PT2186530E - Promotores que apresentam uma especificidade das células endoteliais e os métodos de usar os mesmos - Google Patents

Promotores que apresentam uma especificidade das células endoteliais e os métodos de usar os mesmos Download PDF

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PT2186530E
PT2186530E PT91749986T PT09174998T PT2186530E PT 2186530 E PT2186530 E PT 2186530E PT 91749986 T PT91749986 T PT 91749986T PT 09174998 T PT09174998 T PT 09174998T PT 2186530 E PT2186530 E PT 2186530E
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Nira Bloom
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Vascular Biogenics Ltd
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Description

DESCRIÇÃO
PROMOTORES QUE APRESENTAM UMA ESPECIFICIDADE DAS CÉLULAS ENDOTELIAIS E OS MÉTODOS DE USAR OS MESMOS
CAMPO E ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A presente divulgação está relacionada com sequências polinucleotidicas isoladas apresentando actividade do promotor especifico de células endoteliais, e métodos de utilização dos mesmos e, mais particularmente, para um promotor modificado preproendotelina-1 (PPE-1) que mostra a actividade aumentada e células endoteliais especificas. A presente divulgação relaciona-se ainda com modificações do promotor PPE que aumentam a sua expressão como resposta às condições fisiológicas, incluindo a hipóxia e angiogénese. A terapia genética é uma modalidade emergente para tratar doenças humanas herdadas e adquiridas. Estão a ser direccionados grandes esforços para o desenvolvimento de terapia genética para cancros, doenças cardiovasculares e periféricas, mas existe ainda um grande obstáculo na entrega especifica e eficaz de genes. De um modo geral, o maior factor limitativo da terapia genética com um gene de interesse utilizando um vector virai recombinante como transportador é a capacidade para direccionar especificamente o gene de interesse para o tecido alvo. Os adenovirus que são utilizados para este propósito são capazes de infectar uma grande variedade de células com diferentes afinidades. De facto, utilizar um promotor especifico não tecidular induz até 95% da expressão do gene de interesse no fígado; consequentemente a regulação da expressão é altamente requisitada. Além disso, é actualmente inviável diferenciar entre um endotélio e 1 endotélio vascular em desenvolvimento num tumor em crescimento quando seleccionando um gene.
Quer no desenvolvimento do cancro quer em doenças vasculares, a angiogénese, a criação de novos vasos, desempenha um papel central. Por isso, a regulação deste processo por terapia genética para o endotélio vascular pode ser tremendamente importante para induzir a terapia direccionada para estas doenças. A elevada eficiência da preproendotelina-1 (PPE-1) humana, fornecida pelo vector retroviral, foi obtida em células endoteliais (EC) in-vitro, e modelos animais transgénicos. De qualquer das formas, a técnica anterior não preconiza a utilização deste promotor para a terapia genética in-vivo. Falta ao PPE-1 humano elementos reguladores encontrados nos genes PPE-1 de outros animais mais notoriamente, o rato. A patente dos Estados Unidos 5,747,340 preconiza a utilização do promotor murino PPE-1 e partes do mesmo. No entanto, esta patente não contém nenhuma pista ou sugestão para que um estimulador especifico endotelial possa ser empregue para aumentar o nivel de expressão atingida com o promotor PPE enquanto preservando a especificidade endotelial. Além disso, esta patente não preconiza que o promotor seja induzido para niveis mais elevados de transcrição sob condições hipóxicas.
Existe, portanto, uma necessidade altamente reconhecida para, e será vantajoso ter, um promotor especifico de células endoteliais, métodos melhorados de utilização dos mesmos e células transformadas com o mesmo sem as limitações acima. É esperado que a informação demonstre utilidade acrescida no tratamento de doenças 2 cardiovasculares, cancro e cicatrização de feridas relativas às configurações prévias conhecidas.
RESUMO DA INVENÇÃO
De acordo com um aspecto da presente divulgação é fornecido um polinucleótido funcional isolado como um promotor de células eucarióticas. Os polinucleótidos isolados incluem um elemento potenciador incluindo pelo menos duas cópias da sequência estabelecida na SEQ ID NO:6.
De acordo com outro aspecto da presente divulgação é fornecido um método de expressão de uma sequência de interesse de ácido nucleico codificando uma molécula activa RNA numa proteina tal como uma enzima, molécula repórter e semelhantes em células endoteliais. 0 método inclui administrar a um sujeito um elemento que inclua a sequência de ácido nucleico de interesse posicionada sob controlo regulatório de um promotor funcional em células eucarióticas 0 elemento inclui ainda um elemento potenciador, incluindo pelo menos uma cópia da sequência apresentada na SEQ ID NO:6.
De acordo com ainda outro aspecto da presente divulgação, é fornecido um método de regulação de angiogénese num tecido. 0 método inclui administrar um ácido nucleico incluindo: (a) um promotor endotelial de células específicas; (b) pelo menos uma cópia de um elemento de resposta de hipoxia apresentado na SEQ ID NO: 5; e (c) uma sequência de ácido nucleico que codifica um regulador de angiogénese, estando a sequência de ácido nucleico sob o controlo regulador do promotor e do elemento de resposta à hipóxia. 3
De acordo com ainda outro aspecto da presente divulgação é fornecido um polinucleótido funcional isolado como promotor nas células eucarióticas. 0 polinucleótido isolado inclui um elemento impulsionador incluindo uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 7.
De acordo com um aspecto adicional da presente divulgação, é fornecido um método de regulação da angiogénese num tecido. 0 método inclui a administração de um elemento de ácido nucleico incluindo: a) um promotor especifico de células endoteliais; (b) um elemento impulsionador incluindo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7; (c) pelo menos uma cópia de um elemento de resposta à hipóxia estabelecido na SEQ ID NO: 5; e (d) uma sequência de ácido nucleico codificando um regulador de angiogénese estando a sequência de ácido nucleico sob controlo regulador do promotor, o elemento impulsionador e o elemento de resposta à hipóxia.
De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, é fornecido um polinucleótido isolado funcional como promotor nas células eucarióticas, incluindo o polinucleótido isolado um elemento impulsionador incluindo pelo menos uma cópia da sequência apresentada na SEQ ID NO:8.
De acordo com ainda outro aspecto da presente divulgação, é fornecido um método para expressar uma sequência de interesse nas células endoteliais, incluindo o método a administração de um elemento a um sujeito, incluindo o elemento uma sequência de ácido nucleico de interesse posicionada sob o controlo regulatório de um promotor funcional nas células eucarióticas, e um elemento impulsionador incluindo pelo menos uma cópia da sequência apresentada na SEQ ID NO:8. 4
De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção é fornecido um polinucleótido funcional isolado como um promotor nas células eucarióticas, incluindo o polinucleótido isolado um elemento impulsionador incluindo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8.
De acordo ainda com outras caracteristicas com formas de realização preferidas da divulgação descrita abaixo, o elemento impulsionador inclui 3 cópias da sequência apresentada em SEQ ID NO:6.
De acordo com ainda outras caracteristicas da forma de realização preferida da divulgação de pelo menos duas cópias da sequência apresentada na SEQ ID NO:6 são contíguas.
De acordo com ainda outras caracteristicas em formas de realização preferidas da divulgação do polinucleótido isolado inclui ainda um elemento promotor específico endotelial.
De acordo com ainda outras caracteristicas em formas de realização preferidas da divulgação do elemento promotor específico endotelial incluem pelo menos uma cópia do promotor PPE-1.
De acordo ainda com caracteristicas em formas de realização preferidas da divulgação o polinucleótido isolado inclui ainda um elemento de resposta à hipóxia.
De acordo ainda com outras caracteristicas em formas de realização preferidas da invenção o elemento de resposta à hipóxia inclui pelo menos uma cópia da sequência apresentada em SEQ ID NO: 5. 5
De acordo com outras características em formas de realização preferidas da invenção o elemento melhorador é como indicado na SEQ ID N°: 7.
De acordo com ainda outras caracteristicas em formas de realização preferidas da invenção, é fornecido um composto de ácido nucleico incluindo um referido polinucleótido isolado e uma sequência de interesse de ácido nucleico, estando a sequência de ácido nucleico sob controlo do polinucleótido isolado.
De acordo com ainda outras caracteristicas em formas de realização preferidas a divulgação da sequência de ácido nucleico é seleccionada a partir do grupo consistido de VEGF, p55 e PDGF-BB.
De acordo com ainda outras caracteristicas na forma de realização preferida da divulgação é fornecida uma célula de mamífero transformada com o polinucleótido reivindicado.
De acordo com ainda outras caracteristicas nas formas de realização preferidas da divulgação o promotor mostra a especificidade das células endoteliais.
De acordo com ainda outras caracteristicas nas formas de realização preferidas da invenção o promotor é o PPE-1 conforme apresentado na SEQ ID NO: 1.
De acordo com ainda outras caracteristicas nas formas de realização preferidas da divulgação a administração é afectada por um método seleccionado a partir de um grupo que consiste em: (i) administração sistémica in-vivo; (ii) administração ex-vivo em células removidas a partir de um 6 corpo de um sujeito a subsequente reintrodução das células no corpo do sujeito; e (iii) administração local in-vivo.
De acordo com ainda outras caracteristicas nas formas de realização preferidas da invenção o composto de ácido nucleico inclui ainda um elemento potenciador incluindo pelo menos duas cópias da sequência apresentada na SEQ ID NO: 6.
De acordo com ainda outras caracteristicas da forma de realização preferida da invenção o promotor especifico das células endoteliais incluem pelo menos uma cópia do promotor PPE-1.
De acordo com ainda outras caracteristicas nas formas de realização preferidas da invenção, é fornecido um elemento de ácido nucleico incluindo um polinucleótido isolado reivindicado e uma sequência de interesse de ácido nucleico, estando o ácido nucleico de interesse sob controlo regulatório do polinucleótido isolado.
De acordo com ainda outras caracteristicas na forma de realização preferida descrita o elemento potenciador inclui ainda pelo menos uma cópia da sequência apresentada na SEQ ID NO:6.
De acordo com ainda outras caracteristicas da forma de realização preferida descrita o elemento potenciador inclui uma cópia da sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e pelo menos duas cópias da sequência apresentada na SEQ ID NO: 6.
De acordo com ainda outras caracteristicas descritas nas formas de realização preferidas o elemento potenciador 7 inclui ainda pelo menos uma cópia da sequência apresentada na SEQ ID NO: 6.
De acordo com ainda outras caracteristicas descritas nas formas de realização preferidas pelo menos duas cópias incluem duas cópias.
De acordo com ainda outras caracteristicas nas formas de realização preferidas, o elemento de ácido nucleico inclui ainda um elemento potenciador de pelo menos uma cópia da sequência apresentada na SEQ ID NO:8.
De acordo com ainda outro aspecto da presente divulgação, é fornecido um método para regular a angiogénese num tecido, compreendendo o método a administração de um elemento de ácido nucleico incluindo: (a) um promotor específico de células endoteliais; (b) um elemento potenciador incluindo pelo menos uma cópia da sequência apresentada na SEQ ID NO: 8; e (c) uma sequência de ácido nucleico codificando um regulador da angiogénese, estando a sequência de ácido nucleico sob o controlo regulatório do promotor e elemento potenciador.
De acordo com ainda outras caracteristicas nas formas de realização preferidas descritas, o elemento potenciador inclui ainda pelo menos uma cópia da sequência apresentada na SEQ ID NO:6.
De acordo com ainda outras caracteristicas descritas na forma de realização preferida o elemento potenciador inclui uma cópia da sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e pelo menos duas cópias da sequência apresentada na SEQ ID NO:6. A presente invenção aborda com sucesso as deficiências das configurações conhecidas actualmente fornecendo sequências polinecleotoides isoladas melhoradas com especificidade de células endoteliais e métodos de utilização das mesmas. Os melhoramentos na sequência tornam viáveis métodos de tratamento de uma variedade de doenças, distúrbios e condições que foram previamente consideradas inviáveis. Especificamente, os melhoramentos estão relacionados para a especificidade aumentada das células endoteliais, niveis de expressão aumentados de uma sequência de interesse e uma indução reforçada por condições incluindo isquémia e angiogénese.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A invenção é aqui descrita, apenas como titulo de exemplo, com referência aos desenhos anexos. Com referência especifica agora aos desenhos em detalhe, salienta-se que os elementos são indicados a titulo de exemplo e para fins de discussão ilustrativa das formas de realização preferidas apenas da presente invenção, e são apresentados com o propósito de fornecer o que se acredita ser a mais útil e prontamente compreendida descrição dos princípios e aspectos conceptuais da invenção. A este respeito, nenhuma tentativa é feita para mostrar detalhes estruturais da invenção em maior detalhe do que necessário para uma compreensão fundamental da invenção, sendo a descrição tomada com os desenhos tornando aparente para os peritos na técnica como as diversas formas de invenção podem ser realizadas na prática.
Nos desenhos: 9 A FIG. 1 é um histograma ilustrando o efeito do elemento potenciador da presente invenção na expressão Luciferase quer nas células endoteliais bovinas quer nas células endoteliais humanas usando a linha de célula B2B como um controlo não endotelial. A FIG. 2 é um histograma ilustrando a especificidade endotelial de um promotor da presente invenção num vector adenoviral na expressão Luciferase em várias linhas de células.
As FIGs. 3A e3B são fotomicrográficos ilustrando a expressão GFP sob o controlo de Ad5PPE-l-3X da presente invenção e um Ad5CMV e um elemento de controlo na linha celular BAEC. A FIG. 4 é um histograma da % de apoptose induzida pelo pACPPE-l-3Xp55, pACPPE-l-3XLuciferase e pCCMVp55 nas células endoteliais e não endoteliais. A FIG. 5 é um histograma ilustrando o efeito de introdução de um elemento impulsionador de acordo com a presente invenção num elemento promotor numa resposta de hipóxia. A FIG. 6 é um histograma ilustrando o efeito de introdução um elemento impulsionador de acordo com a presente invenção num promotor de um elemento adeno-vector num elemento de resposta de hipóxia. A FIG. 7 é um histograma que ilustra o efeito de introdução de um elemento impulsionador de acordo com a presente invenção num promotor em niveis de expressão em linhas de células endoteliais bovinas e humanas. 10 A FIG. 8 é um histograma que ilustra niveis de expressão de um gene repórter observado em vários órgãos após injecção de um elemento adenoviral contendo quer um promotor endotelial (PPE-1) ou um promotor de controlo (CMV) ;
As FIGs. 9A-B são dois fotomicrográficos que ilustram a expressão celular de um elemento Ad5CMVGFP (Figura 9a) e um elemento Ad5PPE-l-GFP (Figura 9b) em tecido do figado de ratos injectado com os constructos. A FIG. 10 é um histograma que ilustra o efeito de introdução de um elemento potenciador de acordo com a presente invenção num promotor em niveis de expressão de linhas de células endoteliais e não endoteliais. A FIG. 11 é um histograma que ilustra o efeito da introdução de um elemento potenciador de acordo com a presente invenção num promotor em niveis de expressão em linhas de células endoteliais e não endoteliais.
