JP4243653B2 - 内皮細胞特異性を示すプロモーター及びその使用法 - Google Patents

Description

【０００１】
発明の領域及び背景
本発明は、内皮細胞特異的プロモーター活性を示す単離されたポリヌクレオチド配列、及びその使用法に関し、より具体的には、増加した内皮細胞における活性及び特異性を示す修飾型プレプロエンドセリン−１（ＰＰＥ−１）プロモーターに関する。本発明は、さらに、低酸素及び血管形成を含む生理学的条件に応答して発現を増強するＰＰＥプロモーターの修飾に関する。
【０００２】
遺伝子治療は、先天性及び後天性のヒト疾患を治療するための最先端のモダリティである。癌、心臓血管疾患、及び末梢血管疾患の遺伝子治療のための方法の開発には、多大な努力が向けられているが、効率的かつ特異的な遺伝子送達には依然として大きな障壁が存在する。一般的に、シャトルとして組換えウイルスベクターを使用した、目的の遺伝子による遺伝子治療の主な限定要因は、目的の遺伝子を標的組織へと特異的に差し向ける能力である。この目的のために使用されているアデノウイルスは、種々の親和性で極めて多様な細胞に感染することができる。実際、非組織特異的プロモーターの使用は、目的の遺伝子の発現の最大９５％を肝臓において誘導し；従って、発現の制御が、高度に必要とされている。さらに、遺伝子をターゲティングする場合、正常な血管内皮と、増殖中の腫瘍内の発達中の血管内皮とを区別することは、現在、不可能である。
【０００３】
癌発生においても血管疾患においても、血管形成、新たな血管の創生が、中心的な役割を果たす。従って、血管内皮に対する遺伝子治療によるこの過程の制御は、これらの疾患のターゲティッド療法の誘導において圧倒的に重要であるかもしれない。
【０００４】
レトロウイルスベクターにより送達されるヒトプレプロエンドセリン−１（ＰＰＥ−１）の高い効率が、インビトロ内皮細胞（ＥＣ）及びトランスジェニック動物モデルにおいて得られた。しかしながら、先行技術は、インビボ遺伝子治療のためのこのプロモーターの使用を教示していない。ヒトＰＰＥ−１は、他の動物、最も顕著にはマウスのＰＰＥ−１遺伝子に見い出される制御因子を欠いている。
【０００５】
米国特許第５７４７３４０号は、マウスＰＰＥ−１プロモーター及びその一部の使用を教示している。しかしながら、この特許は、内皮特異性を保存しつつ、ＰＰＥプロモーターにより達成される発現レベルを増加させるために、内皮特異的エンハンサーが利用されうることの暗示又は示唆を全く含有していない。さらに、この特許は、ＰＰＥ−１プロモーターが、低酸素条件下で、より高い転写レベルへと誘導されることを教示していない。
【０００６】
このように、上記の制限を有しない、改良された内皮細胞特異的プロモーター、その使用法、及びそれらにより形質転換された細胞の、広く認識された必要が存在しており、そしてそれらを入手することは、高度に有利であろう。開示された発明は、心臓血管疾患、癌の治療、及び創傷治癒において、従来既知の配置と比較して増加した有用性を示すと予想される。
【０００７】
発明の概要
本発明の一つの面によると、真核細胞においてプロモーターとして機能性の単離されたポリヌクレオチドが提供される。単離されたポリヌクレオチドには、配列番号：６に示された配列少なくとも２コピーを含むエンハンサー因子が含まれる。
【０００８】
本発明のもう一つの面によると、活性ＲＮＡ分子、又は酵素、レポーター分子等のようなタンパク質をコードする目的の核酸配列を、内皮細胞において発現させる方法が提供される。本方法は、真核細胞において機能性のプロモーターの制御調節下に置かれた目的の核酸配列を含む構築物を、対象へ投与することを含む。構築物は、配列番号：６に示された配列少なくとも１コピーを含むエンハンサー因子をさらに含む。
【０００９】
本発明のさらにもう一つの面によると、組織における血管形成を制御する方法が提供される。本方法は、（ａ）内皮細胞特異的プロモーターと；（ｂ）配列番号：５に示された低酸素応答因子少なくとも１コピーと；（ｃ）プロモーター及び低酸素応答因子の制御調節下にある、血管形成制御剤をコードする核酸配列とを含む核酸構築物を投与することを含む。
【００１０】
本発明のさらにもう一つの面によると、真核細胞においてプロモーターとして機能性の単離されたポリヌクレオチドが提供される。単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：７に示された配列を含むエンハンサー因子を含む。
【００１１】
本発明の付加的な面によると、組織における血管形成を制御する方法が提供される。本方法は、（ａ）内皮細胞特異的プロモーターと；（ｂ）配列番号：７に示された配列を含むエンハンサー因子と；（ｃ）配列番号：５に示された低酸素応答因子少なくとも１コピーと；（ｄ）プロモーター、エンハンサー因子、及び低酸素応答因子の制御調節下にある、血管形成制御剤をコードする核酸配列とを含む核酸構築物を投与することを含む。
【００１２】
本発明のさらなる面によると、真核細胞においてプロモーターとして機能性の単離されたポリヌクレオチドが提供され、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：８に示された配列少なくとも１コピーを含むエンハンサー因子を含む。
【００１３】
本発明のさらなる面によると、目的の核酸配列を内皮細胞において発現させる方法が提供され、本方法は、真核細胞において機能性のプロモーターの制御調節下に置かれた目的の核酸配列と、配列番号：８に示された配列少なくとも１コピーを含むエンハンサー因子とを含む構築物を、対象へ投与することを含む。
【００１４】
本発明のさらにもう一つの面によると、真核細胞においてプロモーターとして機能性の単離されたポリヌクレオチドが提供され、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：８に示された配列を含むエンハンサー因子を含む。
【００１５】
下記の本発明の好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、エンハンサー因子は、配列番号：６に示された配列３コピーを含む。
【００１６】
本発明の好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、配列番号：６に示された配列少なくとも２コピーは近接している。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、単離されたポリヌクレオチドは、さらに内皮特異的プロモーター因子を含む。
【００１８】
本発明の好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、内皮特異的プロモーター因子は、ＰＰＥ−１プロモーター少なくとも１コピーを含む。
【００１９】
本発明の好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、単離されたポリヌクレオチドは、低酸素応答因子をさらに含む。
【００２０】
本発明の好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、低酸素応答因子は、配列番号：５に示された配列少なくとも１コピーを含む。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、エンハンサー因子は配列番号：７に示されるようなものである。
【００２２】
本発明の好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、特許請求の範囲に記載された単離されたポリヌクレオチドと、単離されたポリヌクレオチドの制御調節下にある目的の核酸配列とを含む核酸構築物が提供される。
【００２３】
本発明の好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、目的の核酸配列は、ＶＥＧＦ、ｐ５５、及びＰＤＧＦ−ＢＢからなる群より選択される。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、特許請求の範囲に記載された単離されたポリヌクレオチドにより形質転換された哺乳動物細胞が提供される。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、プロモーターは、内皮細胞特異性を示す。
【００２６】
本発明の好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、プロモーターは、配列番号：１に示されるようなＰＰＥ−１プロモーターである。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、投与は、（ｉ）全身インビボ投与；（ｉｉ）対象の身体から摘出された細胞へのエクスビボ投与、及びその後の対象の身体への細胞の再導入；並びに（ｉｉｉ）局所インビボ投与からなる群より選択される方法によって達成される。
【００２８】
本発明の好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、核酸構築物は、配列番号：６に示された配列少なくとも２コピーを含むエンハンサー因子をさらに含む。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、内皮細胞特異的プロモーターは、ＰＰＥ−１プロモーター少なくとも１コピーを含む。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、特許請求の範囲に記載された単離されたポリヌクレオチドと、単離されたポリヌクレオチドの制御調節下にある目的の核酸配列とを含む核酸構築物が提供される。
【００３１】
記載された好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、エンハンサー因子は、配列番号：６に示された配列少なくとも１コピーをさらに含む。
【００３２】
記載された好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、エンハンサー因子は、配列番号：８に示された配列１コピーと、配列番号：６に示された配列少なくとも２コピーとを含む。
【００３３】
記載された好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、エンハンサー因子は、配列番号：６に示された配列少なくとも１コピーをさらに含む。
【００３４】
記載された好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、少なくとも１コピーには２コピーが含まれる。
【００３５】
記載された好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、核酸構築物は、配列番号：８に示された配列少なくとも１コピーを含むエンハンサー因子をさらに含む。
【００３６】
本発明のさらにもう一つの面によると、（ａ）内皮細胞特異的プロモーターと；（ｂ）配列番号：８に示された配列少なくとも１コピーを含むエンハンサー因子と；（ｃ）プロモーター及びエンハンサー因子の制御調節下にある、血管形成制御剤をコードする核酸配列とを含む核酸構築物を投与することを含む、組織における血管形成を制御する方法が提供される。
【００３７】
記載された好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、エンハンサー因子は、配列番号：６に示された配列少なくとも１コピーをさらに含む。
【００３８】
記載された好ましい実施態様におけるさらなる特徴によると、エンハンサー因子は、配列番号：８に示された配列１コピーと、配列番号：６に示された配列少なくとも２コピーとを含む。
【００３９】
本発明は、内皮細胞特異性を有する改良された単離されたポリヌクレオチド配列、及びその使用法を提供することにより、現在既知の配置の欠点をうまく解決する。配列の改良は、従来は実行不可能と考えられた多様な疾患、障害、及び状態を治療する実行可能な方法を作成する。特に、改良は、内皮細胞への特異性の増加、目的の配列の発現レベルの増加、並びに虚血及び血管形成を含む状態による誘導の増強に関する。
【００４０】
図面の簡単な説明
本発明は、添付の図面を参照しつつ、例示のためにのみ、本明細書に記載される。特に詳細な図面に関して、示された明細は、例示のためのものであり、本発明の好ましい実施態様の例示的な記述のみを目的とするものであり、本発明の原理及び概念的な面の、最も有用で、かつ容易に理解される記載であると考えられるものの提供のために提示されることが強調される。これに関して、本発明の基本的な理解に必要であるより詳細には本発明の構造的な詳細を示す試みはなされておらず、図面と共に参照された記載によって、本発明のいくつかの形態がいかにして実際に具体化されうるかが、当業者には明白となるであろう。
図１は、非内皮対照としてＢ２Ｂ細胞系を使用した、ウシ及びヒト両方の内皮細胞系におけるルシフェラーゼ発現に対する、本発明のエンハンサー因子の効果を例示するヒストグラムである。
図２は、様々な細胞系におけるルシフェラーゼ発現に対する、アデノウイルスベクター内の本発明のプロモーターの内皮特異性を例示するヒストグラムである。
図３Ａ及び３Ｂは、ＢＡＥＣ細胞系における、本発明のＡｄ５ＰＰＥ−１−３Ｘ及びＡｄ５ＣＭＶ対照構築物の調節下でのＧＦＰ発現を例示する光学顕微鏡写真である。
図４は、内皮細胞及び非内皮細胞におけるｐＡＣＰＰＥ−１−３Ｘｐ５５、ｐＡＣＰＰＥ−１−３Ｘルシフェラーゼ、及びｐＣＣＭＶｐ５５により誘導されたアポトーシス率（％）のヒストグラムである。
図５は、本発明に係るエンハンサー因子のプロモーター構築物への導入の、低酸素応答に対する効果を例示するヒストグラムである。
図６は、本発明に係るエンハンサー因子の、アデノベクター構築物のプロモーターへの導入の、低酸素応答に対する効果を例示するヒストグラムである。
図７は、本発明に係るエンハンサー因子のプロモーターへの導入の、ウシ及びヒトの内皮細胞系における発現レベルに対する効果を例示するヒストグラムである。
図８は、内皮プロモーター（ＰＰＥ−１）又は対照（ＣＭＶ）プロモーターいずれかを含有しているアデノウイルス構築物の注射後に、様々な器官において観察されたレポーター遺伝子の発現レベルを例示するヒストグラムである。
図９Ａ〜Ｂは、構築物を注射されたマウスの肝組織におけるＡｄ５ＣＭＶＧＦＰ構築物（図９Ａ）及びＡｄ５ＰＰＥ−１−ＧＦＰ構築物（図９Ｂ）の細胞発現を例示する二つの光学顕微鏡写真である。
図１０は、本発明に係るエンハンサー因子のプロモーターへの導入の、内皮細胞系及び非内皮細胞系における発現レベルに対する効果を例示するヒストグラムである。
図１１は、本発明に係るエンハンサー因子のプロモーターへの導入の、内皮細胞系及び非内皮細胞系における発現レベルに対する効果を例示するヒストグラムである。
図１２Ａ〜Ｃは、Ａｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰにより形質導入された細胞、Ａｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰにより形質導入された細胞、及びＡｄ５ＣＭＶＧＦＰにより形質導入された細胞におけるＧＦＰ発現を例示する顕微鏡写真である。
図１３Ａ〜Ｂは、ｍｏｉ−１のＡｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰ及びＡｄ５ＣＭＶＧＦＰによりそれぞれ形質導入されたＳＭＣにおけるＧＦＰ発現を例示する。
図１４Ａ〜Ｂは、ＨｅＬａ細胞において行われた図１３Ａ〜Ｂの実験と類似の実験の結果を示す。
図１５Ａ〜Ｂは、ＨｅｐＧ２細胞において行われた図１３Ａ〜Ｂの実験と類似の実験の結果を示す。
図１６Ａ〜Ｂは、ＮＳＦ細胞において行われた図１３Ａ〜Ｂの実験と類似の実験の結果を示す。
図１７Ａ〜Ｂは、それぞれＡｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰ及びＡｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰを注射されたマウスの血管を裏打ちしている内皮細胞におけるＧＦＰ発現を例示する顕微鏡写真である。
図１８Ａ〜Ｃは、注射されたマウスの腎組織からの結果を例示する顕微鏡写真である。Ａｄ５ＣＭＶＧＦＰを注射されたマウス（図１８Ａ）、Ａｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰ（図１８Ｂ；わずかに高度のＧＦＰ発現が血管壁に可視である；矢印によって示されている）、及びＡｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰ（図１８Ｃ）。
図１９Ａ〜Ｃは、脾組織切片に対して行われた、図１８Ａ〜Ｃに図示された実験と類似の実験を例示する。
図２０Ａ〜Ｄ及び図２０Ｃ’〜Ｄ’は、生理食塩水を注射された対照マウス（図２０Ａ）、Ａｄ５ＣＭＶＧＦＰを注射されたマウス（図２０Ｂ）、Ａｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰを注射されたマウス（図２０Ｃ）、及びＡｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰを注射されたマウス（図２０Ｄ）の転移肺におけるＧＦＰ発現を例示する。抗Ｃｄ３１免疫染色（図２０Ｃ’〜２０Ｄ’）は、各転移組織におけるＧＦＰ発現及びＣＤ３１発現の共局在を確証している。
