (b) 서열번호: 8에 기재되어 있는 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 증강인자 요소; 및 (c) 프로모터 및 증강인자 요소의 조절 제어하에서 혈관신생 조절 인자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구조체를 투여하는 것을 포함하는, 조직 내 혈관신생을 조절하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 요지에 따르면, 상기 증강인자 요소는 서열번호: 8에 기재되어 있는 하나의 카피 및 서열번호: 6에 기재되어 있는 서열의 2 이상의 카피를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 내피세포 특이성을 가진 개선된 분리된 폴리뉴클레오티드 서열 및 그의 사용 방법을 제공함으로써 현재 알려져 있는 상황의 단점을 성공적으로 해결한다. 상기 서열의 개선은 이전에 불가능한 것으로 생각되었던 각종 질환, 장애 및 이상 상태를 용이하게 치료할 수 있게 한다. 구체적으로, 상기 개선은 내피세포에 대한 특이적 증가, 관심대상 서열의 발현 수준의 증가, 및 허혈(ischemia) 및 혈관신생을 포함하는 이상 상태에 의한 유도 강화와 관련이 있다.

본 발명은 단지 예시만을 위한 첨부 도면을 참조로 하여 기재된다. 도면을 상세히 참조하면, 단지 본 발명의 바람직한 실시형태의 예로서 또한 예시적인 논의를 목적으로 제공되며, 본 발명의 원리 및 개념적 요지의 기재가 가장 유용하고 쉽게 이해되도록 하는 것을 위하여 제공됨이 강조된다. 이와 관련하여, 본 발명의 기본적인 이해를 위해 필요 이상으로 본 발명의 구조적인 내용을 나타내고자 하는 시도는 없으며, 이러한 기재 내용은 도면과 함께 본 발명의 몇몇 유형이 어떻게 구체화되는지 당업자가 명백하게 이해하도록 한다.

도 1은 비-내피세포 대조군으로서 B2B 세포주를 사용하여 소 및 인간 내피세포주에서 루시페라아제(Luciferase) 발현에 대한 본 발명의 증강인자 요소의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.

도 2는 다양한 세포주에서 루시페라아제 발현에 대한 아데노바이러스 벡터에서 본 발명의 프로모터의 내피세포 특이성을 나타내는 막대 그래프이다.

도 3(A) 및 도 3(B)는 본 발명의 Ad5PPE-1-3X 및 BAEC 세포주에서 Ad5CMV 제대조군 구조체의 제어하에서 GFP 발현을 나타내는 현미경 사진들이다.

도 4는 내피세포 및 비-내피세포에서 pACPPE-1-3Xp55, pACPPE-1-3X루시페라아제 및 pCCMVp55에 의해 유도되는 세포 사멸율(%)의 막대 그래프이다.

도 5는 저산소증 반응에 대한 본 발명에 따른 증강인자 요소의 프로모터 구조체로의 도입 효과를 나타내는 막대 그래프이다.

도 6은 저산소증 반응에 대한 본 발명에 따른 증강인자 요소의 아데노벡터(adenovector) 구조체로의 도입 효과를 나타내는 막대 그래프이다.

도 7은 소 및 인간 내피세포주에서 발현 수준에 대한 본 발명에 따른 증강인자 요소의 프로모터로의 도입 효과를 나타내는 막대 그래프이다.

도 8은 내피세포 프로모터(PPE-1) 또는 대조군(CMV) 프로모터를 함유하는 아데노바이러스 구조체의 주입 후, 다양한 기관에서 관찰되는 리포터 유전자의 발현 수준을 나타내는 막대 그래프이다.

도 9(A) 및 도 9(B)는 구조체가 주입된 마우스의 간 조직에서 Ad5CMVGFP 구조체(도 9(A)) 및 Ad5PPE-l-GFP 구조체(도 9(B))의 세포 발현을 나타내는 2개의 현미경 사진들이다.

도 10은 내피세포주 및 비-내피세포주에서의 발현 수준에 대한 본 발명에 따른 증강인자 요소의 프로모터로의 도입 효과를 나타내는 막대 그래프이다.

도 11은 내피세포주 및 비-내피세포주에서 발현 수준에 대한 본 발명에 따른 증강인자 요소의 프로모터로의 도입 효과를 나타내는 막대 그래프이다.

도 12(A) 내지 도 12(C)는 각각 Ad5PPE-1-3XGFP 형질 도입된 세포, Ad5PPE-lGFP 형질 도입된 세포 및 Ad5CMVGFP 형질 도입된 세포에서 GFP 발현을 나타내는 현미경 사진들이다.

도 13(A) 및 도 13(B)는 각각 Ad5PPE-1-3XGFP 및 Ad5CMVGFP의 moi-1에 의해 형질 도입된 SMC에서 GFP 발현을 나타낸다.

도 14(A) 및 도 14(B)는 HeLa 세포에서 수행된 도 13(A) 및 도 13(B)와 유사 한 실험의 결과이다.

도 15(A) 및 도 15(B)는 HepG2 세포에서 수행된 도 13(A) 및 도 13(B)와 유사한 실험의 결과이다.

도 16(A) 및 도 16(B)는 inNSF 세포에서 수행된 도 13(A) 및 도 13(B)와 유사한 실험의 결과이다.

도 17(A) 및 도 17(B)는 각각 Ad5PPE-lGFP 및 Ad5PPE-1-3XGFP 구조체가 주입된 마우스의 혈관을 라이닝(lining)하는 내피세포에서의 GFP 발현을 나타내는 현미경 사진들이다.

도 18(A) 내지 도 18(C)는 주입된 마우스의 신장 조직에서의 결과를 나타내는 현미경 사진들이다. Ad5CMVGFP 주입된 마우스(도 18(A)), Ad5PPE-lGFP(도 18(B); 약간 높은 GFP 발현이 혈관벽에서 관찰된다; 화살표 표시) 및 Ad5PPE-1-3XGFP(도 18(C)).

도 19(A) 내지 도 19(C)는 비장 조직의 절편에 대해 실시된, 도 18(A) 내지 도 18(C)에 나타낸 결과와 유사한 실험을 나타낸다.

도 20(A) 내지 도 20(D) 및 도 20(C') 내지 도 20(D')는 각각 식염수 주입된 대조군 마우스(도 20(A)), Ad5CMVGFP 주입된 마우스(도 20(B)), Ad5PPE-lGFP 주입된 마우스(도 20(C)) 및 Ad5PPE-1-3XGFP 주입된 마우스(도 20(D))의 전이성(metastatic) 폐에서의 GFP 발현을 나타낸다. 항 Cd31 면역 염색(immunostaining)(도 20(C') 내지 도 20(D'))을 통해 각 전이성 조직에서 GFP 발현 및 CD31 발현의 공-편재화(co-localization)를 확인할 수 있다.

도 21은 세포 감염된(transfected) 세포가 저산소 상태하에서 배양되었을 때, 쥐 PPE-1 프로모터를 함유하는 플라스미드에 의해 세포 감염된 BAEC에서 루시페라아제 활성(광 유닛/㎍ 단백질)이 유의적으로 높음을 나타내는 막대 그래프이다.

도 22는 Ad5PPE-lLuc 및 Ad5CMVLuc가 사용된 것을 제외하고는 도 21과 같은 막대 그래프이다.

도 23은 상이한 세포주에서 저산소 상태의 효과를 나타내는 도 22와 같은 일련의 막대 그래프들이다.

도 24는 BAEC 세포에서 PPE-1 저산소증 반응에 대한 본 발명의 3X 서열의 효과를 나타내는 막대 그래프이다. 세포들은 Ad5PPE-lLuc 및 Ad5PPE-1-3XLuc에 의해 형질 도입되었다.

도 25는 대퇴부 동맥 결찰(femoral artery ligation) 후, PPE1-Luc 형질 전환 마우스에서의 루시페라아제 발현 수준을 나타내는 막대 그래프이다.

도 26(A) 및 도 26(B)는 본 발명과 병행하여 사용되는 구조체의 플라스미드 지도(map)이다.

도 27(A) 내지 도 27(D)는 결찰 후 21일째에, 상이한 처리 군으로부터 대표적인 동물들의 결찰된 사지의 일련의 초음파 사진들이다. 도 27(A) 대조군, Ad5CMVLuc. 처리군; 도 27(B) 대조군, 식염수 처리군; 도 27(C) Ad5PPE-3X-VEGF 처리군; 도 27(D) Ad5CMV-VEGF 처리군.

도 28은 Ad5PPE-lLuc(밝은 막대) 및 Ad5CMVLuc(짙은 막대)에 의해 형질 도입된 증식 및 휴지 중의 소 대동맥 내피세포(Bovine Aortic Endothelial Cells(BAEC))에서의 루시페라아제 활성을 나타내는 막대 그래프이다.

도 29는 VEGF 첨가 후, 정상 증식, 휴지 상태 및 급속한 증식 상태 중에 Ad5PPE-lLuc.에 의해 형질 도입된 BAEC에서의 루시페라아제 활성을 나타내는 막대 그래프이다.

도 30(A) 및 도 30(B)는 Ad5PPE-lLuc 및 Ad5CMVLuc 정상 주입된 C57BL/6 마우스의 대동맥(도 30(A)) 및 간(도 30(B))에서의 루시페라아제 활성(광 유닛/Lg 단백질)을 나타내는 막대 그래프이다. 활성은 주입 후 1일(n=13), 5일(n=34), 14일(n=32), 30일(n=20) 및 90일째(n=ll)에 측정하였다.

도 31(A) 및 도 31(B)는 정상 주입된 BALB/C 마우스에서 Ad5PPE-lLuc(밝은 막대) 또는 Ad5CMVLuc(짙은 막대)의 주입 후 5일(도 31(A)) 및 14일째(도 31(B))(각 시점에 대해 n = 10임)에 검출된 상대 루시페라아제 활성(광 유닛/㎍ 단백질)을 나타내는 막대 그래프이다. 활성은 각 동물의 전체 체내 루시페라아제 발현의 퍼센트로 표시한다.

도 32는 Sudan-IV에 의해 착색된 ApoE 결핍 마우스로부터 절개된 대동맥을 나타내는 종래의 사진이다. 흉부 대동맥은 보다 적은 적색 염색 죽상 경화증(죽상 경화증) 병변(lesion)을 포함하는 반면에, 복부 영역은 다수의 적색 염색된 죽상 경화증 병변을 포함한다(^l25I-HDL 및 ^l25I-BSA에 의한 대동맥 죽상 경화증 병변의 사진으로부터 조정함. A. Shaish 등, Pathobiology - submitted for publication).

도 33은 Ad5PPE-lLuc(밝은 막대; n=12) 또는 Ad5CMVLuc(짙은 막대; n=12)를 ApoE 결핍 마우스에 전신 주입 후 5일째에 검출된 절대 루시페라아제 활성(광 유닛/㎍ 단백질)을 나타내는 막대 그래프이다. 복부 대동맥으로부터 관찰된 루시페라아제 활성은 높은 병변 수준을 포함하고 있으며, 흉부 부위로부터 관찰된 루시페라아제 활성은 낮은 병변 수준을 포함하고 있다.

도 34는 C57BL/6 유도된 마우스를 상처 치유하기 위해 Ad5PPE-lLuc(짙은 막대) 또는 Ad5CMVLuc(밝은 막대)를 전신 주입 후 5일째에 절대 루시페라아제 활성(광 유닛/㎍ 단백질)을 나타내는 막대 그래프이다.

도 35는 정상 폐, 전이성 폐 및 루이스(Lewis) 폐 암종(carcinoma)-유도된 마우스의 초기 종양에서 루시페라아제 활성을 나타내는 막대 그래프이다. 루이스 폐 암종은 초기 종양 모델에 대해 배후 및 전이성 모델에 대해서는 발바닥에 D122-96 세포 주입에 의해 유도되었다. 루시페라아제 활성은 Ad5PPE-lLuc(n=9; 밝은 막대) 또는 Ad5CMVLuc(n=12; 짙은 막대)의 전신 주입 후 5일째에 측정하였다. 활성은 광 유닛/㎍ 단백질로서 표시한다.

도 36(A) 내지 도 36(D)는 Ad5PPE-lGFP 종양내(intra-tumoral) 주입후 LLC 를 갖는 마우스의 폐 및 종양에서의 GFP 발현 및 조직 형태를 나타내는 현미경 사진들이다. 조직은 OCT에서 동결 처리되었고, 저온 처리(cryostat)에 의해 10㎛으로 절편화되었다. 모든 사진들은 25배 배율로 촬영되었다. 도 36(A) - 폐 전이의 혈관신생 혈관에서 GFP; 도 36(B) - 도 36(A)에서 촬영된 절편의 CD31 항체 면역-염색; 도 36(C) - 초기 종양의 혈관에서 GFP 발현; 도 36(D) - 혈관을 나타내는 C의 절편의 위상차(phase contrast).

도 37은 Ad5CMVLuc, Ad5PPE-lLuc 및 Ad5PPE-1-3X-Luc으로 주입된 루이스 폐 암종-유도된 마우스의 정상 폐 및 전이성 폐에서의 루시페라아제 발현을 나타내는 막대 그래프이다. 루이스 폐 암종은 전이성 모델에 대해 발바닥에 주입된 D122-96 세포에 의해 유도되었다. 루이스 활성은 Ad5CMVLuc(n=7; 짙은 막대), Ad5PPE-lLuc(n=6; 회색 막대) 또는 Ad5PPE-l-3XLuc(n=13; 갈색 막대)의 전신 주입 후 5일째에 측정하였다. 활성은 광 유닛/㎍ 단백질로 표시한다.

도 38은 Ad5CMV, Ad5PPE-lLuc 및 Ad5PPE-1(3X)이 주입된 정상 폐 및 루이스 폐 암종-유도된 마우스에서 간 활성의 퍼센트로서 루시페라아제 활성을 나타내는 막대 그래프이다(간에서 100%임).

도 39(A) 및 도 39(B)는 Ad5PPE-1-3X-GFP 주입된 LLC 폐 전이를 가진 마우스에서 GFP 발현(도 39(A)) 및 Cd31 면역-염색(도 39(B))의 공-편재화를 나타내는 현미경 사진들이다.

도 40은 대퇴부 결찰 후 2, 5, 10 및 18일째에 PPE-1 루시페라아제 형질 전환 마우스의 근육(허혈성 및 정상) 및 대조군(비-결찰된 동물 - 0일; 각 군에 대해 n= 8임)에서 루시페라아제 활성(광 유닛/㎍ 단백질)을 나타내는 막대 그래프이다.

도 41은 대퇴부 결찰 후 5(n=6), 10(n=6) 및 18일째(n=8)에 PPE1 루시페라아제 형질 전환된 마우스의 근육(허혈성 및 정상) 및 대조군(비 결찰된 동물 - 0일)에서 간, 폐 및 대동맥에서의 루시페라아제 활성(광 유닛/㎍ 단백질)을 나타내는 막대 그래프이다.