As FIGs. 12A-C são fotomicrográficos que ilustram a expressão GFP em células transduzidas Ad5PPE-l-3XGFP, células transduzidas, Ad5PPE-lGFP e células transduzidas Ad5CMVGFP.
AS FIGs. 13A-B ilustram a expressão GFP em SMC transduzida através de moi-1 de Ad5PPE-l-3XGFP e Ad5CMVGFP respectivamente.
As FIGs. 14A-B mostram resultados de uma experiência similares às das figuras 13A-B conduzidas em células HeLa.
As FIGs. 15A-B mostram resultados de uma experiência similares às das figuras 13A-B conduzidas em células HepG2. 11
As FIGs. 16A-B mostram resultados de uma experiência similares às das figuras 13a-b conduzidas em células NSF .
As FIGs. 17A-B são fotomicrográficos que ilustram a expressão GFP em células endoteliais de revestimento de um vaso sanguíneo de ratos injectados com os constructos Ad5PPE-lGFP e Ad5PPE-l-3XGFP respectivamente.
As FIGs. 18A-C são fotomicrográficos ilustrando resultados de tecido renal dos ratos injectados. Nos ratos injectados com Ad5CMVGFP (Figura 18A), Ad5PPE-lGFP (Figura 18B; é observada uma expressão ligeiramente mais elevada GFP na parede dos vasos sanguíneos; indicado por uma seta) eAd5PPE-l-3XGFP (Figura 18C).
As FIGs. 19A-C ilustram experiências similares às retratadas nas Figuras 18A-C, conduzidas em secções de tecido de baço.
As FIGs. 20A-D e 20 C'-D' ilustram a expressão GFP em pulmões metastático de ratos de controlo injectados com solução salina (Figura 20A), ratos injectados com Ad5CMVGFP (Figura 20 B) , ratos injectados com Ad5PPE-lGFP (Figura 20 C) e ratos injectados com Ad5PPE-l-3XGFP (Figura 20D). Anti Cd31 imunocoloração (Figuras 20C' a 20D') conformam a co-localização da expressão GFP e expressão CD31 em cada tecido metastático. A FIG. 21 é um histograma ilustrando que a actividade Luciferase (unidades luz/mg proteína) em BAEC transfectada por um plasmídeo contendo o promotor a murina PPE-1 é significativamente mais alto quando as células transfectadas foram incubadas sob condições hipóxicas. 12 A FIG. 22 é um histograma tal como na Figura 21, com a excepção de terem sido empregues Ad5PPE-lLuc e Ad5CMVLuc. A FIG. 23 é uma série de histogramas tal como na Figura 22 mostrando os efeitos da hipóxia em diferentes linhas de células. A FIG. 24 é um histograma que ilustra o efeito de uma sequência 3X da presente invenção na resposta hipóxia PPE-1 nas células BAEC. As células foram transduzidas por Ad5PPE-lLuc e Ad5PPE-l-3XLuc. A FIG. 25 é um histograma que mostra niveis de expressão Luciferase nos ratos transgénicos PPE-l-Luc seguindo a ligação da artéria femoral.
As FIGs. 26A-B são mapas plasmideos de constructos empregues em conjunção com a presente invenção.
As FIGs. 27A-D são uma série de imagens ultra-som de membros ligados de animais representativos de grupos de tratamento diferentes, 21 dias a seguir à ligação. A Figura 27A Controlo, Ad5CMVLuc. Tratado; Figura 27B Controlo, tratado com soro; Figura 27C Ad5PPE-3X-VEGF tratada; Figura 27D Ad5CMV-VEGF tratada. A FIG. 28 é um histograma que ilustra a actividade Luciferase em células endoteliais aórticas bovinas e é um histograma que ilustra a Luciferase em proliferação e em repouso (BAEC) transduzidas com Ad5PPE-lLuc (barras abertas) e Ad5CMVLuc (barras pretas). A FIG. 29 é um histograma que ilustra a actividade Luciferase nas BAEC transduzidas com Ad5PPE-lLuc. Durante a 13 normal proliferação, um estado de repouso e rápida proliferação seguida da adição de VEGF.
As FIGs. 30A-B são histogramas gue ilustram a actividade (unidades luz/mg proteina) nas (Figura 30A) aortas e figados (Figura 30B) de ratos normais injectados C57BL/6, Ad5PPE-lLuc e Ad5CMVLuc. As actividades foram determinadas 1 (n=13) , 5 (n=34) , 14 (n=32), 30 (n=20) e 90 (n=ll) dias após a injecção.
As FIGs. 31A-B são histogramas que ilustram a actividade de Luciferase relativa (unidades luz/mg proteína) detectada cinco (Figura 31A) e quatorze (Figura 31B) (n=10 para cada ponto de tempo) dias após a injecção de Ad5PPE-lLuc (barras abertas) de AdõCMVLuc (barras pretas) em ratos normais BALB/C injectados. A actividade é expressa como uma percentagem da expressão total de Luciferase de Corpo para cada animal. A FIG. 32 é uma imagem da técnica anterior retratando uma Aorta dissecada a partir de ratos deficientes corados a partir de ApoE por Sudan - IV. A aorta torácica contém menos lesão aterosclerótica corada enquanto a região abdominal inclui muitas lesões coradas de vermelho. (Adaptado a partir Imaging of Aortic atherosclerotic lesions by 125I-HDL and 125I-BSA. A. Shaish et al, Pathobiology- submetida para publicação). A FIG. 33 é um histograma que ilustra a actividade absoluta de Luciferase (unidades luz/mg proteína) detectada 5 dias após injecções sistémicas de Ad5PPE-lLuc (barras abertas; n=12) ou Ad5CMVLuc (barras pretas; n=12) para ratos com deficiência de ApoE. A actividade de luciferase observada 14 a partir da aorta abdominal contem lesões de alto nivel e a partir da área torácica (baixos niveis de lesão). A FIG. 34 é um histograma que ilustra actividade absoluta de Luciferase (unidades luz/mg proteína) 5 dias após injecções sistémicas de Ad5PPE-lLuc (barras pretas) ou Ad5CMVLuc (barras abertas) para ratos induzidos com feridas em cicatrização C57BL/6. A FIG. 35 é um histograma que ilustra a actividade de Luciferase num pulmão normal, pulmão metastático e pulmão com tumor primário de Lewis em ratos induzidos com carcinoma de pulmão. 0 carcinoma de pulmão de Lewis foi induzido através da injecção de células D122-96 nas costas para modelo de tumor primário e na planta do pé para modelo metastático. A actividade de Luciferase foi medida 5 dias após injecção sistémica de Ad5PPE-lLuc (n=9; barras abertas) ou Ad5CMVLuc (n=12; barras pretas). A actividade é expressa como unidades luz/mg proteína
As FIGs. 36A-D são fotomicrográficos que ilustram a expressão GFP e morfologia de tecido em pulmões e tumores de ratos portadores de LLC após injecção intra-tumoral de Ad5PPE-lGFP. 0 tecido foi congelado em OCT e seccionado para lOum através de criostato. Todas as fotos foram tiradas em amplificação de 25x. A Figura 36A - GFP em vasos sanguíneos angiogénicos de metástases pulmonares; Figure 36B - CD31 anticorpos imunocorados da secção representada na Figura 36aA; Figura 36C - expressão GFP em vasos sanguíneos de tumor primário; Figura 36D - fase de contraste da secção c de ilustração dos vasos sanguíneos. 15 A FIG. 37 é um histograma que ilustra a expressão de Luciferase num pulmão normal e metastático de ratos induzidos com carcinoma pulmonar de Lewis, injectados com Ad5CMVLuc, Ad5PPE-lLuc e Ad5PPE-l-3X-Luc tendo o carcinoma pulmonar de Lewis sido induzido por células D122-96 injectadas na planta do pé para o modelo metastático. A actividade Luciferase foi medida cinco dias após injecção sistémica de Ad5CMVLuc (n=7;barras pretas), Ad5PPE-lLuc (n=6;barras cinzentas), ou Ad5PPE-l-3XLuc (n=13;barras castanhas). A actividade é expressa como(unidades luz/mg proteina). A FIG. 38 é um histograma ilustrando a actividade de Luciferase como percentagem de actividade hepática é (onde o figado é 100%), em ratos induzidos em pulmão normal e pulmão metastizados induzido com carcinoma de Lewis injectados com Ad5CMV, Ad5PPE-lLuc e Ad5PPE-l(3X). A FIG. 40 é um histograma que ilustra a actividade de
Luciferase (unidades luz/mg proteina) em músculos (isquémicos e normais) de PPE-1 Luciferase em ratos transgénicos aos dois, cinco, dez e 18 dias após ligação femoral e em controlo (animais não ligados - dia 0; n=8 para cada grupo). A FIG. 41 é um histograma que ilustra a actividade de
Luciferase (unidades luz/mg proteina) no figado, pulmão e aorta em músculos (isquémicos e normais) de Luciferase de ratos transgénicos PPE-1 aos 5 (n=6), dez (n=6) e 18 (n=8) dias após ligação femoral e em controlo (animais não ligados - dia 0) . A FIG. 42 é um histograma que ilustra a actividade de
Luciferase, (unidades luz/mg proteina) detectada nos 16
LLC fígados, pulmões e tumores primários de ratos injectados em tumores primários com Ad5CMVLuc (barras pretas) ou Ad5PPE-lLuc (barras abertas).
DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS A presente invenção é de um promotor específico melhorado de células endoteliais que pode ser empregue para direccionar de forma confiável expressão de alto nível de uma sequência de interesse para as células endoteliais e em particular células endoteliais que participam na angiogénese.
Os princípios e utilização da presente invenção podem ser melhor compreendidos com referência aos desenhos e descrições em anexo.
Antes de explicar pelo menos uma forma de realização da invenção em detalhe, é preciso compreender que a invenção não está limitada na sua aplicação aos detalhes de construção e arranjo dos componentes apresentado na seguinte descrição ou ilustrados nos exemplos e desenhos. A invenção é capaz de outras formas de realização ou de ser praticada ou levada a cabo em variadas formas. Também, deverá ser entendido que a fraseologia e terminologia aqui empregues é para efeitos da descrição e não deverá ser considerada como limitativa.
Embora os promotores endoteliais específicos tenham sido previamente descritos (exemplo patente dos Estados Unidos 5,747,340) estes promotores têm sido tipicamente ineficientes na direcção da expressão de células endoteliais ou não foram demonstradas como sendo células específicas endoteliais in-vivo. 17
Elementos potenciadores específicos para células endoteliais têm também sido descritos. Bu et al. (J.Biol Chem. (1997) 272(19): 32613-32622) demonstraram que três cópias (3X) do IX elemento potenciador de PPE-1 (contendo elementos ETE-C, ETE-D, e ETE-E) dota as sequências promotoras de células endoteliais de especificidade in-vitro, embora tal actividade não tenha sido demonstrada in-vivo.
Como é bem conhecido na técnica, as experiências in-vitro não podem prever de forma fiável os resultados in-vivo. Como tal, temos os resultados apresentados por Bu et al., embora a sugestão de especificidade de células endoteliais não forneça prova suficiente para a utilidade do elemento potenciador 3X in-vivo. A falta de estudos in-vivo também nos leva à questão da especificidade das células endoteliais do elemento potenciador 3X em organismos inteiros. A falta desta informação implica que a aplicação terapêutica deste elemento seja questionável, pois quando empregue in-vivo, e em particular quando empregue para a regulação da angiogénese, é imperativo que a expressão do regulador de uma angiogénese (por exemplo, a toxina da célula) seja direccionada especificamente para as células endoteliais, preferencialmente num conjunto sub-específico de células endoteliais que estão envolvidas em angiogénese.
Conforme ilustrado nos exemplos da secção que se segue, os presentes inventores, através de experimentação laboratorial, forneceram, pela primeira vez, provas conclusivas da actividade in-vivo do elemento potenciador 3X. Tais provas identificam o elemento potenciador 3X e os derivados da sua sequência (por exemplo, SEQ ID NO:7) como 18 altamente adequado para utilização em aplicações terapêuticas.
Além disso, ao trazer a presente invenção para a prática foi descoberto que uma configuração novidade da sequência do elemento potenciador PPE-1 da presente invenção dota as sequências promotoras com uma actividade inesperada e altamente especifica nas células endoteliais que participam na angiogénese.
Assim, de acordo com um aspecto da presente invenção é fornecido um polinecleotoide funcional como um promotor especifico num mamífero tal como um ser humano. 0 polinucleótido inclui um elemento potenciador incluindo uma ou mais cópias da sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e preferencialmente uma ou mais cópias da sequência apresentada na SEQ ID NO: 8, que tal como ilustrado na secção de exemplos que se segue, desempenha um papel importante na regulação da expressão das células endoteliais participantes na angiogénese.
Uma nova e específica configuração de sequência de um elemento potenciador utilizável pela presente invenção é ilustrado na SEQ ID NO:7.
Para efeitos desta especificação e as reivindicações que a acompanham, o termo "potenciador" refere-se a qualquer sequência polinucleótida que aumente a eficiência transcricional de um promotor.
De acordo com algumas formas de realização da invenção, os polinucleótidos isolados incluem cópias contíguas de SEQ ID NOs: 6 e/ou 8. Tais sequências são preferencialmente 19 posicionadas numa orientação head-to-tail, embora o elemento potenciador da presente invenção possa também incluir uma ou mais cópias de uma porção especifica da sequência SEQ ID NO:6 ou 8, numa orientação invertida, por exemplo, através da utilização de sequências complementares à SEQ ID NO:6 ou 8 na construção do elemento potenciador.
Preferencialmente, o polinucleótido isolado inclui ainda um elemento promotor especifico de sequência de células endoteliais. Para efeitos desta especificação e as reivindicações que a acompanham, o termo "impulsionador" refere-se a qualquer sequência polinucleótida capaz de mediar a transcrição RNA de uma sequência de interesse a jusante. 0 elemento promotor especifico pode incluir, por exemplo, pelo menos uma cópia do promotor PPE-1.
Preferencialmente, o polinucleótido isolado inclui ainda um elemento de resposta à hipóxia, por exemplo de pelo menos uma cópia da sequência apresentada na SEQ ID NO: 5.