図２１は、マウスＰＰＥ−１プロモーターを含有しているプラスミドによりトランスフェクトされたＢＡＥＣにおけるルシフェラーゼ活性（光単位／μｇタンパク質）が、トランスフェクトされた細胞を低酸素条件下でインキュベートした場合に、有意に高くなることを例示するヒストグラムである。
図２２は、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ及びＡｄ５ＣＭＶＬｕｃが利用されたことを除き、図２１と同様のヒストグラムである。
図２３は、種々の細胞系における低酸素の効果を示す、図２２と同様の一連のヒストグラムである。
図２４は、本発明の３Ｘ配列の、ＢＡＥＣ細胞におけるＰＰＥ−１低酸素応答に対する効果を例示するヒストグラムである。細胞は、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ及びＡｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＬｕｃにより形質導入された。
図２５は、大腿動脈結紮後のＰＰＥ−１−Ｌｕｃトランスジェニックマウスにおけるルシフェラーゼ発現のレベルを示すヒストグラムである。
図２６Ａ〜Ｂは、本発明と併せて利用された構築物のプラスミド地図である。
図２７Ａ〜Ｄは、結紮後２１日目の、種々の処理群からの代表的な動物の結紮された肢の一連の超音波画像である。図２７Ａ：対照Ａｄ５ＣＭＶＬｕｃ処理；図２７Ｂ：対照生理食塩水処理；図２７Ｃ：Ａｄ５ＰＰＥ−３Ｘ−ＶＥＧＦ処理；図２７Ｄ：Ａｄ５ＣＭＶ−ＶＥＧＦ処理。
図２８は、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ（白バー）及びＡｄ５ＣＭＶＬｕｃ（黒バー）により形質導入された増殖期及び休止期のウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）におけるルシフェラーゼ活性を例示するヒストグラムである。
図２９は、ＶＥＧＦ添加後の正常増殖中、休止状態、及び急速増殖中のＡｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃにより形質導入されたＢＡＥＣにおけるルシフェラーゼ活性を例示するヒストグラムである。
図３０Ａ〜Ｂは、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ及びＡｄ５ＣＭＶＬｕｃを注射された正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスの（図３０Ａ）大動脈及び肝臓（図３０Ｂ）におけるルシフェラーゼ活性（光単位／μｇタンパク質）を例示するヒストグラムである。活性は、注射後１日目（ｎ＝１３）、５日目（ｎ＝３４）、１４日目（ｎ＝３２）、３０日目（ｎ＝２０）、及び９０日目（ｎ＝１１）に決定された。
図３１Ａ〜Ｂは、注射された正常なＢＡＬＢ／Ｃマウスにおける、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ（白バー）又はＡｄ５ＣＭＶＬｕｃ（黒バー）の注射後５日目（図３１Ａ）及び１４日目（図３１Ｂ）（各時点についてｎ＝１０）に検出された相対ルシフェラーゼ活性（光単位／μｇタンパク質）を例示するヒストグラムである。活性は、各動物の全身ルシフェラーゼ発現に対する比率（％）として表されている。
図３２は、スーダン−ＩＶにより着色されたＡｐｏＥ欠損マウスから解剖された大動脈を図示する先行技術の画像である。胸大動脈は、比較的少ない赤色に染色されたアテローム性動脈硬化巣を含有しており、腹領域は、多くの赤色に染色されたアテローム性動脈硬化巣を含んでいる。（^１２５Ｉ−ＨＤＬ及び、^１２５Ｉ−ＢＳＡによる大動脈アテローム性動脈硬化巣の画像法（Ａ．Ｓｈａｉｓｈ ら、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ−投稿中）より編集した）。
図３３は、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ（白バー；ｎ＝１２）又はＡｄ５ＣＭＶＬｕｃ（黒バー；ｎ＝１２）のＡｐｏＥ欠損マウスへの全身注射後５日目に検出された絶対ルシフェラーゼ活性（光単位／μｇタンパク質）を例示するヒストグラムである。高い病巣レベルを含有している腹大動脈から、及び、胸区域（低い病巣レベル）から、ルシフェラーゼ活性が観察された。
図３４は、創傷治癒中のＣ５７ＢＬ／６誘導マウスへのＡｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ（黒バー）又はＡｄ５ＣＭＶＬｕｃ（白バー）の全身注射後５日目の絶対ルシフェラーゼ活性（光単位／μｇタンパク質）を例示するヒストグラムである。
図３５は、ルイス肺癌誘導マウスの正常肺、転移肺、及び原発腫瘍におけるルシフェラーゼ活性を例示するヒストグラムである。ルイス肺癌は、原発腫瘍モデルについては背部へ、転移モデルについては足蹠へ、Ｄ１２２−９６細胞を注射することによって誘導された。ルシフェラーゼ活性は、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ（ｎ＝９；白バー）又はＡｄ５ＣＭＶＬｕｃ（ｎ＝１２；黒バー）の全身注射後５日目に測定された。活性は光単位／μｇタンパク質として表されている。
図３６Ａ〜Ｄは、Ａｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰの腫瘍内注射後のＬＬＣ保持マウスの肺及び腫瘍におけるＧＦＰ発現及び組織形態学を例示する顕微鏡写真である。組織は、ＯＣＴ中で凍結させられ、低温槽によって１０μｍに切片化された。写真は、全て、２５×の倍率で撮影された。図３６Ａ−肺転移の血管形成性血管におけるＧＦＰ；図３６Ｂ−図３６Ａに描写された切片のＣＤ３１抗体免疫染色；図３６Ｃ−原発腫瘍の血管におけるＧＦＰ発現；図３６Ｄ−血管を例示するＣの切片の位相差。
図３７は、Ａｄ５ＣＭＶＬｕｃ、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ、及びＡｄ５ＰＰＥ−１−３Ｘ−Ｌｕｃを注射されたルイス肺癌誘導マウスのの正常肺及び転移肺におけるルシフェラーゼ発現を例示するヒストグラムである。ルイス肺癌は、転移モデルについては足蹠に注射されたＤ１２２−９６細胞によって誘導された。ルシフェラーゼ活性は、Ａｄ５ＣＭＶＬｕｃ（ｎ＝７；黒バー）、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ（ｎ＝６；灰色バー）、又はＡｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＬｕｃ（ｎ＝１３；茶色バー）の全身注射後５日目に測定された。活性は光単位／μｇタンパク質として表されている。
図３８は、Ａｄ５ＣＭＶ、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ、及びＡｄ５ＰＰＥ−１（３Ｘ）を注射されたルイス肺癌誘導マウスの正常肺及び肺転移における肝臓活性に対する比率（％）（肝臓を１００％とした場合）としてのルシフェラーゼ活性を例示するヒストグラムである。
図３９Ａ〜Ｂは、Ａｄ５ＰＰＥ−１−３Ｘ−ＧＦＰを注射されたＬＬＣ肺転移を有するマウスにおけるＧＦＰ発現（図３９Ａ）及びＣｄ３１免疫染色（図３９Ｂ）の共局在を例示する顕微鏡写真である。
図４０は、大腿結紮後２日目、５日目、１０日目、及び１８日目のＰＰＥ−１ルシフェラーゼトランスジェニックマウスの筋肉（虚血及び正常）、並びに対照（非結紮動物−０日目；各群ｎ＝８）におけるルシフェラーゼ活性（光単位／μｇタンパク質）を例示するヒストグラムである。
図４１は、大腿結紮後５日目（ｎ＝６）、１０日目（ｎ＝６）、及び１８日目（ｎ＝８）のＰＰＥ−１ルシフェラーゼトランスジェニックマウスの肝臓、肺、及び筋肉内（虚血及び正常）大動脈、並びに対照（非結紮動物−０日目）におけるルシフェラーゼ活性（光単位／μｇタンパク質）を例示するヒストグラムである。
図４２は、Ａｄ５ＣＭＶＬｕｃ（黒バー）又はＡｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ（白バー）を原発腫瘍内に注射されたＬＬＣマウスの肝臓、肺、及び原発腫瘍において検出されたルシフェラーゼ活性（光単位／μｇタンパク質）を例示するヒストグラムである。
【００４１】
好ましい実施態様の説明
本発明は、目的の配列の高レベル発現を、内皮細胞、特に血管形成に参加している内皮細胞へと差し向けるために利用されうる、改良された内皮細胞特異的プロモーターの発明である。
【００４２】
本発明の原理及び使用は、図面及び添付の記載を参照することにより、よりよく理解されうる。
【００４３】
本発明の少なくとも一つの実施態様を詳細に説明する前に、本発明は、以下の記載において示された、又は実施例及び図面に例示された構築物の詳細及び成分の配置に、その適用が制限されないことを理解されたい。本発明は、他の実施態様も可能であり、又は様々な方式で実行もしくは実施されうる。又、本明細書において利用された語法及び術語は、記載の目的のためのものであり、制限的なものと見なすべきではないことも理解されたい。
【００４４】
内皮特異的プロモーターは以前に記載されているが（例えば、米国特許第５７４７３４０号）、これらのプロモーターは、典型的には、発現を内皮細胞へと差し向ける効率が低いか、又はインビボでは内皮細胞に特異的であることが証明されていない。
【００４５】
内皮細胞に特異的なエンハンサー因子も、記載されている。ブー（Ｂｕ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２（１９）：３２６１３−３２６２２）は、（因子ＥＴＥ−Ｃ、ＥＴＥ−Ｄ、及びＥＴＥ−Ｅを含有している）ＰＰＥ−１の１Ｘエンハンサー因子３コピー（３Ｘ）が、インビトロでプロモーター配列に内皮細胞特異性を付与することを証明したが、そのような活性はインビボでは証明されていない。
【００４６】
当分野において周知なように、インビトロ実験から、インビボの結果を確実に予測することはできない。そのため、ブー（Ｂｕ）らによって提示された結果は、内皮細胞特異性は示唆しているが、インビボでの３Ｘエンハンサー因子の有用性に関しては十分な証拠を提供していない。
【００４７】
インビボ研究の不足からも、完全生物における３Ｘエンハンサー因子の内皮細胞特異性は疑問である。インビボで利用された場合、特に血管形成を制御するために利用された場合、血管形成制御剤（例えば、細胞毒）の発現を、内皮細胞、好ましくは血管形成に関与している内皮細胞の特定のサブセットへと特異的に差し向けることは不可欠であるため、このデータの不足は、この因子の治療適用が疑わしいことを意味している。
【００４８】
下記の実施例セクションにおいて例示されるように、本発明者らは、精力的な実験を通して、初めて、３Ｘエンハンサー因子のインビボ活性に関する決定的な証拠を提供した。そのような証拠は、３Ｘ因子及びその配列誘導体（例えば、配列番号：７）が、治療適用における使用に高度に適していることを同定している。
【００４９】
さらに、本発明を実行する中で、本発明のＰＰＥ−１エンハンサー配列の新規な配置が、血管形成に参加している内皮細胞における予想外の、高度に特異的な活性を、プロモーター配列に付与することが発見された。
【００５０】
従って、本発明の一つの面によると、ヒトのような哺乳動物において内皮細胞特異的プロモーターとして機能性の単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００５１】
単離されたポリヌクレオチドは、下記の実施例セクションにおいて例示されるように、血管形成に参加している内皮細胞における発現の制御において重要な役割を果たす、配列番号：６に示された配列１コピー以上を含み、好ましくは配列番号：８に示された配列１コピー以上も含むエンハンサー因子を含む。
【００５２】
本発明により活用可能なエンハンサー因子の一つの特定の新規な配列配置は、配列番号：７に例示される。
【００５３】
この明細書及び添付の特許請求の範囲の目的のため、「エンハンサー」という用語は、プロモーターの転写効率を増加させる任意のポリヌクレオチド配列をさす。
【００５４】
本発明のいくつかの実施態様によると、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：６及び／又は８の近接したコピーを含む。そのような配列は、好ましくは、頭部−尾部方向で位置付けられているが、本発明のエンハンサー因子は、例えば、エンハンサー因子の構築において配列番号：６又は８と相補的な配列を使用することにより、配列番号：６又は８の配列の特定の一部分１コピー以上を逆方向で含んでいてもよい。
【００５５】
好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは、内皮細胞特異的プロモーター配列因子をさらに含む。この明細書及び添付の特許請求の範囲の目的のため、「プロモーター」という用語は、下流の目的の配列のＲＮＡ転写を媒介することができる任意のポリヌクレオチド配列をさす。内皮特異的プロモーター因子は、例えば、ＰＰＥ−１プロモーター少なくとも１コピーを含みうる。
【００５６】
好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは、低酸素応答因子、例えば配列番号：５に示された配列少なくとも１コピーをさらに含む。
【００５７】
従って、本発明のこの面によると、様々なエンハンサー因子配置を含む内皮細胞特異的プロモーターが提供される。
【００５８】
エンハンサー因子配列は、使用されるプロモーター配列の内部、プロモーターの上流、プロモーターと下流の目的の配列との間、又は目的の配列の内部（例えば、イントロン）に位置付けられうることが認識されるであろう。
【００５９】
本発明の単離された核酸配列は、真核生物組織、特に増殖中の内皮細胞、例えば血管形成に関与している内皮細胞における遺伝子発現を制御するために使用されうる。
【００６０】
従って、本発明の単離されたポリヌクレオチド配列は、いくつかの場合においては、本発明の単離されたポリヌクレオチドの制御調節下に置かれた目的の核酸配列をさらに含む核酸構築物の一部として提供されうる。そのような核酸構築物は、例えば選択マーカーをコードする配列、細菌の複製開始点、又はレポーターポリペプチドをコードする配列のような任意の付加的なポリヌクレオチド配列をさらに含みうることが認識されるであろう。そのような核酸構築物は、好ましくは哺乳動物細胞発現のための配置を有し、ウイルス由来であり得る。哺乳動物発現に適した核酸構築物の多数の例が当分野において既知であり、下記の実施例セクションはいくつかのそのような構築物のさらなる詳細を提供する。
【００６１】
この明細書及び添付の特許請求の範囲の目的のため、「目的の配列」という語句は、ＲＮＡポリメラーゼによって転写される能力を有する任意のポリヌクレオチド配列をさす。この定義には、ポリペプチドへと翻訳可能なコーディング配列のみならず、翻訳を受ける運命にないアンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡと結合するＲＮＡ、リボザイム、及びその他の分子モエティのための配列も含まれる。本発明に係る構築物によって使用されうる目的の核酸配列の例は、以下、及び下記の実施例セクションにおいて提供される。
【００６２】
下記の実施例は、本発明の改良された内皮細胞特異的プロモーターが、全身インビボ投与の後に、レポーター遺伝子の発現を内皮組織へと確実に差し向けることができることを例示する。これらの実施例は、さらに、初めて、本発明の単離されたポリヌクレオチドが、アテローム性動脈硬化組織及び／又は血管形成性組織において優先的にレポータータンパク質（ＧＦＰ）を発現させるために使用されうることを示しており、従って治療適用におけるＰＰＥ−１エンハンサー因子及びその誘導体の重要性に関する直接証拠を初めて提供する。
【００６３】
ＧＦＰのようなレポータータンパク質の使用は、特に動物モデルにおける、転移腫瘍増殖の初期段階の検出における、又は転移の非侵入的画像法（Ｙａｎｇ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．ｏｆ Ｓｃｉ．（２００１）２７：２６１６−２６２１）のための有用性を有しているかもしれないが、そのような使用は、特許請求の範囲に記載された発明の企図された有用性の極く一部にすぎない。例えば、ＡｄＰＰＥ−１ＧＦＰは、比較的非侵入的な方法によって血管形成を追跡し治療するため、ＡｄＰＰＥ１ｔｋ、ＡｄＰＰＥ−１ｐ５５、及び／又はその他の抗血管形成治療と組み合わせて使用されうると考えられる。
【００６４】
例えばＡｄＰＰＥ−１−３Ｘ−ｐ５５の構築物におけるＧＦＰレポーター遺伝子のアポトーシス誘導因子（例えば、ｐ５５；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７５８６６）への置換は、増殖中の腫瘍の血管形成性血管内の急速に増殖中の内皮細胞へとアポトーシスを確実にターゲティングすると予測される。そのようなベクターは全身投与されうるため、それは、病巣の位置を発見することなく、発達中の転移病巣においてアポトーシスを効率的に誘導するために利用されうる。そのような使用は、先行技術の実務と比較すると有意な改良である。発達中の血管系において特異的にアポトーシスを誘導することにより、血管形成を排除することが実施可能である。
【００６５】
