DE2333434C3 - Verfahren zur Durchführung serologischer Untersuchungen nach dem Prinzip der Komplementbindungsreaktion und gebrauchsfertige Schnelltestpackung hierfür - Google Patents

Description

Bei der parenteralen Aufnahme körperfremder Stofife kommt es häufig zu einer Abwehrreaktion des Körpers, bei welcher sogenannte Antikörper gebildet werden. Stoffe, welche die Bildung von Antikörpern hervorrufen, werden als Antigene bezeichnet: meist sind diese Gemische von Eiweißarten oder deren Abbauprodukten, von Lipoidsubstanzen und Polysacchariden, beispielsweise Bakterien, Viren, Blutkörperchen und Toxine. Die gebildeten Antikörper, im Falle zellschädigender Antigene auch Immunkörper genannt, binden die Antigene in einer äußerst spezifischen Reaktion; die Gegenwart von Antikörpern führt also zu einer spezifischen Widerstandsfähigkeit des Organismus dem entsprechenden Antigen gegenüber.

Wegen ihrer hochgradigen Spezifität können Antikörper zur Identifikation der entsprechenden Antigene herangezogen werden: Lassen sich in einem Organismus bestimmte Immunkörper nachweisen, so kann mit hoher Sicherheit geschlossen werden, daß der Organismus den entsprechenden Antigenen ausgesetzt war: Der Nachweis der Antikörper wird dabei im Prinzip äußerst einfach dadurch geführt, daß Körperfllüssigkeit, beispielsweise Blut, mit Antigen in Berührung gebracht wird; tritt eine Antigen-Antikörperreaktion ein, so ist der Antikörper-Nachweis geführt. Dabei ist von besonderer Bedeutung, daß der Nachweis von Antigenen über die entsprechenden Antikörper geführt werden kann, wenn Antigene selbst im Organismus nicht mehr vorhanden sind.

Zum Nachweis von Antikörpern, die zur Gruppe der Lysine gehören, wird häufig die sogenannte Komplcmentbindungsreaktion herangezogen. Lysine sind Antikörper, die spezifische bakteriolytische, viruzide, zytolygische oder hämolytische Eigenschaften aufweisen, sofern sie mit den entsprechenden Antigenen in Gegenwart eines unspezifischen, in jedem Normalserum vorkommenden Bestandteiles, dem sogenannten Komplement, zusammengebracht werden. Ohne das Komplement bleibt auch der spezifischeAntikörper unwirksam. Da die Lysine zur Entfaltung ihrer Wirksamkeit sich mit zwei Stoffen, dem Antigen und dem Komplement, binden müssen, werden sie auch als Ambozeptoren (Zweihafter) bezeichnet.

Das Komplement oder Komplementsystem (abgekürzt K oder C) ist eine labile Serumfunktion, welche nach heutigen Kenntnissen aus wenigstens 10 Serumenzymfaktoren besteht und bei halbstündigem Erwärmen auf 56° C, wie auch bei längerem Stehen bei Zimmertemperatur, ihre Aktivität verliert. Die Möglichkeit, das Komplementsystem C" durch Erwärmen zu inaktivieren ist für die Durchführung serologischer

Reaktionen von ausschlaggebender Bedeutung: Antikörper enthaltendes Patientenserum, welches 30 Minuten lang auf 56° C erhitzt worden ist, kann mit entsprechendem Antigen vermischt werden, ohne daß dabei eine Reaktion eintritt. Die Reaktion zwischen Antigen und Antikörper (hier Lysin, also Ambozeptor) tritt erst dann ein, wenn ein komplementhaltiges System zugegeben wird, beispielsweise frisches, nicht erhitztes Serurn.

Die Komplementabhängigkeit der Reaktionen zwischen Antigenen und Ambozeptoren ist besonders eindrucksvoll bei dem sogenannten hämolytischen System zu zeigen. Unter dem hämolytischen System versteht man ein System aus Erythrozyten und für diese spezifischen Ambozeptoren. Dabei wird in der Praxis unter Ambozeptor ein Serum verstanden, welches von den für die Antigen-Antikörper-Komplement-Reaktion wesentlichen Reaktanten nur noch die Ambozeptorkomponente enthält, welches also hinreichend lange auf 56° C erhitzt worden ist, um das Kamplementsystem C zu inaktivieren. Als Erythrozyten werden im allgemeinen Schaferythro.cyten verwendet, als dafür spezifischer Ambozeptor ein gegen Schaferythrozyten sensibilisiertes, komplementinaktiviertes Kaninchenserum. Durch Zugabe einer Erythrozyten-Suspension zu einer Ambozeptorlösung wird zunächst wieder eine Erythrozytensuspension gebildet. Wird dieser ein komplementhaltiges Serum - es wird im allgemeinen frisches, blutkörperchenfreies Meerschweinchenserum verwendet - so zugesetzt, tritt Hämolyse ein: Die Membranen der Schaferythrozyten werden nach Zugabe des Komplements zerstört und Blutfarbstoff geht in Lösung.

Die Reaktion des hämolytischen Systems mit dem Komplement - unter Komplement wird im folgenden immer ein frisches, komplementhaltiges Serum verstanden - ist also eine echte Farbreaktion, die die Gegenwart von Komplement quantitativ und qualitativ anzeigt. Nur bei Gegenwart von Komplement - von derSpontarhämolyse,die in wenigen Fällen auftreten kann und weiter unten diskutiert werden wird, sei hier abgesehen- nimmt die ursprünglich farblose bis blaßgelbe Lösung, welche die Erythrozyten enthält, Blutfarbstoff auf. Dabei hängt die Intensität der roten Färbung innerhalb gewisser Grenzen von der Menge bzw. Aktivität des Komplements ab. Liegt das Komplement in großer Menge oder großer Aktivität vor, so erfolgt Hämolyse, also Dunkelfärbung der über den Blutkörperchen stehenden Lösung, in kurzer Zeit, während bei Anwesenhf it von wenig oder wenig aktivem Komplement das gleiche hämolytische System in der gleichen Zeit nur wenig Hämolyse erleidet.

Das hämolytische System ist demnach als Indikatorsystem für komplementbrauchende Reaktionen geeignet, d. h. als Indikatorsystem für den Nachweis von Reaktionen anderer Antigene mit entsprechenden Antikörpern, insbesondere solcher Antigen-Ambozeptor-Komplement-Reaktionen, welche nicht in so augenfälliger Weise wie die Hämolyse in Erscheinung treten. Das Prinzip ist dabei sehr einfach: Das auf die Gegenwart bestimmter Antikörper zu prüfende, komplementinaktiviertc Serum (gewöhnlich als Probanden-, Patienten- oder einfach Testserum bezeichnet) wird mit dem entsprechenden Antigen zusammengebracht -jnd anschließend mit Komplement versetzt. Sind für das eingesetzte Antigen spezifische Antikörper im TeststrvTi nicht vorhanden, so bleibt das zugesetzte Komplement unverbraucht; das Komplement steht demnach für andere Antigen-Komplement-Reaktionen zur Verfügung. Enthüll das Prüfsystem aus Testserum an Antigen also auch das hämolytische System (nach Inkubation der übrigen Komponenten zugegeben), so findet Hämolyse unter Verfärbung der Lösung statt. Das Auftreten der Hämolyse wird als negativer Testausgang registriert, d. h. als ein Zeichen der Abwesenheit von für das eingesetzte Antigen spezifischen Antikörpern. Sind jedoch ίο im Testserum Antikörper vorhanden, welche in Gegenwart von Komplement mit dem eingesetzten Antigen reagieren, so steht weniger oder überhaupt kein Komplement zur Hämolyseauslösung mehr zur Verfügung; die Hämolyse tritt nicht oder nur abgeschwächt auf. Das Ausbleiben der Hämolyse in einem aus Testserum, Antigen, hämolytischem System und Komplement bestehendem System wird demnach als positiver Testausgang gewertet, also als Hinweis auf die Anwesenheit von dem eingesetzten Antigen entsprechenden Antikörpern im Test^c-?rum.