Assim, de acordo com este aspecto da presente invenção, é fornecido um promotor especifico de células endoteliais que inclui várias configurações de elementos potenciadores.
Será apreciado que as sequências do elemento potenciador podem ser posicionadas dentro da sequência de promotor usada , a montante do promotor, entre o promotor e uma sequência de interesse ou dentro da sequência a jusante ou dentro da sequência de interesse (e.g., intrão). A sequência isolada de ácido nucleico da presente invenção pode ser utilizada para regular a expressão genética em tecido eucariótico. E em particular, na proliferação de 20 células endoteliais, por exemplo células endoteliais envolvidas em angiogénese.
Assim, a seguência polinucleótida isolada da presente invenção pode ser fornecida, nalguns casos, como parte de um composto de ácido nucleico incluindo ainda uma seguência de interesse de ácido nucleico gue está posicionada sob o controlo regulatório do polinecleotoide isolado da presente invenção. Será apreciado gue tal composto de ácido nucleico possa ainda incluir guaisguer seguências polinecleotoides tais como por exemplo, seguências de codificação de marcadores de selecção, origem de replicação na bactéria, ou seguências gue codificam os polipeptídeos repórter. Tal componente de ácido nucleico é preferencialmente configurado para expressão de células mamíferas e pode ser de origem virai. Numerosos exemplos de compostos de ácidos nucleicos adequados para expressão de mamíferos são conhecidos na técnica; a secção de exemplos que se segue proporciona detalhe posterior de vários compostos referidos.
Para efeitos desta especificação e das reivindicações que a acompanham, a frase "sequência de interesse" refere-se a qualquer sequência de ácido polinucleico que tenha a capacidade de ser transcrita por uma polimerase de ARN. Esta definição inclui sequências codificáveis traduzíveis para polipeptídeos, assim como uma sequência para ARN anti-sentido, ARN que se liga a ADN, ribossomas e outras porções moleculares que não se destinam a sofrer translação. Exemplos de sequência de ácido nucleico de interesse que possam ser utilizadas pelo composto de acordo com a presente invenção são fornecidas aqui abaixo e nas secções de exemplo que se seguem. 21
Os exemplos apresentados adiante ilustram que os promotores específicos de células endoteliais da presente invenção podem dirigir de forma confiável a expressão de um gene repórter para o tecido endotelial após administração sistémica in-vivo. Estes exemplos mostram ainda, pela primeira vez, que o polinecleotoide isolado da presente invenção pode ser usado para expressar preferencialmente uma proteina repórter (GFP) em tecido aterosclerótico e/ou angiogénico, fornecendo assim pela primeira vez, prova directa da importância do elemento potenciador PPE-1 e seus derivados em aplicações terapêuticas.
Enquanto utiliza uma proteina repórter, tal como GFP, pode haver utilidade na detecção de estádios precoces do crescimento de tumor metastático, especialmente em modelos animais ou para imagens não-invasivas de metástases (Yang, M. et al., Proc. Nat. Acad. de Sei. (2001) 27:2616-2621) e tal utilização é apenas uma pequena porção da utilidade projectada da invenção reivindicada. Acredita-se que, por exemplo, que AdPPE-lGFP pode ser usado em combinação com AdPPEltk, AdPPE-lp55 e/ou outros tratamentos anti-angiogénicos, de forma a seguir e tratar angiogénese real através de um método relativamente não-invasivo. A substituição do gene repórter GFP com um factor de indução apoptose (por exemplo p55; GenBank accession M75866) num composto de, por exemplo, AdPPE-l-3X-p55 prevê-se que atinja de forma confiante a apoptose de células endoteliais que proliferam rapidamente em vasos sanguíneos angiogénicos em crescimento de um tumor. Pelo facto de tal vector poder ser administrado sistemicamente, pode ser empregue para induzir eficazmente a apoptose no desenvolvimento de focos metastáticos, sem descobrir a localização desses focos. Tal utilização representa uma 22 melhoria significativa em comparação com a prática da técnica anterior. Tal utilização representa uma melhoria significativa na comparação com a técnica anterior. Ao induzir a apoptose especificamente no desenvolvimento da vasculatura, é viável eliminar a angiogénese.
Pode ser usada uma abordagem oposta para revascularizar o tecido, por exemplo em pacientes ateroscleróticos ou em pacientes que tenham sofrido dano significativo da circulação periférica como resultado de doença ou ferimento. Neste caso, pode ser empregue um composto do tipo AdPPE-l-3X-GF, onde GF é um factor de crescimento (por exemplo citoquina) ou modificantes da mesma (por exemplo., AdPPE-l-SEQ ID N0:7-GF). Factores de crescimento adequados para utilização neste contexto incluem, mas não estão limitados a, VEGF (GenBank accession M95200) e ratos PDGF-BB (GenBank accession; 99% identidade AF162784) e EGR-1 (GenBank accession M22326) FGFs (incluindo mas não limitados a GenBank accession XM 003306) e combinações dos mesmos.
Será apreciado que a incorporação do elemento de resposta de hipóxia (por exemplo SEQ ID NO: 5) dentro da sequência de promotor da presente invenção pode ser utilizada para impulsionar ainda mais a expressão de selectividade para os tecidos isquémicos, levando assim à neovascularização dos tecidos seleccionados. Como o fornecimento de sangue melhora, a isquémia é aliviada, o elemento de resposta da hipóxia deixa de ser induzido, os niveis de GF baixam e o processo de neovascularização é parado.
As sequências promotoras geradas de acordo com os ensinamentos da presente invenção são particularmente úteis em regular a angiogénese num tecido. Conforme ilustrado na 23 secção de exemplos que se segue a sequência 3X modificada (SEQ. ID. NO:7) contendo uma sequência promotora da presente invenção e do promotor PPE-1 não modificado são ambos expressos em focos metastizados do modelo LLC. Contudo o exemplo 22 ilustra claramente que a sequência 3X modificada é especificamente responsável quer numa diminuição nos niveis de expressão do gene repórter num pulmão normal quer num um aumento dramático na expressão do gene repórter em focos metastizados. Não existe dica ou sugestão na técnica anterior de que tal resultado possa ser atingido. Assim, a utilização de um composto incluindo o elemento 3X num contexto de terapia genética pode ser esperado para maximizar a entrega a tumores enquanto minimizando os efeitos tóxicos no tecido normal circundante. Significativamente, isto é verdadeiro mesmo se o tecido circundante contenha um componente endotelial, conforme ilustrado na Figura 37. Isto é porque, tal como demonstrado no exemplo 11, a sequência 3X aumenta grandemente o nivel de expressão no tecido endotelial proliferante, mesmo no contexto do promotor PPE-1.
Por exemplo, o gene p55 pode ser utilizado em conjunto com um promotor da presente invenção contendo uma elemento de resposta de hipoxia de modo a induzir especificamente a apoptose em tumores em crescimento. Tal estratégia é considerada viável porque uma massa tumoral tende a em direcção à isquémia à medida que o crescimento do tumor excede muitas vezes a capacidade antigénica do tecido circundante. Outras toxinas celulares expressáveis que possam ser utilizadas ao longo da sequência promotora da presente invenção de modo a reduzir especificamente uma massa tumoral incluindo mas não limitada a, outros genes pró-apoptóticos, o Herpes simplex do gene da timidina cinase (HSV-tk; incluídos no vector de expressão de pORF- 24 HSVltk disponível a partir InvivoGen, San Diego, CA) , a angiostatina (número de acesso Genbank X05199), endostatina (número de acesso Genbank M33272) e angiostatina-endostatina quimera (incluída no vector de expressão de pORF-HSVltk disponível a partir InvivoGen, San Diego, CA).
Alternada ou adicionalmente, os genes da angiostatina ou endostatina podem ser usados em conjunto com um promotor da presente invenção de modo a bloquear especificamente a angiogénese sem induzir a apoptose.
Assim, de acordo com formas de realização alternadas, a angiogénese pode ser estimulada ou bloqueada. Esta flexibilidade irá permitir várias utilizações da invenção incluindo, mas não limitado à redução da massa tumoral e revascularização das regiões ateroscleróticas do coração ou neovascularização dos tecidos periféricos com um fornecimento inadequado de sangue. Um cenário clinicamente relevante é a utilização de um promotor de acordo com a presente invenção para gerar novos vasos sanguíneos em membros de doentes diabéticos. 0 composto de ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser administrado a um sujeito (mamíferos, preferencialmente humanos) ou numa composição farmacêutica onde é misturado com veículos ou excipientes adequados.
Como aqui utilizado, um "composto farmacêutico " refere-se à preparação de um ou mais dos ingredientes activos descritos aqui com outros componentes químicos tais como veículos e excipientes fisiologicamente adequados. 0 propósito de um composto farmacêutico é o de facilitar a administração de um composto num organismo. 25
Aqui o termo "ingrediente activo" refere-se ao composto responsável pelo efeito biológico.
Doravante, as frases "veiculo fisiologicamente aceitável" e "veiculo farmaceuticamente aceitável" que podem ser utilizadas de forma inter-cambiável referem-se a um veiculo ou a um diluente que não cause irritação significativa a um organismo e não revogue a actividade biológica e propriedades do composto administrado. É incluído um adjuvante sob estas frases.
Aqui o termo "excipiente" refere-se a uma substância inerte adicionada à composição farmacêutica para facilitar ainda mais a administração dos ingredientes activos. Exemplos, sem limitação, de excipientes incluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares e tipos de amido, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais e polietilenoglicóis.
As Técnicas para formulação e administração de drogas podem ser encontradas em "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, última edição.
As Composições farmacêuticas da presente invenção podem ser fabricadas através de processos bem conhecidos na técnica, por exemplo através de meios de mistura convencional, dissolução, granulação, confecção de drageias, levigação, emulsão, encapsulação, aprisionamento ou liofilização de processos.
As composições Farmacêuticas para utilizar de acordo com a presente invenção assim sendo formuladas em formas convencionais usando um ou mais veículos fisiologicamente aceitáveis compreendendo excipientes e auxiliares, que 26 facilitam o processamento dos ingredientes activos em preparações que, podem ser usadas farmaceuticamente. A formulação correcta depende da forma de administração escolhida.
Para a injecção, os ingredientes activos da composição farmacêutica podem ser formulados em soluções aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como solução de Hank, Solução de Ringer ou tampão de soro fisiológico. Para administração transmucosal, são usados na formulação penetrantes apropriados à barreira a ser permeada. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica.
Será apreciado que o polinucleótido isolado da presente invenção tenha sido isolado baseado na sua capacidade de promover e impulsionar a transcrição em células eucarióticas. Será apreciado que o polinecleotoide isolado da presente invenção foi isolado baseado na sua capacidade de promover ou impulsionar a transcrição em células eucarióticas numa linhagem endotelial. Portanto uma célula de mamífero transformada por um polinucleótido isolado é uma forma de realização adicional da invenção. Numerosos exemplos de tais células transformadas são fornecidos nos exemplos recitados infra.
Enquanto os exemplos infra lidam especificamente com a utilização de sequência 3X em conjunção com o promotor PPE-1, antecipa-se que a sequência impulsionadora da presente invenção irá também exercer um efeito específico quando usado com outros promotores de sequência eucarióticos.
Tal antecipação é baseada em achados da técnica anterior que mostram que elementos potenciadores são muitas vezes 27 portáteis isto é, podem ser transferidos desde uma sequência promotora para outra e ainda manter a actividade. Para exemplos, ver D. Jones et al. (Dev. Biol. (1995) 171 (1) : 60-72) ; N. S. Yew et al, (Mol. Ther. (2001) 4:75-820) eL. Wu. et al. (Gene Ther. (2001) 8;1416-26). De facto, o trabalho prévio de Bu et al. (J.Biol Chem. (1997) 272(19): 32613-32622) sugere fortemente que os elementos potenciadores relacionados aos da presente invenção, por exemplo potenciadores incluindo SEQ ID NO: 6 podem ser utilizados com promotores construtivos, por exemplo o promotor SV-40. Como tal, os compostos contendo métodos empregues e polinucleótidos isolados incluindo um promotor eucariótico modificado para incluir a sequência impulsionadora da presente invenção estão dentro do âmbito da invenção reivindicada.
Assim, é postulado que uma configuração minima de um elemento impulsionador de acordo com a presente invenção é um polinecleotoide conforme apresentado na SEQ ID NO: 8. Antecipa-se que este impulsionador funcione com uma ampla variedade de promotores incluindo mas não limitado a promotores endoteliais especificos (por exemplo PPE-1; SEQ ID NO.: 1) e promotores constitutivos, promotores virais tais como aqueles derivados a partir de CMV e SV-40. Este impulsionador deverá ser capaz de transmitir especificidade endotelial a uma ampla variedade de promotores. O elemento impulsionador pode ser aumentado, por exemplo, por adição de uma ou mais cópias da sequência apresentada na SEQ ID NO: 6. Estas sequências adicionais podem ser adicionadas contiguamente ou não contiguamente à sequência da SEQ ID NO.: 8. A presente invenção inclui ainda um método de expressar uma sequência de ácido nucleico de interesse em células 28 endoteliais empregando um composto que depende de um elemento potenciador, incluindo pelo menos uma cópia da sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e um promotor para direccionar expressão de alto nivel da sequência de interesse especificamente para as células endoteliais.
Como usado aqui "administração ex-vivo para células removidas a partir de um corpo de um sujeito e subsequente reintrodução das células no corpo do sujeito" inclui especificamente a utilização de células estaminais conforme descrito em ((Lyden et al. (2001) Nature Medicine 7:1194-1201) .
Enquanto os adenovirus são empregues nas experiências descritas nos exemplos apresentados infra, os compostos da presente invenção podem ser facilmente adaptados por aqueles peritos na arte, para outros sistemas de entrega virais .
Objectos adicionais, vantagens e novas caracteristicas da presente invenção tornar-se-ão aparentes para um perito comum na técnica mediante exame dos seguintes exemplos, que não se destinam a ser limitativos. Adicionalmente, cada uma das variadas formas de realização e aspectos da presente invenção conforme delineado acima e conforme reivindicado na secção de reivindicações infra encontra suporte experimental nos exemplos que se seguem.
EXEMPLOS É feita agora referência aos seguintes exemplos, que em conjunto com as descrições acima, ilustram a invenção numa maneira não limitativa. 29
Geralmente, a nomenclatura aqui usada e os procedimentos de laboratório utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e recombinantes de ADN. Tais técnicas são minuciosamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, "Molecular
Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American
Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A
Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias apresentadas nas U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 4,683,202;
4,801,531; 5,192,659 e 5,272,057; "Cell Biology: A
Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994) ; Stites et al. (eds), "Basic and Clinicai Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); imunoensaios disponíveis são amplamente descritas na literature científica e patentes ver, por exemplo, U.S. Pat. Nos. 3,791,932;3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345;4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 and 5,281,521; "Oligonucleotide
Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, 30
IRL R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317,
Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). Outras referências gerais são fornecidas ao longo deste documento. Pensa-se que os conhecimentos ai são bem conhecidos na técnica e são fornecidos para conveniência do leitor.
