ES2338529T3

ES2338529T3 - Prometores que exiben especificidad por celulas endoteliales y metodos para su utilizacion.

Info

Publication number: ES2338529T3
Application number: ES01996590T
Authority: ES
Inventors: Dror Harats; Nira Bloom
Original assignee: Vascular Biogenics Ltd
Current assignee: Notable Labs Ltd
Priority date: 2000-11-17
Filing date: 2001-11-15
Publication date: 2010-05-10
Anticipated expiration: 2021-11-15
Also published as: CA2429342C; HK1158529A1; ES2425321T3; KR20080083031A; EP2386319B1; ATE455562T1; MXPA03004325A; KR100917854B1; JP4243653B2; EP1443970A4; US20040048280A1; EP1443970B1; EP2386319A1; DE60141175D1; HK1068057A1; DK2186530T3; DK2386319T3; WO2002040629A2; IL155940A0; WO2002040629A3

Abstract

Un polinucleótido aislado que funciona como un elemento regulador, el polinucleótido aislado comprendiendo al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8, siendo dicho elemento regulador capaz de regular la expresión de una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor funcional en células endoteliales.

Description

Promotores que exhiben especificidad por células endoteliales y métodos para su utilización.

La presente invención se relaciona con un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, con una construcción de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 8, 31, con una célula de mamífero de acuerdo de acuerdo con las reivindicaciones 10, 33, con el uso de un promotor funcional en células endoteliales de acuerdo con la reivindicación 11, con el uso de una construcción de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 20, 34, 38, con un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 26.

La presente invención se relaciona con secuencias aisladas de polinucleótido que exhiben actividad promotora específica de células endoteliales, y métodos para su uso y, más particularmente con un promotor de preproendotelina-1 modificada (PPE-1) que exhibe mayor actividad y especificidad en células endoteliales. La invención se relaciona además con modificaciones del promotor PPE que mejora su expresión en respuesta a condiciones fisiológicas incluidas hipoxia y angiogénesis.

La terapia génica es una modalidad emergente para el tratamiento de enfermedades humanas adquiridas y heredadas. Se dirigen grandes esfuerzos al desarrollo de métodos para la terapia génica del cáncer, enfermedades vasculares periféricas y cardiovasculares, pero existe aún un obstáculo importante para el suministro de genes efectivos y específicos. En general, el factor limitante principal de la terapia génica con un gen de interés utilizando un vector viral recombinante como lanzadera es la habilidad para dirigir específicamente el gen de interés al tejido objetivo. Los adenovirus que se utilizan para este propósito son capaces de infectar una gran variedad de células con diferentes afinidades. En realidad, el uso de un promotor específico para el tejido induce hasta un 95% de la expresión del gen de interés en el hígado; por lo tanto es muy necesaria la regulación de la expresión. Además, actualmente es factible diferenciar entre endotelio vascular normal y endotelio vascular en desarrollo en un tumor en crecimiento cuando se destina un gen.

Tanto en el desarrollo del cáncer como de enfermedades vasculares, la angiogénesis, la creación de nuevos vasos, juega un papel principal. Por lo tanto, la regulación de este proceso por medio de terapia génica del endotelio vascular puede ser tremendamente importante en la inducción de terapia dirigida para estas enfermedades.

Se obtuvo una alta eficiencia de la preproendotelina-1 (PPE-1) humana, emitida por un vector retroviral, en células endoteliales (EC) in vitro, y en modelos de animales transgénicos. Sin embargo, el estado del arte no enseña el uso de este promotor para terapia génica in vivo. La PPE-1 humana carece de los elementos reguladores encontrados en los genes para la PPE-1 de otros animales, más notablemente el ratón.

La patente estadounidense No. 5.747.340 enseña el uso del promotor de PPE-1 de múrido y de porciones del mismo. Sin embargo, esta patente no contiene indicios o sugerencias de que se pueda emplear un reforzador endotelial específico para incrementar el nivel de expresión logrado con el promotor PPE mientras se preserva la especificidad endotelial. Además, esta patente no enseña que el promotor de PPE-1 sea inducido hasta niveles más altos de transcripción bajo condiciones hipóxicas.

Sun Guo y colaboradores describen un análisis funcional del promotor del gen para la preproendotelina-1 en células epiteliales pulmonares y en monocitos. Biochemical y Biophysical Research Communications, vol. 221, no. 3, 1996, páginas 647-652.

Minchenko Alexander y colaboradores se refieren a la regulación de la expresión del gen para la endotelina-1 en células endoteliales microvasculares humanas por hipoxia y cobalto: Role of hipoxia responsive element, Molecular y Cellular Biochemistry, vol. 208, no. 1-2, Mayo 2000 (2000-05), páginas 53-62.

Bu y colaboradores se refieren a la identificación de una región reguladora específica de células endoteliales en el gen para endotelina-1 de múrido, Journal of Biological Chemistry, 19.12.1987, vol. 51, no. 51, páginas 32613-32622.

Jäger y colaboradores describen el reconocimiento transcripcional específico de células endoteliales de un vector híbrido retroviral de repetición terminal larga que contiene secuencias del promotor de prepro-endotelina-1humana, Journal of Virology, Diciembre 1999, vol. 73, no. 12, páginas 9702-9709.

Existe por lo tanto una necesidad ampliamente reconocida por, y sería muy conveniente tener, un promotor mejorado específico de células endoteliales, métodos de uso para el mismo y células transformadas con el mismo que carezcan de las limitaciones anteriores. Se espera que la invención descrita demuestre una utilidad adicional en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, cáncer y cicatrización de heridas con relación a las configuraciones previamente conocidas.

El polinucleótido aislado está definido en la reivindicación 1, la construcción de ácido nucleico está definida en las reivindicaciones 8 y 31, una célula de mamífero está definida en las reivindicaciones 10 y 33, el uso de un promotor funcional en células endoteliales está definido en la reivindicación 11, el uso de una construcción de ácido nucleico está definido en las reivindicaciones 20, 34 y 38 y el polinucleótido aislado está definido en la reivindicación 26.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que funciona como un promotor en células eucariotas. El polinucleótido aislado incluye un elemento reforzador que cuenta al menos con dos copias de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para expresar una secuencia de ácido nucleico de interés, que codifica una molécula activa de ARN o una proteína tal como una enzima, una molécula reportera y similares en células endoteliales. El método incluye la administración a un individuo de una construcción que incluye la secuencia de ácido nucleico de interés posicionada bajo el control regulatorio de un promotor funcional en células eucariotas. La construcción incluye además un elemento reforzador que incluye al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

De acuerdo aún con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para regular la angiogénesis en un tejido. El método comprende la administración de una construcción de ácido nucleico que incluye: (a) un promotor específico de una célula endotelial; (b) al menos una copia de un elemento de respuesta a una hipoxia expuesto en la SEQ ID NO. 5; y (c) una secuencia de ácido nucleico que codifica un regulador de angiogénesis, estando la secuencia de ácido nucleico bajo control regulador del promotor y el elemento de respuesta a la hipoxia.

De acuerdo aún con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que funciona como promotor en células eucariotas. El polinucleótido aislado comprende un elemento reforzador que incluye la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 7.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para regular la angiogénesis en un tejido. El método comprende la administración de una construcción de ácido nucleico que incluye: (a) un promotor específico de una célula endotelial; (b) un elemento reforzador que incluye la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 7; (c) al menos una copia de un elemento de respuesta a una hipoxia expuesto en la SEQ ID NO. 5; y (d) una secuencia de ácido nucleico que codifica un regulador de angiogénesis, estando la secuencia de ácido nucleico bajo control regulador del promotor, el elemento reforzador y el elemento de respuesta a la hipoxia.

De acuerdo aún con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que funciona como promotor en células eucariotas, el polinucleótido aislado comprende un elemento reforzador que incluye al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8.

De acuerdo aún con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para expresar una secuencia de ácido nucleico de interés en células endoteliales, el método incluye la administración a un individuo una construcción, la construcción incluye la secuencia de ácido nucleico de interés posicionada bajo el control regulador de un promotor que funciona en células eucariotas, y un elemento reforzador que incluye al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8.

De acuerdo aún con otro aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que funciona como promotor en células eucariotas, el polinucleótido aislado comprende un elemento reforzador que incluye la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8.

De acuerdo con características adicionales en modalidades preferidas de la invención descrita más abajo, el elemento reforzador incluye tres copias de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

De acuerdo con características aún adicionales en modalidades preferidas de la invención, al menos dos copias de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6 son contiguas.

De acuerdo con características aún adicionales en modalidades preferidas de la invención, el polinucleótido aislado incluye además un elemento del promotor endotelial específico.

De acuerdo con características aún adicionales en modalidades preferidas de la invención, el elemento promotor endotelial específico incluye al menos una copia del promotor de PPE-1.

De acuerdo con características aún adicionales en modalidades preferidas de la invención, el polinucleótido aislado incluye además un elemento de respuesta a la hipoxia.

De acuerdo con características aún adicionales en modalidades preferidas de la invención, el elemento de respuesta a la hipoxia incluye al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5.

De acuerdo con características aún adicionales en modalidades preferidas de la invención, el elemento reforzador es como el expuesto en la SEQ ID NO: 7.

De acuerdo con características aún adicionales en modalidades preferidas de la invención, se proporciona una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido aislado reivindicado y una secuencia de ácido nucleico de interés, estando la secuencia de ácido nucleico de interés bajo el control regulador del polinucleótido aislado.

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De acuerdo con características aún adicionales en modalidades preferidas de la invención, se selecciona la secuencia de ácido nucleico de interés del grupo que consiste de VEGF, p55 y PDGF-BB.

De acuerdo con características aún adicionales en modalidades preferidas de la invención, se proporciona una célula de mamífero transformada con un polinucleótido aislado reivindicado.

De acuerdo con características aún adicionales en modalidades preferidas de la invención, el promotor exhibe especificidad por células endoteliales.

De acuerdo con características aún adicionales en modalidades preferidas de la invención, el promotor es el promotor de PPE-1 como se expone en la SEQ ID NO: 1.

De acuerdo con características aún adicionales en modalidades preferidas de la invención, se efectúa la administración por medio de un método seleccionado del grupo que consiste de: (i) administración sistémica in vivo; (ii) administración ex vivo a células removidas del cuerpo de un individuo y posterior reintroducción de las células en el cuerpo del individuo; y (iii) administración local in vivo.

De acuerdo con características aún adicionales en modalidades preferidas de la invención, la construcción de ácido nucleico comprende además un elemento reforzador que incluye al menos dos copias de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

De acuerdo con características aún adicionales en modalidades preferidas de la invención, el promotor específico de células endoteliales incluye al menos una copia del promotor de PPE-1.

De acuerdo con características aún adicionales en las modalidades preferidas descritas, el elemento reforzador incluye además al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

De acuerdo con características aún adicionales en las modalidades preferidas descritas, el elemento reforzador incluye una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8 y al menos dos copias de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

De acuerdo con características aún adicionales en las modalidades preferidas descritas, al menos una copia incluye dos copias.

De acuerdo con características aún adicionales en las modalidades preferidas descritas, la construcción de ácido nucleico incluye además un elemento reforzador que contiene al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8.

De acuerdo con aún otro aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para regular la angiogénesis en un tejido, comprendiendo el método la administración de una construcción de ácido nucleico que incluye: (a) un promotor específico de células endoteliales; (b) un elemento reforzador que incluye al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8; y (c) una secuencia de ácido nucleico que codifica un regulador de angiogénesis, estando la secuencia de ácido nucleico bajo el control regulador del promotor y del elemento reforzador.

La presente invención aborda con éxito las deficiencias de las configuraciones actualmente conocidas suministrando secuencias mejoradas de polinucleótidos aislados con la especificidad de las células endoteliales, y métodos para uso de los mismos. Las mejoras en la secuencia hacen factible métodos de tratamiento de una variedad de enfermedades, trastornos y condiciones que antiguamente eran considerados impracticables. Específicamente, las mejoras se relacionan con una mayor especificidad a células endoteliales, mayores niveles de expresión de una secuencia de interés y una mayor inducción por condiciones que incluyen isquemia y angiogénesis.

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Breve descripción de los dibujos

Se describe aquí la invención, únicamente a manera de ejemplo, con referencia a los dibujos acompañantes. Con referencia específica ahora a los dibujos en forma detallada, se destaca que los datos mostrados son solo a manera de ejemplo y para propósitos únicamente de una discusión ilustrativa de las modalidades preferidas de la presente invención, y se presentan en razón a que se cree que son la descripción más útil y fácilmente entendible de los principios y aspectos conceptuales de la invención. En este sentido, no se hace ningún intento por mostrar detalles estructurales de la invención más allá de lo realmente necesario para una cabal comprensión de la invención, haciéndose evidente a partir de la descripción junto con los dibujos para aquellos capacitados en el arte como pueden ser incluidas en la práctica las diferentes formas de la invención. En los dibujos:

La Fig. 1 es un histograma que ilustra el efecto del elemento reforzador de la presente invención sobre a expresión de la Luciferasa tanto en líneas de células endoteliales humanas como de bovino utilizando la línea de células B2B como control no endotelial.

La Fig. 2 es un histograma que ilustra la especificidad endotelial de un promotor de la presente invención en un vector adenoviral sobre la expresión de la Luciferasa en diferentes líneas de células.

Las Figs. 3A y 3B son fotomicrografías que ilustran la expresión de GFP bajo el control de Ad5PPE-1-3X de la presente invención y una construcción de control Ad5CMV en la línea de células BAEC.

La Fig. 4 es un histograma del % de apoptosis inducida por pACPPE-1-3Xp55, pACPPE-1- 3XLuciferasa y pCCMVp55 en células endoteliales y no endoteliales.

La Fig. 5 es un histograma que ilustra el efecto de introducir un elemento reforzador de acuerdo con la presente invención en una construcción de un promotor en respuesta a la hipoxia.

La Fig. 6 es un histograma que ilustra el efecto de introducir un elemento reforzador de acuerdo con la presente invención en un promotor de una construcción de un adenovector en respuesta a la hipoxia.

La Fig. 7 es un histograma que ilustra el efecto de introducir un elemento reforzador de acuerdo con la presente invención en un promotor en niveles de expresión en líneas de células endoteliales humanas y de bovino.

La Fig. 8 es un histograma que ilustra los niveles de expresión de un gen reportero observado en diferentes órganos después de la inyección de una construcción adenoviral que contiene ya sea un promotor endotelial (PPE-1) o un promotor de control (CMV);

Las Figs. 9A-B son dos fotomicrografías que ilustran la expresión celular de una construcción Ad5CMVGFP (Figura 9a) y una construcción Ad5PPE-GFP (Figura 9b) en tejido de hígado de ratones inyectados con las construcciones.

La Fig. 10 es un histograma que ilustra el efecto de introducir un elemento reforzador de acuerdo con la presente invención en un promotor en niveles de expresión en líneas de células endoteliales y no endoteliales.