反対のアプローチは、例えば、アテローム性動脈硬化患者において、又は疾患もしくは外傷の結果として末梢循環系の有意な障害を被った患者において、組織の血管を再生させるために使用されうる。この場合、ＡｄＰＰＥ−１−３Ｘ−ＧＦ型（ここで、ＧＦは増殖因子（例えば、サイトカイン）である）の構築物、又はその修飾型（例えば、ＡｄＰＰＥ−１−配列番号：７−ＧＦ）が、利用されうる。このような情況において使用するのに適した増殖因子には、これらに制限はされないが、ＶＥＧＦ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ９５２００）及びラットＰＤＧＦ−ＢＢ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号；ｍｕｓ−ＡＦ１６２７８４と９９％同一）、及びＥＧＲ−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ２２３２６）、ＦＧＦ（これらに制限はされないが、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ００３３０６を含む）、並びにそれらの組み合わせが含まれる。
【００６６】
さらに虚血組織への発現選択性を増強し、それにより選択された組織の血管を再生させるため、本発明のプロモーター配列への低酸素応答因子（例えば、配列番号：５）の組み込みが使用されうることが認識されよう。血液供給が改良されるにつれ、虚血が軽減され、低酸素応答因子が誘導されないようになり、ＧＦレベルが低下し、そして血管再生過程が停止する。
【００６７】
本発明の教示に従い作成されたプロモーター配列は、組織における血管形成の制御において特に有用である。下記の実施例セクションにおいて例示されるように、本発明の修飾型３Ｘ（配列番号：７）含有プロモーター配列及び未修飾型ＰＰＥ−１プロモーターは、いずれも、ＬＬＣモデルの転移巣において発現される。しかしながら、実施例２２は、修飾型３Ｘ配列が、正常肺におけるレポーター遺伝子の発現レベルの減少、及び転移巣におけるレポーター遺伝子の発現の劇的な増加の両方を特異的に担っていることを明白に例示している。そのような結果が達成されうることの暗示又は示唆は、先行技術には存在しない。従って、遺伝子治療情況における３Ｘ因子を含む構築物の使用は、周囲の正常組織に対する毒性効果を最小限に抑えつつ、腫瘍への送達を最大限に増加させると予想されうる。重要なこととして、図３７において例示されるように、周囲の組織が内皮成分を含有している場合であっても、このことは当てはまる。その理由は、実施例１１において証明されるように、３Ｘ配列が、ＰＰＥ−１プロモーターとの関連においてでも、急速に増殖中の内皮組織における発現レベルを大きく増加させるためである。
【００６８】
例えば、ｐ５５遺伝子は、増殖中の腫瘍において特異的にアポトーシスを誘導するために、低酸素応答因子を含有している本発明のプロモーターと併せて使用されうる。腫瘍増殖がしばしば周囲の組織の血管形成能を超えるため、増殖中の腫瘍塊は虚血へと向かっていることから、そのような戦略は実施可能であると考えられる。腫瘍塊を特異的に縮小させるために本発明のプロモーター配列と共に使用されうるその他の発現可能細胞毒には、これらに制限はされないが、その他のアポトーシス促進性遺伝子、ヘルペス単純チミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡより入手可能なｐＯＲＦ−ＨＳＶ１ｔｋ発現ベクターに含まれている）、アンジオスタチン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０５１９９）、エンドスタチン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ３３２７２）、及びアンジオスタチン−エンドスタチンキメラ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カルフォルニア州、より入手可能なｐＯＲＦ−ＨＳＶ１ｔｋ発現ベクターに含まれている）が含まれる。
【００６９】
別法として、又はさらに、アンジオスタチン遺伝子又はエンドスタチン遺伝子は、アポトーシスを誘導することなく、特異的に血管形成を阻止するために、本発明のプロモーターと併せて使用されうる。
【００７０】
従って、別の好ましい実施態様によると、血管形成は刺激又は阻止されうる。この柔軟性は、これらに制限はされないが、腫瘍塊の縮小、及び心臓のアテローム性動脈硬化領域の血管再生、又は血液供給が不充分な末梢組織の新血管新生を含む、本発明の多様な用途を可能にするであろう。一つの関連した臨床的シナリオは、糖尿病患者の四肢への血液供給を増加させるための新たな血管を生成させるための、本発明に係るプロモーターの使用である。
【００７１】
本発明に係る核酸構築物は、そのまま対象（哺乳動物、好ましくはヒト）へと投与されてもよいし、又は適当な担体もしくは賦形剤と混合された薬学的組成物として投与されてもよい。
【００７２】
本明細書において使用されるように、「薬学的組成物」とは、本明細書に記載された活性成分１個以上の、生理学的に適当な担体及び賦形剤のような他の化学成分との調製物をさす。薬学的組成物の目的は、化合物の生物への投与を容易にすることである。
【００７３】
本明細書において、「活性成分」という用語は、生物学的効果を担う核酸構築物をさす。
【００７４】
以後、交換可能に使用されうる「生理学的に許容される担体」及び「薬学的に許容される担体」という語句は、生物に対する有意な刺激を引き起こさず、かつ投与された化合物の生物学的活性及び特性を消滅させない担体又は希釈剤をさす。補助剤は、これらの語句に含まれる。
【００７５】
本明細書において、「賦形剤」という用語は、活性成分の投与をさらに容易にするために薬学的組成物に添加される不活性物質をさす。賦形剤の例には、これらに制限はされないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖及び型のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、並びにポリエチレングリコールが含まれる。
【００７６】
薬物の製剤化及び投与のための技術は、参照により本明細書に組み込まれる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ペンシルベニア州、の最新版に見出されうる。
【００７７】
本発明の薬学的組成物は、当分野において周知の工程、例えば従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作成、粉砕、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥の工程によって製造されうる。
【００７８】
本発明に係る使用のための薬学的組成物は、活性成分の薬学的に使用されうる調製物への加工を容易にする賦形剤及び補助剤を含む１個以上の生理学的に許容される担体を使用して、従来の様式で製剤化されうる。妥当な製剤化は、選択された投与経路に依存する。
【００７９】
注射の場合、薬学的組成物の活性成分は、水性溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理学的塩緩衝液のような生理学的に適合性の緩衝液の中に製剤化されうる。経粘膜投与の場合、浸透化すべき関門にとって適切な浸透剤が、製剤化において使用される。そのような浸透剤は、当分野において一般的に既知である。
【００８０】
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、内皮系列の真核細胞における転写を促進又は増強する能力に基づき単離されたことが、認識されるであろう。従って、特許請求の範囲に記載された単離されたポリヌクレオチドにより形質転換された哺乳動物細胞は、本発明の付加的な実施態様である。そのような形質転換細胞の多数の例が、本明細書中の下記実施例において提供される。
【００８１】
下記の実施例は、特に、ＰＰＥ−１プロモーターと併せた３Ｘ配列の使用を取り扱っているが、本発明のエンハンサー配列は、その他の真核生物プロモーター配列と共に使用された場合にも、その細胞特異的効果を発揮するであろうことが期待される。
【００８２】
そのような期待は、エンハンサー因子が、しばしば、ポータブルである、即ちあるプロモーター配列から、もう一つの無関係のプロモーター配列へと移動させても、活性を維持しうることを示す先行技術の所見に基づく。例えば、Ｄ．ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．（１９９５）１７１（１）：６０−７２；Ｎ．Ｓ．ユー（Ｙｅｗ）ら（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００１）４：７５−８２０）、及びＬ．ウー（Ｗｕ）ら（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００１）８；１４１６−２６）を参照のこと。実際、ブー（Ｂｕ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２（１９）：３２６１３−３２６２２）の初期の研究は、本発明のエンハンサーと関係のあるエンハンサー因子、例えば配列番号：６を含むエンハンサーが、構成性プロモーター、例えばＳＶ−４０プロモーターと共に使用されうることを強く示唆している。従って、本発明のエンハンサー配列が含まれるよう修飾された真核生物プロモーターを含有している構築物、そのプロモーターの利用法、及びそのプロモーターを含む単離されたポリヌクレオチドは、十分に、特許請求の範囲に記載された発明の範囲内に含まれる。
【００８３】
従って、本発明に係るエンハンサー因子の最小の配置は、配列番号：８に示されるような単離されたポリヌクレオチドであると推測される。このエンハンサーは、これらに制限はされないが、内皮特異的プロモーター（例えば、ＰＰＥ−１；配列番号：１）及び構成性プロモーター、例えば、ＣＭＶ及びＳＶ−４０に由来するもののようなウイルスプロモーターを含む、極めて多様なプロモーターと共に機能すると期待される。このエンハンサーは、極めて多様なプロモーターに内皮特異性を付与することができるはずである。エンハンサー因子は、例えば配列番号：６に示された配列１コピー以上の付加によって強化されうる。これらの付加配列は、配列番号：８の配列と近接して、又は近接せずに付加されうる。
【００８４】
本発明は、目的の配列の高レベル発現を内皮細胞へと特異的に差し向けるために、配列番号：８に示された配列少なくとも１コピーを含むエンハンサー因子及びプロモーターに頼る構築物を利用して、目的の核酸配列を内皮細胞において発現させる方法をさらに含む。
【００８５】
本明細書において使用されるように、「対象の身体から摘出された細胞へのエクスビボ投与、及びその後の対象の身体への細胞の再導入」には特に、（Ｌｙｄｅｎら、（２００１） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７：１１９４−１２０１）に記載されたような幹細胞の使用が含まれる。
【００８６】
下記の実施例に記載された実験においてはアデノウイルスが使用されているが、本発明の構築物は、当業者によってその他のウイルス送達系へと容易に適合化されうる。
【００８７】
本発明のさらなる目的、利点、及び新規な特徴は、制限を目的とするものではない以下の実施例を検討することにより、当業者に明らかになるであろう。さらに、上記において概説され、下記の特許請求の範囲のセクションに記載されたような本発明の様々な実施態様及び面は、各々、以下の実施例において実験的に支持される。
【００８８】
実施例
以下、前記の記載と共に非制限的に本発明を例示する実施例が、参照される。
【００８９】
一般的に、本明細書において使用された命名法、及び本発明において活用された実験手法には、分子的技術、生化学的技術、微生物学的技術、及び組換えＤＮＡ技術が含まれる。そのような技術は、文献に徹底的に説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” 第Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら編 “Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ”，第１〜４巻，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４６６６８２８号；第４６８３２０２号；第４８０１５３１号；第５１９２６５９号、及び第５２７２０５７号に示された方法論；“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，第Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”第Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら（編），“Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（第８版），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，コネチカット州（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ及びＳｈｉｉｇｉ（編），“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照のこと。利用可能なイムノアッセイは、特許及び科学文献に広範に記載されており、例えば、米国特許第３７９１９３２号；第３８３９１５３号；第３８５０７５２号；第３８５０５７８号；第３８５３９８７号；第３８６７５１７号；第３８７９２６２号；第３９０１６５４号；第３９３５０７４号；第３９８４５３３号；第３９９６３４５号；第４０３４０７４号；第４０９８８７６号；第４８７９２１９号；第５０１１７７１号、及び第５２８１５２１号；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）及び“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”第１〜３１７巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照のこと（これらは全て、本明細書に完全に示されているかのごとく参照により組み込まれる）。その他の一般的な参照が、この書類のいたるところに提供されている。それらに含まれる手法は、当分野において周知であると考えられ、読者の便利のために提供されている。それらに含まれている情報は全て、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９０】
特に、下記の実施例と併せて行われた実験は、以下の方法及び材料を利用した。
【００９１】
材料及び方法
細胞培養
ルイス肺癌（Ｄ１２２−９６）細胞（Ｐｒｏｆ．Ｌ．Ｅｉｓｅｎｂａｃｈ，Ｔｈｅ Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル、により譲り受けた）、ヒト胎児腎細胞（２９３）、及びＨｅＬａ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び２ｍＭグルタミンが補足された４．５ｇｒ／ｌ ＤＭＥＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）の中で増殖させた。ウシ大動脈内皮細胞ＢＡＥＣ（Ｐｒｏｆ．Ｎ．Ｓａｖｉｏｎ，Ｇｏｌｄｓｈｌａｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｈｅｂａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｅｌ−Ｈａｓｈｏｍｅｒ、イスラエル、より譲り受けた）、正常皮膚繊維芽細胞ＮＳＦ、ＨｅｐＧ２、及びヒト内皮臍内皮細胞ＨＵＶＥＣ−３０４（ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）は、５％ＦＣＳ、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び２ｍＭグルタミンが補足された１．０ｇｒ／ｌ ＤＭＥＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）の中で増殖させた。ＢＡＥＣ細胞には、完全繊維芽細胞増殖因子（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ．ミズーリ州）を補足した。ＲＩＮｒ１０４６−３８（ＲＩＮ−３８）は、５％ＦＣＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び２ｍＭグルタミンが補足された１９９アール（Ｅａｒｌｅ’ｓ）塩（５．５ｍＭグルコース）培地の中で増殖させた。
【００９２】
「ＨｅｐＧ２」とは、本明細書において使用されるように、ＡＴＣＣ−ＨＢ−８０６５をさす。
【００９３】
「ＨｅＬａ」とは、本明細書において使用されるように、ＡＴＣＣ−ＣＣＬ−２をさす。
【００９４】
「ヒト気管支上皮細胞」及び「Ｂ２Ｂ」とは、本明細書において使用されるように、ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−９６０９をさす。
【００９５】