Especificamente, experiências conduzidas com os exemplos recitados infra empregaram os seguintes métodos e materiais
Materiais e Métodos
Cultura celular
Carcinoma pulmonar de Lewis - (D122-96) (gentilmente cedido pelo Prof Eisenbach L., The Weizmann Institute of Science Rehovot, Israel), rim embrionário humano (293) e as células HeLa foram cultivadas em 4.5gr / 1 de DMEM , suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) , 50 U / ml de penicilina, 50 ug / ml de estreptomicina e glutamina 2 mM (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel). Células endoteliais aórticas bovinas - BAEC (gentilmente cedido pelo Prof N. Savion, Goldshlager Institute, Sheba Medicai Center, em Tel-Hashomer, Israel), fibroblastos da pele Normal - NSF, HepG2 e células endoteliais de umbilical humano - HUVEC-304 (ATCC, EUA) foram cultivadas em 1.0 gr/1 DMEM (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel), suplementado com 5% de FCS, 50 U/ml de penicilina, 50 ug / ml de estreptomicina e 2 mM de glutamina. As células BAEC 31 com factor de foram suplementadas com factor de crescimento de fibroblastos completo (Sigma, St. Louis. MO.). RINrl046-38 (RIN-38) foram cultivadas em 199 sais de Earle (5.5mM Glicose) meio suplementado com 5% de FCS (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel), 50U de penicilina/ml, 50 ug de estreptomicina / ml e glutamina 2 mM. "HepG2" como agui usado refere-se a ATCC-HB-8065. 'HeLa" como aqui usado refere-se a ATCC-CCL-2. "As células Epiteliais Brônquicas Humanas" e "B2B" conforme aqui utilizado refere-se a ATCC-CRL-9609. "HUVEC" e " células endoteliais de veia umbilical Humana " como utilizado aqui refere-se a ATCC-CRL-1730. "CHO" e "Ovário de Hamster Chinês" como usado aqui ATCC-61.
Indução de Hipóxia
Vinte e seis horas após as células de transfecção ou transdução terem sido incubadas numa câmara isolada que foi lavada durante 30 minutos por um fluxo de gás contendo 0.5%O2, 5%C02, equilibrado por N2, câmara isolada foi colocada numa incubadora humidificada 5% CO2, 37°C. A actividade da luciferase em células e tecidos
Para ensaiar a actividade do promotor PPE-1 quantitativamente in-vitro e in-vivo, foi utilizado um kit de sistema de expressão do gene da luciferase (Promega Corp., Madison, WI). Quarenta e oito horas após a 32 transfecção ou transdução foram lavadas e 200ml de tampão de lise foi adicionado durante 15 minutos. Lizados de células foram recolhidos e centrifugados durante 15 minutos (14,000rpm) a 4°C. Subsequentemente foram adicionados lOml do sobrenadante a 50ml do tampão de ensaio da Luciferase. A actividade foi medida num luminimetro durante um periodo de 20 segundos.
Para ensaiar a actividade da Luciferase num tecido sólido, foi excisada uma amostra de 20mg e homogeneizada em lml de solução de homogeneização e centrifugada por 15 minutos (14,000rpm) a 4°C, e 10 ml do sobrenadante foram ensaiados por actividade de Luciferase, conforme descrito acima. Os resultados foram expressos como unidades de luz de luciferase por 1 mg de proteina. A proteina foi medida usando o ensaio de Bradford com albumina de soro bovino (BSA) como padrão.
Actividade GFP in-vitro e in-vivo
Para testar a expressão GFP in-vitro, as células foram lavadas duas vezes com PBS e foram fixadas durante 30 minutos com 4% de paraformaldeido feito de fresco em PBS. Após a fixação foi feita a examinação através de microscópio fluorescente.
De modo a testar a distribuição celular dos genes in-vivo, os tecidos foram fixados em 4% de paraformaldeido feito de fresco num tampão de fosfato 0.1 M durante 6 horas a 40°C, embebido durante a noite em 30% de sucrose a 4°C e congelado num composto OCT (Sakura, USA). Os blocos de tecido foram cortados por um criostato a uma grossura de 10 mm e observado directamente sob microscópio fluorescente, (filtro FITC ) . 33 Células proliferantes e quiescentes
De modo a comparar a actividade do promotor PPE-1 em células BAEC proliferantes e quiescentes, as células foram divididas em dois grupos: 1. Células proliferativas - a crescer e infectar em 10% FCS media. 2. Células quiescentes - a crescer e infectar em meio livre de soro começado 72 horas anteriores à transdução.
Todas as células foram cultivadas numa incubadora humidificada, 5% CO2, 37°C.
Preparação de adenovirus recombinantes deficientes na replicação.
Foram construídos vários adenovirus recombinantes deficientes na replicação (tipo 5) . Uma cassete de expressão, incluindo a murina promotora preproendotelina-1 (PPE-1) (SEQ ID NO:l) localizada a montante do gene luciferase (originado a partir de pGL2-básico GenBank número de acesso X65323) e o local poliA do SV40 (originada a partir de pGL2-básico GenBank número de acesso X65323) foi ligado ao sítio de restrição BamHI do pPAC.plpA (constructo sem promotor) . O gene da GFP (originado a partir de pEGFP, número de acesso GenBank AAB02572) foi ligado ao promotor de PPE-1 no local de restrição Notl. Os adenovirus recombinantes deficientes na replicação designada Ad5PPE-lLuc ou Ad5PPE-lGFP foram preparados por co-transfecção de-pPACPPE-ILUC ou Ad5PPE-lGFP com o plasmídeo pJM17 adenovirus, tal como descrito por Becker, T.C. et al. (Methods Cell biol. 43, Roth M. (ed.). New York. Academic Press., 1994, pp 161-189), seguido de colheita de partículas virais recombinantes. 34
Os virus foram preparados para produção em larga escala. Os stocks virais foram armazenados a 4°C a uma concentração de 109-1012 unidades formação de placa/ml (pfu/ml). Os virus Ad5CMV-Luc (gentilmente cedidos por R. Gerard de UTSw Dallas, Texas) e Ad5CMV-GFP (Biotecnologias quantum, Carlsbad, Canada) contendo o citomegalovirus (CMV) promotor precoce imediato (GenBank Accession no U47119) foi preparado para preparação em larga escala como descrito para os vectores virais de PPE-1 e foram usados como um controlador especifico de não tecido.
Modificações do promotor PPE. 0 promotor murino Modificado PPE-1 foi desenvolvido através da Inserção de Três Cópias de elemento de Transcrição positivo Descoberto POR Bu et al (J. Biol Chem (1997) 272 (19):. 32613-32622) na restrição Nhel local da enzima localizada a jusante (-286bp) à Base pares elemento positivo 43 endógena (-364 a -320 pb). O fragmento potenciador aqui denominado "3X" é uma cópia em triplicado de um elemento de sequência endógena (coordenadas de nucleótidos 407-452 da SEQ ID NO: 1) que a PPE-1 murino promotor. Foi previamente mostrado que a indução de actividade do promotor PPE-1 em células endoteliais vasculares depende da presença deste elemento Bu et al (J. Biol Chem (1997) 272 (19):. 32 613-32 622). O fragmento 3X foi sintetizado usando dois ADN de cadeia simples complementares, fios de 96 pares de base de comprimento (indústrias de biotecnologia; Nes Tziona, Israel) , (SEQ ID NO: 2 e 3) . Os dois únicos fragmentos de ADN de cadeia simples foram emparelhados e cheios utilizando fragmento de Klenow (NEB), o ADN de cadeia dupla 35 resultante foi de 145 pares de bases de comprimento e inclui locais de restrição Nhe-1 (SEQ ID NO: 4). 0 fragmento de 3X foi ligado ao murino PPE-1 a jusante do promotor endógeno Nhe-1 usando ligase T4. A construção resultante foi propagada em células DH5a e foi produzida uma preparação de plasmideo em larga escala usando o kit Qiagene maxi-prep.
Plasmideo Adicional do tipo selvagem promotor PPE-1
É originada a cassete de PPE-1 luciferase (5249bp) contendo 1.4kb de promotor murino do preproendotelina-1 (PPE-1), do gene de luciferase com um Sinal SV40 poliA (GenBank número de acesso X 65323) local e o primeiro intrão do gene murino ET-1 é originado a partir da pEL8 plasmideo (8848bp) usado pelo Harats et al (J. Clin. Inv.(1995) 95:.. 1335-1344). A cassete de PPE-l-luciferase foi extraída do plasmideo pEL8 usando a enzima de restrição BamHI, seguindo por extracção do fragmento de ADN a partir de um gel de agarose a 1% usando um kit de extração (Qiagen, Hilden, Alemanha).
0 plasmideo promotor menos pPAC.plpA 0 plasmideo promotor menos pPAC.plpA (7594bp) contendo sequências do adenovirus tipo 5 foi originado a partir do pPACCMV.pLpA (8800bp). 0 promotor de CMV, o local de clonagem múltipla e o sítio de poliadenilação de SV40 (1206 bp) , foi eliminado pela enzima de restrição Notl, O ADN fragmentado foi extraído a partir de gel de agarose a 1%. O plasmideo linear (7594 bp) foi preenchido pelo fragmento de Klenow e BamHI e foi ligado ao ligante de kit de ligação rápida de ADN em ambas as extremidades coesivas. O plasmideo linear foi re-ligado pela ADN ligase de T4 e 36 transformada em células competentes DH5a, a fim de amplificar o pPAC.plpA com os locais de restrição BamHl. 0 plasmideo foi preparado para a preparação e purificado em grande escalapor kit de purificação de ADN prep maxi. 0 plasmideo Luciferase pPACPPE-1 0 plasmideo pPACPPE-ILuciferase foi construído inserindo a cassete PPE-l-Luciferase no local de restrição BamHl do plasmideo pPAC.plpA, através da utilização da T4 ADN ligase. 0 plasmideo foi subsequentemente utilizado para transformar as células competentes DH5a. 0 plasmideo (12843bp) foi preparado para uma preparação em larga escala e purificado pelo kit de purificação maxi prep ADN.
Plasmideo pPACPPE-lGFP 0 plasmideo pPACPPE-lGFP foi construído através da sub-clonagem do gene GFP (originado a partir de pEGFP, GenBank accession number AAB02572) a jusante do promotor PPE-1 no sítio de restrição Notl, através de T4 ADN ligase. 0 plasmideo foi subsequentemente utilizado para transformar as células competentes DH5a. 0 plasmideo (11,801 bp) foi preparado para uma preparação em larga escala e purificado pelo kit de maxi prep ADN.
pACPPE-13X Luciferase e plasmídeos pACPPE-13X GFP
O pPACPPE-l-3XLuciferase e o plasmideo pPACPPE-l-3XGFP foram construídos através da inserção do PPE-l-3XLuc ou cassete PPE-1-3XGFP digerida pela enzima de restrição BamHl a partir de pEL8-3X (Figura 26B) contendo Luc ou GFP no local de restrição BamHl do plasmideo pPAC.plpA. O pEL8-3X 37 contém o promotor murino modificado PPE-1 (1.55kb) (vermelho) - localizado entre BamHI e Notl que contém o impulsionador triplicador especifico endotelial 3X (como apresentado na SEQ ID NO.: 7) localizada entre dois locais Nhel. 0 promotor, a Luciferase ou o gene GFP , os múltiplos locais SV40 poly A e o primeiro intrão do gene de gene da endotelina-1, todas a um denominado PPE-1 promotor modificado foi digerido e extraído por enzima de restrição BamHI, como descrito em materiais e métodos. Os plasmídeos (12843bp) foram preparados para a preparação em grande escala e purificado por meio de kit de purificação de ADN maxi prep.
Experiência In-vitro, transdução ADN
As células foram colocadas em pratos de 16 mm 24 horas antes da transdução. A transdução de ADN de BAEC (Células Endoteliais de Aorta bovina), HUVEC (células endoteliais de veia umbilical humana), LLC (carcinoma pulmonar de Lewis) e RIN (Rato in-sulinoma), HepG2, HeLa e fibroblastos de pele normal (NSF) foi realizada através da incubação de cada linha de célula com multiplicidade de infecção 1, 5 e 10 (moi) de Ad5PPE-lLuc for 4 h num volume total de meio de cultura de 500 ml, seguido de incubação com o meio de cultura num volume total de seguida de incubação 2 ml por 48 horas. A Ad5CMVLuc foi usada como controlo específico de não tecido.
Animais
Todos os procedimentos animais forma aprovados pelo "Animal Care and Use Committee " do centro médico de Sheba, Tel-Hashomer. 38
Foram usadas diferentes estirpes de ratos: (i) Masculino, 3 meses de idade, ratos Tipo Selvagem C57BL/6 (quintas Harlan, Jerusalém, Israel). (ii) Masculino, 3 meses de idade, Tipo ratos BALB / C (quintas Harlan, Jerusalém, Israel). (iii) masculinos e femininos 6 meses gene ApoE deficientes ratos híbridos de C57BL/6xSJ129 camundongos (Plump AS. et al. Cell (1991) 71:343-353). (iv) macho e fêmea 3 meses de idade sobre-expressando o gene da luciferase sob o controlo de um murino PPE-1 promotor (5.9Kb), gerado pelo Harats et al. (J. Clin. Inv. (1995)95: . . 1335-1344) .
Todos os ratos cresceram no Instituto de Investigação de Lípidos e Aterosclerose.
Pressão de Tecido Genético em ratos normais
Para ensaiar a eficiência e especificidade do tecido, IO10 pfu/ml de Ad5PPElLuc ou Ad5CMVLuc (como o controle não-tecido específicos), foram suspensos em 100 ml de soro fisiológico injectado na veia da cauda do rato conforme descrito acima. A actividade Luciferase foi ensaiada 1, 5, 14, 30 e 90 dias pós injecção. Para localizar a distribuição celular dos genes repórter expressos, Ad5PPE-1GFP ou Ad5CMVGFP (IO10 pfu/ml em 100 ml de soro fisiológico) foram injectados na veia de ratos normais, masculinos, de 3 meses de idade C57BL/6. A expressão GFP foi detectada 5 dias pós injecção. Todos os ratos aparentaram star saudáveis e não foi notada toxicidade ou inflamação no fígado ou outros tecidos.