La Fig. 11 es un histograma que ilustra el efecto de introducir un elemento reforzador de acuerdo con la presente invención en un promotor en niveles de expresión en líneas de células endoteliales y no endoteliales.

Las Figs. 12A-C son fotomicrografías que ilustran la expresión de GFP en células transducidas Ad5PPE-1-3XGFP, células transducidas Ad5PPE-1-GFP y células transducidas Ad5CMVGFP respectivamente.

Las Figs. 13A-B ilustran la expresión de GFP en SMC transducidas por moi-1 de Ad5PPE- 3XGFP y Ad5CMVGFP respectivamente.

Las Figs. 14A-B muestran los resultados de un experimento similar a aquel de las Figuras 13A-B llevado a cabo en células HeLa.

Las Figs. 15A-B muestran los resultados de un experimento similar a aquel de las Figuras 13A-B llevado a cabo en células HepG2.

Las Figs. 16A-B muestran los resultados de un experimento similar a aquel de las Figuras 13A-B llevado a cabo en células NSF.

Las Figs. 17A-B son fotomicrografías que ilustran la expresión de GFP en células endoteliales que revisten un vaso sanguíneo de ratones inyectados con las construcciones Ad5PPE-1GFP y Ad5PPE-1-3XGFP respectivamente.

Las Figs. 18A-C son fotomicrografías que ilustran los resultados de tejido de ratón de ratones inyectados. Ratones inyectados con Ad5CMVGFP (Figura 18A), Ad5PPE-1GFP (Figura 18B; es visible una expresión ligeramente superior de GFP en la pared del vaso sanguíneo; indicada por una flecha) y Ad5PPE-1-3XGFP (Figura 18C).

Las Figs. 19A-C ilustran experimentos similares a aquellos descritos en las Figs. 18A-C, llevados a cabo sobre secciones de tejido de bazo.

Las Figs. 20A-D y 20C'-D' ilustran la expresión de GFP en pulmones metastáticos de ratones de control inyectados con Suero Fisiológico (Figura 20A), ratones inyectados con Ad5CMVGFP (Figura 20B), ratones inyectados con Ad5PPE-1GFP (Figura 20C) y ratones inyectados con Ad5PPE-1-3XGFP (Figura 20D). La inmunocoloración con anti Cd31 (Figuras 20C' a 20D') confirma la colocalización de la expresión de GFP y la expresión de CD31 en cada tejido metastático.

La Fig. 21 es un histograma que ilustra qué actividad de Luciferasa (unidades de luz/\mug de proteína) en BAEC transfectada por un plásmido que contiene al promotor de PPE-1 de múrido es significativamente superior cuando las células transfectadas fueron incubadas bajo condiciones hipóxicas.

La Fig. 22 es un histograma como en la Figura 21, excepto porque se emplearon Ad5PPE-1Luc y Ad5CMVLuc.

La Fig. 23 es una serie de histogramas como en la Figura 22 que muestran los efectos de la hipoxia en diferentes líneas de células.

La Fig. 24 es un histograma que ilustra el efecto de la secuencia 3X de la presente invención sobre la respuesta a la hipoxia de la PPE-1 en células BAEC. Las células fueron transducidas por Ad5PPE-1Luc y Ad5PPE-1-3XLuc.

La Fig. 25 es un histograma que muestra los niveles de expresión de Luciferasa en ratones transgénicos PPE-1Luc después de la ligación de la arteria femoral.

Las Figs. 26A-B son mapas de plásmido de las construcciones empleadas junto con la presente invención.

Las Figs. 27A-D son series de imágenes de ultrasonido de extremidades ligadas de animales representativos de los diferentes grupos de tratamiento, 21 días después de la ligación. La Figura 27A, Control, Tratado con Ad5CMVLuc, la Figura 27B Control, tratado con solución salina; la Figura 27C, tratado con Ad5PPE-3X-VEGF; la Figura 27D tratado con Ad5CMV-VEGF.

La Fig. 28 es un histograma que ilustra la actividad de la Luciferasa en Células Endoteliales Aórticas de Bovino en proliferación y en reposo (BAEC) transducidas con Ad5PPE-1Luc (barras sin relleno) y Ad5CMVLuc (barras de color negro).

La Fig. 29 es un histograma que ilustra la actividad de la Luciferasa en BAEC transducidas con Ad5PPE-1Luc durante proliferación normal, un estado de reposo y proliferación rápida después de la adición de VEGF.

Las Figs. 30A-B son histogramas que ilustran la actividad de la Luciferasa (unidades de luz/\mug de proteína) en las aortas (Figura 30A) e hígados (Figura 30B) de ratones normales C57BL/6 inyectados con Ad5PPE-1Luc y Ad5CMVLuc. Se determinaron las actividades 1 (n = 13), 5 (n = 34), 14 (n = 32), 30 (n = 20) y 90 (n = 11) días después de la inyección.

Las Figs. 31A-B son histogramas que ilustran la actividad relativa de la Luciferasa (unidades de luz/\mug de proteína) detectada cinco (Figura 31A) y catorce (Figura 31B) (n = 10 para cada lapso de tiempo) días después de la inyección de Ad5PPE-1Luc (barras sin relleno) o Ad5CMVLuc (barras de color negro) en ratones BALB/C inyectados normales. La actividad se expresa como porcentaje de expresión total de Luciferasa en el organismo de cada animal.

La Fig. 32 es una imagen del estado del arte que describe una Aorta disecada de ratones deficientes en ApoE coloreados con Sudán - IV. La aorta torácica contiene menos lesión aterosclerótica teñida de rojo mientras que la región abdominal incluye muchas lesiones ateroscleróticas teñidas de rojo. (Adaptado de Imaging of Aortic atherosclerotic lesions by ^{125}I-HDL y ^{125}I-BSA. A. Shaish y colaboradores, Pathobiology - enviado para publicación).

La Fig. 33 es un histograma que ilustra la actividad absoluta de la Luciferasa (unidades de luz/\mug de proteína) detectada 5 días después de inyecciones sistémicas de Ad5PPE-1Luc (barras sin relleno; n = 12) o Ad5CMVLuc (barras de color negro; n = 12) a ratones deficientes en ApoE. La actividad de la Luciferasa observada a partir de la aorta abdominal contiene niveles de lesión altos y a partir del área torácica (bajos niveles de lesión).

La Fig. 34 es un histograma que ilustra la actividad absoluta de la Luciferasa (unidades de luz/\mug de proteína) 5 días después de inyecciones sistémicas de Ad5PPE-1Luc (barras de color negro) o Ad5CMVLuc (barras sin relleno) a ratones C57BL/6 a los que se les indujo la cicatrización de las heridas.

La Fig. 35 es un histograma que ilustra la actividad de la Luciferasa en pulmón normal, pulmón metastático y tumor primario de ratones a los que se les indujo carcinoma de pulmón de Lewis. El carcinoma de pulmón de Lewis fue inducido por inyección de células D122-96 en los lomos para modelo de tumor primario y en la pata para modelo metastático. Se midió la actividad de la Luciferasa cinco días después de inyección sistémica de Ad5PPE-1Luc (n = 9; barras sin relleno) o Ad5CMVLuc (n = 12; barras de color negro). La actividad se expresa como unidades de luz/\mug de proteína.

Las Figs. 36A-D son fotomicrografías que ilustran la expresión de GFP y la morfología del tejido en pulmones y tumores de ratones que padecen de LLC después de inyección intratumoral de Ad5PPE-1GFP. Se congeló el tejido en OCT y se lo seccionó hasta 10 \mum por medio de un criostato. Todas las imágenes fueron tomadas con una magnificación de 25x. Figura 36A-GFP en vasos sanguíneos angiogénicos de metástasis de pulmón; Figura 36B - Inmunocoloración de anticuerpo CD31 de la sección representada en la Figura 36a; Figura 36C -Expresión de GFP en vasos sanguíneos de tumor primario; Figura 36D - contraste de fases de la sección e la sección de C que ilustra vasos sanguíneos.

La Fig. 37 es un histograma que ilustra la expresión de la Luciferasa en pulmón normal y pulmón metastático de ratones a los cuales se les indujo carcinoma de pulmón de Lewis, inyectados con Ad5CMVLuc, Ad5PPE-1Luc y Ad5PPE-1-3XLuc e indujo carcinoma de pulmón de Lewis por medio de células D 122-96 inyectadas en la pata para el modelo metastático. Se midió la actividad de la Luciferasa cinco días después de la inyección sistémica de Ad5CMVLuc (n = 7; barras de color negro), Ad5PPE-1Luc (n = 6; grises) o Ad5PPE-1-3XLuc (n = 13; barras marrón). La actividad se expresa como unidades de luz/\mug de proteína.

La Fig. 38 es un histograma que ilustra la actividad de la Luciferasa como porcentaje de actividad del hígado (donde el hígado es 100%), en pulmón normal y metástasis de pulmón de ratones a los cuales se les indujo carcinoma de pulmón de Lewis inyectados con Ad5CMV, Ad5PPE-1Luc y Ad5PPE-1(3X).

La Fig. 40 es un histograma que ilustra la actividad de la Luciferasa (unidades de luz/\mug de proteína) en músculos (isquémicos y normales) de ratones transgénicos PPE-lLuciferasa a los dos, cinco, diez y 18 días después de ligación de la femoral y en control (animales no ligados - día 0; n = 8 para cada uno de los grupos).

La Fig. 41 es un histograma que ilustra la actividad de la Luciferasa (unidades de luz/\mug de proteína) en el hígado, pulmón y aorta en músculos (isquémicos y normales) de ratones transgénicos PPE-lLuciferasa a los cinco (n = 6), diez (n = 6) y 18 (n = 8) días después de ligación de la femoral y en control (animales no ligados - día 0).

La Fig. 42 es un histograma que ilustra la actividad de la Luciferasa, (unidades de luz/\mug de proteína) detectada en los hígados, pulmones y tumores primarios de ratones con LLC inyectados en tumores primarios con Ad5CMVLuc (barras de color negro) o Ad5PPE-1Luc (barras sin relleno).

Descripción de las modalidades preferidas

La presente invención es de un promotor mejorado específico de células endoteliales que puede ser empleado para dirigir en forma confiable la expresión de alto nivel de una secuencia de interés en células endoteliales y en particular células endoteliales que participan en angiogénesis.

Los principios y el uso de la presente invención pueden ser mejor entendidos con referencia a los dibujos y descripciones acompañantes.

Antes de explicar al menos una modalidad de la invención en detalle, debe entenderse que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles de construcción y la disposición de los componentes expuestos en la siguiente descripción o ilustrados en los ejemplos y dibujos. La invención es capaz de otras modalidades o de ser practicada o llevada a cabo en diferentes formas. También, se debe entender que la fraseología y terminología empleada aquí sirve para la descripción y no debe ser considerada como limitante.

Aunque se han descrito previamente promotores endoteliales específicos (por ejemplo, en la patente estadounidense No. 5.747.340), esos promotores han sido típicamente ineficientes para dirigir la expresión en células endoteliales o no se ha demostrado que sean específicos para células endoteliales in vivo.

También se han descrito elementos reforzadores específicos para células endoteliales. Bu y colaboradores (J. Biol Chem. (1997) 272 (19): 32613-32622) han demostrado que tres copias (3X) del elemento reforzador 1X de PPE-1 (que contiene elementos ETE-C, ETE-D, y ETE-E) dota secuencias promotoras con especificidad de células endoteliales in vitro, aunque tal actividad no ha sido demostrada in vivo.

Como se conoce bien en el arte, los experimentos in vitro no pueden predecir en forma confiable resultados in vivo. De modo que, los resultados de Bu y colaboradores, aunque sugestivos de especificidad de células endoteliales, no proporcionan evidencia suficiente en cuanto a la utilidad del elemento reforzador 3X in vivo.

La falta de estudios in vivo también cuestiona la especificidad de las células endoteliales del elemento reforzador 3X en organismos completos. La carencia de estos datos implica que la aplicación terapéutica de este elemento es cuestionable, debido a que cuando se emplea in vivo, y en particular cuando se emplea para regularla angiogénesis, es imperativo que la expresión de un regulador de angiogénesis (por ejemplo, una toxina celular) sea dirigida específicamente a célula endoteliales, preferiblemente en un subconjunto específico de células endoteliales que están involucradas en angiogénesis.

Como se ilustra en la sección de ejemplos que se presenta más adelante, los presentes inventores, a través de experimentación laboriosa, han presentado, por primera vez, evidencia concluyente en cuanto a la actividad in vivo del elemento reforzador 3X. Tal evidencia identifica al elemento 3X y sus derivados de secuencia (por ejemplo, SEQ ID NO: 7) como muy adecuados para uso en aplicaciones terapéuticas.

Además, en la reducción de la presente invención a la práctica, se ha descubierto que una nueva configuración de la secuencia reforzadora PPE-1 de la presente invención dota a las secuencias del promotor con una actividad inesperada y altamente específica en células endoteliales que participan en angiogénesis.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido funcional aislado como un promotor específico de células endoteliales en un mamífero tal como un ser humano.

El polinucleótido aislado comprende un elemento reforzador que incluye una o más copias de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6 y preferiblemente una o más copias de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8, que como se ilustra en la sección de Ejemplos que se presenta más adelante, juega un importante papel en la regulación de la expresión en células endoteliales que participan en angiogénesis.

Una configuración de secuencia, nueva y específica, de un elemento reforzador utilizable por la presente invención es ilustrada en la SEQ ID NO: 7.

Para los propósitos de esta especificación y las reivindicaciones acompañantes, el término "reforzador" se refiere a cualquier secuencia de polinucleótidos que incrementa la eficiencia transcripcional de un promotor.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el polinucleótido aislado incluye copias contiguas de las SEQ ID NOs: 6 y/o 8. Tales secuencias se posicionan preferiblemente en una orientación de cabeza a cola, aunque, el elemento reforzador de la presente invención puede incluir también una o más copias de una porción específica de la secuencia de la SEQ ID NO: 6 u 8, en una orientación invertida, por ejemplo, usando secuencias complementarias a SEQ ID NO: 6 u 8 en la construcción del elemento reforzador.

Preferiblemente, el polinucleótido aislado incluye además un elemento de la secuencia promotora específico de células endoteliales. Para los propósitos de esta descripción y las reivindicaciones acompañantes, el término promotor "promotor" se refiere a cualquier secuencia de polinucleótidos capaz de mediar la transcripción del ARN de una secuencia de interés secuencia abajo. El elemento promotor específico endotelial puede incluir, por ejemplo, al menos una copia el promotor de PPE-1.

Preferiblemente, el polinucleótido aislado incluye además un elemento de respuesta a la hipoxia, por ejemplo al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5.