Das geschilderte Testverfahren iiat als »Komplementbindungsreaktion« Eingang in die serologischen Laboratorien gefunden und wird in großem Umfange zum Nachweis von Krankheitserregern über du. ihnen entsprechenden Antikörper verwendet, vergleiche hierzu oeispielsweise »N. Henning, Klinischf.· ^aboratoriumsdiagnostik, 3. Auflage, 1966, Seiten 308-311«.

Besondere Bedeutung hat dabei die Komplementbindungsreaktion beim Nachweis der Syphilis, sie wird jedoch in kaum geringerem Umfange auch zum Nachweis von Morbus Bang, Echinokokkose, Gonorrhoe, Keuchhusten, Leptospirose, Maul- und Klauenseuche, Mumps, Pemphigus, Rhinosklerom, Rotz, Tuberkulose, Toxoplasmose, Trichinose, Viruserkrankungen und anderen Krankheiten angewandt.

Dem einfachen, oben dargelegten Prinzip der Kompiementbindungsreaktion steht jedoch eine recht aufwendige Praxis gegenüber. Die Praxis der Komplementbindungsreaktion sei im folgenden am Beispiel des Syphilis-(Lues-)-Nachweises illustriert. Es werden im allgemeinen fünf voneinander getrennt aufbewahrte Reaktanten bzw. Lösungen von Reaktanten verwendet:

1. Das zu untersuchende Patienten^erum (P) wird gewonnen, indem man (im allgemeinen venöses Blut) in einem Gläschen gerinnen läßt, den Blutkuchen mittels Glasstab oder langer Platinnadel von der Glaswand ablöst und das Glasröhrchen über Nacht bei etwa 2-5° C aufbewahrt. Dabei trennt sich dt;s Serum meist so klar ab, daß es ohne weiteres abpipettiert werden kann. Das frisch entnommene Blut darf nicht nach der Blutentnahme stark abgekühlt und sofort zentrifugiert werden, da so gewonnenes Serum !sieht unspezifische Hämolysehemmung zeigt.

Das abpipettierte Serum wird durch halbstündiges Erwärmen auf etwa 56° C komplementinaktiviert. Zum Gebrauch wird es im allgemeinen im Verhältnis 1 : 5 mit möglichst steriler 0,9%igef NaCI-Lösung verdünn!.
2. Hammel- bzw. Schaferythrozyten ( E) werden im allgemeinen als 2-4%ige Suspension gewaschener Erythrozyten in physiologischer Kochsalzlösung eingesef'.t. An Stelle der physiologischen Kochsalzlösung, welche auch zum Auswasehe 1 verwendet wird, können auch ähnliehe Lösungen, wie Kolmer-Lösung oder Osler-Strauß-

Meier-Losung, verwundet werden. Zu der Umstellung der Suspensions-Konzentration können verschiedene Verführen, insbesondere über die Hämalokrit-Bestimmung. herangezogen werden. 3. Als liämolytischer Ambozcptor ( A ) zur Vervollständigung des hämolytischen Systems ( I.A ) wird Serum von Kaninchen verwendet, die mit Schafblutkörperchen vorbehandelt sind. Das Serum ist wie unter 1 beschrieben. Komplement inaktiviert. Der hämolytischc Tiler des Ambo/eptors soll wenigstens 1 : 1000 betragen. Unter dem hämolytischen liter wird dabei diejenige Verdünnung des Kaninchenserums verstanden, bei welcher unter bestimmten Standardbedingungen bei Vorhandensein einer ausreichenden oiler überschüssigen Ko'tiplementmenge gerade noch vollständige Hämolyse der vorgege-

„IL1..I1: U f.. I...

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Im allgemeinen wird die Titerbestimmung in einein System aus 0.5 ml Ambo/eptorverdunnung (zunehmende Verdünnung). 0.5 ml Komplementverdiinnung. 0.5 ml 2'rige Hammelerythro/yten-Suspeiision und 1.5 ml Verdünnungsmittel (physiologische Kochsalzlösung. KoI-mer-S.ilzlosung. [iagle-Losiing oder Veronall'ufferlösung) durchgeführt, welches bei 37 C Ί0 Minuten lang inkuhiert wird. Vorzugsweise soll der Ambo/eptor einen Titer von wenigstens 1 4000 aufweisen, also noch in einer Verdunnung von 1 : 4000 unter Standardbedingungen \ollige Hämolyse herbeiführen. Als Amhozepti)r-(iebrauchsdosis wird die 4fache Menge der nach einer Stunde losenden Ambozeptordosis verwendet.

AK Komplement ( K) wird frisches Meer-■>chweint henserum verwendet. Das Komplement wird erst unmittelbar vor der Verwendung mit / B physiologischer Kochsalzlosung verdünnt. Die Komplement-Ciehrauchsdosis wird durch \ crdunnungsreihen. ähnlich wie unter 3. angesehen, ermittelt, indem einem Testsystem, welches in einem Rohrchen aufeinander abgestimmte Mengen an Schaferythro/yten ( E) und hamolytivehem Ambozeptor (/)) enthält, unter- -chiedliehc Mengen Komplement zugegeben werden, worauf mit Verdünnungsmittel auf jeweils die gleiche Gesamtmenge (im allgemeinen .1 ml) verdünnt und 60 Minuten lang bei 37' C inkubiert wird. Auf diese Weise wird ermittelt. wieviel Komplement wenigstens erforderlich ist. um vollige Hämolyse herbeizuführen. Die Gebrauchsdosis liegt meist bei etwa dem Doppelten dieser Menge.

5. Als Antigen (Ag) für die Komplementbindungsreaktion auf Syphilis wird im allgemeinen Cardiolipin-Antigen. oder Reiter-Antigen verwendet. Cardiolipin ist ein aus Rinderherz gewonnenes Phospholipid. welches mit den durch Lues-Erregern induzierten Antikörpern einen Antigen-Antikörper-Komplex bildet. Die Verwendung von Cardiolipin wird dadurch ermöglicht, daß die durch einen gegebenen Erreger induzierten Antikörper nicht nur mit dem virulenten Erreger selbst Antikörper-Antigen-Reaktionen eingehen, sondern auch mit bestimmten, strukturell äußerst nahe verwandten anderen Antigenen. wie z. B. durch bestimmte chemische Reaktionen abgeschwächten Hrregern. Die Spezifität der Antikörper ist insofern keine totale, was für die Praxis von erheblicher Bedeutung ist. da das Vorhandensein von Antikörpern gegen äußerst gefährliche oder schwer gewinnbare Antigene durch Einsatz von lirsatzantigenen geprüft werden kann.
Das gebrauchsfertige Cardiolipin-Antigen besteht aus einer /.. B. 0.0 1 75^Γί igen alkoholischen Losung von Cardiolipin mit 0.0X75% Lecithin und 0,3'* Cholesterin und ist im Handel erhältlich Hs wird gewöhnlich in einer Verdünnung von etwa 1 : 100 bis etwa I : 200 verwendet. Andere Zubereitungen des C ardiolipin-Antigens sind möglich.

Reiter-Antigen besteht aus konservierten, durch Ultraschall aufgeschlossenen Kulliirspirochäteii. ist ebenfalls im Handel erhältlich und wird für die Anwendung im Verhältnis I : 2 bis 1 : H verdünnt.

t '. . *«. I I t 11-l.lMt- Il ΙΛΙ Hll^lirni^i.tt.llLrr^lKKiiiiM'titiitiLiii Vorrat an Verdünnungsmittel erforderlieh. Wie bereits erwähnt, kommt physiologische Kochsalzlösung in Frage (0.^l)'/cig oder bei erhöhter llamolyseresistenz der Schaferythrozyten O.X.V&ig). An Stelle von physiologischer Kochsalzlösung kann auch Kolmer-Lösung. welche neben Kochsalz auch Magnesiumsulfat enthält. Lagfes-Pufferlösimg. die neben Kochsalz auch einen K Na-Phospatpuffer enthält. Osier-Strauß-Meier-Lösung oder eine ähnliche Lösung verwendet werden. Die Verwendung von Lösungen, die Magnesium und/oder Calciumioncn enthalten, ist im allgemeinen vorteilhaft, da die Lnzymreaktionen der Komplcmenlbindungsrcaktion zweiwertige Kationen als Cofaktoren erfordern. Zur Stabilisierung enthalten die Verdünnungslösungen im allgemeinen Zusätze wie Phenol (z. B. 0.3 Gew.%).