도 42는 Ad5CMVLuc(짙은 막대) 또는 Ad5PPE-lLuc(밝은 막대)이 초기 종양에 주입된 LLC 마우스의 간, 폐 및 초기 종양에서 검출된 루시페라아제 활성(광 유닛/㎍ 단백질)을 나타내는 막대 그래프이다.

본 발명은 관심대상 서열의 고-수준 발현을 신뢰성있게 내피세포 및 특히 혈관신생에 참여하는 내피세포에 지시하기 위해 사용할 수 있는 개선된 내피세포-특이적 프로모터에 관한 것이다.

본 발명의 원리 및 용도는 도면 및 첨부되어 있는 기재 내용을 참조로 하여 보다 잘 이해될 것이다.

하나 이상의 본 발명에 따른 일 실시형태를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 하기 기재 내용에 기재되어 있거나 또는 하기 실시예 및 도면에서 설명하고 있는 구성의 상세한 설명 및 성분들의 배치에 한정되는 것이 아님은 물론이다. 본 발명은 또 다른 실시형태일 수 있으며, 다양한 방법으로 실시 또는 수행될 수 있다. 또한, 술어 및 용어들은 기재를 목적으로 하는 것이며, 한정의 의미로서 간주되어서는 안됨은 물론이다.

내피세포에 특이적인 프로모터가 이미 기재되어 있지만(예를 들면 미국 특허 제 5,747,340호), 이들 프로모터는 통상적으로 내피세포로 발현을 지시하는데 있어 효율적이지 못하거나, 내피세포에 대해 생체 내 특이적인 것으로 증명되지 않았다.

내피세포에 대해 특이적인 증강인자 요소들이 또한 기재되어 있다. Bu 등(J. Biol Chem. (1997) 272(19): 32613-32622)은 PPE-1의 IX 증강인자 요소 중 3개의 카피(3X)(ETE-C, ETE-D 및 ETE-E 요소를 함유함)가 시험관 내 내피세포 특이성을 프로모터 서열에 부여한다는 것을 증명하고 있지만, 이러한 활성은 생체 내 실험에서 증명되지는 않았다.

본 기술 분야에 잘 알려져 있는 바와 같이, 시험관 내 실험은 생체 내 결과를 신뢰성있게 예측할 수 없다. 이와 같이, Bu 등에 의해 제공된 결과는 비록 내피세포 특이성을 암시하고 있다 하더라도, 생체 내 3X 증강인자 요소의 용도에 대한 충분한 증거를 제공하지는 않고 있다.

이와 같이 생체 내 연구의 부족은 전체 유기체에서 3X 증강인자 요소의 내피세포 특이성을 의심케 한다. 생체 내에서 사용될 때, 특히 혈관신생을 조절하기 위해 사용될 때, 혈관신생 조절 인자(예를 들면 세포 독소)의 발현은 바람직하게는 혈관신생에 관여하는 내피세포에 특이적인 서브세트(subset)에서 내피세포에 대해 특이적으로 지시하는 것이 필수적이기 때문에, 이러한 자료의 부족은 상기 요소의 치료 용도가 의문스럽다는 것을 의미한다.

후술하는 실시예에서 나타난 바와 같이, 본 발명자들은 각고의 실험을 통해 최초로 3X 증강인자 요소의 생체 내 활성에 대해 결정적인 증거를 제공하였다. 이러한 증거는 3X 요소 및 그 서열 유도체(예를 들면 서열번호: 7)를 치료용도에서 사용하기에 매우 적합한 것으로 확인하고 있다.

또한, 본 발명을 실시할 때, 본 발명의 PPE-1 증강인자 서열의 신규한 배열이 프로모터 서열에 혈관신생에 참여하는 내피세포에 있어 기대치 않게 상당한 특이적 활성을 부여한다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명의 요지에 따르면, 인간과 같은 포유류에서 내피세포 특이적 프로모터로서 기능하는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 6에 기재되어 있는 서열의 하나 이상의 카피, 바람직하게는 후술하는 실시예 부분에서 설명되는 바와 같이 혈관신생에 참여하는 내피세포에서 발현을 조절하는 중요한 역할을 수행하는 서열번호: 8에 기재되어 있는 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다.

본 발명에 의해 이용할 수 있는 증강인자 요소의 특이적이고 신규한 서열 배열은 서열번호: 7에 기재되어 있다.

본 명세서 및 첨부 청구범위에서, 용어 "증강인자"는 프로모터의 전사 효율을 증가시키는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.

본 발명의 일부 실시형태에 따르면, 분리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 6 및/또는 8의 인접한 카피를 포함한다. 비록 본 발명의 증강인자 요소가 또한 서열번호: 6 또는 8의 서열의 특이적 부분의 하나 이상의 카피를 포함할 수 있지만, 이러한 서열은 바람직하게는 머리-대-꼬리(head-to-tail) 배향으로 위치해 있으며, 예를 들면 상기 증강인자 요소의 구성에서 서열번호: 6 또는 8에 상보적인 서열을 사용함으로써 역배향으로 위치해 있다.

바람직하게는, 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 내피세포-특이적 프로모터 서열 요소를 더 포함한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 용어 "프로모터"는 하류(downstream)의 관심대상 서열의 RNA 전사를 매개할 수 있는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 내피세포 특이적 프로모터 요소는 예를 들면 PPE-1 프로모터의 하나 이상의 카피를 포함할 수 있다.

바람직하게는, 분리된 폴리뉴클레오티드는 저산소증 반응 요소, 예를 들면 서열번호: 5에 기재되어 있는 서열의 하나 이상의 카피를 더 포함한다.

따라서, 본 발명의 요지에 따르면, 다양한 증강인자 요소 배열을 포함하는 내피세포 특이적 프로모터가 제공된다.

상기 증강인자 요소 서열이 사용되는 프로모터 서열, 프로모터의 상류 내, 프로모터와 하류의 관심대상 서열의 사이, 또는 관심대상 서열 내에 (예를 들면, 인트론)에 위치될 수 있다고 이해될 것이다.

본 발명의 분리된 핵산 서열은 진핵 세포 조직, 특히 증식 중의 내피세포 예를 들면 혈관신생에 관여하는 내피세포에서 유전자 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드 서열은 몇몇의 경우에 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드의 조절 제어하에 위치되는 관심대상 핵산 서열을 더 포함하는 핵산 구조체의 일부로서 제공될 수 있다. 이러한 핵산 구조체는 예를 들면 선택 표지자(marker)를 코딩하는 서열, 박테리아에서 복제 원점(origin of replication) 또는 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 서열과 같은 임의의 부가적인 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함할 수 있다. 이러한 핵산 구조체는 바람직하게는 포유류 세포 발현을 위해 배열되고, 바이러스 원점을 가질 수 있다. 포유류 발현에 적합한 핵산 구조체의 다수 예가 본 기술분야에 알려져 있다; 후술하는 실시예 부분은 이러한 몇몇 구조체에 대한 상세한 설명을 더 제공한다.

본 명세서 및 첨부되어 있는 청구범위에서, 용어 "관심대상 서열"은 RNA 폴리머라아제에 의해 전사되는 능력을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상기 정의는 폴리뉴클레오티드로 번역가능한 코딩 서열, 뿐 아니라 안티센스(antisense) RNA, DNA에 결합하는 RNA, 리보자임 및 번역과정을 겪도록 결정되지 않은 다른 분자 잔기용 서열을 포함한다. 본 발명에 따른 구조체에 의해 사용될 수 있는 관심대상 핵산 서열의 예가 후술되어 있으며, 후술하는 실시예 부분에 제공되어 있다.

이하 제공되는 실시예는 본 발명의 개선된 내피세포 특이적 프로모터가 전신 생체 내 투여 후 리포터 조직의 발현을 내피세포 조직에 신뢰성있게 지시할 수 있음을 기재하고 있다. 이들 실시예는 또한 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드가 죽상 경화증 및/또는 혈관신생 조직에서 리포터 단백질(GFP)을 우선적으로 발현하기 위해 사용될 수 있어 치료 용도로서 PPE-1 증강인자 요소 및 그 유도체의 중요성에 대한 직접적인 증거를 제공할 수 있다는 것을 최초로 보여준다.

GFP와 같은 리포터 단백질의 사용은 전이성 종양 성장의 초기 단계의 검출시, 특히 동물 모델에서 그 유용성이 있으며, 비-침입성(non-invasive) 전이 이미징용으로서 유용성이 있지만(Yang, M. 등., Proc. Nat. Acad. of Sci. (2001) 27: 2616-2621), 이러한 용도는 본 발명의 의도된 유용성의 작은 부분에 불과하다. 예를 들면, AdPPE-lGFP가 상대적으로 비-침입성 방법에 의해 혈관신생을 추적하여 치료하기 위하여 AdPPE1tk, AdPPE-lp55 및/또는 다른 항-혈관신생 처리와 조합하여 사용될 수 있다고 믿어진다.

예를 들면 AdPPE1-3X-p55와 같은 구조체에서 세포 사멸 유도 인자(예를 들면, p55; GenBank 등록번호 M75866)로 GFP 리포터 유전자를 대체하면, 성장 중의 종양의 혈관신생 혈관에서 신속하게 증식하는 내피세포에 대해 신뢰성있게 세포 사멸을 표적화할 것으로 예상된다. 이러한 벡터가 전신 투여될 수 있기 때문에, 병소(foci)의 위치를 발견하지 않고도 전이성 병소를 확장시키는데 있어 세포 사멸을 효과적으로 유도하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 사용은 선행기술과 비교하여 유의할만한 개선을 보인다. 혈관 구조(vasculature)를 확장시키는데 있어 세포 사멸을 특이적으로 유도함으로써, 혈관신생을 제거할 수 있다.

이와 반대의 접근 방법으로서 예를 들면 죽상 경화증 환자 또는 질환 또는 손상의 결과 말초 순환이 상당한 손상된 환자들에게서 조직을 재혈관화하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 경우, GF가 성장 인자(예를 들면, 시토킨(cytokine) 또는 그 변형물(예를 들면, AdPPE-1-서열번호: 7-GF)인 AdPPE-1-3X-GF 형의 구조체가 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 적합한 성장 인자는 VEGF(GenBank 등록번호 M95200) 및 래트 PDGF-BB(GenBank 등록번호; mus-AF162784에 대해 99% 동등성) 및 EGR-1(GenBank 등록번호 M22326) FGFs(GenBank 등록번호 XM 003306를 포함하지만, 한정되지는 않음) 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 프로모터 서열 내로 저산소증 반응 요소(예를 들면, 서열번호: 5)를 혼입하는 것은 허혈성 조직에 대한 발현 선택성을 보다 강화하기 위해 사용될 수 있기 때문에, 선택된 조직의 신(neo)-혈관조직화로 진행될 수 있다는 것으로 이해될 것이다. 혈액 공급이 개선됨에 따라, 허혈이 경감되며, 저산소증 반응 요소의 유도가 중지되며, GF 수준이 감소하며 신-혈관조직화 진행이 정지된다.

본 발명의 개시 내용에 따르면, 생성되는 프로모터 서열은 특히 조직에서의 혈관신생을 조절하는데 유용하다. 후술하는 실시예 부분에서 설명되는 바와 같이, 본 발명의 프로모터 서열 및 변형되지 않은 PPE-1 프로모터를 함유하는 변형된 3X(서열번호: 7)가 LLC 모델의 전이성 병소에서 발현된다. 그러나, 실시예 22는 변형 3X 서열이 정상 폐에서 리포터 유전자의 발현 수준의 감소 및 전이성 병소에서 리포터 유전자의 발현에서 극적인 증가를 특이적으로 담당하고 있음을 명백히 설명하고 있다. 이러한 결과가 달성될 수 있다는 것은 종래 기술에서는 암시나 제시하고 있지 않다. 따라서, 유전자 치료 분야에서 3X 요소를 포함하는 구조체의 사용은 주위의 정상 조직에 대한 독성 효과를 최소화하면서 종양으로의 전달을 극대화할 것으로 예상할 수 있다. 유의적으로, 도 37에 나타낸 바와 같이, 주위 조직이 내피세포 성분을 함유하고 있더라도 적용된다. 이는 실시예 11에 나타낸 바와 같이, 3X 서열이 PPE-1 프로모터 분야에서도 급속히 증식하는 내피세포 조직에서도 발현 수준을 크게 증가시키기 때문이다.

예를 들면, p55 유전자는 성장 중의 종양에 세포 사멸을 특이적으로 유도하기 위해 저산소증 반응 요소를 함유하는 본 발명의 프로모터와 조합하여 사용될 수 다. 이러한 방법은 종양 성장이 종종 주위 조직의 혈관신생 능력을 초과함에 따라 성장 중의 종양 덩어리가 허혈로 진행하는 경향이 있기 때문에 가능한 것으로 생각된다. 종양 덩어리를 특이적으로 감소시키기 위해 본 발명의 프로모터 서열과 함께 사용될 수 있는 다른 발현가능한 세포 독소는 다른 프로-세포 사멸 유전자, 헤르페스(Herpes) 단일(simplex) 티미딘 키나아제 유전자(HSV-tk; InvivoGen, San Diego, CA이 시판하고 있는 pORF-HSVltk 발현 벡터에 포함됨) 안지오스타틴(Genbank 등록번호 number X05199), 엔도스타틴(Genbank 등록번호 number M33272) 및 안지오스타틴-엔도스타틴 키메라(chimera)(InvivoGen, San Diego, CA이 시판하고 있는 pORF-HSVltk 발현 벡터에 포함됨)를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

이와 달리 또는 부가적으로, 안지오스타틴 또는 엔도스타틴 유전자는 세포 사멸을 유도하는 것 없이 혈관신생을 특이적으로 차단하기 위해 본 발명의 프로모터와 조합하여 사용될 수 있다.

따라서, 또 다른 바람직한 실시형태에 따르면, 혈관신생은 자극 또는 차단될 수 있다. 이러한 유연성은 불충분한 혈액 공급을 가진 종양 덩어리의 감소, 심장의 죽상 경화증 부위의 재혈관화 또는 말초조직의 신-혈관화를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 본 발명의 용도의 다양성을 가능하게 한다. 관련있는 임상 계획은 당뇨병 환자의 사지에서의 혈액 공급을 증가시키기 위해 새로운 혈관을 생성하기 위한 본 발명에 따른 프로모터의 용도이다.

본 발명에 따른 핵산 구조체는 대상체(포유류, 바람직하게는 인간)에 그 자체로 투여되거나, 또는 적합한 담체 또는 부형제(excipient)와 혼합되는 약제학적 조성물로 투여될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 조성물"은 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학 성분을 갖는 본 명세서에 기재되어 있는 하나 이상의 활성 성분의 제제를 의미한다. 약제학적 조성물의 목적은 화합물을 유기체에 쉽게 투여하기 위함이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "활성 성분"은 생물학적 효과를 발휘할 수 있는 핵산 구조체를 의미한다.