Por lo tanto, de acuerdo con este aspecto de la presente invención, se proporciona un promotor específico de célula endotelial que incluye diferentes configuraciones del elemento reforzador.

Se apreciará que las secuencias del elemento reforzador se pueden posicionar dentro de la secuencia utilizada del promotor, secuencia arriba del promotor, entre el promotor y una secuencia de interés secuencia abajo o dentro de la secuencia de interés (por ejemplo, un intrón).

La secuencia aislada de ácido nucleico de la presente invención puede ser utilizada para regular la expresión génica en tejido eucariota, y en particular, en la proliferación de células endoteliales, por ejemplo células endoteliales involucradas en angiogénesis.

Por lo tanto, la secuencia aislada de polinucleótido de la presente invención puede ser suministrada, en algunos casos, como parte de una construcción de ácido nucleico que incluye además una secuencia de ácido nucleico de interés que se posiciona bajo el control regulador del polinucleótido aislado de la presente invención. Se apreciará que tal construcción de ácido nucleico puede incluir además cualquiera de las secuencias adicionales de polinucleótido tales como por ejemplo, las secuencias que codifican marcadores de selección, origen de replicación en bacterias, o secuencias que codifican polipéptidos reporteros. Tal construcción de ácido nucleico está preferiblemente configurada para expresión en células de mamífero y puede ser de origen viral. Se conocen en el arte numerosos ejemplos de construcciones de ácido nucleico adecuadas para la expresión en mamíferos; la sección de Ejemplos que viene más adelante proporciona detalles adicionales de varias de tales construcciones.

Para los propósitos de esta especificación y las reivindicaciones acompañantes, la frase "secuencia de interés" se refiere a cualquier secuencia de polinucleótidos que tenga la capacidad de ser transcrita por una ARN polimerasa. Esta definición incluye secuencias de codificación traducibles en polipéptidos, así como secuencias para ARN antisentido, ARN que enlace ADN, ribozimas y otras fracciones moleculares que no están destinadas a experimentar traducción. Los ejemplos de secuencias de ácido nucleico de interés que pueden ser utilizadas por la construcción de acuerdo con la presente invención se proporcionan aquí más abajo y en la sección de Ejemplos que se presenta más adelante.

Los ejemplos presentados aquí más abajo ilustran que los promotores mejorados específicos de células endoteliales de la presente invención pueden dirigir fácilmente la expresión de un gen reportero a tejido endotelial después de la administración sistémica in vivo. Estos ejemplos muestran además, por primera vez, que el polinucleótido aislado de la presente invención puede ser utilizado para expresar preferencialmente una proteína reportera (GFP) en tejido aterosclerótico y/o angiogénico, suministrando así por primera vez evidencia directa en cuanto a la importancia del elemento reforzador PPE-1 y su derivado en aplicaciones terapéuticas.

Mientras que el uso de una proteína reportera, tal como GFP, puede tener utilidad en la detección de etapas tempranas del crecimiento de tumores metastáticos, especialmente en modelos animales, o para representación óptica no invasiva de metástasis (Yang, M. y colaboradores, Proc. Nat. Acad. of Sci. (2001) 27: 2616-2621) tal uso es únicamente una pequeña porción de la utilidad proyectada de la invención reivindicada. Se cree, por ejemplo, que se puede utilizar AdPPE-1GFP en combinación con AdPPE1tk, AdPPE-1p55 y/o otros tratamientos anti-angiogénicos, con el propósito de seguir y tratar angiogénesis por medio de un método relativamente no invasivo.

Se predice que el reemplazo del gen reportero GFP con un factor inductor de apoptosis (por ejemplo, p55; número de acceso al GenBank M75866) en una construcción, por ejemplo de AdPPE-1- 3X-p55, dirige en forma confiable la apoptosis hasta una proliferación rápida de células endoteliales en vasos sanguíneos angiogénicos de un tumor en crecimiento. Debido a que tal vector puede ser administrado sistémicamente, puede ser empleado para inducir afectivamente apoptosis en focos metastáticos en desarrollo, sin descubrir la localización de esos focos. Tal uso representa una mejora significativa en comparación con la práctica del estado del arte. Por medio de la inducción de apoptosis específicamente en el desarrollo de vasculatura, es factible eliminar angiogénesis.

Se puede utilizar una aproximación opuesta para revascularizar tejido, por ejemplo en pacientes ateroscleróticos o en pacientes que hayan sufrido un deterioro significativo de la circulación periférica como resultado de una enfermedad o de una lesión. En este caso, se puede emplear una construcción del tipo AdPPE-1-3X-GF, en donde GF es un factor de crecimiento (por ejemplo, citoquina) o modificantes del mismo (por ejemplo, AdPPE-1-SEQ ID NO: 7-GF). Los factores de crecimiento adecuados para uso en este contexto incluyen, pero no se limitan a, VEGF (número de acceso al GenBank M95200) y PDGF- BB de rata (número de acceso al GenBank; 99% de identidad con mus-AF162784) y EGR-1 (número de acceso al GenBank M22326) los FGF (incluyendo, pero sin limitarse a, el número de acceso al GenBank XM 003306) y combinaciones de los mismos.

Se apreciará que se puede utilizar la incorporación de un elemento de respuesta a la hipoxia (por ejemplo, la SEQ ID NO: 5) dentro de la secuencia del promotor de la presente invención para reforzar más la expresión selectivamente con tejidos isquémicos, condiciendo por lo tanto a neovascularización de tejidos seleccionados. A medida que mejora el suministro de sangre, se alivia la isquemia, el elemento de respuesta a la hipoxia deja de ser inducido, declinan los niveles de GF y se detiene el proceso de neovascularización.

Las secuencias promotoras generadas de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención son particularmente útiles en la regulación de la angiogénesis en un tejido. Como se ilustra en la sección de Ejemplos que viene más adelante, la secuencia promotora que contiene 3X modificada (SEQ ID NO: 7) de la presente invención y al promotor de PPE-1 no modificado se expresan ambos en focos metastáticos del modelo de LLC. Sin embargo, el ejemplo 22 ilustra claramente que la secuencia 3X modificada es específicamente responsable tanto por la disminución en los niveles de expresión del gen reportero en un pulmón normal y un dramático incremento en la expresión del gen reportero en focos metastáticos. No existe ni una indicación ni una sugerencia en el estado del arte de que se pudiera lograr tal resultado. Por lo tanto, se puede esperar que el uso de una construcción que incluya al elemento 3X en el contexto de una terapia génica maximice el suministro a los tumores mientras minimice los efectos tóxicos los efectos tóxicos en el tejido normal circundante. Significativamente, esto es verdad incluso si el tejido circundante contiene un componente endotelial, como se ilustra en la Figura 37. Esto es debido a que, como se demuestra en el ejemplo 11, la secuencia 3X incrementa grandemente el nivel de expresión en tejido endotelial en rápida proliferación, incluso en el contexto del promotor de PPE-1.

Por ejemplo, el gen p55 podría ser utilizado junto con un promotor de la presente invención que contenga un elemento de respuesta a la hipoxia con el propósito de inducir específicamente apoptosis en tumores en crecimiento. Tal estrategia es considerada factible ya que una masa de tumor en crecimiento tiende a la isquemia a medida que el crecimiento del tumor a menudo excede la capacidad angiogénica del tejido circundante. Otras toxinas expresables de la célula que pueden ser utilizadas junto con la secuencia promotora de la presente invención con el propósito de reducir específicamente una masa tumoral incluyen, pero no se limitan a, otros genes proapoptóticos, el gen de timidina quinasa del Herpes simple (HSV-tk; incluido en el vector de expresión pORF-HSV1tk disponible con InvivoGen, San Diego, CA), angiostatina (número de acceso del GenBank X05199), endostatina (número de acceso del GenBank M33272) y una quimera de angiostatina-endostatina (incluida en el vector de expresión pORF-HSV1tk disponible con InvivoGen, San Diego, CA).

Alternativamente, o adicionalmente, los genes de la angiostatina o la endostatina podrían ser utilizados junto con un promotor de la presente invención con el propósito de bloquear específicamente la angiogénesis sin inducir apoptosis.

Por lo tanto, de acuerdo con modalidades alternativas preferidas, se puede estimular o bloquear la angiogénesis. Esta flexibilidad permitirá usos variados de la invención, incluyendo, pero sin limitarse a, la reducción de la masa de un tumor y la revascularización de regiones ateroscleróticas del corazón o la neovascularización de tejidos periféricos con un suministro inadecuado de sangre. Un escenario clínico relevante es el uso de un promotor de acuerdo con la presente invención para generar nuevos vasos sanguíneos para incrementar el suministro de sangre en extremidades de pacientes diabéticos.

La construcción de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se puede administrar a un individuo en sí mismo (mamíferos, preferiblemente humanos), o en una composición farmacéutica donde se mezcla con portadores o excipientes adecuados.

Como se la utiliza aquí, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de uno o más de los ingredientes activos descritos aquí con otros componentes químicos tales como portadores y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.

Aquí el término "ingrediente activo" se refiere a la construcción de ácido nucleico responsable por el efecto biológico.

De aquí en adelante, las frases "portador fisiológicamente aceptable" y "portador farmacéuticamente aceptable" que pueden ser utilizadas en forma intercambiable se refieren a un portador o a un diluyente que no causa una irritación significativa a un organismo y que no se abroga la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Un adyuvante está incluido bajo estas frases.

Aquí el término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un ingrediente activo. Los ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diferentes azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilén glicoles.

Las técnicas para formulación y administración de medicamentos se pueden encontrar en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden fabricar por medio de procesos bien conocidos en al arte, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, elaboración de grageas, levigación, emulsificación, encapsulación, entrapamiento o liofilización.

Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la presente invención se pueden formular por lo tanto en forma convencional utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que contienen excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos en preparaciones que pueden ser utilizadas farmacéuticamente. La formulación adecuada depende de la ruta de administración escogida.

Para inyección, los ingredientes activos de la composición farmacéutica se pueden formular en soluciones acuosas, preferiblemente en amortiguadores fisiológicamente compatibles tales como la solución de Hank, la solución de Ringer, o un amortiguador fisiológico salino. Para administración transmucosa, se utilizan penetrantes apropiados en la formulación para la barrera que va a ser permeada. Tales penetrantes son generalmente conocidos en el arte.

Se apreciará que el polinucleótido aislado de la presente invención ha sido aislado con base en su capacidad para promover o reforzar la transcripción en células eucariotas de un linaje endotelial. Por lo tanto, una célula de mamífero transformada con un polinucleótido aislado reivindicado es una modalidad adicional de la invención. En los ejemplos citados aquí más adelante se suministran numerosos ejemplos de tales células transformadas.

Aunque los ejemplos suministrados aquí más adelante tratan específicamente con el uso de la secuencia 3X junto con el promotor de PPE-1, se anticipa que la secuencia reforzadora de la presente invención ejercerá también su efecto específico en la célula cuando se la utiliza con otras secuencias promotoras eucariotas.

Tal anticipación se basa en hallazgos del estado del arte que muestran que los elementos reforzadores son a menudo portátiles, es decir, que pueden ser transferidos de una secuencia promotora a otra secuencia promotora no relacionada y mantendrán aún la actividad. Por ejemplo, ver D. Jones y colaboradores. (Dev. Biol. (1995) 171(1): 60-72); N. S. Yew y colaboradores, (Mol. Ther. (2001) 4: 75-820) y L. Wu y colaboradores (Gene Ther. (2001) 8: 1416-26). En realidad, el trabajo anterior de Bu y colaboradores. (J. Biol Chem. (1997) 272 (19): 32613-32622) sugiere fuertemente que los elementos reforzadores relacionados con aquellos de la presente invención, por ejemplo reforzadores que incluyen la SEQ ID NO: 6, pueden ser utilizados con promotores constitutivos, por ejemplo el promotor SV-40. Como tales, las construcciones que contienen, los métodos que emplean y los polinucleótidos aislados que incluyen un promotor eucariota modificado para incluir la secuencia reforzadora de la presente invención están también dentro del alcance de la invención reivindicada.

Por lo tanto, se postula que una configuración mínima de un elemento reforzador de acuerdo con la presente invención es un polinucleótido aislado como el expuesto en la SEQ ID NO: 8. Se anticipa que este reforzador funciona con una gran variedad de promotores, incluyendo pero sin limitarse a promotores endoteliales específicos (por ejemplo, PPE-1; SEQ ID NO: 1) y promotores constitutivos, por ejemplo promotores virales tales como aquellos derivados de CMV y SV-40. Este reforzador debe ser capaz de impartir especificidad endotelial a una gran variedad de promotores. El elemento reforzador puede ser aumentado, por ejemplo por medio de la adición de una o más copias de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6. Estas secuencias adicionales se pueden añadir en forma contigua o no contigua a la secuencia de la SEQ ID NO: 8.

La presente invención incluye además un método de expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés en células endoteliales empleando una construcción que se basa en un elemento reforzador que incluye al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8 y un promotor para dirigir la expresión de alto nivel de la secuencia de interés específicamente a células endoteliales.

Como se lo utiliza aquí "administración ex vivo a células removidas del organismo de un individuo y la posterior reintroducción de las células en el organismo del individuo" incluye específicamente el uso de células madre no humanas como se describe en (Lyden y colaboradores (2001) Nature Medicine 7: 1194-1201).

Aunque se emplean adenovirus en los experimentos descritos en los ejemplos presentados aquí a continuación, las construcciones de la presente invención podrían ser fácilmente adaptadas por aquellos ordinariamente capacitados en el arte a otros sistemas de suministro adenoviral.

Objetivos adicionales, ventajas, y nuevas características de la presente invención serán evidentes para alguien normalmente capacitado en el arte por medio del examen de los siguientes ejemplos, que no pretenden constituirse en limitantes. Adicionalmente, cada una de las diferentes modalidades y aspectos de la presente invención como se delinearon aquí anteriormente y como se reivindican en la sección de las reivindicaciones más adelante, encuentran soporte experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Se hace referencia ahora a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la invención en una forma no limitante.

Generalmente, la nomenclatura utilizada aquí y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Tales técnicas son explicadas completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook y colaboradores, (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel y colaboradores, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley y Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson y colaboradores, "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren y colaboradores (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); las metodologias expuestas en las patentes estadounidenses Nos. 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites y colaboradores (eds), "Basic y Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman y Co., New York (1980); los inmunoensayos disponibles están extensamente descritos en patentes y literatura científica, ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription y Translation" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R I., ed. (1986); "Immobilized Cells y Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak y colaboradores, "Strategies for Protein Purification y Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996).

A través de todo este documento se suministran otras referencias generales. Se cree que los procedimientos allí descritos son conocidos en el arte y se suministran para conveniencia del lector.

