DE2406362C2

DE2406362C2 -

Info

Publication number: DE2406362C2
Application number: DE2406362A
Authority: DE
Inventors: Gordon Lee Dallas Tex. Us Dorn
Original assignee: Jk And Susie Lwadley Research Institute And Blood Bank Dallas Tex Us
Current assignee: Jk And Susie Lwadley Research Institute And Blood Bank Dallas Tex Us
Priority date: 1973-02-12
Filing date: 1974-02-11
Publication date: 1988-02-18
Also published as: AU6522974A; JPS5642280B2; CA1021238A; IT1018621B; US3928139A; DE2406362A1; FR2217419A1; JPS49110822A; FR2217419B1; GB1458147A

Description

Die Erfindung betrifft die Gegenstände gemäß den Patentansprüchen 1 bis 14. Septikämie, also die Anwesenheit von pathogenen Mikroorga nismen im Blut, gehört zu den schwersten Infektionskrankheiten. Trotz einer großen Zahl von Antibiotika und Fungiziden beträgt die Mortalität der Septikämie etwa 25%. Wenn darüber hinaus die Septikämie von einem Schock begleitet ist, steigt die Mortalität auf über 60% an. Patienten mit zehrenden Krankheiten, oder nach schweren Operationen, oder Patienten, die Immunsuppresiva oder Zytostatika erhalten, sind besonders anfällig gegenüber Septikämie.

Zur Bekämpfung der Septikämie ist die frühzeitige Anwendung von geeigneten Antibiotika besonders wichtig: Es ist daher für den Arzt unbedingt notwendig, nicht nur so früh wie möglich zu erfahren, ob Septikämie vorliegt, sondern eben falls die Art der auslösenden Mikroorganismen und die Empfindlichkeit der Mikroorganismen gegenüber Antibiotika kennenzulernen. Die genaue Diagnose der Septikämie hängt daher von einer möglichst schnellen und wirksamen quantita tiven Analyse des Patientenblutes ab.

Bisher wurden im wesentlichen drei analytische Verfahren zur Bestimmung von Mikroorganismen in Körperflüssgkeiten durchgeführt. Das üblichste Verfahren ist die Kultur im flüssigen Brühmedium. Bei diesem Verfahren werden im allge meinen 5 bis 10 ml Blut aseptisch in eine Vakuumflasche eingebracht, die ein Nährmedium und ein für anaerobes oder aerobes Wachstum geeignetes Gasmedium enthält. Die Flaschen werden täglich auf sichtbares Wachstum untersucht. Wenn Wachstum festgestellt wird, oder am 2. und 10. Tag nach Beginn des Testes, werden 1 ml der Probe entnommen und auf Agar platten ausgestrichen. Falls Mikroorganismen vorhanden sind, bilden diese in etwa 24 Stunden Kolonien auf den Platten.

Ein anderes übliches Verfahren ist die sogenannte Gieß plattenmethode, bei der etwa 0,5 bis 1,0 ml Blut in 20 ml eines Nähragarmediums suspendiert und diese Mischung direkt auf eine Platte ausgegossen wird. Falls Mikroorganismen vorhanden sind, bilden sie in etwa 24 Stunden auf den Platten Kolonien.

Ein neuerdings entwickeltes Verfahren ist die sogenannte Filtrationsmethode. Bei diesem Verfahren werden zuerst die roten und weißen Blutkörperchen aus dem Serum einer Blut probe durch Fällung oder Zentrifugieren mit geringer Geschwindigkeit entfernt. Das verbleibende Serum wird dann durch einen Filter geschickt, das Teilchen mit der Größe von Bakterien oder darüber festhält. Diese Filter sind Filter aus einer festen Matrix mit sehr kleinen sich da durch erstreckenden Poren. Die Filter werden dann auf eine Nähragarplatte gelegt. Bei Anwesenheit von Mikroorganismen können diese durch Auswachsen von einzelnen Kolonien in etwa 24 Stunden festgestellt werden.

Keine der zuerst genannten drei analytischen Methoden führt zu einer schnellen Feststellung von Mikroorganismen in einer Blutprobe. Es wird darauf hingewiesen, daß der Tod bei einer schweren Infektion des Blutes innerhalb von 24 bis 48 Stunden eintreten kann und in der Tat in manchen Fällen eintritt, bevor das analytische Verfahren beendet ist. Darüber hinaus ist insbesondere die Flüssigagarmethode nicht quantitativ.

Ferner kann bei der Flüssigagarmethode ein Überwachsen durch schneller wachsende Mikroorganismen eintreten. Wenn eine Blut probe zwei oder mehr verschiedene Mikroorganismen enthält und wenn einer dieser Keime stärker wächst und weniger an fällig ist als die anderen, kann eine wesentlich schnellere Reproduktion in den angegebenen Medien eintreten, so daß gegebenenfalls vorliegende andere Mikroorganismen über wachsen werden. Es ist aber äußerst wichtig, daß der Arzt weiß, ob mehr als eine Keimsorte im Blut vorliegt, und zwar nicht nur aus der Sicht, daß ein geeignetes Antibiotikum für alle Mikroorganismen appliziert werden muß, sondern insbesondere wegen der Tatsache, daß die Anwesenheit von zwei oder mehr Mikroorganismenstämmen gleichzeitig im Blut anzeigt, daß das Abwehrsystem des Patienten am Zusammen brechen ist. Darüber hinaus ist es für den Arzt wichtig, die genaue Anzahl von Keimen im Blutstrom zu erfahren. Hieraus lassen sich Schlüsse auf die Schwere der Blutinfektion und die Dosierung der geeigneten Antibiotika ableiten. Die Gieß plattenmethode wird im allgemeinen als quantitativ betrachtet. Ein Nachteil der Gießplattenmethode besteht darin, daß bei diesem Verfahren offen gearbeitet wird, so daß die Platte von außen kontaminiert werden kann, indem beispiels weise Pathogene durch die Laboratmosphäre oder das Personal auf die Platte übertragen werden können.