「ＨＵＶＥＣ」及び「ヒト臍静脈内皮細胞」とは、本明細書において使用されるように、ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１７３０をさす。
【００９６】
「ＣＨＯ」及び「チャイニーズハムスター卵巣」とは、本明細書において使用されるように、ＡＴＣＣ−６１をさす。
【００９７】
低酸素誘導
トランスフェクション又は形質導入の後２６時間目に、０．５％Ｏ_２、５％ＣＯ_２、残部はＮ_２、を含有している気流により３０分間洗浄された隔離されたチャンバーの中で、細胞をインキュベートした。隔離されたチャンバーを、５％ＣＯ_２、３７℃の湿潤インキュベーター内に置いた。
【００９８】
細胞び組織におけるルシフェラーゼ活性
インビトロ及びインビボで定量的にＰＰＥ−１プロモーター活性をアッセイするため、ルシフェラーゼ遺伝子発現系キットを利用した（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）。トランスフェクション又は形質導入の後４８時間目に、細胞を洗浄し、２００μｌの溶解緩衝液を１５分間添加した。細胞溶解物を収集し、４℃で１５分間（１４，０００ｒｐｍ）遠心分離した。その後、上清１０μｌを、５０μｌのルシフェラーゼアッセイ緩衝液に添加した。活性は、２０秒間、照度計で測定した。
【００９９】
固形組織におけるルシフェラーゼ活性をアッセイするためには、２０ｍｇの試料を切除し、ホモジナイゼーション溶液１ｍｌでホモジナイズし、４℃で１５分間（１４，０００ｒｐｍ）遠心分離し、上清１０ｍｌを、前記と同様に、ルシフェラーゼ活性に関してアッセイした。結果は、タンパク質１μｇ当たりのルシフェラーゼ光単位として表される。タンパク質は、標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いたブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイを使用して測定した。
【０１００】
インビトロ及びインビボのＧＦＰ活性
インビトロでＧＦＰ発現を試験するため、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、新鮮に作成された４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで３０分間固定した。固定後、蛍光顕微鏡検による調査を達成した。
【０１０１】
インビボ送達された遺伝子の細胞分布を試験するため、新鮮に作成された４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸緩衝液で、４℃で６時間、組織を固定し、４℃で３０％ショ糖に一夜浸漬し、そしてＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ，ＵＳＡ）で凍結させた。低温槽により組織ブロックを１０μｍの厚さに切断し、蛍光顕微鏡検（ＦＩＴＣフィルタ）の下で直接観察した。
【０１０２】
増殖細胞及び休止細胞
増殖ＢＡＥＣ及び休止ＢＡＥＣにおけるＰＰＥ−１プロモーター活性を比較するため、１．１０％ＦＣＳ培地中で増殖させ感染させる増殖細胞と、２．形質導入前７２時間以内に開始した無血清培地中で増殖させ感染させる休止細胞という二つの群に、細胞を分割した。細胞は、全て、５％ＣＯ_２、３７℃の湿潤インキュベーター内で増殖させた。
【０１０３】
組換え複製欠損アデノウイルスの調製
いくつかの組換え複製欠損アデノウイルス（５型）を構築した。ルシフェラーゼ遺伝子（ｐＧＬ２−ｂａｓｉｃ ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６５３２３に由来）及びＳＶ４０ポリＡ部位（ｐＧＬ２−ｂａｓｉｃ ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６５３２３に由来）の上流に置かれたマウスプレプロエンドセリン−１（ＰＰＥ−１）プロモーター（配列番号：１）を含む発現カセットを、ｐＰＡＣ．ｐｌｐＡ（プロモーターを含まない構築物）のＢａｍＨＩ制限部位へとライゲートさせた。ＧＦＰ遺伝子（ｐＥＧＦＰ，ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ０２５７２に由来）は、ＮｏｔＩ制限部位でＰＰＥ−１プロモーターとライゲートさせた。Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ又はＡｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰと名付けられた複製欠損組換えアデノウイルスは、ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ），Ｔ．Ｃ．ら（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌ．４３，Ｒｏｔｈ Ｍ．（編）．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９４，１６１〜１８９頁）によって記載されたようにして、ｐＰＡＣＰＰＥ−１Ｌｕｃ又はＡｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰをアデノウイルスプラスミドｐＪＭ１７と共トランスフェクトした後、組換えビリオンを採集することによって調製した。
【０１０４】
ウイルスを、大規模作製のために調製した。ウイルスストックは、１０^９〜１０^１２プラーク形成単位／ｍｌ（ｐｆｕ／ｍｌ）という濃度で４℃で保存した。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ４７１１９）を含有しているウイルスＡｄ５ＣＭＶ−Ｌｕｃ（ＵＴＳｗ Ｄａｌｌａｓ，ＴｅｘａｓのＲ．Ｇｅｒａｒｄより譲り受けた）及びＡｄ５ＣＭＶ−ＧＦＰ（Ｑｕａｎｔｕｍ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，カナダ）を、ＰＰＥ−１ウイルスベクターに関して記載されたようにして大規模調製のため調製し、非組織特異的対照として使用した。
【０１０５】
ＰＰＥプロモーターの修飾
修飾型マウスＰＰＥ−１プロモーターは、Ｂｕら（Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２（１９）：３２６１３−３２６２２）によって発見された正の転写因子３コピーを、４３塩基対の内因性の正の因子（−３６４〜−３２０ｂｐ）の下流（−２８６ｂｐ）に置かれたＮｈｅＩ制限酵素部位へ挿入することにより開発した。
【０１０６】
本明細書において「３Ｘ」と名付けられたエンハンサー断片は、マウスＰＰＥ−１プロモーター内に存在する内因性配列因子（ヌクレオチドは、配列番号：１の４０７〜４５２に相当）のトリプリケートコピーである。血管内皮細胞におけるＰＰＥ−１プロモーター活性の誘導は、この因子の存在に依存することが以前に示された。Ｂｕら（Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２（１９）：３２６１３−３２６２２）。３Ｘ断片は、９６塩基対長の２個の相補的な一本鎖ＤＮＡ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；Ｎｅｓ Ｔｚｉｏｎａ，イスラエル）（配列番号：２及び３）を使用することにより合成した。２個の一本鎖ＤＮＡ断片をアニーリングさせ、クレノウフラグメント（ＮＥＢ）を使用して隙間を埋めた。得られた二本鎖ＤＮＡは、１４５塩基対長であり、Ｎｈｅ−１制限部位（配列番号：４）を含んでいた。
【０１０７】
３Ｘ断片を、Ｔ４リガーゼを使用して、内因性Ｎｈｅ−１部位の下流のマウスＰＰＥ−１プロモーターへとライゲートさせた。得られた構築物をＤＨ５αコンピテント細胞において繁殖させ、大規模なプラスミド調製物をマキシプレップキアゲン（ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ Ｑｉａｇｅｎｅ）キットを使用して作製した。
【０１０８】
付加的なプラスミド
野生型ＰＰＥ−１プロモーター
１．４ｋｂのマウスプレプロエンドセリン−１（ＰＰＥ−１）プロモーター、ＳＶ４０ポリＡシグナル（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６５３２３）部位を含むルシフェラーゼ遺伝子、及びマウスＥＴ−１遺伝子の第１イントロンを含有しているＰＰＥ−１−ルシフェラーゼカセット（５２４９ｂｐ）は、ハラッツ（Ｈａｒａｔｓ）ら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ．（１９９５）９５：１３３５−１３４４）により使用されたｐＥＬ８プラスミド（８８４８ｂｐ）に由来する。ＰＰＥ−１−ルシフェラーゼカセットは、ＢａｍＨＩ制限酵素を用いてｐＥＬ８プラスミドから抽出し、引き続き、抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を使用して１％アガロースゲルからＤＮＡ断片の抽出をした。
【０１０９】
プロモーターを含まないｐＰＡＣ．ｐｌｐＡプラスミド
アデノウイルス５型の配列を含有しているプロモーターを含まないｐＰＡＣ．ｐｌｐＡプラスミド（７５９４ｂｐ）は、ｐＰＡＣＣＭＶ．ｐＬｐＡ（８８００ｂｐ）に由来した。ＣＭＶプロモーター、マルチプルクローニング部位、及びＳＶ４０ポリアデニル化部位（１２０６ｂｐ）を、ＮｏｔＩ制限酵素によって排除し、断片化されたＤＮＡを、１％アガロースゲルから抽出した。直鎖状プラスミド（７５９４ｂｐ）を、クレノウ断片によって平滑末端化し、ラピッドＤＮＡライゲーションキットによってＢａｍＨＩリンカーを両付着末端へとライゲートさせた。直鎖状プラスミドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって再ライゲートさせ、ＢａｍＨ１制限部位を含むｐＰＡＣ．ｐｌｐＡを増幅するため、ＤＨ５αコンピテント細胞へと形質転換した。プラスミドを大規模調製のため調製し、マキシプレップＤＮＡ精製キットによって精製した。
【０１１０】
ｐＰＡＣＰＰＥ−１ルシフェラーゼプラスミド
ｐＰＡＣＰＰＥ−１ルシフェラーゼプラスミドは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用することにより、ｐＰＡＣ．ｐｌｐＡプラスミドのＢａｍＨＩ制限部位に、ＰＰＥ−１−ルシフェラーゼカセットを挿入することにより構築した。その後、プラスミドを、ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換するために使用した。プラスミド（１２８４３ｂｐ）を大規模調製のため調製し、マキシプレップＤＮＡ精製キットによって精製した。
【０１１１】
ｐＰＡＣＰＰＥ−１ＧＦＰプラスミド
ｐＰＡＣＰＰＥ−１ＧＦＰプラスミドは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって、ＰＰＥ−１プロモーターの下流のＧＦＰ遺伝子（ｐＥＧＦＰ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ０２５７２）を、ＮｏｔＩ制限部位へサブクローニングすることにより構築した。
【０１１２】
その後、プラスミドを、ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換するために使用した。プラスミド（１１，８０１ｂｐ）を大規模調製のために調製し、マキシプレップＤＮＡ精製キットによって精製した。
【０１１３】
ｐＡＣＰＰＥ−１３Ｘルシフェラーゼプラスミド及びｐＡＣＰＰＥ−１３ＸＧＦＰプラスミド
ｐＰＡＣＰＰＥ−１−３Ｘルシフェラーゼ及びｐＰＡＣＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰは、ｐＰＡＣ．ｐｌｐＡプラスミドのＢａｍＨＩ制限部位に、Ｌｕｃ又はＧＦＰを含有しているｐＥＬ８−３Ｘ（図２６Ｂ）からＢａｍＨＩ制限酵素によって消化されたＰＰＥ−１−３ＸＬｕｃカセット又はＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰカセットを挿入することにより構築した。ｐＥＬ８−３Ｘは、２個のＮｈｅＩ部位間に置かれた（配列番号：７に示されているような）トリプリケート内皮特異的エンハンサー３Ｘを含有している、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩとの間に置かれた修飾型マウスＰＰＥ−１プロモーター（１．５５ｋｂ）（赤）を含有している。プロモーター、ルシフェラーゼ遺伝子又はＧＦＰ遺伝子、ＳＶ４０ポリＡ部位、及びエンドセリン−１遺伝子の第１イントロン（全部でＰＰＥ−１修飾型プロモーターカセットと名付けた）を、材料及び方法に記載されたようにして、ＢａｍＨＩ制限酵素によって消化し抽出した。プラスミド（１２８４３ｂｐ）を大規模調製のために調製し、マキシプレップＤＮＡ精製キットによって精製した。
【０１１４】
インビトロ実験、ＤＮＡ形質導入
形質導入の２４時間前に、細胞を１６ｍｍディッシュに播いた。ＢＡＥＣ細胞（ウシ大動脈内皮細胞）、ＨＵＶＥＣ細胞（ヒト臍静脈内皮細胞）、ＬＬＣ細胞（ルイス肺癌）、及びＲＩＮ細胞（ラット膵島細胞腺腫）、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｅＬａ細胞、及び正常皮膚繊維芽細胞（ＮＳＦ）のＤＮＡ形質導入は、各細胞系を、全容量５００μｌの増殖培地で４時間、感染多重度（ｍｏｉ）１、５、及び１０のＡｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃと共にインキュベートした後、全容量２ｍｌの増殖培地と共に４８時間インキュベートすることによって達成した。Ａｄ５ＣＭＶＬｕｃを、非組織特異的対照として使用した。
【０１１５】
動物
動物手法は、全て、Ｓｈｅｂａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｅｌ−Ｈａｓｈｏｍｅｒの「Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ」によって承認された。
【０１１６】
異なるマウス系統を使用した：
（ｉ）雄３ヶ月齢野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈａｒｌａｎ ｆａｒｍｓ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）
（ｉｉ）雄３ヶ月齢ＢＡＬＢ／Ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ ｆａｒｍｓ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）
（ｉｉｉ）雄及び雌の６ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６ｘＳＪ１２９マウスのＡｐｏＥ遺伝子欠損マウスハイブリッド（Ｐｌｕｍｐ ＡＳ．ら、Ｃｅｌｌ（１９９１）７１：３４３−３５３）
（ｉｖ）ハラッツ（Ｈａｒａｔｓ）ら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ．（１９９５）９５：１３３５−１３４４）によって作成された、マウスＰＰＥ−１プロモーター（５．９Ｋｂ）の調節下でルシフェラーゼ遺伝子を過剰発現している雄及び雌の３ヶ月齢
【０１１７】
マウスは、全て、Ｌｉｐｉｄｓ ａｎｄ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいて飼育した。
【０１１８】
正常マウスにおける組織遺伝子発現
効率及び組織特異性をアッセイするため、１０^１０ｐｆｕ／ｍｌのＡｄ５ＰＰＥ１Ｌｕｃ又はＡｄ５ＣＭＶＬｕｃ（非組織特異的対照として）を、１００μｌの生理食塩水に懸濁させ、前記のようなマウスの尾静脈へと注射した。ルシフェラーゼ活性は、注射後１日目、５日目、１４日目、３０日目、及び９０日目にアッセイした。発現されたレポーター遺伝子の細胞分布を決定するため、Ａｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰ又はＡｄ５ＣＭＶＧＦＰ（１０^１０ｐｆｕ／ｍｌを含む１００μｌ生理食塩水）を、正常な３ヶ月齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈へと注射した。ＧＦＰ発現を、注射後５日目に検出した。マウスは、全て、外見上健康であり、毒性又は炎症は、肝臓又はその他の組織において認められなかった。
【０１１９】
組織におけるＧＦＰ活性
インビボ送達された遺伝子の細胞分布を試験するため、注射されたマウスからの組織試料を、４℃で６時間、新鮮に作成された４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸緩衝液で固定し、４℃で３０％ショ糖に一夜浸漬し、そしてＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ、カルフォルニア州、ＵＳＡ）で凍結させた。組織ブロックを１０μｍの厚さに切断し、蛍光顕微鏡検（ＦＩＴＣフィルタ）の下で直接観察した。
【０１２０】
腫瘍移植