이하, 혼용하여 사용될 수 있는 용어 "생리학적으로 허용가능한 담체" 및 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 유기체에 유의적인 자극을 유발하지 않고, 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다. 보조제(adjuvant)가 이 용어에 포함된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "부형제"는 활성 성분의 투여를 보다 용이하게 하기 위한 약제학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 의미한다. 그 예들은 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당류 및 전분류, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

약물의 제형화 및 투여 기술은 본 명세서에 참고 문헌으로서도 포함되어 있는 "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition"에서 찾아볼 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 기술 분야에 잘 알려진 공정, 예를 들면 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정(dragee)화, 연화제화, 유제화, 캡슐화, 포집 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은 활성 성분을 제제로 가공하는 것을 용이하게 하고, 약제학적으로 사용될 수 있는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형화는 선택된 투여 경로에 따라 다르다.

주사제의 경우, 약제학적 조성물의 활성 성분은 수용액, 바람직하게는 행크스 용액(Hank's solution)과 같은 생리학적으로 상용성이 있는 완충액에서 제형화될 수 있다. 점막(transmucosal) 투여를 위해, 침투시킬 장벽에 적절한 침투제(penetrant)가 제형을 위해 사용된다. 이러한 침투제는 본 기술 분야에 일반적으로 알려져 있다.

본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 내피세포 계통(lineage)의 진핵 세포에서 전사를 촉진 또는 강화하는 능력을 토대로 분리되었음이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드로 형질 변환된 포유류 세포는 본 발명의 또 다른 실시형태이다. 이러한 형질 전환된 세포의 다수 예가 후술하는 실시예에 제공되어 있다.

이하 제공되는 실시예들은 PPE-1 프로모터와 함께 3X 서열의 사용을 구체적으로 취급하고 있는 반면, 본 발명의 증강인자 서열은 진핵 세포 프로모터 서열과 함께 사용될 때 그 세포 특이적 효과를 발휘할 것으로 예상된다.

이러한 예상은 증강인자 요소가 종종 이동성, 즉 하나의 프로모터 서열로부터 관련은 없지만 여전히 활성을 유지하는 다른 프로모터 서열로 이동될 수 있음을 보여주는 종래의 발견을 기초로 한다. 예를 들면, D. Jones 등(Dev. Biol. (1995) 171(1): 60-72); N. S. Yew 등(Mol. Ther. (2001) 4: 75-820) 및 L. Wu. 등(Gene Ther. (2001) 8; 1416-26) 참조. 실제로, Bu 등의 초기 연구(J. Biol Chem. (1997) 272 (19): 32613-32622)는 본 발명과 관련된 증강인자 요소, 예를 들면 서열번호: 6을 포함하는 증강인자가 구성 프로모터, 예를 들면 SV-40 프로모터와 함께 사용될 수 있음을 강하게 암시하고 있다. 이와 같이, 본 발명의 증강인자 서열을 포함하도록 변형된 진핵 세포 프로모터를 함유하는 구조체, 이를 사용하는 방법 및 이를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 범위에 있다.

따라서, 본 발명에 따른 증강인자 요소의 최소 배열은 서열번호: 8에 기재되어 있는 분리된 폴리뉴클레오티드일 것으로 추측된다. 이 증강인자는 내피세포 특이적 프로모터(예를 들면 PPE-1; 서열번호: 1) 및 구성 프로모터, 예를 들면 CMV 및 SV-40로부터 유도되는 것과 같은 바이러스 프로모터를 포함하는 광범위한 프로모터와 함께 기능할 것으로 기대되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 증폭체는 광범위한 프로모터에 내피세포 특이적을 부여할 수 있다. 상기 증강인자 요소는 예를 들면 서열번호: 6에 기재되어 있는 서열의 하나 이상의 카피를 부가시킴으로써 커질 수 있다. 이러한 부가적인 서열은 서열번호: 8의 서열에 인접하게 또는 인접하지 않게 부가될 수 있다.

본 발명은 서열번호: 8에 기재되어 있는 서열의 하나 이상의 카피 및 내피세포에 특이적으로 관심대상 서열의 높은 발현 수준을 지시하는 프로모터를 포함하는 증강인자 요소에 의존하는 구조체를 사용하여 내피세포에서 관심대상 핵산 서열을 발현시키는 방법을 더 포함한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "대상체로부터 제거된 세포에 생체외 투여한 후, 이 세포를 대상체로 재도입"은 구체적으로 (Lyden 등. (2001) Nature Medicine 7: 1194-1201)에 기재되어 있는 바와 같이 줄기 세포의 사용을 포함한다.

아데노바이러스가 하기에 제공되는 실시예에 기재되어 있는 실험에서 사용되는 동안, 본 발명의 구조체는 본 기술분야의 당업자에 의해 다른 바이러스 전달 체계에 용이하게 적용될 수 있다.

본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아닌 하기 실시예를 실시할 때, 본 발명의 추가적인 목적, 이점 및 신규한 특징은 본 기술 분야의 당업자에게는 명백하게 될 것이다. 부가적으로, 상술한 바와 같은 또한 청구범위에 기재되어 있는 바와 같은 본 발명의 다양한 실시형태 및 요지는 하기 실시예에서 실험적으로 뒷받침된다.

실시예

상기 기재 내용과 함께 하기 실시예를 참조로 하여 비-한정 방식으로 본 발명을 설명한다.

일반적으로, 본 발명에서 사용되고 있는 명명 및 실험 절차는 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술들은 문헌에 상세히 설명되어 있다. 예를 들면 "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook 등., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel 등.,"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson 등., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren 등. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국 특허 제 4,666,828호; 4,683,202호; 4,801,531호; 5,192,659호 및 5,272,057에 기재되어 있는 방법들; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes 1-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites 등. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); 사용 가능한 면역 분석(immunoassay)이 특허 및 과학 논문에 광범위하게 기재되어 있다, 예를 들면, 미국 특허 제 3,791,932호; 3,839,153호; 3,850,752호; 3,850,578호; 3,853,987호; 3,867,517호; 3,879,262호; 3,901,654호; 3,935,074호; 3,984,533호; 3,996,345호; 4,034,074호; 4,098,876호; 4,879,219호; 5,011,771호 및 5, 281,521호; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal,B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak 등., "Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); 이들 모든 문헌들은 본 명세서 전반에 걸쳐 제공되어 있다. 다른 일반적인 참고 문헌들도 본 명세서 전반에 제공되어 있다. 이들 문헌에 나와 있는 절차들은 본 기술 분야에서 잘 공지되어 있는 것으로 믿어지며, 독자의 편의를 위해 제공된다. 이들 문헌에 포함되어 있는 모든 정보는 본 명세서에 포함된다.

구체적으로, 후술하는 실시예와 함께 실시되어 있는 실험들은 하기 방법 및 재료란을 토대로 수행되었다:

재료 및 방법

세포 배양

루이스 폐 암종 - (D122-96)(Prof. L. Eisenbach, The Weizmann Institute of Science Rehovot, 이스라엘 제공), 인간 배아 신장(293) 및 HeLa 세포를 10% 우태아 혈청(FCS), 50 U/ml 페니실린, 50 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 2 mM 글루타민을 포함하는 4.5gr/l DMEM에서 성장시켰다(Biological industries, Beit-Haemek, 이스라엘). 소 대동맥 내피세포 - BAEC(Prof. N. Savion, Goldshlager Institute, Sheba Medical Center, Tel-Hashomer, 이스라엘 제공), 정상 피부 섬유아세포 - NSF, HepG2 및 인간 배꼽 내피세포 - HUVEC-304(ATCC, USA)를 5% FCS, 50 U/ml 페니실린, 50㎍/ml 스트렙토마이신 및 2 mM 글루타민을 포함하는 l.Ogr/1 DMEM(Biological industries, Beit-Haemek, 이스라엘)에서 성장시켰다. BAEC 세포를 완전 섬유아세포 성장 인자(Sigma, St. Louis. MO.)로 함유시켰다. RINrlO46-38(RIN-38)을 5% FCS(Biological Industries, Beit-Haemek, 이스라엘), 50U 페니실린/ml, 50 ㎍ 스트렙토마이신/ml 및 2 mM 글루타민을 포함하는 199 Earle's 염(5.5mM 글루코오스) 배지에서 성장시켰다.

본 명세서에서 사용되는 "HepG2"은 ATCC-HB-8065을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 "HeLa"는 ATCC-CCL-2를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 "인간 기관지(Bronchial) 내피세포" 및 "B2B"는 ATCC-CRL-9609을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 "HUVEC" 및 "인간 배꼽 정맥 내피세포"는 ATCC-CRL-1730을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 "CHO" 및 "차이니스 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary)"는 ATCC-61을 의미한다.

저산소증 유도

세포 감염 또는 형질 도입 후 26시간 째, 세포를 0.5% 0₂, 5% CO₂, 잔량 N₂를 함유하는 기류에 의해 30분 동안 세척한 고립 챔버에서 배양하였다. 상기 고립 챔버를 습윤 5% C0₂, 37℃ 배양기에 위치시켰다.

세포 및 조직에서 루시페라아제 활성

시험관 내 및 생체 내 PPE-1 프로모터 활성을 정량적으로 분석하기 위해, 루 시페라아제 유전자 발현계 키트를 사용하였다(Promega Corp., Madison, WI). 세포 감염 또는 형질 도입 후 48시간째, 세포를 세척하고, 200㎕ 용균(lysis) 완충액을 15분 동안 첨가하였다. 세포 용균물(lysate)을 수거하여 4℃에서 15분 동안(14,000rpm) 원심분리하였다. 이어서, 상청액 10㎕를 50㎕ 루시페라아제 분석 완충액에 첨가하였다. 발광기(Luminometer)에서 20초에 걸쳐 활성을 측정하였다.

고형 조직에서의 루시페라아제 활성을 분석하기 위해, 20mg 샘플을 절개하여 균질 용액 1ml에서 균질화하고, 4℃에서 15분(14,000rpm)동안 원심분리하고, 상술한 바와 같이 루시페라아제 활성을 위해 상청액 10ml를 분석하였다. 그 결과를 1ug 단백질 당 루시페라아제 광 유닛으로 표시하였다. 우혈청 알부민(BSA)을 표준으로 하여 브래드포드 분석법(Bradford assay)을 이용하여 단백질을 측정하였다.

시험관 내 및 생체 내 GFP 활성

시험관 내 GFP 발현을 시험하기 위해, 세포를 PBS로 2번 세척하였고, PBS 내 새로 제조한 4% 파라포름알데히드로 30분 동안 고정하였다. 고정 후, 형광 현미경으로 검사하였다.

생체 내 전달된 유전자의 세포 분포를 시험하기 위해, 조직을 0.1M 포스페이트 완충액 내 새로 제조한 4% 파라포름알데히드에서 6시간 동안 4℃에서 고정하고, 밤새 30% 수크로오스에서 침지시킨 다음, OCT 화합물(Sakura, USA)에서 동결시켰다. 상기 조직 블록을 저온 유지 장치(cryostat)에 의해 10㎛ 두께로 잘라내고, 형광 현미경 하에서 직접 관찰하였다(FITC filter).

증식 및 휴지 세포

증식 및 휴지 상태의 BAEC에서 PPE-1 프로모터 활성을 비교하기 위해, 세포를 다음과 같은 2군으로 나누었다: 1. 증식 세포 - 10% FCS 배지에서 성장 및 감염. 2. 휴지 세포 - 형질 도입 전 72시간 내 개시된 무혈청 배지에서 성장 및 감염.

모든 세포를 습윤 배양기 5% CO₂, 37℃에서 성장시켰다.

재조합 복제 결핍 아데노바이러스의 제조

몇몇 재조합 복제 결핍 아데노바이러스(5형)를 구성하였다. 루시페라아제 유전자(pGL2-basic GenBank 등록번호 X65323 유래) 및 SV40 polyA 부위(pGL2-basic GenBank 등록번호 X65323 유래) 상류에 위치한 쥐 프리프로엔도셀린-1(PPE-1) 프로모터(서열번호: 1)를 포함하는 발현 카세트를 pPAC.plpA(프로모터가 없는 구조체)의 BamHI 제한 부위로 결찰하였다. GFP 유전자(pEGFP, GenBank 등록번호 AAB02572 유래)를 NotI 제한 부위에서 PPE-1 프로모터에 결찰하였다. Ad5PPE-lLuc 또는 Ad5PPE-lGFP라 불리는 복제 결핍 재조합 아데노바이러스를 Becker, T. C. 등이 기재한 바와 같이 아데노바이러스 플라스미드 pJM17로 pPACPPE-lLuc 또는 Ad5PPE-lGFP를 공-세포 감염(co-transfection)시킴으로써 제조하고(Methods Cell biol. 43, Roth M. (ed). New York. Academic Press, 1994, pp. 161-189), 재조합 비리온(virion)을 수거하였다.

바이러스를 대량 생산하였다. 바이러스 군체(stock)를 10⁹-10¹² 플라크-형성 유닛/ml(pfu/ml)의 농도로 4℃에서 보관하였다. 사이토갈로바이러스(CMV) 즉시 초 기 프로모터(immediate early promoter)(GenBank 등록번호 U47119)를 함유하는 바이러스 Ad5CMV-Luc(R. Gerard from UTSw Dallas, Texas 제공) 및 AdSCMV-GFP(Quantum biotechnologies, Carlsbad, 캐나다)를 PPE-1 바이러스 벡터에 대해 기재한 바와 같이 대량 생산하였고, 비-조직 특이적 대조군으로 사용하였다.

PPE 프로모터의 변형

Bu 등(J. Biol Chem. (1997) 272 (19): 32613-32622)에 의해 개발된 양성 전사 요소의 3개의 카피를 43 염기쌍 내생(endogenous) 양성 요소(-364 내지 -320 bp)의 하류(-286bp)에 위치한 the NheI 제한 효소 부위에 삽입함으로써 변형 쥐 PPE-1 프로모터를 개발하였다.

본 명세서에서 "3X"로 명명된 증강인자 단편은 쥐 PPE-1 프로모터에 존재하는 내생 서열 요소(서열번호: 1의 뉴클레오티드 동등물 407-452)의 3중 카피(triplicate copy)이다. 혈관 내피세포 내 PPE-1 프로모터 활성의 유도는 요소의 존재에 따라 다르다는 것이 이미 알려져 왔다(Bu 등 (J. Biol Chem. (1997) 272 (19): 32613-32622)). 3X 단편을 길이가 96 염기쌍인 2개의 상보적 단일 가닥의 DNA 가닥을 사용하여 합성하였다(BioTechnology industries; Nes Tziona, 이스라엘), (서열번호: 2 및 3). 상기 2개의 단일 가닥의 DNA 단편을 어닐링하고, Klenow 단편(NEB)을 사용하여 충전시키고; 얻어진 2중 가닥의 DNA는 145 염기쌍 길이를 가지고, Nhe-1 제한 효소(서열번호: 4)를 포함하였다.

3X 단편을 T4 리가아제(Ligase)를 사용하여 내생 Nhe-1의 쥐 PPE-1 프로모터 하류로 결찰시켰다. 얻어진 구조체를 DH5α 항체 반응 세포(competent)에서 전개시 키고, maxi-prep Qiagene 키트를 사용하여 플라스미드를 대량 생산하였다.