Específicamente, los experimentos llevados a cabo junto con los ejemplos descritos aquí más adelante emplearon los siguientes métodos y materiales:

Materiales y Métodos Cultivo de células

Se cultivaron células de Carcinoma de Pulmón de Lewis - (D122-96) (gentilmente suministradas por el Prof. L. Eisenbach, The Weizmann Institute of Science Rehovot, Israel), de Riñón Embrionario Humano (293) y HeLa en 4,5 g/l de DMEM, suplementado con suero de ternera fetal al 10% (FCS), 50 U/ml de penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina y glutamina 2 mM (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel). Se cultivaron Células Endoteliales Aórticas de Bovino-BAEC (gentilmente suministradas por el Prof. N. Savion, Goldshlager Institute, Sheba Medical Center, Tel- Hashomer, Israel), Fibroblastos Normales de Piel-NSF, HepG2 y Células Endoteliales Umbilicales Humanas-HUVEC-304 (ATCC, EUA) en 1,0 g/l de DMEM (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel), suplementado con FCS al 5%, 50 U/ml de penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina y glutamina 2 mM. Se suplementaron las células BAEC con factor de crecimiento completo de fibroblastos (Sigma, St. Louis, MO). Se cultivaron RINr1046-38 (RIN-38) en medio 199 de sales de Earle (glucosa 5,5 M) suplementado con FCS al 5% (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel), 50U de penicilina/ml, 50 \mug de estreptomicina/ml y glutamina 2 mM.

"HepG2" como se lo utiliza aquí se refiere a ATCC-HB-8065.

"HeLa" como se lo utiliza aquí se refiere a ATCC-CCL-2.

"Human Bronchial Epithelial cells" y "B2B" como se los utiliza aquí se refieren a ATCC-CRL-9609.

"HUVEC" y "Human Umbilical Vein Endothelial Cells" como se los utiliza aquí se refieren a ATCC- CRL-1730.

"CHO" y "Chinese Hamster Ovary" como se los utiliza aquí se refieren a ATCC- 61.

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Inducción de Hipoxia

Veintiséis horas después de la transfección o la transducción se incubaron las células en una cámara aislada que fue lavada durante 30 minutos por medio de un flujo de gas que contenía 0,5% de O_{2}, 5% de CO_{2} balanceado por N_{2}. Se colocó la cámara aislada en una incubadora humidificada con 5% de CO_{2} a 37ºC.

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Actividad de la luciferasa en células y tejidos

Para evaluar cuantitativamente la actividad del promotor de PPE-1 in vitro e in vivo, se empleó un kit de un sistema de expresión génica de Luciferasa (Promega Corp., Madison, WI). Cuarenta y ocho horas después de la transfección o la transducción se lavaron las células y se añadieron 200 \mul de amortiguador de lisis durante 15 minutos. Se recolectaron lisados celulares y se centrifugó durante 15 minutos (14.000 rpm) a 4ºC. Posteriormente, se añadieron 10 \mul del sobrenadante a 50 \mul de amortiguador de análisis de Luciferasa. Se midió la actividad en un Luminómetro durante un período de 20 segundos.

Para analizar la actividad de la Luciferasa en tejido sólido se extirparon y homogenizaron 20 mg de muestra en 1ml de la solución de homogenización y se centrifugó durante 15 minutos (14.000 rpm) a 4ºC, y se analizaron 10 ml del sobrenadante por la actividad de la Luciferasa, como se describió anteriormente. Se expresaron los resultados como unidades de luz de Luciferasa por 1 \mug proteína. Se midió la proteína utilizando el ensayo de Bradford con albúmina de suero bovino (BSA) como estándar.

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Actividad de GFP in vitro e in vivo

Para analizar la expresión de GFP in vitro, se lavaron las células dos veces con PBS y se las fijó durante 30 minutos con paraformaldehído al 4% recientemente preparado en PBS. Después de la fijación, se llevó a cabo un examen por medio de microscopía de fluorescencia.

Con el propósito de analizar la distribución celular del gen suministrado in vivo, se fijaron tejidos en paraformaldehído al 4% recientemente preparado en amortiguador de fosfato 0,1 M durante 6 horas a 4ºC, humedecidos durante la noche en sacarosa al 30% a 4ºC y congelados en compuesto OCT (Sakura, EUA). Los bloques de tejido fueron cortados en rebanadas por medio de un criostato con un espesor de 10 \mum y observados directamente bajo microscopía de fluorescencia (filtro FITC).

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Células en proliferación y en reposo

Con el propósito de comparar la actividad del promotor de PPE-1 en BAEC en proliferación y en reposo, se dividieron las células en dos grupos: 1. Células en proliferación - desarrolladas e infectadas en medio FCS al 10%. 2. Células en reposo - desarrolladas e infectadas en medio libre de suero que se inició 72 horas antes de la transducción.

Todas las células fueron cultivadas en una incubadora humidificada, 5% de CO_{2}, 37ºC.

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Preparación de adenovirus recombinante de replicación deficiente

Se construyeron varios adenovirus recombinantes de replicación deficiente (tipo 5). Se ligó un casete de expresión que incluía al promotor preproendotelina-1 (PPE-1) de múrido (SEQ ID NO:1) localizado secuencia arriba del gen de la Luciferasa (originado a partir del número de acceso del GenBank X65323 básico de pGL2) y al sitio poli A de SV40 (originado a partir del número de acceso del GenBank X65323 básico de pGL2) dentro del sitio de restricción BamHI de pPAC.plpA (construcción sin promotor). Se ligó el gen GFP (originado a partir de pEGFP, número de acceso del GenBank AAB02572) al promotor de PPE-1 en el sitio de restricción NotI. Se prepararon los adenovirus recombinantes de replicación deficiente llamados Ad5PPE- 1Luc o Ad5PPE-1GFP por medio de co-transfección de pPACPPE-1Luc o Ad5PPE-1GFP con el plásmido adenovirus pJM17 como lo describen Becker, T. C. y colaboradores (Methods Cell biol. 43, Roth M. (ed). New York. Academic Press, 1994, páginas 161-189) seguido por la recolección de los viriones recombinantes.

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Se prepararon virus para producción a gran escala. Se almacenaron las poblaciones virales a 4ºC en una concentración de 10^{9}-10^{12} unidades formadoras de placa/ml (pfu/ml). Se prepararon los virus Ad5CMV-Luc (gentilmente suministrados por R. Gerard de UTSw Dallas, Tejas) y Ad5CMV- GFP (Quantum Biotechnologies, Carlsbad, Canadá) que contenían al promotor inmediato temprano de citomegalovirus (CMV) (número de acceso del GenBank U47119) para producción a gran escala como se describe para los vectores virales PPE-1 y fueron utilizados como un control no específico del tejido.

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Modificaciones del promotor PPE

Se desarrolló el promotor modificado PPE-1 de múrido por medio de la inserción de tres copias del elemento positivo de transcripción descubierto por Bu y colaboradores (J. Biol Chem. (1997) 272(19): 32613-32622) dentro del sitio de la enzima de restricción NheI localizado secuencia abajo (-286 pb) del elemento endógeno positivo de 43 pares de bases (-364 a -320 pb).

El fragmento reforzador llamado aquí "3X" es una copia por triplicado de un elemento endógeno de la secuencia (coordenadas el nucleótido 407-452 de la SEQ ID NO: 1) presente en el promotor de PPE-1 de múrido. Se ha mostrado previamente que la inducción de la actividad del promotor de PPE-1 en células endoteliales vasculares depende de la presencia de este elemento, Bu y colaboradores (J. Biol Chem. (1997) 272(19): 32613-32622). Se sintetizó el fragmento 3X por medio del uso de dos hebras de ADN monocatenarias complementarias de 96 pares de bases de longitud (BioTechnology Industries; Nes Tziona, Israel), (SEQ ID NO: 2 y 3). Se aparearon los dos fragmentos de ADN monocatenario y se rellenó utilizando un fragmento Klenow (NEB); el ADN bicatenario resultante era de 145 pares de bases de longitud e incluía sitios de restricción Nhe-1 (SEQ ID NO: 4).

Se ligó el fragmento 3X dentro del promotor de PPE-1 de múrido secuencia debajo del sitio endógeno Nhe-1 utilizando T4 Ligasa. Se propagó la construcción resultante en células competentes DH5\alpha y se produjo una preparación a gran escala de plásmido utilizando el kit maxi-prep de Qiagene.

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Plásmidos Adicionales Promotor de PPE-1 de tipo silvestre

El casete de PPE-1-Luciferasa (5249 pb) que contiene 1,4 kb del promotor preproendotelina- 1 (PPE-1) de múrido, el gen de Luciferasa con un sitio para señal poli A de SV40 (número de acceso del GenBank X 65323) y el primer intrón del gen ET-1 de múrido se origina a partir del plásmido pEL8 (8848 pb) utilizado por Harats y colaboradores (J. Clin. Inv. (1995) 95: 1335-1344). Se extrajo el casete de PPE-1-Luciferasa del plásmido pEL8 por medio del uso de la enzima de restricción BamHI, seguido por la extracción del fragmento de ADN del gel de agarosa al 1% utilizando un kit de extracción (Qiagen, Hilden, Alemania).

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El plásmido pPAC.plpA sin promotor

El plásmido pPAC.plpA sin promotor (7594 pb) que contiene las secuencias del adenovirus tipo 5 se originó partir del pPACCMV.pLpA (8800 pb). El promotor CMV, el sitio de clonación múltiple y el sitio de poliadenilación de SV40 (1206 pb) fueron eliminados por la enzima de restricción NotI. Se extrajo el fragmento de ADN del gel de agarosa al 1%. Se rellenó el plásmido lineal (7594 pb) por medio del fragmento Klenow y se ligó el enlazador BamHI por medio del kit rápido de ligación de ADN a ambos extremos cohesivos. Se ligó nuevamente el plásmido lineal por medio de T4 ADN ligasa y se lo transformó en células competentes DH5\alpha, con el propósito de amplificar al pPAC.plpA con los sitios de restricción BamH1. Se preparó el plásmido para producción a gran escala y se lo purificó por medio del kit maxi prep de purificación de ADN.

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Plásmido pPACPPE-1Luciferasa

Se construyó el plásmido pPACPPE-1Luciferasa por medio de la inserción del casete de PPE-1-Luciferasa dentro del sitio de restricción BamHI del plásmido pPAC.plpA, por medio del uso de T4 ADN ligasa. Se utilizó posteriormente el plásmido para transformar células competentes DH5\alpha. Se preparó el plásmido (12843 pb) para producción a gran escala y se lo purificó por medio del kit de purificación maxi prep de ADN.

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Plásmido pPACPPE-1GFP

Se construyó el plásmido pPACPPE-1GFP por medio de subclonación del gen GFP (originado a partir de pEGFP, número de acceso del GenBank AAB02572) secuencia abajo del promotor de PPE-1 dentro del sitio de restricción NotI, por medio de T4 ADN ligasa.

Se utilizó posteriormente el plásmido para transformar células competentes DH5\alpha. Se preparó el plásmido (11.801 pb) para producción a gran escala y se lo purificó por medio del kit de purificación maxi prep de ADN.

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Plásmidos pACPPE-1 3X Luciferasa y pACPPE-1 3X GFP

Se construyeron pPACPPE-1-3XLuciferase y pPACPPE-1-3XGFP por medio de la inserción del casete PPE-1-3XLuc o PPE-1-3XGFP digerido por medio de la enzima de restricción BamHI de pEL8-3X (Figura 26B) que contiene Luc o GFP dentro del sitio de restricción BamHI del plásmido pPAC.plpA. pEL8-3X contiene al promotor modificado PPE-1 de múrido (1,55 kb) (rojo) - localizado entre BamHI y NotI que contiene al reforzador endotelial específico por triplicado 3X (como el expuesto en la SEQ ID NO.: 7) localizado entre dos sitios NheI. El promotor, la Luciferasa o el gen GFP, los sitios poli A de SV40 y el primer intrón del gen de endotelina-1, todos llamados el casete promotor modificado PPE-1 fueron digeridos y extraídos por medio de la enzima de restricción BamHI como se describe en materiales y métodos. Se prepararon los plásmidos (12843 pb) par producción a gran escala y se los purificó por medio del kit de purificación maxi prep de ADN.

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Experimento in vitro, transducción de ADN

Se sembraron en placa células en platos de 16 mm 24 horas antes de la transducción. Se llevó a cabo la transducción de ADN de células BAEC (Células Endoteliales Aórticas de Bovino), HUVEC (Células Endoteliales de Vena Umbilical Humana), LLC (Carcinoma de Pulmón de Lewis) y RIN (insulinoma de Rata), HepG2, HeLa y fibroblastos Normales de piel (NSF) por medio de la incubación de cada línea de células con multiplicidad de infección 1, 5 y 10 (moi) de Ad5PPE-1Luc durante 4 h en un volumen total de 500 \mul de medio de crecimiento, seguido por incubación con el medio de crecimiento en un volumen total de 2 ml durante 48 horas. Se utilizó Ad5CMVLuc como control no específico del tejido.

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Animales

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el "Animal Care y Use Committee" del Sheba Medical Center, Tel-Hashomer. Se utilizaron diferentes cepas de ratón:

(i): Ratones macho, 3 meses de edad, C57BL/6 de tipo silvestre (granjas Harlan, Jerusalén, Israel).

(ii): Ratones macho BALB/C de 3 meses de edad (granjas Harlan, Jerusalén, Israel).

(iii): Ratones macho y hembra de 6 meses de edad deficientes en el gen ApoE, híbridos de los ratones C57BL/6xSJ129 (Plump A. S. y colaboradores. Cell (1991) 71: 343-353).

(iv): Ratones macho y hembra de 3 meses de edad que sobreexpresan al gen de la Luciferasa bajo el control del promotor de PPE-1 de múrido (5.9Kb), generados por Harats y colaboradores (J. Clin. Inv. (1995) 95: 1335-1344).

Todos los ratones crecieron en el Lipids y Atherosclerosis Research Institute.

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Expresión del gen en tejido de ratones normales

Para analizar la eficiencia y especificidad del tejido, se suspendieron 10^{10} pfu/ml de Ad5PPE1Luc o Ad5CMVLuc (como control no específico del tejido), en 100 \mul de suero fisiológico y se inyectaron en la vena de la cola de ratones como se describió aquí anteriormente. Se analizó la actividad de la Luciferasa 1, 5, 14, 30 y 90 días después de la inyección. Para localizar la distribución celular de los genes reporteros expresados, Ad5PPE-1GFP o Ad5CMVOFP (10^{10} pfu/ml en 100 \mul de suero fisiológico) fueron inyectados en la vena de la cola de ratones macho normales C57BL/6 de 3 meses de edad. Se detectó la expresión de GFP cinco días después de la inyección. Todos los ratones parecieron sanos y no se observó toxicidad o inflamación en el hígado u otro tejido.