ルイス肺癌細胞（ＬＬＣ）を、トリプシン／ＥＤＴＡで採集し、ＰＢＳで３回洗浄し、そして生存率を評価するために０．１％トリパンブルー（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）で計数した。マウスにおける腫瘍血管形成におけるＰＰＥ−１プロモーター活性の活性レベルを試験するため、２つの異なる腫瘍モデルを使用した。
【０１２１】
原発腫瘍モデルにおいては、細胞（１×１０^６個／ｍｌを含む生理食塩水１００μｌ）をマウスの背部に皮下注射した（ｎ＝１７）。注射後２１日目に、Ａｄ５ＰＰＥ−１、Ａｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰ、Ａｄ５ＣＭＶ、又はＡｄ５ＣＭＶＧＦＰ（１０^１０ｐｆｕ／ｍｌ）を腫瘍組織（ＩＴ）に注射するか、又は静脈注射し、前記のようにして、それらの活性を検出した。
【０１２２】
転移腫瘍モデルにおいては、細胞（５Ｘ１０^５個／ｍｌを含む生理食塩水５０μｌ）をマウス足蹠に注射した（ｎ＝１２）。腫瘍組織が直径０．７ｍｍのサイズに達した時点で、（原発腫瘍を有する）足蹠を麻酔及び無菌の条件下で摘除した。術後１４日目に、ウイルス（Ａｄ５ＰＰＥ−１、Ａｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰ、Ａｄ５ＣＭＶＬｕｃ、又はＡｄ５ＣＭＶＧＦＰ）をマウス尾静脈へと注射した。
【０１２３】
いずれの腫瘍実験モデルにおいても、ウイルス注射後５日目にマウスを屠殺し、組織を切除し、ルシフェラーゼ又はＧＦＰの活性に関して試験した。
【０１２４】
創傷治癒モデル
雄３ヶ月齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ナトリウムペントバルビタール（６ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射によって麻酔を施した。それらの背部の毛をそり、直線的に５ｃｍ切開した。その切開を、４／０無菌絹糸によって即座に縫合した。治癒中の創傷における血管形成過程を、２日毎に、Ｈ＆Ｅ染色及び抗フォン−ウィルブランド（ｖｏｎ−Ｗｉｌｌｉｂｒａｎｄ）抗体免疫組織化学的染色によって調査した。
【０１２５】
切開後１０日目に、１０^１０ｐｆｕ／ｍｌのＡｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ又はＡｄ５ＣＭＶＬｕｃを尾静脈へと全身注射した。注射後５日目に、マウスを屠殺し、切開部位の皮膚、及び対照としての正常な対側部位において、前記のようにしてルシフェラーゼ活性をアッセイした。
【０１２６】
組織学的調査
腫瘍及び転移組織における血管形成の程度を評価するため、組織を５μｍの切片へと切断し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。抗ＣＤ３１（ラット抗マウスＣＤ３１モノクローナルＡｂ、Ｐｈａｒｍｉｎｏｇｅｎ，ニュージャージー州、ＵＳＡ）抗体を、腫瘍モデルにおける血管再生の分析のために使用した。
【０１２７】
統計分析
統計的有意差に関する群間の分析は、ｔ検定ＡＮＯＶＡ又はマン−ホイトニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）順位検定の使用により達成した。データは、平均＋ＳＥとして示される。
【０１２８】
実施例１
インビトロの３Ｘ−ＰＰＥ−１プラスミド活性の分析
ＰＰＥ−１−３Ｘの活性を分析するため、ＰＰＥ−１−３Ｘプロモータープラスミド及び未修飾ＰＰＥ−１プロモータープラスミドにおけるレポーター遺伝子発現の比較を行った。ＰＰＥ−１−３Ｘ断片又は未修飾ＰＰＥ−１断片のいずれかと、レポーター遺伝子ルシフェラーゼとを含有しているレポーター遺伝子プラスミドを、内皮細胞系及び非内皮細胞系、並びにＰＰＥ−１プロモーターを発現している気管支上皮細胞系（Ｂ２Ｂ）へとトランスフェクトした（前記の材料及び方法を参照のこと）。Ｂ２Ｂ細胞系は、ＰＰＥ−１プロモーターと比して非内皮細胞系における発現を低下させる３Ｘ因子の能力の指標を提供するために選択された。トランスフェクションは、リポフェクタミン（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）を使用して達成した。容認された分子生物学実務に従い、βｇａｌ−ｎｅｏプラスミドを、それぞれの場合におけるトランスフェクション効率の指標として利用した。
【０１２９】
トランスフェクション後４８時間目に、細胞を溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州）を使用して採集し、ルシフェラーゼ活性を、照度計（ＴＤ−２０ｅ−Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって分析した。異なる形質転換効率を規準化するため、平行してβｇａｌ活性を分析した。結果は、図１及び表１に要約されている。ＰＰＥ−３Ｘの調節下でのルシフェラーゼ活性は、未修飾ＰＰＥ−１の調節下でのルシフェラーゼ活性より１５〜２０倍高い。非内皮細胞系においては、ＰＰＥ−１を使用した場合にも、ＰＰＥ−１−３Ｘを使用した場合にも、最小の発現が検出された。これは、ＰＰＥ−３Ｘが、インビボでの内皮細胞への特異的な遺伝子送達のための有望な候補であることを証明している。
【表１】

【０１３０】
実施例２
インビトロのＡｄ５ＰＰＥ−１／ルシフェラーゼの活性及び特異性
ＰＰＥ−１／ルシフェラーゼ、ＰＰＥ−１−３Ｘ／ルシフェラーゼ、ＰＰＥ−１／ＧＦＰ、及びＰＰＥ−１−３Ｘ／ＧＦＰも、Ａｄ５プラスミドとライゲートさせ、Ａｄ５ＰＰＥ−１／Ｌｕｃ及びＡｄ５ＰＰＥ−１−３Ｘ／Ｌｕｃ、Ａｄ５ＰＰＥ−１／ＧＦＰ及びＡｄ５ＰＰＥ−１−３Ｘ／ＧＦＰを作製した（Ｖａｒｄａ−Ｂｌｏｏｍ ら、（２００１）Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ８：８１９−８２７）。これらの構築物を、以下に詳述されるようにして別々にアッセイした。
【０１３１】
Ａｄ５ＰＰＥ−１／Ｌｕｃの活性を試験するため、Ｂ２Ｂ（ヒト気管支上皮）、ＢＡＥＣ（ウシ大動脈内皮細胞）、及びＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮細胞）のトランスフェクションを行った。これらの３個の細胞系は、エンドセリン遺伝子を発現しており、試験された構築物の内皮細胞における発現のレベルを示すために選択された。エンドセリン遺伝子を発現していないＲＩＮ（ラット膵島細胞腺腫）細胞系を、陰性対照として利用し、同じ構築物によりトランスフェクトした。Ａｄ５ＣＭＶＬｕｃ（ＣＭＶプロモーターの調節下のルシフェラーゼ）を、全ての細胞系において非内皮特異的対照として使用した。
【０１３２】
図２は、内皮細胞系ＢＡＥＣ及びＨＵＶＥＣにおいては、ＣＭＶプロモーターより高いルシフェラーゼ発現が、ＰＰＥ−１プロモーターによって達成されたことを明白に例示している。内皮由来でないＲＩＮ細胞においては、ＣＭＶプロモーターの方がＰＰＥ−１プロモーターより多くのルシフェラーゼ活性を生成させた。これらの結果は、未修飾ＰＰＥ−１プロモーターの内皮特異性を証明している。
【０１３３】
実施例３
Ａｄ５ＰＰＥ−３ＸＬｕｃ及びＡｄ５ＰＰＥ−３ＸＧＦＰの活性及び特異性
特異性及び発現レベルに対する３Ｘ因子の影響を確認するため、Ａｄ５ＰＰＥ−３Ｘ／ルシフェラーゼ構築物及びＡｄ５ＰＰＥ−３Ｘ／ＧＦＰ構築物を、前記実施例２に記載された細胞系をトランスフェクトするために使用した。実施例２と同様に、Ａｄ５ＣＭＶＬｕｃを非内皮特異的対照として使用した。ＣＭＶプロモーターと比較して、より高いＢＡＥＣ細胞系及びＨＵＶＥＣ細胞系におけるルシフェラーゼ発現が、ＰＰＥ−３Ｘプロモーターの調節下で検出された。
【０１３４】
図３Ａは、ＢＡＥＣ細胞系におけるＡｄ５ＰＰＥ−１−３Ｘの調節下でのＧＦＰ発現を例示する顕微鏡写真である。図３Ｂは、ＢＡＥＣ系におけるＡｄ５ＣＭＶのＧＦＰ発現を例示する顕微鏡写真である。これらの図面によって明白に示されるように、ＰＰＥ−１−３Ｘプロモーターの方が、内皮細胞において、より活性が高い。これらの結果は、３Ｘ因子が、ＰＰＥ−１プロモーターの内皮特異性を損なわないことを明白に示している。細胞培養物におけるＰＰＥ−１プロモーター及びＰＰＥ−１−３Ｘプロモーターの相対活性は、下記実施例６において提示される。
【０１３５】
実施例４
ｐ５５遺伝子のアポトーシス促進活性のインビトロアッセイ
Ｐ５５（ＴＮＦＲ１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７５８６６）のＰＡＣＰＰＥ３Ｘ（ＰＰＥ−１−３Ｘプロモーターを含有）及びＰＡＣＣＭＶへのサブクローニングの後、これらのプラスミド及びＧＦＰ（ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター；ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，カリフォルニア州）の共トランスフェクションを、前記と同様にして実施した。簡単に説明すると、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって、ＰＰＥ−１プロモーターの下流（ルシフェラーゼ遺伝子の代わり）のＮｏｔＩ制限部位へと遺伝子をサブクローニングした後、それをＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。トランスフェクション後２４時間目、小さく丸形のアポトーシス細胞が、視覚的に正常細胞から識別可能であった。アポトーシス促進性プラスミドによりトランスフェクトされた細胞の電子顕微鏡検は、典型的なアポトーシスの様相を示し、それにより視覚的評価が確証された。
【０１３６】
ＰＰＥ−１−３Ｘプロモーターの調節下では、内皮細胞においてのみｐ５５によってアポトーシスが誘導されたが（図４）、ＣＭＶプロモーターは細胞特異的活性を示さなかった。ＰＰＥ−１−３Ｘの調節下のルシフェラーゼは、試験された細胞系においてアポトーシスを誘導しなかった。これらの結果は、ＰＰＥ−１−３Ｘプロモーターを利用することによって、内皮細胞において特異的にアポトーシスを誘導することが実行可能であることを示している。
【０１３７】
実施例５
低酸素応答因子（ＨＲＥ）は低酸素感受性内皮細胞における標的遺伝子発現を増強しうる
低酸素は、血管の緊張度及び構造の重要な制御因子である。虚血性心疾患及び癌の両方における血管形成の強力な刺激であることも示されている（Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｇ．Ｌ．ら、（２０００）Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．；４７５：１２３−３０；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｋ．Ｊ．（２００１）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１：３；３２８−３１、及びＳｈｉｍｏ，Ｔ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．１７４；５７−６４）。さらに、低酸素は、エリスロポエチン、ＶＥＧＦ、解糖酵素、及びＥＴ−１を含む多くの遺伝子の発現を制御することが報告されている。これらの遺伝子は、共通の酸素感知経路、低酸素誘導因子（ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ）−１（ＨＩＦ−１）と名付けられた誘導可能転写複合体によって調節される。ＨＩＦ−１複合体は、標的遺伝子のシス作用性低酸素応答因子（ｈｙｐｏｘｉａ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＨＲＥ）と結合することにより、低酸素に対する転写応答を媒介する。ＨＲＥとは、ＶＥＧＦ、一酸化窒素シンターゼ−２、エリスロポエチン、及びエンドセリン−１、ＥＴ−１を含むその他を含む、低酸素に応答する少数の遺伝子のプロモーター内に位置している保存された配列である。ＥＴ−１プロモーターは、転写開始部位の１１８ｂｐ上流の位置に逆位の低酸素応答因子を含有しており、その因子は、７塩基対を含有しており、かつ、ＧＡＴＡ−２と、５’ＧＣＡＣＧＴＴ３’−５０塩基対に位置するＡＰ１部位との間に置かれている。（配列番号：５）。
【０１３８】
プレプロエンドセリン−１（ＰＰＥ−１）プロモーターは、腫瘍組織又は虚血組織の低酸素微小環境において発現を増加させる能力を有する低酸素応答因子（ＨＲＥ）を含有しており、従って「腫瘍組織特異的」かつ／又は「虚血組織特異的」である。このＨＲＥの実際の機能を評価するため、ルシフェラーゼ又はＧＦＰレポーター遺伝子と関連し、かつ、アデノウイルスベクターによって送達されるＰＰＥ−１プロモーター及びＰＰＥ−１−３Ｘプロモーターのアッセイに着手した。
【０１３９】
正常酸素条件及び低酸素条件（０．５％Ｏ２、１６ｈ）の下での、ＰＰＥ−１プロモーター又はＰＰＥ−１−３Ｘプロモーターの調節下でのルシフェラーゼ活性を、ＢＡＥＣ細胞において比較した。ＰＰＥ−１プロモーターの調節下でのルシフェラーゼ活性は、低酸素（図５及び６）に暴露された場合、５倍高くなった。さらに、ＰＰＥ−１−３Ｘプロモーターの調節下でのルシフェラーゼ活性は、低酸素条件下で２．５倍高くなった。要約すると、正常酸素でのＰＰＥ−１−３Ｘ遺伝子による発現レベルは、未修飾ＰＰＥ−１プロモーターで観察されるより高いにも関わらず、ＰＰＥ−１プロモーターへの３Ｘ因子の導入は、低酸素に応答して下流遺伝子の発現レベルをさらに増加させることができる。
【０１４０】
実施例６
内皮細胞系におけるＰＰＥ−１−３Ｘプロモーター及びＰＰＥ−１プロモーターの活性のさらなる評価
図７は、ｐＰＰＥ−１／ルシフェラーゼ及びｐＰＰＥ−１−３Ｘ／ルシフェラーゼを使用したＢ２Ｂ、ＨＵＶＥＣ、及びＢＡＥＣのトランスフェクション実験からの結果を要約したものである。ＰＰＥ−１−３Ｘプロモーターの調節下では、ＰＰＥ−１プロモーターより高いルシフェラーゼ発現（３０倍、８．５倍、及び１．５倍）が、Ｂ２Ｂ、ＨＵＶＥＣ、及びＢＡＥＣにおいてそれぞれ観察された。これらの結果は、前記の結果を確証しており、ＰＰＥ−１−３Ｘが、高レベル発現を内皮細胞へと特異的に差し向けるために極めて好適であることを確立するために役立つ。将来のインビボ送達の情況において、ＰＰＥ−１−３Ｘ構築物により達成されるより高い発現レベルは、より少量のＤＮＡの投与と同義である。これは、次に、特異性をさらに増加させるために役立つであろう。
【０１４１】
実施例７
インビボのＡｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃの効率、特異性、及び安定性
実施例２〜６において観察された発現の内皮特異性が、細胞培養物のアーティファクトではなかったことを確証するため、前記の「正常マウスにおける組織遺伝子発現」に記載されたようにして、Ａｄ５ＰＰＥ−１／ルシフェラーゼ構築物をＣ５７ＢＬ／６マウスへと注射した。インビトロ研究の場合と同様に、Ａｄ５ＣＭＶ／ルシフェラーゼを陰性対照として利用した。
【０１４２】
アデノウイルスベクターの注射後、血管新生組織及び非血管新生組織におけるルシフェラーゼの特異的活性及び安定性をアッセイした。結果は、図８（肝臓における発現と比したルシフェラーゼ発現）及び表２（全身発現に対する比率（％）としてのルシフェラーゼ発現）に要約されている。予想通り、Ａｄ５ＣＭＶ／ルシフェラーゼで処理されたマウスにおいては、ルシフェラーゼ活性の大部分（全身発現の８０％以上）が、肝臓に見出された。ＰＰＥ−１プロモーターによって調節されたルシフェラーゼ活性は、肝臓において比較的低かった（全身発現の３７〜５４％）。大動脈におけるＰＰＥ−１に由来する発現（注射後５日目及び１４日目にそれぞれ全身発現の２３〜３３％）は、Ａｄ５ＣＭＶ／ルシフェラーゼで処理されたマウス（最大で全身発現の１．８％以下；表２）と比較してはるかに高かった。これらの結果は、細胞培養物において観察された内皮特異性を確証している。肝臓が高度に血管新生性の器官であることを想起すべきである。従って、以下に詳述されるように、器官内の細胞発現の調査を行った。
【表２】

【０１４３】
図３０Ａ及び３０Ｂは、１１０匹の注射されたマウスの大動脈（Ａ）及び肝臓（Ｂ）における絶対ルシフェラーゼ活性（光単位／μｇタンパク質）を示している。ルシフェラーゼ活性は、注射後１日目（ｎ＝１３）、５日目（ｎ＝３４）、１４日目（ｎ＝３２）、３０日目（ｎ＝２０）、及び９０日目（ｎ＝１１）に測定した。大動脈における結果は、主として内皮細胞におけるプロモーター（ＰＰＥ−１又はＣＭＶ）活性を表しており、肝臓における結果は、主として肝細胞における活性を表している。
【０１４４】
実施例８
ＢＡＬＢ／ＣマウスにおけるインビボのＡｄ５ＰＰＥ−１の効率、特異性、及び安定性のアッセイ
観察された結果が動物の特定の系統のアーティファクトではなかったことを証明するため、実施例７の実験を、１２週齢ＢＡＬＢ／Ｃマウス（各群ｎ＝１０）において繰り返した。
【０１４５】
ＢＡＬＢ／Ｃマウスにおいては、アデノウイルスベクターによる絶対的な結果が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスより低かったため、ルシフェラーゼ発現は、全組織における全ルシフェラーゼ活性に対する比率（％）として表される。
【０１４６】