Die praktische Durchführung serologischer Tests mit Hilfe der KoniplemeiHbindungsreaktion ist außerordentlich aufwendig, da einerseits die Rcaktanten in ihrer Aktivität je nach Herstellung stark schwanken und verschieden schnell Aktivitätsverluste bei der Lagerung erleiden, und weil andererseits eine Abstimmungder Aktivitäten der Reaktanten aufeinander erforderlich ist. Daß eine Abstimmung der Aktivitäten erforderlich ist. ist leicht einzusehen: Wäre z. B. erheblich mehr Komplement im Testsystem vorhanden. als zur Auslösung der Patientenantikörpcr-Antigen-Reaktion erforderlich, so würde in jedem Falle eine schnelle Hämolyse erzielt: der Test würde also weniger empfindlich oder gar völlig bedeutungslos. Uni_u:- kehrt wird der Test bei Unterschuß an Komplement überempfindlich, was zu fälschlich positivem Testergebnis führen kann. Für die Konzentrationseinstellung der beiden Komponenten des hämolytischen Systems zueinander gilt Ähnliches wie für die Konzentrationseinstellung des Komplements zum hämolytischen System. Auch hier müssen die Erythrozyten-Suspension und die Ambozeptor-Gebrauchsverdünnung aufeinander abgestimmt sein. Dabei wird die Ambozeptorgebrauchslösung gewöhnlich so eingestellt, daß sie etwa die zweifache zur vollständigen Hämolyse bei Komplementüberschuß erforderliche Mindestkonzentration aufweist. Im folgenden wird, wenn nichts anderes ausdrücklich vermerkt wird, immer davon ausgegangen, daß die Reaktanten in, wie oben beschrieben, aufeinander abgestimmten Mengen zusammengebracht werden. Mischungen der Reak-

(•inten werden tier Einfachheit halber durch Aneinanderreihen der oben genannten Abkürzungen gekennzeichnet. »EAK« bedeutet beispielsweise eine Mischung von Hammel- bzw. Schaferythrozyten (/·.'). gegen Hammelcrythrozytcn scnsihilisierter Ambo-/eplorlösung (A) und Komplement (K) in aufeinander abgestimmten Konzentrationen. Üblicherweise werden.;T.»bci die Lösungen /·.', A, K. V und Αχ jeweils etwa 0.2Ü ml ausmachen.

Her Hauptversuch, also die Untersuchung des Patientunserums, wird in der Weise durchgeführt, dall in einem Teströhrehen das System VKAg hergestellt und 30 Minuten lang bei +37" C inkiibiert wird. Dieser erste Schritt des Hauptversuches wird im allgemeinen als »Hindung« bezeichnet. Im Anschluß daran wiril das hamolytischc System EA zugesetzt und das erhaltene System PEAKAy₁ erneut bei 37" C inkubiert. Die Dauer der zweiten Inkubation betragt im iiiij;CiViCM"iOi*i COcHiiiiiS Civvti .ni iviitlllieil. Viii MCIt JC-tlocli in Abhängigkeit von den genauen Konzcntrationsvcrhällnissen. Im Zweifelsfallc kann die Inkubationsdauer für den zweiten Schritt des Hauptversuehcs durch ein Vergleichsexperiment mit nicht-cigenhemmendem Serum eines Gesunden ermittelt werden. Das hiimolytischc System ( EA) wird vor Zusatz zum System VKAf; durch Inkubieren bei 37° C »sensibilisiert«.

Ein entsprechender Versuch wird als sogenannte Serum-Konlrolle ohne Verwendung von Antigen durchgeführt, wobei im übrigen wie im Hauptversuch verfahr.n wird. Die Serum-Kontrolle am System VEA K dient zur Prüfung des Patientenserums auf Eigenhemmungsneigung. da nur im Falle eines eigenhemmenden Serums die Hämolyse bei Abwesenheit von Antigen ausbleibt oder geschwächt wird. Es ist zweckmäßig, durch weitere Inkubations-Vorversuche zu ermitteln, ob die Systeme (E) und (EA) Spontanhamolyse zeigen, was sie für die Durchführung der Komplcmentbindungsreaktion unbrauchbar macht. Ferner ist es zweckmäßig, eine sogenannte Systemkontrolle vorzunehmen, um sicherzustellen, daß das System EAK Hämolyse zeigt.

Die Bestimmung des Hämolysegrades wird jeweils visuell oder photometrisch in bekannter Weise vorgenommen.

Die Notwendigkeit, die Versuchssysteme jeweils aus einer Vielzahl von Lösungen (6 Lösungen im Hauptversuch, 5 Lösungen bei der Serumkontrolle) zusammenzustellen, macht die Durchführung der Komplementbindungsreaktion noch aufwendiger, als sie wegen der Konzentrations- bzw. Aktivitätseinstellung der Reaktanten aufeinander ohnehin schon ist. Erfahrungsgemäß führt die Notwendigkeit, eine außerordentliche Vielzahl von Einzelpipettierungen vornehmen zu müssen, zu Fehlern in der Versuchsdurchführung.

Eine Straffung der Maßnahmen zur Durchführung der Komplementbindungsreaktion kommt bisher schon deshalb nicht in Frage, weil wegen der durchzuführenden Haupt- und Kontrollversuche (PEAKAg, PEAK, EAK, EA, E) eine getrennte Lieferung der Reaktanten prinzipiell erforderlich ist. Eine Vereinigung mehrerer Reaktantenlösungen zu einer gemeinsamen Lösung schied jedoch auch aus anderen Gründen aus: Da die Reaktantert erhebliche Stabilitätsunterschiede aufweisen, bleibt die korrekte Aktivitätseinstellung der Reaktanten aufeinander in gemeinsamer Lösung nur vorübergehend erhalten; ferner reagieren die Reaktanten in gemeinsamen Lösungen miteinander.

Ls bestand also die Aufgabe, für den Arzt bzw. das serologisch arbeitende Laboratorium eine Moglichkeit zu schaffen, die Komplcmenlbindungsrcaktion zuverlässig in einfacher Weise durchzuführen, ohne daß dazu aufwendige Einstellungen der Reaktanten-Aktivitäten aufeinander erforderlich sind.

Die CH-PS 51° 172 schildert die bestimmte ra'umliehe Ausgestaltung eines Testgerätes für immunologische Untersuchungen, beispielsweise zur Bestimmung der Anwesenheil von Schwangcrschaftshormoncn im weiblichen Urin. Inder DT-OS 2019 190winl ein Tcstplättchen zur Durchführung und Beobachtung eines immunochemischcn oder diagnostischen Tests auf seiner Oberfläche geschildert. Beide Vorschläge aus dem Stand der Technik sehen vor, daß Testreagentien in konservierter F^;orm auf bzw. in dem zum lest Omgcsci/.icn Gcicti vui liegen. Ntineic riiiiwcise

ao auf eine verein/achte Durchfuhrung der Komplementbindungsrcaktion finden sich hier jedoch nicht Die geschilderte Aufgabe wird ausgehend von einem Verfahren zur Durchführung serologischer Untersuchungen nach dem Prinzip der Komplementbindungsrcaktion durch Umsetzung der Reaktantcn

1. Patientenserum

2. Erythrozyten

3. für die Erythrozyten spezifische Ambozcptorcr

4. Komplement und

5. Antigen oder nicht zu 3. gehörige Antikörper dadurch gelöst, daß die Reaktanten der Komponente 1 mit den Komponenten 4 und 5 in Gegenwart der Komponente 3 durchgeführt wird.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine gebrauchsfer tige, in fester Form konservierte Reaktanten enthaltende Schnelltcstpackung für die Durchführung des Verfahrens, die gekennzeichnet ist durch einer gleichzeitig auch als Reaktionsgefäß dienenden Behälter, der den Reaktanten 3. sowie wenigstens einer der Reaktanten 4. und 5. in für die Durchführung des Tests aufeinander abgestimmten Mengen gemeinsarr cnthält.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise so verfahren, daß man in einem Haupt- unt einem Vergleichsversuch zunächst eine Mischung inkubiert, welche sämtliche zur Durchführung dei Komplementbindungsreaktion erforderlichen Reaktanten außer den Erythrozyten in aufeiannder abgestimmten Mengen enthält, und daß man der Mischung eine in bekannter Weise auf die Mengen der übriger Reaktanten eingestellte Erythrozyten -Menge zusetzi und anschließend erneut inkubiert, wobei die Inkubationsdauer jeweils etwa 10 Minuten bis 2 Stunden vorzugsweise etwa 25 bis 65 Minuten beträgt.