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Actividad de GFP en tejidos

Para analizar la distribución celular del gen suministrado in vivo, se fijaron muestras de tejido de ratones inyectados en paraformaldehído al 4% recientemente preparado en amortiguador de fosfato 0,1 M durante 6 horas a 4ºC, remojadas durante la noche en sacarosa al 30% a 4ºC y se congelaron en compuesto OCT (Sakura, California, EUA). Los bloques de tejido fueron cortados en rebanadas con un espesor de 10 \mum y observados directamente bajo microscopía de fluorescencia (filtro FITC).

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Implantación de tumor

Se recolectaron células de Carcinoma de Pulmón de Lewis (LLC) con tripsina/EDTA, se las lavó 3 veces con PBS y se hizo un recuento con Tripán azul al 0,1% (Biological Industries, Beit- Haemek, Israel) para evaluar su viabilidad. Con el propósito de analizar el nivel de actividad de la actividad el promotor de PPE-1 en angiogénesis tumoral en ratones, se utilizaron dos diferentes modelos de tumor.

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En el modelo de tumor primario, se inyectaron en forma subcutánea las células (1x10^{6} células/ml en 100 \mul de suero fisiológico) en los lomos de los ratones (n = 17). Veintiún días después de la inyección, se inyectaron Ad5PPE-1, Ad5PPE-1GFP, Ad5CMV, o Ad5CMVGFP (10^{10} pfu/ml) en el tejido tumoral (IT) o en forma intravenosa y se detectó su actividad como se describió anteriormente.

En el modelo de tumor metastático, se inyectaron las células (5 x 10^{5} células/ml en 50 \mul de suero fisiológico) en la pata de los ratones (n = 12). Cuando el tejido tumoral alcanzó un tamaño de 0,7 mm de diámetro, se resecó la pata (con el tumor primario) bajo acción de la anestesia y en condiciones estériles. Catorce días después de la cirugía se inyectaron los virus (Ad5PPE-1, Ad5PPE- 1GFP, Ad5CMVLuc o Ad5CMVGFP) en la vena de la cola del ratón.

En ambos modelos experimentales de tumor se sacrificaron los ratones 5 días después de la inyección viral, se extirparon sus tejidos y se analizó la actividad de la Luciferasa o de GFP.

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Modelo de cicatrización de las heridas

Se anestesiaron ratones macho C57BL/6 de 3 meses de edad por medio de una inyección subcutánea de pentobarbital sódico (6 mg/kg). Se rasuraron sus lomos y se hicieron incisiones rectas de 5 cm. Se suturaron inmediatamente las incisiones con hilo de seda estéril 4/0. Se examinó el proceso angiogénico en la cicatrización de las heridas cada dos días por medio de H&E y de coloración inmunohistoquímica del anticuerpo anti von-Willibrand.

Diez días después de las incisiones se inyectaron sistémicamente 10^{10} pfu/ml de Ad5PPE-1Luc o Ad5CMVLuc en la vena de la cola. Cinco días después de las inyecciones se sacrificaron los ratones y se evaluó la actividad de la Luciferasa como se describió anteriormente en la piel del sitio de la incisión y en la cara contra lateral normal como control.

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Examen histológico

Con el propósito de evaluar el grado de angiogénesis en tejido tumoral y que ha hecho metástasis, se cortaron en rebanadas los tejidos en secciones de 5 \mum y se tiñeron con Hematoxilina y Eosina (H&E). Se utilizaron anticuerpos anti CD31 (anticuerpos monoclonales CD31 anti ratón de rata. Pharminogen, NJ, EUA) para el análisis de neo-vascularización en los modelos tumorales.

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Análisis estadístico

Se llevaron a cabo análisis entre grupos para diferencias estadísticamente significativas con el uso d la prueba t de ANOVA, o la prueba de Rango de Mann-Whitney. Se presentan los datos como la media + SE.

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Ejemplo 1 Análisis de la actividad del plásmido 3X-PPE-1 in vitro

Con el propósito de analizar la actividad del PPE-1-3X, se llevó a cabo una comparación de la expresión del gen reportero en el plásmido del promotor de PPE-1-3X y el plásmido del promotor de PPE-1 no modificado. Se transfectaron los plásmidos del gen reportero que contenían o bien el fragmento PPE-1-3X o el fragmento PPE-1 no modificado y se transfectó la Luciferasa del gen reportero en líneas de células endoteliales y no endoteliales así como a una línea de células de epitelio bronquial (B2B) que expresa al promotor de PPE-1 (ver materiales y métodos más arriba). Se escogió la línea de células B2B para suministrar una indicación de la capacidad del elemento 3X para reducir la expresión en líneas de células no endoteliales con relación al promotor de PPE-1. Se logró la transfección utilizando lipofectamina (Promega Corp., Madison, WI). Se empleó un neo plásmido \betagal como indicador de la eficiencia de la transfección en cada caso de acuerdo con prácticas aceptadas de biología molecular.

Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se recolectaron las células utilizando amortiguador de lisis (Promega Corp., Madison, WI) y se analizó la actividad de la Luciferasa por medio de un luminómetro (TD-20e - Turner Designs, Sunnyvale, California). Paralelamente, se analizó la actividad de \betagal con el propósito de estandarizar diferentes eficiencias de transformación. Los resultados se encuentran resumidos en la Figura 1 y en la Tabla 1. La actividad de la Luciferasa bajo el control de PPE-3X es 15-20 veces mayor que la actividad de la Luciferasa bajo el control del PPE-1 no modificado. En líneas de células no endoteliales se detectó una expresión mínima utilizando tanto PPE-1 como PPE-1-3X. Esto demuestra que PPE-3X es un candidato promisorio para el suministro de un gen específicamente dentro de células endoteliales in vivo.

TABLA 1 Actividad de la Luciferasa en células transfectadas con construcciones de Luciferasa PPE-1 y PPE-1-3X

1

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Ejemplo 2 Actividad y especificidad de Ad5PPE-1/Luciferasa in vitro

Se ligaron también los PPE-1/Luciferasa, PPE-1-3X/Luciferasa, PPE-1/GFP y PPE-1- 3X/GFP en el plásmido Ad5 para producir AdSPPE-1/Luc y Ad5PPE-1-3X/luc, Ad5PPE-1/GFP y Ad5PPE-1-3X/GFP (Varda-Bloom y colaboradores, (2001) Gene therapy 8:819-827). Se evaluaron separadamente estas construcciones como se detalla aquí más adelante.

Con el propósito de analizar la actividad del Ad5PPE-1/luc, se llevaron a cabo transfecciones de B2B (células epiteliales bronquiales humanas), BAEC (Células Endoteliales Aórticas de Bovino) y HUVEC (Células Endoteliales de Vena Umbilical Humana). Estas tres líneas de células expresan el gen de endotelina y fueron escogidas para indicar niveles de expresión de la construcción analizada en una célula endotelial. Se empleó la línea de células RIN (Insulinoma de Rata), que no expresa endotelina, como control negativo y se la transfectó con la misma construcción. Se utilizó Ad5CMVLuc (Luciferasa bajo el control del promotor CMV) como control específico no endotelial en todas las líneas de células.

La Figura 2 ilustra claramente que se logró una expresión mayor de Luciferasa en líneas de células endoteliales BAEC y HUVEC con el promotor de PPE-1 que con el promotor CMV. En las células RIN, que no son de origen endotelial, el promotor CMV produjo más actividad de Luciferasa que el promotor de PPE-1. Estos resultados demuestran la especificidad endotelial del promotor de PPE-1 no modificado.

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Ejemplo 3 Actividad y especificidad de Ad5PPE-3 XLuc y Ad5PPE-3 XGFP

Se utilizaron las construcciones Ad5PPE-3X/Luciferasa y Ad5PPE-3X/GFP para transfectar las líneas de células descritas aquí más arriba en el Ejemplo 2 a fin de determinar el impacto del elemento 3X sobre los niveles de especificidad y expresión. Como en el Ejemplo 2, se utilizó Ad5CMVLuc, como un control específico no endotelial. Se detectó una expresión mayor de Luciferasa en líneas de células BAEC y HUVEC bajo el control del promotor PPE-3X comparada con el promotor CMV.

La Figura 3a es una fotomicrografía que ilustra la expresión de GFP bajo el control de Ad5PPE-1-3X en la línea de células BAEC. La Figura 3b es una fotomicrografía que ilustra la expresión de GFP bajo el control de Ad5CMV en la línea BAEC. Como se observa claramente por medio de estas Figuras, el promotor de PPE-1-3X es más activo en células endoteliales. Estos resultados indican claramente que el elemento 3X no se resta de la especificidad endotelial del promotor de PPE-1. Se presentan actividades relativas de los promotores PPE-1 y PPE-1-3X en cultivos celulares en el ejemplo 6 aquí más adelante.

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Ejemplo 4 Ensayo in vitro de actividad pro-apoptótica del gen p55

Después de la subclonación de P55 (TNFR1, número de acceso del GenBank M75866) dentro de PACPPE3X (que contiene al promotor de PPE-1-3X), y dentro de PACCMV, se llevó a cabo la cotransfección de estos plásmidos y GFP (vector pEGFP-C1; CLONTECH, Palo Alto, CA) como se describió aquí más arriba. En resumen, se subclonó el gen secuencia abajo del promotor de PPE-1 (en vez del gen de la luciferasa) en el sitio de restricción NotI, por medio de la T4 ADN ligasa, seguido por su transformación en células competentes DH5\alpha. Veinticuatro horas después de la transfección, eran visualmente discernibles células apoptóticas pequeñas y redondeadas de las células normales. La microscopía electrónica de células transfectadas con los plásmidos pro-apoptóticos mostró apariencia típica de apoptosis, confirmando la evaluación visual.

Bajo el control del promotor de PPE-1-3X, se indujo apoptosis por p55 únicamente en células endoteliales (Figura 4), mientras que el promotor CMV no mostró ninguna actividad específica de la célula. La Luciferasa bajo el control de PPE-1-3X no indujo apoptosis en ninguna de las líneas analizadas. Estos resultados indican que por medio del empleo del promotor de PPE-1-3X, es factible inducir apoptosis específicamente en células endoteliales.

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Ejemplo 5 Un elemento sensible a la hipoxia (HRE) puede reforzar la expresión del gen objetivo en células endoteliales hipóxicas sensibles

La hipoxia es un regulador importante del tono y estructura de los vasos sanguíneos. También se ha demostrado que es un estímulo potente de angiogénesis (tanto en enfermedades isquémicas del corazón como en cáncer (Semenza, G. L. y colaboradores (2000) Adv Exp Med Biol.; 475: 123-30; Williams, K. J. (2001) Breast Cancer Res. 2001: 3; 328-31 y Shimo, T. (2001) Cancer Lett. 174; 57-64). Además, se ha reportado que la hipoxia regula la expresión de muchos genes incluida la eritropoyetina, VEGF, enzimas glicolíticas y ET-1. Estos genes están controlados por una ruta común sensible al oxígeno, un complejo de transcripción inducible llamado factor-1 inducible por hipoxia (HIF-1). El complejo HIF-1 media respuestas transcripcionales a la hipoxia por medio del enlazamiento del elemento de respuesta a la hipoxia que actúa en forma cis (HRE) de genes objetivo. El HRE es una secuencia conservada localizada en los promotores de pocos genes que responden a hipoxia incluyendo: VEGF, Óxido Nítrico Sintasa-2, eritropoyetina y otros que incluyen endotelina-1, ET-1. El promotor ET-1 contiene un elemento invertido de respuesta a la hipoxia en la posición -118 pb secuencia arriba del sitio de inicio de la transcripción, el elemento contiene 7 pares de bases y está localizado entre los sitios GATA-2 y AP1 5' GCACGTT 3' - de 50 pares de bases. (SEQ ID NO: 5.).

El promotor preproendotelina-1 (PPE-1) contiene un elemento sensible a la hipoxia (HRE) que tiene el potencial para incrementar su expresión en el microambiente hipóxico del tumor o de tejidos isquémicos, convirtiéndolo por lo tanto en "específico del tejido tumoral" y/o en "específico de tejido isquémico". Con el propósito de evaluar la función real de este HRE, se llevaron a cabo ensayos del promotor de PPE-1 y del promotor de PPE-1-3X junto con un gen reportero de Luciferasa o GFP y suministrado por medio de un vector adenoviral.

La actividad de la Luciferasa bajo el control del promotor de PPE-1 o del promotor de PPE- 1-3X fue comparada en células BAEC bajo condiciones normóxicas e hipóxicas (0,5% de O_{2} durante 16 h). La actividad de la Luciferasa bajo el control del promotor de PPE-1 fue 5 veces mayor cuando se lo expuso a hipoxia (Figuras 5 y 6). Además, la actividad de la Luciferasa bajo el control del promotor de PPE-1-3X fue 2,5 veces mayor bajo condiciones hipóxicas. En resumen, la introducción del elemento 3X dentro del promotor PPE 1 es capaz aún de incrementar los niveles de expresión de un gen secuencia abajo en respuesta a hipoxia, a pesar de que los niveles normóxicos de expresión con el gen PPE-1-3X son más altos que aquellos observados con el promotor de PPE-1 no modificado.

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Ejemplo 6 Evaluación adicional de la actividad del promotor de PPE-1-3X y PPE-1 en líneas de células endoteliales

La Figura 7 resume los resultados de los experimentos de transfección de B2B, HCTVEC y BAEC utilizando pPPE-1/Luciferasa y pPPE-1-3X/Luciferasa. Se observó una expresión más alta de Luciferasa (30, 8,5 y 1,5 veces más) bajo el control del promotor de PPE-1-3X que bajo el promotor de PPE-1 en B2B, HUVEC y BAEC, respectivamente. Estos resultados confirman aquellos presentados aquí más arriba y sirven para establecer que PPE-1-3X se adapta bien a dirigir un nivel alto de expresión específicamente para células endoteliales. En el contexto del futuro suministro in vivo, los niveles más altos de expresión logrados con la construcción PPE-1-3X se traducen en administración de cantidades más pequeñas de ADN. Esto, a su vez, servirá para incrementar aún más la especificidad.

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Ejemplo 7 Eficiencia, especificidad y estabilidad de Ad5PPE-1Luc in vivo

Con el propósito de confirmar que la especificidad endotelial de expresión observada en los ejemplos 2 a 6 no fue un artefacto del cultivo celular, se inyecto la construcción Ad5PPE-1/Luciferasa en ratones C57BL/6 como se describió aquí más arriba en "Expresión génica en tejidos en ratones normales". Como en los estudios in vitro, se empleó Ad5CMWLuciferase como un control negativo.