Weiterhin führen die Flüssigagar- und Gießplattenmethoden nicht zu einer wirksamen Trennung der pathogenen Mikro organismen von gegebenenfalls im Blut vorliegenden anti mikrobiell wirksamen Faktoren. Insbesondere wird die phago zytische Aktivität der Granulozyten und Monozyten und die normale antibakerizid wirkende Aktivität der Serumfaktoren dahin wirksam, daß das Wachstum der zur Kultur isolierten Bakterien verringert wird. In einigen Fällen, wenn die Patienten vor Abnahme der Blutprobe bereits Antibiotika erhalten haben, können restliche Mengen der Antibiotika in den Proben zur Durchführung der drei beschriebenen Kultur verfahren vorhanden sein, die dann das Wachstum der Bakterien inhibieren können.

Zwar ist die Filtrationsmethode im allgemeinen dem Flüssig agar- und dem Gießplattenverfahren in der Bestimmungsmöglich keit für mehr als einen Keimtyp im Blut überlegen und ergibt darüber hinaus eine quantitative Analyse, aber auch diese Methode hat ihre Nachteile. Erstens besteht wie bei der Gießplattenmethode beim Filtrationsverfahren die Möglich keit einer äußeren Kontamination. Es ist für Bakterien ver hältnismäßig einfach, aus der Laborluft in die Probe während des Analysenganges einzudringen. Darüber hinaus kann die anfängliche Fällung oder das Zentrifugieren mit geringer Geschwindigkeit, die bei diesem Verfahren zur Trennung der roten und weißen Blutkörperchen aus dem Serum angewendet werden, dazu führen, daß pathogene Mikroben vorzeitig aus dem Serum vor dem Durchlaufen durch das Filter entfernt werden.

Darüber hinaus sind die bekannten Verfahren verhältnismäßig aufwendig und teuer. Das Filtrationsverfahren ist wahrschein lich das teuerste und die Flüssigagartechnik ist wahrschein lich die billigste, trotzdem sind alle diese Verfahren ver hältnismäßig teuer, und zwar nicht nur bezüglich der einge setzten Materialien, sondern insbesondere im Hinblick auf den Zeitverbrauch der Labortechniker.

Es besteht daher ein Bedürfnis nach einem Verfahren zum Nachweis von Keimen in Körperflüssigkeiten, das billig, verhältnismäßig einfach unter Verwendung von Standardlaborausrüstungen durchzuführen ist und das trotzdem zu einer schnellen Be stimmung der genauen Anzahl der Keime in einer Blutprobe, zur Identifizierung der Arten der vorhandenen Keime, zur Feststellung, ob mehr als ein Keimtyp vorliegt, zur Fest stellung der antibakteriellen und antimykotischen Empfind lichkeit der verschiedenen Arten der isolierten Keime und zur Trennung der Keime von Blut und Plasma führt.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur schnellen Bestimmung der Anzahl und Art eines oder mehrerer pathogener Keime in Körperflüssigkeiten zu schaffen.

Zur Lösung dieser Aufgabe dient das Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 13 sowie die Vorrichtung gemäß Anspruch 14.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden pathogene Keime in einer Blutprobe bestimmt, indem die Blutprobe, vorzugsweise nach Lyse, auf ein geliertes, flüssiges Filtermedium in einem geschlossenen sterilen Zentrifugierbehälter aufgebracht wird, wobei das flüssige Filtermedium eine größere Dichte als die Flüssigkeitsprobe aufweist und eine sterile wäßrige Lösung darstellt, die die pathogenen Keime aus der Blutprobe selektiv aufnimmt. Anschließend wird - nach Verflüssigen des Geliermittels - zentrifugiert, wobei die Flüssigkeits probe gegen das Filtermedium gedrückt wird, und dadurch die pathogenen Keime veranlaßt werden, selektiv in das Filter medium überzugehen und sich von der Masse der Flüssig keitsprobe abzutrennen, so daß der Rest der Flüssigkeits probe von dem flüssigen Filtermedium getrennt werden kann. Das flüssige Filtermedium mit den darin enthaltenen Keimen wird dann sorgfältig gemischt, so daß eine im wesentlichen gleichmäßige Verteilung der Keime erhalten wird. Dann werden Anteile des flüssigen Filtermediums mit den darin verteilten Keimen den üblichen Kulturbedingungen unterzogen.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgeschlagen, die aus einem Zentrifugierbehälter besteht, der fest mit einer zur Injek tion geeigneten Verschlußvorrichtung geschlossen ist und bei dem das Innere des Behälters das oben angegebene flüssige Filtermedium enthält, wobei der Freiraum bei einem unter atmosphärischen Druck gehalten wird. Die wäßrige Lösung enthält ein thermisch empfindliches Geliermittel.

Die Erfindung ermöglicht durch das Verfahren und durch die Vorrichtung eine einfache und schnelle Bestimmung der genauen Anzahl von Mikroorganismen in einer Blutprobe; darüber hinaus läßt sich feststellen, ob mehr als eine Keimart vorliegt. Weiterhin wird die Trennung der Mikroorganismen von Blut körperchen und anderen flüssigen Bestandteilen des Blutes und auch die Trennung der Mikroorganismen von antimikrobiell wirksamen Faktoren des Blutes und allen gegebenenfalls beim Abnehmen der Blutprobe im Blut vorhandenen Antibiotika er möglicht. Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei allen Körperflüssigkeiten angewendet werden, wie bei Blut, Knochen mark-, Spinal- und Pleural-Flüssigkeiten, Urin und ähnlichem.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Zeichnungen näher erläutert.

In den Fig. 1 bis 10 sind die verschiedenen Verfahrens schritte bei den bevorzugten Analysenmethoden gemäß Erfin dung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung schematisch dargestellt.

Das bevorzugte Verfahren wird in Einzelheiten bei der quanti tativen Bestimmung von Bakterien in einer Blutprobe beschrieben. Es wird darauf hingewiesen, daß es in allen Fällen des Verdachtes auf Septikämie außerordentlich wichtig ist, daß der Arzt eine sehr schnelle Analyse der Blutprobe erhält. Die Analyse muß schnell anzeigen, welche Arten von pathogenen Mikroben und welche Mengen derartiger Pathogene im Blut vor liegen.