Der wesentliche Unterschied zwischen dem alter und dem neuen Verfahren liegt beim Hauptversuch darin, daß nach dem neuen Verfahren nicht das System PKAg (L, 4., 5.), sondern das System PAKAg (l.,3.,4., 5.) der Erst-Inkubation (»Bindung«) unterworfen wird. Dafür unterbleibt die »Sensibilisierung« des Systems EA durch Inkubation. Der wesentliche Unterschied gegenüber dem Serumkontrollversuch nach dem herkömmlichen Verfahren besteht darin, daß das System PAK (L. 3., 4.) der Erstinkubation unterworfen wird, nicht dagegen das System PK (L. 4.). Selbstverständlich kann das vorstehend beschriebene Verfahren auch mit auf konventionelle Weise gelagerten oder frisch hergestellten Reaktanten

durchgeführt werden.

Wesentlich ist fiir die Hrfindiing weiterhin die überraschende Tatsache,daß große Mengen von hämolytischen Ambozcptor, Komplement und Antigen (gege benenfalls Antikörper) in ihren Konzentrationen bzw. Aktivitäten aufeinander eingestellt und in durch Tiefgefrieren oder Gefriertrocknen konservierten Portionen in Schnelltcsipackungen gelagert werden können, ohne daß bei der Lagerung ein störend ungleichartiger Aktivitütsabfall der Reaktanten verschiedener Schnclltcstpackungcn auftritt. Bs wurde ferner gcfun den. daß der Aktivitütsabfall der konservierten Reaktanten in einer Schnelltestpackung gering ist.

Die erfindungsgemäßc .Schnelltestpackung besteht im allgemeinen aus einem Behälter und einer Verschlußkappe, wobei beide in verschiedensten Formen vorliegen können. Der Behälter und vorzugsweise auch die Verschlußkappe soll jedoch gegenüber den emgesei/.ieii Rcakiuuiciiiusuiigcii cnciüiMüu iiici't Sciii. Beispielsweise sind Glasbehälter, die mit den für Arzneimittelpackungen üblichen Kunststoffstopfen bzw. -Verschlußkappen verschließbar sind, geeignet. Der Behälter kann auch mehrere Innenräume für getrennte Lagerung von Reaktanten aufweisen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der neuen Schnelltestpackung ist diese als Einweg-Wegwerfpakkung ausgebildet, die zugleich als Reaktionsgefäß für die Testdurchführung geeignet ist. In diesem Fall weist die neue Schnelltestpackung vorzugsweise die Form der für die Durchführung der Komplementbindungsreaktion gebräuchlichen Tcströhrchen auf und ist aus Glas oder einem anderen durchsichtigen Material gefertigt; ferner enthält sie die Reaktanten in für die Durchführung eines Einzeltests geeigneter Menge.

Die in der neuen Schnelltestpackung enthaltenen Reaktanten sind in fester Form, insbesondere durch Gefriertrocknung oder Tiefgefrieren bei Temperaturen unterhalb —21° C konserviert. Dabei sind gefriergetrocknete Reaktanten besonders geeignet sowie tiefgefrorene Lösungen der Reaktanten, welche bei Temperaturen unterhalb —30 bis —35° C, vorzugsweise unterhalb — Z3° C, schnell eingefroren worden sind. Nach dem Einfrieren der Reaktantenlösungen sind diese bei Temperaturen unter —21° C, vorzugsweise unter —40° C, insbesondere unter — 55° C, aufzubewahren.

Sind die in der neuen Schnelltestpackung enthaltenen Reaktanten durch Tiefgefrieren konserviert, so können sie zum Gebrauch z. B. durch Stehenlassen bei Raumtemperatur aufgeschmolzen und anschließend wie auf herkömmliche Weise hergestellte Lösungen unter Zusatz der noch fehlenden Lösungen weiter behandelt werden. Sind die in der neuen Schnelltestpackung enthaltenen Reaktanten durch Gefriertrocknung konserviert, so werden sie durch Zugabe von Lösungsmittel, beispielsweise physiologischer Kochsalzlösung, bzw. durch Zugabe weiterer Reaktanten in einer überschüssigen Menge Lösungsmittel in Lösung gebracht.

Bei der Gefriertrocknung einzelner Reaktanten kann es zweckmäßig sein, ein inertes Trägermaterial zuzusetzen; als solches kann beispielsweise Humanalbumin dienen. Es ist nicht erforderlich, bei der Gefriertrocknung einzelner Reaktanten eine Lösung mit so viel Lösungsmittel einzusetzen, wie bei konvendoneller Durchführung der Komplementbindungsreaktion eingesetzt werden würde. Vielmehr können zur rationelleren Trocknung konzentrierte Reaktantenl.ösungen vielfach eingesetzt werden. In diesem Falle weist der gefriergetrocknete Reaktant, d. h. der bei der Gefriertrocknung verbleibende Rückstand einer konzentrierteren Reaktanten-Lösiing, einen geringe ren Gehalt an Begleitstoffen, beispielsweise anorganischen Salzen, auf, als nötig wäre, um durch Zusatz von destilliertem Wasser eine gebrauchsfertige Reaktanteiii-Lösung herzustellen. Bei der Zugabe von Lösungsmittel zu gefriergetrockneten Reaktanten ist

ίο deshalb der Gehalt dieser Reaktanten an Bcglcitstoifen insbesondere anorganischen Salzen zu berücksichtigen; sind sämtliche in der neuen Schnelltestpakkung enthaltenen Reaktanten in gefriergetrockneter Form konserviert, so kann es zweckmäßig sein, bei der Lieferung der Schnelltestpackung in der Konzentration auf den Begleitstoffgehalt der Reaktanten ein gestellte Verdünnungsmittel mitzuliefern.

Im allgemeinen liegen von den in einer erfindungs-

^ctVlcJDci'i jCni"icmcSip<iCKüi"ig CriinüitCnCn rvCcirvtämCil entweder alle in gefriergetrockneter Form oder alle in tiefgefrorener Form vor; es bestehen jedoch keine grundsätzlichen Bedenken gegen Mischformen, die einen Teil der Reaktanten in tiefgefrorener, einen anderen Teil in gefriergetrockneter Form enthalten.

Im Falle der Gefriertrocknung ist es im allgemeinen erwünscht, die für die gebrauchsfertige Lösung erforderlichen Salze mit dem zur Versuchsdurchführung zugegebenen Lösungsmittel einzubringen. Es wurde nämlich beobachtet, daß mangelhafte Stabilität gefriergetrockneter Reaktanten für die Komplcmentbindungsreaktion weitgehend auf die Anwesenheit von Salzen, insbesondere von hygroskopischen Erdalkalisalzen zurückzuführen ist. Sorgt man für weitgehende Abwesenheit der genannten Salze, so wird eine stark erhöhte Stabilität der Reaktanten erreicht.