注射後５日目の最も高い相対ルシフェラーゼ発現は、Ａｄ５ＰＰＥ−１を注射されたマウスの脾臓（９０．９％）、及びＡｄ５ＣＭＶを注射されたマウスの肝臓（８６．２％）において観察された。注射後５日目の活性（１．７５％）と比較して、注射後１４日目のＡｄ５ＰＰＥ−１を注射されたマウスの大動脈における相対ルシフェラーゼ活性の有意な増加（３２．９％）も観察された（図３１Ａ及び３１Ｂ；Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃが白バー；Ａｄ５ＣＭＶＬｕｃが黒バー）。
【０１４７】
これらの結果は、マウスの系統に関わらず、注射されたＤＮＡの肝細胞による優先的な取り込みにも関わらず、ＰＰＥ−１プロモーターの組織特異性が、肝細胞発現を効率的に排除するのに充分に強力であることを確認している。
【０１４８】
実施例９
インビボのＡｄ５ＰＰＥ−１により送達された遺伝子の細胞局在
インビボでＰＰＥ−１によって発現された遺伝子の細胞発現部位を確認するため、アデノウイルスベクターＡｄ５ＰＰＥ−１−ＧＦＰによって送達された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用した。Ａｄ５ＣＭＶＧＦＰ（Ｑｕａｎｔｕｍ，カナダ）を、非内皮細胞特異的陰性対照として使用した。静脈注射後５日目、マウスを屠殺し、組織を蛍光顕微鏡検によって分析した。
【０１４９】
Ａｄ５ＣＭＶＧＦＰベクターを注射されたマウスにおいては、肝臓における発現の大部分が肝細胞に検出され、内皮細胞には発現が検出されなかった（図９Ａ）。極めて対照的に、Ａｄ５ＰＰＥ−１−ＧＦＰを注射されたマウス（図９Ｂ）は、肝細胞における発現を示さず、肝臓の血管内の内皮細胞における有意な発現を示した。同様の結果が、他の組織でも得られ、ＰＰＥ−１に由来する発現は、事実上全て、内皮に検出され、ＣＭＶに由来する発現は内皮には存在しなかった。これらの結果は、内皮細胞及び非内皮細胞を含有している器官においてすら内皮特異性が保存されていることを示している。この所見は、増殖中の腫瘍における血管形成の予防にとって重要な意義を有している。
【０１５０】
実施例１０
インビトロのＡｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＬｕｃ及びＡｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰの効率及び内皮特異性のアッセイ
細胞におけるレポーター遺伝子ルシフェラーゼ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現の駆動におけるＡｄ５ＰＰＥ−１及びＡｄ５ＰＰＥ−１−３Ｘの相対効率を決定するため、内皮細胞における特異的活性を、前記の細胞系を使用してインビトロで試験した。Ａｄ５ＣＭＶＬｕｃ及びＡｄ５ＣＭＶＧＦＰを、非組織特異的対照として利用した。Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ及びＡｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰを、３Ｘ配列の付加によって引き起こされた発現レベルの相対変化を確認するために利用した。
【０１５１】
図１０及び１１に要約されている結果は、ＰＰＥ−１−３Ｘプロモーターの調節下でのルシフェラーゼ活性が、非内皮細胞であるラット膵島細胞腺腫ＲＩＮ、ＨｅＬＡ、ＨｅＰＧ２、及び正常皮膚繊維芽細胞（ＮＳＦ）における活性と比較して、ＥＣ系（ウシ大動脈内皮細胞ＢＡＥＣ）において５〜１０倍高かったことを示している（図１０及び１１）。
【０１５２】
図１０は、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ、Ａｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＬｕｃ、及びＡｄ５ＣＭＶＬｕｃにより形質導入されたＢ２Ｂ細胞、ＢＡＥＣ細胞、及びＲＩＮ細胞におけるルシフェラーゼ活性を、光単位／μｇタンパク質として示している。最も高いルシフェラーゼ発現は、Ａｄ５ＣＭＶＬｕｃにより形質導入されたＲＩＮ細胞において観察されたが、この構築物のＢＡＥＣ細胞及びＢ２Ｂ細胞における発現は少なかった。二番目に高いレベルのルシフェラーゼ発現は、Ａｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＬｕｃにより形質導入されたＢＡＥＣ細胞において観察された。Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃは、ＢＡＥＣ細胞において、より低いレベルで発現された。Ｂ２Ｂ細胞系においては、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ及びＡｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＬｕｃが、ほぼ同一のレベルで発現された。
【０１５３】
全体として、ＰＰＥ−１−３Ｘプロモーターの調節下での内皮細胞系におけるルシフェラーゼ活性は、同一感染条件（ｍｏｉ＝１０）で、ＰＰＥ−１プロモーターの調節下よりも２３倍高く、ＣＭＶプロモーターの調節下よりも２３〜４７倍高かった。これは、非内皮ＲＩＮ細胞におけるルシフェラーゼ発現は、ＣＭＶプロモーターの調節下の方が３０００倍高かった（図１０）という事実にも関わらずである。
【０１５４】
ＰＰＥ−１及びＰＰＥ−１−３Ｘが、他の非内皮細胞系列において不活性であることを確立するため、ＨｅＬＡ細胞系、ＨｅｐＧ２細胞系、ＮＳＦ細胞系を形質導入した。ＢＡＥＣを、内皮対照として利用した。図１１は、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ、Ａｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＬｕｃ、及びＡｄ５ＣＭＶＬｕｃにより形質導入されたＨｅＬＡ細胞系、ＨｅｐＧ２細胞系、ＮＳＦ細胞系、及びＢＡＥＣ細胞系におけるルシフェラーゼ活性を光単位／μｇタンパク質として示している。Ａｄ５ＣＭＶＬｕｃによる形質導入は、ＨｅＬＡ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、及びＮＳＦ細胞において、高レベルのルシフェラーゼ発現を引き起こした。これらの細胞系は、ＰＰＥ−１の調節下ではルシフェラーゼを発現せず、ＰＰＥ−１−３Ｘプロモーターでは低レベルでルシフェラーゼを発現した。予想通り、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ又はＡｄＳＰＰＥ−１−３ＸＬｕｃにより形質導入されたＢＡＥＣ細胞は、高いルシフェラーゼ発現を示した。
【０１５５】
これらの結果は、総合すると、ＰＰＥ−１プロモーターへの３Ｘ配列の導入が、非内皮細胞における不要な発現を防止しつつ、内皮細胞系における発現レベルを増加させたことを示している。
【０１５６】
ＰＰＥ−１プロモーターへの３Ｘ配列の付加は、ｍｏｉ＝１により形質導入されたＢＡＥＣにおけるＧＦＰ発現を図示している図１２Ａ〜Ｃに示されるように、ＥＣ系（ウシ大動脈内皮細胞ＢＡＥＣ）における緑色蛍光タンパク質発現のレベルも増加させた。この実験において、ＣＭＶプロモーターを使用した場合には、ＧＦＰの発現は観察されなかった。
【０１５７】
図１２中、パネルＡは、Ａｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰにより形質導入された細胞を示し、パネルＢはＡｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰにより形質導入された細胞を示し、パネルＣはＡｄ５ＣＭＶＧＦＰを示している。ここでも、ＰＰＥ−１プロモーターへの３Ｘ配列の導入は、レポーター遺伝子の発現を有意に増加させた。この結果は、内皮特異的エンハンサーとして機能する３Ｘ配列の能力が、転写される下流遺伝子の機能ではないことを示している。
【０１５８】
さらに、Ａｄ５ＰＰＥ−１−３Ｘ−ＧＦＰ及びＡｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰによる形質導入は、図１３〜１６に要約されるように、ＣＭＶプロモーターの下での高い発現と比較して、非内皮細胞ＳＭＣ、ＨｅｌＡ、ＨｅＰＧ２、及び正常皮膚繊維芽細胞（ＮＳＦ）においてＧＦＰ発現をもたらさなかった。
【０１５９】
図１３は、ｍｏｉ＝１のＡｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰ（パネルＡ）又はＡｄ５ＣＭＶＧＦＰ（パネルＢ）のいずれかにより形質導入されたＳＭＣにおけるＧＦＰ発現を示している。高レベルのＧＦＰ発現が、Ａｄ５ＣＭＶＧＦＰ形質導入から生じたが、Ａｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰ形質導入による形質導入からは、ＧＦＰ発現が生じなかった。
【０１６０】
図１４は、ＨｅＬａ細胞において行われた同様の実験の結果を示している。先の図と同様に、パネルＡはＡｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰにより形質導入された細胞を示し、パネルＢはＡｄ５ＣＭＶＧＦＰにより形質導入された細胞を示している。ここでも、高レベルのＧＦＰ発現が、Ａｄ５ＣＭＶＧＦＰ形質導入から生じたが、Ａｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰ形質導入による形質導入からは、ＧＦＰ発現が生じなかった。
【０１６１】
図１５は、ＨｅｐＧ２細胞において行われた同様の実験の結果を示している。先の図と同様に、パネルＡはＡｄ５ＰＰＥ−１（３Ｘ）ＧＦＰにより形質導入された細胞を示し、パネルＢはＡｄ５ＣＭＶＧＦＰにより形質導入された細胞を示している。ここでも、高レベルのＧＦＰ発現が、Ａｄ５ＣＭＶＧＦＰ形質導入から生じたが、Ａｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰ形質導入からは、ＧＦＰ発現が生じなかった。
【０１６２】
図１６は、ＮＳＦ細胞において行われた同様の実験の結果を示している。先の図と同様に、パネルＡはＡｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰにより形質導入された細胞を示し、パネルＢはＡｄ５ＣＭＶＧＦＰにより形質導入された細胞を示している。ここでも、高レベルのＧＦＰ発現がＡｄ５ＣＭＶＧＦＰ形質導入によって生じたが、Ａｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰによる形質導入からは、非常に低いＧＦＰ発現が生じた。
【０１６３】
これらの結果は、総合すると、配列番号：７の３Ｘ配列を含有している修飾型ＰＰＥ−１プロモーターを使用することにより、高レベルの内皮特異性及び高レベルの内皮発現が得られることを示している。
【０１６４】
実施例１１
インビボでＡｄ５ＰＰＥ−１−３Ｘによって送達されたレポーター遺伝子の細胞局在
インビボでＰＰＥ−１−３Ｘプロモーターの調節下で発現されたレポーター遺伝子の細胞局在パターンを決定するため、Ａｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰ及びＡｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰを、前記のようなマウスに注射した。静脈注射後５日目、マウスを屠殺し、組織を蛍光顕微鏡検によって分析した。
【０１６５】
Ａｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰを注射されたマウスの肝臓、腎臓、及び脾臓の血管の内皮細胞には、Ａｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰを注射されたマウスと比較して有意に高いＧＦＰ活性が観察された。図１７Ａ及びＢは、代表的な結果を示している。
【０１６６】
図１７Ａは、Ａｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰを注射されたマウスの血管を裏打ちしている内皮細胞における低レベルのＧＦＰ発現を示している。図１７Ｂは、構築物への３Ｘ配列の付加によって、はるかに高いレベルのＧＦＰ発現が生じたことを示している。
【０１６７】
血管の裏打ちにおける高発現にもかかわらず、肝細胞、糸球体、上皮細胞、及び脾細胞には発現が検出されなかった（図１８及び１９）。
【０１６８】
図１８は、注射されたマウスの腎組織からの代表的な結果を示している。Ａｄ５ＣＭＶＧＦＰを注射されたマウス（図１８Ａ）、Ａｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰを注射されたマウス（図１８Ｂ）、及びＡｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰを注射されたマウス（図１８Ｃ）は、全て、腎細胞における低いＧＦＰ活性を示した。図１８Ｂにおいては、わずかに高いＧＦＰ発現が、血管壁に可視である（矢印によって示されている）。
【０１６９】
図１９は、注射されたマウスの脾組織からの代表的な結果を示している。Ａｄ５ＣＭＶＧＦＰを注射されたマウス（図１９Ａ）、Ａｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰを注射されたマウス（図１９Ｂ）、及びＡｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰを注射されたマウス（図１９Ｃ）は、全て、脾臓の細胞における低レベルのＧＦＰ活性を示した。Ａｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰを注射されたマウスの血管には、比較的高いＧＦＰ活性が可視である（矢印によって示されている）。
【０１７０】
これらの結果は、ＰＰＥ−１プロモーター及びＰＰＥ−１−３Ｘプロモーターが、いずれも、インビボで内皮細胞特異的であることを確証した。さらに、両プロモーターの活性が、非増殖内皮組織、即ち、健康な器官の血管に限定されていたことも示唆している。従って、腫瘍血管形成モデルにおけるアッセイを行った。
【０１７１】
実施例１２
インビボの腫瘍新血管新生におけるＡｄ５ＰＰＥ−１構築物のアッセイ
レポーター遺伝子の発現を腫瘍内の血管形成性血管へと特異的に差し向けるＡｄ５ＰＰＥの能力を確認するため、（材料及び方法に既に記載された）マウスＬＬＣモデルを利用した。
【０１７２】
一つの実験においては、腫瘍新血管新生中のルシフェラーゼ発現を、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ又はＡｄ５ＣＭＶＬｕｃ（各１０^１０ｐｆｕ／ｍｌ）の全身注射後５日目に試験した。
【０１７３】
この実験においては、原発腫瘍モデル及び転移腫瘍モデルの両方へのＡｄ５ＣＭＶＬｕｃの全身注射が、原発腫瘍又は転移肺における最小の発現をもたらした。この発現レベルは、未処置の正常肺においてＣＭＶによって指図された最小のルシフェラーゼ発現と類似していた（図３５；黒バー；ｎ＝１２）。極めて対照的に、ＰＰＥ−１プロモーター（図３５；白バー；ｎ＝９）の調節下では、高度に血管形成性の肺転移が、低血管新生性の原発腫瘍及び未処置肺におけるルシフェラーゼ活性より約２００倍高かったルシフェラーゼ活性と関連していた。
【０１７４】
肝臓、腎臓、心臓、及び膵臓のような非転移組織におけるルシフェラーゼ発現は最小であった。大動脈における発現レベルは、転移肺におけるレベルの約３０％であった。
【０１７５】
ＬＬＣモデルにおける付加的な実験においては、Ａｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰ及びＡｄ５ＣＭＶＧＦＰ構築物を、原発腫瘍及び転移肺におけるレポーター遺伝子発現の局在位置を決定するために利用した。
【０１７６】
腫瘍細胞自体には発現が検出されなかったが、Ａｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰを注射されたマウスは、原発腫瘍の血管における高レベルのＧＦＰ特異的発現を示した（図３６Ｃ）。この観察は、実施例２０に提示されたＬＬＣ細胞培養モデルの結果と一致している。肺転移においては、高レベルのＧＦＰ発現が、転移巣の大きな動脈及び小さな血管形成性血管の両方に検出された（図３６Ａ）。正常肺組織には、発現が検出されなかった。内皮細胞局在は、ＧＦＰ発現（図３６Ａ）及びＣＤ３１抗体免疫染色（図３６Ｂ）の共局在によって証明された。著しく対照的に、Ａｄ５ＣＭＶＧＦＰを注射されたマウスにおいては、原発腫瘍にも肺転移にもＧＦＰ活性が検出不可であった。
【０１７７】
図３６Ｃは、Ａｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰの腫瘍内注射の後の原発腫瘍の血管におけるＧＦＰ発現を例示している。図３６Ｄは、腫瘍及びその血管を例示するパネルＣと同一物の位相差画像である。
【０１７８】
これらの結果は、ＰＰＥ−１が腫瘍細胞自体においては高レベルの発現を駆動せず、このプロモーターが、腫瘍内の血管内皮、特に急速に増殖中の血管形成性血管においては高レベルの発現を駆動することを示している。
【０１７９】
原発皮下腫瘍モデルへのＡｄ５ＣＭＶの腫瘍内注射は、腫瘍組織においては高いルシフェラーゼ発現をもたらし、肝臓においては中レベルの発現をもたらした（腫瘍において発現された量の１０％；図４２）。転移肺には、発現が検出されなかった。他方、腫瘍内注射した場合、ＰＰＥ−１プロモーターの調節下でのルシフェラーゼ発現は、原発腫瘍及び転移肺において類似したルシフェラーゼ発現レベルをもたらし、肝臓には発現が検出されなかった。