In den Zeichnungen ist die Analysensequenz anhand einer be vorzugten Ausführungsform der Erfindung schematisch darge stellt. In Fig. 1 weist die bei dem bevorzugten Verfahren eingesetzte Vorrichtung 20 ein reagenzglasartiges Glasgefäß 21 mit einer Öffnung 22 am oberen Ende auf, wobei diese Öffnung mit einer Durchstichkappe 23 verschlossen ist. Die selbst schließende Gummidurchstichkappe 23 ist im Schnitt dargestellt, um den in einer Einziehung befindlichen durch stechbaren Bereich 24 a zu zeigen. Die Innenseite der Kappe 23 weist vorzugsweise eine kegelstumpfförmige Einziehung 24 b auf. Der sterile Inhalt der Vorrichtung 20 besteht aus einer wäßrigen Lösung (flüssiges Filtermedium) 25 und einem eva kuierten Raum 26 (vollständiges oder teilweises Vakuum). Der Freiraum 26 wird bei unteratmosphärischem Druck, und zwar bei einem vorherbestimmten Wert gehalten, so daß eine be stimmte Menge Flüssigkeit (durch Injektion durch die Kappe 23) aufgenommen werden kann, ohne daß sich innerhalb der Vor richtung 20 ein zu starker Druck bildet, der dann die Kappe 23 aus der Öffnung 22 herauspressen könnte. Evakuierte Be hälter dieser Art sind an sich bekannt und werden mit ver schiedenen Unterdrucken hergestellt, um vorherbestimmte Flüssigkeitsmengen durch die Durchstechkappe aufzunehmen. Geeignete evakuierte Behälter sind beispielsweise in der US-PS 24 60 641 beschrieben. Die Vorrichtung 20 kann bei spielsweise ein evakuiertes Proberöhrchen sein, wie die unter der Handelsmarke "Vacutainer" von der Becton Dickinson Company vertriebenen Röhrchen, die zusätzlich noch eine wäßrige Lösung 25 enthalten. Die wäßrige Lösung 25 bildet das flüssige Filtermedium.

Das flüssige Filtermedium kann eine wäßrige Lösung einer beliebig gelösten Substanz darstellen, vorausgesetzt, daß sie gegenüber den darin suspendierten Keimen nicht toxisch ist und eine ausreichende Dichte aufweist, um rote und weiße Blutkörper chen oder Zellreste zu suspendieren. Das flüssige Filter medium hat also eine größere Dichte als Blut wie zum Beispiel über 1,06 g/cm³ und suspendiert damit Blutzellen oder Blut zellreste, kann aber pathogene Mikroben aufnehmen. Ferner enthält das flüssige Filtermedium eine geringe Menge eines thermisch empfindlichen Geliermittels.

Als geeignete in Lösung befindliche Stoffe für das flüssige Filtermedium können Zucker eingesetzt werden wie Saccharose Glucose, Maltose, Fructose, Manitol, Sorbitol und ähnliche. Das flüssige Filtermedium enthält mindestens etwa 40 Gew.-% Zucker und kann gegebenenfalls den Zucker bis zur Sättigungs grenze enthalten. Vorzugsweise beträgt der Gehalt an Zucker etwa 40 bis 50 Gew.-% des flüssigen Filtermediums. Im allge meinen werden Zucker und insbesondere Saccharose bevorzugt eingesetzt, da diese Lösungen bei einem physiologischen pH- Wert wie 6,0 bis 7,0 gehalten werden können.

Als gelöste Stoffe können aber auch alle anderen Verbindungen eingesetzt werden, solange die Lösung eine höhere Dichte als Blut aufweist und Blutkörperchen und insbesondere rote Blut körperchen und Überreste roter Blutkörperchen zurückhalten und suspendieren kann und gegenüber den pathogenen Mikroben nicht toxisch ist. Eine andere geeignete Verbindung ist bei spielsweise "Hypaque"-Natrium C₁₁H₈J₃N₂NaO₄(3,5-Diacetamido- 2,4,6-trÿod-benzoesäure als Natriumsalz). Dieser Verbindung kann in wäßriger Lösung in gleichen Konzentrationen wie die oben angegebenen Zucker verwendet werden.

Andere in Lösung vorliegende und als wäßrige Filtermedien geeignete Verbindungen sind makromolekulare Stoffe, die im wäßrigen Medium ein flüssiges Gel aufbauen können, das eine so geringe Porendichte aufweist, daß rote Blutkörperchen oder deren Reste nicht eindringen können, wobei aber die Porengröße groß genug ist, um pathogene Mikroben durchzu lassen. Geeignet zu diesem Zweck als gelöster Makromolekular stoff ist beispielsweise ein wasserlösliches vernetztes Poly meres, das im löslichen Netzwerk mikroporenartige Öffnungen aufweist. Ein derartiges wasserlösliches Polymer ist bei spielsweise das Copolymer aus Saccharose und Epichlorhydrin mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 300 000 bis 500 000, einer Intrinsic-Viskosität von etwa 0,17 dl/g und einer spezifischen Drehung [α] von +56,5°, das dialysier bares Material in Mengen unter 1 Gew.-% enthält. Eine der artige Verbindung wird unter der Marke "FICOLL" von der Pharmacia Fine Chemicals Inc. gebracht. Andere geeignete Polymere sind Dextrane mit mittleren Molekulargewichten von etwa 10 000 bis 2 000 000 und vorzugsweise etwa 50 000. Nach dem Auflösen in Wasser wirken diese Polymere als flüssige Filtermedien für pathogene Mikroben, da sie in dem wasser löslichen Netzwerk Mikroporenöffnungen mit einer Größe von etwa 1 bis 7 µm zu haben scheinen.

Die wasserlöslichen Polymere liegen in der wäßrigen Lösung in Konzentrationen von etwa 10 bis 40 und vorzugsweise etwa 20 bis 30 Gew.-% vor.