Im Falle der Konservierung durch Tiefgefrieren kann es zweckmäßig sein, die einzelnen Lösungen so einzustellen, daß die bei Aufschmelzen und Vermischen resultierende Lösung einen relativ niedrigen NaCl-Gehalt von beispielsweise 0,85 Gew.% aufweist. In diesem Falle kann eine erhöhte Hämolyseresistenz der Erythrozyten zu einem gewissen Grade ausgeglichen werden, ohne daß es nötig wäre, die Erythrozyten-Suspension zu verwerfen. Bei Verwendung von Erythrozyten normaler Hämolyse-Empfindlichkeit ist eine Gesamt-NaCI-Konzentration von 0,90 Gew.% gewöhnlich erwünscht, diese kann im Falle einer niedrigeren NaCl-Konzentration der tiefgefrorenen Lösung eingestellt werden durch Zugabe von NaCl-Konzentrat zum Konzentrationsausgleich.

Die Reaktanten sind in der neuen Schnelltestpakkung vorzugsweise voneinander getrennt aufbewahrt. Die Trennung kann beispielsweise durch Einfrieren bzw. Gefriertrocknen der Reaktantenlösungen an verschiedenen Stellen der Schnelltestpackung geschehen, sie kann aber auch dadurch erreicht werden, daß zunächst eine Reaktantenlösung eingefroren wird, diese mit beispielsweise physiologischer Kochsalzlösung überschichtet wird, worauf die Trennschicht ein-

gefroren und schließlich selbst mit einer weiteren Reaktantenlösung überschichtet wird. Dabei ist es zweckmäßig, so zu arbeiten, daß keine wesentliche Vermischung der Reaktantenlösungen auftritt. Die getrennte Lagerung der Reaktanten kann auch so erreicht werden, daß ein Teil der Reaktanten in der Verschlußkappe der Schnelltestpackung konserviert (worunter im folgenden Konservierung durch Gefriertrocknung oder Tiefgefrieren verstanden wird)

wird, während tier verbleibende Teil der von der Sch nc 11 test packung aufzunehmenden Reaktanten beispielsweise auf dem [Joden der Packung konserviert wird. Andere Arten, die Reaktanten voneinander getrennt zu lagern, sind möglich.

Die getrennte Lagerung der einzelnen Reaktanten ist dann von Bedeutung, wenn eine verlängerte Ge hrauchsfähigkeit der Schnelltestpackung erwünscht wird. Soll clic Schnelltestpackung in relativ kurzer Zeit, beispielsweise innerhalb weniger Tage bis zu einer Woche nach ihrer Herstellung verwendet werden, so kann im allgemeinen auf getrennte Lagerung verzichtet werden. Die Dauer der Gebrauchsfähigkeit der Schnelltestpackung ist bei gemeinsamer Lagerung der Reaktanten im Einzelfall zu ermitteln.

Obwohl es meist vorteilhaft ist, die einzelnen Reaktanten in der neuen Schnelltestpackung getrennt voneinander zu lagern, da in diesem Falle Reaktionen wahrend der Lagerung verhindert werden, bestehen keinerlei Bedenken, gefriergetrocknete Reaktanten miteinander zu mischen, insbesondere, wenn dafür gesorgt wird, daß die Restfeuchtigkeit der gefriergetrockneten Stoffe niedrig ist. Im allgemeinen soll die Restfeuchtigkeit unter 1 Gew.%, vorzugsweise unter 0,5 Gew.%, liegen. Auch im Falle der Gefriertrocknung einzelner Reaktanten ist es vorteilhaft, die Lagerung bei Temperaturen unterhalb Zimmertemperatur, vorzugsweise bei Temperaturen unter etwa 5 ° C, vorzunehmen. Besonders günstig i;;. insbesondere wenn jahrelange Lagerung beabsichtigt ist. Lagerung auch der gefriergetrockneten Produkte bei Temperaturen unterhalb von etwa —21° C.

Die Konzentrationen bzw. Aktivitäten der einzelnen in der neuen Schnelltestpackung enthaltenen Reaktanten sind aufeinander abgestimmt in prinzipiell (qualitativ) gleicher Weise wie bei der Beschreibung des herkömmlichen Verfahrens zur Durchführung der Komplementbindungsreaktion dargelegt. Hinsichtlich der quantitativen Titer-Einstellung der Reaktanten sind jedoch andere Verhältnisse als bei der konventionellen Durchführung der Reaktion besonders bevorzugt. Die Ambozeptor-Gebrauchsdosis ist nämlich vorzugsweise wenigstens etwa 25% höher als die übliche Gebrauchsdosis. Sie liegt im allgemeinen bei etwa dem 5- bis 16fachen der bei 60minütiger Inkubation bei 37° C gerade noch lösenden Ambozeptordosis. vorzugsweise bei etwa dem 6- bis lOfachen.

Beim Komplement kann bereits eine Gebrauchsdosis verwendet werden, die nur etwa 10-25% höher liegt als die Komplementeinheit. Das Verfahren kann auch bei Einsatz der Reaktanten in den zur Zeit üblichen Mengenverhältnissen (Gebrauchsdosen), insbesondere bei Inkubationsdauer von etwa 30 bis 100 Minuten durchgeführt werden. Die günstigste Inkubationsdauer kann leicht ermittelt werden.

Die neue Schnelltestpackung kann die Reaktanten-Kombinationen AK, AAg und AKAg enthalten. Wie bereits ausgeführt, ist es meist vorteilhaft, die Reaktanten voneinander getrennt zu lagern; dies gilt insbesondere für die Lagerung von K und Ag, welche in besonderem Maße zu unspezifischer Reaktion bei gemeinsamer Lagerung neigen. Die Reaktanten der Kombinationen AK und AAg lassen sich jedoch im allgemeinen auch tiefgefroren ohne weiteres gemeinsam lagern, wenn eine Lageningsdauer von etwa 9 Monaten nicht überschritten wird. Die Haltbarkeit sollte jedoch bei gemeinsamer Lagerung von Reaktanten im Einzelfall geprüft werden.

Von besonderer Bedeutung sind erfindungsgemäl.V Schnelltestpackiingcn. die die Reaktanten-Kombination AKAg (bzw. AK Antikörper) enthalten, d.h. sämtliche zur Durchführung der Komplementbiiidungsrcaktion erforderlichen Reaktantei mit Ausnahme der Erythrozyten und des I'atientenscriims. Bei der Reaktanten-Kombination AKAg kommen verschiedene Möglichkeiten der Lagerung in Frage: Die getrennte Lagerung sämtlicher Reaktanten, also

ίο A/Κι Ag, und die teilweise getrennte Lagerung, bei welcher eine tier Komponenten von den anderen getrennt gelagert wird. Bei teilweiser Trennung der Reaktanten beider Lagerung kommen insbesondere die Anordnungen AK'Ag und AAg K in Frage. Die Lagerungsanordniing KAg/A scheidet im allgemeinen wegen unspezifischer Reaktion zwischen K und Ag aus. Sie kann selbstverständlich im Einzelfall verwirklicht werden, wenn entsprechende Vorversuche im Faiie eines bestimmten Antigens die Verträglichkeit

ao von K und Ag bei der Lagerung ergeben haben. Entsprechendes gilt für die gemeinsame Lagerung aller drei Komponenten, die gewöhnlich ausscheidet. Hs gilt im übrigen, wie bereits ausgeführt, daß die ge meinsamc Lagerung unverträglicher Reaktanten nach

as getrennter Gefriertrocknung möglich ist. Unter den genannten Lagerungsanordnungen der bevor/igten Ausführungsform der Erfindung, welche die Reaktanten-Kombination AKAg enthält, ist die Anordnung AKAg und die Anordnung A/K, Ag von besonderer Bedeutung.