부가적 프로모터

야생형 PPE-1 프로모터

1.4kb의 쥐 프리프로엔도셀린-1(PPE-1) 프로모터를 함유하는 PPE-1-루시페라아제 카세트, SV40 polyA 신호(GenBank 등록번호 X 65323) 부위를 가진 루시페라아제 유전자 및 쥐 ET-1 유전자의 제1 인트론(intron)을 Harats 등(J. Clin. Inv. (1995) 95: 1335-1344)에 의해 사용된 pEL8 플라스미드(8848bp)로부터 유도하였다. 상기 PPE-1-루시페라아제 카세트를 BamHI 제한 효소를 사용하여 pEL8 플라스미드로부터 추출하고, 추출 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 1% 아가로오스 겔로부터 DNA 단편을 추출하였다.

프로모터-없는 pPAC.plpA 플라스미드

아데노바이러스형 5의 서열을 함유하는 무-프로모터 pPAC.plpA 플라스미드(7594bp)를 pPACCMV.pLpA(8800bp)으로부터 유도하였다. CMV 프로모터, 다중 클로닝 부위 및 SV40 폴리아데닐레이션 부위(polyadenylation site)(1206 bp)를 NotI 제한 효소에 의해 제거하였다. 단편화된 DNA를 1% 아가로오스 겔로부터 제거하였다. 선형 플라스미드(7594 bp)를 Klenow 단편에 의해 채우고, BamHI 링커(linker)를 급속 DNA 결찰 키트에 의해 결합성(cohesive) 말단부위에 결찰시켰다. BamH1 제한 효소로 pPAC.plpA를 증폭시키기 위해, 상기 선형 플라스미드를 T4 DNA 리가아제에 의해 재-결찰하고, DH5α 항체 반응 세포로 형질 변형하였다. 플라스미드를 대량생산하고, maxi prep DNA 정제 키트를 사용하여 정제하였다.

pPACPPE-l루시페라아제 플라스미드

PPE-1-루시페라아제 카세트를 T4 DNA ligase를 사용하여 pPAC.plpA 플라스미드의 BamHI 제한 부위에 삽입함으로써 pPACPPE-l루시페라아제 플라스미드를 구성하였다. 이후, 플라스미드를 DH5α 항체 반응 세포를 변형시키기 위해 사용하였다. 플라스미드(12843bp)를 대량생산하였고, maxi prep DNA 정제 키트를 사용하여 정제하였다.

pPACPPE-IGFP 플라스미드

pPACPPE-lGFP 플라스미드를 T4 DNA 리가아제에 의해 PPE-1 프로모터 하류의 GFP 유전자(pEGFP로부터 유래, GenBank 등록번호 AAB02572)를 NotI 제한 부위로 서브-클로닝함으로써 플라스미드를 구성하였다.

이후, 플라스미드를 DH5α 항체 반응 세포를 변형시키기 위해 사용하였다. 플라스미드(11,801bp)를 대량생산하였고, maxi prep DNA 정제 키트를 사용하여 정제하였다.

pACPPE-13X 루시페라아제 및 pACPPE-13X GFP 플라스미드

Luc 또는 GFP를 함유하는 pEL8-3X(도 26(B))로부터 BamHI 제한 효소에 의해 소화되는 PPE-1-3XLuc 또는 PPE-1-3XGFP 카세트를 pPAC.plpA 플라스미드의 BamHI 제한 효소로 삽입함으로써 pPACPPE-1-3X루시페라아제 및 pPACPPE-1-3XGFP를 구성하였다. pEL8-3X는 BamHI 및 2개의 NheI 부위 사이에 위치한 3중 내피세포 특이적 증강인자 3X(서열번호: 7에 기재되어 있음)를 함유하는 NotI 사이에 위치한 변형된 쥐 PPE-1 프로모터(1.55kb)(적색)을 함유한다. 프로모터, 루시페라아제 또는 GFP 유전자, SV40 polyA 부위 및 엔도셀린-1 유전자의 제1 인트론, PPE-1 변형 프로모터 카세트로 명명된 이들 모두를 소화시키고, 재료 및 방법란에 기재되어 있는 바와 같이 BamHI 제한 효소로 추출하였다. 플라스미드(12843bp)를 대량생산하고, maxi prep DNA 정제 키트로 정제하였다.

시험관 내 실험, DNA 형질 도입

형질 도입 24시간 전에 16mm 디쉬에 세포를 도말(plating)하였다. BAEC(소 대동맥 내피세포), HUVEC(인간 배꼽 정맥 내피세포), LLC(루이스 폐 암종) 및 RIN(래트 인슐리노마), HepG2, HeLa 및 정상 피부 섬유아세포(NSF) 세포의 DNA 형질 도입을 성장 배지 총 부피 500㎕에서 4시간 동안 Ad5PPE-lLuc의 1, 5 및 10 감염 다중성(moi)으로 각 세포주를 배양하고, 48시간 동안 총 부피 2ml에서 상기 성장 배지를 배양함으로써 수행하였다. Ad5CMVLuc를 비-조직 특이적 대조군으로서 사용하였다.

동물

모든 동물 절차는 Sheba Medical Center, Tel-Hashomer의 "Animal Care and Use Committee"에 의해 승인되었다.

상이한 마우스 균주를 사용하였다:

(i) 웅성, 3월령, 야생형 C57BL/6 마우스(Harlan farms, 예루살렘, 이스라엘).

(ii) 웅성, 3월령 BALB/C 마우스(Harlan farms, 예루살렘, 이스라엘).

(iii) 웅성 및 자성 6월령 C57BL/6xSJ129 마우스의 ApoE 유전자 결핍 마우스 혼성(Plump AS. 등. Cell (1991) 71: 343-353).

(iv) 웅성 및 자성 3월령 쥐 PPE-1 프로모터(5.9Kb)의 제어하에 루시페라아제 유전자의 과발현, Harats 등(J. Clin. Inv. (1995) 95: 1335-1344)에 의해 제조

모든 마우스를 Lipids and Atherosclerosis Research Institute에서 성장시켰다.

정상 마우스에서 조직 유전자 발현

효율성 및 조직 특이적을 분석하기 위해, 10¹⁰pfu/ml의 Ad5PPElLuc 또는 Ad5CMVLuc(비-조직-특이적 대조군)를 100㎕의 생리 식염수에 현탁시키고, 상술한 바와 같이 마우스의 꼬리 정맥에 주입하였다. 주입 후 1, 5, 14, 30 및 90일에 루시페라아제 활성을 분석하였다. 발현된 리포터 유전자의 세포 분포를 편재화하기 위해, Ad5PPE-lGFP 또는 Ad5CMVGFP(100㎕의 생리 식염수 중의 10¹⁰ pfu/ml)를 정상 3월령 웅성 C57BL/6 마우스의 꼬리 정맥에 주입하였다. 주입 후 5일에 GFP 발현을 검출하였다. 모든 마우스는 건강한 것처럼 보였고, 간 또는 다른 조직에서 주목할만한 독성 또는 염증은 없었다.

조직에서 GFP 활성

생체 내 전달된 유전자의 세포 분포를 시험하기 위해, 주입된 마우스로부터 조직 샘플을 0.1M 포스페이트 완충액 내 새로 제조한 4% 파라포름알데히드 중에서 4℃에서 6시간 동안 고정하고, 밤새 4℃의 30% 수크로오스에 침지시킨 다음, OCT 화합물(Sakura, California, USA)에서 동결시켰다. 상기 조직 블록을 10㎛ 두께로 잘라내고, 형광 현미경 하에서 직접 관찰하였다(FITC filter).

종양 이식

루이스 폐 암종 세포(LLC)를 트립신/EDTA로 수거하고, PBS로 3번 세척한 다음, 0.1% 트립판 블루(Biological industries, Beit-Haemek, 이스라엘)로 계수하여 이들의 생존율(viability)을 분석하였다. 마우스의 종양 혈관신생에서 PPE-1 프로모터 활성의 활성 수분을 시험하기 위해, 2개의 상이한 종양 모델을 사용하였다.

초기 종양 모델에서, 세포(100㎕ 생리 식염수 중의 lx10⁶ 세포/ml)를 마우스 배후에 피하 주사하였다(n=17). 주입 후 21일째에, Ad5PPE-1, Ad5PPE-lGFP, AdSCMV 또는 Ad5CMVGFP(10^l0 pfu/ml)을 종양 조직(IT)에 주입 또는 정맥내 주입하고, 이들의 활성을 상술한 바와 같이 검출하였다.

전이성 종양 모델에서, 세포(50㎕ 생리 식염수 중 5x10⁵ 세포/ml)를 마우스 발바닥에 주입하였다(n=12). 종양 조직이 직경 0.7mm에 이르면, 발바닥(초기 종양을 가진)을 마취 및 멸균 조건하에서 절개하였다. 수술 후 14일째에, 바이러스(Ad5PPE-1, Ad5PPE-lGFP, Ad5CMVLuc 또는 Ad5CMVGFP)를 마우스 꼬리 정맥에 주입하였다.

2개의 종양 실험 모델에서, 마우스를 바이러스 주입 후 5일에 희생시키고, 이들의 조직을 절개하여 루시페라아제 또는 GFP 활성에 대해 시험하였다.

상처 치유 모델

웅성 3월령 C57BL/6 마우스를 소듐 펜토바르비탈(6mg/kg)을 피하 주사하여 마취시켰다. 이들의 등털을 깎고, 5cm 직선형으로 절개하였다. 4/0 살균 실크 실로 즉시 절개 부위를 봉합하였다. 상처 치유 중 혈관신생 과정을 H & E 및 항 폰-빌리브란트(von-Willibrand) 항체 면역 조직 화학 염색법(immunohistochemistry staining)으로 2일 마다 검사하였다.

절개 후 10일째에, 10¹⁰ pfu/ml의 Ad5PPE-lLuc 또는 Ad5CMVLuc을 꼬리 정맥에 전신 주입하였다. 주입 후 5일째에, 마우스를 희생시키고, 절개 부위의 피부 및 대조군으로서 정상 반대편 부위에서 상술한 바와 같이 루시페라아제 활성을 분석하였다.

조직학적 검사

종양 및 전이된 조직에서 혈관신생의 범위를 평가하기 위해, 조직을 5㎛ 절편으로 자르고, 헤마톡실린 및 에오신(H & E)으로 염색하였다. 항 CD31(래트 항 마우스 CD31 단일 클론성 Ab. Pharminogen, NJ, USA) 항체를 종양 모델에서의 신혈관조직화 분석을 위해 사용하였다.

통계 분석

통계적으로 유의적인 차이를 위해 그룹 간 분석을 t-test ANOVA 또는 Mann-Whitney Rank test를 이용하여 수행하였다. 그 데이터를 평균 + 표준 편차로 나타낸다.

실시예 1

시험관 내 3X-PPE-l 플라스미드 활성 분석

PPE-1-3X의 활성을 분석하기 위하여, PPE-1-3X 프로모터 플라스미드 및 비변형된 PPE-1 프로모터 플라스미드에서 리포터 유전자 발현을 비교하였다. PPE-1-3X 단편 또는 비변형 PPE-1 단편을 함유하는 리포터 유전자 플라스미드 및 리포터 유전자 루시페라아제를 내피세포주 및 비-내피세포주로 세포 감염시키고, PPE-1 프로모터(상기 재료 및 방법란 참조)를 발현하는 기관지 내피세포주(B2B)에 세포 감염시켰다. PPE-1 프로모터 대비 비-내피세포주에서의 발현을 감소시키는 3X 요소의 능력의 지표를 제공하기 위해 B2B 세포주를 선택하였다. 리포펙타민(Promega Corp., Madison, WI)을 사용하여 세포 감염시켰다. 허용되는 분자 생물학 실험에 따라 각 경우에 있어 세포 감염 효율의 지표로서, βgal-네오 플라스미드를 사용하였다.

세포 감염 후 48시간째에, 세포를 용균 완충액(Promega Corp., Madison, WI)을 사용하여 수거하고, 루시페라아제 활성을 발광기(TD-20e - Turner Designs, Sunnyvale, 캘리포니아)에 의해 분석하였다. 동시에, 상이한 형질 변형 효율의 표준화를 위해 βgal 활성을 분석하였다. 그 결과들이 도 1 및 표 1에 요약되어 있다. PPE-3X의 제어하 루시페라아제 활성은 비변형 PPE-1의 제어하 루시페라아제 활성에 비해 15-20배 높다. 비-내피세포주에서, PPE-1 및 PPE-1-3X를 사용하여 최소 발현을 검출하였다. 이는 PPE-3X가 생체 내 내피세포로 특이적으로 유전자의 전달을 위한 유망한 후보임을 증명한다.

플라스미드	루시페라아제 활성: 내피세포주		비내피세포주
	HUVAC	BAEC	RIN
PPE-1	135.12	1121.3	0.73
PPE-1-3X	768	18331.7	0.32

실시예 2

시험관 내 Ad5PPE-1/루시페라아제의 활성 및 특이성

PPE-1/루시페라아제, PPE-1-3X/루시페라아제, PPE-1/GFP 및 PPE-13X/GFP를 또한 Ad5 플라스미드에 결찰시켜 Ad5PPE-1/Luc 및 Ad5PPE-1-3X/luc, Ad5PPE-1/GFP 및 Ad5PPE-1-3X/GFP를 제조하였다(Varda-Bloom 등., (2001) Gene therapy 8 : 819-827). 이들 구조체를 후술하는 바와 같이 별도로 분석하였다.

Ad5PPE-1/luc의 활성을 시험하기 위해, B2B(인간 기관지 내피세포), BAEC(소 대동맥 내피세포) 및 HUVEC(인간 배꼽 동맥 내피세포)를 세포 감염시켰다. 이들 3개의 세포주는 내피세포 유전자를 발현하고, 내피세포에서 시험된 구조체의 발현 수준을 나타내기 위해 선택된다. 내피세포를 발현하지 않는 RIN(래트 인슐리노마) 세포주를 음성 대조군으로서 사용하였고, 동일 구조체로 세포 감염시켰다. Ad5CMVLuc(CMV 프로모터의 제어하 루시페라아제)를 모든 세포주에서 비-내피세포 특이적 대조군으로서 사용하였다.

도 2는 CMV 프로모터 보다는 PPE-1 프로모터를 가진 내피세포 BAEC 및 HUVEC 세포주에서 보다 높은 루시페라아제 발현이 달성되고 있음을 명확히 보여주고 있다. 내피세포 원점을 갖지 않는 RIN 세포에서는, PPE-1 프로모터에 비해 CMV 프로모터가 보다 높은 루시페라아제 활성을 나타내었다. 이들 결과는 비변형 PPE-1 프로모터의 내피세포 특이성을 증명하고 있다.