Unter dem Begriff "thermisch empfindliches Geliermittel" wird jede Verbindung verstanden, die in der wäßrigen Lösung 25 bei einer Zimmertemperatur liegenden Temperatur geliert, aber bei höheren Temperaturen wieder flüssig wird, und zwar bei solchen, die für die pathogenen Mikroorganismen unschäd lich sind, wie beispielsweise unter 50°C und vorzugsweise nicht über 42°C. Geeignete thermisch empfindliche Gelier mittel sind jeweils solche, die gegenüber der Lösung oder der Analysenprobe keine nachteilige Wirkungen ausüben. Derartige Verbindungen sind beispielsweise die Gelatinen, das heißt also aus dem Collagen durch Kochen von Haut, Bändern, Sehnen, Knochen oder ähnlichem in Wasser enthaltenen Proteine.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann nach einer bevorzugten Ausführungsform zur Bestimmung von Bakterien in einer Probe einer Körperflüssigkeit mit der folgenden Ausrüstung durch geführt werden:

Mit der oben beschriebenen Vorrichtung 20 mit dem flüssigen Filtermedium, wobei das Röhrchen ein Volumen von etwa 12 bis 14 m² hat und etwa 1 bis 2 ml der wäßrigen Flüssig filterlösung enthält;
einem weiteren evakuierten 12- bis 14-ml-Teströhrchen, das ein Material wie Natrium-polyanetholsulfat (bei spielsweise 1,6 ml) oder Heparin enthält, das als Anti coagulans wirkt und die phagozytische Aktivität der Granulozyten und Monozyten und die normale antibakterielle Aktivität des Serums inhibiert;
zwei sterilen Glasspritzen (mit zurückgezogenem Kolben), die 10 ml sterile Luft enthalten und zwei abnehmbaren hypodermischen 3,75-cm-Nadeln einer Stärke von 5,3 µm;
einer 1-ml-Einmalspritze und eine hypodermische 2,5-cm- Einmalnadel einer Stärke von 5,3 µm;
einer 3-ml-Einmalspritze und einer ebensolchen hypo dermischen Einmalnadel;
drei Blutagarplatten;
einer EMB (Eosin-methylenblau)-Platte;
einer Sabouraud-Agarplatte und
mit einem Röhrchen mit Thioglycolatmedium.

Es wird darauf hingewiesen, daß mit Ausnahme der Vorrichtung 20 oder einer ähnlichen Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verschiedene Geräte und Kultur medien angewendet werden können. Insbesondere wird darauf hingewiesen, daß die oben angegebenen Kulturmedien nur bei spielhaft sind, da sie im allgemeinen vorzugsweise zum Nach weis der am häufigsten vorkommenden pathogenen Mikroben verwendet werden. Die vorgeschlagenen Blutagarplatten sind die üblicherweise eingesetzten Blutagarplatten, die im wesent lichen aus Schafblut und einem Nährmaterial wie Zucker bestehen, wobei diese Ausgangsverbindungen durch einen sich verfestigenden Agar auf einer Petriplatte zusammengehalten werden. Die Sabouraud-Agarplatte ist speziell zur Kultur von Pilzen geeignet. Die EMB-Platte wird zur schnellen Identi fizierung bestimmter Keime verwendet, da diese in einer be stimmten Weise darauf Flecken bilden. Das flüssige Thio glykolatmedium mit zugesetztem Natrium-polyanetholsulfat (SPS) ist im wesentlichen ein Trägermedium, das als Rück halt für das Wachstum von anaeroben und aeroben Bakterien und der meisten Pilze geeignet ist.

Zwar können verschiedenste Vorrichtungen zur Duchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden, meist werden aber die oben bezeichneten Geräte und Materialien in der im folgenden näher beschriebenen Weise eingesetzt.

Die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung 20 wird anfänglich wie in Fig. 2 dargestellt, umgedreht, so daß die wäßrige Lösung nach unten gegen die Kappe 23 fließen kann. Dann wird die Vorrichtung in ein geeignetes Kühlaggregat wie in einen Kühlschrank eingesetzt und soweit gekühlt, bis die Gelatine verfestigt ist. Das Röhrchen kann beispielsweise in der in Fig. 3 dargestellten umgedrehten Stellung auf 4°C abgekühlt werden.

Anschließend wird eine vorher bestimmte Menge einer Blut probe wie beispielsweise 8,3 ml in das evakuierte Teströhr chen mit dem Natrium-anetholsulfonat SPS injiziert. Die roten Blutkörperchen werden vorzugsweise mit einem geeigneten für Mikroorganismen nicht toxischen Mittel wie beispielsweise einem nicht toxischen Saponin lysiert. Es wird aber darauf hingewiesen, daß die meisten Saponine zumindest gegenüber einigen Mikroorganismen toxisch sind. Es wurde jedoch ge funden, daß die toxischen Bestandteile aus bisher für toxisch gehaltenen Saponinen entfernt werden können. Einige im Handel erhältliche Saponinzube reitungen sind nicht toxisch, so daß auch diese Verbindungen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Anwendung finden können. Die 1-ml-Einmalspritze wird zum Injizieren von 0,3 ml des nicht toxischen Saponins (12%) in das evakuierte Teströhr chen mit der Blut-SPS-Mischung verwendet. Gegebenenfalls können die Blutkörperchen aber auch in anderer Weise wie beispielsweise durch Verdünnung im Verhältnis von 1 : 1 mit destilliertem Wasser lysiert werden.

Diese vorherige Lyse der Blutprobe verringert die mögliche Maskierungswirkung der Erythrocyten soweit wie möglich. Eine Maskierungswirkung kann sich im allgemeinen dadurch ergeben, daß die Erythrocyten auf der Oberfläche des flüssigen Filter mediums während des Zentrifugierens verkleben und die ver klebten Zellen dabei pathogene Mikroben einschließen, wenn diese während des Zentrifugierens nach unten wandern, so daß sie das flüssige Filtermedium nicht erreichen. Als nächstes wird eine der sterilen Glasspritzen mit einer hypodermischen 3,75-cm-Nadel verwendet, um 8 mm der Mischung aus Blut, SPS und Saponin in dem evakuierten Röhrchen zu entnehmen. Diese Mischung wird dann in der in Fig. 4 sche matisch dargestellten Weise in der Vorrichtung 20 injiziert. Die Nadel stößt durch die Einlage 24 a der Gummikappe 23, passiert durch die gelierte wäßrige Filterlösung 25, so daß dann der Kolben niedergedrückt werden kann, um die Probe 27, wie in Fig. 4 dargestellt, auf dem gelierten wäßrigen Filtermedium 25 abzusetzen. Die durch das Ein spritzen der Blutprobe im Freiraum 26 ausgelöste Turbulenz führt zu keiner Störung des wäßrigen gelierten Filter mediums 25, so daß dieses als feste Bodenschicht in der Vorrichtung 20 verbleibt.