Después de la inyección de vectores adenovirales, se evaluó la actividad específica y estabilidad de Luciferasa en tejidos vascularizados y no vascularizados. Los resultados se resumen en la Figura 8 (expresión de Luciferasa con relación a la expresión en el hígado) y en la Tabla 2 (expresión de Luciferasa como un porcentaje de la expresión total en el organismo). Como se esperaba, en ratones tratados con Ad5CMV/Luciferasa la mayor parte de la actividad de la Luciferasa (> 80% de la expresión total en el organismo) fue encontrada en el hígado. La actividad de la Luciferasa controlada por el promotor de PPE-1 fue menor en el hígado (37-54% de la expresión total en el organismo). La expresión derivada de PPE-1 fue mucho mayor en la aorta (23-33% de la expresión total en el organismo 5 y 14 días después de la inyección, respectivamente), comparada con ratones tratados con Ad5CMV/Luciferasa (hasta 1,8% de la expresión total en el organismo; Tabla 2). Estos resultados confirman la especificidad endotelial observada en el cultivo celular. Se debe recordar que el hígado es un órgano altamente vascularizado. Por lo tanto, se llevó a cabo el examen de expresión celular dentro de órganos, como se detalla aquí a continuación.

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TABLA 2 Expresión de Luciferasa en órganos, 5 y 14 días después de la inyección de construcciones basadas en PPE-1 y CMV

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Las Figuras 30A y 30B demuestran la actividad absoluta de la Luciferasa (unidades de luz/\mug de proteína) en las aortas (A) e hígados (B) de los 110 ratones inyectados. Se midió la actividad de la Luciferasa 1 (n = 13), 5 (n = 34), 14 (n = 32), 30 (n = 20) y 90 (n = 11) días después de la inyección. Los resultados en la aorta representan la actividad de los promotores (PPE-1 o CMV) principalmente en células endoteliales, mientras que los resultados en los hígados representan su actividad principalmente en hepatocitos.

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Ejemplo 8 Ensayos de eficiencia, especificidad y estabilidad de Ad5PPE-1 in vivo - en ratones BALB/C

Se repitieron los experimentos del ejemplo 7 en ratones BALB/C de 12 semanas de edad (n = 10 para cada grupo) con el propósito de demostrar que los resultados observados no fueron un artefacto de una cepa particular de animales.

Debido a que los resultados absolutos con los vectores adenovirales fueron menores en ratones BALB/C que en ratones C57BL/6, la expresión de la Luciferasa se expresa como porcentaje de la actividad total de la Luciferasa en todos los tejidos.

La expresión relativa más alta de la Luciferasa 5 días después de la inyección fue observada en los bazos de ratones inyectados con Ad5PPE-1 (90,9%), y en los hígados de ratones inyectados con Ad5CMV (86,2%). Se observó también un incremento significativo en la actividad relativa de la Luciferasa en las aortas de ratones inyectados con Ad5PPE-1 14 días después de la inyección (32,9%), comparado con su actividad cinco días después de la inyección (1,75%) (Figuras 31A y 31B; barras sin relleno para Ad5PPE-1Luc; barras de color negro para Ad5CMVLuc).

Estos resultados confirman que independientemente de la cepa de ratón, la especificidad del tejido del promotor de PPE-1 es suficientemente fuerte para eliminar efectivamente la expresión de hepatocitos, a pesar de la captación preferencial del ADN inyectado por los hepatocitos.

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Ejemplo 9 Localización celular del gen suministrado por Ad5PPE-1 in vivo

A fin de determinar los sitios de expresión celular del gen expresado por PPE-1 in vivo, se utilizó Proteína Fluorescente Verde (GFP) suministrada por el vector adenoviral Ad5PPE-1-GFP. Se utilizó Ad5CMVGFP (Quantum, Canadá) como control negativo específico de células no endoteliales. Cinco días después de la inyección intravenosa se sacrificaron los ratones y se analizaron sus tejidos por medio de microscopía de fluorescencia.

En los ratones inyectados con el vector Ad5CMVGFP, la mayor parte de la expresión fue detectada en los hepatocitos, y no se detectó expresión en células endoteliales en el hígado (Figura 9A). En agudo contraste, los ratones inyectados con Ad5PPE-1-GFP (Figura 9B), no mostraron expresión en hepatocitos, pero una expresión significativa en células endoteliales en los vasos sanguíneos del hígado. Se obtuvieron resultados similares en otros tejidos donde prácticamente toda la expresión derivada de PPE-1 fue detectada en el endotelio, mientras que ninguna expresión derivada de CMV fue endotelial. Estos resultados indican que la especificidad endotelial se preserva incluso dentro de un órgano que contiene células endoteliales y no endoteliales. Este hallazgo tiene implicaciones importantes para la prevención de la angiogénesis en tumores en crecimiento.

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Ejemplo 10 Ensayos de eficiencia y especificidad endotelial de Ad5PPE-1 -3X Luc y Ad5PPE-1 -3X GFP in vitro

Con el propósito de determinar la eficacia relativa de Ad5PPE-1 y Ad5PPE-1-3X para dirigir la expresión de los genes reporteros de Luciferasa y de proteína fluorescente verde (GFP) en células, se analizó la actividad específica en células endoteliales in vitro utilizando las líneas de células descritas aquí anteriormente. Se emplearon Ad5CMVLuc y Ad5CMVGFP como controles no específicos del tejido. Se emplearon Ad5PPE-1Luc y Ad5PPE-1GFP para determinar el cambio relativo en el nivel de expresión provocado por la adición de la secuencia 3X.

Los resultados, resumidos en las Figuras 10 y 11, indican que las actividades de la Luciferasa bajo el control del promotor de PPE-1-3X fueron 5-10 veces más altas en líneas EC (Células Endoteliales Aórticas de Bovino - BAEC) comparadas con la actividad en células no endoteliales - Insulinoma de Rata - RIN, HeLa, HePG2 y fibroblastos de piel normal (NSF) (figuras 10 y 11).

La Figura 10 muestra la actividad de la Luciferasa como unidades de luz/\mug de proteína en células B2B, BAEC y RIN transducidas por Ad5PPE-1Luc, Ad5PPE-1-3XLuc, y Ad5CMVLuc. La expresión más alta de la Luciferasa fue observada en células RIN transducidas por Ad5CMVLuc, sin embargo esta construcción se expresó pobremente en células BAEC y B2B. El siguiente nivel más alto de expresión de Luciferasa fue observado en células BAEC transducidas por Ad5PPE-1-3XLuc. Ad5PPE-1Luc se expresó en niveles menores en células BAEC. En la línea de células B2B se expresaron Ad5PPE-1Luc y Ad5PPE-1-3XLuc en niveles casi idénticos.

En conjunto, la actividad de la Luciferasa en las líneas de células endoteliales bajo el control del promotor de PPE-1-3X fue 23 veces más alto que bajo el control del promotor de PPE-1 y 23-47 veces más alto que bajo el control del promotor CMV en las mismas condiciones de infección (moi = 10). Esto a pesar del hecho de que la expresión de la Luciferasa en células RIN no endoteliales fue 3000 veces mayor bajo el control del promotor CMV (figura 10).

Con el propósito de establecer que PPE-1 y PPE-1-3X son inactivos en otros linajes de células no endoteliales, se transdujeron las líneas de células HeLA, HepG2, NSF. Se empleó BAEC como control endotelial. La Figura 11 muestra la actividad de la Luciferasa como unidades de luz/\mug de proteína en células HeLA, HepG2, NSF y BAEC transducidas por Ad5PPE-1Luc, Ad5PPE-1- 3XLuc y Ad5CMVLuc. La transducción con Ad5CMVLuc provocaron altos niveles de expresión de Luciferasa en células HeLA, HepG2 y NSF. Estas líneas de células fallaron en expresar Luciferasa bajo el control de PPE-1 y expresaron Luciferasa en niveles bajos con el promotor de PPE-1-3X. Como se esperaba, las células BAEC transducidas con Ad5PPE-1Luc o Ad5PPE-1-3XLuc exhibieron alta expresión de Luciferasa.

Tomados en conjunto estos resultados indican que la introducción de la secuencia 3X en el promotor de PPE-1 provocó niveles más altos de expresión en líneas de células endoteliales mientras se evita la expresión no deseada en células no endoteliales.

La adición de la secuencia 3X al promotor de PPE-1 también incrementó los niveles de expresión de proteína fluorescente Verde en líneas EC (Células Endoteliales Aórticas de Bovino - BAEC) como se indica en las Figuras 12A-C que describen la expresión de GFP en BAEC transducidas por moi = 1. No se observó expresión de GFP utilizando un promotor CMV en este experimento.

En la Figura 12, el panel A indica células transducidas con Ad5PPE-1-3XGFP, el panel B indica células transducidas con Ad5PPE-1GFP y el panel C indica Ad5CMVGFP. Nuevamente, la introducción de la secuencia 3X en el promotor de PPE-1 incrementa significativamente la expresión del gen reportero. Este resultado indica que la habilidad de la secuencia 3X para actuar como un reforzador endotelial específico no es función del gen secuencia abajo que está siendo transcrito.

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Además, la transducción de Ad5PPE-1-3X-GFP y Ad5PPE-1GFP resultó en no expresión de GFP en células no endoteliales SMC, HelA, HePG2 y fibroblastos de piel normal (NSF) comparado con la alta expresión bajo el promotor CMV como se resume en las Figuras 13-16.

La Figura 13 muestra la expresión de GFP en SMC transducido por moi =1 ya sea de Ad5PPE-1-3XGFP (panel A) o de Ad5CMVGFP (panel B). Aunque la expresión de alto nivel de GFP resultó de la transducción de Ad5CMVGFP, no resultó expresión de GFP a partir de la transducción con la transducción de Ad5PPE-1-3XGFP.

La Figura 14 muestra los resultados de un experimento similar llevado a cabo en células HeLa. Como en la figura anterior, el panel A indica células transducidas con Ad5PPE-1-3XGFP y el panel B indica células transducidas con Ad5CMVGFP. Nuevamente, aunque la expresión de alto nivel de GFP resultado de la transducción de Ad5CMVGFP, no resultó expresión de GFP a partir de la transducción con la transducción de Ad5PPE-1-3XGFP.

La Figura 15 muestra los resultados de un experimento llevado a cabo en células HepG2. Como en la figura anterior, el panel A indica células transducidas con Ad5PPE-1(3X)GFP y el panel B indica células transducidas con Ad5CMVGFP. Nuevamente, aunque resultó expresión de alto nivel de GFP a partir de la transducción de Ad5CMVGFP, no resultó expresión de GFP como resultado de la transducción con Ad5PPE-1-3XGFP.

La Figura 16 muestra los resultados de un experimento similar llevado a cabo en células NSF. Como en la figura anterior, el panel A indica células transducidas con Ad5PPE-1-3XGFP y el panel B indica célula transducidas con Ad5CMVGFP. Nuevamente, aunque resultó expresión de alto nivel de GFP a partir de la transducción Ad5CMVGFP, resultó expresión muy baja de GFP a partir de la transducción con Ad5PPE-1-3XGFP.

Estos resultados, tomados en conjunto, indican un alto nivel de especificidad endotelial y se obtiene un alto nivel de expresión endotelial por medio del uso de un promotor modificado PPE-1 que contiene la secuencia 3X de la SEQ ID NO.: 7.

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Ejemplo 11 Localización celular de un gen reportero suministrado por Ad5PPE-1 -3X in vivo

Con el propósito de determinar el patrón de localización celular de un gen reportero expresado bajo el control del promotor de PPE-1-3X in vivo, se inyectaron Ad5PPE-1-3XGFP y Ad5PPE-1GFP en ratones como se describió aquí más arriba. Cinco días después de la inyección intravenosa, se sacrificaron los ratones y se analizaron sus tejidos por medio de microscopía fluorescente.

Se observó una actividad significativamente superior de GFP en las células endoteliales de los vasos sanguíneos de hígado, riñón y bazo de ratones inyectados con Ad5PPE-1-3XGFP comparado con los ratones inyectados con Ad5PPE-1GFP. Las Figuras 17A y B muestran resultados representativos.

La Figura 17A muestra expresión de bajo nivel de GFP en células endoteliales que revisten un vaso sanguíneo de un ratón inyectado con el Ad5PPE-1GFP. La Figura 17B muestra el nivel mucho más alto de expresión de GFP resultante de la adición de la secuencia 3X a la construcción.

A pesar de la alta expresión en el revestimiento de los vasos sanguíneos, no se detectó expresión en los hepatocitos, glomérulos, células epiteliales y esplenocitos (Figuras 18 y 19).

La Figura 18 muestra resultados representativos de tejido de riñón de ratones inyectados. Los ratones inyectados con Ad5CMVGFP (Figura 18A), los ratones inyectados con Ad5PPE-1GFP (Figura 18b) y Ad5PPE-1-3XGFP (Figura 18C) exhibieron todos baja actividad de GFP en células de riñón. En la figura 18B, la expresión ligeramente superior de GFP es visible en la pared del vaso sanguíneo (indicada por la flecha).

La Figura 19 muestra los resultados representativos de tejido de vaso de ratones inyectados. Los ratones inyectados con Ad5CWGFP (Figura 19A), los ratones inyectados con Ad5PPE-1GFP (Figura 19B) y los ratones inyectados con Ad5PPE-1-3XGFP (Figura 19 C) exhibieron todos actividad de bajo nivel de GFP en células del bazo. Mayor actividad de GFP es visible en los vasos sanguíneos de ratones inyectados con Ad5PPE-1-3XGFP (indicada por la flecha).

Estos resultados confirmaron que tanto el promotor de PPE-1 como el promotor de PPE-1-3X son específicos de células endoteliales in vivo. Ellos sugieren además que la actividad de ambos promotores era limitada en tejido endotelial sin proliferación (es decir, vasos sanguíneos de órganos sanos. Por lo tanto, se llevaron a cabo ensayos en un modelo angiogénico tumoral.

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Ejemplo 12 Ensayos de la construcción Ad5PPE-1 en neovascularización tumoral in vivo

A fin de determinar la capacidad de AD5PPE para dirigir específicamente la expresión de un gen reportero a vasos sanguíneos angiogénicos en un tumor, se empleó el modelo de LLC (descrito aquí más arriba en materiales y métodos).

En un experimento, se analizó la expresión de Luciferasa en neovascularización tumoral cinco días después de inyecciones sistémicas de Ad5PPE-1Luc o Ad5CMVLuc (10^{10} pfu/ml cada una).

En este experimento, la inyección sistémica de Ad5CMVLuc tanto para modelos tumorales primarios como metastáticos resultó en expresión mínima en el tumor primario o en el pulmón metastático. Este nivel de expresión fue similar a la expresión mínima de Luciferasa dirigida por CMV en pulmones normales sin contacto previo de ningún tipo (Figura 35; barras de color negro; n = 12). En agudo contraste, bajo el control del promotor de PPE-1 (Figura 35; barras sin relleno; n = 9), se asociaron la metástasis de pulmón altamente angiogénica con la actividad de la Luciferasa que fue aproximadamente 200 veces mayor que la actividad de la Luciferasa en el tumor primario pobremente vascularizado y los pulmones sin contacto previo de ningún tipo.