Actividade GFP nos tecidos 39
Para testar a distribuição celular do gene entregue in-vivo, amostras simples de tecido dos ratos injectados foram fixadas em 4% para formaldeido feito de fresco em 0.1 M tampão de fosfato por 6 horas a 4°C, embebido durante a noite em 30% de sucrose a 4o C e congelado num composto OCT (Sakura, Califórnia, USA). Os blocos de tecido foram fatiados a uma grossura de 10 mm e observados directamente sob microscópio fluorescente (filtro FITC).
Implantação de Tumor
As células de carcinoma pulmonar de Lewis (LLC) foram colhidas com tripsina/EDTA, lavadas 3 vezes com PBS e contadas com 0.1% trypan blue (Indústrias Biológicas, Beit-Haemek, Israel) para aferir a sua viabilidade. De modo a testar o nivel de actividade do promotor PPE-1 na angiogénese do tumor em ratos, foram usados dois modelos de tumor diferentes.
No modelo de tumor primário, as células (lxlO6 células/ml em 100 ml de soro fisioçógico) onde injectado subcutaneamente nas costas dos ratos (n=17). Vinte e um dias pós injecção Ad5PPE-l, Ad5PPE-lGFP, Ad5CMV, ou Ad5CMVGFP (106pfu/ml) onde injectados no tecido do tumor (IT) ou intravenosamente e a sua actividade foi detectada conforme descrito acima.
No modelo de tumor metastizado, as células (células5xl05 /ml em 50 ml de soro fisiológico) foram injectadas nas plantas das patas dos ratos (n=12). Quando o tecido do tumor atingiu um tamanho de 0.7 mm de diâmetro, a planta da pata (com o tumor primário) foi ressecado sob condições anestésicas e estéreis. Quatorze dias após cirurgia os 40 vírus (Ad5PPE-l, Ad5PPE-IGFP, Ad5CMVLuc ou Ad5CMVGFP) foram injectados na veia da cauda do rato.
Em ambos modelos experimentais de tumor os ratos foram sacrificados 5 dias após a injecção pós virai, os seus tecidos excisados e testados para actividades de Luciferase ou GPF.
Modelo de Cicatrização de Feridas
Ratos Masculinos de 3 meses de idade C57BL/6 foram anestesiados através de injecção subcutânea de pentobarbital de sódio (6mg/kg). As suas costas foram rapadas e foram feitas incisões de 5 cm a direito. As incisões foram suturadas de imediato com fio de seda 4/0 esterelizado. 0 processo angiogénico na cicatrização de feridas foi examinado a cada dois dias através de H&E e anti-von-Willibrand anticorpo coloração imuno-histoquímica.
Dez dias pós incisões foram injectados sistemicamente 1010pfu/ml de Ad5PPE-lLuc ou Ad5CMVLuc na veia da cauda. Cinco dias pós injecções os ratos foram sacrificados e a actividade Luciferase foi ensaiada como descrito acima no local da incisão na pele e em local contra lateral normal como controlo.
Examinação histológica
De modo a avaliar a extensão da angiogénese no tumor e tecido metastizado, os tecidos foram cortados em secções de 5 mm e corados com Hematoxilina e Eosina (H&E) . Anti CD31 (rat anti rato CD31 monoclonal Ab. Pharminogen, NJ, USA) foram usados anticorpos para analisar a neovascularização nos modelos de tumor. 41
Análise estatística A análise entre grupos para diferenças estatísticas significativas foi realizada com a utilização de t-test ANOVA, ou o teste Mann-Whitney Rank. A informação é mostrada como mean+SE. EXEMPLO 1
Análise de actividade de plasmídeo 3X PPE-1 in-vitro
De modo a analisar a actividade do PPE-1-3X, a comparação de expressão de um gene repórter no promotor plasmídeo PPE-1-3X e promotor plasmídeo não modificado PPE-1 foi realizada. Os plasmídeos de gene repórter contendo quer o fragmento PPE-1-3X ou o fragmento não modificado PPE-1 e o gene repórter luciferase foram transfretados em linhas de células endoteliais e não endoteliais bem como a linha de celular epitelial bronquial (B2B) o que expressa o promotor PPE-1 (ver materiais e métodos acima). A linha de célula B2B foi escolhida para fornecer uma indicação da capacidade do elemento 3X para reduzir a expressão em células não endoteliais relativas ao promotor PPE-1. A transfecção foi conseguida usando lipofectamina (Promega Corp., Madison, WI). Um plasmídeo 3gal-neo foi empregue como um indicador da eficiência da transfecção em cada caso de acordo com a prática biológica molecular aceite.
Quarenta e oito horas pós transfecção, as células foram colhidas utilizando o tampão de (Promega Corp., Madison, WI) e a actividade Luciferase foi analisada por um luminímetro (TD-20e - Turner Designs, Sunnyvale,
Califórnia). Em paralelo, a actividade Pgal foi analisada 42 de modo a ser standardizada para diferentes eficiências de transformação. Os resultados foram resumidos na Figurai e Tabela 1. A actividade de Luciferase sob o controlo de PPE-3X él5-20 vezes maior do que a actividade Luciferase sob o controlo de PPE-1 não modificado. Em linhas de células não endoteliais foi detectada a expressão minima utilizada quer no PPE-1 e no PPE-1-3X. Isto demonstra que PPE-3X é um candidato promissor para entrega de um gene especificamente para as células endoteliais in-vivo.
Tabela 1- Actividade Luciferase nas células transfectadas com PPE-1 e PPE-1-3X constructos Luciferase
Plasmideo Actividade Luciferase em: Linhas de células endoteliais Linhas de células não endoteliais HUVAC BAEC RIN PPE-1 135.12 1121.3 0.73 PPE-1-3X 768 18331.7 0.32 EXEMPLO 2
Actividade e especificidade de Luciferase Ad5PPE-l/ in-vi tro A PPE-l/Luciferase, PPE-1-3X/Luciferase, PPE-l/GFP ePPE-1-3X/GFP foram também ligadas a plasmideo Ad5 para produzir Ad5PPE-l/Luc e Ad5PPE-l-3X/luc, Ad5PPE-l/GFP e Ad5PPE-l-3X/GFP (Varda-Bloom et al., (2001) Gene therapy 8:819-827).
Estes constructos foram ensaiados separadamente conforme detalhado infra.
De modo a testar a actividade do Ad5PPE-l/luc, as transfecções de B2B (Epitélio brônquico humano), BAEC (Células Endoteliais aórticas bovinas) e HUVEC (células 43
Endoteliais umbilicais humanas) foram tomadas. Estas três linhas de células expressaram o gene endotelino e foram escolhidas para indicar os niveis de expressão do constructo testado numa célula endotelial. 0 RIN (Rato Insulinoma) linha de célula, que não expressa endotelina, foi empregue como um controlo negativo e afectado com o mesmo composto. Ad5CMVLuc (Luciferase sob o controlo do promotor CMV) foi usada como controlo especifico não endotelial nas linhas de células. A Figura 2 ilustra claramente que a expressão de Luciferase mais elevada foi conseguida em linhas de células BAEC e HUVEC com o promotor PPE-1 mais do que no promotor CMV. Nas células RIN, que não são de origem endotelial, o promotor CMV produziu mais actividade Luciferase do que o promotor PPE-1. Estes resultados demonstram a especificidade endotelial do promotor PPE-1 não modificado. EXEMPLO 3
Actividade e Especificidade de Ad5PPE-3XLuc e Ad5PPE-3XGFP
Constructos Ad5PPE-3X/Luciferase e Ad5PPE-3X/GFP foram utilizados para transfectar as linhas de células supra descritas no Exemplo 2 de modo a assegurar o impacto do elemento 3X nos niveis de especificidade e expressão. Como no exemplo 2, Ad5CMVLuc foi usada num controlo endotelial não especifico. A expressão mais elevada de Luciferase em linhas de células BAEC e HUVEC foi detectada sob o controlo do promotor PPE-3X conforme comparado com o promotor CMV.
A Figura 3a é um fotomicrográfico que ilustra a expressão GFP sob o controlo de Ad5PPE-l-3X na linha de célula BAEC. A Figura 3b é um fotomicrograma que ilustra a expressão GFP 44 do Ad5CMV na linha BAEC. Como é claramente mostrado por estas figuras, o promotor PPE-1-3X é mais activo nas células endoteliais. Estes resultados indicam claramente que o elemento 3X não diminui a partir da especificidade endotelial do promotor PPE-1. As actividades relativas dos promotores PPE-1 e PPE-1-3X na cultura das células são apresentados no exemplo 6 infra. EXEMPLO 4
Ensaio In-vitro de actividade pro-apoptotica do gene p55
Seguindo a subclonagem do P55 (TNFR1, GenBank accession number M75866) em PACPPE3X (contendo o promotor PPE-1-3X), e em PACCMV, a co-transfecção destes plasmideos e GFP (pEGFP-Cl vector; CLONTECH, Paio Alto, CA) foi realizada conforme descrito acima. Brevemente, o gene foi subclonado a jusante do promotor PPE-1 (em vez do gene Luciferase) em local de restrição Notl, através de T4 ADN ligase, seguido da transformação em células competentes DH5a. Vinte e quatro horas pós transfecção, células apoptoticas redondas e pequenas eram visualmente discerniveis das células normais. 0 eléctron microscópico das células transfectadas com os plasmideos mostrara aparência típica de apoptose, confirmando a avaliação visual.
Sob o controlo do promotor PPE-1-3X, foi induzida a apoptose apenas por p55 apenas nas células endoteliais (Figura 4) , onde o promotor CMV não mostrou qualquer actividade específica das células. A Luciferase sob o controlo do PPE-1-3X não induziu apoptose em quaisquer linhas de células testadas. Estes resultados indicam que empregar o promotor PPE-1-3X, é viável para induzir a apoptose especificamente nas células endoteliais. 45 EXEMPLO 5 0 Elemento de Resposta à Hipóxia (HRE) pode aumentar a expressão do gene alvo em células endoteliais hipóxicas sensíveis A Hipóxia é um regulador importante da estrutura e tom dos vasos sanguíneos. Também se demonstrou ser um potente Estímulo da angiogénese (Quer nas Doenças Cardíacas isquémicas Quer nos cancros (Semenza, GL et al (2000) Adv Exp Med Biol475:123-30; Williams, K.J. (2001) Breast Câncer Res. 2001: 3; 328-31 e Shimo, T. (2001) Câncer Lett. 174, 57-64) .
Além disso, a hipóxia foi avaliada para regular a expressão de vários genes, incluindo a eritropoietina, o VEGF, as enzimas glicolíticas e ET-1. Estes genes São controlados por um Caminho Comum de detecção de oxigénio, um Complexo de Transcrição induzível um complexo de transcrição induzida denominado hipóxia induzida factor-1 (HIF-1). Os meios complexos HIF-1 de respostas transcricionais à hipóxia ligando o elemento responsivo a hipóxia (HRE) de genes-alvo. O HRE é uma Sequência conservada localizada em Promotores de alguns genes que respondem à hipóxia incluindo: VEGF, o óxido nítrico sintase-2, eritropoietina e outros, incluindo a endotelina-1, ET-1. O promotor de ET- 1 Contém uma resposta invertida do promotor de na posição -118 bp a montante do local de início da transcrição, o elemento contém sete pares de bases e localiza-se entre os locais GATA-2 e AP1 5 'GCACGTT 3' - 50 pares de bases. (SEQ ID NO: 5). 46 0 promotor A preproendotelina-1 (PPE-1) Contém um elemento de resposta à hipóxia (HRE) que tem o potencial para aumentar a expressão no microambiente do tumor de tecidos isquémicos, tornando-o assim "tecido tumoral especifico" e/ou "tecido isquémico especifico". De modo a avaliar a actual função deste HRE, foram efectuados ensaios do promotor PPE-1 e promotor PPE-1-3X em conjunto com a Luciferase ou gene repórter GFP e entregue por um vector adenoviral. A actividade Luciferase sob controlo do promotor PPE-1 ou o promotor PPE-1-3X foi comparada em células BAEC sob
condições normóxicas e hipóxicas (0.5% O2 para 16h). A actividade Luciferase sob o controlo do promotor PPE-1 foi 5 vezes mais elevada quando exposto à hipoxia (Figuras 5 e 6) . Ainda, a actividade de Luciferase sob o controlo do promotor PPE-1-3X foi 2.5 vezes superior sob condições hipóxicas. Em suma, a introdução do elemento 3X no promotor PPE 1 é ainda capaz de aumentar os niveis de expressão de um gene a jusante em resposta à hipóxia, apesar de os niveis normóxicos de expressão com o gene PPE-1-3X serem mais elevados do que aqueles observados com o promotor PPE- 1 não modificado. EXEMPLO 6
Outras avaliações do PPE-1-3X e actividade de promotor PPE-1 nas linhas de células endoteliais A Figura 7 resume os resultados das experiências de transfecção de B2B, HUVEC e BAEC utilizando pPPE- 1/Luciferase E pPPE-l-3X/Luciferase. A expressão mais elevada de Luciferase (30, 8.5 e 1.5 vezes mais foi observado) sob o controlo do promotor PPE-1-3X do que sob o 47 promotor PPE-1 em B2B, HUVEC e BAEC, respectivamente. Estes resultados confirmam aqueles apresentados supra e servem para estabelecer que ο PPE-1-3X está adequado para direccionar expressões de alto nível especificamente para células endoteliais. No contexto de futura entrega in-vivo, os níveis mais elevados de expressão atingidos com o composto do constructo PPE-1-3X traduz-se na administração de quantidades menores de ADN. Isto, por sua vez, irá servir para aumentar ainda mais a especificidade. EXEMPLO 7
Eficiência, especificidade e estabilidade do Ad5PPE-lLuc in-vivo
De modo a confirmar que a especificidade endotelial da expressão observada nos exemplos 2 a 6 não era o artefacto da cultura das células, o composto Ad5PPE-l/Luciferase foi injectado em ratos C57BL/6 como descrito supra em "expressão de tecido em ratos normais". Tal como nos Estudos in-vitro, Ad5CMV/Luciferase foi empregue como um controlo negative. A seguir à injecção de vectores, a actividade específica e estabilidade da Luciferase foram ensaiadas em tecidos vascularizados e não vascularizados. Os resultados são resumidos na Figura 8 (Expressão de Luciferase relativa à expressão no fígado) e Tabela 2 (Expressão de Luciferase como percentagem de expressão total no organismo). Conforme esperado, nos ratos tratados em Ad5CMV/ Luciferase a maior parte da actividade luciferase (>80% da expressão total do organismo) foi encontrada no fígado. A actividade
Luciferase controlada pelo promotor PPE-1 foi mais baixa no fígado (37-54% da expressão total do organismo). A 48 expressão derivada de PPE-1 foi muito mais elevada na aorta (23-33% da expressão total do organismo 5 e 14 dias após injecção respectivamente) , comparada com os ratos tratados Ad5CMV/Luciferase (até 1.8% da expressão total do organismo; Tabela 2).