Anschließend wird die hypodermische Nadel aus der Gummikappe 23 herausgezogen und die Vorrichtung 20 mit der gelierten wäßrigen Filterschicht 25 und der Schicht der Blutprobe 27 in der umgekehrten Stellung erwärmt, bis die Gelatine weich wird und die wäßrige Filterschicht 25 sich verflüssigt. Die Vorrichtung wird auf eine Temperatur erwärmt, die nicht zu einer Zerstörung der gegebenenfalls in der Blutprobe vor handenen pathogenen Mikroben führt, aber andererseits aus reichend hoch ist, um die Gelatine zu verflüssigen. Wie sich aus der schematischen Darstellung in Fig. 5 ergibt, kann das Röhrchen im umgedrehten Zustand durch Eintauchen in ein Wasserbad auf etwa 37 bis 42°C erwärmt werden. Durch die Verflüssigung der Gelatine in der wäßrigen Lösung bildet sich so eine flüssige wäßrige Filterlösung, die nun als Flüssigfilter für pathogene Mikroben dienen kann.

Die Abtrennung der pathogenen Mikroben aus der Blutprobe erfolgt durch Einsetzen der Vorrichtung 20 in umgekehrter Stellung in eine geeignete Zentrifuge, in der das Röhrchen bei einer Temperatur unterhalb 42°C einer zur Trennung der pathogenen Mikroben von den anderen Bestandteilen der Blut probe ausreichenden Zentrifugalkraft unterworfen wird. Ge schwindigkeit und Zentrifugierzeit können je nach Konstruk tionsmaterial der Vorrichtung 20 und Art der Zentrifuge in weitem Umfang variieren. Meist wird eine ausreichende Zentri fugierung erzielt, wenn der Behälter mit der wäßrigen Lösung und der Probe einer 100- bis 6000fachen und vorzugsweise etwa 1400- bis 5000fachen Schwerkraft unterworfen wird. Besonders geeignet ist ein Verfahren unter Verwendung einer Schwingzentrifuge, bei welcher etwa 10 bis 20 Minuten eine 2000- bis 4000fache Schwerkraft auf das System einwirkt.

Nach der Behandlung des Röhrchens in der Zentrifuge ent sprechend der Darstellung in Fig. 6 wird die zweite 10-ml- Glasspritze mit steriler Luft zum Abziehen des größten Teils der flüssigen Probe 27 von der wäßrigen Polymer schicht 25 eingesetzt. Wie sich schematisch aus Fig. 7 ent nehmen läßt, können beispielsweise 7,5 ml der restlichen Probe abgezogen werden.

Nach dem Entfernen des Restes der Probe wird die wäßrige Filterlösung 25 zunächst sorgfältig gemischt, um sicherzu stellen, daß alle von der Lösung aufgenommenen pathogenen Mikroben gleichmäßig in dieser verteilt werden. Die Lösung 25 kann beispielsweise kräftig geschüttelt werden, indem die Kappe 23 der Vorrichtung 20 im umgekehrten Zustand etwa ½ bis 4 Minuten auf einen Vortex-Mischer aufgesetzt wird. Dieser Schritt des Mischens ist schematisch in Fig. 8 darge stellt. Dann wird die wäßrige Filterlösung 25 mit den ge gebenenfalls vorhandenen gleichmäßig verteilten pathogenen Mikroben unter Verwendung der 3-ml-Einmalspritze, wie in Fig. 9 dargestellt, aus der Vorrichtung 20 abgezogen. In dem Röhrchen sollten etwa 1½ ml Flüssigkeit verbleiben. Diese Flüssigkeit kann dann auf einem geeigneten Bakteriennährboden verteilt werden; dieser Verfahrensschritt ist schematisch in Fig. 10 dargestellt. Mit der oben angegebenen Vorrichtung kann das Material wie folgt verteilt werden:

Eine Blutagarplatte nimmt 0,2 ml der wäßrigen Lösung auf; diese Platte kann dann bei 37°C aerob inkubiert werden. Eine andere Blutagarplatte nimmt 0,2 ml der wäßrigen Lösung auf und kann in einem Kerzenglas bei 37°C inkubiert werden. Eine weitere Blutagarplatte nimmt 0,2 ml der wäßrigen Lösung auf und kann dann bei 37°C in einer anaeroben Umgebung inkubiert werden. Die Sabouraud-Agarplatte kann nach Zugabe von 0,2 ml des wäßrigen Mediums bei 25°C in aerober Umgebung inkubiert werden. Die EMB-Platte kann nach Zugabe von 0,2 ml der wäßrigen Lösung bei 37°C in einem Kerzenglas inkubiert werden. Das flüssige Thioglycolatmedium kann nach Zugabe von 0,5 ml der wäßrigen Lösung bei 37°C inkubiert werden. Die Nährböden werden täglich auf Anwesenheit von Kolonien untersucht. Die Anzahl der Mikroben in 1 ml Blut kann durch Multiplizieren der Anzahl der Kolonien unter Berücksichti gung eines Korrekturfaktors bestimmt werden. Dieser Korrek turfaktor zieht die Teilungsgeschwindigkeit eines bestimmten Keimes, die eingesetzten Volumina an Blut und Filterflüssig keit und die auf die Platte aufgebrachte Menge der endgül tigen Mischung ein. In dem oben angegebenen allgemeinen Beispiel beträgt der Korrekturfaktor 1,56.