In der Praxis wird in der Regel so verfahren werden, daß dem Benutzer der Schnelltestpackungen jeweils zwei verschiedene Varianten der Schnelltestpackung zur Verfugung gestellt werden, nämliche eine Packung zur Durchführung des Hauptversuches, in welcher die Reaktanten A, K und Ag enthalten sind, sowie eine Schnelltestpackung, welche zur Durchführung der Vergleichsversuche nur zwei der Peaklanten enthält. Dabei stammen die in beid '.n Typen von Schnelltestpackungen enthaltenen Reaktanten vorzugsweise von der gleichen Charge. Auch hier ist die Ausführungsform der Erfindung, bei welcher ein Teströhrchen die Komponenten A and K enthält, sehr vorteilh;¹."'.; die Herstellung wird dadurch stark vereinfacht, daß nur eine Art von Reaktanten enthaltendem Teströhrchen hergestellt zu werden braucht. Je nachdem, ob dieses eine die Reaktanten A und K enthaltende Teströhrchen mit einer Antigen enthaltenden Verschlußkappe oder mit einer leeren Verschlußkappe verschlossen wird, entsteht eine erfindungsgemäße Schnelltestpakkung zur Durchführung des Hauptversuches oder zur Durchführung der Vergleichsversuche. Selbstverständlich kann, wie unten gezeigt wird, die Schnelltestpackung, welche alle drei Reaktanten. davon das Antigen in der Verschlußkappe enthält, auch zur Durchführung der Vergleichsversuche verwendet werden; dies ist jedoch mit an sich vermeidbaren Antigenverlusten verbunden. Bei der Herstellung kann es zweckmäßig sein, etwa für 40% der A und K enthaltenden Teströhrchen Antigen enthaltende Verschlußkappen herzustellen.

Sollen mehrere Patientenseren gleichzeitig geprüft werden, so kann eine Vielzahl erfindungsgemäßer Schnelltestpackungen jeweils paarweise für Hauptversuch und Serumkontroile in einem Ständer aneeordnet werden, in welchem die verschiedenen Testsysteme hergestellt und inkubiert werden. Selbstverständlich können die Schnelltestpackungen bereits im

Ständer für mehrere Parallelversuche geliefert werden; ebenso können die einzelnen Testsysteme zur Durchführung mehrerer Parallelversuche bereits starr miteinander verbunden geliefert werden, z. B. in Form einer Tüpfu'platte. Dabei kann ein Teil der Bohrungen beispielsweise die Reaktanten A, K und Ag enthalten, ein anderer Teil die Reaktanten A und K. Auch hier ist eine Vielzahl von Variationen möglich.

Bisher ist ausschließlich die Verwendung der neuen Schnelltestpackung zum Nachweis bestimmter Antigene über die ihnen entsprechenden Antikörper im Patientenserum diskutiert worden. Das zugrunde liegende Prinzip, die Bildung spezifischer Antigen-Antikörper-Komplexe über den Komplementverbrauch nachzuweisen, läßt sich jedoch selbstverständlich auch zur Umkenrung des Verfahrens heranziehen: Das Antigen selbst kann im Patientenserum nachgewiesen werden, wenn für dieses Antigen spezifische Antikörper zur Verfügung stehen. Dies ist insbesondere im haue der Serumhepaiitis (Australia Antigen) von Bedeutung. Die Einzeltestpackung enthält in diesem Falle an Stelle des Testantigens Testantikörper, also neben dem hämolytischen Ambozeptor beispielsweise einen Australia-Antigen-spezifischen Ambozeptor.

Die erfindungsgemäße Schnelltestpackung kann auch unter einer einzigen Verschlußkappe mehrere Kammern aufweisen, von welchen beispielsweise eine zur Durchführung des Hauptversuches, eine andere zur Durchführung der Serumkontrolle vorgesehen ist. In diesem Fall können die Kammern z. B. jeweils die zur Durchführung der Versuche erforderlichen Einzelportionen der Reaktanten. wobei natürlich die Reaktanten jeder Einzelportion vorzugsweise voneinander getrennt gelagert sind, enthalten.

Statt eines einzigen Antigens kann die erfindungsgemäße Schnelltestpackung eine Antigenkombination enthalten. Auf diese Weise wird ein einfacher sogenannter Screening-Test auf mehrere Erreger ermöglicht.

Zur Durchführung von Vergleichsversuchen können auch erfindungsgemäße Schnelltestpackungen vorteilhaft sein, welche neben den bereits genannten Bestandteilen auch in separater Lagerung konserviertes. Test-positives Patientenserum, schwach-positives l'atientenscrum oder Test-negatives Patientenserum enthalten.

Die erfindungsgemäße Schnelltestpackung stellt einen außerordentlichen Fortschritt auf dem Gebiet der ungewandten Serologie dar. Eine außerordentliche Vielzahl wichtiger serologischer Untersuchungen wird erstmalig einem weiten Kreis von Benutzern zugänglich. Bei Verwendung der neuen Schnelltestpackung ist die Durchführung von auf der Komplementbindungsreaktion basierenden Versuchen nicht mehr aufwendiger als die meisten heute im Rahmen der allgemein-medizinischen Praxis durchgeführten Laboruntersuchungen. Dadurch wird ein »Screening«, also die Vorsorgeuntersuchung sehr vieler Patienten in einem Umfange möglich, der bisher wegen der Komplexität der erforderlichen Maßnahmen kaum verstellbar war. Insbesondere kann durch die erfindungsgemäßc Schnelltestpackung die diagnostische Versorgung von Gebieten verbessert werden, die sich nicht im unmittelbaren Hinzugsbereich großer diagnostischer Laboratorien befinden.

Doch auch für das eigentliche diagnostische Laboratorium bedeutet clic Erfindung einen erheblichen Fortschritt. Da die aufwendigen Dosierungen und Aktivitätseinstellungen der Reaktanten maschinell beim Hersteller vorgenommen werden, entfallen beim Verbraucher, also dem serologischen Laboratorium, die lohnintensivsten Maßnahmen der Untersuchung. Gerade für das serologisch arbeitende Laboratorium ist die Zusammenstellung mehrerer bzw. vieler Schnelltestpackungen zu einer Einheit, die die Untersuchung mehrerer Patientenseren nebeneinander gestattet, von großer Bedeutung.

Typische Beispiele für die Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Schneütestpackungen sind in den Zeichnungen erläutert.

Fig. 1 zeigt im Querschnitt eine Schnelltestpakkung, bestehend aus einem Glasbehälter 1 von etwa 10 cm' Fassungsvermögen, welcher mit einer Kunststoffkappe 2 verschlossen ist. Die Schnelltestpackung der Fig. 1 enthält einen für Schaf-Erythrozyten spezifischen Ambozeptor 3 und Meerschweinchen-Komplement 4. beide in tiefgefrorener Form. Ambozeptor 3 und Komplement 4 sind voneinander getrennt gelagert, was durch Schräglage der Schnelltestpakkung bei Einfüllen und Tiefgefrieren des Komplements und anschließende entgegengsetzte Schräglage bei Einfüllen und Tiefgefrieren des Amnozeptors erreicht wurde. Bei dem hämolytischen Ambozeptor handelt es sich um Kaninchenserum, welches in bekannter Weise gesen Schafblutkörperchen sensibilisiert und schließlich Komplement-inaktiviert worden war. Der eingesetzte Ambozeptor (0.1 ml) war im Verhältnis 1 : 250 verdünnt und wies einen Titcr von 1 : 4000 auf. Das Meerschweinchen-Komplement (ebenfalls 0,1 ml) war im Verhältnis 1 : 9 verdünnt und wies einen Titer von 1 : 90 auf.

Da das Komplement einen Titer von 1 : 90 aufwies, wobei sich die Titerbestimmung auf 0,5 ml-Proben und 2%ige Erythrozytensuspension bezieht, entsprechen 0,1 ml Komplement in Verdünnung 1 : 9 zwei Komplcmenteinheiten, also der zweifachen zur vollständigeji Lösung erforderlichen Mindestmenge. Da ein Ambozeptor vom Titer 1 : 4000 verwendet wurde, wobei sich der Titcr auf eine Lösungsmenge von 0,25 ml (die nämlich zusammen mit 0,25 ml Erythrozyten-Suspension die bei der Standardisierung verwendeten 0,5 ml hämolytisches System ergeben), entsprechen 0,1 ml Ambozeptor der Verdünnung V₂₅₀ etwa 6,4 Ambozcptor-Einheiten, also dem 6,4fachen der bei cinstündiger Inkubation bei 37° C gerade noch lösenden Ambozeptordosis.