Estes resultados confirmam a especificidade endotelial observada na cultura celular. Deverá ser recordado que o figado é um órgão altamente vascularizado. Assim, foi levada a cabo a examinação da expressão celular nos órgãos, conforme detalhado infra.
Tabela 2 - Expressão Luciferase nos órgãos 5 e 14 dias após injecção de PPE-1 e constructos baseados em CMV
Dia pós 5 14 Unidades luz/mg proteína Unidades luz/mg proteína Orgão PPE-1 CMV PPE-1 CMV Aorta 13.012.9 (32.7%) 1.410.5 (0.56%) 10.612.4 (12.6%) 1.310.3 (1.1%) Coração 0.210.1 (0.5%) 110.6 (0.4%) 1.510.3 (1.7%) 1.810.6 (1.6%) Orgão PPE-1 CMV PPE-1 CMV figado 22.714.5 (57%) 2191111.5 (88.6%) 34.917.8 (41.6%) 52.8110.6 (46.8%) pulmão 0.210.1 (0.5%) 2.311.0 (0.9%) 3.610.8 (4.3%) 2.010.9 (1.8%) músculo 0.310.1 (0.7%¾ 0.810.2 (0 . 3%) 1.210.3 (1.4%) 1.510.5 (1 .3%) baço 1.310.8 (3.2%) 1.610.9 (0.6%) 2.010.4 (2.4%) 2.310.9 (2.0%) pancreas 210.6 (5.0%) 20.116.8 (8.1%) 26.415.9 (31.5%) 45.2124.5 (40.1%) rim 0.110 0.910.6 0.610.1 0.810.3
Tabela 2 continua. 49
As Figuras 30A e 30 B demonstram a actividade de Luciferase absoluta (unidades luz/mg proteína) nas aortas (A) e fígados (B) dos 110 ratos injectados. A actividade Luciferase foi medida 1 (n=13), 5 (n=34), 14 (n=32), 30 (n=20) e 90 (n=ll) dias pós injecção. Os resultados na aorta representam a actividade dos promotores (PPE-1 ou CMV) maioritariamente nas células endoteliais, enquanto os resultados no fígado representam a sua actividade maioritariamente nos hepatócitos. EXEMPLO 8
Ensaios de eficiência, especificidade e estabilidade da Ad5PPE-l in-vivo- em ratos BALB/C
As experiências do exemplo 7 foram repetidas em ratos BALB/C de 12 semanas (n=10 para cada grupo) de modo a demonstrar que os resultados observados não foram um artefacto de uma particular estirpe de animais.
Devido aos resultados absolutos nos vectores adenovirais terem sido mais baixos nos ratos BALB/C do que nos ratos C57BL/6 a expressão Luciferase é expressa numa percentagem da actividade total de Luciferase em todos os tecidos. A expressão relativa mais elevada de Luciferase 5 dias pós injecção foi observada nos baços de Ad5PPE-l (90.9%), e nos fígados de ratos injectados Ad5CMV (86.2%). Um aumento significativo na actividade relativa de Luciferase nas aortas de ratos injectados Ad5PPE-l 14 dias pós injecção (32.9%), comparado com a sua actividade 5 dias pós injecção (1.75%) foi também observado (Figuras 31A e 31B; Ad5PPE-lLuc -barras abertas; Ad5CMVLuc-barras pretas). 50
Estes resultados confirmam que independentemente da estirpe dos ratos a especificidade do tecido do promotor PPE-1 é suficientemente forte para eliminar efectivamente a expressão hepatócita, apesar de captação preferencial de ADN injectado por hepatócitos. EXEMPLO 9 A localização celular do gene entregue por Ad5PPE-l in-vivo A fim de verificar locais de expressão celular do gene expressos pelo PPE-1 in-vivo, foi utilizada Proteína Verde Fluorescente (GFP) entregue pelo vector adenoviral Ad5PPE-1-GFP. Ad5CMVGFP (Quantum, Canada) foi usado como foi usado como controlo negativo não-endotelial específico de células. Cinco dias após injecção intravenosa os ratos foram sacrificados e os seus tecidos foram analisados através de microscopia fluorescente.
Nos ratos injectados com vector Ad5CMVGFP, a maior parte da expressão foi detectada nos hepatócitos e não foi detectada expressão nas células endoteliais do fígado. (Figura 9A) . Em contraste, os ratos injectados Ad5PPE-l-GFP (Figura 9B), mostrando nenhuma expressão nos hepatócitos, mas expressão significante nas células endoteliais nos vasos sanguíneos do fígado. Foram obtidos resultados similares praticamente em todas as expressões derivadas de PPE-1 foi detectada no endotélio, enquanto nenhuma da expressão derivada CMV foi endotelial. Estes resultados indicam especificidade endotelial é preservada mesmo dentro de um órgão contendo células endoteliais e não endoteliais. Este achado tem implicações importantes para prevenção de angiogénese em tumores em crescimento. 51 EXEMPLO 10
Ensaios de eficiência e especificidade endotelial do Ad5PPE-l-3X Luc e Ad5PPE-l-3X GFP in-vitro
De modo a determinar a eficácia relativa da expressão de direcção do Ad5PPE-l e Ad5PPE-l-3X dos genes repórter Luciferase e proteína verde fluorescente (GFP) nas células, a actividade específica nas células endoteliais foi testada em linhas de células in-vitro descritas acima. Ad5CMVLuc e Ad5CMVGFP foram empregues como controlo não específico de tecidos. Ad5PPE-lLuc e Ad5PPE-lGFP foram utilizados para determinar a mudança relativa do nível de expressão causado por adição da sequência de 3X.
Os resultados, resumidos nas Figuras 10 e llindicam que as actividades de Luciferase sob o controlo do promotor PPE-1-3X foram 5-10 vezes superiores nas linhas EC (Células Endoteliais Aórticas Bovinas - BAEC) comparada com a actividade em células não endoteliais - Rato Insulinoma -RIN, HeLA, HePG2 e fibroblastos de pele normal (NSF) (figuras 10 e 11). A Figura 10 mostra actividade Luciferase como light units/mg proteína em células B2B, BAEC e RIN cells transduzidas por Ad5PPE-lLuc, Ad5PPE-l-3XLuc, expressão mais elevada de Luciferase Ad5CMVLuc Luciferase foi observada nas células RIN transduzidas por Ad5CMVLuc, no entanto, este constructo foi fracamente expresso em células BAEC e B2B. Os próximos níveis elevados de expressão Luciferase foi observado em células BAEC transduzidas por Ad5PPE-l-3XLuc. Ad5PPE-lLuc foi expressada em níveis mais baixos em células BAEC. Na linha de células B2B Ad5PPE-lLuc 52 e Ad5PPE-l-3XLuc foram expressas a níveis praticamente idênticos.
Em geral, a actividade Luciferase nas células endoteliais sob o controlo do promotor de actividade na célula endotelial PPE-1-3X foi 23 vezes mais elevada do que sob o controlo do promotor PPE-1 e 23-47 vezes mais elevada do que sob o controlo do promotor CMV nas mesmas condições de infecção (moi=10) . Isto é apesar do facto de a expressão Luciferase em células não endoteliais RIN ter sido 3000 vezes superior sob o controlo do promotor CMV (figura 10).
De modo a estabelecer que os PPE-1 ePPE-l-3X são inactivos noutras linhagens de células não endoteliais HeLA, HepG2, NSF foram transduzidas linhas de células. BAEC foi empregue como controlo endotelial. A Figure 11 mostra actividade Luciferase como unidades luz/mg proteína em HeLA, HepG2, NSF e células BAEC transduzidas através de Ad5PPE-lLuc, Ad5PPE-l-3XLuc e Ad5CMVLuc. A transdução com Ad5CMVLuc causou níveis elevados de expressão Luciferase em células HeLA, HepG2 e NSF. Estas linhas de células falharam em expressar a Luciferase sob o controlo de PPE-1 e expressaram a Luciferase a níveis baixos com o promotor PPE-1-3X. Conforme esperado, as células BAEC transduzidas com Ad5PPE-lLuc ou Ad5PPE-l-3XLuc mostraram uma elevada expressão de Luciferase.
Tomados em conjunto estes resultados indicam que a introdução da sequência 3X no promotor PPE-1 causou níveis mais elevados de expressão em linhas de células endoteliais enquanto prevenindo expressão indesejada em células não endoteliais. 53 A adição da sequência 3X ao promotor PPE-1 aumentou também a expressão de proteína verde florescente em linhas EC (Células endoteliais aórticas bovinas - BAEC) conforme indicado nas Figuras 12 A-C que descreve a expressão GFP em BAEC transduzida por moi=l. Não foi observada nenhuma expressão GFP utilizando um promotor CMV nesta experiência.
Na Figura 12, o painel A indica células transduzidas, o painel B indica células transduzidas Ad5PPE-l-3XGFP Ad5PPE-1GFP e o painel C indica células transduzidas Ad5CMVGFP. Novamente, a introdução da sequência 3X no promotor PPE-1 na expressão significativamente aumentada do gene repórter. Este resultado indica que a habilidade da sequência 3X para funcionar como um impulsionador endotelial especifico não é uma função do gene a jusante a ser transcrito.
Além disso, a transdução Ad5PPE-l-3X-GFP e transdução Ad5PPE-lGFP resulta em não expressão GFP em células não endoteliais. SMC, HelA, HePG2 e fibroblastos normais de pele (NSF) comparado com a expressão elevada sob o promotor CMV como resumido nas figuras 13-16. A Figura 13 mostra expressão GFP em SMC transduzido através de moi=l de quer Ad5PPE-l-3XGFP (painel A) ou Ad5CMVGFP (painel B) . Enquanto o nivel elevado de expressão GFP resultou da expressão de transdução Ad5CMVGFP, nenhuma expressão GFP resultou da transdução com Ad5PPE-l-3XGFP. A Figura 14 mostra resultados de uma experiência similar conduzida em células HeLa. Como na figura prévia, o Painel A indica células transduzidas com Ad5PPE-l-3XGFP e o Painel B indica células transduzidas com Ad5CMVGFP. De novo, enquanto o nivel elevado de expressão GFP resultou a partir 54 de transdução Ad5CMVGFP, nenhuma expressão GFP resultou a partir da transdução com Ad5PPE-l-3XGFP. A Figura 15 mostra resultados de uma experiência similar conduzida em células HepG2. Tal como na figura prévia, o painel A indica células transduzidas com Ad5PPE-l(3X)GFP e o painel B indica células transduzidas com Ad5CMVGFP. De novo. Enquanto o nivel de expressão GFP resultou a partir da transdução Ad5CMVGFP, nenhuma expressão GFP resultou da transdução com Ad5PPE-l-3XGFP. A Figura 16 mostra resultados de uma experiência similar conduzida em células NSF. Como na figura prévia, o painel A indica células transduzidas com Ad5PPE-l-3XGFP e o painel B indica células transduzidas com Ad5CMVGFP. De novo, enquanto o nivel elevado de expressão GFP resultou a partir da transdução Ad5CMVGFP, a expressão GFP muito baixa resultou a partir da transdução com Ad5PPE-l-3XGFP.
Estes resultados, tomados em conjunto, indicam um nivel elevado de especificidade endotelial e um elevado nivel de expressão endotelial é obtido através da utilização de um promotor PPE-1 modificado contendo a sequência 3X da SEQ ID NO.: 7. EXEMPLO 11
Localização celular de um gene repórter entregue por Ad5PPE-l-3X in-vivo
De modo a determinar o padrão de localização celular de um gene repórter expresso sob o controlo do promotor PPE-1-3X in-vivo, Ad5PPE-l-3XGFP a Ad5PPE-lGFP foram injectados em ratos conforme descrito acima. Cinco dias após injecção 55 intravenosa, os ratos foram sacrificados e os seus tecidos analisados através de um microscópio fluorescente.
Significativamente, a actividade GFP foi observada nas células endoteliais nos vasos sanguíneos do fígado, rim e baço dos ratos injectados Ad5PPE-l-3XGFP comparando com os ratos Ad5PPE-lGFP. As Figuras 17A e B mostram resultados representativos. A Figura 17A mostra um baixo nivel de expressão GFP em células endoteliais alinhadas num vaso sanguíneo de um rato injectado com o Ad5PPE-lGFP. A Figura 17B mostra os níveis muito mais elevados de expressão do elevado nível GFP resultando da adição da sequência 3X ao constructo.
Apesar da elevada expressão no alinhamento dos vasos sanguíneos, não foi detectada expressão nos hepatócitos, glomérulos, células epiteliais e esplenócitos (Figuras 18 e 19) . A Figura 18 mostra resultados representativos a partir do tecido renal dos ratos injectados. Os ratos injectados com Ad5CMVGFP (Figura 18A), Ad5PPE-lGFP (Figura 18b) e Ad5PPE-1-3XGFP (Figura 18C) os ratos injectados mostraram baixa actividade GFP em células renais. Na figura 18B, expressão GFP ligeiramente mais elevada é visível na parede do vaso sanguíneo (indicada por seta). A Figura 19 mostra resultados representativos a partir de tecido do baço dos ratos injectados. Ratos injectados Ad5CMVGFP (Figural9A), ratos injectados Ad5PPE-lGFP (Figura 19B) e ratos injectados Ad5PPE-l-3XGFP (Figura 19C) Todos mostraram baixos níveis de actividade nas células do baço 56 GFP. Elevada actividade GFP é visível nos vasos sanguíneos dos ratos injectados Ad5PPE-l-3XGFP (indicados por seta).
Estes resultados confirmaram que quer o promotor PPE-1 e o promotor PPE-1-3X são células endoteliais específicas in-vivo.
Sugerem ainda que a actividade de ambos promotores esteve limitada em tecido endotelial não (i.e. vasos sanguíneos de órgãos saudáveis. Assim, os ensaios num modelo de tumor angiogénico foi tomado. EXEMPLO 12
Ensaios de constructo Ad5PPE-l na neovascularização de tumor in-vivo A fim de determinar a capacidade de AD5PPE a expressão especificamente directa de um gene repórter de vasos sanguíneos angiogénicos em um tumor, foi utilizado o modelo murino LLC (anteriormente descrito em materiais e métodos).
Numa experiência, expressão da luciferase na neovascularização do tumor foi testada cinco dias após a injecção sistémica de Ad5PPE-lLuc ou Ad5CMVLuc (1010pfu/ml cada).