실시예 3

Ad5PPE-3XLuc 및 Ad5PPE-3XGFP의 활성 및 특이성

3X 요소의 특이성 및 발현 수준에 대한 영향을 확인하기 위해, Ad5PPE-3X/루시페라아제 및 Ad5PPE-3X/GFP 구조체를 사용하여 상기 실시예 2에 기재된 세포주들을 세포 감염시켰다. 실시예 2에서와 같이, Ad5CMVLuc를 비-내피세포-특이적 대조군으로서 사용하였다. CMV 프로모터에 비해 PPE-3X 프로모터의 제어하에서 보다 높은 루시페라아제 발현이 BAEC 및 HUVEC 세포주에서 검출되었다.

도 3(A)는 BAEC 세포주에서 Ad5PPE-1-3X의 제어하 GFP 발현을 나타내는 현미경 사진이다. 도 3(B)는 BAEC 세포주에서 Ad5CMV의 GFP 발현을 나타내는 현미경 사진이다. 이들 도면에 명백히 나타낸 바와 같이, PPE-1-3X 프로모터는 내피세포에서 보다 활성이다. 이러한 결과는 3X 요소가 PPE-1 프로모터의 내피세포 특이성으로부터 벗어나 있지 않음을 의미한다. 세포 배양에서 PPE-1 및 PPE-1-3X 프로모터의 상대 활성을 하기 실시예 6에 제공되어 있다.

실시예 4

p55 유전자의 프로-세포 사멸 활성의 시험관 내 분석

P55(TNFR1, GenBank 등록번호 M75866)를 PACPPE3X(PPE-1-3X 프로모터 함유) 및 PACCMV로 서브 클로닝한 후, 이들 플라스미드 및 GFP(pEGFP-Cl 벡터; CLONTECH, Palo Alto, CA)의 공-세포 감염을 상술하는 바와 같이 수행하였다. 요약하면, 유전자를 T4 DNA 리가아제에 의해 PPE-1 프로모터(루시페라아제 유전자 대신에) 하류에 NotI 제한 부위로 서브 클로닝하고, DH5α항체 반응 세포로 형질 변환하였다. 세포 감염 후 24시간째에, 작으면서 둥근 세포 사멸 세포를 정상세포로부터 육안으로 식별할 수 있었다. 이러한 육안 평가를 확인해주는, 프로-세포 사멸 플라스미드로 세포 감염시킨 세포의 전자 현미경 관찰 결과, 전형적인 세포 사멸의 외관을 나타내었다.

PPE-1-3X 프로모터의 제어하에서, 세포 사멸이 내피세포에서만 p55에 의해 유도된 반면(도 4), CMV 프로모터는 어떠한 세포 특이적 활성을 나타내지 못하였다. PPE-1-3X의 제어하에서 루시페라아제는 모든 시험된 세포주에서 세포 사멸을 유도하지 못하였다. 이들 결과는 PPE-1-3X 프로모터를 사용함으로써 내피세포에서 특이적으로 세포 사멸을 유도할 수 있음을 보여주고 있다.

실시예 5

저산소증 반응성 요소(HRE)는 저산소 상태에 민감한 내피세포에서 표적 유전자 발현을 강화시킬 수 있다.

저산소증은 혈관의 색조 및 구조에 있어 중요한 조절 인자이다. 또한, 저산소증은 허혈성 심장 질환 및 암의 혈관신생의 잠재적 자극 인자인 것으로 밝혀졌다(Semenza, G. L. 등. (2000) Adv Exp Med Biol.; 475: 123-30; Williams, K. J. (2001) Breast Cancer Res. 2001: 3;328-31 and Shimo, T. (2001) Cancer Lett. 174; 57-64). 또한, 저산소증은 적혈구 조혈 인자(erythropoietin), VEGF, 글리콜 분해 효소 및 ET-1을 포함하는 다수의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 보고되어 왔다. 이들 유전자는 저산소증 유도 인자-1(HIF-1)로 명명된 유도성 전사 복합체인 공동 산소-감지 경로(common oxygen-sensing pathway)에 의해 제어된다. 상기 HIF-1 복합체는 표적 유전자의 cis 활성 저산소증 반응성 요소(HRE)를 결합함으로써 저산소증에 전사성 반응을 매개한다. 상기 HRE는 VEGF, 산화 질소 신타아제-2(Nitric Oxide Syntase-2), 적혈구 조혈 인자 및 엔토셀린-1, ET-1을 포함하는 기타 프로모터를 포함하는 저산소증에 반응하는 극소수의 유전자의 프로모터에 위치한 보존 서열(conserved sequence)이다. ET-1 프로모터는 전사 개시 부위의 상류 위치 -118bp에 있으며, 7개의 염기쌍을 함유하며, GATA-2 및 API 부위 5'GCACGTT 3'- 50 염기쌍(서열번호: 5) 사이에 위치하는 역 저산소증 반응 요소를 포함한다.

프리프로엔도셀린-1(PPE-1) 프로모터는 종양 또는 허혈성 조직의 저산소 상태 미세 환경에서 그 발현을 증가시키는 잠재성이 있는 저산소증 반응성 요소(HRE)를 함유함으로써 "종양 조직 특이적" 및/또는 "허혈성 조직 특이적"이도록 한다. 상기 HRE의 실제 기능을 평가하기 위해, 아데노바이러스 벡터에 의해 전달된 루시페라아제 또는 GFP 리포터 유전자와 함께 PPE-1 프로모터 및 PPE-1-3X 프로모터의 분석을 수행하였다.

PPE-1 프로모터 또는 PPE-1-3X 프로모터의 제어하에서 루시페라아제 활성을 정상 산소 상태 및 저산소 상태(16시간 동안 0.5% 0₂) 하의 BAEC 세포에서 비교하였 다. PPE-1 프로모터 제어하에서의 루시페라아제 활성은 저산소 상태에 노출될 때에 비해 5배 높았다(도 5 및 도 6). 또한, PPE-1-3X 프로모터의 제어하에서 루시페라아제 활성은 저산소 상태하에서 보다 2.5배 높았다. 요약하면, 3X 요소를 PPE-1 프로모터에 도입하면, PPE-1-3X 유전자로 정상 산소 상태 발현 수준이 비변형 PPE-1 프로모터로 관찰된 수준보다 높았지만, 저산소 상태에 반응하는 하류 유전자의 발현 수준을 증가시킬 수 있다.

실시예 6

내피세포 주에서 PPE-1-3X 및 PPE-1 프로모터 활성의 다른 평가

도 7은 pPPE-1/루시페라아제 및 pPPE-1-3X/루시페라아제를 사용하여 수행한 B2B, HUVEC 및 BAEC 세포 감염 실험의 결과를 요약한 것이다. B2B, HUVEC 및 BAEC에서 PPE-1 프로모터 하에서 보다도 PPE-1-3X 프로모터의 제어하에서 보다 높은 루시페라아제 발현(30, 8.5 및 1.5배)이 각각 관찰되었다. 이러한 결과는 상술한 바와 같은 결과를 확인시켜주는 것이며, PPE-1-3X가 내피세포에 특이적으로 고수준의 발현을 지시하도록 잘 작용됨을 설정하도록 한다. 미래의 생체 내 전달과 관련하여, PPE-1-3X 구조체로 달성되는 보다 높은 발현 수준은 보다 적은 양의 DNA 투여로 번역한다. 환언하면, 이는 특이성을 더욱 증가시킬 것이다.

실시예 7

Ad5PPE-ILuc의 생체 내 효율, 특이성 및 안정성

실시예 2 내지 6에서 관찰된 발현의 내피세포 특이성이 세포 배양의 결과물이 아님을 확인하기 위해, Ad5PPE-1/루시페라아제 구조체를 상술한 "정상 마우스에서 조직 유전자 발현"에서 기재한 바와 같이 C57BL/6 마우스에 주입하였다. 시험관 내 연구에서와 같이, Ad5CMV/루시페라아제를 음성 대조군으로서 사용하였다.

아데노바이러스 벡터를 주입한 후, 혈관화된 조직 및 비-혈관화된 조직에서루시페라아제의 특이적 활성 및 안정성을 분석하였다. 그 결과들이 도 8(간에서의 발현에 대한 루시페라아제 발현) 및 표 2(체내 전체 발현율로서의 루시페라아제 발현)에 요약되어 있다. 기대한 대로, Ad5CMV/루시페라아제 처리된 마우스에서, 대부분의 루시페라아제 활성(전체 체내 발현의 80%를 넘음)이 간에서 발견되었다. PPE-1 프로모터에 의해 제어된 루시페라아제 활성은 간에서 보다 낮았다(전체 체내 발현의 37-54%). PPE-1 유도 발현은 Ad5CMV/루시페라아제 처리된 마우스(전체 체내 발현의 1.8%까지; 표 2)에 비해 대동맥(주입 후 5일 및 14일째에 전체 체내 발현의 각각 23-33%)에서 훨씬 높았다. 이러한 결과는 세포 배양에서 관찰되는 내피세포 특이성을 확인하여 준다. 간이 매우 혈관화된 기관임을 명심해야 한다. 따라서, 후술하는 바와 같이 조직내 세포 발현의 검사를 수행하였다.

PPE-1 및 CMV 기재 구조체의 주입 후 5일 및 14일째 기관에서의 루시페라아제 발현

주입 후 일수	5		14
	광 유닛/㎍ 단백질		광 유닛/㎍ 단백질
조직	PPE-1	CMV	PPE-1	CMV
대동맥	13.0±2.9 (32.7%)	1.4±0.5 (0.56%)	0.6±2.4 (12.6%)	1.3±0.3 (1.1%)
심장	0.2±0.1 (0.55)	1±0.6 (0.4%)	1.5±0.3 (1.7%)	1.8±0.6 (1.6%)
간	22.7±4.5 (57%)	219±111.5 (88.6%)	34.9±7.8 (41.6%)	52.8±10.6 (46.8%)
폐	0.2±0.1 (0.5%)	2.3±1.0 (0.9%)	3.6±0.8 (4.3%)	2.0±0.9 (1.8%)
근육	0.3±0.1 (0.7%)	0.8±0.2 (0.3%)	1.2±0.3 (1.4%)	1.5±0.5 (1.3%)
비장	1.3±0.8 (3.2%)	1.6±0.9 (0.6%)	2.0±0.4 (2.4%)	2.3±0.9 (2.0%)
체장	2±0.6 (5.0%)	20.1±6.8 (8.1%)	26.4±5.9 (31.5%)	45.2±24.5 (40.1%)
신장	0.1±0 (0.25%)	0.9±0.6 (0.4%)	0.6±0.1 (0.71%))	0.8±0.3 (0.7%)

도 30(A) 및 도 30(B)는 110마리의 주입된 마우스의 대동맥(A) 및 간(B)에서 절대 루시페라아제 활성(광 유닛/㎍ 단백질)을 나타내고 있다. 주입 후 1일(n=13), 5일(n=34), 14일(n=32), 30일(n=20) 및 90일(n=11)째에 루시페라아제 활성을 측정하였다. 대동맥에서의 이러한 결과는 내피세포에서 프로모터(PPE-1 또는 CMV)가 가장 활성적인 반면, 간에서의 활성은 간세포에서 가장 활성적임을 나타내고 있다.

실시예 8

생체 내 Ad5PPE-1의 효율, 특이성 및 안정성의 분석 - BALB/C 마우스에서

관찰된 결과가 특정 동물 균주의 결과물이 아님을 증명하기 위하여, 실시예 7의 실험을 12주령의 BALB/C 마우스(각 군 당 n=10)에서 반복하였다.

아데노바이러스 벡터를 이용한 절대적인 결과가 C57BL/6 마우스에서 보다 BALB/C 마우스에서 더 낮았기 때문에, 루시페라아제 발현은 모든 조직에서 전체 루시페라아제 활성의 퍼센트로서 표시한다.

주입 후 5일째에 가장 높은 상대 루시페라아제 발현이 Ad5PPE-1의 비장에서 관찰되었고(90.9%), Ad5CMV 주입된 마우스의 간에서 관찰되었다(86.2%). 주입 후 5일째에서의 활성(1.75%)에 비해 주입 후 14일째에 Ad5PPE-1 주입된 마우스의 대동맥에서 상대 루시페라아제 활성에서 유의적인 증가(32.9%)가 관찰되었다(도 31(A) 및 도 31(B); Ad5PPE-lLuc-밝은 막대; Ad5CMVLuc-짙은 막대).

이들 결과는 마우스 균주에 관계없이 PPE-1 프로모터의 조직 특이성은 간세포에 의해 주입된 DNA의 우선적인 흡수에도 불구하고 간세포 발현을 효과적으로 제거할 정도로 충분히 강력함을 확인시켜 주고 있다.

실시예 9

생체 내 Ad5PPE-1에 의해 전달되는 유전자의 세포 편재

생체 내 PPE-1에 의해 발현되는 유전자의 세포 발현 부위를 확인하기 위하여, 아데노바이러스 벡터 Ad5PPE-1-GFP에 의해 전달되는 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)을 사용하였다. Ad5CMVGFP(Quantum, 캐나다)를 비-내피세포-특이적 음성 대조군으로서 사용하였다. 정맥 주사 후 5일째에, 마우스를 희생시키고, 그 조직을 형광 현미경법으로 분석하였다.

Ad5CMVGFP 벡터가 주입된 마우스에서, 대부분의 발현은 간세포에서 검출되었고, 간의 내피세포에서는 어떠한 발현도 검출되지 않았다(도 9(A)). 확실히 대조적으로, Ad5PPE-1-GFP 주입된 마우스(도 9(B))는 간세포에서 어떠한 발현도 나타내지 않았지만, 간의 혈관에 있는 내피세포에서 유의적인 발현을 나타내었다. 거의 모든 PPE-1 유도 발현이 내피세포에서 검출되는 반면, 어떠한 CMV 유도 발현도 내피세포에서 검출되지 않은 다른 조직에서도 유사한 결과가 얻어졌다. 이들 결과는 내피세포 특이성이 내피세포 및 비-내피세포를 함유하는 조직에서도 보존됨을 나타낸다. 이러한 발견은 성장 중의 종양에서 혈관신생을 방지하기 위한 중요한 의미를 갖는다.

실시예 10

시험관 내 Ad5PPE-1-3X Luc 및 Ad5PPE-1-3X GFP의 효율성 및 내피세포 특이성의 분석

세포에서 리포터 유전자 루시페라아제 및 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현을 유도할 때의 Ad5PPE-1 및 Ad5PPE-1-3X의 상대적인 효능을 알아보기 위해, 내피세포에서의 특이적 활성을 상술한 바와 같이 세포주를 사용하여 시험관 내 시험하였다. Ad5CMVLuc 및 Ad5CMVGFP를 비-조직 특이적 대조군으로서 사용하였다. 3X 서열을 부가함으로써 유발되는 발현 수준에서의 상대적인 변화를 확인하기 위해 Ad5PPE-lLuc 및 Ad5PPE-lGFP를 사용하였다.