Fig. 2 zeigt eine Schnelltestpackung, welche, wie die Schnclltestpackung der Fig. 1 aus einem mit einem Stopfen 2 versehenen Behälter 1 besteht, aber neben Ambozeptor 3 und Komplement 4 noch Antigen 5 enthält. Dabei ist das Antigen 5 von den übrigen Reaktanten 3 und 4 getrennt in einem zum Inneren der Packung hin offenen Hohlraum der Verschlußkappe 2 tiefgefroren aufbewahrt. Ambozeptor 3 und Komplement 4 sind entsprechend der Anordnung in Fig. 1 getrennt voneinander gelagert. Die Menger und Konzentrations- bzw. Aktivitätsverhältnisse vor Ambozeptor und Komplement entsprechen denjenigen der Fig. I. Bei dem Antigen 5 (0,5 ml) handelte es sich um handelsübliches Cardiolipin-Antiger I : 150.

Ein weiteres Beispiel der erfindungsgemäßer Sehnelltcstpackung entspricht ebenfalls der Anord nung der Fig. 2; an Stelle von 0.1 ml Ambozeptoi der oben angegebenen Verdünnung wurden 0,1 m

der gleichen Ambozcptorlösung, jedoch mit 0,55 ml (),85%iger physiologischer Kochsalzlösung im Verhältnis 1 : 6,5 verdünnt, verwendet.

Fig. 3 zeigt eine erfindungsgemäße Schnelltestpakkung, welche als Reaktionsgefäß für die Durchführung des Tests ausgebildet ist und aus einem gläsernen Teströhrchen 6 besteht, welches mit einer Verschlußkappe 7, die im übrigen der Kappe 2 prinzipiell entspricht und einen entsprechenden Kohlraum aufweist, verschlossen ist. Das Teströhrchen enthält 0,1 ml Komplement - Verdünnung und Titer wie oben angegeben -, welches am Boden des Teströhrchens bei

- 35 ° C eingefroren worden ist. Das Komplement ist mit 0,55 ml 0,85%iger physiologischer Kochsalzlösung 8 überschichtet. Die physiologische Kochsalzlösung ist schließlich mit 0,1 ml Ambozeptor - Verdünnung und Titer wie oben angegeben - überschichtet. Im Hohlraum der Verschlußkappe 7 sind 0,5 ml Antigen (Reiter-Antigen 1 : 8) eingefroren. Die Schnelltestpackung enthält Stickstoff als Schutzgas.

Fig. 4 zeigt eine Schneiitestpackung, weiche derjenigen der Fig. 2 entspricht, in welcher jedoch die räumlich getrennte Lagerung der am Boden der Pakkung befindlichen Reaktanten durch eine Trennwand 9 erreicht wird. Die Ziffern 3 bis 5 haben die gleiche Bedeutung wie in Fig. 1 bis 3.

Fig. 5 zeigt eine erfindungsgemäße Schnelltestpakkung in Ampullcnform. Sie enthält ein Gemisch 10 von 0,1 ml Ambozeptor 1 : 50 und 0,1 ml Komplement 1 : 9 mit 0,8 ml 0,85%iger physiologischer Kochsalzlösung sowie eine Lösung aus 0,5 ml Cardiolipin-Antigen I : 150 und 0,8 ml 0,85 %iger physiologischer Kochsalzlösung.

Fig. fizeigt eine erfindungsgemäße Schnelltestpakkung, in welche zwei Reaktanten voneinander getrennt in dem Hohlraum der Verschlußkappe untergebracht sind. Dabei enthält die Verschlußkappe eine tiefgefrorene Lösung 11 aus 0,1 ml Ambozeptor 1 : 50 und 0.4 ml 0,85%iger physiologischer Kochsalzlösung sowie eine weitere tiefgefrorene Lösung aus 0,1 ml Komplement I : 9 und 0,4 ml 0,85%iger physiologischer Kochsalzlösung. Das Teströhrchen 6 enthält eine Lösung aus 0,5 ml handelsübliches Reiter-Antigen 1 : 8 und 0,8 ml 0,85%iger Kochsalzlösung.

Fig. 7 zeigt erfindungsgemäße Schnelltestpackungen im Tüpfclplatten-Verbund. Jede der Bohrungen 13 in einer aus Polymethacrylat gefertigten Platte 14 stellt eine erfindungsgemäße Schneiitestpackung dar. Jede der Bohrungen enthält entsprechend der in Fig. 1 gezeigten Anordnung getrennt gelagerte Reaktanten.

Fig. 8zeigt eine crfindungsgemaße Schnclltcstpakkung, welche der in Fig. 4 dargestellten Schnelltestpackung entspricht, jedoch gefriergetrockneten Ambozeptor 15 und gefriergetrocknetes Komplement 16 enthält. Die Gefriertrocknung wurde so vorgenommen, daß 0,1 ml Komplement - Verdünnung und Titer wie oben - mit einer Lösung von 0,0025 g Humanalbumin in 0,5 ml Wasser aufgenommen und in die eine der im Innenraum der Schnelltestpackung durch die Trennwand 9 gebildeten Kammern, gegeben wurden. Entsprechend wurde mit 0,1 ml Ambozeptorlösung

- Verdünnung und Titer wie oben - verfahren, wobei die andere Kammer verwendet wurde. Die Gefriertrocknung seihst wurde in üblicher bekannter Weise bei einer Anfangstemperatur von etwa —50° C vorgenommen.

Die crfindtingsgcmäßen Schnelllestpackungcn sind mit den für die Durchführung eines Einzeltests gewöhnlich besonders bevorzugten Reaktanten-Mengen illustriert worden. Es kommt bei der Komplement-Bindungsreaktion jedoch nicht auf die Absolul-

S mengen der Reaktanten an, sondern nur darauf, daß die einzelnen Reaktanten mengenmäßig aufeinander abgestimmt sind. Ein Einzeltest kann also im Prinzip mit beliebigen Vielfachen aller Reaktanten durchgeführt werden. Schnelltestpackungen für Untersuchungen im Mikromaßstab (bis 0,1 ml Gesamtvolumen aller Reaktanten) entsprechen also den in Fig. 1 bis 8 dargestellten Schnelltestpackungen prinzipiell, enthalten jedoch nur beispielsweise ein Zwanzigstel der Reaktantenmengen. Besonders geeignet für Untersuchungen im Mikromaßstab ist beispielsweise eine flache uhrglasförmige Schale wie in Fig. 9 dargestellt. Die Schale 17 weist einen Durchmesset von etwa 2 cm auf und enthält Ambozeptor, Komplement und Antigen in aufeinander zur Durchführung der Komplementbindungsreaktion abgestimmten Mengen als tiefgefrorene Tropfen 18 bis 20 ihrer Lösungen. Die Schale ist mit einem Stuck Kunststoff-Klebestreifen 21 abgedeckt. Entsprechende Tüpfelplatten sind ebenfalls besonders vorteilhaft. Ebenso wie die in der Schnelltestpackung enthaltenen Reaktantenmengen maßstäblich reduziert sein können, können auch größere Mengen in einer Schnelltestpackung vorliegen. Fig. 10 zeigt eine Schnelltestpackung, welche 50 ml Ambozeptor 22 (Verdünnung 1 : 1250, Titer 1 : 4000) und 50 ml Komplement 23 (Verdünnung 1 : 45, Titer 1 : 90), in einer mit einem Plastikstopfen 24 verschlossenen gläsernen Standflasche 25 enthält. Mit Ausnahme der in Fig. 8 dargestellten Schneiitestpackung enthalten alle Packungen der Beispiele die Reaktanten in tiefgefrorener Form.

Das neue Verfahren zur Durchführung der Komplementbindungsreaktion bzw. die Handhabung der Schnelltestpackung wird durch die folgenden Beispiele illustriert. Dabei wird die in Fig. 3 dargestellte Schnelltestpackung verwendet.