Es wird nochmals darauf hingewiesen, daß die einzelnen Ver fahrensschritte sowie Vorrichtungen, Ausrüstungen und die eingesetzten Kulturmedien gegebenenfalls variiert werden können. So können beispielsweise zum Vermischen der Blutprobe mit dem Antikoagulans und/oder dem eine Lyse auslösenden Mittel alle bekannten Vorrichtungen eingesetzt werden. Weiter kann zum Beispiel im Verfahrensschritt 7 die Spritze dazu verwendet werden, um nur die untere flüssige Filterschicht 25 zusammen mit einer sehr geringen Menge der Probe aus der Schicht 27 aus dem Inneren der Vorrichtung 20 abzuziehen, so daß der Rest der Probeschicht 27 in der Vorrichtung ver bleibt.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Verschiedene jeweils 8 ml umfassende Proben sterilen Blutes von gesunden Blutspendern wurden mit jeweils 0,4 ml von humanpathogenen Keimen, nämlich Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli und Candida albicans in verschiedenen Konzentrationen inocculiert.

Zu jeder Probe wurden 0,3 ml einer 12 gew.-%igen wäßrigen nicht toxischen Saponinlösung zugesetzt. Dann wurde jede Probe unter aseptischen Bedingungen wie in der Beschreibung angegeben, in einen evakuierten Behälter wie eine Vorrichtung 20 überführt, die eine vorbestimmte Menge des wäßrigen Filtermediums enthielt, und zwar 1,5 ml einer wäßrigen Lösung mit 20 bis 25% eines Copolymeren aus Epichlorhydrin und Saccharose mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 300 000 bis 500 000, einer Intrinsic-Viskosität von etwa 0,17 dl/g, einer spezifischen Drehung von [α] von 56,5° ("FICOLL"-Lösung) sowie 1,5 Gew.-% Gelatine (Eastman Purified Pigskin). Ein anderer Teil der Behälter 20 enthielt 1,5 ml einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt an 50 Gew.-% Saccharose und 1,5 Gew.-% Gelatine (Eastman Purified Pigskin) mit einem pH-Wert von 6,5. Jede der Vorrichtungen 20 wurde umgedreht und in umgekehrter Stellung auf 4°C gekühlt, bevor die Proben in der in Fig. 4 schematisch dargestellten Weise zugegeben wurden. Dann wurden Proben mit den gleichen human pathogenen Bakterien sowohl in den Vorrichtungen 20, die die wäßrige "FICOLL"-Lösung enthielten, als auch in den Vorrichtungen 20, die eine wäßrige Saccharoselösung ent hielten (ausnahmsweise wurde für P. aerugenosa nur FICOLL- Lösung verwendet), eingebracht. Nachdem jede Probe in der Vorrichtung 20 mit der benötigten Menge der Blutproben mit einem bekannten Gehalt an humanpathogenen Keimen versetzt worden war, wurden diese im umgedrehten Zustand in ein Wasserbad eingesetzt. Das Wasserbad wurde bei 42°C gehalten, so daß die Gelatine sich verflüssigen konnte. Jedes Röhr chen wurde dann in umgekehrter Stellung in einer Servall- Zentrifuge mit einem HB4-Rotor zentrifugiert. Die Geschwin digkeit der Zentrifuge und die Zentrifugierzeit wurden entsprechend den Werten in den folgenden Tabellen 1 bis 6 variiert. Jede Probe wurde einer relativen Zentrifugal kraft von 164 g, 650 g, 1465 g, 2520 g, 4080 g und 5860 g unterworfen. Weiterhin wurde jede Probe diesen verschiedenen Zentrifugengeschwindigkeiten für 10, 20 und 30 Minuten unterworfen.

Nach dem Zentrifugieren wurden 8,0 ml der über der wäßrigen Filterschicht überstehenden Flüssigkeit mit einer 10-ml- Spritze abgezogen. Der restliche Inhalt wurde etwa ½ bis 2 Minuten in einem Vortex-Mischer kräftig gemischt, dann wurden 0,2-ml-Proben dieses Materials zum Auszählen der Kolonien auf Agarmedium aufgebracht. Bei jedem Versuch wurden Kontrollzählungen der verwendeten Suspension durchge führt. Die mittlere prozentuale Wiedergewinnung (mit den angegebenen Standardabweichungen) der pathogenen Keime in den Proben läßt sich aus den folgenden Tabellen 1 bis 6 ent nehmen.

Tabelle 1

Wäßrige "Ficoll"-Lösung als Flüssigfilter, Zentrifugierzeit 10 min

Trennmaterial: "Ficoll"
Zeit: %-Wiedergewinnung 10 min

Tabelle 2

Wäßrige Saccharoselösung als Flüssigfilter, Zentrifugierzeit 10 min

Trennmaterial: Saccharose
Zeit: %Wiedergewinnung 10 min

Tabelle 3

Wäßrige "Ficoll"-Lösung als Flüssigfilter, Zentrifugierzeit 20 min

Trennmaterial: "Ficoll"
Zeit: %Wiedergewinnung 20 min

Tabelle 4

Wäßrige Saccharoselösung als Flüssigfilter, Zentrifugierzeit 20 min

Trennmaterial: Saccharose
Zeit: %Wiedergewinnung 20 min

Tabelle 5

Wäßrige "Ficoll"-Lösung als Flüssigfilter, Zentrifugierzeit 30 min

Trennmaterial: "Ficoll"
Zeit: 30 min %Wiedergewinnung

Tabelle 6

Wäßrige Saccharoselösung als Flüssigfilter, Zentrifugierzeit 30 min

Trennmaterial: Saccharose
Zeit: %Wiedergewinnung 30 min

Diese Ergebnisse sind im Vergleich zu den bisherigen Methoden zur Konzentrierung und Wiedergewinnung von pathogenen Mikro ben als ausgezeichnet anzusehen.