【０１８０】
実施例１３
癌細胞培養系におけるＡｄ５ＰＰＥ−１構築物のアッセイ
癌細胞においてルシフェラーゼ発現を駆動するＡｄ５ＰＰＥ−１及びＡｄ５ＣＭＶの効率をアッセイするため、Ｄ１２２−９６ルイス肺癌細胞系を利用した。
【０１８１】
様々な感染多重度（ｍｏｉ）におけるインビトロ形質導入を達成した。結果は、両方のアデノウイルスベクターが、ルシフェラーゼ遺伝子をこれらの細胞へと形質導入しうることを示している（表３）。にも関わらず、ＬＬＣ細胞においてＰＰＥ−１プロモーターによって指図されたルシフェラーゼ活性は、内皮細胞において検出された活性よりはるかに低く、それぞれ５０光単位／μｇタンパク質対１０００〜２５００光単位／μｇタンパク質であった。
【表３】

【０１８２】
実施例１４
インビボの腫瘍血管形成性血管における３Ｘ配列の効果のアッセイ
血管形成性血管におけるＰＰＥ−１プロモーターに対する３Ｘ配列の効果を確認するため、（材料及び方法に既に記載された）ルイス肺癌（ＬＬＣ）転移モデルを利用した。１０^１０感染単位のＡｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰ、Ａｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰ、又はＡｄ５ＣＭＶＧＦＰのＩＶ注射後５日目、マウスを屠殺し、材料及び方法に記載されたようにして組織を分析した。
【０１８３】
図２０Ａ〜Ｄは、生理食塩水を注射された対照マウス（図２０Ａ）、Ａｄ５ＣＭＶＧＦＰを注射されたマウス（図２０Ｂ）、Ａｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰを注射されたマウス（図２０Ｃ）、及びＡｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰを注射されたマウス（図２０Ｄ）の転移肺におけるＧＦＰ発現を要約している。抗ＣＤ３１免疫染色（図２０Ｃ’〜２０Ｄ’）は、各転移組織内のＧＦＰ発現の位置を確証している。結果は、対照の生理食塩水を注射されたマウスにはＧＦＰ発現が検出されず（図２０Ａ）、ＣＭＶを注射されたマウスの上皮気管支の周囲にはわずかな発現が存在したが、これらのマウスの転移肺の血管形成性血管には存在しなかったことを示している（図２０Ｂ）。低いＧＦＰ発現が、Ａｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰを注射されたマウスの転移肺に観察され（図２０Ｃ及び２０Ｃ’）、高度かつ特異的な発現が、Ａｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰを注射されたマウスの新血管に観察された（図２０Ｄ及び２０Ｄ’）。
【０１８４】
これらの結果は、実施例１０のインビボの結果と、実施例２、３、及び６のインビトロの結果との間の見かけの矛盾を説明する。ＰＰＥ−１プロモーター及びＰＰＥ−１−３Ｘプロモーターは、いずれも内皮特異的である。しかしながら、３Ｘ配列は、増殖中の腫瘍内の新たに形成されつつある血管のような、急速に増殖中の内皮組織における発現レベルを大きく増加させる。
【０１８５】
実施例１５
腫瘍血管形成性血管におけるＰＰＥ−１プロモーターに対する３Ｘ因子の効果
腫瘍血管形成性血管におけるＰＰＥ−１プロモーターの効力及び特異的活性に対する本発明の３Ｘ因子の効果を研究するため、ＬＬＣ転移モデルを利用した。１０^１０ｐｆｕ／ｍｌのＡｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ、Ａｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＬｕｃ、Ａｄ５ＣＭＶＬｕｃ、Ａｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰ、Ａｄ５ＰＰＥ−１−３Ｘ−ＧＦＰ、又はＡｄ５ＣＭＶＧＦＰのｉ．ｖ．注射後５日目に、マウスを屠殺し、前記のようにして、組織をルシフェラーゼ又はＧＦＰの発現に関して分析した。
【０１８６】
図３７は、Ａｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＬｕｃ、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ、又はＡｄ５ＣＭＶＬｕｃの全身注射の後の、正常肺におけるルシフェラーゼ発現と、転移肺におけるルシフェラーゼ発現とを比較したヒストグラムである。実験群は、Ａｄ５ＣＭＶＬｕｃ（ｎ＝７；黒バー）、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ（ｎ＝６；灰色バー）、及びＡｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＬｕｃ（ｎ＝１３；茶色バー）であった。活性は、光単位／μｇタンパク質として表されている。
【０１８７】
ＰＰＥ−１−３Ｘプロモーターの調節下でのルシフェラーゼ発現は、正常肺における活性と比較して転移肺においては３５倍大きく、３Ｘ因子を含まないＰＰＥ−１プロモーターによって駆動された発現より３．５倍高かった（ｐ＜０．００１）。Ａｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＬｕｃを注射されたマウスのその他の組織には、極めて低いルシフェラーゼ活性が検出された。注射された各動物の肝臓に対する比率（％）として肺におけるルシフェラーゼ発現を計算すると、転移肺における活性が、正常肺における活性と比較して１０倍増加していることが明らかとなった（図３８）。
【０１８８】
特定の細胞型へのレポーター遺伝子発現の局在を決定するため、ＧＦＰ構築物を利用した。図３９は、Ａｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰを注射されたマウスの転移肺におけるＧＦＰ発現を示している（図３９Ａ）。ＣＤ３１抗体による免疫染色（図３９Ｂ）は、新血管におけるＧＦＰ発現の位置を確証している。ＧＦＰ発現は、対照の生理食塩水を注射されたマウスには検出されなかった。ＣＭＶを注射されたマウスの上皮気管支の周囲には低レベルの発現が検出されたが、転移肺の血管形成性血管には検出されなかった。要約すると、これらの結果は、発現レベルの大きな増加が、Ａｄ５ＰＰＥ−１構築物への３Ｘ因子の導入に起因したこと、及びこの増加した発現が、腫瘍の血管形成性血管に特異的であったことを示している。可能性として、目的の配列の発現レベルをさらに強化するため、観察された効果を、前記の低酸素応答と共役させることができるかもしれない。
【０１８９】
実施例１６
ＰＰＥ−１低酸素応答のさらなる特徴決定
マウスＰＰＥプロモーター活性に対する低酸素の効果をさらに特徴決定するため、ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）を、ＤＮＡプラスミド（ｐＥＬ８；図２６Ａ）によってトランスフェクトした。ｐＥＬ８プラスミドは、マウスＰＰＥ−１プロモーター（１．４ｋｂ）（赤）、ルシフェラーゼ遺伝子（１８４２ｂｐ）、ＳＶ４０ポリＡ部位、及びエンドセリン−１遺伝子の第１イントロンを含有している。全部でＰＰＥ−１プロモーターカセットと名付けられたこれらは、材料及び方法に記載されたようにして、ＢａｍＨＩ制限酵素によって消化され、抽出された。トランスフェクション後、細胞を低酸素条件に曝した。
【０１９０】
１８時間の低酸素（０．５％Ｏ_２）に曝されたトランスフェクトされたＢＡＥＣにおけるルシフェラーゼ発現は、正常酸素環境において増殖させられた細胞におけるルシフェラーゼ発現より８倍高かった（図２１）。図２１は、マウスＰＰＥ−１プロモーターを含有するプラスミドによってトランスフェクトされたＢＡＥＣにおけるルシフェラーゼ活性（光単位／μｇタンパク質）が、トランスフェクトされた細胞を低酸素環境においてインキュベートした場合、有意に高くなったことを示している。β−ガラクトシダーゼレポーターベクターとの共トランスフェクション、及びＬａｃＺ活性のアッセイにより、等しいトランスフェクション効率が確証された。
【０１９１】
アデノウイルスベクターによって送達されたマウスＰＰＥ−１プロモーターも低酸素によってアップレギュレートされるか否かを決定するため、ＢＡＥＣをＡｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃにより形質導入した。この実験においては、Ａｄ５ＣＭＶＬｕｃを非特異的対照として使用した。結果は、図２２に要約されているように、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃにより形質導入されたＢＡＥＣにおける低酸素時のルシフェラーゼ活性についてである。全く対照的に、Ａｄ５ＣＭＶにより形質導入された細胞においては、正常酸素と低酸素との間で有意な差が検出されなかった（図２２）。
【０１９２】
ＰＰＥ−１プロモーター活性の増強が内皮細胞に特異的であるか否かを理解するため、種々の細胞系（ＢＡＥＣ、Ｂ２Ｂ、ＣＨＯ、ＲＩＮ、及び心筋細胞）を、Ａｄ５ＰＰＥ−１によって形質導入し（ｍｏｉ＝１０）、低酸素環境（０．５％Ｏ_２）又は正常酸素環境に曝した。結果は、図２３に要約されている。ルシフェラーゼ発現は、低酸素環境において培養されたＢ２Ｂ細胞においてわずかに増加し、ＢＡＥＣ細胞において有意に増加した。その他の細胞系におけるルシフェラーゼ発現は、正常酸素と比較して、低酸素環境によって減少した。これらの結果は、ＰＰＥ−１プロモーターの低酸素誘導が、主に、内皮細胞系列において起こることを確証している。
【０１９３】
実施例１７
ＰＰＥ−１低酸素応答に対する３Ｘ配列の効果
ＰＰＥ−１低酸素応答に対する３Ｘ配列の効果を確認するため、ＢＡＥＣをＡｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ及びＡｄ５ＰＰＥ−１（３Ｘ）Ｌｕｃによって形質導入した。形質導入後、ＢＡＥＣ細胞を、既に詳述されたようにして、低酸素環境又は正常酸素環境のいずれかでインキュベートした。結果は、図２４に要約されている。Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ構築物を使用した場合のルシフェラーゼ発現は、低酸素に応答して有意に増加した（７倍）（低酸素においては２５７８、正常酸素においては３２２．１）。対照的に、Ａｄ５ＰＰＥ−１（３Ｘ）Ｌｕｃ構築物は、低酸素に応答してわずか１．５倍の増加を示した（正常酸素条件における２８７４．５から低酸素条件における４３１５まで）。これらの結果は、３Ｘ配列がＰＰＥ−１プロモーターに付加された場合に観察された、正常酸素時の高い発現レベルが、ある程度、低酸素応答を隠蔽するようはたらいていることを示している。
【０１９４】
実施例１８
トランスジェニックマウスモデルにおける低酸素に対するＰＰＥ−１プロモーターの応答のアッセイ
局部的な低酸素／虚血に供された組織におけるマウスＰＰＥ−１プロモーター活性を調査するため、材料及び方法に既に記載されたｍＰＰＥ−１−Ｌｕｃトランスジェニックマウスを利用した。以前に記載されたようにして（Ｃｏｕｆｆｉｎｈａｌ Ｔ．ら、（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５２；１６６７−１６７９）、マウスを局部的な後肢虚血へと誘導した。簡単に説明すると、ペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）で動物に麻酔を施した。後肢の一側性虚血を、伏在動脈及び膝窩動脈の分岐からおよそ２ｍｍ近位の右大腿動脈の結紮によって誘導した。灌流の機能変化の誘導を確かめるため、７．５ＭＨｚトランスデューサー及び血管造影ソフトウェアを装備したシナジー（Ｓｙｎｅｒｇｙ）超音波システム（ＧＥ）によって、超音波画像法を４日目及び１４日目に実施した。動物は、最大１８日間、従来の条件の下で収容した。
【０１９５】
結紮後２日目、５日目、１０日目、及び１８日目に、虚血筋肉、正常非結紮筋肉、肝臓、肺、及び大動脈におけるルシフェラーゼ発現をアッセイした。
【０１９６】
図２５に要約された結果は、結紮後数日間、肝臓、肺、及び大動脈においては有意な差が検出されなかったが、正常非結紮筋肉及び虚血筋肉の両方において、ルシフェラーゼ遺伝子発現が大腿結紮の後に増加したことを示している。虚血筋肉における最高ルシフェラーゼ発現は、結紮後５日目に検出され、非結紮筋肉における最高ルシフェラーゼ発現は、大腿動脈結紮後１０日目に検出された。これは、ＰＰＥ−１プロモーターの低酸素応答が、インビボ系において機能的であることを示している。非虚血筋肉におけるルシフェラーゼ発現は、対照の非施術組織（０日目）における発現と比較して、試験された数日間、変化しなかった。対照的に、虚血筋肉におけるルシフェラーゼ発現は、５日目に、他の時点よりも有意に高くなった。
【０１９７】
５日目、ＰＰＥ−１により駆動されたルシフェラーゼ発現は、対照の非施術マウスより、そして１０日目及び１８日目の虚血筋肉と比較して、２．５倍高かった（図４０）。
【０１９８】
局部虚血に曝されたトランスジェニックマウスの肝臓、肺、及び大動脈を含む他の非虚血組織におけるルシフェラーゼ発現は、虚血誘導後１８日以内に、これらの組織におけるルシフェラーゼ発現の有意な変化を明らかにしなかった（図４１）。
【０１９９】
さらに、これらの結果は、内皮組織を高い比率（％）で含有している組織（肺及び大動脈）におけるルシフェラーゼ発現が、内皮組織を低い比率（％）で含有している組織（肝臓及び非虚血筋肉）より高かったことを確証している。
【０２００】
実施例１９
内皮細胞におけるＡｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ活性に対する細胞増殖レベルの効果
Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃの効率及び特異的活性に対する細胞増殖レベルの効果を確認するため、内皮細胞（ＢＡＥＣ）の血管形成モデルをインビトロで試験した。形質導入されたＢＡＥＣを、血清枯渇によって休止状態へと誘導するか、又は正常な増殖のため１０％ＦＣＳで増殖させた。簡単に説明すると、細胞を、血清枯渇後７２時間目の休止細胞として、又は正常培地（１０％ＦＣＳ）中の増殖細胞として、４８時間、形質導入した。ルシフェラーゼ活性は、細胞量の差について規準化するため、光単位／μｇタンパク質として表される。提示された結果は、４回の代表的な独立した実験からのトリプリケート試験の平均値である。
【０２０１】
ＰＰＥ−１プロモーター（白バー；図２８）の調節下での正常増殖ＢＡＥＣにおけるルシフェラーゼ発現は、休止細胞より４倍高く、ＣＭＶプロモーター（黒バー；図２８）の調節下でのルシフェラーゼ発現より２５倍高かった。さらに、増殖細胞では、ＰＰＥ−１プロモーターの調節下での活性が、ＣＭＶプロモーター調節下での活性より１０倍高かった。
【０２０２】
血管形成条件をインビトロで模倣するため、４０ｎｇ／ｍｌ血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の添加によって急速な増殖へと誘導されたＢＡＥＣにおいて、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ活性を試験した。これらの条件下での活性を、前記のような正常増殖細胞及び休止細胞における活性と比較した。ＶＥＧＦにより細胞増殖へと誘導されたＢＡＥＣにおけるルシフェラーゼ発現は、正常増殖細胞よりも４４倍高く、休止細胞よりも８３倍高かった（図２９）。
【０２０３】
総合すると、これらの実験は、ＰＰＥ−１プロモーターの転写調節下での目的の配列の活性レベルが、細胞増殖レベルの関数であり、急速な増殖は、より高い発現レベルを引き起こすことを示している。
【０２０４】
実施例２０
アテローム性動脈硬化誘導マウスにおけるＰＰＥ−１プロモーターのアッセイ
アテローム性動脈硬化血管におけるＡｄ５ＰＰＥ−１ベクターの効率及び特異性を試験するため、１０^１０ｐｆｕ／ｍｌのウイルスベクターを、６ヶ月齢ＡｐｏＥ欠損マウス（Ｐｌｕｍｐ，Ａ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ；１９９１；７１：３４３−３５３）へと全身注射した。
【０２０５】
ＡｐｏＥ欠損マウスは、加齢するにつれ、脂質範囲食への誘導なしに、高コレステロール値、及び広範なアテローム生成斑を発症する。図３２は、スーダン（Ｓｕｄａｎ）−ＩＶによって着色された、ＡｐｏＥ欠損マウスから解剖された大動脈の写真である。胸大動脈は比較的少ない赤色に染色されたアテローム性動脈硬化巣を含有しており、腹領域は高度にアテローム性動脈硬化性であることに注意されたい。（図３２は、^１２５Ｉ−ＨＤＬ及び^１２５Ｉ−ＢＳＡによる大動脈アテローム性動脈硬化巣の画像法（Ａ．Ｓｈａｉｓｈ ら、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ−投稿中）より編集した）。
【０２０６】
図３３は、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ（白バー；ｎ＝１２）及びＡｄ５ＣＭＶＬｕｃ（黒バー；ｎ＝１２）のＡｐｏＥ欠損マウスへの注射後５日目に観察されたルシフェラーゼ発現を要約している。結果は、比較的少ないアテローム性動脈硬化巣を含有している胸部、及びアテローム性動脈硬化巣に富む腹大動脈における絶対ルシフェラーゼ発現として提示されている。