도 10 및 도 11에 요약되어 있는 결과는, 비-내피세포 - 래트 인슐리노마 - RIN, HeLA, HePG2 및 정상 피부 섬유아세포(NSF)에서 활성에 비해 PPE-1-3X 프로모터의 제어하에서 루시페라아제 활성은 EC 세포주(소 대동맥 내피세포-BAEC)에서 5-10배 높았음을 의미한다.

도 10은 Ad5PPE-lLuc, Ad5PPE-1-3XLuc 및 Ad5CMVLuc에 의해 형질 도입된 B2B, BAEC 및 RIN 세포에서 광 유닛/㎍ 단백질로서 루시페라아제 활성을 나타내고 있다. 가장 높은 루시페라아제 발현이 Ad5CMVLuc에 의해 형질 도입된 RIN 세포에서 관찰되었지만, 이 구조체는 BAEC 및 B2B 세포에서 발현이 약하였다. 다음으로 높은 루시페라아제 발현 수준은 Ad5PPE-1-3XLuc에 의해 형질 도입된 BAEC 세포에서 관찰되었다. Ad5PPE-lLuc는 BAEC 세포에서 보다 낮은 수준으로 발현되었다. B2B 세포주에서, Ad5PPE-lLuc 및 Ad5PPE-1-3XLuc이 거의 동일한 수준에서 발현되었다.

전체적으로, PPE-1-3X 프로모터의 제어하 내피세포주에서 루시페라아제 활성은 동일한 세포 감염 조건에서(moi=10) PPE-1 프로모터의 제어하에서 보다는 23배 높았고, CMV의 제어하에서 보다는 23-47배 높았다. 비-내피 RIN 세포에서 루시페라아제 발현은 CMV 프로모터의 제어하에서 보다 3000배 높았다는 사실과 반대이다(도 10).

PPE-1 및 PPE-1-3X가 다른 비-내피세포 계통에서 불활성인지 확인하기 위해서, HeLA, HepG2, NSF 세포주를 형질 도입하였다. BAEC은 내피세포 대조군으로서 사용하였다. 도 11은 Ad5PPE-lLuc, Ad5PPE-1-3XLuc 및 Ad5CMVLuc에 의해 형질 도입된 HeLA, HepG2, NSF 및 BAEC 세포에서 광 유닛/㎍ 단백질로서 루시페라아제 활성을 나타내고 있다. Ad5CMVLuc로 형질 도입은 HeLA, HepG2 및 NSF에서 루시페라아제의 높은 발현 수준을 유발하였다. 이들 세포주는 PPE-1의 제어하에서 루시페라아제를 발현시키지 못하였고, PPE-1-3X 프로모터로는 낮은 수준으로 루시페라아제를 발현시켰다. 기대한 대로, Ad5PPE-lLuc 또는 Ad5PPE-1-3XLuc으로 형질 도입된 BAEC 세포는 높은 루시페라아제 발현을 나타내었다.

이들 결과는 PPE-1 프로모터로 3X 서열을 도입하면 비-내피세포에서 원하지 않는 발현을 방지하면서 내피세포주에서의 보다 높은 수준의 발현을 유발할 수 있음을 보여준다.

moi=1에 의해 형질 도입된 BAEC에서 GFP 발현을 나타내는 도 12(A) 내지 도 12(C)에 나타낸 바와 같이, PPE-1 프로모터에 3X 서열을 부가하였더니, EC 세포주(소 대동맥 내피세포-BAEC)에서 녹색 형광 단백질 발현의 수준이 증가하였다. 본 실험에서 CMV 프로모터를 사용하여서는 어떠한 GFP 발현도 관찰되지 않았다.

도 12에서, 패널 A는 Ad5PPE-1-3XGFP 형질 도입된 세포를 나타내며, 패널 B는 Ad5PPE-lGFP 형질 도입된 세포를 나타내며, 패널 C는 Ad5CMVGFP를 나타낸다. PPE-1 프로모터로 3X 서열을 도입하였더니, 리포터 유전자의 발현이 유의적으로 증가하였다. 이러한 결과는 내피세포 특이적 증강인자로서 기능하는 3X 서열의 능력이 전사되는 하류 유전자의 기능이 아님을 의미한다.

나아가, Ad5PPE-1-3X-GFP 및 Ad5PPE-lGFP 형질 도입은 도 13 내지 도 16에 요약한 바와 같이 CMV 프로모터 하에서 높은 발현에 비해 비-내피세포 SMC, HelA, HePG2 및 정상 피부 섬유아세포(NSF)에서는 어떠한 GFP 발현도 초래하지 않았다.

도 13은 Ad5PPE-1-3XGFP(패널 A) 또는 Ad5CMVGFP(패널 B)의 moi=1에 의해 형질 도입된 SMC에서의 GFP 발현을 나타낸다. 높은 수준의 GFP 발현은 Ad5CMVGFP 형 질 도입에 기인하지만, 어떠한 GFP 발현도 Ad5PPE-1-3XGFP 형질 도입에 기인하지 않았다.

도 14는 HeLa 세포에서 실시된 유사한 실험의 결과를 나타내고 있다. 이전 도면에서와 같이, 패널 A는 Ad5PPE-1-3XGFP 형질 도입된 세포를 나타내며, 패널 B는 Ad5PPE-lGFP 형질 도입된 세포를 나타낸다. 높은 수준의 GFP 발현은 Ad5CMVGFP 형질 도입에 기인하지만, 어떠한 GFP 발현도 Ad5PPE-1-3XGFP 형질 도입에 기인하지 않았다.

도 15는 HepG2 세포에서 수행된 유사한 실험의 결과를 나타낸다. 이전 도면에서와 같이, 패널 A는 Ad5PPE-1(3X) GFP에 의해 형질 도입된 세포를 나타내며, 패널 B는 Ad5PPE-lGFP에 의해 형질 도입된 세포를 나타낸다. 높은 수준의 GFP 발현은 Ad5CMVGFP 형질 도입에 기인하지만, 어떠한 GFP 발현도 Ad5PPE-1-3XGFP 형질 도입에 기인하지 않았다.

도 16는 NSF 세포에서 수행된 유사한 실험의 결과를 나타낸다. 이전 도면에서와 같이, 패널 A는 Ad5PPE-1-3XGFP에 의해 형질 도입된 세포를 나타내며, 패널 B는 Ad5CMVGFP에 의해 형질 도입된 세포를 나타낸다. 높은 수준의 GFP 발현은 Ad5CMVGFP 형질 도입에 기인하지만, 매우 낮은 GFP 발현이 Ad5PPE-1-3XGFP 형질 도입에 기인하였다.

이러한 결과는 높은 수준의 내피세포 특이성을 나타내며, 높은 수준의 내피세포 발현은 서열번호: 7의 3X 서열을 함유하는 변형 PPE-1 프로모터를 사용하여 얻어진다.

실시예 11

생체 내 Ad5PPE-1-3X에 의해 전달된 리포터 유전자의 세포내 편재화

생체 내 PPE-1-3X 프로모터의 제어하에서 발현되는 리포터 유전자의 세포내 편재 형태를 알아보기 위해, Ad5PPE-13XGFP 및 Ad5PPE-lGFP를 상술한 바와 같이 마우스에 주입하였다. 정맥 주사 후 5일째, 마우스를 희생시키고, 그 조직을 형광 현미경법으로 분석하였다.

Ad5PPE-1-3XGFP 주입된 마우스의 간, 신장 및 비장 혈관의 내피세포에서 Ad5PPE-lGFP 주입된 마우스에 비해 유의적으로 높은 GFP 활성이 관찰되었다. 도 17(A) 및 도 17(B)는 대표적인 결과를 나타낸다.

도 17(A)는 Ad5PPE-lGFP가 주입된 마우스의 혈관을 라이닝(lining)하는 내피세포에서 낮은 GFP 발현 수준을 나타내고 있다. 도 17(B)는 구조체에 3X 서열의 부가에 기인하는 GFP 발현의 훨씬 높은 수준을 나타내고 있다.

혈관의 라이닝에 있어서 높은 발현에도 불구하고, 어떠한 발현도 간세포, 사구체(glomeruli), 상피 세포 및 비장 세포에서 검출되지 않았다(도 18 및 도 19).

도 18은 주입된 마우스의 신장 조직에서의 대표적인 결과를 나타내고 있다. Ad5CMVGFP 주입된 마우스(도 18(A)), Ad5PPE-1GFP(도 18(B)) 및 Ad5PPE-1-3XGFP(도 18(C)) 주입된 마우스는 모두 신장 세포에서 낮은 GFP 활성을 나타내었다. 도 18(B)에서는, 약간 높은 GFP 발현이 혈관벽에서 관찰되었다(화살표로 표시함).

도 19는 주입된 마우스의 비장 조직에서의 대표적인 결과를 나타내고 있다. Ad5CMVGFP 주입된 마우스(도 19(A)), Ad5PPE-1GFP(도 19(B)) 및 Ad5PPE-1-3XGFP(도 19(C)) 주입된 마우스는 모두 비장 세포에서 낮은 GFP 활성을 나타내었다. 약간 높은 GFP 활성이 Ad5PPE-1-3XGFP 주입된 마우스의 혈관에서 관찰되었다(화살표로 표시함).

이러한 결과들을 통해 PPE-1 및 PPE-1-3X 프로모터가 생체 내에서 내피세포에 특이적이라는 것을 알 수 있다. 이들은 또한 상기 2개의 프로모터가 비-증식 중의 내피세포(즉, 건강한 조직의 혈관)에 한정되었음을 암시하고 있다. 따라서, 종양 혈관신생 모델에서 분석을 수행하였다.

실시예 12

생체 내 종양 신혈관조직화에서 Ad5PPE-I 구조체의 분석

종양에서 혈관신생 혈관에 리포터 유전자의 발현을 특이적으로 지시하는 AD5PPE의 능력을 확인하기 위해서, 쥐 LLC 모델(상기 재료 및 방법란에서 기재한 바와 같이)을 사용하였다.

하나의 실험에 있어서, Ad5PPE-lLuc 또는 Ad5CMVLuc의 전신 주입(각각 10¹⁰ pfu/ml) 후 5일째에 종양 신혈관조직화에서 루시페라아제 발현을 시험하였다.

이 실험에서, 초기 및 전이성 종양 모델에 Ad5CMVLuc을 전신 주입하였더니, 초기 종양 및 전이성 폐에서 최소 발현을 초래하였다. 이러한 발현 수준은 깨끗한 정상 폐에서 CMV에 의해 지시되는 루시페라아제의 최소 발현과 유사하였다(도 35; 짙은 막대; n=12). 확실히 대조적으로, PPE-1 프로모터의 제어하에서(도 35; 밝은 막대; n=9), 매우 높은 혈관신생 폐 전이는 약하게-혈관화된 초기 종양 및 깨끗한 폐에서 루시페라아제 활성 보다 약 200배 높은 루시페라아제 활성과 관련되었다.

간, 신장, 심장 및 췌장과 같은 비-전이성 조직에서 루시페라아제 발현은 최소이었다. 대동맥에서 발현 수준은 전이성 폐에서의 발현의 약 30%이었다.

LLC 모델에서의 추가적인 실험에 있어서, 초기 종양 및 전이성 폐에서 리포터 유전자 발현을 편재화하기 위해 Ad5PPE-lGFP 및 Ad5CMVGFP 구조체를 사용하였다.

비록 종양 세포 자신에서는 어떠한 발현도 검출되지 않았지만, Ad5PPE-lGFP 주입된 마우스는 초기 종양의 혈관에서 GFP 특이적 발현의 높은 수준을 나타내었다(도 36(C)). 이러한 관찰은 실시예 20에서 제공된 LLC 세포 배양 모델의 결과와 일치한다. 폐 전이에서, 높은 수준의 GFP 발현이 전이성 병소의 대동맥 및 작은 혈관신생 혈관에서 검출되었다(도 36(A)). 정상 폐 조직에서는 어떠한 발현도 검출되지 않았다. 내피세포 편재화는 GFP 발현(도 16(A)) 및 CD31 항체 면역-염색(도 16(B))의 공-편재화에 의해 증명되었다. 현저하게 대조적으로, Ad5CMVGFP 주입된 마우스에서, 어떠한 GFP 활성도 초기 종양 및 폐 전이에서 검출할 수 없었다.

도 36(C)는 Ad5PPE-lGFP의 종양 내 주입 후 초기 종양의 혈관에서의 GFP 발현을 보여주고 있다. 도 36(D)는 종양 및 그 혈관을 나타내는 패널 C와 같이 나타나는 위상차 사진이다.

이들 결과는 PPE-1가 종양 세포 자체에서 높은 수준의 발현을 유도하지 못한 반면, 프로모터는 종양 내 혈관 내피세포, 특히 급속히 증식하는 혈관신생 혈관에서 높은 수준의 발현을 유도함을 나타낸다.

초기 피하 종양 모델로 AdSCMV의 종양 간(intra-tumor) 주입은 종양 조직에서 높은 루시페라아제 발현을 초래하고, 또한 간에서 적정 수준의 발현을 초래하였다(종양에서 발현량의 10%; 도 42). 전이성 폐에서는 어떠한 발현도 검출되지 않았다. 한편, 종양 간 주입시, PPE-1 프로모터의 제어하에서 루시페라아제 발현은 초기 종양 및 전이성 폐에서 유사한 루시페라아제 수준을 초래하였고, 간에서는 어떠한 발현도 검출되지 않았다.

실시예 13

암종 세포 배양계에서 Ad5PPE-1 구조체의 분석

암 세포에서 루시페라아제 발현을 유도하는 Ad5PPE-1 및 AdSCMV의 효율을 분석하기 위해, D122-96 루이스 폐 암종 세포주를 사용하였다.

감염의 다양한 다중성(moi)으로 시험관 내 형질 도입을 수행하였다. 그 결과를 통해 아데노바이러스 벡터가 루시페라아제 유전자를 이들 세포로 형질 도입할 수 있음을 알 수 있다(표 3). 그러나, PPE-1 프로모터에 의해 지시되는 루시페라아제 활성은 각각 50 대 1000-2500 광 유닛/㎍ 단백질로 내피세포에서 검출된 활성 보다 LLC 세포에서 훨씬 낮았다.

시험관 내 Ad5PPE-ILuc 및 Ad5CMVLuc로 루이스 페 암종 세포주(D122-96)의 형질 도입

	MOI=1	MOI=5	MOI=10
Ad5PPE-1	8.1±0.06	33.95±7.0	50.7±5.0
Ad5CMV	9.3±1.1	47.3±4.0	88.13±10.1

실시예 14

생체 내 종양 혈관신생 혈관에서 3X 서열의 효과의 분석

혈관신생 혈관에서 PPE-1 프로모터에 대한 3X 서열의 효과를 확인하기 위해, 루이스 폐 암종(LLC) 전이 모델(상술한 재료 및 방법란에 기재한 바와 같이)을 사용하였다. Ad5PPE-1GFP, Ad5PPE-1-3XGFP 또는 Ad5CMVGFP의 10¹⁰ 세포 감염성 유닛의 IV 주사 후 5일째에, 마우스를 희생시키고, 그 조직을 재료 및 방법란에 기재한 바와 같이 분석하였다.