Beispiel 2

Um die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Nachweismethode aufzuzeigen, wurden 500 Blutproben von Patienten, die im Verdacht standen, Infektionen des Blutstromes zu haben, und zwei oder drei der folgenden Verfahren analysiert:

a) Blutflaschenverfahren: Zwei 5-ml-Proben des Patienten blutes wurden steril in zwei übliche BBL-Blutflaschen eingebracht. Die eine Flasche wurde anaeroben und die andere Flasche aeroben Kulturbedingungen ausgesetzt; beide Flaschen wurden bei 37°C inkubiert. Die Flaschen wurden täglich auf Anzeichen für mikrobielles Wachstum untersucht. Falls Wachstum festgestellt wurde oder falls kein Wachstum festgestellt wurde, wurden 1-ml-Proben aus jeder Flasche am zweiten und sechsten Tag nach Zugabe der Blutprobe entnommen. Die Proben wurden mikroskopisch und durch Ausstreichen auf übliche Bakterien- und Pils nährböden (Agarplatten) analysiert.
b) Gießplattenverfahren: 0,5 ml Patientenblut wurden aseptisch in jeweils 12 Petrischalen eingebracht. Dann wurden 20 ml Sabouraud-Agarmedium oder Blutagarmedium je Platte ein gebracht und der Inhalt kräftig gemischt. Danach wurden die Platten unter folgenden Bedingungen inkubiert: drei Platten (Sabourauds Medium),25°C, aerob drei Platten (Blutagarmedium),37°C, aerob drei Platten (Blutagarmedium),37°C, anaerob drei Platten (Blutagarmedium),37°C, Kerzenflasche
Alle Platten wurden täglich auf Anzeichen für mikrobielles Wachstum untersucht.
c) Erfindungsgemäßes Dichtezentrifugierverfahren: 8,3 ml Patientenblut wurden in ein steriles evakuiertes Röhrchen mit 1,7 ml einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt an 0,35 Gew.-% Natrium-polyanetholsulfonat und 0,85 Gew.-% Natriumchlorid überführt. Die roten Blutkörperchen im Röhrchen wurden mit 0,3 ml einer 12%igen wäßrigen Saponinlösung lysiert, dann wurden 8 ml dieser Mischung in ein weiteres evakuiertes Röhrchen entsprechend Vor richtung 20 mit 1,7 ml einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt an 20 Gew.-% eines Copolymers aus Epichlorhydrin und Saccharose und 1,5 Gew.-% Gelatine entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Lösung überführt. Jede Vor richtung 20 wurde dann umgedreht und bei 4°C so lange gekühlt, bis die wäßrige Polymerlösung durch die Gelatine verfestigt war. Dann wurden die Blutproben in der in Fig. 4 schematisch dargestellten und in Beispiel 1 beschriebenen Weise in jede Vorrichtung 20 injiziert. Anschließend wurde die wäßrige Polymerlösung in jeder Vorrichtung 20 durch Eintauchen in ein bei 42°C gehaltenes Wasserbad verflüssigt. Jede Vorrichtung 20 wurde anschließend im umgedrehten Zustand 45 Minuten in einer International U.V.-Zentrifuge bei 3000 U/min zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurden 8 ml der über der wäßrigen Polymerschicht über stehenden Flüssigkeit mit Hilfe einer 10-ml-Spritze ab gezogen. Der verbleibende Anteil in jeder Vorrichtung 20 wurde 1 Minute in einem Vortex-Mischer kräftig durch mischt, dann wurden 0,2-ml-Proben entnommen, gleichmäßig ausgestrichen und auf den folgenden Medien inkubiert: eine Blutagarplatte,37°C, aerob zwei Blutagarplatten,37°C, anaerob eine Blutagarplatte,37°C, Kerzenglas eine Sabourauds-Agarplatte,25°C, aerob
Der Rest der Probe wurde in ein Röhrchen mit flüssigem Thioglycolatmedium überführt und bei 37°C inkubiert. Die Platten und das Röhrchen wurden täglich auf Anzeichen für mikrobielles Wachstum untersucht.

Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der folgenden Tabelle 7 zusammengestellt.

Tabelle 7

Eine Zusammenfassung der in Tabelle 7 enthaltenen Daten ist in der folgenden Tabelle 8 gegeben:

Tabelle 8

Wie Tabelle 8 zeigt, ist das Zentrifugierverfahren bezüglich des prozentualen positiven Nachweises gegenüber dem Blut flaschen- und dem Gießplattenverfahren überlegen. Der posi tive Nachweis betrifft auch Fälle mit mehr als einem Keim. Das Zentrifugierverfahren ist wesentlich schneller als die Blutflaschenmethode. Die Ergebnisse in den Tabellen 7 und 8 zeigen darüber hinaus, daß bei einem gegebenen Blutvolumen die Zentrifugiermethode empfindlicher als die quantitative Gießplattenmethode ist, das heißt also, das ein höherer Prozentsatz der in der Blutprobe vorhandenen Organismen ge wonnen wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die Vorrichtung können zum Abtrennen von pathogenen Mikroben aus Flüssigkeitsproben wie Körperflüssigkeiten eingesetzt werden, um die Gegenwart von pathogenen Mikroben in der Körperflüssigkeit nachzuweisen, wie beispielsweise zur Diagnose von Septikämie. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Unter suchung von Blut von als gesund angenommenen Blutspendern eingesetzt werden, um infiziertes Blut festzustellen, bevor es einem Patienten verabreicht wird.

Die erfindungsgemäßen Maßnahmen unter Einbeziehung des Flüssigfilters und des Zentrifugierens bilden ein neues Ver fahren, um pathogene Keime in einer Flüssigkeitsprobe zu konzentrieren und um dann die konzentrierten Mikroben von antimikrobiell wirksamen Faktoren, wie sie im allgemeinen in Flüssigkeiten wie Blut und anderen Körperflüssigkeiten vorhanden sind, abzutrennen. Darüber hinaus eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Trennung und Konzentrierung von pathogenen Mikroben aus Körperflüssigkeitsproben wie Blut, wenn in Notsituationen bei Patienten mit schnell ver laufender akuter Septikämie eine mikroskopische Untersuchung notwendig ist. Die Flüssigfiltermedium weist eine größere Dichte als die Flüssigkeitsprobe auf, aus welcher die pathogenen Keime aufgenommen werden. So hat bei spielsweise das erfindungsgemäß in Konzentrationen von 10 bis 40 Gew.-% in wäßriger Lösung eingesetzte Copolymere aus Saccharose und Epichlorhydrin eine Dichte von etwa 1,035 bis 1,16 g/ml. Diese dichten Flüssigfilter führen nicht nur zu einer selektiven Aufnahme der Keime, sondern suspendieren und schützen die Keime, sobald sie von dem Medium aufge nommen sind und darin zurückgehalten werden. Die sehr dichten polymeren Medien schützen und konservieren pathogene Mikroben, und zwar insbesondere solche, die teilweise ge schädigte Zellwände aufweisen, also Sphäroplasten.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Nachweis von allen pathogenen Mikroben eingesetzt werden, wie Bakterien, Pilzen, L-Formen der Bakterien und Mycoplasmen.