La expresión de Luciferasa en tejidos no metastáticos tales como el hígado, riñón, corazón y páncreas fue mínima. El nivel de expresión en la aorta fue aproximadamente del 30% de los niveles en los pulmones metastáticos.

En un experimento adicional en el modelo de LLC se emplearon construcciones de Ad5PPE- 1GFP y Ad5CMVGFP para localizar la expresión del gen reportero en el tumor primario y en pulmones metastáticos.

Los ratones inyectados con Ad5PPE-1GFP, mostraron niveles altos de expresión específica de GFP en los vasos sanguíneos del tumor primario (Figura 36C), aunque no se detectó expresión en las mismas células tumorales. Esta observación es consistente con los resultados del modelo de cultivo de células LLC presentadas en el ejemplo 20. En metástasis de pulmón, se detectaron altos niveles de expresión de GFP tanto en arterias grandes como en vasos angiogénicos pequeños de los focos metastáticos (Figura 36A). No se detectó expresión en el tejido normal de pulmón. La localización de células endoteliales se demostró por medio de colocalización de la expresión de GFP (Figura 16A) y la inmunocoloración del anticuerpo CD31 (Figura 16B). En notable contraste, en ratones inyectados con Ad5CMVGFP, no fue detectable actividad de GFP tanto en el tumor primario como en metástasis de pulmón.

La Figura 36C ilustra la expresión de GFP en vasos sanguíneos de un tumor primario después de inyección intratumoral de Ad5PPE-1GFP. La Figura 36D es una imagen de contraste de fases de la misma presentada como panel C que ilustra el tumor y sus vasos sanguíneos.

Estos resultados indican que aunque PPE-1 no dirige en sí misma la expresión de alto nivel en células tumorales, el promotor no dirige expresión de alto nivel en endotelio vascular dentro del tumor, especialmente en vasos angiogénicos en proliferación rápida.

La inyección intratumoral de Ad5CMV en un modelo de tumor primario subcutáneo resultó en alta expresión de Luciferasa en el tejido tumoral y en niveles moderados de expresión en el hígado (10% de la cantidad expresada en el tumor; Figura 42). No se detectó expresión en los pulmones metastáticos. Por otro lado, cuando se inyecta en forma intratumoral, la expresión de Luciferasa bajo el control del promotor de PPE-1 resultó en niveles similares de expresión de Luciferasa en el tumor primario y los pulmones metastáticos y no se detectó expresión en el hígado.

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Ejemplo 13 Ensayos de la construcción Ad5PPE-1 en un sistema de cultivo de células de carcinoma

Con el propósito de evaluar la eficiencia de Ad5PPE-1 y Ad5CMV para elegir la expresión de la Luciferasa en células cancerosas, se empleó la línea de células de Carcinoma de Pulmón D122- 96 de Lewis.

Se llevó a cabo la transducción in vitro en diferentes multiplicidades de infección (moi). Los resultados indican que ambos vectores adenovirales son capaces de transducir al gen de la Luciferasa con esas células (Tabla 3). Sin embargo, la actividad de la Luciferasa dirigida por el promotor de PPE- 1 fue mucho menor en las células LLC que la actividad detectada en células endoteliales, 50 versus 1000-2500 unidades de luz/\mug de proteína, respectivamente.

TABLA 3 Transducción in vitro de la línea de células de carcinoma de pulmón de Lewis (D122-96) con Ad5PPE-1Luc y Ad5CMVLuc

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Ejemplo 14 Ensayo del efecto de la secuencia 3X en vasos sanguíneos angiogénicos tumorales in vivo

Con el fin de determinar el efecto de la secuencia 3X sobre el promotor de PPE-1 en vasos sanguíneos angiogénicos, se empleó el modelo de metástasis de Carcinoma de Pulmón de Lewis (LLC) (descrito aquí anteriormente en material y métodos). Cinco días después de la inyección IV de 10^{10} unidades infecciosas de Ad5PPE-1GFP, Ad5PPE-1-3XGFP o Ad5CMVGFP, se sacrificaron los ratones y se analizaron sus tejidos como se describe en material y métodos.

Las Figuras 20A-D resumen la expresión de GFP en pulmones metastáticos de ratones de control inyectados con solución salina (Figura 20A), ratones inyectados con Ad5CMVGFP (Figura 20 B), ratones inyectados con Ad5PPE-1GFP (Figura 20 C) y ratones inyectados con Ad5PPE-1-3XGFP (Figura 20D). La inmunocoloración de anti-CD31 (Figuras 20C' a 20D') confirma la localización de la expresión de GFP en cada tejido metastático. Los resultados muestran que aunque no se detectó expresión de GFP en ratones de control inyectados con solución salina (Figura 20A), hubo una ligera expresión alrededor de los bronquios epiteliales de los ratones inyectados con CMV, pero no en los vasos sanguíneos angiogénicos del pulmón metastático de esos ratones (Figura 20B). Se observó baja expresión de GFP en pulmones metastáticos de ratones inyectados con Ad5PPE-1GFP (Figuras 20C y 20C'), aunque se observó expresión
alta y específica en los nuevos vasos sanguíneos de ratones inyectados con Ad5PPE-1-3XGFP (Figura 20D y 20 D').

Estos resultados explican la aparente disparidad entre los resultados in vivo del ejemplo 10 y los resultados in vitro de los ejemplos 2, 3 y 6. Tanto el promotor de PPE-1 como el promotor de PPE- 1-3X son específicos del endotelio. Sin embargo, la secuencia 3X incrementó mucho el nivel de expresión en tejido endotelial de rápida proliferación, tal como los vasos sanguíneos recientemente formados en a un tumor en crecimiento.

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Ejemplo 15 Efecto del elemento 3X sobre el promotor de PPE-1 en vasos sanguíneos angiogénicos tumorales

Con el fin de estudiar el efecto del elemento 3X de la presente invención sobre la eficacia y actividad específica del promotor de PPE-1 en vasos sanguíneos angiogénicos tumorales, se empleó el modelo de metástasis de LLC. Cinco días después de la inyección intravenosa de 10^{10} pfu/ml de Ad5PPE-1Luc, Ad5PPE-1-3XLuc, Ad5CMVLuc, Ad5PPE-1GFP, Ad5PPE-1-3X-GFP o Ad5CMVGFP, se sacrificaron los ratones y se analizaron sus tejidos por la expresión de Luciferasa o GFP como se describe aquí más arriba.

La Figura 37 es un histograma que compara la expresión de la Luciferasa en pulmones normales versus aquella en pulmones metastáticos después de inyección sistémica de Ad5PPE-1- 3X1uc, Ad5PPE-1Luc o Ad5CMVLuc. Los grupos experimentales fueron Ad5CMVLuc (n = 7; barras de color negro), Ad5PPE-1Luc (n = 6; barras de color gris) y Ad5PPE-1-3XLuc (n = 13; barras de color marrón). La actividad se expresa como unidades de luz/\mug de proteína.

La expresión de Luciferasa bajo el control del promotor de PPE-1-3X era 35 veces mayor en los pulmones metastáticos con relación a su actividad en pulmones normales y 3,5 veces superior que la expresión dirigida por el promotor de PPE-1 sin el elemento 3X (p < 0,001). Se detectó actividad muy baja de Luciferasa en otros tejidos de ratones inyectados con Ad5PPE-1-3XLuc. El cálculo de la expresión de Luciferasa en los pulmones como porcentaje del hígado de cada animal inyectado reveló que se incrementó la actividad 10 veces en el pulmón metastático comparado con la actividad en un pulmón normal (Figura 38).

A fin de localizar la expresión del gen reportero para tipos específicos de células, se emplearon construcciones de GFP. Se ha mostrado la expresión de GFP en pulmones metastáticos de ratones inyectados con Ad5PPE-1-3XGFP. La inmunocoloración por el anticuerpo CD31 conforma la ubicación de la expresión de GFP en los nuevos vasos sanguíneos. No se detectó expresión de GFP en ratones de control inyectados con solución salina. Bajo nivel de expresión alrededor de los bronquios epiteliales de los ratones inyectados con CMV, pero no en los vasos sanguíneos angiogénicos del pulmón metastático. En resumen, estos resultados indican que se presentaron grandes incrementos en el nivel de expresión a partir de la introducción de un elemento 3X en construcciones Ad5PPE-1 y que esta mayor expresión era específica para los vasos sanguíneos angiogénicos de tumores. Potencialmente, se puede acoplar el efecto observado con la respuesta a la hipoxia descrita aquí más arriba para potenciar aún más los niveles de expresión de una secuencia de interés.

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Ejemplo 16 Caracterización adicional de la respuesta de PPE-1 a la hipoxia

A fin de caracterizar adicionalmente el efecto de la hipoxia sobre la actividad del promotor de PPE-1 de múrido, se transfectaron células endoteliales aórticas de bovino (BAEC) por medio de un plásmido de ADN (pEL8; Figura 26A). El plásmido pEL8 que contiene al promotor de PPE-1 de múrido (1,4 kb) (rojo), al gen de la luciferasa (1842 pb), los sitios poli A de SV40 y al primer intrón del gen de la endotelina-1, todos denominados el casete del promotor de PPE-1 fue digerido y extraído por la enzima de restricción BamHI como se describe en materiales y métodos. Después de la transfección, se sometieron las células a condiciones hipóxicas.

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La expresión de la Luciferasa en BAEC transfectadas sometidas a 18 horas de hipoxia (0,5% de O_{2}) fue ocho veces superior que la expresión de la Luciferasa en células cultivadas en un ambiente normóxico (Figura 21). La Figura 21 muestra que la actividad de la Luciferasa (unidades de luz/\mug de proteína) en BAEC transfectadas por un plásmido que contenía al promotor de PPE-1 de múrido fue significativamente mayor cuando se incubaron las células transfectadas en un ambiente hipóxico. Se confirmaron eficiencias de transfección equivalentes por cotransfección con un vector reportero de \beta-galactosidasa y ensayos de actividad de LacZ.

Con el fin de determinar si el promotor de PPE-1 de múrido suministrado por el vector adenoviral se reduce también por hipoxia, se transdujeron BAEC por medio de Ad5PPE-1Luc. Se utilizó Ad5CMVLuc, un control no específico en este experimento. Los resultados se resumen en la Figura 22. La actividad de la Luciferasa por hipoxia en BAEC transducidas por Ad5PPE-1Luc. En agudo contraste, no se detectó una diferencia significativa entre normoxia e hipoxia en las células transducidas con Ad5CMV (Figura 22).

Para comprender si la mejora de la actividad del promotor de PPE-1 es específica para células endoteliales, se transdujeron diferentes líneas de células (BAEC, B2B, CHO, RIN y Miocitos Cardíacos) por medio de Ad5PPE-1 (moi = 10) y fueron sometidas a un ambiente de hipoxia (0,5% de O_{2}) o de normoxia. Los resultados se resumen en la figura 23. Se incrementó ligeramente la expresión de Luciferasa en células B2B y se incrementó significativamente en células BAEC cultivadas en un ambiente hipóxico. Se redujo la expresión de la Luciferasa en otras líneas de células por el ambiente hipóxico, comparado con la normoxia. Estos resultados confirman que ocurre inducción hipóxica del promotor de PPE-1 principalmente en linajes de células endoteliales.

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Ejemplo 17 Efecto de la secuencia 3X sobre la respuesta de PPE-1 a la hipoxia

Con el fin de determinar el efecto de la secuencia 3X sobre la respuesta de PPE-1 a la hipoxia, se transdujeron BAEC por medio de Ad5PPE-1Luc y de Ad5PPE-1(3X)Luc. Después de la transducción, se incubaron la células BAEC ya sea en un ambiente hipóxico o en uno normóxico como se detalló aquí anteriormente. Los resultados se resumen en la Figura 24. Se incrementó significativamente la expresión de Luciferasa utilizando la construcción Ad5PPE-1Luc (siete veces) en respuesta a la hipoxia (2578 en hipoxia y 322,1 en normoxia). En contraste, la construcción Ad5PPE-1(3X)Luc exhibió únicamente un incremento de 1,5 veces en respuesta a la hipoxia (de 2874,5 en condiciones de normoxia a 4315 en condiciones de hipoxia). Estos resultados indican que el alto nivel normóxico de expresión observado cuando se añade la secuencia 3X al promotor de PPE-1 sirve para enmascarar la respuesta hipóxica en cierta medida.

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Ejemplo 18 Ensayos de la repuesta de PPE-1 a la hipoxia en un modelo de ratón transgénico

Con el fin de examinar la actividad del promotor de PPE-1 de múrido en tejidos sometidos a hipoxia/isquemia regional, se emplearon ratones transgénicos mPPE-1-Luc, descritos aquí más arriba en materiales y métodos. Se indujeron los ratones a isquemia regional de las extremidades posteriores como se describió anteriormente (Couffinhal T. y colaboradores (1998) Am. J. Pathol. 152; 1667-1679). En resumen, se anestesiaron los animales con pentobarbital sódico (40 mg/kg, en forma intraperitoneal). Se indujo isquemia unilateral de las extremidades posteriores por medio de ligación de la arteria femoral derecha, aprox. 2 mm próximo a la bifurcación de las arterias safena y poplítea. Para verificar la inducción del cambio funcional en perfusión, se obtuvieron imágenes por ultrasonido los días 4 y 14 por medio del sistema Synergy de ultrasonido (GE) equipado con un transductor de 7,5 MHz y un software angiográfico. Se alojaron los animales en condiciones convencionales hasta por 18 días.

Se analizó la expresión de la Luciferasa 2, 5, 10 y 18 días después de la ligación en el músculo isquémico, en el músculo normal no ligado, en el hígado, pulmón, y aorta.

Los resultados, resumidos en la Figura 25, muestran que aunque no se detectó una diferencia significativa en el hígado, pulmón y aorta durante los días posteriores a la ligación, se incrementó la expresión del gen de la Luciferasa después de la ligación femoral tanto en el músculo normal no ligado como en el músculo isquémico. Mientras que el pico de expresión de la Luciferasa en el músculo isquémico fue detectado cinco días después de la ligación, el pico de expresión de la Luciferasa en el músculo no ligado fue detectado diez días después de la ligación de la arteria femoral. Esto indica que la respuesta hipóxica del promotor de PPE-1 es funcional en un sistema in vivo. La expresión de la Luciferasa en el músculo no isquémico no cambio durante los días analizados, comparado con su expresión en el tejido de control no operado (día = 0). En contraste, la expresión de la Luciferasa en el músculo isquémico fue significativamente superior el día 5 que en cualquier otro momento.

El día 5, la expresión dirigida por PPE-1 de la Luciferasa fue 2,5 veces superior que en ratones de control no operados, y comparable con el músculo isquémico en los días 10 y 18 (Figura 40).