Zur Durchführung des Hauptversuches wird eine erfindungsgemäße Schnelltestpackung dem Tiefkühlschrank entnommen und durch Eintauchen in ein Wasserbad von 37° C aufgetaut. Durch das Auftauen

+5 bildet sich die Lösung AKAg, welcher 0,25 ml Patientenserum (Gewinnung siehe oben) zugesetzt werden. Die erhaltene Lösung PAKAg wird nun eine halbe Stunde lang bei 37° C inkubiert. Dabei findet eine Bindung statt, sofern das Patienten», ,um Antikörper, im vorliegenden Fall Lues-Antikörper, enthält: Es bilden sich unter Verbrauch des Komplements Antigcn-Antikörpe^-Komplcxe. Dieser Schritt des Verfahrens unterscheidet sich von dem entsprechenden Schritt bei konventioneller Durchführung der Komplementbindungsreaktion dadurch, daß während der Bindung der hämolytische Ambozeptor bereits zugegen ist.

Anschließend an die halbstündige Inkubation werden dem System 0,25 ml der 2%igen Schaf-Erythrozyten-Suspension zugesetzt, worauf erneut bei 37° C inkubiert wird. Die Inkubationsdauer in diesem zweiten Schritt beträgt ebenfalls eine halbe Stunde. (Sie hängt von der genauen Einstellung der Reaktanten aufeinander ab; da diese vom Lieferanten der Einzcltcstpackung vorgenommen wird, wird dem Benutzer vom Lieferanten zweckmäßigerweise ein Richtwert für die Inkubationsdaucr mitgeteilt. Die erforderliche Inkuhationsdauer. die im allgemeinen 30 Minuten

beträgt, ergibt sich jedoch aus einem Vergleichsversuch mit nicht-eigenhemrnendem Serum von Gesunden.)

Nach Ablauf der zweiten Inkubation wird das Testergebnis, d. h. der Hämolysegrad des Versuchsansatzes visuell oder photometrisch auf bekannte Weise ausgewertet.

Bei der Durchführung serologischer Untersuchungen sind Vergleichsversuche fast unerläßlich. Die obenaufgeführten Vergleichsversuche lassen sich elegant auch bei Verwendung der erfindungsgemäßen Einzeltestpackung durchführen, dabei wird auch zur Durchführung der Kontrollversuche das neue Verfahren verwendet:

Zur Durchführung der Serumkontrolle (Eigenhemmungstest) wird eine Einzeltestpackung dem Tiefkühlschrank entnommen, die Verschlußkappe, welche das Antigen enthält, wird entfernt, worauf der Inhalt des Teströhrchens im Wasserbad von 37° C aufgeschmolzen wfcrii unter Bildung der flüssigen Lösung AK. Dieser Lösung wird die gleiche Menge Patientenserum wie im Hauptversuch zugegeben, die Lösung wird durch Zugabe von physiologischer Kochsalzlösung auf die gleiche Flüssigkeitsmenge wie im Hauptversuch aufgefüllt. Das erhaltene System PAK wird nunmehr, um die Reaktionsverhä'tnisse denjenigen des Hauptversuches möglichst anzunähern, zunächst eine halbe Stunde lang bei 37° C inkubiert, worauf wie im Hauptversuch nach Zugabc der Erythrozytcn-Suspensionein zweites Mal inkubiert wird.

Die Interpretation des Ergebnisses ist die gleiche wie bei dem Serumkontrollversuch in konventioneller Durchführung.

Die Systemkontrolle im System EAK wirdentspre-

S chend der Serumkontrolle durchgeführt; die Antigen enthaltende Verschlußkappe wird entfernt, die Zugabe von Patientenserum unterbleibt jedoch.

Es verbleiben die Kontrollversuche in den Systemen EA und E. Die Prüfung der Erythrozyten-Suspension E auf Spontanhämolyse unter Inkubationsbedingungen ist selbstverständlich ohne weiteres möglich; die erfindungsgemiiße Einzeltestpackung ist dazu nicht erforderlich. Zur Prüfung des Systems EA, welches unter Inkubationsbedingungen keine Hämnlyse !.eigen darf, wird die Antigen enthaltende Verschlußkappe der Schnelltestpackung entfernt, der Inhalt des verbleibenden Teströhrchens im Wasserbad von 56° C aufgeschmolzen und 20 Minuten bei dieser Temperatur belassen. Die verbleibende Lösung A

_ao wird auf Raumtemperatur abgekühlt, mit der Erythrozyten-Suspension versetzt und etwa 30 Minuten lang bei 37° C inkubiert (der Test des Systems EA kann gewöhnlich unterbleiben, da in diesem System Spontanhämolyse, also Hämolyse in Abwesenheit von

a₅ Komplement, außerordentlich selten ist; ein Test des Systems EA zur Überprüfung von Ambo^cptor auf das Vorhandensein von Komplementspuren ist nicht erforderlich, da der eingesetzte Ambozeptor selbstverständlich bei der Herstellung vom Lieferanten überprüft wird).

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (8)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Durchführung serologischer Untersuchungen nach dem Prinzip der Komplementbindungsreaktion durch Umsetzung der Reaktanten

1. Patientenserum

2. Erythrozyten

3. für die Erythrozyten spezifische Ambozeptoren

4. Komplement und

5. Antigen oder nicht zu 3. gehörige Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion der Komponente (1) mit den Komponenten (4) und (5) in Gegenwart der Komponente (3) durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem Haupt- und einem Verg.V;chsversuch zunächst eine Mischung inkubiert, welche sämtliche zur Durchführung der Komplementbindungsreaktion erforderlichen Reaktanten außer den Erythrozyten in aufeinander abgestimmten Mengen enthält, und daß man der Mischung eine in bekannter Weise auf die Mengen der übrigen Reaktanten eingestellte Erythrozyten-Menge zusetzt und anschließend erneut inkubiert, wobei die Inkubationsdauer jeweils etwa 10 Minuten bis 2 Stunden, vorzugsweise etwa 25 bis 65 Minuten, beträgt.

3. Gebrauchsfertige, in fester Form konservierte Reaktanten enthaltende Schnelltestpakkung für die Durchführung ües Verfahrens nach Patentanspruch 1, gekennzeichnet durch einen gleichzeitig auch als Reaktioi.jgefäß dienenden Behälter, der den Reaktanten 3. sowie wenigestcns einen der Reaktanten 4. und 5. in für die Durchführung des Tests aufeinander abgestimmten Mengen gemeinsam enthält.

4. Schnelltestpackung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens einen der Reaktanten von wenigstens einem weiteren Reaktanten getrennt lagernd enthält.

5. Schnelltestpackung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sämtliche enthaltenen Reaktanten voneinander getrennt gelagert sind.

6. Schnelltestpackung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die in fester Form vorliegenden Reaktanten gefriergetrocknet oder bei Temperaturen unter —21° C, vorzugsweise unter — 40° C, tiefgefroren sind.

7. Schnelltestpackung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Glas oder einem anderen inerten durchscheinenden oder vorzugsweise durchsichtigen Material gefertigt ist.

8. Schnelltestpackung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem für die Durchführung der serologischen Untersuchung vorgesehenen Teströhrchen und einer Verschlußkappe besteht, welche einen zum Inneren der Pakkung hin offenen Hohlraum aufweist, wobei das Teströhrchen einen Teil der Reaktanten, vorzugsweise den für die Erythrozyten spezifischen Ambozeptor und das Komplement enthält und wenigstens ein weiterer Reaktant, vorzugsweise das Antigen bzw. der Antikörper in dem Hohlraum der Verschlußkappe gelagert ist.

¹J. Schnelltestpackung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie in von den übrigen Reaktanten getrennter Lagerung konserviertes, Test-positives oder Test-negatives Patientenserum enthält.

K). Schnelltestpackung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktant 3. in einer Menge vorliegt, die wenigstens etwa 25% höher isl als die übliche Gebrauchbdosis und vorzugsweise dem 5 - bis 16fachen der bei 6,)minütiger Inkubation bei 37° C gerade noch lösenden Ambozeptordosis entspricht.