Es wird darauf hingewiesen, daß wäßrige Zuckerlösungen und insbesondere wäßrige Saccharoselösungen wirksam zur Ge winnung der L-Formen und der Mycoplasmen eingesetzt werden können. Die konzentrierten Saccharoselösungen sind hyper tonisch und schützen die L-Formen und Mycoplasmen vor einer Lyse. Im allgemeinen enthalten die konzentrierten wäßrigen Saccharoselösungen eine kleine Menge Gelatine, wie etwa 1 bis 2 Gew.-%; diese Lösungen sind die bevorzugt eingesetzten Flüssigfilter bei Durchführung des erfindungsgemäßen Ver fahrens. Die Lösungen sind, wie bereits angegeben, hyper tonisch, sie weisen aber einen ausreichenden Auftrieb auf, um rote und weiße Blutkörperchen und Zellreste während des Zentrifugierens abzuhalten, während sie gleichzeitig nicht die pathogenen Keime ausschließen, so daß sie eine Art Kissen- oder Schirmwirkung für die pathogenen Keime bilden, und somit die darin suspendierten Keime schützen. Außerdem sind die Filter wärmestabil. Beispielsweise können die Saccharose-Gelatine-Mischungen während der Vorbereitung der Vorrichtung 20 autoklaviert werden, ohne daß ein uner wünschter Abbau der Gelatine oder eine Ausfällung auftreten. Darüber hinaus können diese Lösungen bei einem fast neutralen oder physiologischen pH-Wert gehalten werden.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den bekannten Verfahren besteht darin, daß dadurch pathogene Keime als erstes in einem geschlossenen System konzentriert werden können, das nicht einer äußeren Konta mination mit pathogenen Keimen durch deren Anwesenheit in den Laboratorien oder im Krankenhaus ausgesetzt ist. Weiter hin werden die konzentrierten pathogenen Keime von anti mikrobiell wirksamen Faktoren, wie sie normalerweise in Körperflüssigkeiten vorliegen, abgetrennt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum wirksamen Nachweis sehr geringer Konzentrationen der Mikroorganismen wie beispielsweise einem Mikroorganismus je ml Blut eingesetzt werden.

Claims

1. Verfahren zur Abtrennung von pathogenen Keimen aus Körperflüssigkeiten mit sich anschließender Bestimmung der Keime nach bekannten Methoden, gekenn zeichnet durch

a) Einbringen eines flüssigen Filtermediums, be stehend aus einer wäßrigen Lösung mit einer höheren Dichte als die jeweilige Körperflüssigkeit, die gegenüber den pathogenen Keimen nicht toxisch ist und zur selektiven Aufnahme der pathogenen Keime aus der Körperflüssigkeit befähigt ist und in der ein thermisch empfindliches Gelier mittel enthalten ist, in einen geschlossenen, bei unteratmosphärischem Druck gehaltenen Zentri fugierbehälter,
b) Abkühlen bis das flüssige Filtermedium verfestigt ist,
c) Aufbringen der Körperflüssigkeit auf das gelierte Filtermedium,
d) Erwärmen bis sich das Filtermedium ver flüssigt hat,
e) Zentrifugieren, so daß die Probe der Körper flüssigkeit gegen das flüssige Filtermedium ge preßt wird, bis die pathogenen Keime von dem flüssigen Filtermedium aufgenommen sind,
f) Abziehen der über dem Filtermedium befindlichen Flüssigkeit,
g) Durchmischen des flüssigen Filtermediums zur gleich mäßigen Verteilung der aufgenommenen Keime und Entnahme aliquoter Teile zur Bestimmung der Keime.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Behälter nach Einführen des flüssigen Filtermediums umkehrt und alle weiteren Verfahrens schritte bei umgekehrter Position des Behälters durch führt, wobei man die Körperflüssigkeit durch das gelierte Flüssigkeitsmedium hindurch aufbringt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als flüssiges Filtermedium eine wäßrige Lösung eines Zuckers verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuckerlösung mindestens 4%ig ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als flüssiges Filtermedium eine wäßrige Lösung eines makromolekularen Stoffes verwendet, dessen Mikroporenöff nungen im gelösten Netzwerk eine Größe von 1 bis 7 µm haben.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das flüssige Filtermedium aus einer wäßrigen Lösung eines Copolymeren aus Saccharose und Epichlorhydrin mit einem mittleren Molekulargewicht von etw 300.000 bis 500.000 und einer spezifischen Drehung [α] von 56,5° besteht.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung einen Gehalt von etwa 10 bis 40 Gew.-% des Copolymeren aufweist.

8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Filtermedium eine wäßrige Lösung eines Dextrans mit einem Molekulargewicht von etwa 10 000 bis 2 000 000 verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Dextranlösung etwa 10 bis 40 Gew.-% Dextran enthält.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch ge kennzeichnet, daß die Menge des Geliermittels 1 bis 5 Gew.-% beträgt.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch ge kennzeichnet, daß das Geliermittel Gelatine ist.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch ge kennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Blut ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Blutprobe zuvor lysiert wurde.

14. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Zentrifugierbehälter besteht, der mit einem mittels einer Injektionsnadel durchstechbaren, selbstschließenden Verschluß verschlossen ist und im Inneren ein flüssiges gegebenenfalls durch Abkühlen verfestigtes Filtermedium nach den Ansprüchen 1a bis 11 mit einer größeren Dichte als die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe sowie einen unter unteratmosphärischen Druck stehenden freien Raum für die Aufnahme der Flüssigkeitsprobe auf weist.