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La expresión de Luciferasa en otros tejidos no isquémicos incluyendo hígado, pulmones y aorta de los ratones transgénicos sometidos a isquemia regional no reveló cambios significativos dentro de los 18 días posteriores a la inducción de isquemia en la expresión de Luciferasa en esos tejidos (Figura 41).

Además, estos resultados confirman que la expresión de Luciferasa fue mayor en tejidos que contenían un alto porcentaje de tejido endotelial (pulmón y aorta) que en aquellos tejidos que contenían un bajo porcentaje de tejido endotelial (hígado y músculo no isquémico).

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Ejemplo 19 Efecto del nivel de proliferación celular sobre la actividad de Ad5PPE-1 Luc en células endoteliales

Con el fin de determinar el efecto del nivel de proliferación celular sobre la eficiencia y actividad específica de Ad5PPE-1Luc, se analizó un modelo angiogénico de células endoteliales (BAEC), in vitro. Las BAEC transducidas fueron inducidas o bien hasta reposo por eliminación del suero o cultivadas en FCS al 10% para proliferación normal. En resumen, las células fueron transducidas durante 48 horas ya sea como células en reposo - 72 horas después de la eliminación del suero o como células en proliferación - en medio normal (FCS al 10%). La actividad de la Luciferasa se expresa como unidades de luz/\mug de proteína, para normalizar la diferencia en la cantidad de células. Los resultados presentados son un promedio de un análisis por triplicado de cuatro experimento independientes representativos.

La expresión de la Luciferasa bajo el control del promotor de PPE-1 (barras sin relleno; Figura 28) fue 4 veces superior en BAEC que proliferan en forma normal que en células en reposo, y 25 veces superior en BAEC que proliferan en forma normal que la expresión de la Luciferasa bajo el control del promotor CMV (barras de color negro; Figura 28). Además, en células en proliferación, la actividad bajo el control del promotor de PPE-1 fue 10 veces superior que aquella bajo el control del promotor CMV.

Con el fin de estimular condiciones angiogénicas in vitro, se analizó la actividad de Ad5PPE- 1Luc en BAEC inducidas para proliferación rápida por medio de la adición de 40 ng/ml de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Se comparó la actividad bajo estas condiciones en células que proliferan en forma normal y en células en reposo como se describió aquí anteriormente. La expresión de la Luciferasa en BAEC que indujo a la proliferación celular con VEGF fue 44 veces superior que en células que proliferan en forma normal, y 83 veces superior que en células en reposo (Figura 29).

Juntos, estos experimentos indican que el nivel de actividad de una secuencia de interés bajo el control transcripcional del Promotor PPE-1 es una función del nivel de proliferación celular, con proliferación rápida que provoca niveles más altos de expresión.

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Ejemplo 20 Ensayos del promotor de PPE-1 en ratones a los que se les indujo Aterosclerosis

Con el fin de analizar la eficiencia y especificidad del vector Ad5PPE-1 en vasos sanguíneos ateroscleróticos, se inyectaron sistémicamente 10^{10} pfu/ml de los vectores virales a ratones deficientes de ApoE de 6 meses de edad (Plump, A. S. y colaboradores. Cell; 1991; 71: 343-353).

A medida que los ratones deficientes en ApoE envejecen, desarrollan valores altos de colesterol y extensas placas aterogénicas sin inducción de una dieta rica en lípidos. La Figura 32 es una imagen de una aorta disecada de un ratón deficiente en ApoE coloreada con Sudan - IV. Obsérvese que la aorta torácica contiene menos lesiones ateroscleróticas coloreadas de rojo mientras que la región abdominal es altamente aterosclerótica. (Figura 32 adaptada de imágenes de lesiones ateroscleróticas aórticas por 125I-HDL y 125I-BSA. A. Shaish y colaboradores, Pathobiology - enviada para publicación).

La Figura 33 resume la expresión de Luciferasa observada 5 días después de inyecciones sistémicas de Ad5PPE-1Luc (barras sin relleno; n = 12) y Ad5CMVLuc (barras de color negro; n = 12) a ratones deficientes de ApoE. Los resultados se presentan como expresión absoluta de Luciferasa en el área torácica que contiene menos lesión aterosclerótica, y la aorta abdominal que es una lesión aterosclerótica rica.

La expresión de la Luciferasa controlada por el promotor de PPE-1 era 6 veces superior en la aorta abdominal altamente aterosclerótica, y 1,6 veces superior en la aorta torácica ligeramente aterosclerótica comparada con la expresión bajo el control del promotor CMV.

No se observó una diferencia significativa entre las dos regiones de la aorta en los ratones inyectados con Ad5PPE-1Luc, aunque se observó una expresión superior de Luciferasa en la aorta torácica del grupo inyectado con
Ad5CMVLuc comparado con baja expresión en la aorta abdominal que contiene lesión.

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Estos resultados indican que aunque un promotor constitutivo (CMV) tiene una tendencia a cerrarse en áreas donde la aterosclerosis es más severa, el promotor de PPE-1 relativamente no es afectado por el progreso de la enfermedad.

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Ejemplo 21 Ensayos del promotor de PPE-1 en un modelo de cicatrización de heridas

Con el fin de analizar la actividad específica y la eficiencia de construcciones de Ad5PPE-1 para dirigir la expresión de Luciferasa a vasos sanguíneos con heridas para cicatrización, se empleó la cicatrización de heridas de múrido como se describió aquí anteriormente en Materiales y Métodos.

Como en otros experimentos, se utilizó Ad5CMVLuc como un control no específico del tejido. La actividad de la Luciferasa bajo el control del promotor de PPE-1 (Figura 34; barras sin relleno) fue mayor tanto en la región normal (6,8 \pm 3,2) como en la región con heridas para cicatrización (5 \pm 1,6) comparado con la actividad observada bajo el control de CMV (Figura 34; barras de color negro).

Debido a que tanto el promotor CMV como el promotor PPE-1 exhibieron niveles reducidos de expresión en la cicatrización de lesiones, estos resultados son difíciles de interpretar. A pesar de esta observación inesperada, es claro que el promotor de PPE-1 dirige niveles mayores de expresión que el promotor CMV tanto en tejido normal como cicatrizado. La presencia de tejido de cicatriz necrótica puede dar cuenta de los niveles de expresión reducida observados con ambos promotores en la cicatrización de heridas.

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Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

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\bulletPlump, A. S. y colaboradores. Cell, 1991, vol. 71, 343-353 [0207]

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<110> Harats, Dror

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<120> PROMOTORES QUE EXHIBEN ESPECIFICIDAD POR CÉLULAS ENDOTELIALES Y MÉTODOS PARA SU UTILIZACIÓN

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<130> 01/22752

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<150> US 60/248.582

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<151> 2000-11-17

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<160> 8

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 1334

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 1

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5

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<210> 2

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<211> 96

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido sintético

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<400> 2

7

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<210> 3

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<211> 96

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido sintético

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<400> 3

8

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<210> 4

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Sitio de restricción de Nhe-1

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

gctagc

\hfill

6

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<210> 5

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> características diversas

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<223> Caja -E- elemento sensible a la hipoxia

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcacgt

\hfill

6

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<210> 6

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<211> 44

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> características diversas

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<223> Elemento reforzador específico endotelial de múrido

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

gtacttcata cttttcattc caatggggtg actttgcttc tgga

\hfill

44

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<210> 7

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<211> 143

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Una copia por triplicado de una secuencia reforzadora de múrido originada a partir del promotor de PPE-1

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<400> 7

9

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<210> 8

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<211> 47

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> fragmento de EDC

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctggagggtg actttgcttc tggagccagt acttcatact tttcatt

\hfill

47

Claims

1. Un polinucleótido aislado que funciona como un elemento regulador, el polinucleótido aislado comprendiendo al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8, siendo dicho elemento regulador capaz de regular la expresión de una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor funcional en células endoteliales.

2. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en donde dicho elemento regulador incluye además al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

3. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en donde dicho elemento regulador incluye una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8 y al menos dos copias de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

4. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en donde dicho promotor que funciona en células endoteliales comprende al menos una copia del promotor de PPE-1.

5. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, que comprende además un elemento de respuesta a la hipoxia.

6. El polinucleótido aislado de la reivindicación 5, en donde dicho elemento de respuesta a la hipoxia incluye al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5.

7. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en donde dicho elemento regulador es como el expuesto en la SEQ ID NO: 7.

8. Una construcción de ácido nucleico que comprende al polinucleótido aislado de la reivindicación 1 y una secuencia de ácido nucleico de interés, dicha secuencia de ácido nucleico de interés estando bajo el control regulador de dicho polinucleótido aislado.

9. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 8, en donde dicha secuencia de ácido nucleico de interés es seleccionada del grupo que consiste de VEGF, p55 y PDGF-BB.

10. Una célula de mamífero transformada con el polinucleótido aislado de la reivindicación 1.

11. El uso de una construcción funcional en células endoteliales para la fabricación de un medicamento para la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés en células endoteliales, dicha construcción comprendiendo una secuencia de ácido nucleico de interés posicionada bajo el control regulador de un promotor funcional en células endoteliales, y un elemento regulador que incluye al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8.

12. El uso de 11, en donde dicho promotor exhibe especificidad de célula endotelial.

13. El uso de la reivindicación 12, en donde dicho promotor es el promotor de PPE-1 como el expuesto en la SEQ ID NO: 1.

14. El uso de la reivindicación 11, en donde dicho elemento regulador incluye además al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

15. El uso de la reivindicación 14, en donde dicho elemento regulador es como el expuesto en la SEQ ID NO: 7.

16. El uso de la reivindicación 14, en donde dicha al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6 incluye dos copias.

17. El uso de la reivindicación 14, en donde dichas al menos dos copias de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6 son contiguas.

18. El uso de la reivindicación 11, en donde dicha secuencia de ácido nucleico de interés es seleccionada del grupo que consiste de VEGF, p55 y PDGF-BB.

19. El uso de la reivindicación 11, en donde dicho medicamento está diseñado para administración por medio de un método seleccionado del grupo que consiste de:

(i): administración sistémica in vivo;

(ii): administración ex vivo a células removidas del cuerpo de un individuo y posterior reintroducción de dichas células dentro de dicho cuerpo de dicho individuo; y

(iii): administración local in vivo.

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20. El uso de una construcción de ácido nucleico para la fabricación de un medicamento para regular la angiogénesis en un tejido, comprendiendo la construcción de ácido nucleico:

(a): un promotor específico de célula endotelial;

(b): al menos una copia de un elemento de respuesta a la hipoxia expuesto en la SEQ ID NO: 5;

(c): un elemento regulador que incluye al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8, y

(d): una secuencia de ácido nucleico que codifica un regulador de angiogénesis, dicha secuencia de ácido nucleico estando bajo el control regulador de dicho promotor y dicho elemento de respuesta a la hipoxia.

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21. El uso de la reivindicación 20, en donde dicho medicamento está diseñado para administración por medio de un método seleccionado del grupo que consiste de:

(i): administración sistémica in vivo;

(ii): administración ex vivo a células removidas del cuerpo de un individuo, dichas células posteriormente reintroducidas dentro de dicho cuerpo de dicho individuo; y

(iii): administración local in vivo.

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22. El uso de la reivindicación 20, en donde dicha construcción de ácido nucleico incluye además:

(e): al menos una copia de una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

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23. El uso de la reivindicación 22, en donde dicha al menos una copia de una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6 incluye dos copias contiguas.

24. El uso de la reivindicación 20, en donde dicho promotor específico de células endoteliales comprende al menos una copia del promotor de PPE-1.

25. El uso de la reivindicación 20, en donde dicha secuencia de ácido nucleico que codifica un regulador de angiogénesis se selecciona del grupo que consiste de VEGF, p55 y PDGF-BB.

26. Un polinucleótido aislado funcional como promotor en células eucariotas, el polinucleótido aislado comprendiendo un elemento regulador que incluye la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 7.

27. El polinucleótido aislado de la reivindicación 26, que comprende además un elemento promotor endotelial específico.

28. El polinucleótido aislado de la reivindicación 27, en donde dicho elemento promotor endotelial específico comprende al menos una copia del promotor de PPE-1.

29. El polinucleótido aislado de la reivindicación 26, que comprende además un elemento de respuesta a la hipoxia.

30. El polinucleótido aislado de la reivindicación 29, en donde dicho elemento de respuesta a la hipoxia incluye al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5.

31. Una construcción de ácido nucleico que comprende al polinucleótido aislado de la reivindicación 28 y una secuencia de ácido nucleico de interés, estando dicha secuencia de ácido nucleico de interés bajo el control regulador de dicho polinucleótido aislado.

32. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 31, en donde dicha secuencia de ácido nucleico de interés se selecciona del grupo que consiste de VEGF, p55 y PDGF-BB.

33. Una célula de mamífero transformada con el polinucleótido aislado de la reivindicación 28.

34. El uso de una construcción de ácido nucleico para la fabricación de un medicamento para regular la angiogénesis en un tejido, comprendiendo dicha construcción de ácido nucleico:

(a): un promotor específico de célula endotelial;

(b): un elemento regulador que incluye la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 7;

(c): al menos una copia de un elemento de respuesta a la hipoxia expuesto en la SEQ ID NO: 5; y

(d): una secuencia de ácido nucleico que codifica un regulador de angiogénesis, dicha secuencia de ácido nucleico estando bajo el control regulador de dicho promotor, de dicho elemento reforzador y de dicho elemento de respuesta a la hipoxia.

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35. El uso de la reivindicación 34, en donde dicho medicamento está diseñado para administración por medio de un método seleccionado del grupo que consiste de:

(i): administración sistémica in vivo;

(ii): administración ex vivo a células removidas del cuerpo de un individuo, y posterior reintroducción de dichas células dentro de dicho cuerpo de dicho individuo; y

(iii): administración local in vivo.

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36. El uso de la reivindicación 34, en donde dicho promotor específico de células endoteliales comprende al menos una copia del promotor de PPE-1 (SEQ ID NO: 1).

37. El uso de la reivindicación 34, en donde dicha secuencia de ácido nucleico que codifica un regulador de angiogénesis se selecciona del grupo que consiste de VEGF, p55 y PDGF-BB.

38. El uso de una construcción de ácido nucleico para la fabricación de un medicamento para regular la angiogénesis en un tejido, comprendiendo dicha construcción de ácido nucleico:

(a): un promotor específico de célula endotelial;

(b): un elemento regulador que incluye al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8; y

(c): una secuencia de ácido nucleico que codifica un regulador de angiogénesis, dicha secuencia de ácido nucleico estando bajo el control regulador de dicho promotor y de dicho elemento regulador.

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39. El uso de la reivindicación 38, en donde dicho elemento regulador incluye además al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

40. El uso de la reivindicación 38, en donde dicho elemento regulador incluye una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8 y al menos dos copias de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

41. El uso de la reivindicación 38, en donde la construcción de ácido nucleico incluye además un elemento de respuesta a la hipoxia.