도 20(A) 내지 도 20(D)는 식염수 주입된 대조군 마우스(도 20(A)), Ad5CMVGFP 주입된 마우스(도 20(B)), Ad5PPE-lGFP 주입된 마우스(도 20(C)) 및 Ad5PPE-1-3XGFP 주입된 마우스(도 20(D))의 전이성 폐에서의 GFP 발현을 요약하고 있다. 항-CD31 면역 염색법(도 20(C') 내지 도 20(D'))은 각 전이성 조직에서 GFP 발현의 위치를 확인시켜 준다. 이 결과를 통해 어떠한 GFP 발현도 대조군-식염수 주입된 마우스에서 검출되지 않은 반면(도 20(A)), CMV 주입된 마우스의 상피 기관지 주변에서 약간의 발현이 있었지만 이들 마우스의 전이성 폐의 혈관신생 혈관에서는 검출되지 않았음을 알 수 있다(도 20(B)). 낮은 GFP 발현이 Ad5PPE-lGFP 주입된 마우스의 전이성 폐에서 검출된 반면(도 20(C) 및 도 20(C')), 높은 특이적 발현이 Ad5PPE-1-3XGFP 주입된 마우스의 새로운 혈관에서 관찰되었다(도 20(D) 및 도 20(D')).

이러한 결과들은 실시예 10의 생체 내 결과와 실시예 2, 3 및 6의 시험관 내 결과 사이에 명백한 불일치를 설명해 주고 있다. PPE-1 및 PPE-1-3X 프로모터는 내피세포 특이적이다. 그러나, 3X 서열은 성장 중의 종양에서 새로이 형성되고 있는 혈관과 같은 급속하게 증식하는 내피세포 조직에서 발현 수준을 증가시킨다.

실시예 15

종양 혈관신생 혈관에서 PPE-1 프로모터에 대한 3X 요소의 효과

종양 혈관신생 혈관에서 PPE-1 프로모터의 효능 및 특이적 활성에 대한 본 발명의 3X 요소의 효과를 연구하기 위해, LLC 전이 모델을 사용하였다. 10¹⁰pfu/ml의 Ad5PPE-lLuc, Ad5PPE-1-3XLuc, Ad5CMVLuc, Ad5PPE-1GFP, Ad5PPE-1-3X-GFP 또는 Ad5CMVGFP의 i.v. 주사 후 5일째에, 마우스를 희생하고, 그 조직을 상술한 바와 같이 루시페라아제 또는 GFP 발현에 대해 분석하였다.

도 37은 Ad5PPE-1-3Xluc, Ad5PPE-lLuc 또는 Ad5CMVLuc의 전신 주입 후 전이성 폐에서의 루시페라아제 발현과 정상 폐에서 루시페라아제 발현을 비교하는 막대 그래프이다. 실험군은 Ad5CMVLuc(n=7; 짙은 막대), Ad5PPE-lLuc(n=6; 회색 막대) 및 Ad5PPE-1-3XLuc(n=13; 갈색 막대)이었다. 활성을 광 유닛/㎍ 단백질로서 표시한다.

PPE-1-3X 프로모터의 제어하에서의 루시페라아제 발현은 정상 폐에서의 활성에 비해 전이성 폐에서 35배 높았고, 3X 요소 없이 PPE-1 프로모터에 의해 유도되는 발현 보다는 3.5배 높았다(p < 0.001). 매우 낮은 루시페라아제 활성이 Ad5PPE-1-3XLuc 주입된 마우스의 다른 조직에서 검출되었다. 각 주입된 동물의 간으로부터 퍼센트로서 폐에서의 루시페라아제 발현을 계산하면, 정상 폐에서의 활성에 비해 전이성 폐에서 활성이 10배 증가하였음을 알 수 있었다(도 38).

특이적 세포 유형에 리포터 유전자 발현을 편재화하기 위해, GFP 구조체를 사용하였다. 도 39는 Ad5PPE-1-3XGFP 주입된 마우스의 전이성 폐에서의 GFP 발현(도 39(A))을 보여주고 있다. CD31 항체에 의한 면역-염색법(도 39(B))은 새로운 혈관에서 GFP 발현의 위치를 확인시켜 준다. 대조군-식염수 주입된 마우스에서 어떠한 GFP 발현도 검출되지 않았다. CMV 주입된 마우스의 상피 기관지 주변에서 낮은 수준의 발현이 있었지만, 전이성 폐에서의 혈관신생 혈관에서는 없었다. 요약하면, 이들 결과를 통해 발현 수준에 있어 큰 증가는 Ad5PPE-l 구조체로 3X 요소의 도입에 기인하고, 이러한 증가된 발현은 종양의 혈관신생 혈관에 특이적이었음을 알 수 있다. 잠재적으로는, 상기 관찰된 효과가 관심대상 서열의 발현 수준을 더욱 증가시키기 위해 상술한 저산소증 반응과 연관될 수 있다.

실시예 16

PPE-1 저산소증 반응의 또 다른 특성화

쥐 PPE1 프로모터 활성에 대한 저산소증의 효과를 더욱 특성화하기 위해, 소 대동맥 내피세포(BAEC)를 DNA 플라스미드로 세포 감염시켰다(pEL8; 도 26(A)). 상기 pEL8 플라스미드는 쥐 PPE-1 프로모터(1.4kb)(적색), 루시퍼라아제 유전자(1842 bp), SV40 polyA 부위 및 엔도셀린-1 유전자의 제1 인트론을 함유하며, 모두 PPE-1 프로모터 카세트로 명명된 이들을 소화하고, 재료와 방법란에서 상술한 BamHI 제한 효소에 의해 추출하였다. 세포 감염시킨 후, 세포를 저산소 상태 처리하였다.

저산소 상태(0.5% 0₂)에서 18시간 처리한 세포 감염된 BAEC에서 루시퍼라아제 발현은 정상 산소 상태에서 성장시킨 세포에서의 루시퍼라아제 발현 보다 8배 높았다(도 21). 도 21은 쥐 PPE-1 프로모터를 함유하는 플라스미드에 의해 세포 감염된 BAEC에서의 루시퍼라아제 활성(광 유닛/㎍ 단백질)이 세포 감염된 세포가 저산소 환경에서 배양될 때 유의적으로 더 높았음을 나타내고 있다. β-갈락토시다아제 리포터 벡터로 공-세포 감염 및 LacZ 활성의 분석에 의해 동등한 세포 감염 효율이 확인되었다.

아데노바이러스 벡터에 의해 전달된 쥐 PPE-1 프로모터가 또한 저산소 상태에 의해 상향-조절되는지 확인하기 위하여, BAEC를 Ad5PPE-lLuc에 의해 형질 도입하였다. Ad5CMVLuc를 본 실험에서는 비 특이적 대조군으로 사용하였다.

그 결과들이 도 22 -Ad5PPE-lLuc에 의해 형질 도입된 BAEC에서의 저산소 상태 루시퍼라아제 활성- 에 요약되어 있다. 현저하게 대조적으로, 정상 산소 상태 및 저산소 상태에서의 어떠한 유의적인 차이도 Ad5CMV 형질 도입된 세포에서 검출 되지 않았다(도 22).

PPE-1 프로모터 활성의 강화가 내피세포에 특이적인지 이해하기 위해, 상이한 세포주(BAEC, B2B, CHO, RIN 및 심근 세포)를 Ad5PPE-1(moi=10)에 의해 형질 도입하고, 저산소 상태(0.5% 0₂) 또는 정상 산소 상태에서 처리하였다. 그 결과가 도 23에 요약되어 있다. 루시퍼라아제 발현은 B2B 세포에서 약간 증가하였고, 저산소 상태에서 배양된 BAEC 세포에서는 유의적으로 증가하였다. 다른 세포주에서 루시퍼라아제 발현은 저산소 상태에 의해 정상 산소 상태에 비해 감소되었다. 이러한 결과들에 의해, 내피세포 계통에서 PPE-1 프로모터의 저산소 상태 유도가 우선적으로 발생함으로 알 수 있다.

실시예 17

PPE-1 저산소증 반응에 대한 3X 서열의 효과

PPE-1 저산소증 반응에 대한 3X 서열의 효과를 확인하기 위해, BAEC을 Ad5PPE-lLuc 및 Ad5PPE-1(3X) Luc에 의해 형질 도입하였다. 형질 도입 후, BAEC 세포를 저산소 상태 또는 정상 산소 상태에서 상술한 바와 같이 배양하였다. 그 결과가 도 24에 요약되어 있다. Ad5PPE-lLuc 구조체를 사용하여 루시퍼라아제 발현하였더니 저산소 상태에 반응하여 유의적으로 증가하였다(7배)(저산소 상태 2578이고, 정상 산소 상태에서 322.1). 대조적으로, Ad5PPE-1(3X) Luc 구조체는 저산소증에 반응하여 1.5배 만이 증가하였다(정상 산소 상태에서 2874.5에서 저산소 상 태에서 4315). 이러한 결과들을 통해, 3X 서열이 PPE-1 프로모터에 부가될 때 관찰되는 높은 정상 산소 상태 발현 수준이 어느 정도까지 저산소증 반응을 차단하는 역할을 함을 알 수 있다.

실시예 18

형질 전환된 마우스 모델에서 저산소증에 대한 PPE-1 반응의 분석

국소 저산소증/허형 처리된 조직에서 쥐 PPE-1 프로모터 활성을 검사하기 위해, 상술한 재료 및 방법란에 기재한 바와 같이, mPPE-1-Luc 형질전환 마우스를 사용하였다. 마우스들을 상술한 바와 같이 국소적 뒷다리 허혈을 유도하였다(Couffinhal T. 등. (1998) Am. J. Pathol. 152; 1667-1679). 간단히, 동물들을 펜토바르비탈 소듐(40mg/kg, IP)으로 마취시켰다. 뒷다리의 단면 허혈은 복재 및 오금 동맥의 분기점에서 약 2mm의 우대퇴부 동맥을 결찰함으로써 유도하였다. 관류에서 기능적 변화의 유도를 증명하기 위해, 초음파 이미징을 7.5MHz 변환기 및 혈관 그래픽 소프트웨어를 구비한 시너지 초음파 장치(GE)를 이용하여 4일 및 14일째 수행하였다. 동물을 18일까지 통상적인 조건하에서 사육하였다.

루시퍼라아제 발현은 허혈성 근육, 정상 비-결찰된 근육, 간, 폐 및 대동맥에서 결찰 후 2, 5, 10 및 18일째에 분석하였다.

도 25에 요약되어 있는 결과를 통해 결찰 후 수일 동안 간, 폐 및 대동맥에서 어떠한 유의적인 차이가 검출되지 않는 반면에, 루시퍼라아제 유전자 발현은 정상 비-결찰한 근육 및 허혈성 근육에서 대퇴부 결찰 후 증가하였음을 알 수 있다. 최대 루시퍼라아제 발현이 결찰 후 5일째에 검출되는 반면에, 비-결찰된 근육에서의 최대 루시퍼라아제 발현은 대퇴부 동맥 결찰 후 10일째에 검출되었다. 이는 생체 내 시스템에서 PPE-1 프로모터의 저산소증 반응이 기능적임을 나타낸다. 비허혈성 근육에서 루시퍼라아제 발현은 수술되지 않은 대조군 조직(0일)에서의 발현과 달리 시험 기간 중에 변하지 않았다. 대조적으로, 허혈성 근육에서의 루시퍼라아제 발현은 다른 시점 보다는 5일째에 유의적으로 높았다.

5일째, PPE-1 유도 루시퍼라아제 발현은 수술하지 않은 대조군 마우스 및 10일 및 18일째의 허혈성 근육에 비해 2.5배 높았다(도 40).

국소적으로 허혈 처리된 형질 전환 마우스의 간, 폐 및 대동맥을 포함하는 다른 비-허혈성 조직에서의 루시퍼라아제 발현은 이들 조직에서의 루시퍼라아제 발현에서 허혈성 유도 후 18일 내에는 유의적인 변화를 나타내지 않았다(도 41).

또한, 이들 결과를 통해 루시퍼라아제 발현이 내피세포 조직(간 및 비허혈성 근육)의 낮은 퍼센트를 함유하는 조직 보다는 내피세포 조직(폐 및 대동맥)의 높은 퍼센트를 함유하는 조직에서 더 높았다는 것을 확인할 수 있다.

실시예 19

내피세포 에서 Ad5PPE-ILuc 활성에 대한 세포 증식 수준의 효과

Ad5PPE-ILuc의 효율 및 특이적 활성에 대한 세포 증식 수준의 효과를 확인하기 위해, 내피세포(BAEC)의 혈관신생 모델을 시험관 내 시험하였다. 형질 도입된 BAEC을 혈청 배제에 의해 휴지 상태로 유도하거나 정상 증식을 위해 10% FCS에서 성장시켰다. 간단히, 세포를 휴지 세포-혈청 배제 후 72시간 또는 증식 세포-정상 배지(10% FCS)로서 48시간 동안 형질 도입하였다. 루시퍼라아제 활성을 광 유닛/㎍ 단백질로서 표시하여 세포 양에서 차이를 평균화한다. 제공되어 있는 결과들은 4개의 대표적인 독립적인 실험으로부터 3번 시험한 평균이다.

PPE-1 프로모터의 제어하에서의 루시퍼라아제 발현(밝은 막대; 도 28)은 휴지 세포에서 보다 정상 증식 BAEC에서 4배 높고, CMV 프로모터의 제어하에서 루시퍼라아제 발현보다는 정상 증식 BAEC에서 25배 더 높았다(짙은 막대; 도 28). 또한, 증식 세포에서, PPE-1 프로모터의 제어하에서의 활성은 CMV 프로모터 제어하에서의 활성 보다 10배 더 높았다.

혈관신생 상태를 시험관 내 모의하기 위해, Ad5PPE-lLuc 활성을 40ng/ml 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF)를 첨가함으로써 급속한 증식으로 유도된 BAEC에서 시험하였다. 이러한 조건하에서의 활성은 상술한 바와 같이 정상 증식 중의 세포 및 휴지 상태의 세포에서 활성을 비교하였다. VEGF로 세포 증식 유도된 BAEC에서 루시퍼라아제 발현은 정상 증식 세포에서 보다 44배 높았고, 휴지 세포에서 보다는 83배 높았다(도 29).

이러한 실험을 통해 PPE-1 프로모터의 전사적 제어하에서 관심대상 서열의 활성 수준이 보다 높은 발현 수준을 유발하는 급속한 증식과 함께 세포 증식의 수준의 기능임을 알 수 있다.

실시예 20

죽상 경화증(Atherosclerosis) 유도된 마우스에서 PPE-1 프로모터의 분석

죽상 경화증 혈관에서 Ad5PPE-1 벡터의 효율 및 특이성을 시험하기 위해, 10^l0 pfu/ml의 바이러스 벡터를 6월령의 ApoE 결핍 마우스에 전신 주입하였다(Plump, A. S. 등. Cell; 1991; 71:343-353).