【０２０７】
ＰＰＥ−１プロモーターにより調節されたルシフェラーゼ発現は、ＣＭＶプロモーターの調節下での発現と比較して、高度にアテローム性動脈硬化性の腹動脈においては６倍高く、わずかにアテローム性動脈硬化性の胸大動脈においては１．６倍高かった。
【０２０８】
Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃを注射されたマウスにおいては二つの大動脈領域間に有意差が観察されなかったが、Ａｄ５ＣＭＶＬｕｃを注射された群の胸大動脈においては、病巣を含有している腹大動脈における低い発現と比較して、より高いルシフェラーゼ発現が観察された。
【０２０９】
これらの結果は、構成性プロモーター（ＣＭＶ）はアテローム性動脈硬化が最も重度である区域において機能を停止する傾向を有しており、ＰＰＥ−１プロモーターは、疾患進行によって比較的影響を受けないことを示している。
【０２１０】
実施例２１
創傷治癒モデルにおけるＰＰＥ−１プロモーターのアッセイ
Ａｄ５ＰＰＥ−１構築物の、治癒中の創傷血管へルシフェラーゼ発現を差し向ける効率及び特異性を試験するため、材料及び方法に既に記載されたようなマウス創傷治癒を利用した。
【０２１１】
他の実験と同様に、Ａｄ５ＣＭＶＬｕｃを、非組織特異的対照として使用した。ＰＰＥ−１プロモーター（図３４；白バー）の調節下でのルシフェラーゼ活性は、ＣＭＶ調節下（図３４；黒バー）で観察された活性と比較して、正常領域（６．８±３．２）においても、治癒中の創傷領域（５±１．６）においても高かった。
【０２１２】
ＣＭＶプロモーター及びＰＰＥ−１プロモーターの両方が、治癒中の創傷における減少した発現レベルを示したため、これらの結果は、解釈が困難である。この予想外の観察に関わらず、ＰＰＥ−１プロモーターが、正常組織においても治癒中の組織においてもＣＭＶプロモーターより高い発現レベルを駆動することは明らかである。壊死瘢痕組織の存在が、治癒中の創傷における両プロモーターにより観察された減少した発現レベルの原因であるかもしれない。
【０２１３】
本発明を、特定の実施態様と併せて記載してきたが、多くの代替物、修飾、及び改変が、当業者には明白になろう。従って、そのような代替物、修飾、及び改変は、添付の特許請求の範囲の本旨及び広い範囲に含まれるものとする。この明細書において言及されたアクセッション番号により同定される出版物、特許、特許出願、又は配列は、全て、アクセッション番号により同定される個々の出版物、特許、特許出願、又は配列が、各々、参照により本明細書に組み込まれると特別に個々に示されたかのごとく、参照により、完全に、本明細書に組み込まれる。さらに、本願における任意の参照の引用又は同定は、そのような参照が、本発明に対する先行技術として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。
「配列表フリーテキスト」
配列番号２は合成オリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号３は合成オリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号４はＮｈｅ−１制限酵素部位の配列である。
配列番号５は低酸素応答因子Ｅ−ｂｏｘの配列である。
配列番号６はマウス内皮特異的エンハンサー因子の配列である。
配列番号７はＰＰＥ−１プロモーター由来のマウスエンハンサー配列のトリプリケートコピーの配列である。
配列番号８はＥＤＣフラグメントの配列である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 非内皮対照としてＢ２Ｂ細胞系を使用した、ウシ及びヒト両方の内皮細胞系におけるルシフェラーゼ発現に対する、本発明のエンハンサー因子の効果を例示するヒストグラムである。
【図２】 様々な細胞系におけるルシフェラーゼ発現に対する、アデノウイルスベクター内の本発明のプロモーターの内皮特異性を例示するヒストグラムである。
【図３】 ＢＡＥＣ細胞系における、本発明のＡｄ５ＰＰＥ−１−３Ｘ及びＡｄ５ＣＭＶ対照構築物の調節下でのＧＦＰ発現を例示する光学顕微鏡写真である。
【図４】 内皮細胞及び非内皮細胞におけるｐＡＣＰＰＥ−１−３Ｘｐ５５、ｐＡＣＰＰＥ−１−３Ｘルシフェラーゼ、及びｐＣＣＭＶｐ５５により誘導されたアポトーシス率（％）のヒストグラムである。
【図５】 本発明に係るエンハンサー因子のプロモーター構築物への導入の、低酸素応答に対する効果を例示するヒストグラムである。
【図６】 本発明に係るエンハンサー因子の、アデノベクター構築物のプロモーターへの導入の、低酸素応答に対する効果を例示するヒストグラムである。
【図７】 本発明に係るエンハンサー因子のプロモーターへの導入の、ウシ及びヒトの内皮細胞系における発現レベルに対する効果を例示するヒストグラムである。
【図８】 内皮プロモーター（ＰＰＥ−１）又は対照（ＣＭＶ）プロモーターいずれかを含有しているアデノウイルス構築物の注射後に、様々な器官において観察されたレポーター遺伝子の発現レベルを例示するヒストグラムである。
【図９】 構築物を注射されたマウスの肝組織におけるＡｄ５ＣＭＶＧＦＰ構築物（図９Ａ）及びＡｄ５ＰＰＥ−１−ＧＦＰ構築物（図９Ｂ）の細胞発現を例示する二つの光学顕微鏡写真である。
【図１０】 本発明に係るエンハンサー因子のプロモーターへの導入の、内皮細胞系及び非内皮細胞系における発現レベルに対する効果を例示するヒストグラムである。
【図１１】 本発明に係るエンハンサー因子のプロモーターへの導入の、内皮細胞系及び非内皮細胞系における発現レベルに対する効果を例示するヒストグラムである。
【図１２】 Ａｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰにより形質導入された細胞、Ａｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰにより形質導入された細胞、及びＡｄ５ＣＭＶＧＦＰにより形質導入された細胞におけるＧＦＰ発現を例示する顕微鏡写真である。
【図１３】 ｍｏｉ−１のＡｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰ及びＡｄ５ＣＭＶＧＦＰによりそれぞれ形質導入されたＳＭＣにおけるＧＦＰ発現を例示する。
【図１４】 ＨｅＬａ細胞において行われた図１３Ａ〜Ｂの実験と類似の実験の結果を示す。
【図１５】 ＨｅｐＧ２細胞において行われた図１３Ａ〜Ｂの実験と類似の実験の結果を示す。
【図１６】 ＮＳＦ細胞において行われた図１３Ａ〜Ｂの実験と類似の実験の結果を示す。
【図１７】 それぞれＡｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰ及びＡｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰを注射されたマウスの血管を裏打ちしている内皮細胞におけるＧＦＰ発現を例示する顕微鏡写真である。
【図１８】 注射されたマウスの腎組織からの結果を例示する顕微鏡写真である。Ａｄ５ＣＭＶＧＦＰを注射されたマウス（図１８Ａ）、Ａｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰ（図１８Ｂ；わずかに高度のＧＦＰ発現が血管壁に可視である；矢印によって示されている）、及びＡｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰ（図１８Ｃ）。
【図１９】 脾組織切片に対して行われた、図１８Ａ〜Ｃに図示された実験と類似の実験を例示する。
【図２０】 生理食塩水を注射された対照マウス（図２０Ａ）、Ａｄ５ＣＭＶＧＦＰを注射されたマウス（図２０Ｂ）、Ａｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰを注射されたマウス（図２０Ｃ）、及びＡｄ５ＰＰＥ−１−３ＸＧＦＰを注射されたマウス（図２０Ｄ）の転移肺におけるＧＦＰ発現を例示する。抗Ｃｄ３１免疫染色（図２０Ｃ’〜２０Ｄ’）は、各転移組織におけるＧＦＰ発現及びＣＤ３１発現の共局在を確証している。
【図２１】 マウスＰＰＥ−１プロモーターを含有しているプラスミドによりトランスフェクトされたＢＡＥＣにおけるルシフェラーゼ活性（光単位／μｇタンパク質）が、トランスフェクトされた細胞を低酸素条件下でインキュベートした場合に、有意に高くなることを例示するヒストグラムである。
【図２２】 Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ及びＡｄ５ＣＭＶＬｕｃが利用されたことを除き、図２１と同様のヒストグラムである。
【図２３】 種々の細胞系における低酸素の効果を示す、図２２と同様の一連のヒストグラムである。
【図２４】 本発明の３Ｘ配列の、ＢＡＥＣ細胞におけるＰＰＥ−１低酸素応答に対する効果を例示するヒストグラムである。
【図２５】 大腿動脈結紮後のＰＰＥ−１−Ｌｕｃトランスジェニックマウスにおけるルシフェラーゼ発現のレベルを示すヒストグラムである。
【図２６】 本発明と併せて利用された構築物のプラスミド地図である。
【図２７】 結紮後２１日目の、種々の処理群からの代表的な動物の結紮された肢の一連の超音波画像である。図２７Ａ：対照Ａｄ５ＣＭＶＬｕｃ処理；図２７Ｂ：対照生理食塩水処理；図２７Ｃ：Ａｄ５ＰＰＥ−３Ｘ−ＶＥＧＦ処理；図２７Ｄ：Ａｄ５ＣＭＶ−ＶＥＧＦ処理。
【図２８】 Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ（白バー）及びＡｄ５ＣＭＶＬｕｃ（黒バー）により形質導入された増殖期及び休止期のウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）におけるルシフェラーゼ活性を例示するヒストグラムである。
【図２９】 ＶＥＧＦ添加後の正常増殖中、休止状態、及び急速増殖中のＡｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃにより形質導入されたＢＡＥＣにおけるルシフェラーゼ活性を例示するヒストグラムである。
【図３０】 Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ及びＡｄ５ＣＭＶＬｕｃを注射された正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスの（図３０Ａ）大動脈及び肝臓（図３０Ｂ）におけるルシフェラーゼ活性（光単位／μｇタンパク質）を例示するヒストグラムである。
【図３１】 注射された正常なＢＡＬＢ／Ｃマウスにおける、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ（白バー）又はＡｄ５ＣＭＶＬｕｃ（黒バー）の注射後５日目（図３１Ａ）及び１４日目（図３１Ｂ）（各時点についてｎ＝１０）に検出された相対ルシフェラーゼ活性（光単位／μｇタンパク質）を例示するヒストグラムである。
【図３２】 スーダン−ＩＶにより着色されたＡｐｏＥ欠損マウスから解剖された大動脈を図示する先行技術の画像である。
【図３３】 Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ（白バー；ｎ＝１２）又はＡｄ５ＣＭＶＬｕｃ（黒バー；ｎ＝１２）のＡｐｏＥ欠損マウスへの全身注射後５日目に検出された絶対ルシフェラーゼ活性（光単位／μｇタンパク質）を例示するヒストグラムである。
【図３４】 創傷治癒中のＣ５７ＢＬ／６誘導マウスへのＡｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ（黒バー）又はＡｄ５ＣＭＶＬｕｃ（白バー）の全身注射後５日目の絶対ルシフェラーゼ活性（光単位／μｇタンパク質）を例示するヒストグラムである。
【図３５】 ルイス肺癌誘導マウスの正常肺、転移肺、及び原発腫瘍におけるルシフェラーゼ活性を例示するヒストグラムである。
【図３６】 Ａｄ５ＰＰＥ−１ＧＦＰの腫瘍内注射後のＬＬＣ保持マウスの肺及び腫瘍におけるＧＦＰ発現及び組織形態学を例示する顕微鏡写真である。図３６Ａ−肺転移の血管形成性血管におけるＧＦＰ；図３６Ｂ−図３６Ａに描写された切片のＣＤ３１抗体免疫染色；図３６Ｃ−原発腫瘍の血管におけるＧＦＰ発現；図３６Ｄ−血管を例示するＣの切片の位相差。
【図３７】 Ａｄ５ＣＭＶＬｕｃ、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ、及びＡｄ５ＰＰＥ−１−３Ｘ−Ｌｕｃを注射されたルイス肺癌誘導マウスのの正常肺及び転移肺におけるルシフェラーゼ発現を例示するヒストグラムである。
【図３８】 Ａｄ５ＣＭＶ、Ａｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ、及びＡｄ５ＰＰＥ−１（３Ｘ）を注射されたルイス肺癌誘導マウスの正常肺及び肺転移における肝臓活性に対する比率（％）（肝臓を１００％とした場合）としてのルシフェラーゼ活性を例示するヒストグラムである。
【図３９】 Ａｄ５ＰＰＥ−１−３Ｘ−ＧＦＰを注射されたＬＬＣ肺転移を有するマウスにおけるＧＦＰ発現（図３９Ａ）及びＣｄ３１免疫染色（図３９Ｂ）の共局在を例示する顕微鏡写真である。
【図４０】 大腿結紮後２日目、５日目、１０日目、及び１８日目のＰＰＥ−１ルシフェラーゼトランスジェニックマウスの筋肉（虚血及び正常）、並びに対照（非結紮動物−０日目；各群ｎ＝８）におけるルシフェラーゼ活性（光単位／μｇタンパク質）を例示するヒストグラムである。
【図４１】 大腿結紮後５日目（ｎ＝６）、１０日目（ｎ＝６）、及び１８日目（ｎ＝８）のＰＰＥ−１ルシフェラーゼトランスジェニックマウスの肝臓、肺、及び筋肉内（虚血及び正常）大動脈、並びに対照（非結紮動物−０日目）におけるルシフェラーゼ活性（光単位／μｇタンパク質）を例示するヒストグラムである。
【図４２】 Ａｄ５ＣＭＶＬｕｃ（黒バー）又はＡｄ５ＰＰＥ−１Ｌｕｃ（白バー）を原発腫瘍内に注射されたＬＬＣマウスの肝臓、肺、及び原発腫瘍において検出されたルシフェラーゼ活性（光単位／μｇタンパク質）を例示するヒストグラムである。
【配列表】

Claims (18)

1. 制御因子として機能性の単離されたポリヌクレオチドであって、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：８に示された配列少なくとも１コピーを含み、前記制御因子は、内皮特異的プロモーターに操作可能に連結されたヌクレオチド配列の制御された発現を可能にする、単離されたポリヌクレオチド。
2. 前記制御因子は、配列番号：６に示された配列少なくとも１コピーをさらに含む請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド。
3. 前記制御因子は、配列番号：８に示された配列１コピーと、配列番号：６に示された配列少なくとも２コピーとを含む請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド。
4. 前記内皮特異的プロモーター因子は、ＰＰＥ−１プロモーター少なくとも１コピーを含む請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド。
5. 低酸素応答因子をさらに含む請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド。
6. 前記低酸素応答因子は、配列番号：５に示された配列少なくとも１コピーを含む請求項５記載の単離されたポリヌクレオチド。
7. 前記制御因子は配列番号：７に示されるものである請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド。
8. 請求項１記載の単離されたポリヌクレオチドと目的の核酸配列とを含む核酸構築物であって、前記目的の核酸配列は前記単離されたポリヌクレオチドの制御調節下にある核酸構築物。
9. 前記目的の核酸配列は、ＶＥＧＦ、ｐ５５、及びＰＤＧＦ−ＢＢからなる群より選択される請求項８記載の核酸構築物。
10. 請求項８記載の核酸構築物により形質転換された哺乳動物細胞。
11. 内皮細胞において制御因子として機能性の単離されたポリヌクレオチドであって、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：７に示された配列を含むエンハンサー因子を含む単離されたポリヌクレオチド。
12. 内皮特異的プロモーター因子をさらに含む請求項１１記載の単離されたポリヌクレオチド。
13. 前記内皮特異的プロモーター因子は、ＰＰＥ−１プロモーター少なくとも１コピーを含む請求項１２記載の単離されたポリヌクレオチド。
14. 低酸素応答因子をさらに含む請求項１１記載の単離されたポリヌクレオチド。
15. 前記低酸素応答因子は、配列番号：５に示された配列少なくとも１コピーを含む請求項１４記載の単離されたポリヌクレオチド。
16. 請求項１１記載の単離されたポリヌクレオチドと目的の核酸配列とを含む核酸構築物であって、前記目的の核酸配列は前記単離されたポリヌクレオチドの制御調節下にある核酸構築物。
17. 前記目的の核酸配列は、ＶＥＧＦ、ｐ５５、及びＰＤＧＦ−ＢＢからなる群より選択される請求項１６記載の核酸構築物。
18. 請求項１６記載の核酸構築物により形質転換された哺乳動物細胞。

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