Nesta experiência, a injecção sistémica de Ad5CMVLuc de modelos de tumores primários e metastáticos resultou em expressão mínima no tumor primário ou metastático no pulmão. Este nível de expressão foi semelhante à expressão mínima de luciferase dirigido por CMV em pulmões normais ingénuos (Figura 35; barras pretas, n = 12). Em contraste, sob o controlo de um promotor de PPE-1(Figura 35; barras abertas, n = 9), as metástases do pulmão altamente 57 angiogénicos foram associados à actividade de luciferase, que foi cerca de 200 vezes mais elevada do que a actividade da luciferase no tumor primário pouco vascularizado e os pulmões naturais. A expressão da luciferase em tecidos não-metastáticas, tais como o figado, rim, coração e pâncreas foi minima. O nivel de expressão na aorta foi de cerca de 30% dos niveis de metastáticos nos pulmões.
Numa experiência adicional no modelo LLC constructos Ad5PPE-lGFP e Ad5CMVGFP foram utilizados para localizar a expressão do gene repórter nos pulmões tumorais primários e metastáticos.
Ratos Ad5PPE-lGFP injectados, demonstraram altos níveis de expressão da GFP específica nos vasos sanguíneos do tumor primário (Figura 36C), mas não foi detectada expressão nas próprias células tumorais. Esta observação é consistente com os resultados do modelo de cultura de células LLC apresentado no exemplo 20. Em metástases pulmonares, níveis elevados de expressão de GFP foi detectada em ambas as artérias grandes e pequenos vasos angiogénicos dos focos metastáticos (figura 36A) . Nenhuma expressão estava detectada no tecido de pulmão normal. A localização das células endoteliais foi demonstrada por co-localização da expressão GFP (Figura 16A) e o anticorpo de CD31 imunocoloração (Figura 16B). Em flagrante contraste, em ratinhos injectados Ad5CMVGFP, nenhuma actividade GFP foi detectável tanto no tumor primário e de metástases do pulmão.
Figura 36C ilustra expressão GFP nos vasos sanguíneos de um tumor primário após a injecção intratumoral de Ad5PPE-lGFP. 58 A Figura 36D é uma imagem de contraste de fase do mesmo arquivado como painel C ilustra o tumor e os seus vasos sanguíneos.
Estes resultados indicam que, apesar de PPE-1 não conduzir a expressão de alto nível em células tumorais, por si só, o promotor não conduzem a expressão de alto nível no endotélio vascular no interior do tumor, especialmente no que proliferam rapidamente vasos angiogénicos. A injecção infratumoral de Ad5CMV em modelo de tumor subcutâneo primário resultou em alta expressão de luciferase nos níveis teciduais e moderadamente tumorais de expressão no fígado (10% do valor expresso no tumor, Figura 42) .
Nenhuma expressão foi detectada nos pulmões metastáticos. Por outro lado, quando injectado infratumoral, a expressão de luciferase sob o controlo de um promotor de PPE-lresultou em níveis semelhantes de expressão de luciferase em que o tumor primário e as metástases nos pulmões e ausência de expressão foi detectada no fígado. EXAMPLO 13
Ensaios do constructo Ad5PPE-l num sistema de cultura de células de carcinoma A fim de ensaiar a eficácia do Ad5PPE-l e Ad5CMV e para conduzir a expressão de luciferase em células cancerosas, foi utilizada a linha de células de pulmão de Lewis Carcinoma D122-96. A transdução in vitro em diferentes multiplicidades de infecção (moí) foi realizada. Os resultados indicam que 59 ambos os vectores adenovirais são capazes de transduzir o gene de luciferase a estas células (Tabela 3) . No entanto, a actividade da luciferase dirigida pelo promotor de PPE-1 foi muito menor nas células de LLC que a actividade detectada nas células endoteliais, 50 vs 1000-2500 unidades de luz / mg proteina, respectivamente.
Tabela 3 - Transdução In-vitro de linha de célula carcinoma pulmonar Lewis (D122-96) com Ad5PPE-lLuc eAd5CMVLuc. MOI=l MOI=5 MOI=10 Ad5PPE-l Ad5CMV 8.1±0.06 9.3±1.1 33.95±7.0 47.3±4.0 5 0.7±5.0 88.13±10.1 EXEMPLO 14
Ensaio do efeito da sequência 3X em vasos sanguíneos angiogénicos tumorais in vivo A fim de determinar o efeito da sequência de 3X sobre a PPE-1 no promotor de vasos sanguíneos angiogénicos, o carcinoma pulmonar de Lewis (LLC) metástases modelo (aqui anteriormente descrito em materiais e métodos) foi empregue. Cinco dias após a injecção IV de 1010 unidades infecciosas de Ad5PPE-lGFP, Ad5PPE-l-3XGFP ou Ad5CMVGFP, os ratinhos foram sacrificados e os seus tecidos foram analisados como descrito em materiais e métodos.
Figuras 20 A-D resumem a expressão GFP nos pulmões metastáticos de ratos injectados com solução salina (Figura 20A) , os ratos injectados com Ad5CMVGFP (Figura 20 B) , os ratos injectados com Ad5PPE-lGFP (Figura 20 C) e camundongos injectados com Ad5PPE -1-3XGFP (Figura 20D) . 60
Anti-CD31 imunocoloração (Figuras 20C 'para 20D') confirmar a localização da expressão da GFP em cada tecido metastático. Os resultados mostram que, enquanto não há expressão de GFP detectada no controlo-ratinhos injectados com soro (Figura 20A), houve uma ligeiro expressão em torno dos brônquios epitelial dos ratinhos injectados por CMV, mas não nos vasos sanguíneos angiogénicos do pulmão metastático destes ratos (Figura 20B). Baixa expressão da GFP observada nos pulmões metastáticas de ratinhos injectados Ad5PPE-lGFP (Figuras 20C e 20C'), enquanto a maior e observou-se a expressão específica de novos vasos sanguíneos Ad5PPE-l-3XGFP nos ratinhos injectados (Figura 2OD e 20 D') .
Estes resultados explicam a aparente disparidade entre os resultados in vivo do exemplo 10 e os resultados in vitro de exemplos 2, 3 e 6. Tanto a PPE-1 e o promotor de PPE-1-3X são específicas do endotélio. No entanto, a sequência de 3X aumenta significativamente o nível de expressão no tecido endotelial que proliferam rapidamente, tais como a recentemente a formação de vasos sanguíneos num tumor em crescimento. EXEMPLO 15
Efeito do elemento 3X sobre a PPE-1 no promotor de vasos sanguíneos angiogénicos tumorais A fim de estudar o efeito do elemento 3X da presente invenção, sobre a eficácia e a actividade específica da PPE-1 no promotor de vasos sanguíneos angiogénicos tumorais, o modelo de metástases LLC foi empregue. Cinco dias após injecção intravenosa de IO10 pfu / ml de Ad5PPE-lLuc, Ad5PPE-l-3XLuc, Ad5CMVLuc, Ad5PPE-lGFP, Ad5PPE-l-3X- 61 GFP ou Ad5CMVGFP, os ratinhos foram sacrificados e os seus tecidos foram analisados para a expressão da luciferase ou GFP como acima descrito. A Figura 37 é um histograma gue compara a expressão de luciferase em pulmões normais versus agueles metastáticos nos pulmões após injecção sistémica de Ad5PPE-l-3Xluc, Ad5PPE-lLuc ou Ad5CMVLuc. Os grupos experimentais foram Ad5CMVLuc (n = 7; barras pretas), Ad5PPE-lLuc (n = 6; barras cinzentas) e Ad5PPE-l-3XLuc(n = 13; barras castanhas). A actividade é expressa como unidades de luz /mg de proteína. A expressão de luciferase sob o controlo do promotor de PPE-1-3X foi 35 vezes maior nos pulmões metastáticos em relação à sua actividade nos pulmões normais e 3,5 vezes maior do que a expressão conduzida pelo promotor de PPE-1 sem o elemento 3X (p <0,001). Muito pouca actividade de luciferase foi detectada em outros tecidos de ratos injectados com Ad5PPE-l-3XLuc. O cálculo da expressão de luciferase nos pulmões como percentagem a partir do fígado de cada animal injectado revelou que a actividade aumentou 10 vezes no pulmão metastático em relação à actividade no pulmão normal (Figura 38). A fim de localizar a expressão do gene repórter para tipos de células específicos, forma empreguem construções de GFP. A expressão GFP no pulmão metastático de Ad5PPE-l-3XGFP dos ratinhos injectados foi mostrada. Imunocoloração pelo anticorpo CD31 confirmar a localização da expressão da GFP nos novos vasos sanguíneos. Não foi detectada expressão da GFP no controlo de ratos injectados com soro. Baixo nível 62 de expressão em torno dos brônquios epitelial dos ratinhos injectados por CMV, mas não nos vasos sanguineos angiogénicos do pulmão metastático. Em resumo, estes resultados indicam que grandes aumentos nos niveis de expressão resultou a partir de introdução de um elemento 3X em Ad5PPE-l e constructos que este aumento da expressão era especifico para os vasos sanguineos angiogénicos de tumores. Potencialmente, o efeito observado pode ser conjugado com a resposta de hipoxia descritas anteriormente para aumentar ainda mais os niveis de uma sequência de interesse de expressão. EXEMPLO 16 A caracterização adicional da resposta PPE-1 hipoxia
De modo a caracterizar ainda mais o efeito de hipoxia no promotor murino de actividade PPE-1, células endoteliais de aorta bovina (BAEC) foram transf ectadas por um ADN de plasmideo (pEL8, Figura 26A) . 0 plasmideo contém o pEL8 promotor murina PPE-1 (1.4kb) (vermelho), o gene da luciferase (1842 bp), os locais poli A de SV40 e o primeiro intrão da endotelina.
Um gene, denominado o todo PPE-1 cassete promotor foi digerido e extraído por enzima de restrição BamHI, como descrito em materiais e métodos. Após a transfecção, as células foram submetidas a condições de hipoxia. A expressão de luciferase em BAEC transfectada submetida a 18 horas de hipoxia (0,5% de 02) foi oito vezes maior do que a expressão de luciferase em células cultivadas em um ambiente normóxico (Figura 21) . A Figura 21 mostra que a actividade da luciferase (unidades de luz / mg de proteína) 63 em BAEC transfectado por um plasmídeo contendo o PPE-1 murino promotor foi significativamente maior quando as células transfectadas foram incubadas num meio ambiente hipóxico. Eficiências de transfecção equivalentes foram confirmadas por co-transfecção com um vector repórter β-galactosidase e os ensaios de actividade de LacZ. A fim de determinar se o promotor murino PPE-1 entregue por vector adenoviral é também sobre-regulada por hipóxia, BAEC foram transduzidas por Ad5PPE-lLuc. Ad5CMVLuc foi utilizado um controle não especifico nesta experiência.
Os resultados estão resumidos na Figura 22. A actividade de luciferase hipóxia em BAEC transduzidas por Ad5PPE-lLuc. Em contraste, não houve diferença significativa entre normóxia e a hipóxia foi detectada nas células transduzidas Ad5CMV (Figura 22).
Para entender se o reforço da PPE-1 actividade do promotor é especifico para células endoteliais, as diferentes linhas de celulares (BAEC, B2B, CHO, RIN e miócitos cardíacos) foram transduzidas por Ad5PPE-l (moi = 10) e foram submetidas a hipóxia (0,5% de 02) ou ambiente normóxico. Os resultados estão resumidos na figura 23. A expressão de Luciferase foi ligeiramente aumentada em células B2B e aumentou si gnificativamente em células BAEC cultivadas num ambiente hipóxico. Expressão de luciferase em outras linhas de células foi reduzida pelo meio ambiente hipóxico, comparada com normóxia. Estes resultados confirmam que a indução hipóxica de um promotor PPE-1 ocorre principalmente em linhagens de células endoteliais. EXEMPLO 17 64
Efeito da sequência 3X sobre a resposta PPE-1 hipoxia A fim de determinar o efeito da sequência de 3X no PPE-1 resposta hipoxia, BAEC foram transduzidas por Ad5PPE-lLuc e Ad5PPE-l (3X) Luc. Após a transdução, as células foram incubadas quer num ambiente hipóxico ou normóxico conforme aqui detalhado. Os resultados estão resumidos na Figura 24. A Expressão de luciferase usando constructo o Ad5PPE-lLuc aumentou significativamente (sete dobras) em resposta à hipóxia (2578 em hipoxia e em normóxia 322,1). Em contraste, o constructo Ad5PPE-l (3X) Luc exibiu apenas 1.5 vezes de aumento, em resposta à hipóxia (a partir de 2874.5 em normóxia a 4315 em condições de hipóxia). Estes resultados indicam que o elevado nível de expressão normóxica observada quando a sequência 3X é adicionado ao promotor PPE-1 e serve para mascarar a resposta hipóxica em alguma extensão. EXEMPLO 18
Ensaios de resposta PPE-1 à hipóxia num modelo de rato transgénico A fim de examinar a PPE-1 na actividade de promotor murino os tecidos submetidos a hipóxia/isquemia, os ratos mPPE-1-Luc transgénicos, anteriormente descritos em materiais e métodos, foram utilizados. Os ratinhos foram induzidos à isquemia dos membros posteriores, tal como descrito anteriormente (Couffinhal T. et al. (1998) Am. J. Pathol. 152,-1667-167 9). Em resumo, os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico (40 mg / kg, IP) . A Isquemia unilateral do membro posterior foi induzida por ligadura da 65 artéria femoral direita, aprox. 2 milímetros proximal à bifurcação da artérias safena e poplítea.
Para verificar a indução de alterações funcionais na perfusão, imagiologia de ultra-sons foi realizada nos dias 4 e 14 por um sistema de ultra-som Sinergia (GE), equipado com um transdutor de 7,5 MHz e de software angiográfico. Os animais foram alojados em condições convencionais até 18 dias. A expressão de luciferase foi ensaiada 2, 5, 10 e 18 dias após a ligadura no músculo isquémico, na posição normal músculo não-ligado, no fígado, pulmão e aorta.
Os resultados, resumidos na Figura 25, mostram que, enquanto não foi observada diferença significativa no fígado, pulmão e da aorta durante a ligadura de pós, a expressão do gene de luciferase aumentada dias após a ligadura femoral em ambos no não-ligado normal e no músculo isquémico. Quando foi detectada a expressão de luciferase de pico no músculo isquémica cinco dias após a ligação, o pico de expressão da luciferase no músculo não-ligado foi detectado 10 dias após ligação da artéria femoral. Isto indica que a resposta hipóxica do promotor PPE-1 é funcional num sistema in vivo. Expressão da luciferase no músculo não-isquémico não se alterou durante os dias testados, em comparação com a sua expressão no tecido de controlo não-operado (dia = 0) . Em contraste, a expressão da luciferase no músculo isquémica foi significativamente maior no dia 5 do que em outros pontos de tempo.