ApoE 결핍 마우스 연령으로서, 이들을 높은 콜레스테롤 수치로 성장시키고 지질 리치(reach)식이를 유도하지 않은 광범위한 죽상 형성 플라크를 형성시켰다. 도 32는 Sudan-IV에 의해 착색된 ApoE 결핍 마우스로부터 절개된 대동맥의 사진이다. 흉부 대동맥은 적색 염색된 죽상 경화증 병변을 포함하는 반면에, 복부 부위는 매우 죽상 경화성임을 명심할 것. (도 32는 1251-HDL 및 125I-BSA에 의해 죽상 경화증 병변의 이미징으로부터 적용됨. A. Shaish 등, Pathobiology-submitted for publication).

도 33은 Ad5PPE-lLuc(밝은 막대; n=12) 및 Ad5CMVLuc(짙은 막대; n=12)를 ApoE 결핍 마우스에 전신 주입한 후 5일째에 관찰한 루시퍼라아제 발현을 요약하고 있다. 그 결과는 죽상 경화증 병변을 함유하는 흉부 영역 및 죽상 경화증 병변이 풍부한 복부 대동맥에서 절대 루시퍼라아제 발현으로서 제공되어 있다.

PPE-1 프로모터에 의해 제어되는 루시퍼라아제 발현은 CMV 프로모터 제어하에서의 발현에 비해 상당히 죽상 경화성인 복부에서 6배 더 높았고 약간 죽상 경화성인 흉부 대동맥에서는 1.6배 높았다.

Ad5PPE-lLuc 주입된 마우스에서 2개의 대동맥 영역 사이에 어떠한 유의적인 차이도 관찰되지 않은 반면, 병변을 함유하는 복부 대동맥에서의 낮은 발현에 비해 Ad5CMVLuc 주입된 군의 흉부 대동맥에서 보다 높은 루시퍼라아제 발현이 관찰되었다.

이러한 결과를 통해, 구성 프로모터(CMV)는 죽상 경화증이 가장 심각한 영역에서 차단하는 경향이 있고, PPE-1 프로모터는 질환의 진전에 의해 상대적으로 거의 영향을 받지 않음을 알 수 있다.

실시예 21

상처 치유 모델에서 PPE-1 프로모터의 분석

루시퍼라아제 발현을 혈관 상처 치유하도록 지시하는 Ad5PPE-1 구조체의 효율 및 특이적 활성을 시험하기 위해서, 재료 및 방법란에서 상술한 쥐 상처 치유를 사용하였다.

다른 실험에서와 같이, Ad5CMVLuc를 비-조직 특이적 대조군으로서 사용하였다. PPE-1 프로모터 제어하에서 루시퍼라아제 활성(도 34; 밝은 막대)은 CMV 제어하에서 관찰되는 활성(도 34; 짙은 막대)에 비해 정상 (6.8±3.2) 및 상처 부위의 치유(5±1.6)에서 보다 높았다.

CMV 및 PPE-1 프로모터가 상처 치유에 있어 감소된 발현 수준을 나타내었기 때문에, 이러한 결과를 해석하기는 곤란하다. 이러한 기대치 않은 관찰에도 불구하고, PPE-1 프로모터가 정상 및 치유 조직에서 CMV 프로모터 보다도 높은 발현 수준을 유도한다는 것은 명백하다. 괴사 상처 조직의 존재는 상처 치유시 2개의 프 로모터로 관찰되는 감소된 발현 수준을 설명해준다.

본 발명을 구체적인 실시형태를 들어 기재하였지만, 많은 대체, 변형 및 변화가 본 기술 분야의 당업자에게 있어서는 자명하다. 따라서, 첨부되어 있는 청구범위의 정신 및 광범위한 범위 내에 속하는 이러한 대체, 변형 및 변화를 포함하고자 하는 것이다. 각각의 문헌, 특허, 특허 출원 또는 등록번호에 의해 확인되는 서열은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되도록 구체적으로 또한 개별적으로 나타낸 만큼, 모든 문헌, 특허, 특허 출원 및 본 명세서에서 언급하고 있는 등록번호에 의해 확인되는 서열은 본 명세서에 참고 문헌으로 전적으로 포함된다. 또한, 본 출원에서 몇몇 문헌을 인용 또는 확인하는 것이 이러한 문헌들이 본 발명에 대한 종래 기술로서 이용될 수 있는 것으로 해석되어서는 안 된다.

<110> VASCULAR BIOGENICS LTD. <120> PROMOTERS EXHIBITING ENDOTHELIAL CELL SPECIFICITY, AND METHODS OF USING SAME <150> US 60/248,582 <151> 2000-11-17 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1334 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtagtgta cttctgatcg 60 gcgatactag ggagataagg atgtacctga caaaaccaca ttgttgttgt tatcattatt 120 atttagtttt ccttccttgc taactcctga cggaatcttt ctcacctcaa atgcgaagta 180 ctttagttta gaaaagactt ggtggaaggg gtggtggtgg aaaagtaggg tgatcttcca 240 aactaatctg gttccccgcc cgccccagta gctgggattc aagagcgaag agtggggatc 300 gtccccttgt ttgatcagaa agacataaaa ggaaaatcaa gtgaacaatg atcagcccca 360 cctccacccc acccccctgc gcgcgcacaa tacaatctat ttaattgtac ttcatacttt 420 tcattccaat ggggtgactt tgcttctgga gaaactcttg attcttgaac tctggggctg 480 gcagctagca aaaggggaag cgggctgctg ctctctgcag gttctgcagc ggtctctgtc 540 tagtgggtgt tttctttttc ttagccctgc ccctggattg tcagacggcg ggcgtctgcc 600 tctgaagtta gccgtgattt cctctagagc cgggtcttat ctctggctgc acgttgcctg 660 tgggtgacta atcacacaat aacattgttt agggctggaa taaagtcaga gctgtttacc 720 cccactctat aggggttcaa tataaaaagg cggcggagaa ctgtccgagt cagacgcgtt 780 cctgcaccgg cgctgagagc ctgacccggt ctgctccgct gtccttgcgc gctgcctccc 840 ggctgcccgc gacgctttcg ccccagtgga agggccactt gctgaggacc gcgctgagat 900 ctaaaaaaaa aacaaaaaac aaaaaacaaa aaaacccaga ggcgatcaga gcgaccagac 960 accgtcctct tcgttttgca ttgagttcca tttgcaaccg agttttcttt ttttcctttt 1020 tccccactct tctgacccct ttgcagaatg gattattttc ccgtgatctt ctctctgctg 1080 ttcgtgactt tccaaggagc tccagaaaca ggtaggcgcc acttgcgaat ctttctactt 1140 cagcgcagca gttatcgctt ctgttttcca cttttctttc tttcttttct ttcattcttt 1200 cctttttatt tattttttta attactgaag ctccagcagc aagtgcctta caattaatta 1260 acttctgtgt gaagcgaaag aaataaaacc cctgtttgaa tacagctgac tacaaccgag 1320 tatcgcatag cttc 1334 <210> 2 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 gctagcgtac ttcatacttt tcattccaat ggggtgactt tgcttctgga gggtgacttt 60 gcttctggag ccaatgggta cttcatactt ttcatt 96 <210> 3 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 gctagcctcc agaagcaaag tcaccccatt ggaatgaaaa gtatgaagta caatgaaaag 60 tatgaagtac ccattggctc cagaagcaaa gtcacc 96 <210> 4 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nhe-1 restriction site <400> 4 gctagc 6 <210> 5 <211> 6 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> Hypoxia responsive element - E-box <400> 5 gcacgt 6 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> Murine endothelial specific enhancer elemet <400> 6 gtacttcata cttttcattc caatggggtg actttgcttc tgga 44 <210> 7 <211> 143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A triplicate copy of a murine enhancer sequence originated from the PPE-1 promoter <400> 7 gtacttcata cttttcattc caatggggtg actttgcttc tggagggtga ctttgcttct 60 ggagccagta cttcatactt ttcattgtac ttcatacttt tcattccaat ggggtgactt 120 tgcttctgga ggctagctgc cag 143 <210> 8 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EDC fragment <400> 8 ctggagggtg actttgcttc tggagccagt acttcatact tttcatt 47

Claims

내피세포 특이적 프로모터 요소, 및 서열번호: 8에 기재되어 있는 서열의 하나 이상의 카피를 가지는 조절 요소로 이루어진, 내피세포 조절 요소로서 기능하는 분리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 조절 요소는 상기 내피세포 특이적 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절할 수 있는 것이고, 상기 내피세포 특이적 프로모터는 서열번호: 1에 기재되어 있는 것인 분리된 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, 상기 조절 요소가 서열번호: 6에 기재되어 있는 서열의 하나 이상의 카피를 추가로 갖는 것인 분리된 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, 상기 조절 요소가 서열번호: 8에 기재되어 있는 서열의 카피 하나 및 서열번호: 6에 기재되어 있는 서열의 둘 이상의 카피로 이루어진 것인 분리된 폴리뉴클레오티드.
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제 1 항에 있어서, 서열번호: 5에 기재된 서열의 하나 이상의 카피로 이루어진 저산소증 반응 요소를 추가로 갖는 분리된 폴리뉴클레오티드.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 조절 요소가 서열번호: 7에 기재되어 있는 것인 분리된 폴리뉴클레오티드.
제 1 항의 분리된 폴리뉴클레오티드, 및 VEGF, p55 및 PDGF-BB로 이루어지는 군으로부터 선택된 관심대상 핵산 서열을 갖는 핵산 구조체로서, 상기 관심대상 핵산 서열이 상기 분리된 폴리뉴클레오티드의 조절 제어를 받는 것인 핵산 구조체.
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제 1 항의 분리된 폴리뉴클레오티드로 형질 변환된 포유류 세포.
혈관신생의 조절을 필요로 하는 대상에 있어서 혈관신생의 조절을 위한, 핵산 구조체를 포함하는 의약으로서, 상기 핵산 구조체는 내피세포 내에서의 관심대상 핵산 서열의 발현에 사용되며, 상기 핵산 구조체는 서열번호: 1에 기재되어 있는 내피세포 특이적 프로모터의 조절 제어를 받도록 위치한, VEGF, p55 및 PDGF-BB로 이루어지는 군으로부터 선택된 핵산 서열, 및 서열번호: 8에 기재되어 있는 서열의 하나 이상의 카피를 갖는 내피세포 조절 요소를 갖는 것인, 의약.
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제 12 항에 있어서, 상기 조절 요소가 서열번호: 6에 기재되어 있는 서열의 하나 이상의 카피를 추가로 가지는 것인 의약.
제 15 항에 있어서, 상기 조절 요소가 서열번호: 7에 기재되어 있는 것인 의약.
제 15 항에 있어서, 상기 서열번호: 6에 기재되어 있는 서열의 하나 이상의 카피가 서열번호: 6에 기재되어 있는 서열의 두 개의 카피로 이루어진 것인 의약.
제 17 항에 있어서, 상기 서열번호: 6에 기재되어 있는 서열의 두 개의 카피가 인접해 있는 것인 의약.
삭제
제 12 항에 있어서,

(i) 전신성 생체내 투여;

(ii) 대상체로부터 제거된 세포에 생체외 투여한 후, 이 세포를 상기 대상체 내로 재도입; 및

(iii) 국소적 생체내 투여

로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법에 의해 인간이 아닌 대상에게 투여되도록 고안된 의약.
혈관신생의 조절을 필요로 하는 대상의 조직 내에서 혈관신생의 조절에 사용되는, 핵산 구조체를 포함하는 의약으로서, 상기 핵산 구조체는 하기를 갖는 것인 의약:

(a) 서열번호: 1에 기재되어 있는 내피세포 특이적 프로모터;

(b) 서열번호: 8에 기재되어 있는 서열의 하나 이상의 카피를 갖는 내피세포 조절 요소;

(c) 서열번호: 5에 기재되어 있는 저산소증 반응 요소의 하나 이상의 카피; 및

(d) 상기 프로모터 및 저산소증 반응 요소의 조절 제어를 받는, VEGF, p55 및 PDGF-BB로 이루어지는 군으로부터 선택된 핵산 서열.
제 21 항에 있어서,

(i) 전신성 생체내 투여;

(ii) 대상체로부터 제거된 세포에 생체외 투여한 후, 이 세포를 상기 대상체 내로 재도입; 및

(iii) 국소적 생체내 투여

로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법에 의해 인간이 아닌 대상에게 투여되도록 고안된 의약.
삭제
제 21 항에 있어서, 상기 조절 요소가 서열번호: 7에 기재되어 있는 것인 의약.
제 21 항에 있어서, 상기 핵산 구조체가

(e) 서열번호: 6에 기재되어 있는 서열의 하나 이상의 카피를 추가로 가지는 것인 의약.
제 25 항에 있어서, 상기 서열번호: 6에 기재되어 있는 서열의 하나 이상의 카피가 두 개의 인접해 있는 카피를 갖는 것인 의약.
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서열번호: 1에 기재되어 있는 내피세포 특이적 프로모터, 및 서열번호: 7에 기재되어 있는 서열을 갖는 조절 요소로 이루어진, 진핵 내피세포에서 프로모터로서 기능하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
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제 29 항에 있어서, 서열번호: 5에 기재되어 있는 서열의 하나 이상의 카피로 이루어진 저산소증 반응 요소를 추가로 갖는 분리된 폴리뉴클레오티드.
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제 29 항의 분리된 폴리뉴클레오티드, 및 VEGF, p55 및 PDGF-BB로 이루어지는 군으로부터 선택되는 관심대상 핵산 서열로 이루어진 핵산 구조체로서, 상기 관심대상 핵산 서열은 상기 분리된 폴리뉴클레오티드의 조절 제어를 받는 것인 핵산 구조체.
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제 29 항에 따른 분리된 폴리뉴클레오티드로 형질 변환된 포유류 세포.
조직 내에서 혈관신생의 조절에 사용되는, 핵산 구조체를 포함하는 의약으로서, 상기 핵산 구조체는 하기를 갖는 것인 의약:

(a) 서열번호: 1에 기재되어 있는 내피세포 특이적 프로모터;

(b) 서열번호: 7에 기재되어 있는 서열을 갖는 내피세포 조절 요소;

(c) 서열번호: 5에 기재되어 있는 저산소증 반응 요소의 하나 이상의 카피; 및

(d) VEGF, p55 및 PDGF-BB로 이루어지는 군으로부터 선택된 혈관신생 조절 인자를 코딩하는 핵산 서열로서, 상기 프로모터, 상기 내피세포 조절 요소 및 상기 저산소증 반응 요소의 조절 제어를 받는 핵산 서열.
제 37 항에 있어서,

(i) 전신성 생체내 투여;

(ii) 대상체로부터 제거된 세포에 생체외 투여한 후, 이 세포를 상기 대상체 내로 재도입; 및

(iii) 국소적 생체내 투여

로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법에 의해 인간이 아닌 대상에게 투여되도록 고안된 의약.
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