No dia 5, a expressão PPE-1 dirigida de luciferase foi 2,5 vezes maior do que no controlo de ratos não operados e 66 comparado com o músculo isquémico no dia 10 e 18 (Figura 40) . A expressão de luciferase noutros tecidos não-isquémicos, incluindo fígado, pulmões e aorta dos ratinhos transgénicos sujeitos a isquemia regional não revelou alterações significativas no prazo de 18 dias após a indução de isquemia na expressão de luciferase nestes tecidos (Fig. 41) .
Além disso, estes resultados confirmam que a expressão da luciferase era mais elevada em tecidos que contêm uma percentagem elevada de tecido endotelial (pulmão e da aorta) do que nos tecidos contendo uma baixa percentagem de tecido endotelial (fígado e músculo não-isquémico). EXEMPLO 19
Efeito do nível de proliferação celular na actividade Ad5PPE-lLuc em células endoteliais A fim de determinar o efeito do nível de proliferação celular em eficiência e actividade específica de Ad5PPE-lLuc, um modelo angiogénico de células endoteliais (BAEC), foi testado in vitro. BAEC transduzidas foram induzidas para quiescência por privação de soro ou cultivadas em 10% de FCS para a proliferação normal. Resumidamente, as células foram transduzidas durante 48 horas, quer como células quiescentes - 72 horas após privação de soro ou como células que proliferam - em meios normais (10% de FCS). A actividade de luciferase é expressa em unidades/mg de proteína de luz, para normalizar para a diferença na quantidade de células. Os resultados apresentados são uma 67 média de teste triplicado a partir de quatro experiências independentes representativas A expressão de luciferase sob o controlo de um promotor de PPE-1(barras abertas, Fig. 28) foi quatro vezes mais elevada em indivíduos normais proliferando BAEC do que em células quiescentes, e 25 vezes mais elevadas em proliferação BAEC normal do que a expressão de luciferase sob o controlo do promotor de CMV (barras pretas e a figura 28). Além disso, em células em proliferação, a actividade, sob o controlo de um promotor-PPE-1 foi 10 vezes maior do que sob o controlo do promotor de CMV. A fim de simular as condições angiogénicas in vitro, a actividade Ad5PPE-lLuc foi testada em BAEC induzidas à rápida a proliferação pela adição de factor de crescimento vascular endotelial 40 ng / ml (VEGF). A actividade nestas condições foi a comparação da actividade nas células em proliferação e células normais quiescentes como descrito acima. A expressão de luciferase em BAEC induzida a proliferação de células com VEGF foi 44 vezes maior do que nas células normais em proliferação, e 83 vezes mais elevada do que em células quiescentes (Figura 29).
Em conjunto, estas experiências indicam que o nivel de actividade de uma sequência de interesse sob controlo transcricional da PPE-1 Promotor é uma função do nivel de proliferação celular, causando a rápida proliferação de niveis de expressão maiores. EXEMPLO 20
Ensaios do promotor PPE-1 na aterosclerose em ratos induzidos 68 A fim de testar a eficiência e especificidade do vector Ad5PPE-l em vasos sanguíneos ateroscleróticos, 1010pfu/ml dos vectores virais foram injectados sistemicamente a ratos de 6 meses de idade, deficientes em ApoE (Plump, A.S. et al celular,. De 1991; 71: 343-353).
Com ApoE deficiente os ratinhos, desenvolvem valores elevados de colesterol e extensas placas aterogénicas sem indução da dieta de alcance lipidico. A Figura 32 é um retrato de uma aorta dissecada de um rato deficiente de ApoE colorido pelo Sudan- IV. Observe que a aorta torácica contém lesões ateroscleróticas coradas menos vermelhas, enquanto a região abdominal é altamente aterosclerótica. (A Figura 32 adaptada a partir de imagens de lesões ateroscleróticas da aorta por 125I-HDL e 125I-BSA.A. Shaish et al, Pathobiology -. Submetido para publicação). A Figura 33 resume a expressão de luciferase observada cinco dias pós injeções sistémicas de Ad5PPE-lLuc (barras abertas, n = 12) e Ad5CMVLuc (barras pretas, n = 12) para ratinhos deficientes em ApoE. Os resultados são apresentados como a expressão de luciferase absoluta na área torácica que contém menos de lesão aterosclerótica, e da aorta abdominal, que é rica na lesão aterosclerótica. A expressão de luciferase controlada pelo promotor de PPE-1 foi 6 vezes maior na abdominal altamente aterosclerótica, e 1,6 vezes mais elevadas na aorta torácica aterosclerótica ligeiramente em comparação com a expressão sob o controlo do promotor de CMV. Não foi observada diferença significativa entre as duas regiões aorta nos ratos injectados Ad5PPE-lLuc, enquanto a 69 expressão de luciferase maior foi observada em aorta torácica do grupo injectado Ad5CMVLuc comparado à baixa expressão na aorta abdominal que contêm lesão.
Estes resultados indicam que, apesar de um promotor constitutivo (CMV) ter uma tendência a fechar em áreas em que a aterosclerose é mais severa, o promotor PPE-1 não é relativamente afectada pela progressão da doença. EXEMPLO 21
Ensaios do promotor PPE-1 num modelo de cicatrização de feridas A fim de testar os constructos Ad5PPE-l de eficiência e actividade especifica em dirigir a expressão da luciferase de vasos sanguíneos de cura da ferida, uma cicatrização de feridas de murino como anteriormente descrito em Materiais e Métodos foi empregada.
Tal como noutras experiências, Ad5CMVLuc foi usada como um controlo não-especifico do tecido. A actividade da luciferase sob o promotor PPE-1, (Figura 34; barras abertas) de controlo foi maior, tanto na posição normal (6.813.2) e na região de cicatrização de feridas (561,6) em comparação com a actividade observada sob o controlo de CMV (Figura 34; barras pretas).
Como tanto o CMV e promotor de PPE-1 apresentaram redução dos niveis de expressão na cicatrização de feridas, estes resultados são dificeis de interpretar. Apesar desta observação inesperada, é evidente que a PPE-lpromotor dirige uma maior niveis de expressão do que o promotor de CMV em ambos os tecidos normal e de cura. A presença de tecido de cicatriz necrótica pode explicar os niveis de 70 expressão reduzidos observados com ambos os promotores na cicatrização de feridas. LISTA DE SEQUÊNCIA <110> Harats, Dror <12 0> PROMOTORES EXIBINDO ESPECIFICIDADE DE CÉLULAS ENDOTELIAIS E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO DAS MESMAS <130> 01/22752 <150> US 60/248,582 <151> 2000-11-17 <160> 8 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 1334 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 1 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgfcgtgt qfcgtagtgta cfc Ectgatcg 60 gcgâtacEâg ggagataagg atgtacctga ca-aaaccaca ttgttgttgt tatcattatt 120
atttagtttt ccttocttgc taactcctga cggaatcttt etcaeetcaa atgcgaagta ISO ctttagttta gaaaagacçt ggtggaaggg gtggtggtgg aaaagtaggg tgítettec* 240 aactaatctg gttccccgcc cgccccagta gctgggattc aagagcgaag agtggggatc 300 gtcccettgt ttgateagaa ãqaeâtaaaa ggaaaateaa gtgaaeaatg afc«ag*ccca 360 cctccacccc acccccctgc gcqcgcacaa taeaatctat ttaattgtac ttcatacctt 420 tcattecaat ggggtgactt tgcttctgqa gaaactcttq attettgaac tçtggggctg 480 geagctagca aaaqgggaag cgggcfcgcfcg ctetctgcaq gttetgcagç ggtctctgfcc 540 tagtgggtgt tttccctttc ttagccctgc cccrtggattg tcagacggcg ggcgtctqcc 600 tctgaagfcta gccgtgattt cetctagaqc cgggtcttat ctctggctgc acgttgcctg 660 tgggtgseta atcaeaeaat aaeattgtfct agggctggaa tâaãgteaga getgtttacc ?20 71 cccactctac aggggttcaa tataaaaagg cgçcggagaa etgtccgagt cagacqcgtt 78Q cetgeaccgg egctgagage ctgacccçjgt ctgetccgct gtCGt&gcgc çctgcctccc 840 ggcfcgcccgc gacgctttcg ccccagtgga aqggccactt qçtgaggacc gcgctgagat 900 ctaaaaaaaa aaeaaaaaac aaaaaacaaa aaaacccaga ggcgatcaga gcgaccagac 990 accgtectct tçgttttge* ttgagttcca tttgeasceg agttttctfet xttteettts 1020 tccccactçt tctgacccct ttgcaçaatg gattatCttc ccgtgatctfc ctctctgctg 1Q80 ttcgtgactt tccasggaqc tccagaaaea qgtaggcgce actxgegaat ctttetactfc 1140 eagegeagca gfctategctt etgttttcea cttttcttte tttettctct ctcattetxe 1200 ccttcttaxt tatttfcfetta attaetgaag ctccageagc aagtgcctta eaafctaatta 1290 aettetgtgt gaagcgaaag aaataaaacc cctgtttgaa tacagccgac tacaacçgag 1320 tatcgeatag ctec 1334
<210> 2 <211> 96 <212> ADN <213> sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 2 getagegtae ttcatacttt tcattccaat ggggtgaect tgcttctgga gggtgacttt ÍG gettetgçag ccaatgggta ctxeataett tteatt 90
<210> 3 <211> 96 <212> ADN <213> sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético 72 <4Ο0> 3 getagcsstec agaagçaaag tçacccçatt gfaatgaaas gtatgaagta caafcgaaaag SO tatgaagtac ccattggcec cagaagcaaa gteacc 9®
<210> 4 <211> 6 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Nhe-1 local de restrição <400> 4 gctagc 6 <210> 5 <211> 6
<212> ADN <213> Mus musculus <22 0> <221> misc_feature <223> Elemento responsivoo à hipóxia - E-box <400> 5 gcacgt 6
<210> 6 <211> 44 <212> ADN <213> Mus musculus <22 0> <221> misc_feature <223> elemento endotelial potenciador especifico Murino 73 <4Ο0> β gtacttcata cttttcattc caatggggtg actttgcttc tgga 44
<210> 7 <211> 143 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Uma cópia triplicado de uma sequência potenciador murino originado de t ele PPE-1 <400> 7 gtacttcata cttttcattc caatggggtg actttgcttc tggagggtga ctttgettct 60 ggagecagta cttcatactt tteattgt&c ttcatacttt tcattecaat ggggtgactt 120 tgcttetgga ggctagctge caf l*3
<210> 8 <211> 47 <212> ADN <213> sequência Artificial <220>
<223> fragmento EDC <400> 8 ctggaqggtg actttgctic tggagccagt acttcatact tttcatt 47
Lisboa, 29 de Julho de 2013. 74

Claims (10)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um polinucleótido compreendendo: (a) Um promotor funcional nas células endoteliais; (b) Um elemento regulatório compreendendo pelo menos uma cópia da sequência conforme apresentado na a SEQ ID NO: 8 ou a sequência complementar operacionalmente ligado ao referido promotor, e (c) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma toxina celular sob controlo regulador do referido promotor e o referido elemento regulador. 2. 0 polinucleótido da reivindicação 1, onde o referido elemento regulador inclui ainda pelo menos uma cópia da sequência como descrito em SEQ ID NO: 6 ou a sua sequência complementar. 3. 0 polinucleótido da reivindicação 1 ou 2, em que o referido promotor funcional em células endoteliais, compreende a pré-pró-endotelina-1 (PPE-1) do promotor. 4. 0 polinucleótido de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, que compreende ainda um elemento de resposta a hipoxia, que inclui, pelo menos, uma cópia da sequência tal como estabelecido na SEQ ID NO: 5. 5. 0 polinucleótido de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o referido elemento de regulação é a sequência tal como estabelecido na SEQ ID NO: 7 ou a sua sequência complementar. 1 6. 0 polinucleótido de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o referido promotor compreende pelo menos um exemplar do promotor de PPE-1-3X. 7. 0 polinucleótido de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a referida toxina celular é seleccionada a partir do grupo consistindo de um Herpes simplex timidina cinase, uma angiostatina, a endostatina e a angiostatina, endostatina quimera.
  2. 8. Uma construção de ácido nucleico que compreende o polinucleótido de qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
  3. 9. A construção de ácido nucleico da reivindicação 8, em que a referida toxina celular é herpes simplex timidina cinase.
  4. 10. A construção de ácido nucleico da reivindicação 8 ou 9, compreendendo um adenovírus deficiente na replicação (tipo 5), vector de expressão.
  5. 11. Uma célula de mamífero transformada com a construção de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 8 a 10.
  6. 12. Utilização da construção de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 8 a 10 para o fabrico de um medicamento para reduzir a massa do tumor num sujeito com essa necessidade.
  7. 13. A utilização da reivindicação 12, em que o referido medicamento é para administração por um método seleccionado de entre o grupo que consiste em: 2 (i) a administração sistémica in vivo; (ii) a administração ex vivo para as células removidas de um corpo de um sujeito e subsequente reintrodução das referidas células para dentro do referido corpo do referido indivíduo, e (iii) o local de administração in vivo.
  8. 14. Utilização de uma construção de ácido nucleico compreendendo um polinucleótido que compreende: (a) um promotor de PPE-1; (b) um elemento regulador, compreendendo a sequência tal como estabelecido na SEQ ID NO: 8 ou a sua sequência complementar operacionalmente ligada ao referido promotor, e (c) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma toxina Herpes simplex timidina cinase células sob controlo regulador do referido promotor e o referido elemento de regulação; para o fabrico de um medicamento para reduzir a massa do tumor num sujeito com necessidade dos mesmos.
  9. 15. A construção de ácido nucleico da reivindicação 8 ou 9, compreendendo um vector de adenovírus. 16. 0 polinucleótido de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o referido promotor funcional em células endoteliais, compreende a sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID NO: 1.
  10. 17. Uma construção de ácido nucleico compreendendo um polinucleótido que compreende: (a) um promotor de PPE-1; 3 (b) um elemento regulador, compreendendo a sequência tal como estabelecido na SEQ ID NO: 8 ou a sua sequência complementar operacionalmente ligado ao referido promotor, e (c) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma toxina Herpes simplex timidina cinase células sob controlo regulador do referido promotor e o referido elemento regulador. Lisboa, 29 de Julho de 2013. 4
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